Universidade Federal de Juiz de Fora

Universidade Federal de Juiz de Fora
ROSANA DE PAIVA OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO EM RATAS WISTAR
PRENHES SUBMETIDAS AO ULTRA-SOM TERAPÊUTICO
DE 3 MHz.
JUIZ DE FORA
2007
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Universidade Federal de Juiz de Fora
Programa de Pós – Graduação em Saúde – Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Juiz de Fora
Curso de Mestrado em Saúde – Área de Concentração Saúde Brasileira
NÚCLEO DE PESQUISA EM TOXICOLOGIA REPRODUTIVA
ROSANA DE PAIVA OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO EM RATAS WISTAR
PRENHES SUBMETIDAS AO ULTRA-SOM TERAPÊUTICO
DE 3 MHz.
JUIZ DE FORA
2007
ROSANA DE PAIVA OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO EM RATAS WISTAR
PRENHES SUBMETIDAS AO ULTRA-SOM TERAPÊUTICO
DE 3 MHz.
Dissertação
de
Mestrado
apresentada
ao
Programa de Pós – Graduação em Saúde;
Faculdade de Medicina da Universidade Federal
de Juiz de Fora, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre em Saúde – área
de concentração Saúde Brasileira.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Martha de Oliveira Guerra
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Vera Maria Peters
JUIZ DE FORA
2007
Oliveira, Rosana de Paiva
Desenvolvimento embrionário em ratas Wistar prenhes
submetidas ao ultra-som terapêutico de 3 MHz / Rosana de Paiva Oliveira
orientador: Profa. Dra. Martha de Oliveira Guerra; coorientador: Profa. Dra. Vera Maria Peters. – 2007.
75 f.
Dissertação (Mestrado em Saúde)-Faculdade de Medicina,
Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2007.
1. Embriologia - Toxicologia. 2. Pesquisa com embriões - Animal.
I. Guerra, Martha de Oliveira. II. Peters, Vera Maria. III. Título.
CDU 611-013
ROSANA DE PAIVA OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO EM RATAS WISTAR PRENHES
SUBMETIDAS AO ULTRA-SOM TERAPÊUTICO DE 3 MHz.
Dissertação
de
Mestrado
apresentada
ao
Programa de Pós – Graduação em Saúde;
Faculdade de Medicina da Universidade Federal
de Juiz de Fora, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre em Saúde – área de
concentração Saúde Brasileira.
Aprovada em: 19 de Setembro de 2007.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Profa. Dra. Martha de Oliveira Guerra (Orientadora)
Universidade Federal de Juiz de Fora
___________________________________
Prof. Dr. Amaury Teixeira Leite Andrade
Universidade Federal de Juiz de Fora
______________________________________
Profa. Dra. Maria das Graças Ribeiro
Universidade Federal de Minas Gerais
Aos meus amados pais Cirenice e José Rubens.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
À minha amada mãe Cirenice, que mesmo de longe tenho certeza que sempre
guia meus passos.
Ao meu querido pai José Rubens, por estar sempre ao meu lado me
incentivado.
Ao meu marido Eli, pela compreensão das horas ausentes.
À Dra. Martha de Oliveira Guerra pela amizade, paciência, dedicação e carinho
durante a orientação.
À Dra. Vera Maria Peters, diretora do Centro de Biologia da Reprodução, pelo
fornecimento dos animais e pelo apoio durante o desenvolvimento das
atividades práticas.
Ao Prof. Dr. Mourão, pelo auxílio na estatística.
Ao Prof. Dr. Bernard, pelo auxílio durante o desenvolvimento prático.
Aos técnicos Evelise Rocha de Souza, Paulo Sérgio do Carmo e Rosemar
Rodrigues de Azevedo pelo apoio e atenção durante o desenvolvimento
prático.
Aos bolsistas Pedro, Marco Aurélio e Sâmia pela dedicação e amizade durante
o experimento prático.
À querida amiga Lú, pela ajuda nas horas mais difíceis.
As amigas Alessanda Louzada pela amizade, paciência, pela força e
encorajamento nas horas mais difíceis do Mestrado.
A todos os funcionários do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução, pelo
cuidado com os animais de experimento e pela atenção que me dispensaram.
Às Redes Mineiras de Bioterismo – Rede 2824/05 e 2827/05.– FAPEMIG.
A todos muitíssimo obrigada.
RESUMO
O ultra-som terapêutico tem amplo uso em diversas disfunções estéticas, cujo
tratamento é procurado por mulheres jovens que podem se expor à irradiação em
período precoce de gestação. Estudos sobre o efeito do ultra-som terapêutico na
gestação são antigos, apresentam resultados controversos, foram realizados com
metodologia nem sempre compatível com a clínica, com métodos e técnicas diversas,
nenhuma reproduzida em dois trabalhos semelhantes e poucos envolveram as fases
precoces de gestação. Os efeitos do ultra-som devem-se ao aumento da
permeabilidade por vasodilatação, alteração de difusão de íons, modificação da
posição de partículas intra e extracelular e alterações da configuração normal da
célula, as quais podem acarretar alteração na sua atividade. Durante a fase precoce
do desenvolvimento embrionário as células dependem de síntese protéica e de
diversas sinalizações processadas através de canais de sódio e potássio. Além disso,
microtúbulos e microfilamentos são extremamente importantes na morfogênese.
Portanto, a exposição ao ultra-som poderia acarretar lesões no concepto. No presente
estudo, avalia-se o efeito da exposição de ratas, no início da prenhez, ao ultra-som
terapêutico por ondas pulsadas e ondas contínuas. A metodologia consistiu em utilizar
ratas em dois períodos: pré-implantação (grupos A1, A2 e A3) e implantação (grupos
B1, B2 e B3). Os animais foram sedados e expostos ao ultra-som terapêutico de
freqüência 3 MHz e intensidade de 0,6 W/cm2 (SATA), por 5min. Os grupos A1 e B1
receberam ondas pulsadas; os grupos A2 e B2, ondas contínuas e os grupos A3 e B3
ultra-som simulado. As ratas foram eutanasiadas no 20o dia pós-inseminação. No
sangue coletado procedeu-se à análise do hematócrito, da hemoglobina, dos
leucócitos totais, do aspartato aminotransferase (AST/TGO), da alanina
aminotransferase (ALT/TGP), do colesterol, dos triglicérides e da creatinina.
Posteriormente, os animais foram submetidos à autópsia para identificação de lesões
de órgãos internos, remoção e pesagem de fígado, rins e ovários. Foram contados os
fetos vivos, malformados, mortos e reabsorvidos; seus cérebros, pulmões, fígados,
rins e placentas foram pesados. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA - uma
via - seguida de teste de Dunnett. Dados não paramétricos foram submetidos aos
testes do Qui quadrado ou Kruskall Walis. A hipótese nula foi rejeitada quando p<
0,05. Nas mães não foram observadas alterações de peso corporal e de órgãos, nem
da capacidade reprodutiva. Nos fetos o peso relativo do coração, fígado, pulmão e dos
rins aumentou no grupo A2; no grupo B2 o coração e o cérebro tiveram seu peso
aumentado, e o peso da placenta diminuiu no grupo B1. Em conclusão, no modelo
experimental usado, não foram observados efeitos tóxicos do ultra-som sobre o
organismo materno, exceto pelo aumento dos triglicerídeos. O ultra-som pulsado no
período de pré-implantação não alterou os fetos, mas as ondas contínuas induziram
aumento do peso relativo do coração, fígado, dos pulmões e rins. No período de
implantação, o ultra-som pulsado causou diminuição do peso da placenta, e as ondas
contínuas acarretaram aumento do peso absoluto do cérebro e do coração fetais.
Palavras-chaves: Ultra-som terapêutico; Gestação; Efeitos teratogênicos.
ABSTRACT
Therapeutic ultrasound is widely used in different aesthetic treatment by young
women, who can be irradiated during early gestation. Researches regarding the effects
of therapeutic ultrasound on gestation present controversial results. Methodologies
incompatible with clinical aspects are used and different methods and technics were
employed. However none of them were reproduced in two similar works and only a few
observed the early gestation, period when pregnancy is commonly unnoticed. The
ultrasound causes increased cell membrane permeability, alterations in ionic diffusion,
vasodilation; modifies the intra and extracellular particles position and alter the normal
configuration of cells, leading to functional alterations. During early embryo
development, cells depend upon protein synthesis and on sinalizations triggered by
sodium and potassium channels. Furthermore the participation of microtubules and
microfilaments on morphogenesis are extremely important. All this indicates the
exposition to ultrasound could cause lesions on the conceptus. In the present work the
effects of therapeutic ultrasound with pulsed and continous waves during early
pregnancy of the rat were assesed. The methodology consisted in rats exposition to
ultrasound in two periods: preimplantion (groups A1, A2 and A3) and implantation
(groups B1, B2 and B3). The animals were sedated and exposed to therapeutic
ultrasound, frequence of 3 MHz, intensity of 0.6 W/cm2 (SATA), during five minutes.
Groups A1 and B1 received pulsed waves, groups A2 and B2 received continuous
waves whereas the groups A3 and B3 were sham-exposed. The rats were
euthanatized by an overdose of anesthesic 20 days after insemination. The hematocrit,
hemoglobin, total leukocytes, and the level of aspartate aminotransferases, alanine
transaminase, cholesterol, triglycerides and creatinine were analysed. The dams
underwent authopsy for the identification of lesions in the internal organs and removal
and weghing of the liver, kidneys and ovaries. The number of resorptions, live, dead
and malformed fetuses were counted. The fetal brain, lungs, liver, kidneys and
placentae were weighed. The data were processed using the one-way analysis of
variance (ANOVA) followed by Dunnett's test. Non parametric data were analyse using
the Chi-Square or Kruskal-Wallis tests. The null hyphotesis was reject when p< 0.05.
No alterarions were detected on body and maternal organs’ weights, and reproductive
performance. The relative weights of heart, liver, kidneys and lungs were higher in
group A2. Heart and brain were heavier in group B2, and the weight of placentae
decreased in group B1. In conclusion, in the experimental model used, the ultrasound
showed no toxic effects on the maternal organism, except for the increased triglyceride
levels. The pulsed -wave ultrasound presented no fetal toxic effects on the
preimplantation period, but the continuous waves induced an increase on the relative
weights of heart, liver, kidneys and lungs. During the implantation period, the pulsedwave ultrasound caused a decrease in placentae weights, and the continuous waves
induced an increased on the aboslute weights of fetal brain and heart.
Key-words: Therapeutic ultrasound; Pregnancy; Teratogenic
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
FIGURAS
FIG. 1.
Peso corporal materno do experimento A.......................................
46
FIG. 2
Peso corporal materno do experimento B.......................................
51
Experimentos in vitro e in vivo, vias de acesso ao procedimento,
sedação/anestesia e tipo de onda em estudo sobre ultra-som e
gestação..........................................................................................
30
Experimentos com ultra-som em animais gestantes: dias, tempo,
intensidade e freqüência de exposição... .......................................
31
QUADRO
Quadro 1
Quadro 2
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Peso corporal e dos órgãos de ratas Wistar submetidas, durante os
dias 1- 5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas
(USC), ultra-som por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som
simulado (USS)...................................................................................
47
Tabela 2 Hemogramas e análises bioquímicas de ratas Wistar submetidas,
durante os dias 1-5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas
contínuas (USC), ultra-som por ondas pulsadas (USP) e ao ultrasom simulado (USS)...........................................................................
48
TabelaCapCapacidade
3
reprodutiva das ratas submetidas, durante os dias 1-5
pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultrasom por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado
(USS)...................................................................................................
49
Tabela 4 Peso corporal e de órgãos dos fetos das ratas submetidas, durante
os dias 1-5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas
(USC),
pulsadas
(USP)
e
ao
ultra-som
simulado
(USS)..................................................................................................
50
Tabela 5 Peso corporal e de órgãos das ratas submetidas, durante os dias 57 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultrasom por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado
(USS).................................................................................................
52
Tabela 6 Hemograma e análises bioquímicas das ratas submetidas, durante
os dias 5-7 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas
(USC), ultra-som por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som
simulado (USS)........................................................................
53
Tabela 7 Capacidade reprodutiva das ratas submetidas, durante os dias 5-7
pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultrasom por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado
(USS)................................................................................................
54
Tabela 8 Peso corporal e de órgãos dos fetos das ratas submetidas, durante
os dias 5-7 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas,
pulsadas e ao ultra-som simulado..................................
55
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................
12
2. HIPÓTESE.........................................................................................
14
3. OBJETIVOS.......................................................................................
15
4. REVISÃO DE BIBLIOGRÁFICA........................................................
16
4.1 ULTRA-SOM....................................................................................
16
4.1.1 Generalidades.............................................................................
16
4.1.2 Ultra-som terapêutico....................................................................
19
4.1.3 Efeitos biofísicos do ultra-som.......................................................
20
4.1.4 Efeito mecânico.............................................................................
21
4.1.5 Efeito térmico.................................................................................
23
4.1.6 Efeitos terapêuticos do ultra-som..................................................
23
4.1.7 Contra-indicações ao ultra-som terapêutico .................................
26
4.1.8 Ultra-som terapêutico: efeitos na reprodução...............................
28
4.1.9 Estudos experimentais sobre os efeitos do ultra-som na
gestação................................................................................................
28
4.2 Desenvolvimento Embrionário Precoce...........................................
32
4.2.1. Desenvolvimento embrionário: fase de pré-implantação.............
33
4.2.2. Desenvolvimento embrionário: fase de implantação...................
36
5. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................
41
6. RESULTADOS..................................................................................
46
6.1 Experimento A: Tratamento do dia 1 a 5 pós - inseminação...........
46
6.2 Experimento B: Tratamento do dia 5 a 7 pós - inseminação...........
51
7. DISCUSSÃO......................................................................................
56
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................
65
1. INTRODUÇÃO
Ultra-som é definido como um conjunto de vibrações mecânicas,
essencialmente as mesmas das ondas sonoras, mas com uma freqüência
acima da capacidade de audição humana. Na medicina, é utilizado para a
obtenção de imagens corporais; na área odontológica, como instrumento para
remoção de cáries, clareamento dos dentes (BERNARDES et al., 2007) e, na
fisioterapia, na especialidade dermato-funcional para tratamento de reabilitação
das disfunções estéticas, reparo de tecidos lesados, no pré-operatório de
lipocirurgias, na cicatrização de feridas cirúrgicas e não cirúrgicas e outras
disfunções estéticas (ARAUJO et al., 2003; GUIRRO; GUIRRO, 2004;
ULLMANN; REIS; STEIBEL, 2004; GONÇALVES et al., 2005; BORGES,
2006).
Tem aumentado a procura por tratamentos estéticos com a
finalidade de diminuir lipodistrofias gelóides, particularmente por mulheres mais
jovens (GUIRRO; GUIRRO, 2004; BORGES, 2006), que, por estarem em plena
fase reprodutiva, correm o risco de serem expostas à irradiação por ultra-som
terapêutico na fase precoce da gestação (15 primeiros dias).
Quando o concepto é lesado nesta ocasião, de uma maneira geral,
ocorre aborto precoce, que a mulher raramente percebe, exceto por uma
hemorragia vaginal freqüentemente confundida com alguma alteração da
menstruação (SCIALLY, 1992).
13
Os estudos visando ao efeito do ultra-som sobre a gestação, além
de apresentarem resultados controversos, foram realizados com metodologias
diferentes, com intensidade e freqüências diversas (CHILD et al, 1984;
BARNETT; WALSH; ANGLES, 1990; NORTON et al., 1991; HANDE; DEVI,
1992; VORHESS, 1994; JENSH et al., 1995) de tal forma que embora haja
contra-indicação para seu uso durante a gestação, não existem dados
científicos reproduzíveis e suficientes para afirmar ou negar sua contraindicação.
Diante do exposto, no presente projeto, pretende-se avaliar o
desenvolvimento fetal em ratas, expostas, no início da prenhez, ao ultra-som
terapêutico por ondas pulsadas e ondas contínuas.
2. HIPÓTESE
A exposição ao ultra–som (pulso pulsado ou contínuo) altera o
desenvolvimento embrionário precoce de ratos e interfere no desenvolvimento
fetal.
3. OBJETIVOS
3.1 Observar o desenvolvimento dos fetos das ratas expostas, do
primeiro ao quinto dia de prenhez, ao ultra-som terapêutico – ondas pulsadas
ou contínuas.
3.2 Observar o desenvolvimento dos fetos das ratas expostas, do
quinto ao sétimo dia de prenhez, ao ultra-som terapêutico – ondas pulsadas ou
contínuas.
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Ultra-Som:
4.1.1 Generalidades
Ondas mecânicas são as que se propagam em meios deformáveis
ou elásticos. Elas surgem de uma vibração numa região de meio elástico, a
qual é transmitida para as partículas adjacentes, que vibram e transferem,
novamente, parte da energia para outra partícula, e assim sucessivamente até
o término da energia da onda.
A onda é um transferidor de energia, e as ondas sonoras envolvem o
movimento vibratório de moléculas, de modo que há uma velocidade
característica de propagação da onda para cada meio em particular,
dependendo da relação entre a densidade e elasticidade do meio. Esta relação
é denominada impedância acústica do meio (LOW; REED, 2001).
O ultra-som é produzido por uma corrente alternada que flui através
de cristal pizoelétrico, como quartzo, titanato de bário ou zirconato de chumbo,
alojado em um transdutor. A vibração nestes materiais resulta na produção
mecânica de ondas sonoras de alta freqüência (STARKEY, 2001).
17
Quanto maior a freqüência com que as ondas ultra-sônicas são
emitidas por um dado transdutor, menos o feixe sonoro irá divergir; com isso há
uma vibração maior das moléculas dos tecidos e, por conseguinte, uma maior
absorção, pois o feixe estará incidindo em ângulo reto com menos refração e
reflexão (BASS; SHIELDS, 1998; ZISKIN; McDJARMID; MICHLOVITZ,1999).
As moléculas de todas as matérias se encontram em movimento
aleatório constante durante a emissão de ondas sonoras, e quanto maior o
movimento das moléculas maior é a temperatura gerada (LOW; REED, 2001;
STARKEY, 2001). Em geral, a energia percorre um caminho em linha reta.
Entretanto, quando percorre qualquer meio seu trajeto é influenciado pelas
alterações de densidade do meio. A energia que atinge uma interface entre
duas densidades diferentes pode ser refletida, refratada ou absorvida pelo
material, ou pode continuar a atravessar o material não sofrendo mudança.
Reflexão:
A onda pode se refletir completamente, quando toda a energia é
impedida de entrar na próxima camada, ou parcialmente, quando parte da onda
é refletida e outra parte penetra no tecido. Tecidos moles e água refletem
apenas 0,2 % das ondas emitidas, ou seja, 98,8% da onda penetram nesses
meios (STARKEY, 2001; LOW; REED, 2001; GUIRRO; GUIRRO, 2004).
18
Refração:
Ocorre devido a diferenças na impedância acústica (resistência) dos
meios. Quando a energia deixa uma camada densa e entra em uma menos
densa, sua velocidade aumenta. Se o feixe incide na interface dos meios de
forma não normal, o feixe que passa pelo segundo meio não continua em linha
reta, pois muda de direção na interface por causa das velocidades diferentes
nos dois meios (STARKEY, 2001; LOW; REED, 2001).
Absorção:
O ultra-som aumenta o movimento das moléculas causando
vibrações e colisões moleculares, o que resulta em calor. Desse modo a
energia cinética é convertida em energia térmica à medida que passa pelo
tecido. A energia diminui exponencialmente com a distância da fonte, pois uma
proporção fixa dela é absorvida a cada unidade de distância, de modo que a
quantidade restante será sempre menor que a inicial (LOW; REED, 2001). A
absorção de energia sonora é maior nos tecidos com quantidades maiores de
proteína e menor conteúdo de água (FRIZZEL; DUNN, 1984).
Atenuação:
É proporcional à absorção e dependerá também da reflexão e
refração das interfaces (LOW; REED, 2001). Quanto mais alta a freqüência,
19
maior é a atenuação do feixe quando este passa pelos tecidos moles
(GUIRRO; GUIRRO, 2004).
4.1.2 Ultra-som terapêutico
O ultra-som terapêutico é um movimento ondulatório na forma de
onda mecânica de alta freqüência que transmite energia através da vibração de
partículas do meio (TER HAAR, 1987).
Dependendo da freqüência do ultra-som, a intensidade do feixe
ultra-sônico pode atingir diferentes profundidades e sofrer maior atenuação da
intensidade. A taxa de absorção e, conseqüentemente, a atenuação aumentam
conforme aumenta a freqüência do ultra-som, por causa da fricção das
moléculas que as ondas devem superar para passar para o próximo meio,
através dos tecidos (KITCHEN; PARTRIDGE, 1990). Sendo assim, há menos
energia para penetrar nos tecidos (ZISKIN; McDJARMID; MICHLOVITZ, 1999).
O feixe de 1MHz apresenta maior divergência que o de 3 MHz
(ZISKIN;
McDJARMID;
MICHLOVITZ,1990).
Logo,
freqüências
maiores
apresentam feixes de ondas com divergência menor, levando a uma absorção
maior pelas camadas mais superficiais do tecido, com penetração mais
superficial (TER HAAR, 1987).
O feixe ultra-sônico de 1MHz atinge profundidade média de 30mm, e
o de 3MHz aproximada de 65mm (Wadsworth; Chanmugan,1980). A
intensidade
de
freqüência
1MHz
pode
ser
reduzida
à
metade
em
20
aproximadamente 48mm de gordura ou 9mm de músculo, ao passo que um
feixe de 3 MHz pode ter a sua intensidade reduzida pela metade em
aproximadamente 16mm de gordura ou 3mm de músculo (MacDiarmid; Burns,
1987).
4.1.3 Efeitos biofísicos do ultra-som
O ultra-som é uma modalidade de onda de penetração profunda,
capaz de produzir alterações nos tecidos.
Na prática clínica do ultra-som
terapêutico há dois regimes de pulso comumente empregados: o contínuo e o
pulsado. Conforme o regime de pulso selecionado, prevalecem mecanismos de
efeitos térmicos ou não térmicos (STARKEY, 2001).
As alterações fisiológicas dentro dos tecidos, associadas
à
aplicação do ultra-som, podem ser agrupadas em duas classes, mas há
sobreposições entre elas: efeitos mecânicos (alterações dentro dos tecidos,
resultantes do efeito mecânico da energia sonora) e efeitos térmicos
(alterações dentro dos tecidos, como um resultado direto da elevação da
temperatura do tecido, promovida pelo ultra-som). Estes efeitos não são
restritos a cada pulso selecionado. Os dois tipos de efeitos ocorrem, porém a
proporção e a amplitude de cada um deles dependem do pulso selecionado e
da intensidade de saída da onda (STARKEY, 2001).
A produção dos efeitos biofísicos depende da forma como são
emitidas as ondas ultra-sonoras (LOW; REED, 2001). Quanto maior for o ciclo
21
de fornecimento, maiores serão os efeitos térmicos; quanto maior for a
intensidade de saída, maior será a grandeza dos efeitos.
4.1.4 Efeito mecânico:
Como efeitos mecânicos do ultra-som terapêutico podemos citar:
a.
Ondas estacionárias - resultam da sobreposição de ondas
refletidas sobre as ondas, incidentes no tecido. Esse efeito pode
levar à lesão tecidual e é evitado pela movimentação contínua do
cabeçote durante o tratamento (DYSON, 1987).
b.
Cavitação - consiste na formação de pequenas bolhas
gasosas no interstício, graças à vibração produzida pela energia
ultra-sonora em um meio contendo líquido - sangue ou fluidos dos
tecidos -, quando estimulado acusticamente (FLINT; SUSLICK, 1991;
HALLOW et al., 2006). A cavitação engloba formação, crescimento,
colapso e efeitos físicos, químicos e biológicos, associados às bolhas
gasosas (FRIZZEL; DUNN, 1984).
Quando a onda sonora é de intensidade moderada, as bolhas de
gás podem permanecer intactas por muitos ciclos e vibram,
produzindo alterações reversíveis na permeabilidade da membrana
celular - cavitação estável (MORTIMER; DYSON, 1988). Este tipo de
cavitação é responsável, em parte, pela estimulação do reparo de
22
tecidos, através de modificações na permeabilidade da membrana
celular para os íons de cálcio (KITCHEN; BAZIN, 1998) e sódio
(YOUNG; DYSON, 1989).
Ocorrendo
ondas
com
intensidade
elevada
e
ondas
estacionárias, as bolhas entram em colapso, liberando grande
quantidade de energia,
causadora de compressão violenta das
bolhas durante o pico de alta pressão, seguida de colapso total. A
compressão violenta pode levar à formação de radicais livres
altamente reativos (YOUNG, 2003), que podem ser lesivos,
danificando
tecidos,
células
sangüíneas
e
outras
estruturas
biológicas. Esse efeito é denominado cavitação transitória (TER
HAAR, 1987; YOUNG, 2003; STARKEY, 2001).
c. Correntes acústicas - referem-se ao movimento unidirecional
do fluído no campo do ultra-som (YOUNG, 2003). Exercem
sobrecarga viscosa sobre a membrana das células, aumentando sua
permeabilidade. Logo, podem alterar a taxa de difusão de íons,
causando alterações terapeuticamente úteis, como o aumento na
captação de cálcio pelas células (MORTIMER; DYSON, 1988). Esta
alteração é de grande importância, já que o cálcio, como “segundo
mensageiro celular”, pode ter efeito acentuado no aumento da
produção e liberação de fatores que contribuem para o processo de
reparo tecidual. Dessa forma, o ultra-som terapêutico tem o potencial
23
de acelerar a resolução normal da inflamação, desde que o estímulo
inflamatório seja removido (DYSON, 1982, 1987).
4.1.5 Efeito térmico:
As
vibrações
sônicas
do
ultra-som
terapêutico
produzem
micromassagem nos tecidos, gerando calor por fricção (HOOGLAND, 1986). E
por esse meio favorece a cicatrização, alivia a dor, reduz a rigidez articular e o
espasmo muscular e aumenta o fluxo sangüíneo local (LOW; REED, 2001;
YOUNG, 2003). Para se obterem tais efeitos, a temperatura precisa ser
mantida entre 40º a 45º C por, pelo menos, cinco minutos (DeLISA; GANS,
2002).
4.1.6 Efeitos terapêuticos do ultra-som
a) Em processos inflamatórios
Após uma lesão, ocorrem vários eventos celulares e químicos nos
tecidos moles (YOUNG, 2003). O processo de reparo de uma lesão pode ser
dividido em três fases (CLARK, 1990), todas elas influenciáveis pela terapia do
ultra-som (DYSON, 1987).
24
(I) Inflamação:
Os neutrófilos são os primeiros a entrar no leito da ferida, com a
função de limpar o local de partículas estranhas como bactérias e restos de
tecidos lesados (YOUNG, 2003). Em seguida migram os macrófagos, que
fazem a fagocitose e produzem, no local, fatores que induzem a formação do
tecido de granulação (LEIBOVICH; ROSS, 1975). A suave vibração das
moléculas líquidas, produzidas pelo ultra-som nos tecidos, pode aumentar a
taxa de fagocitose e o movimento de partículas e células (EVANS, 1980). Os
efeitos da cavitação estável e da corrente acústica parecem aumentar a difusão
do cálcio através da membrana celular. Como segundo mensageiro celular, o
cálcio pode induzir aumento, produção e liberação de fatores que facilitam a
cicatrização, como a histamina dos mastócitos (DYSON, 1990; YOUNG, 2003).
(II) Proliferação/ Formação de tecido de granulação
Esta fase se sobrepõe ao final da fase inflamatória, iniciando, dentro
de três dias após a lesão, quando ocorre uma intensa proliferação de
fibroblastos e de células endoteliais, que formam os novos vasos sangüíneos
(GUIRRO; GUIRRO, 2004). Nesta fase, a lesão é preenchida com células,
principalmente, macrófagos e fibroblastos. Também ocorre angiogênese e
formação de matriz de tecido conjuntivo, composta de fibronectina, ácido
hialurônico e colágeno tipo I e II (YOUNG, 2003). Segundo Mummery (1987)
apud Dyson (1987) e Ramirez (1997), a cavitação estável com baixa
intensidade favorece o influxo de cálcio em fibroblastos expostos ao ultra-som.
25
O autor comenta que este processo se deve à alteração temporária na
permeabilidade da membrana celular, e o influxo de cálcio sinaliza que
ocorreram alterações extracelulares, sendo, portanto, necessário uma resposta
reparadora.
Os fibroblastos, quando expostos à energia ultra-sônica, em níveis
terapêuticos, podem sintetizar mais colágeno, aumentando a força de tensão
dos tecidos moles (HARVEY et al, 1992). Em ratos, a irradiação de feridas por
energia de baixa intensidade abreviou a resolução do processo inflamatório
(GUIRRO; FERREIRA; GUIRRO, 1995; YOUNG; DYSON, 1989).
(III) Remodelamento:
Pode continuar por meses ou anos após a fase de proliferação. O
colágeno do tipo III é substituído por colágeno tipo I, em resposta ao estresse
mecânico a que o tecido está sendo submetido. O processo continua até o
colágeno I adquirir características semelhantes às do tecido antes da lesão,
porém as características do tecido cicatricial nunca serão idênticas às do tecido
não lesado (GUIRRO; GUIRRO, 2004).
Quando o ultra-som é aplicado, logo após a lesão, pode melhorar
tanto a aparência estética, como as propriedades mecânicas do tecido
cicatricial resultante (YOUNG, 2003). Experimentalmente foi observado que o
uso do ultra-som (três vezes / semana – 0.1W / cm2) em lesões ocorridas há
duas semanas, levou ao aumento da força tênsil e da elasticidade (WEBSTER,
26
1980 apud KITCHEN, 2003). No tratamento de lesões por incisão na fase
inflamatória, aumentou também a força tênsil e o conteúdo de colágeno (BYL et
al., 1992; 1993).
O tratamento com ultra-som, durante a fase inflamatória de reparo,
aumenta a quantidade de colágeno depositado na lesão e estimula a deposição
de colágeno com características mais semelhantes às da pele não lesada que
nos controles não tratados (DYSON, 1981).
b) Na Fonoforese
A fonoforese é a aplicação tópica de agentes farmacológicos através
da camada externa da pele (estrato córneo), dirigida pelo ultra-som para o
tecido subjacente. Vários mecanismos têm sido sugeridos para explicar o
aumento da penetração das drogas com auxílio do ultra-som (SKAUEN, 1984;
FANG et al., 1999), entre eles o aumento da temperatura e da cavitação, bem
como a pressão de radiação (TYLE; AGRAWALA, 1989; GUIRRO; GUIRRO,
2004).
4.1.7 Contra-indicações ao ultra-som terapêutico:
O ultra-som pode ser uma terapia efetiva ou um risco potencial
dependendo do modo como é aplicado e da área irradiada, mas muitas das
contra-indicações não se baseiam em qualquer evidência científica:
27
-
Diretamente sobre o coração – pela possibilidade de
modificação no potencial de ação e suas propriedades contráteis.
-
Diretamente sobre tumores – pela possibilidade de induzir
crescimento e/ou metastáses.
-
Globo ocular – pela chance de produzir cavitação, podendo
ocorrer dano à retina.
-
Diretamente sobre endopróteses – pelo alto coeficiente de
absorção do cimento acrílico, e dos componentes à base de polímeros
poderiam sofrer ação dos efeitos térmicos.
-
Diretamente sobre implantes metálicos – podem aumentar
o índice de reflexão do feixe ultra-sônico.
-
Processos infecciosos – risco de disseminação pelo
aumento da permeabilidade vascular.
-
Tromboflebites e varizes – pelo risco de promover
-
Sobre o útero gravídico – pela possibilidade da cavitação
embolias.
do líquido amniótico e da ocorrência de malformações no feto.
28
4.1.8 Ultra-som terapêutico: efeitos na reprodução
4.1.8.1 Útero gravídico
As contra-indicações do uso do ultra-som terapêutico sobre o útero
gravídico prendem-se ao fato de o ultra-som produzir cavitação e elevação da
temperatura (DELISA; GANS, 2002); interferir com proliferação de células
(reparo dos tecidos), com risco para as células embrionárias/fetais em
desenvolvimento (LOW; REED, 2001) e, dessa forma, induzir a malformações
(GUIRRO; GUIRRO, 2004). De fato, Shoji, Murakami, Shimizu (1975), relatam
que a intensidade do ultra-som, dentro da escala terapêutica, pode estar
associada a anomalias congênitas em camundongos. McLEOD; FOWLOW
(1989), relataram agenesias sacrais, microcefalia e atraso no desenvolvimento,
deficiência no crescimento intrauterino e pós-natal em recém - nascido de uma
mulher submetida a 18 aplicações de ultra-som terapêutico, do 60 ao 290 dia de
gestação, para tratar uma bursite no íleo esquerdo.
4.1.9 Estudos experimentais sobre os efeitos do ultra-som na
gestação
Estudos sobre os efeitos do ultra-som durante a gestação foram
realizados em camundongos e ratos. Alguns indicam a ocorrência de mortes
(SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU, 1975); alterações embrionárias in vitro
(BARNETT; WALSH; ANGLES, 1990; AKAMATSU, 1981); retardo de
crescimento fetal (HANDE; DEVI,1992; SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU, 1975),
29
decréscimo do peso (HANDE; DEVI,1992). Já outros não relatam alteração no
desenvolvimento embrionário ou fetal (McCLAIN; HOAR; SALTZMAN, 1972;
CHILD; CARSTENSEN; DAVIS, 1984; KIMMEL et al., 1983; KIMELL et al.,
1989; ATKINSON; WILLIAMS, 1990; MARGUILES et al., 1991; NORTON et
al.,1991; VORHESS et al., 1994; FISHER et al., 1994).
São encontradas diversas abordagens na metodologia utilizada para
os estudos sobre ultra-som e gestação, tanto no que se refere à intensidade e
às freqüências, quanto ao período de desenvolvimento ao qual se expôs o
animal prenhe à terapêutica (CHILD; CARSTENSEN; DAVIS, 1984; BARNETT;
WALSH; ANGLES, 1990; NORTON et al., 1991; HANDE; DEVI, 1992;
VORHESS, 1994; JENSH et al., 1995). Alguns estudos relatam a exposição por
emissão das ondas via abdominal, com anestesia (ABRAHAM; ZISKIN;
HEYNER,
1989;
ATKINSON;
SIBLEY;
WILLIAMS,
1990;
CHILD;
CARSTENSEN; DAVIS, 1984; HANDE; DEVI, 1992; JENSH et al., 1995;
KIMMEL et al., 1989; MARGULIES et al., 1991; McCLAIN; HOAR; SALTZMAN,
1972; NORTON et al., 1990; NORTON et al., 1991; O’ BRAIN; STRATMEYER,
SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU, 1975) e outros sem anestesia prévia
(BARNETT; WALSH; ANGLES, 1990; FISHER et al., 1994; VORHEES et al.,
1991; VORHESS et al., 1994).
Durante a aplicação das ondas, ocorreram casos em que as ratas
eram treinadas na água para permanecerem imóveis (VORHEES et al., 1991;
VORHESS et al., 1994) em outros, eram imobilizadas (BARNETT; WALSH;
ANGLES, 1990; FISHER et al., 1994). As modulações do aparelho em relação
30
ao tempo, à freqüência e à intensidade de exposição, nos estudos relatados,
são diversas. O tempo de exposição foi variado de dois minutos (O’ BRIEN;
STRATMEYER, 1975) até 5 horas (SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU, 1975), o
período de gestação variou muito e foram testadas tanto ondas pulsadas como
contínuas.
O QUADRO 1 mostra algumas das abordagens usadas no estudo do
ultra-som na gestação
QUADRO 1. Experimentos in vitro e in vivo, vias de acesso ao procedimento,
sedação/anestesia e tipo de onda em estudo sobre ultra-som e gestação.
Experimento
Autores
in vivo
1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 18, 19
in vitro
2, 4, 8
Exposição direta do corno uterino
1, 3, 5, 14
Via abdominal
6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 17, 18, 19
Com anestesia
1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17
Sem anestesia
4, 6, 18, 19
Onda contínua
1, 3, 7, 9, 12, 13, 16, 17, 18, 19
Onda pulsada
2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 14
Autores: ABRAHAM; ZISKIN; HEYNER (1989)1; AKAMATSU (1981)2;
ATKINSON; SIBLEY; WILLIAMS (1990)3; BARNETT; WALSH; ANGLES
(1990)4; CHILD; CARSTENSEN; DAVIS (1984)5; FISHER et al. (1994)6;
HANDE; DEVI (1992)7; IWABE (1993)8 ;JENSH et al. (1995)9; KIMMEL et al.
(1983)10; KIMMEL et al. (1989)11; MARGULIES et al. (1991)12; McCLAIN;
HOAR; SALTZMAN (1972)13; NORTON et al.(1990)14; NORTON et al.(1991)15;
O’ BRIEN16; STRATMEYER, 1975; SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU (1975)17;
VORHEES et al. (1991)18; VORHESS et al. (1994)19.
No QUADRO 2 estão resumidos os dias de prenhez, a duração da
exposição, a freqüência e a intensidade relatados em experimentos obtidos na
literatura.
31
QUADRO 2. Experimentos com ultra-som em animais gestantes: dias, tempo,
intensidade e freqüência de exposição.
Dias de prenhez
Tempo de
exposição
Freqüência
Intensidade de
exposição
3 e 6 (5)
15 min (4, 8, 18)
1 MHz (1, 10, 11, 12)
0 a 1.0 mW/cm2 (9)
4 a 19 (6, 7, 18)
2.5 min (5)
1.1 MHz (3)
1.5 ou 15 mW/cm2
4 a 20 (19)
3 min (3)
2 MHz (2, 8)
2.5 mW/cm2 (9)
8 (10, 11, 17)
5 min (5, 12)
2.25 MHz (17)
10 mW/cm2 (13)
8 a 10 e 11 a13 (13) 10min (1, 7, 10, 11, 19)
2.5 MHz (5, 13, 14, 15)
40 mW/cm2 (17)
9,5 (4)
12 min (6)
3 MHz (6, 18, 19)
65 mW/cm2 (7)
10 ( 12 )
20 min (15)
3.14 MHz (4)
120 mW/cm2 (8)
11 a 13 (13)
30 min (4, 13, 14, 15)
3.5 MHz (7)
13 (16)
35 min (9)
5 MHz (9)
14 e 15 (15)
2horas (13)
15 e 16 (14)
5 horas (17)
15, 17 e 19 (9)
60 min (2)
0; 0.05; 0.050 ou
1.0W/cm2 (11)
0; 2; 10; 20; 30
W/cm2 (19)
0.1; 0,2 ou 30.0
W/cm2 (18)
0.65; 1.0 ou 1.8
W/cm2 (2)
0.78 w/ cm2 (14 e 15)
15 a 20 (1)
0; 2.0 ou 30 W/cm2
(6)
15, 18, 21 e 22(3)
(5)
1 W/ cm2 (3)
3 W/ cm2 (2)
15 a 1.2 W/cm2 (4)
16 a 2.5 W/cm2 (12)
Autores: ABRAHAM; ZISKIN; HEYNER, (1989)1; AKAMATSU, (1981)2;
ATKINSON; SIBLEY; WILLIAMS, (1990)3; BARNETT; WALSH; ANGLES,
(1990)4; CHILD; CARSTENSEN; DAVIS, (1984)5; FISHER et al., (1994)6;
HANDE; DEVI, (1992)7; IWABE, (1993)8; JENSH et al., (1995)9; KIMMEL et al.,
(1983)10; KIMMEL et al., (1989)11; MARGULIES et al., (1991)12; MCCLAIN;
HOAR; SALTZMAN, (1972)13; NORTON et al.,(1990)14; NORTON et
al.,(1991)15; O’ BRIEN; STRATMEYER16; SHOJI; MURAKAMI; SHIMIZU,
(1975)17; VORHEES et al., (1991)18; VORHESS et al., (1994)19.
32
Acompanhando-se os procedimentos seguidos pelos autores, como
assinalado pelas células com mesmo fundo, colocadas no Quadro 2, é possível
observar que não existem dois experimentos semelhantes, e não há
reprodutibilidade dos dados. Isso faz com que os resultados relatados não
permitam avaliar com segurança os riscos do ultra-som para a gestação.
4.2 DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRECOCE
A compreensão do modelo experimental usado no presente trabalho
exige alguns conhecimentos básicos sobre o desenvolvimento embrionário
inicial em mamíferos.
O desenvolvimento dos mamíferos inicia-se com os processos de
fertilização, nos quais ocorrem eventos moleculares coordenados. Estes
eventos continuam com as fases de transporte e segmentação do embrião pelo
trato
genital
feminino,
sua
implantação
no
útero,
a
gastrulação,
a
organogênese, o crescimento e a maturação dos órgãos e sistemas. A
completa maturação de alguns órgãos e sistemas somente se faz após o
nascimento.
E a fertilização, neles, ocorre na ampola da tuba uterina. Com a
penetração do espermatozóide, o ovócito é ativado, o segundo corpúsculo
polar é produzido, os pronúcleos masculino e feminino são formados, o
material genético dos dois gametas funde-se e forma-se o zigoto, que iniciará
diferentes eventos morfológicos e bioquímicos. Iniciam-se as segmentações
33
sucessivas e o transporte pela tuba uterina até o útero, onde o blastocisto se
implanta dando início à embriogênese (GUERRA; PETERS, 1999; PARIA;
SONG; DEY, 2001; ROSSI-FERRAGUT et al., 2001; RONDEROS, 2006).
4.2.1. Desenvolvimento embrionário: fase de pré-implantação.
Após a fertilização, os embriões migram pela tuba uterina, enquanto
passam pelos primeiros estágios da clivagem. É a fase de pré-implantação,
que acontece nos primeiros sete dias de gestação em humanos e nos
primeiros quatro a cinco dias, em roedores. Divisões subseqüentes vão se
seguindo e originando células-filha denominadas blastômeros (PARIA; SONG;
DEY, 2001; DUMM, 2006).
Em ratos a fase de zigoto a dois blastômeros ocorre na ampola da
tuba uterina, no primeiro dia de prenhez. Enquanto o embrião transita pela tuba
uterina, no segundo dia atinge a fase de dois blastômeros e, entre o segundo e
o quarto dia, ocorrem as divisões subseqüentes até quatro células. A fase de
mórula é atingida no quarto dia, também na tuba uterina (CARSON;
NAFTOLIN, 1982; SINGH et al., 1993; SOUZA et al., 1997), embora SINGH et
al. (1993) tenham detectado alguns blastocistos precoces, nesse mesmo dia.
Na fase de mórula, os blastômeros se alinham, apertando-se uns
contra os outros para formar uma esfera compacta de 16 blastômeros (MOLEY,
1999;
O’RAHILLY,
compactação,
ocorre
MÜLLER,
quando
2001).
as
Este
células
fenômeno,
reorganizam
denominado
as
organelas
34
intracitoplasmáticas, tornam-se polarizadas, trocam a forma esférica pela
cilíndrica e aderem-se umas às outras mais firmemente por junções “tights”.
Algumas células localizam-se no centro da estrutura, e as demais células as
circundam. As células centrais darão origem ao maciço celular interno (MCI),
do qual se origina o embrião, e as externas, às células do trofectoderma, fonte
de origem da placenta (PARIA; SONG; DEY, 2001; O’RAHILLY, MÜLLER,
2001).
Na mórula, as células do MCI começam a secretar fluído e, logo aos
64 blastômeros, estabelece-se o início de uma cavidade, chamada de
blastocele, identificando-se aí a fase de blastocisto inicial (DUMM, 2006). Esta
mudança coincide com a entrada do blastocisto na cavidade uterina (CARSON;
NAFTOLIN, 1982).
As fases iniciais do desenvolvimento embrionário (até a terceira
divisão celular) são controladas pelo genoma materno; em ratos corresponde
ao estágio de duas células e em humanos a 4-8 células. Desta fase em diante,
o controle passa a ser efetuado pelo genoma do embrião (LAURINCK et al.,
2000; PARIA; SONG; DEY, 2001), que começa a produzir sinais moleculares,
recebidos pelas células epiteliais da tuba uterina, as quais respondem
produzindo secreções específicas necessárias ao desenvolvimento do embrião.
Assim, o controle das clivagens e a formação da mórula e do blastocisto estão
estreitamente correlacionadas a fatores produzidos pelo próprio embrião e pelo
epitélio tubário (KOBAYASHI et al., 1997).
35
Trânsito do embrião pela tuba uterina e útero
De acordo com MOORE e CROXATTO (1988), o transporte
tubário não se faz de maneira regular; o zigoto permanece algum tempo na
região da ampola, aprisionado pelo fechamento da junção istmo - ampolar.
Depois de algumas horas ou dias (no ser humano 95% do tempo de transporte
é gasto nesta região, e no camundongo 25%), a junção istmo - ampolar abre-se
e deixa passar o (s) zigoto (s) para a região do istmo. Em seguida, fecha-se de
novo e parece só reabrir na próxima ovulação. CROXATTO et al. (1991)
afirmam que este fato parece ser importante para o transporte mecânico dos
embriões, como também por isolá-los num ambiente especial, provavelmente
necessário para o seu desenvolvimento. Na etapa seguinte, quando já ocorrem
as clivagens sucessivas, o embrião fica no istmo por um tempo variável até
que, com a abertura da junção útero - tubária, passa para o útero, onde
ocorrerá a implantação.
As contrações circulares, e progressivas, das fibras musculares lisas
da tuba uterina são importantes para o encaminhamento do embrião em
direção ao útero (HARPER, 1994). Hormônios interferem na contratilidade
tubária: ela fica aumentada sob efeito do estrogênio e retardada, pela presença
de progesterona (CARSON; NAFTOLIN, 1982; FORCELLEDO; CROXATTO,
1988; VINIJSAMUN et al., 1990; CROXATTO et al., 1991). Em ratas, níveis
elevados de estrogênio retardam o crescimento de embrião em fase de préimplantação, e ele pode, inclusive, sofrer degeneração (TONG et al., 2000).
36
O embrião de rata produz grande quantidade de prostaglandina E1,
que diminui a contratilidade das fibras musculares, sugerindo que o embrião
pode influir no seu transporte (VIGGIANO; CEBRAL; GIMENO, 1994 apud
HARPER, 1990; VIGGIANO et al., 1992).
4.2.2. Desenvolvimento embrionário: fase de implantação.
A implantação do blastocisto é uma seqüência de interações
bioquímicas e físicas entre blastocisto e útero que conduz à formação de um
contato íntimo e especializado entre trofoblasto e endométrio (ACOSTA, 1994;
LEE; DeMAYO, 2004). Implica também processos que impedem a rejeição
materna. Já foi observado, em seres humanos, que o sucesso da implantação
está correlacionado a níveis de citocina TH1 baixos e TH2 altos (LIM et al.,
2000) e, em camundongos, a expressão materna do fator inibidor de leucemia
é crucial para a sua implantação (STEWART et al., 1992; TSAI et al., 1999).
A implantação só ocorre quando blastocisto e endométrio estão
“maduros”, isto é, fisiologicamente capacitados para se unirem. Desde a
entrada no útero, blastocisto e endométrio interagem, mas mesmo antes disso,
é a presença do blastocisto que mantém o corpo lúteo funcionando e garante o
ambiente progestacional do útero, necessário ao implante do blastocisto.
São produzidos no útero: [1] Fatores que estimulam o crescimento e
protegem o embrião da apoptose (HERRLER et al, 1998); [2] Proteína
relacionada ao processo de proliferação celular nos estágios iniciais de adesão
(FAZLEABAS; VERHAGE, 1991); [3] Proteína trofoblástica 1 (o TP-1), que
37
suprime a secreção de prostaglandina F-2alfa (PGF 2α), hormônio que induz
contratilidade da musculatura uterina e estimula a luteólise (BAZER; ROBERT,
1983); [4] EGF (fator de crescimento epidérmico), que contribui para a
sobrevivência do blastocisto (SPANOS et al.,2000).
O blastocisto, por seu turno, produz óxido nítrico (NO), que induziria
vasodilatação e relaxamento da musculatura lisa uterina, colaborando com a
implantação (GAGIOTI et al., 2000); estrogênio, que contribuiria para a
sensibilização do endométrio (SARTOR; DULUC, 1980; SENGUPTA et al.,
1981) e prostaglandinas, que teriam efeito local no endométrio, provavelmente
estimulando vasodilatação (PAKRASI; DEY, 1982; HARPER; NORRIS;
RAJKUMAR, 1983; KINOSHITA et al., 1985).
Para se implantar o blastocisto, é preciso ativar e, em seguida
perder a zona pelúcida, que se adelgaça progressivamente até se romper em
algum ponto e o blastocisto escapa por ele – um fenômeno denominado
“eclosão”.
A ativação do blastocisto compreende modificação na expressão de
moléculas de antígenos de histocompatibilidade (WEITLAUF, 1994); a
transformação de sua carga elétrica neutra para negativa (CLEMETSON;
MOSHFEGHI; MALLIKARJU-NESWRA, 1971); a produção pelo endométrio de
proteínas – blastoquinina ou uteroglobina (FINN, 1977), além de outros fatores.
38
O útero também necessita modificar-se com as alterações típicas da
fase progestacional: vasos sangüíneos dilatados e tortuosos, glândulas
endometriais dilatadas e cheias de secreção, células do estroma contendo
glicogênio. Além disso, o endométrio deve torna-se receptivo para o
blastocisto. Psychoyos (1966) demonstrou que, em ratas, nos três a quatro
primeiros dias após a inseminação, o endométrio é “neutro” ou não receptivo
ao blastocisto, porém, a partir da tarde do quarto dia e o início do quinto dia,
sofre diversas alterações que o tornam receptivo. É do mesmo autor a
afirmação de que um pico de estrogênio, agindo no endométrio, previamente
sensibilizado
por
concentrações
elevadas
de
progesterona,
tornava-o
receptivo. Mais tarde o período de receptividade endometrial foi chamado de
janela de implantação e definido como: “uma janela temporal de maturação do
endométrio durante a qual o trofoblasto pode unir-se às células epiteliais do
endométrio” (STRAUSS III; COUTIFARIS, 1999). A janela de implantação no
rato tem duração de 12 horas (PSYCHOYOS, 1966) e em humanos, quatro
dias (STRAUSS III; COUTIFARIS, 1999).
As alterações morfológicas do endométrio são um conjunto de
transformações da membrana plasmática das suas células epiteliais tais como:
alterações nos contornos, ultra-estrutura e composição bioquímica; aumento da
densidade e tipos de proteínas; decréscimo de carga da superfície, expressão
de novos carboidratos e epitopos (PARIA; SONG; DEY, 2001).
A implantação ocorre em três etapas: união, penetração e inclusão
(PARR; PARR, 1989; ACOSTA, 1994; PARIA; SONG; DEY, 2001). A união
39
compreende duas fases: aposição, pré-união ou primeiro estágio de oclusão e
adesão ou segundo estágio de oclusão (PARR; PARR, 1989).
Na aposição do blastocisto se imobiliza, mas não se prende no
endométrio (ACOSTA, 1994; WEITLAUF, 1994). Durante a aposição,
microvilosidades da superfície do trofoblasto e da região apical das células
epiteliais do endométrio se interdigitam, aumentando muito a superfície de
contato entre as duas estruturas (ENDERS, 1972).
A adesão caracteriza-se pela fixação definitiva do blastocisto ao
endométrio. Nessa ocasião observa-se no endométrio: o desaparecimento do
glicocálice da superfície luminal das células epiteliais e do trofoblasto e a
redução das cargas negativas do glicocálice e das células epiteliais do
endométrio (PARR; PARR, 1989; WEITLAUF, 1994).
Na penetração, os processos citoplasmáticos do trofoblasto se
estendem entre e debaixo das células epiteliais, que são deslocadas, sofrem
apoptose, destacam-se grupos ou isoladamente e são fagocitadas pelo
trofoblasto. A penetração do trofoblasto é facilitada pela redução de
desmossomos,
observado
no
quinto
dia
de
prenhez
(SCHLAFKE;
ENDERS,1975; WEITLAUF, 1994; ILLIIGWORH et al., 2000).
Em seres humanos, observou-se que as células epiteliais do
endométrio expressam fator sinalizador de morte – FAS, e o trofoblasto
expressa seu ligante FAS-L. Quando se forma o complexo FAS-FAS-L, as
40
fases da apoptose são ativadas em segundos e desencadeiam a morte celular
em horas. Com a morte das células epiteliais, a lâmina basal fica exposta,
ocorrendo sua invasão pelo trofoblasto, que chega até ao estroma (PARR;
PARR, 1989).
Diante do que foi explanado, fica claro que o período entre
fertilização e término da implantação de um embrião envolve alterações de
organelas; troca de sinalização entre embrião em desenvolvimento e células
endometriais, que resultam em síntese de proteínas e outras substâncias; além
de um delicado equilíbrio hormonal e de interações de estruturas do
citoesqueleto de células embrionárias e maternas (CATALA, 2000), todas
passíveis de se alterarem sob efeito do ultra-som.
5. MATERIAL E MÉTODOS
Foram usadas ratas Wistar, com três meses de idade, nulíparas,
pesando entre 150 e 180g, obtidas na colônia do Biotério do Centro de Biologia
da Reprodução - Universidade Federal de Juiz de Fora. Todos os animais em
experimento foram mantidos em armários climatizados (ALESCO).
As condições do alojamento dos animais já foram descritas
anteriormente (PINTO et al. 2007).
As ratas foram mantidas em gaiolas de polipropileno, providas de
camas de maravalha selecionada, mamadeira para água filtrada e cocho para
ração do tipo peletizada. A água foi oferecida ad libitum e cada rata recebeu,
em média, 25g de ração/dia.
As
fêmeas
foram
inseminadas
com
machos
de
fertilidade
comprovada, considerando-se o primeiro dia de gestação aquele em que foi
detectada a presença de espermatozóides no esfregaço vaginal.
Constatada
a
inseminação
as
ratas
foram
aleatoriamente
distribuídas em grupos experimentais - Grupo 1: pulso pulsado; Grupo 2:
pulso contínuo; Grupo 3: ultra-som simulado - e mantidas em armários
climatizados (ALESCO).
Cada
animal
foi
sedado
com 12
mg/Kg
de
Xilazina,
via
intraperitoneal e submetido à tricotomia na região abdominal para demarcação
42
da região de aplicação do ultra-som (Ultrasound Plus marca Advice Máster1),
que foi realizado desde o primeiro até o quinto dia pós-inseminação
(Experimento A) ou do quinto ao sétimo dia pós-inseminação (Experimento
B).
Grupos Experimentais:
Grupos A1 e B1: foram emitidas ondas com pulso pulsado com 5ms
de energia ativa e 5ms inativo.
Grupos A2 e B2: foram submetidos ao mesmo procedimento que os
grupos anteriores, porém com pulso contínuo.
Grupos A3 e B3: ultra-som simulado. Procedimento semelhante aos
anteriores mas o aparelho ficou desligado.
Para a exposição, foi passado um gel condutor no abdome da rata
(LOW; REED, 2001) e nela aplicado o ultra-som com as seguintes
características: ERA de 0,4 cm2, freqüência de 3 MHz, intensidade de 0,6
W/cm2 (SATA), com um tempo de cinco minutos de aplicação.
1
Gentilmente cedido pela empresa RO; SU- Indústria e comércio Ltda.
43
Completado o tempo o gel foi removido do abdome e as ratas foram
transportadas para gaiolas limpas, com forro de maravalha selecionada.
Todos os animais foram observados por 30 minutos após a
aplicação do ultra-som e, posteriormente, uma vez ao dia, visando à
constatação de alterações clínicas indicativas de estresse, dor ou toxicidade,
seguindo os critérios descritos por Christian (2001) e Hood; Miller (2006):
modificação na deambulação, presença de piloereção, estereotipia, ocorrência
de diarréia, cromodacriorréia, perdas sangüíneas vaginais e óbitos.
Os animais pertencentes ao Grupo A foram pesados no 1o, 3o, 6o, 9o,
15o e 20o dias pós-inseminação e os do Grupo B no 10, 5o, 70, 90,150 e 200. O
consumo de ração pelo Grupo A
foi estimado no 2o, 5o, 6o dias pós-
inseminação e no Grupo B 20 , 60, 70 e 80 dias de prenhez após esse período
foi medido uma vez por semana, tomando-se como base a diferença de peso
em gramas da ração colocada num dia e sobras obtidas no dia posterior.
As ratas foram eutanasiadas no 20o dia pós-inseminação através de
exsangüinação por punção cardíaca sob anestesia com 90 mg/Kg de
Ketamina, i.m e 10 mg/Kg de Xilazina i.p. No sangue coletado procedeu-se à
análise do hematócrito, da hemoglobina, dos leucócitos totais, do aspartato
aminotransferase (AST/TGO), da alanina aminotransferase (ALT/TGP),
do
colesterol, dos triglicerideos e da creatinina. Posteriormente, os animais foram
submetidos à autópsia para identificação de lesões de órgãos internos. Fígado,
rins, ovários, cornos uterinos e tubas uterinas foram removidos, pesando-se os
três primeiros em balança de precisão.
44
Cada ovário foi examinado sob estereomicroscópio para contagem
do número de corpos lúteos, e os cornos uterinos foram seccionados
longitudinalmente desde a extremidade ovárica esquerda até a direita,
expondo-se o seu conteúdo e contando os fetos vivos, mortos e reabsorções.
Foram considerados fetos vivos os que apresentaram movimentos
espontâneos ou após estímulo ao toque de uma pinça. Fetos foram
examinados externamente à procura de malformações e depois pesados, do
mesmo modo que suas respectivas placentas.
Os fetos foram submetidos à crioanestesia e autopsiados para
remoção e pesagem de cérebro, coração, pulmão, fígado e rins.
Os dados obtidos foram processados por análise de variância (uma
via) e, posteriormente, submetidos a ANOVA – uma via, e ao teste de Dunnett.
Dados não paramétricos foram submetidos aos testes do Qui quadrado ou
Kruskall Walis. A hipótese nula foi rejeitada quando p< 0,05. Para análise
estatística foi considerado o peso da cria e não os pesos individuais dos fetos.
O protocolo experimental foi submetido à Comissão de Ética em
Experimentação Animal da UFJF, sendo aprovado (protocolo n
CEEA).
º
040/2005
6. RESULTADOS
6.1 Experimento A: Tratamento do dia 1 ao 5 pós –
inseminação.
Não foram observados indícios clínicos de toxicidade materna em
nenhum dos grupos analisados. A FIGURA 1 resume os dados sobre o peso
corporal materno do experimento A.
260
Peso corporal (g)
240
220
200
USP
USC
USS
180
160
140
0
0
5
10
15
20
Dias de prenhez
FIGURA 1. Peso corporal materno do experimento A.
Nota-se que o peso corporal das ratas foi semelhante em todos os
grupos.
54
Na TABELA 1 são apresentados os dados referentes ao peso
corporal e ao dos órgãos maternos.
TABELA 1 - Peso corporal e dos órgãos de ratas Wistar submetidas, durante
os dias 1- 5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultrasom por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
GRUPOS
Variáveis analisadas
USC
USP
USS
Peso
corporal
corrigido (g)1
194,72 ± 9,81 (14)
188,39 ± 12,64 (15)
191,71 ± 9,87 (13)
Ganho de peso (g)
21,08 ± 6,40 (13)
22,15 ± 4,43 (14)
23,83 ± 7,11 (13)
Fígado (g)
9,51 ± 0.80 (14)
9,45 ± 0.80 (15)
9,21 ± 0.57 (13)
Rim D (g)
0,73 ± 0,08 (14)
0,69 ± 0,04 (14)
0,68 ± 0,05 (13)
Rim E (g)
0,70 ± 0.08 (14)
0,69 ± 0.04 (14)
0,67 ± 0,05 (13)
Rins E+D (g)
1,44 ± 0,16 (14)
1,38 ± 0,07 (14)
1,35 ± 0,10 (13)
Peso relativo rins %
0,74 ± 0,08 (14)
0,73± 0,04 (14)
0,70 ± 0,05 (13)
Ovário D (mg)
41,71 ± 9,66 (14)
42,00 ± 14,38 (15)
38,31 ± 10,70 (13)
Ovário E (mg)
31,93 ± 7,86 (14)
35,00 ± 9,23 (15)
37,46 ± 11,03 (13)
Ovários E+D (mg)
73,64 ± 7,93 (14)
77,00 ± 10,38 (14)
75,77 ± 8,74 (13)
1
Peso corporal corrigido = peso corporal sem útero, ovários e tubas uterinas.
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) número de
mães estudadas. D= direito; E= Esquerdo. Dados extremos, observados no
“box plot”, foram excluídos da análise. p> 0.05.
Nota-se que não houve alteração de peso corporal e dos órgãos das
ratas nos diferentes grupos experimentais.
Na TABELA 2 estão expressos os resultados dos hemogramas e
das análises bioquímicas em ratas de todos os grupos experimentais 1-5.
54
TABELA 2 - Hemogramas e análises bioquímicas de ratas Wistar submetidas,
durante os dias 1-5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC),
ultra-som por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
GRUPOS
Variáveis
analisadas
USC
USP
USS
Hematócrito (%)
39,07 ± 2,70 (14)
37,47 ± 2,85 (15)
38,53 ± 2,77 (15)
Hemoglobina
(g/dl)
12,21 ± 1,06 (14)
12,19 ± 0,71 (15)
11,86 ± 0,80 (15)
Leucócitos
totais(cel/mm3)
4323 ± 1254 (14)
5306 ± 1351(15)
5426 ± 1555 (15)
T.G.O. (U/L)
83,64 ± 62,32 (14)
35,08 ± 19,12 (13)
47,14 ± 12,23 (14)
T.G.P. (U/L)
35,79 ± 12,88 (14)
33,50 ± 7,92 (16)
32,79 ± 7,56 (14)
Colesterol
(mg/dl)
94,75 ± 25,37 (14)
100,02 ± 18,63 (16)
89,96 ± 6,45 (15)
236,64 ± 75,50 (14)*
248,22 ± 125,15 (16)*
141,73 ± 51,78 (15)
0,54 ± 0,06 (13)
0,61 ± 0,11 (15)
0,53 ± 0,16 (14)
Triglicerideos
(mg/dl)
Creatinina
(mg/dl)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) número de mães
estudadas. *p< 0.05 em relação ao grupo USS.
Houve diferença significativa na concentração de triglicerídeos no
grupo USC e USP, quando comparado ao USS.
Na TABELA 3 encontram-se os dados relativos à capacidade
reprodutiva das ratas nos diferentes grupos experimentais 1 -5.
54
TABELA 3 - Capacidade reprodutiva das ratas submetidas, durante os dias 1-5
pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultra-som por
ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
GRUPOS
Variáveis
Analisadas
USC
USP
USS
C.Lúteos D
6,36 ± 1,65 (14)
6,40 ± 2,06 (15)
5,83 ± 2,17 (12)
C.Lúteos E
4,79 ± 1,53 (14)
5,40 ± 2,20 (15)
6,09 ± 2,07 (12)
C. Lúteos D+E
156
177
137
C. Lúteos/ mãe
11,14 ± 1,17 (14)
11,80 ± 1,01 (14)
11,42 ± 1,62 (12)
Implantes Corno D
5,14 ± 2,21(14)
5,73 ± 1,87 (15)
4,92 ± 2,11 (12)
Implantes Corno E
4,15 ± 1.21 (13)
4,93 ± 2,20 (14)
5,60 ± 1,65 (10)
126
155
115
Implantes/ mãe
Nº fetos vivos (%
por grupo)
9,00 ± 2,15 (14)
10,33 ± 1,80 (15)
9,58 ± 1,83 (12)
101 (80,2)
131 (84,5)
93 (69,4)
Fetos vivos /mãe
Nº Fetos mortos (%
por grupo)
7,21 ± 2,12 (14)
8,73 ± 1,79 (15)
7,75 ± 2,34 (12)
7 (6,48)
7 (5,07)
11 (10,6)
Fetos mortos / mãe
Nº
Reabsorções
(%por grupo)
1,17 ± 0,41 (6)
1,00 ± 0,01 (7)
1,22 ± 0,44 (9)
17 (5,55)
17 (4,52)
11 (2,40)
Implantes
Reabsorção/ Mãe
1,89 ± 0,78 (9)
1,89 ± 1,05 (9)
1,38 ± 0,51 (8)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) o número de mães
estudadas. p>0.05. D= direito; E= Esquerdo. p> 0.05
Nota-se que não houve alteração em relação à capacidade
reprodutiva das ratas nos diferentes grupos experimentais 1-5.
Os dados referentes ao peso corporal e ao de órgãos de
fetos
(média/ ninhadas) das ratas submetidas, durante os dias 1-5 pós-inseminação,
ao ultra-som por ondas contínuas, pulsadas e ao ultra-som simulado
encontram-se na TABELA 4.
54
TABELA 4: Peso corporal e de órgãos dos fetos das ratas submetidas, durante
os dias 1-5 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC),
pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
Grupos
Variáveis
Analisadas
USC
USP
USS
Peso Corporal
(mg)
1778,93 ± 228,59(14)
1792,93 ± 228,59(15)
1821 ± 227,41 (15)
Placenta (mg)
467,71 ± 69,63 (14)
461,27 ± 49,72 (15)
464,20 ± 118,25 (15)
Coração (mg)
12,85 ± 2,30 (13)
11,67 ± 1,11 (15)
11,77 ± 1,09 (13)
178,92 ± 18,16 (13)
162,40 ± 18,61 (15)
163,54 ± 21,38 (13)
Rins (mg)
11,31 ± 2,01 (13)
9,27 ± 1,39 (15)
10,31 ± 1,49 (13)
Pulmão (mg)
69,38 ± 9,41 (13)
58,60 ± 8,27 (15)
62,77 ± 9,35 (13)
Cérebro (mg)
Peso
Rel
coração
Peso
Rel
fígado
110,38 ± 7,74 (13)
103,40 ± 5,82 (15)
104,85 ± 11,98 (13)
0,70 ± 0,08 (13)*
0,65 ± 0,04 (15)
0,63 ± 0,03 (13)
9,80 ± 0,84 (13)*
9,05 ± 0,68 (15)
8,76 ± 0,49 (13)
Peso Rel rins
Peso
Rel
pulmão
6,17 ± 0,76 (13)*
5,15 ± 0,55 (15)
5,52 ± 0,45 (13)
3,80 ± 0,44 (13)*
3,26 ± 0,34 (15)
3,36 ± 0,42 (13)
Fígado (mg)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) o número de
ninhadas estudadas. * p<0.05 em relação ao grupo ultra-som simulado (USS).
Rel = relativo.
Houve diferença significativa em relação ao peso relativo do
coração, fígado, pulmão e dos rins e no grupo USC, quando comparado ao
USS 1-5.
54
6.2 Experimento B: Tratamento do dia 5 a 7 pós inseminação.
Não foram observados indícios clínicos de toxicidade materna em
nenhum dos grupos analisados. A FIGURA 2 resume os dados sobre o peso
corporal materno do experimento B.
260
Peso corporal (g)
240
220
200
USP
USC
USS
180
160
140
0
0
5
10
15
20
Dias de prenhez
FIGURA 2. Peso corporal materno do experimento B.
Nota-se que o peso corporal das ratas foi semelhante em todos os
grupos.
Na TABELA 5 são apresentados os dados referentes ao peso
corporal e de órgãos maternos.
54
TABELA 5 - Peso corporal e de órgãos das ratas submetidas, durante os dias
5-7 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultra-som por
ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
GRUPOS
Variáveis
Analisadas
Peso corporal
corrigido (g)1
Ganho de peso
(g)
USC (n=15)
USP (n=15)
USS (n=13)
191,7 ± 12,22 (15)
193,3 ± 8,28 (15)
189,0 ± 13,62 (13)
19,29 ± 9,02 (15)
24,01 ± 7,25 (15)
20,15 ± 9,05 (13)
Fígado (g)
9,33 ± 1,00 (15)
9,44 ± 0,56 (15)
9,08 ± 0,98 (13)
Rim D (g)
0,68 ± 0,06 (15)
0,69 ± 0,04 (15)
0,70 ± 0,07 (14)
Rim E (g)
0,67 ± 0,07 (15)
0,68 ± 0,05 (15)
0,69 ± 0,07 (14)
Rins E + D (g)
Peso relativo rins
%
1,35 ± 0,13 (15)
1,37 ± 0,08 (15)
1,40 ± 0,13 (14)
0,71 ± 0,07 (15)
0,71 ± 0,04 (15)
0,73 ± 0,05 (13)
Ovário D (mg)
38,71 ± 12,46 (14)
65,13 ± 10,41 (15)
44,50 ± 9,78 (14)
Ovário E (mg)
Ovários E + D
(mg)
33,6 ± 12,43 (14)
36,57 ± 10,26 (14)
32,43 ± 6,17 (14)
72,36 ± 10,63 (14)
74,93 ± 10,56(15)
76,93 ± 11,86 (14)
1
Peso corporal corrigido = peso corporal sem útero, ovários e tubas uterinas.
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) número de
mães estudadas. D= direito; E= Esquerdo. Dados extremos, observados no
“box plot”, foram excluídos da análise. p> 0.05
Nota-se que não houve alteração de peso corporal e de órgãos das
ratas nos diferentes grupos experimentais 5-7.
Na TABELA 6 estão expressos os resultados de hemogramas e
análises bioquímicas em ratas de todos os grupos experimentais 5-7.
54
TABELA 6 - Hemograma e análises bioquímicas das ratas submetidas, durante
os dias 5-7 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultrasom por ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
Variáveis
Analisadas
Grupos
USC
USP
USS
Hematócrito
(%)
38,50 ± 4,41 (13)
37,33 ± 3,35 (15)
38,60 ± 1,96 (15)
Hemoglobina
(g/dl)
11,41 ± 2,06 (13)*
11,51 ± 0,83 (15)
12,49 ± 1,04 (15)
Leucócitos
(cel/mm3)
5615 ± 1690 (13)
6005 ± 1416 (15)
5823 ± 1111 (15)
Colesterol
(mg/dl)
134,92 ± 66,31 (14) 125,04 ± 45,04 (15)
93,26 ± 7,86 (15)
Triglicerideos
(mg/dl)
276,93 ± 179,05 (14) 253,87 ±158,71(15) 151,93 ± 104,71 (15)
T.G.O. U/L
61,36 ± 48,19 (14)
35,07 ± 11,45 (15)
49,07 ± 23,52 (14)
T.G.P. U/L
36,71 ± 12,96 (14)
29,80 ± 6,99 (15)
37,93 ± 12,85 (15)
Creatinina
(mg/dl)
0,59 ± 0,084 (14)
0,60 ± 0,109 (15)
0,53 ± 0,137 (15)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) número de mães
estudadas. *p< 0.05 em relação ao grupo USS.
Houve diferença significativa na concentração de hemoglobina no
grupo USC, quando comparado ao USS 5-7.
Na TABELA 7 encontram-se os dados relativos à capacidade
reprodutiva das ratas nos diferentes grupos experimentais 5-7.
54
TABELA. 7: Capacidade reprodutiva das ratas submetidas, durante os dias 5-7
pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC), ultra-som por
ondas pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado (USS).
GRUPOS
Variáveis
Analisadas
USC
USP
USS
C.Lúteos D
5,79 ± 2,04 (14)*
6,07 ± 1,83 (15)
7,50 ± 1,99 (14)
C.Lúteos E
Corpos lúteos D +
E
5,07 ± 2,02 (14)
5,60 ± 1,80 (15)
4,79 ± 0,97 (14)
152
175
172
Corpos lúteos/ mãe
10,86 ± 1,66 (14)
11,67 ± 1,05 (15)
12,29 ± 1,49 (14)
Implantes Corno D
5,64 ± 1,78 (14)
5,47 ± 1,88 (15)
6,00 ± 1,92 (14)
Implantes Corno E
4,64 ± 1,95 (14)
5,29 ± 1,82 (14)
4,31 ± 1,03 (13)
Total de implantes
144
156
140
Implantes/ mãe
N0 de fetos vivos
(% por grupo)
10,29 ± 1,77 (14)
10,40 ± 2,06 (15)
10,00 ± 2,11 (14)
104 (72,2)
118 (75,6)
84 (60,0)
Fetos vivos / Mãe
N0 fetos mortos
(% por grupo)
7,43 ± 2,93 (14)
7,87 ± 2,87 (15)
6,00 ± 3,09 (14)
6 (5,4)
3 (2,3)
8 (8,7)
Fetos mortos/mãe
0,40 ± 0,51 (15)
0,20 ± 0,41 (15)
0,57 ± 0,51 (14)
N0 de reabsorções
(% por grupo)
34 (23,6)
35 (22,4)
48 (34,3)
Reabsorção total /
Mãe
3,78 ± 2,59 (9)
2,69 ± 1,60 (13)
4,00 ± 2,76 (12)
% de perdas préimplantação
13,72 ± 7,10 (6)
20,07 ± 14,00 (9)
20,63 ± 18,26 (12)
Perdas préimplantação /mãe
1,50 ± 0,84 (6)
2,33 ± 1,50 (9)
2,67 ± 2,50 (12)
% de perdas pósimplantação
32,94 ± 27,06 (12)
29,87 ± 16,12 (13)
42,40 ± 26,53 (13)
Perdas pósimplantação / mãe
3,33 ± 2,46 (12)
2,92 ± 1,55 (13)
4,31 ± 2,69 (13)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) o número de mães
estudadas. *p<0.05. D= direito; E= Esquerdo.
Nota-se que não houve alteração em relação à capacidade
reprodutiva das ratas nos diferentes grupos experimentais 1-5.
54
Os dados referentes ao peso corporal e de órgãos de fetos (média/
ninhadas) das ratas submetidas, durante os dias 5-7 pós-inseminação, ao ultrasom por ondas contínuas, pulsadas e ao ultra-som simulado encontram-se na
TABELA 8.
TABELA 8 - Peso corporal e de órgãos dos fetos das ratas submetidas, durante
os dias 5-7 pós-inseminação, ao ultra-som por ondas contínuas (USC),
pulsadas (USP) e ao ultra-som simulado(USS).
Grupos
Variáveis
Analisadas
USC
USP
USS
Peso Corporal (mg) 1989,78 ± 176,70 (14) 1902,80 ± 185,78 (15) 1851,07 ± 206,75 (14)
Peso Placenta (mg)
455,23 ± 60,23 (14)
415,33 ± 37,93 (15)*
478,21 ± 89,56(14)
Peso Coração (mg)
14,58 ± 2,06 (12)*
11,73 ± 1,91 (15)
12,55 ± 1,13 (9)
190,25 ± 19,21 (12)
174,93 ± 26,48 (15)
173,22 ± 8,79 (9)
Peso Rins (mg)
12,18 ± 2,86 (12)
10,87 ± 1,81 (15)
10,44 ± 0,88 (9)
Peso Pulmão (mg)
71,42 ± 9,46 (12)
65,7 ± 12,35 (15)
66,11 ± 3,44 (9)
Peso Cérebro (mg)
121,75 ± 14,60 (12)*
110,33± 14,27 (15)
103,44 ± 9,15 (9)
Peso Rel rins
0,61 ± 0,14 (11)
0,57 ± 0,07 (15)
0,55 ± 0,06 (9)
Peso Rel coração
0,72 ± 0,08 (12)
0,62 ± 0,09 (15)
0,66 ± 0,05 (9)
Peso Rel fígado
9,44 ± 0,64 (12)
9,16 ± 0,84 (15)
9,14 ± 0,69 (9)
Peso Rel pulmão
3,55 ± 0,43 (12)
3,41 ± 0,46 (15)
3,49 ± 0,26 (9)
Peso Fígado (mg)
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. (N) o número de
ninhadas estudadas. * p<0.05 em relação ao grupo ultra-som simulado (USS).
Rel = relativo.
Houve diferença significativa em relação ao peso do coração e do
cérebro no grupo USC e peso de placenta no grupo USP, quando comparado
ao USS 5-7.
7. DISCUSSÃO
No presente estudo procurou-se um modelo experimental que se
assemelhasse ao procedimento terapêutico para reabilitação de disfunções
dermato-funcionais. As regiões do abdome da rata, aproximadamente
correspondentes à posição dos cornos uterinos, foram expostas à mesma
intensidade e tempo previstos para uma aplicação de ultra-som terapêutico:
3MHz, onda pulsada ou contínua, intensidade de 0,6 W/cm2 por 5 minutos.
Com o propósito de distinguir efeitos nocivos das ondas ultrasônicas sobre o organismo materno, que causando alguma alteração pudesse
interferir com o desenvolvimento embrionário (KHERA, 1985, 1987), procedeuse à análise dos indicativos clínicos de toxicidade, estresse ou sofrimento
materno (CHAHOUD et al., 1999; HOOD; MILLER, 2006). Nenhum de tais
indicativos foi evidente entre os grupos experimentais, o que sugere ausência
de efeitos lesivos das ondas, pulsadas ou contínuas, concordando com
trabalhos de Vorhess et al., 1991, que também não encontraram efeitos tóxicos
maternos em ratas não anestesiadas expostas ao ultra-som (3.0 MHz,
intensidade 0.1, 0.2 ou 30.0 W/cm2, onda contínua), desde o quarto até o 19O
dia pós-inseminação por 15 minutos/dia, e Kimel et al., (1989), que expuseram
camundongos fêmeas ao ultra-som( 1 MHz, intensidade de 0-1.0 W/cm2, onda
pulsada) no 80 dia de prenhez, por 10 min.
56
Os exames laboratoriais e hematológicos do presente estudo
corroboram a hipótese de ausência ou baixa toxicidade, pois a única alteração
observada referiu-se aos triglicérides, aumentados nos grupos expostos ao
ultra-som (experimento A) e redução na concentração de hemoglobina
(experimento B). Nenhum dos dois dados é acompanhado de outras alterações
que sugerissem comprometimento importante do organismo materno, capaz de
interferir com o desenvolvimento do embrião ou feto.
As condições hormonais maternas são muito importantes para o
desenvolvimento embrionário. Embora as fases iniciais da prenhez da rata
sejam prolactino-dependentes, níveis sangüíneos de progesterona, ou de
estrogênio, inadequados, interferem na viabilidade do embrião, por alterarem o
trânsito tubário (CARSON; NAFTOLIN, 1982; FORCELLEDO; CROXATTO,
1988; VINIJISAMUN, 1990; CROXATTO et al.,1991; PARIA; SONG; DEY,
2001).
Diferentemente do que acontece em humanos, na gestação da rata
os corpos lúteos mantêm-se ativos durante todo o período gestacional e são
necessários ao seu êxito (KELLER, 2006). Eles aumentam de volume ao longo
da prenhez e demonstrou-se também que seu crescimento está intimamente
correlacionado ao aumento de secreção de progesterona e 20-hidroxiprogesterona, hormônios também indispensáveis à manutenção da prenhez na
rata (UCHID et al., 1970).
57
Por serem as estruturas mais volumosas do ovário, os corpos lúteos
contribuem bastante para o peso do ovário do animal prenhe (WAYNFORTH,
1971) e, dessa forma, o peso do ovário e o número de corpos lúteos permitem
uma avaliação indireta dos progestágenos maternos. Nos dois grupos
experimentais, foram encontrados pesos de ovários e número de corpos lúteos
semelhantes, o que pode ser tomado como indício de que o ambiente hormonal
materno não diferiu entre eles.
Pode-se, portanto, concluir que a exposição de ratas desde o
primeiro até o sétimo dia pós-inseminação, ao ultra-som terapêutico, não
causou alterações maternas capazes de interferir
no desenvolvimento
embrionário.
O desenvolvimento animal pode ser basicamente dividido em três
períodos com relação à sua susceptibilidade à lesão: [a] pré-diferenciação –
compreendendo as primeiras divisões celulares e a formação do blastocisto –
quando um toxicante produz, com poucas exceções, o “efeito tudo ou nada” -;
[b] diferenciação precoce correspondendo à fase de organogênese – período
em que os esboços embrionários de órgãos e sistemas estão em
desenvolvimento e [c] diferenciação avançada, quando ocorre a histogênese e
a maturação funcional dos órgãos (HOOD, 2006).
A fase de pré-diferenciação é feita no interior da tuba uterina, em um
ambiente líquido. Em ratas, o dia 1 pós-inseminação corresponde à fertilização
e ao início da primeira divisão da clivagem; no segundo dia permanecem em
58
fase de dois blastômeros. Ao longo do terceiro dia encontram-se fases de duas
a quatro células. No quarto dia observa-se a fase de mórula e, ocasionalmente,
alguns blastocistos em fase inicial de desenvolvimento (SOUZA; GUERRA;
PETERS, 1997; ALBERTS et al.,1997; MOLEY, 1999; MOORE; PERSAUD,
2000). Entre o terceiro e o quarto dias após a inseminação, inicia-se a
blastogênese e, no quinto dia, os blastocistos já migraram para o útero, onde
iniciam a implantação, que se completa no sétimo dia pós-inseminação
(MASON; KANG, 1994; MOLEY, 1999).
A exposição das ratas ao ultra-som durante os dias 1 a 7 pósinseminação, envolve, portanto, o período em que todas as células do concepto
estão em atividade mitótica elevada, logo susceptíveis a alterações na divisão
celular. Lesões na fase de pré-diferenciação podem ser graves, causando a
morte do concepto, ou alterações moderadas a leves, que retardam seu
crescimento e desenvolvimento. O transporte pelo trato reprodutor pode ser
acelerado ou retardado,
o que leva à dissincronia entre a fase de
desenvolvimento e a janela de implantação, impedindo ou interrompendo o
processo de implantação, o que também resulta em morte do concepto.
A morte durante a fase precoce do desenvolvimento pode ser
inferida pelo aumento do índice de perdas pré – embrionárias (estimado
tomando cada corpo lúteo como indicativo de um ovócito que, sendo
fecundado, geraria um zigoto ) (KELLER, 2006); pelo aumento de reabsorções
59
precoces ou tardias, que mostram mortes de embriões implantados e pelo
menor número de implantes ou fetos no útero.
A diferença entre corpos lúteos e implantes nos cornos uterinos
indica, aproximadamente, o número de conceptos “perdidos” (TYL; MARR,
2006). Os dados obtidos no trabalho mostram que a média de implantes por
mãe e o índice de perdas embrionárias pré-implantação foram semelhantes em
todos os grupos estudados; portanto, é possível supor que nem as ondas
emitidas no modo pulsado nem contínuo interferiram no desenvolvimento das
fases pré-diferenciadas.
Outro fator que pode influir no desenvolvimento e na sobrevivência
do embrião em sua fase inicial de desenvolvimento diz respeito ao transporte
tubário.
O tempo de transporte do embrião pela tuba uterina dura quatro a
cinco dias (SINGH et al., 1993; SOUZA; GUERRA; PETERS, 1997). Hormônios
como o estrogênio e a progesterona modificam as contrações tubárias; o
primeiro acelera o trânsito tubário, já a progesterona o retarda (CARSON;
NAFTOLIN, 1982; FORCELLEDO; CROXATTO, 1988; VINIJISAMUN, 1990;
CROXATTO et al.,1991). Por outro lado, produtos secretados pelo embrião e
pelas células tubárias
e estruturas do citoesqueleto, necessárias às
modificações morfogênicas do embrião (CATALA, 2000), também não parecem
ter sido influenciados pelas ondas ultra-sônicas uma vez que o número de
implantes / mãe e o índice de implantação estariam reduzidos o que não se
60
observou. É possível, assim, sugerir que ondas pulsadas ou contínuas do ultrasom não altera o trânsito tubário nem o “diálogo” entre embrião e células
tubárias.
Como já foi citado, os efeitos do ultra-som terapêutico envolvem
mecanismos que aumentam a permeabilidade da membrana celular, alteram a difusão de
íons, promovem vasodilatação, modificam a posição de partículas intra ou
extracelulares, ou mesmo a configuração normal da célula, levando à alteração de suas
atividades (HILL, 1972; GUIRRO; GUIRRO, 2004). Além disso, estudos “in vitro”
mostraram ruptura de membranas e de macromoléculas e desnaturação de
enzimas em cultivos celulares submetidos ao ultra-som terapêutico (LEITE,
1989). Tais alterações poderiam interferir nos mecanismos iniciais das divisões
celulares e processos de difusão de informações intercelulares, levando a
mortes ou malformações. De fato, Shoji, Murakami, Shimizu (1975), relatam
que a intensidade do ultra-som, dentro da escala terapêutica, pode estar
associado a anomalias congênitas em camundongos. McLEOD e
FOWLOW (1989), relataram agenesias sacrais, microcefalia e atraso no
desenvolvimento, deficiência no crescimento intrauterino e pós-natal
em
recém- nascido de uma mulher submetida a 18 aplicações de ultra-som
terapêutico para tratar uma bursite no íleo esquerdo do 60 ao 290
dia de
gestação; foram constatadas malformações na criança.
No presente trabalho, não foram observadas malformações externas
e as mortes fetais ocorreram na mesma proporção em todos os grupos
experimentais, concordando com o reportado por Fisher et al. (1994), que
61
expuseram ratas anestesiadas e imersas num tanque de água, do quarto ao
190 de prenhes, ao ultra-som (3MHz, onda pulsada, com intensidades de até
30 W/cm2 (SPTA)), durante 10 minutos, e McClain, Hoar, Saltzman (1972), que
expuseram ratas prenhas no período da organogênese ao ultra-som de 2MHz,
onda contínua, por períodos de até 2 horas por dia.
Não foram observadas alterações no peso corporal, concordando
com Child, Carstensen e Davis (1984); Vorhess et al.(1991) e Norton et al.
(1991). Entretanto, Hande e Davi (1992) relataram redução do peso e
diminuição do comprimento dos fetos de camundongos, cujas mães foram
expostas ao ultra-som pulso contínuo (3,5 MHZ, intensidade 65mW/cm2), em
um único dia - 3,5 ou 6,5 pós-inseminação, por 10 minutos. Os autores
sugerem que o ultra-som pode promover efeitos adversos em embriões de
camundongos, dependendo do estágio de desenvolvimento a que forem
expostos.
A ausência de efeito teratogênico, observada no presente trabalho,
também foi constatada por Kimel et al. (1983) em fêmeas de camundongo
expostas no 8
O
dia de prenhez; por Vorhess et al.,1991, quando expuseram
ratas do 40 ao 190 dia de prenhez; por Margulies et al. (1991). Shoji,
Murakami, Shimizu (1975) e McLeod, Fowlow (1989) discordam destes
resultados.
Fetos de mães irradiadas entre os dias 1 a 5 pós-inseminação
tiveram peso relativo de coração, fígado e rins superiores aos de ultra-som
62
simulado, já os de mães expostas entre os dias 5 a 7 apresentaram peso do
cérebro e do coração maior que os de ultra-som simulado, indicando maior
crescimento desses órgãos. Estes resultados discordam dos apresentados por
Akamatsu (1981), que relatou retardo no desenvolvimento embrionário de ratas
expostas, “in vitro”, na fase de mórula tardia e no início da formação do
blastocisto, ao ultra-som (onda contínua, com intensidade de 0.65, 1 , 1.8, 2 ou
3 W/cm2). Notou-se que, com a intensidade de 2 ou 3 W/cm2, também foram
observadas alterações morfológicas.
Barnet, Walsh e Angles (1990) expuseram embriões no dia 9,5o de
prenhez, in vitro ao ultra-som de 3,14MHz e analisaram sua morfologia após 48
horas de cultivo. Os embriões expostos ao ultra-som durante 5 a 15 minutos, a
38,5o C, não apresentaram alterações, mas com 30 minutos mostravam
pequena diminuição do mesoblasto. Quando expostos por 15 minutos, à
temperatura de 40o C exposição, foi observada redução significativa na
proporção cabeça / corpo.
Conforme foi mencionado, é muito difícil realizar comparações entre
os resultados encontrados pelos diferentes autores que estudaram o efeito do
ultra-som sobre o desenvolvimento embrionário. Os experimentos observados
na literatura são, na maioria das vezes, incompatíveis com a realidade clínica.
Além disso, tempos de exposição, tipo de pulso, intensidade e freqüência são
diferentes conforme os autores. No presente trabalho, procurou-se um modelo
experimental
mais
próximo
do
que
acontece
nos
tratamentos
das
63
dermatopatias funcionais, e outros estudos estão em desenvolvimento, visando
comprovar e ampliar os resultados encontrados até o momento.
Em conclusão,
no
modelo
experimental
usado,
não
foram
observados efeitos tóxicos do ultra-som sobre o organismo materno. Também
no ultra-som pulsado não houve efeito sobre os fetos no período de préimplantação, mas as ondas contínuas induziram aumento do peso relativo do
coração, fígado, pulmão e dos rins. No período de implantação do blastocisto, o
ultra-som pulsado causou diminuição do peso da placenta, e as ondas
contínuas acarretaram aumento do peso absoluto do cérebro e do coração.
8.
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