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TÍTULO: ENTOMOLOGIA MOLECULAR FORENSE: COMPARAÇÃO QUANTITATIVA E QUALITATIVA
DE AMOSTRAS DE DNA DE DÍPTEROS NECRÓFAGOS OBTIDAS PELA TÉCNICA DE SALTING OUT
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: BIOMEDICINA
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
AUTOR(ES): ARIEL DE CAMPOS MIRON BARNEI
ORIENTADOR(ES): ROGÉRIA MARIA VENTURA
COLABORADOR(ES): DANIELA RUIZ GARCIA, VALÉRIA BRITO FRANCO
1. RESUMO
As Ciências Forenses constituem uma área de estudos aplicada à produção de
provas técnicas científicas, com a finalidade de contribuírem com a elucidação de
causas na justiça. Uma destas áreas é a Entomologia Forense que estuda
artrópodes, em suas várias fases, que podem infestar imóveis (causas urbanas),
alimentos (causas da indústria alimentícia) e compor a fauna cadavérica (área
médico-legal). Nesta última área, a Entomologia Forense permite estimar o intervalo
pós-morte (IPM) de um cadáver. Para extrair quaisquer evidências a partir dos
achados entomológicos é necessário que haja a identificação da espécie do inseto
encontrado. Essa identificação geralmente é feita a partir das características
morfológicas do espécime coletado. Porém, em muitos casos essa diferenciação
torna-se difícil, pois há muitas semelhanças entre certas espécies em estágios
iniciais de desenvolvimento. Essa identificação pode ser ampliada graças ao
aperfeiçoamento de técnicas da Biologia Molecular que analisa o material genético
contido nos insetos em diferentes fases do seu ciclo de vida. Estas análises fazem
parte da Entomologia Molecular Forense. É possível também realizar a identificação
do indivíduo através do material da larva e a identificação de material genético
diferente do cadáver e do inseto, ou seja, do possível suspeito, com as análises
moleculares. Análises experimentais anteriores realizadas pelo nosso grupo
aprimoraram a técnica de extração de DNA de “salting out” para amostras de insetos
necrófagos. Para isto, exemplares de todas as fases evolutivas de dípteros foram
submetidas ao método modificado com duas etapas adicionais de purificação com
clorofórmio. Os resultados revelaram a aplicabilidade deste método. No presente
estudo, avaliamos de forma comparativa, a quantidade e a qualidade (grau de
pureza) do DNA obtido de amostras de diferentes fases do ciclo de vida dos dípteros
necrófagos. Os resultados revelaram que entre as amostras de DNA analisadas, as
de larvas foram as que geraram maior quantidade e qualidade, sendo portanto,
altamente indicadas para a utilização na Entomologia Molecular Forense.
2. INTRODUÇÃO
A Entomologia é o estudo da interação dos insetos com o homem e o meio
ambiente. Como sub-área desta ciência, a Entomologia Forense constitui uma
ferramenta de suma importância para a resolução de causas na justiça. Pode ser
utilizada em casos de investigação criminal, determinando a causa, local e modo da
morte, intervalo pós-morte e identificação de suspeito e vítima (VELHO et al,2012).
Entre os insetos de interesse forense estão os necrófagos da ordem Diptera, que
compreende cerca de 86.000 espécies conhecidas, sendo uma das maiores ordens
de insetos. As espécies que fazem parte desta ordem podem ser encontradas em
quase todos os habitats. No Brasil, as principais famílias de dípteros necrófagos são
a Musciidae, Calliphoridae e Sarcophagidae (OLIVEIRA-COSTA, 2011).
Sob o ponto de vista morfológico, os dípteros em geral, apresentam apenas um
par de asas, encontrando-se o segundo par reduzido a halteres, utilizado na
estabilização do voo, e um par de olhos compostos. As larvas dos dípteros possuem
corpo de consistência mole, de tonalidade creme e sem membros de locomoção,
não se encontrando a cabeça diferenciada (CAINÉ, 2010).
Para os estudos forenses é muito importante a identificação de insetos da fauna
cadavérica. Contudo, nem sempre a correta identificação morfológica é possível,
principalmente quando se encontram somente larvas e pupas. A Biologia Molecular
é uma ferramenta muito útil na Entomologia Forense para auxiliar a identificação das
larvas e pupas de dípteros necrófagos, obtidas em cadáveres ou em cenas de crime
sem cadáver mas, com manchas biológicas infestadas. Através da análise de
marcadores moleculares específicos pode-se identificar com exatidão a espécie de
inseto ao qual a larva pertence e assim, pode-se avaliar o IPM, a identidade genética
do cadáver, entre outras informações ( IDE, 2014 ;MARTINS et al.,2013).
As análises genéticas de DNA de insetos adultos contudo, também são
importantes, pois estes também podem conter material biológico do cadáver
utilizado para a sua alimentação. (CAINÉ, 2010).
A padronização de técnicas de extração de DNA e a avaliação da eficácia destas
técnicas em amostras das diferentes fases de ciclo de vida dos insetos podem
contribuir significativamente com a Entomologia Molecular Forense.
3. OBJETIVOS
O objetivo desse estudo é avaliar de forma comparativa a quantidade e a
qualidade (grau de pureza) do DNA obtido de amostras de diferentes fases do ciclo
de vida (larvas, pupas e insetos adultos) dos dípteros necrófagos, a partir de
extrações realizadas pelo método de salting out modificado (MELO & VENTURA,
2013).
4. METODOLOGIA
4.1 Coleta, preservação e identificação
Os espécimes de dípteros que fizeram parte desse estudo foram coletados em
armadilha adaptada do modelo proposto por Ferreira (1978 apud GUIMARAES &
GUIMARAES, 2003) na região Litoral Sul de São Paulo no período de Junho de
2013 e região metropolitana de São Paulo no período de Julho de 2013.
As armadilhas foram confeccionadas com garrafas PET e as iscas utilizadas
foram peixes. As armadilhas foram distribuídas em diferentes ambientes de aspectos
ecológicos distintos, fixadas de 1 a 10 metros do solo por aproximadamente quinze
dias. Entre os períodos de 15 a 20 dias após a colocação das armadilhas, foram
realizadas as coletas dos insetos adultos, larvas e pupas na armadilha.
Esses insetos adultos foram identificados por
métodos convencionais de
diferenciação morfológica, comparando-os com as formas descritas em atlas e livros
de Parasitologia, Biologia e Entomologia Forense (REY, 1992; JUNIOR & SASSON,
1981; OLIVEIRA-COSTA, 2011). Algumas pupas foram acondicionadas em potes de
coleta para posterior maturação e identificação. As larvas em diferentes estágios
também foram devidamente identificadas morfologicamente com o guia on-line de
identificação de larvas de insetos dípteros (PINHO, 2008).
4.2 Extração do DNA pelo método de Salting-out
Amostras unitárias de larvas, pupas e insetos adultos de espécies de dípteros
das famílias Muscidae, Calliphoridae e Sarcophagidae foram utilizadas para a
extração de DNA pelo método de salting-out modificado (MELO & VENTURA, 2013).
As amostras foram maceradas em 1000µl de PBS 1X e centrifugadas a 10.000
rpm por 2 minutos. Constituíram-se assim os pellets de células.
Para a extração adicionou-se aos pellets 600µl de Buffer A e misturou-se até
dissolvê-los totalmente. Após a dissolução, adicionou-se 20µl de SDS 10% e
homogenizou-se as amostras por inversão. Em seguida, adicionou-se 100µl de
Pronase E, homogenizou-se novamente as amostras por inversão, e estas foram
incubadas por 20 minutos em temperatura de 60ºC.
Após a incubação adicionou-se 100µl de NaCl saturado (5M) e misturou-se
vigorosamente por 10 minutos. Em seguida, centrifugou-se as amostras a 10.000
rpm durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo e
adicionou-se 1000µl de EtOH (etanol) absoluto gelado. Após a homogeneização, as
amostras foram mantidas overnight a -20ºC para precipitação do DNA.
As amostras foram então, centrifugadas em 10 000 rpm por 10 minutos. O EtOH
absoluto foi descartado e adicionou-se 400µl de EtOH 70% gelado para a lavagem
dos pellets de DNA, misturando por inversão de tubos. Em seguida, as amostras
foram centrifugadas a 10 000 rpm por 10 minutos. Após retirada do EtOH, foi
realizada a secagem dos pellets em estufa à 37 oC. Os pellets de DNA foram
ressuspensos em H2O Milli-Q estéril. As amostras foram preservadas a 4 oC ou 20oC.
As amostras de DNA extraídas pelo método de salting-out foram submetidas a
análise em espectrofotômetro para verificar a concentração de DNA e sua pureza. O
valor de pureza é calculado através da relação Abs260/Abs280 que deve estar entre
1,8 e 2,0. Para valores inferiores a 1,8, considera-se contaminação da amostra e a
concentração do DNA em µg/ml é calculada na fórmula ABS260 x FATOR DE
DILUIÇÃO x FATOR CONSTANTE (50).
Realizou-se a eletroforese em gel de agarose a 0,8% das amostras de DNA
obtidas e observou-se o perfil eletroforético em transluminador de luz UV.
5. DESENVOLVIMENTO
Os casos mais relevantes publicados na história da Entomologia Forense foram
referentes à primeira aplicação entomológica que ocorreu em 1235, na China
(BENECK, 2001), e o caso do corpo da criança oculto sobre o piso de uma
residência na França, onde Bergeret, em 1855, utilizou a Entomologia como
ferramenta auxiliar na elucidação do homicídio (PUJOL-LUZ ET AL., 2008).
No Brasil, Edgard Roquette Pinto, no Rio de janeiro e Oscar Freire, na Bahia
iniciaram estudos na área entomológica. Estes pesquisadores obtiveram ótimos
resultados, porém pela falta de atualização de dados taxonômicos, biológicos e
técnicos, além da grande diversidade biológica e restrições jurídicas e éticas tiveram
dificuldade no andamento desses estudos (PUJOL-LUZ ET AL., 2008).
As técnicas comumente utilizadas para estabelecer a IPM são as análises de
vestígios, observação externa do cadáver, do esfriamento do corpo, dos livores de
hipóstase, da rigidez cadavérica e de outros sinais que podem ser indicativos para
determinar a cronotanatognose (diagnóstico do tempo da morte). O entomologista
forense pode auxiliar na análise dos espécimes coletados na cena do crime, para
indicar o tempo post-mortem com maior precisão graças ao seu vasto conhecimento
de morfologia, biologia e ecologia de insetos necrófagos (VELHO ET AL., 2012).
A estimativa do IPM pelo estudo entomológico é efetuada segundo um de dois
métodos. Um dos métodos, geralmente utilizado nas primeiras fases do processo de
decomposição cadavérica, utiliza a informação relativa à estimativa da idade dos
estádios imaturos que aproveitam o cadáver como fonte de alimento. Os insetos
utilizados para esta estimativa são geralmente dípteros pertencentes às famílias,
Calliphoridae e Sarcophagidae. Uma vez que estes dípteros tenham depositado
ovos no cadáver, a estimativa da idade dos ovos, das larvas ou das pupas mais
antigos fornecerá um IPM mínimo (CATTS, 1990; ANDERSON, 1995).
O outro método baseia-se na progressiva sucessão de artrópodes encontrados
no cadáver (CATTS & GOFF, 1992) e no fato de cada fase da decomposição
cadavérica atrair seletivamente determinadas espécies. A análise desta sucessão
poderá, assim, fornecer informação sobre o tempo decorrido após a morte, com
estimativas dos intervalos mínimos e máximos de IPM (CAINÉ, 2010).
Como o método de identificação, ainda, alguns entomologistas coletam as ninfas
dos cadáveres em análise e as mantém em laboratório com armazenamento e
temperatura adequada até que se tornem pupa e eclodam, dando origem a novos
insetos adultos, para assim identifica-las pela morfologia e calcular o tempo
aproximado da morte (MARTINS et al., 2013). Nestes casos, para a confirmação
taxonômica das espécimes pode-se aplicar técnicas de Biologia Molecular, como a
amplificação específica de segmentos do genoma da suposta espécie, por PCR
(CAINÉ, 2010).
6. RESULTADOS
6.1.
Coleta e identificação morfológica
A coleta e identificação morfológica, realizada segundo os critérios da taxonomia
clássica de dípteros, foram efetuadas conforme descrito por MELO & VENTURA
(2013). Resumidamente, após a coleta e triagem por coloração, tamanho e
morfologia dos insetos necrófagos, foi realizado uma analise taxonômica e
identificaram-se espécimes das famílias Sarcophagidae, Calliphoridae e Muscidae.
6.2.
Extração de DNAg das espécimes de dípteros
Para a extração do DNA pelo método de salting-out foram utilizadas larvas,
pupas e insetos adultos das espécimes Sarcophagidae, Muscidae e Calliphoridae
devidamente identificados e acondicionados em álcool 70%. As amostras foram
ressuspensas em H2O Milli-Q estéril e analisadas por espectrofotometria para
verificar a concentração de DNA e sua pureza.
Foi possível obter amostras de DNA de todas as espécimes de insetos
analisados pela metodologia de salting-out, que é simples e de fácil manipulação.
Contudo, as amostras obtidas de insetos adultos e pupas revelaram um grau de
pureza inferior a 0,07 e quantidades inferiores à 40 microgramas de DNA. Por outro
lado, as amostras obtidas de larvas revelaram quantidades e grau de pureza
melhores do que as de pupa e de insetos adultos, conforme mostrado na tabela 1.
Tabela 1. Espectrofotometria de DNA de larvas de insetos necrófagos para
obtenção de quantidade de DNA e para avaliação do grau de pureza
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A identificação precisa da espécie de uma prova entomológica representa um
passo crucial na análise forense. Espécies taxonomicamente relacionadas podem
divergir substancialmente nas taxas de crescimento e hábitos ecológicos.
O diagnóstico da espécie baseado nas características morfológicas/anatômicas
do espécime pode revelar-se inútil na distinção de estádios imaturos, quer devido a
estes, não raras vezes, serem morfologicamente indistinguíveis, quer devido à
inexistência de chaves para a sua classificação. A utilização do DNA na
caracterização destes estádios encontra-se amplamente descrita na literatura
científica (Mazzanti et al, 2010; Cainé, 2010).
A técnica proposta nesse estudo para a obtenção do material genético, mostrouse válida para a extração das larvas de Chrysomya spp e Sarcophaga spp de 10mm
a 13mm. Provavelmente esse resultado foi acarretado pela quantidade de células e
proteínas que o imaturo possui na sua fase larval mais avançada.
A metodologia de salting-out que é simples, de fácil manuseio e de baixo custo
mostrou que é possível sua utilização na Entomologia Molecular Forense. Uma vez
obtida a amostra de DNA, várias outras técnicas moleculares podem ser aplicadas
na identificação de insetos imaturos ou espécies desmembradas.
8. FONTES CONSULTADAS
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