Caracterização Genética de caprinos da Raça Anglonubiana no

Universidade Federal do Piauí
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE CAPRINOS DA RAÇA
ANGLONUBIANA NO CENTRO NORTE DO PIAUÍ
Ellida de Aguiar Silvestre
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Piauí como parte das exigências do Programa de
Pós-graduação em Genética e Melhoramento, área
de concentração em Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de “Mestre”.
Teresina – PI
2012
Ellida de Aguiar Silvestre
Bióloga
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE CAPRINOS DA RAÇA ANGLONUBIANA NO
CENTRO NORTE DO PIAUÍ
Orientador: Prof. Dr. Fábio Barros Britto - UFPI
Coorientador: Prof. Dr. José Elivalto Guimarães
Campelo – UFPI
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Piauí como parte das exigências do Programa de
Pós-graduação em Genética e Melhoramento, área
de concentração em Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de “Mestre”.
Teresina – PI
2012
FICHA CATALOGRÁFICA
Universidade Federal do Piauí
Biblioteca Comunitária Jornalista Carlos Castello Branco
Serviço de Processamento Técnico
S587c
Silvestre, Ellida de Aguiar
Caracterização genética de caprinos da raça Anglonubiana no
Centro Norte do Piauí / Ellida de Aguiar Silvestre. – 2012.
53f. : il.
Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento) –
Universidade Federal do Piauí, Teresina, 2012.
Orientação: Profº. Dr. Fábio Barros Britto
Co-orientação: Prof. Dr. José Elivalto Guimarães Campelo
1. Genética -Caprino. 2. Diversidade Genética. 3.
Caracterização Molecular. 4. Microssatélite. I. Título.
CDD:636.390 8
Caracterização genética de caprinos da raça Anglonubiana no estado do Piauí
.
Ellida de Aguiar Silvestre
Aprovada em: ____ / ____ /____
Comissão julgadora:
_____________________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Barros Britto - Orientador
Universidade Federal do Piauí
_____________________________________________________________
Prof. Dr. José Elivalto Guimarães Campelo - Co-orientador
Universidade Federal do Piauí
_____________________________________________________________
Pesq. Dr. Fábio Mendonça Diniz – Membro titular
Embrapa Meio-Norte
_____________________________________________________________
Pesqa. Dra. Maria Imaculada Zucchi – Membro titular
APTA - Piracicaba - SP
Dedico à minha mãe Vanêce de Aguiar Silvestre,
e ao meu irmão Erick de Aguiar Silvestre.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me fortalecer nas horas difíceis e sempre me acompanhar na minha
jornada;
À Universidade Federal do Piauí, por subsidiar esta etapa da minha vida profissional
e em especial ao Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento;
Ao PROCAD por proporcionar intercâmbio para a conclusão da minha dissertação;
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos;
Ao Dr. Fábio Barros Britto, pela paciência e acima de tudo por ser um bom amigo;
Ao Dr. José Elivalto Guimarães Campelo, pela a ajuda constante;
Ao Dr. José Baldin Pinheiro, por abrir as portas do seu laboratório me ajudando a
finalizar este projeto;
À Dra. Maria Imaculada Zucchi, por me ajudar e se preocupar com o meu tarbalho;
Às professoras Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes e Dr. Ângela Celis de Almeida
Lopes, por serem verdadeiras mães na minha vida acadêmica;
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento por
ensinar não só a disciplina, mas também a viver;
Aos criadores de caprinos Anglonubianos, por permitirem a realização das coletas;
Aos amigos Márcio da Silva Costa, Pollyana Oliveira da Silva, Felipe Pereira da Silva
Barçante pelo auxílio nas coletas de dados e por dividir comigo momentos de
descontração;
Aos colegas do laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento da ESALQ,
pela companhia e ajuda para a realização das análises;
Ao Miklos Maximiliano Bajay, por me ajudar nas análises;
Aos amigos Erina Victorio Rodrigues, Hendrie Ferreira Nunes e José Ribamar
Assunção Filho, pelos momentos de descontração, ajuda e apoio;
Aos demais colegas do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento;
Ao amigo Alexandre Marcolino por acreditar e sempre me incentivar;
Aos meus inesquecíveis amigos Katharinne Ingrid Moraes de Carvalho, Bruno
Soares Moreira, Jamile Queiroz de Sousa, Samira da Silva Maciel, Flavia Danniele
Frota Machado, Edson Falcão Lima Filho, Denise Mendes Martins, Camilla Micaely,
Ocimara Oliveira, Betriny Nascimento, Carolina Vasconcelos entre outros, por
mesmo de longe me apoiarem e me ajudarem na parte prática como também com
conselhos;
Ao meu namorado Leandro Longato Neto, pela paciência na última etapa e por me
proporcionar segurança e carinho;
Aos meus sogros e cunhada pela hospitalidade;
À minha mãe e irmão, por acreditar inabalavelmente em mim e no meu potencial;
Aos meus familiares, em especial meu pai, pelo apoio;
A todos que tornaram possível a realização deste projeto.
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................................VII
ABSTRACT...............................................................................................................VIII
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................IX
LISTA DE TABELAS....................................................................................................X
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................11
2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................13
2.1. Caprinocultura no Brasil e Nordeste....................................................................13
2.2. A raça Anglonubiana...........................................................................................15
2.3. Uso de marcadores moleculares na caracterização genética.............................17
2.4. Estimativas populacionais...................................................................................20
3. MATERIAL E MÉTODO.........................................................................................24
3.1. Amostragem........................................................................................................24
3.2. Extração de DNA.................................................................................................25
3.3. Marcadores Microssatélites.................................................................................25
3.4. Genotipagem.......................................................................................................28
3.5. Análise estatística................................................................................................28
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................30
5. CONCLUSÕES......................................................................................................43
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................4
VII
RESUMO
SILVESTRE, E. A. Caracterização genética de caprinos da raça Anglonubiana
no Centro Norte do Piauí. 2012. 53p. Dissertação para obtenção do título de
Mestre em área de concentração em Genética e Melhoramento - Universidade
Federal do Piauí, Teresina, Piauí, 2012.
O caprino Anglonubiano é um animal resistente, indicado para cruzamentos
com as cabras mestiças melhorando a produção de leite e carne, sendo úteis para
regiões de clima tropical. Este trabalho teve como objetivo a caracterização da
variabilidade genética da raça Anglonubiana em rebanhos de seleção no Centro
Norte do Piauí. Foram coletados pêlos de 96 animais da raça Anglonubiana em
quatro fazendas localizados nos municípios de Angical, José de Freitas, Teresina e
Campo Maior, sendo 24 animais em cada fazenda. Para a caracterização da raça foi
utilizado um painel de 25 microssatélites sugeridos pela FAO. A extração do DNA foi
realizada com o uso da resina Chelex-100 (Bio-Rad) e após as amplificações, as
amostras foram genotipadas em gel de acrilamida a 7%, e coradas com nitrato de
prata. Foram realizadas análises de variabilidade genética, além da verificação a
aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg e das análises da diversidade genética
utilizando as estatísticas de Nei. O nível de estruturação genética foi avaliada, pelo
programa STRUCTURE. Dos 25 locos analisados, oito foram utilizados para a
caracterização da raça Anglonubiana por apresentarem amplificações consistentes
(ILSTS11, ETH225, McM527, INRA23, ETH10, OarfCB304, OarfCB48 e MAF209). O
número médio de alelos por loco foi de 3,88. Parte dos locos apresentaram desvios
significativos para o EHW, indicando certo grau de endogamia. Porém, foi também
evidenciada possível presença de alelos nulos nas análises. O coeficiente de
diferenciação genética (GST’) mostrou que 11,9% da variação genética existente,
está distribuída entre as populações e 88,1% dentro. O valor de GIS (27,9%) indicou
deficiência de heterozigotos nas populações. O programa STRUCTURE indicou a
existência de três grupos distintas (ΔK=3). Porém os resultados mostram que os
rebanhos analisados ainda estão pouco estruturados.
Palavras-chave: Capra hircus, caracterização molecular, diversidade genética,
microssatélite
VIII
ABSTRACT
Silvestre, E. A. Genetic characterization of Anglonubian goats in Central
Northern Piaui. 2012. 53p. Dissertation presented to the Federal University of Piauí,
Teresina, Piauí, 2012 in fulfillment of requirements for the Degree of Master in
Genetics and Breeding.
The Anglonubian goat is a resistant animal, indicated for breeding with
naturalized animals to improve the production of milk and meat. This study was
aimed at describing the genetic variability of Anglonubian herds in Central Northern
Piauí. Hair samples were collected from 96 Anglonubian goats from four different
farms located in Angical, José de Freitas, Teresina and Campo Maior, 24 animals
from each farm. A panel of 25 microsatellites suggested by FAO were used for
characterization. DNA extraction was performed with Chelex-100 resin (Bio-Rad).
After amplification, samples were genotyped by acrylamide gel electrophoresis 7%,
and stained with silver nitrate. The genetic variability and deviation from HardyWeinberg equilibrium were estimated. Nei tests were performed and the level of
genetic structure was evaluated with the STRUCTURE software. Of the 25 loci
analyzed, eight were used to characterize the Anglonubian breed due to consistent
amplifications (ILSTS11, ETH225, McM527, INRA23, ETH10, OarfCB304, and
OarfCB48 MAF209). The average number of alleles per locus was 3.88. Most loci
showed significant deviations for HWE, indicating some degree of inbreeding.
However, null alleles may be present in the analysis. The coefficient of genetic
differentiation (GST ') showed that 11.9% of the genetic variation is distributed among
and 88.1% within populations. Based on GIS (27.9%), the populations examined
showed heterozygote deficiency . The program STRUCTURE indicated the existence
of three distinct populations (K = 3). These results show that the herds sampled are
poorly structured.
Keywords: Capra hircus, genetic diversity, microsatellite, molecular characterization
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Exemplares de caprinos da raça Anglonubiana........................................16
Figura 2 - Mapa do estado do Piauí, destacando os locais de coleta das amostras.
Fonte: modificado do Wikipédia, 2012.......................................................................24
Figura 3 - Teste para amplificação dos primers McM527 e ETH10 (10 amostras
cada) em gel de agarose 1%......................................................................................30
Figura 4 - Gel de acrilamida 7% do loco INRA23 (A) e OarfCB48 (B) mostrando seus
respectivos alelos (indicado pelas setas azuis) e setas vermelhas indicando o ladder
10pb............................................................................................................................30
Figura 5 - Histograma das frequências alélicas dos oito locos SSR estudados nas
quatro populações de caprino Anglonubiano amostradas. O eixo Y indica as
frequências alélicas e o eixo X o número de alelos alelos encontrados. Legenda:
azul (Angical), vermelho (José de Freitas), verde (Teresina) e roxo (Campo
Maior).........................................................................................................................33
Figura 6 - Dendrograma construído para o método UPGMA para as quatro
populações de Anglonubianos estudadas..................................................................38
Figura 7 - Dendrograma dos indivíduos como unidades taxônomicas pelo método
UPGMA. Cor determinada pelo programa STRUCTURE (azul = José de Freitas;
vermelho = Teresina; verde = Angical + Campo Maior). a = Angical, jf = José de
Freitas, t = Teresina e cm = Campo Maior.................................................................39
Figura 8 - Representação gráfica do ΔK mais provável de acordo com Evanno, et. al.
(2005).........................................................................................................................40
Figura 9 - Designação das populações de Anglonubiano usando a estrutura baseada
na alocação das amostras para K=3. 1- Angical, 2- José de Freitas, 3-Teresina, 4Campo Maior..............................................................................................................41
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Microssatélites com suas respectivas, sequências direta e reversa,
tamanho em pares de base (pb) esperados, temperatura de anelamento
recomendada e referência bibliográfica.....................................................................26
Tabela 2 - Número de alelos por loco (A), riqueza alélica (Ar), valor PIC,
heterozigosidade esperada (HE), heterozigosidade observada (HO) e frequência de
alelos nulos (θ) para os oito locos analisados............................................................31
Tabela 3: Número médio de alelos por loco (A), riqueza alélica (Ar), valor PIC,
heterozigosidade esperada (HE), heterozigosidade observada (HO) e número de
indivíduos amplificados (N) considerando os oito locos para as quatro populações
analisadas..................................................................................................................32
Tabela 4 - Teste exato de aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p-valor) para
cada loco dentro de cada população (valores não significativos encontram-se em
negrito).......................................................................................................................35
Tabela 5 - Estrutura genética das populações de caprinos da raça Anglonubiana
através das estatísticas de Nei (1973) para os 8 locos analisados...........................36
Tabela 6: Estrutura genética das populações de caprinos da raça Anglonubiana
considerando cada população....................................................................................37
Tabela 7 - Matriz das distâncias genéticas de Rogers (1972) modificada por Wright
(1978), das quatro populações. 1- Angical, 2- José de Freitas, 3- Teresina, 4- Campo
maior (diagonal inferior). Distâncias geográficas em km entre os municípios (diagonal
superior).....................................................................................................................37
11
1. INTRODUÇÃO
A produção de caprino no Brasil é uma atividade econômica que nos últimos
anos tem mostrado expansão, sendo que o efetivo de caprinos teve em 2010 um
aumento de 1,6% em relação a 2009. A Região Nordeste possui o maior efetivo de
animais, superando 90% do total nacional, que se destinam a produção de carne e
também de leite (IBGE, 2010). Esse crescimento é em consequência de inúmeras
vantagens que a criação de caprinos apresenta em relação a outras culturas,
merecendo destaque à necessidade de menor área para a criação, menor consumo
de alimento por animal, facilidade de manejo, além da diversidade de produção
(NEVES et al., 2008).
A região Nordeste se caracteriza por ser um ambiente adverso à produção de
animais de grande porte, cuja limitação é devida, principalmente, à escassez de
água e à ocorrência de altas temperaturas durante as épocas mais secas do ano.
Assim, a criação de animais de médio porte torna-se importante para as populações
de baixa renda, cuja limitação de recursos financeiros, implica na necessidade de
animais com adequação a esse ambiente, que lhes sirvam em termos de produção
de leite, queijo, carne e couro (SILVA e ARAÚJO, 2000; SILVA et al., 2008).
Nos últimos anos a introdução de raças exóticas de caprinos no semiárido do
Nordeste tem sido observada. A principal justificativa para essas importações é a
busca de melhoria da produtividade, já que raças mais especializadas são
apresentadas como alternativa viável para contornar o problema do baixo
desempenho dos atuais rebanhos nativos no semiárido do Nordeste (SANTOS et al.,
2005). Dentre as opções para esse fim, a raça Anglonubiana tem sido a mais usada
pelos produtores, especialmente para a produção de leite na porção leste da região
(FREITAS et al., 2004). Por outro lado, a introdução de raças exóticas pode causar a
descaracterização dos rebanhos nativos, levando a extinção destes como grupo
genético, razão pela qual se faz necessário controle sobre a introdução de novas
raças, bem como do seu manejo genético no país.
A raça Anglonubiana é originária da Inglaterra, formada a partir de cruzamentos
entre caprinos ingleses comuns e reprodutores importados do norte da África (região
da Núbia no Egito) (MASON, 1988). Ela foi introduzida na região Nordeste do Brasil
a partir do século XIX, apresentada como raça exótica com potencial para melhoria
dos índices de produção dos rebanhos da região. Hoje a raça pode ser considerada
12
como naturalizada no país. São animais que apresentam grande porte e pelagem
com cores variadas, portanto, uma indicação de presença de variabilidade. É
divulgada como raça de dupla aptidão (produção de carne e leite), sendo que
segundo UNEB (2012) apresenta bom potencial para a produção de carne. Alem
disso, apresenta adaptabilidade a regiões semiáridas, por ter na sua formação a
presença de raça originária de país de clima quente (SILVA et al., 2006).
O estado do Piauí, como os demais do Nordeste, apresenta um número
significativo de caprinos da raça Anglonubiana, porém, em maior quantidade na
forma de mestiços, razão pela qual já assume importância socioeconômica para o
Estado, ao participar complementando a renda familiar no campo. Diante desse
contexto, a caracterização genética da raça no Estado seria essencial para planos
de melhoramento genético regional, além da utilização para fim comercial (SIDER e
ZAROS, 2008). Os resultados obtidos com estudos dessa natureza levariam ao
conhecimento da história da raça no país, além de contribuírem para o planejamento
de programas de manejo, melhoramento genético e até mesmo de conservação.
Neste contexto, as
análises
com marcadores
moleculares
têm sido
consideradas fundamentais, uma vez que podem ser utilizadas na caracterização
genética de populações, na estimativa das distâncias genéticas entre populações e
entre indivíduos, na análise filogenética, em mapas de ligação e na identificação
individual em controle de paternidade (PONSUKSILI et al., 1999). Assim, o presente
trabalho teve como objetivo usar marcadores moleculares baseados em locos de
microssatélites, para caracterizar a variabilidade genética em rebanhos que praticam
seleção na raça Anglonubiana, localizados na parte Centro Norte do Piauí.
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Caprinocultura no Brasil e Nordeste
A cabra doméstica (Capra hircus) foi introduzida no Brasil com a chegada dos
portugueses. Acredita-se que essa introdução tenha acontecido em 1534,
juntamente com os bovinos, quando Dona Ana Pimentel, esposa de Martim Afonso
de Sousa, solicitou a importação destes últimos na Capitania de São Vicente
(PIRES, 1990). A presença de caprinos no Brasil foi citada primeiramente por
Cardim em 1583 (MACHADO et al., 2000), sendo que esses animais vieram de
Portugal e Cabo Verde, para fornecer carne (DANTAS SILVA, 1995).
Desde então, o Brasil consolidou-se como criador destes
animais,
apresentando características edafoclimáticas apropriadas para a expansão e
incremento da produção dos rebanhos caprinos. A caprinocultura no Brasil ainda é
uma atividade desenvolvida de forma empírica e extensiva, com baixos níveis
tecnológicos. Porém, nos últimos anos esta atividade tem recebido incentivos de
ações conjuntas de governos estaduais, instituições de pesquisa e empresários
rurais (SEBRAE, 2007). Essa atividade caracteriza-se, principalmente, pela sua
importância sócio-econômica junto à população do semiárido nordestino (BEZERRA
et al., 2001a).
A maior parte do rebanho de caprino brasileiro se concentra na Região
Nordeste, ocupando pequenos núcleos de criação privados e públicos (RIBEIRO et
al., 2004). Segundo IBGE (2010), o Brasil possui um efetivo de 9.312.784 caprinos,
dos quais 8.458.578 estão nesta região. O Estado do Piauí é o terceiro maior
produtor, com um rebanho de 1.386.515 cabeças, sendo superado apenas pela
Bahia e Pernambuco. Estes dados revelam o potencial que a região possui para o
desenvolvimento de políticas associadas à caprinocultura. Esta região apresenta
baixos índices zootécnicos por não utilizar tecnologias compatíveis com a realidade
ambiental e financeira da mesma. Esses animais são explorados em sistemas de
manejo extensivo utilizando grandes áreas, com o uso, principalmente, de animais
mestiços e sem raça definida (SRD) e em muitos casos sem cuidados sanitários
requeridos. Entretanto, ao se buscar conhecer todos os elementos que interferem
nesses índices pode-se obter maior eficiência reprodutiva e produtiva dos rebanhos
(PIMENTA FILHO et al., 2002).
14
Em unidades produtivas que utilizam algum nível de tecnologia, é evidente a
melhoria na produção e reprodução, criando assim perspectivas de organização
empresarial da atividade (COSTA et al., 2003). A esse respeito, no sistema
extensivo a vegetação da caatinga é a fonte básica de alimentação, não se
adotando a suplementação alimentar, a não ser no período crítico de seca. Já no
sistema intensivo, a suplementação alimentar (energética, protéica e/ou mineral) é
utilizada para obtenção da melhoria na produção e reprodução do rebanho. Além
das fontes alimentares disponíveis na natureza, há a utilização de campos cultivados
e suplementação alimentar (pastejo misto) (FERNANDES FILHO, 2007).
Além da deficiência tecnológica, a população do Nordeste brasileiro enfrenta
diversos desafios referentes à alimentação, desigualdades de renda, de educação,
de saúde, de acesso ao trabalho e aos meios de produção (VALENTE, 1997). No
estado do Piauí, a caprinocultura tem sido trabalhada visando à produção de carne,
como acontece na maior parte do semiárido do Nordeste. Além do papel econômico,
esta atividade também desempenha um papel social contribuindo para a melhoria da
qualidade de vida no campo, onde as condições de sobrevivência são mais difíceis
(SILVA SOBRINHO e GONZAGA NETO, 2002). Essa atividade vem sendo
considerada um instrumento eficaz para o desenvolvimento da zona semiárida. O
leite e a carne caprina são importantes fontes de proteína animal para as
populações de média e baixa renda, e a pele é muito utilizada na manufatura de
calçados e vestimentas gerando renda monetária a médio e longo prazo (SILVA e
ARAÚJO, 2000; BEZERRA et al., 2001b).
Os caprinos apresentam características peculiares que favorecem sua
exploração no Nordeste em relação aos animais de grande porte, dentre as quais se
destacam a adaptação à ampla variedade de condições climáticas, principalmente a
escassez hídrica, são rústicos que implica requerer pouca suplementação nutricional
(MEDEIROS et al., 1994). Outra característica importante é o seu comportamento
reprodutivo. Em geral, as fêmeas são consideradas poliéstricas estacionais, onde os
ciclos estrais acontecem em um determinado período do ano. Característica essa
herdada de raças de clima temperado com fotoperíodo bem caracterizado durante o
ano (GRANADOS et al., 2006). Em zonas tropicais a intensidade luminosa quase
não apresenta variação durante as quatro estações, levando as fêmeas a serem
poliéstricas não estacionais e, portanto, apresentando cio mais vezes no ano. A
15
estacionalidade reprodutiva dependerá principalmente de fatores como condições
térmicas e alimentação (HAFEZ, 1995; FREITAS e LOPES JÚNIOR, 2002).
Muitos produtores buscam a melhoria de seus rebanhos por meio de seleção
dentro da raça, ou recorrendo à utilização de mais de uma raça através de
cruzamentos, que é uma opção de alterar a produção e produtividade do plantel de
forma mais rápida. O cruzamento entre raças especializadas e locais tem sido
incentivado por proporcionar genótipos com melhor rendimento e qualidade de
carcaça, razão pela qual nos últimos anos algumas raças exóticas têm sido
introduzidas no país, principalmente com a perspectiva de melhorar geneticamente a
produção de carne e leite das raças locais. Esses animais introduzidos são criados
em rebanhos puros, onde são multiplicados reprodutores que são comercializados
para uso em rebanhos de produção, geralmente em acasalamentos sem registro
zootécnico (OLIVEIRA, 2006).
2.2. A raça Anglonubiana
O registro da raça Anglonubiana no Brasil é datado de 1859 sendo que sua
introdução ocorreu no estado da Bahia. É uma raça bem adaptada a regiões de
clima tropical, com sistema de manejo intensivo, podendo ser criada em sistema de
manejo extensivo e semiextensivo. São animais de grande porte apresentando peso
médio de 90 kg nos machos e 70 kg nas fêmeas, porém podendo alcançar até 120
kg (OLIVEIRA, 2006), se criados em manejo intensivo. A raça Anglonubiana
caracteriza-se por apresentar dupla aptidão: propícia à produção de carne e leite.
As principais características raciais são: a cabeça tem chanfro com perfil
convexo e é bem conformada, com cornos ou amochada. Apresenta orelhas com
implantação alta e longas, espalmadas, pendentes, ultrapassando a ponta do
focinho em até três centímetros, possui o pavilhão interno voltado para a face e as
extremidades voltadas para frente. Machos e fêmeas podem apresentar barbela de
tamanho pequeno. Apresenta a linha dorso-lombar com tendência de elevação rumo
a garupa. Os pêlos são curtos de espessura regular, mas nos machos pode se
apresentar mais espessos ao longo da linha dorsal. A pelagem é variada
predominando as cores escuras, mas frequentemente a malhada ou tartaruga. Os
cascos são escuros em combinação com a cor da pelagem. A pele é frouxa e a
mucosa escura (OLIVEIRA, 2006). Apresenta facilidade de transmissão de suas
16
características, especialmente o tamanho e a forma da orelha, e o chanfro com perfil
convexo, o que leva a confundi-la com seus mestiços.
Estima-se que 36,4% dos rebanhos do estado do Piauí possuem animais da
raça Anglonubiana (SILVA et al., 2011) . Essa raça encontra-se bem distribuída no
Brasil. Com rebanhos nos estados do Piauí, Ceará, Pernambuco, Maranhão, Bahia,
Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo. De acordo com o SEBRAE a raça é
criada, sobretudo nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Minas Gerais e Bahia
(http://www.sebrae.com.br/setor/ovino-e-caprino/o-setor/racas-caprino/anglonubiana).
Figura 1: Exemplares de caprinos da raça Anglonubiana (Fonte: Pollyana Oliveira)
A raça Anglonubiana é indicada para cruzamentos com raças nativas ou tipos
sem padrão racial definido (SRD), visando melhor produção de carcaça e leite, essa
prática tem produzido resultados satisfatórios no Brasil e no mundo (SILVA e
ARAÚJO, 2000). Esta raça apresenta um bom desempenho produtivo e reprodutivo
aliado à rusticidade e por isso se mostra resistente às adversidades climáticas do
Nordeste (PEREIRA, 1999). Medeiros et al. (1997 e 1998) apontam a raça
Anglonubiana como uma das mais recomendadas para as condições do Brasil
Central, por ser originária de regiões de clima tropical da África e por apresentar
produção de leite e carne superior às raças nativas e tipos comuns nacionais.
Segundo Borges e Gonçalves (2002), a produção leiteira da raça chega a ser de 2 a
4 kg/dia. Os cabritos vão para o abate aos três meses, com aproximadamente 21 a
22 kg, se manejados com suplementação alimentar.
17
Trabalhos de levantamento populacional realizados com caprinos no estado
do Piauí mostraram que a raça Anglonubiana apresenta grande participação na
formação de alguns dos grupos raciais da região, principalmente em relação à
contribuição dos animais SRD (COSTA, 2010 e CASTELO BRANCO, 2001).
2.3. Uso de marcadores moleculares na caracterização genética
Os marcadores moleculares podem ser qualquer fenótipo proveniente de um
gene expresso ou de um segmento de DNA não expresso e devem segregar pelas
gerações segundo padrões mendelianos (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
Podem diferir de várias formas: quanto ao nível de polimorfismo, ao tipo de herança,
à reprodutibilidade, à abundância dentro do genoma, à especificidade dos locos, às
técnicas utilizadas e ao investimento financeiro (BUSO et al., 2003).
São as ferramentas mais eficazes para o estudo de Genética de populações,
tornando-se importante para o melhoramento genético das espécies de interesse
econômico. Assumem também importante papel nos programas de conservação “in
situ” e “ex situ” de animais em vias de extinção. São úteis na determinação do nível
de consaguinidade, estrutura e diversidade genética das populações. Geram
informações genéticas sobre a história, a geografia e as relações ecológicas entre
as espécies (HAIG, 1998; BARON, 2000). Além de identificar locos de
características de interesse econômico (QTLs), mapeamento genético, estudos
evolucionários, identificação de paternidade, introgressão de genes úteis, estudos
diagnóstico precoce de doenças e seleção assistida por marcadores (AMARANTE e
WOMACK, 2004).
Dentre os marcadores moleculares estão os marcadores Restriction Fragment
Length Polymorphism (RFLP); minissatélites ou loco Variable Number of Tandem
Repeats (VNTR); Random Amplied Polymorphic DNA (RAPD); Sequence Tangged
Sites (STS); Amplied Fragment Length Polymorphism (AFLP), microssatélites ou
Single Sequence Repeats (SSR) e Single Nucleotide Polimorphism (SNPs).
Os microssatélites apresentam algumas vantagens em relação aos outros
marcadores como: elevada heterozigosidade, necessidade de pequenas amostras
de DNA, fáceis de interpretar, não são afetados por variações ambientais, permitem
selecionar regiões especificas dentro da molécula de DNA, mais informativos,
multialélicos, codominantes, conservados entre espécies relacionadas, abundante
18
no genoma, possuírem alta reprodutibilidade e amplificarem facilmente por PCR
(FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; SALLES et al., 2003). São compostos por
sequências simples repetidas de nucleotídeos e menores que 100 pares de base de
comprimento (TAUTZ, 1989). Geralmente, essas sequências estão localizadas em
regiões não codificadoras, mas também podem ser encontradas com menor
frequência em regiões codificadoras (SCHLÖTTERER e TAUTZ, 1992). Sua
classificação é realizada de acordo com o tamanho e a complexidade da sequência
que compõe as repetições. Nos microssatélites, as repetições dos nucleotídeos são
denominadas por mono, di, tri, ou tetranucleotídeos em número variável de vezes.
Tais sequências nucleotídicas podem ser produzidas por disfunção da polimerase ao
copiar a mesma sequência várias vezes durante a replicação do material genético,
recombinação desigual ou alinhamento incorreto das fitas de DNA (MOORE et al.,
1994). Segundo Schug et al. (1998), a maioria dos microssatélites estudados são
repetições do tipo dinucleotídeos.
As diferentes repetições encontradas nos microssatélites são divididas em
repetições perfeitas, quando não apresentam nenhuma interrupção; repetições
imperfeitas, quando são interrompidas por bases não repetidas e repetições
compostas, quando duas ou mais repetições de microssatélites estão dispostas
adjacentemente (CAIXETA et al., 2006). De acordo com a FAO (2004), são
necessários 25 marcadores microssatélites para estudo de distância genética em
espécies domésticas, desde que obedeçam aos seguintes critérios: apresentar
domínio público; não serem ligados; com herança mendeliana; possuírem no mínimo
quatro alelos; preferivelmente que possuam homologia entre espécies relacionadas;
que possam ser usados em qualquer sequenciador automático, em mutiplex e de
fácil reprodutibilidade.
Os alelos microssatélites são revelados pela amplificação utilizando a Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) com iniciadores específicos que variam em número
de pares de bases, complementares a sequências que flanqueiam a região repetitiva
(FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). A análise de microssatélites por PCR em
relação ao uso de sondas é vantajoso devido ao tamanho pequeno do fragmento
microssatélite, coamplificação por PCR (multiplex), e a simples interpretação dos
resultados. Além disto, os testes são mais rápidos, padronizados e automatizados
(BUROW e BLAKE, 1998). Estudos da homologia genética entre espécies
19
ruminantes mostraram que 34% e 43% dos locos de microssatélites de bovinos e
ovinos, respectivamente foram polimórficos em caprinos (VAIMAN et al., 1996).
Tendo em vista a expressão codominante e o multialelismo, os marcadores
microssatélites são os que possuem o mais elevado conteúdo de informação. Por
isso, são considerados os mais indicados para estudos de diversidade genética,
mapa genético, fluxo gênico. Além de serem utilizados no esclarecimento de
paternidades duvidosas, na detecção de introgressões, definição da estrutura das
populações, avaliação de fontes de novos fundadores para populações pequenas e
ameaçadas de extinção e poderem indicar locais para reintrodução (FRANKHAM et
al., 2008). No mapeamento genético busca-se identificar polimorfismos relacionados
a regiões genéticas de interesse, mesmo que não se conheça o gene diretamente
envolvido no fenótipo em questão (WOMACK, 1993). Desta forma, tornam-se úteis
em estudos de genética de populações e melhoramento, pois constituem uma
ferramenta ideal para a associação entre o fenótipo e o genótipo monogênico ou
poligênico (IHARA et al., 2004).
Nos últimos anos tem-se observado o crescimento da genômica no Brasil,
tendo início na década de 90. Divide-se em genômica estrutural e funcional. A
genômica estrutural como o nome diz, estuda a estrutura dos genes e aborda desde
as ferramentas de mapeamento genético, sequenciamento e análise estrutural e
modelagem de proteínas. Já a genômica funcional, estuda a função dos genes,
tendo como principal ferramenta os estudos de expressão gênica, abordando
principalmente a análise de transcriptomas (SIDER e ZAROS, 2008). A produção de
pequenos ruminantes tem sido beneficiada pelas ferramentas da genômica, porém,
há ainda muito que ser feito.
Alguns trabalhos já foram realizados com caprinos utilizando essa nova
abordagem. Entre eles estão, o mapeamento genético de caprinos (VAIMAN et
al.,1996), que tem assumido grande importância nos estudos de genômica e
genética molecular permitindo estudar a arquitetura genética de características
quantitativas (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). E o uso de bibliotecas Bacterial
Artificial Chromosome (BAC) (SCHIBLER et al., 1998).
A tecnologia de microarranjos para a espécie caprina ainda não foram
descritos. No entanto, é comum recorrer à genômica comparativa, por exemplo,
aplicando microarranjos bovinos para testar cDNAs de caprinos (SIDER et al., 2008).
A genômica comparativa também tem ajudado a superar a limitação nos estudo de
20
seleção assistida por marcadores, que ainda não está sendo plenamente aplicada
ao melhoramento de caprinos, em parte em função da escassez de informação
genética nesta espécie (SIDER e ZAROS, 2008).
O projeto brasileiro de grande porte intitulado Desenvolvimento de
Biotecnologias para Promoção Socioeconômica Sustentável da Caprinocultura
(BioBode) apoiado financeiramente pela FINEP, foi iniciado, visando a aplicação da
Conservação da biodiversidade, a Genômica Funcional, a Proteômica, a
Bioinformática e a Prospecção de genes em benefício do aumento da informação
genética em caprinos. (SIDER e ZAROS, 2008).
2.4. Estimativas populacionais
O estudo da diversidade genética entre e dentro de populações permite gerar
informações importantes para a melhor gestão das populações analisadas. Dentre
os parâmetros mais utilizados estão, a estimativa da frequência alélica,
heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He), conteúdo de informação
polimórfica (PIC), desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), estatística F (FST,
FIT e FIS), e distâncias genéticas.
A frequência alélica representa a proporção de um dado alelo em relação ao
total de alelos de um mesmo loco cromossômico. Sendo estimada pela contagem
direta dos alelos de um loco e considerando que a população está em equilíbrio de
Hardy-Weinberg (ROCHA, 2009). A variância da frequência alélica é dada por:
Sendo, x a frequência alélica e n o número de indivíduos da amostra.
A heterozigosidade pode ser considerada uma medida de diversidade
genética (MENEZES et al., 2006), sendo nada mais que a proporção de indivíduos
heterozigotos observados, por locos, na população. A heterozigosidade de um
marcador é a possibilidade de um indivíduo ser heterozigoto no loco marcado e
dependerá do número de alelos e suas respectivas frequências. Para que um loco
seja considerado polimórfico, o alelo mais comum deve apresentar uma frequência
inferior a 95% e, para ser considerado altamente polimórfico a heterozigosidade
21
deve ser maior que 70%, implicando frequência menor do que 0,55 do alelo mais
frequente (OTT, 1992).
O conteúdo de informação polimórfica (PIC) indica a informatividade do
marcador em estudos genéticos (BOTSTEIN et al., 1980). No entanto, o PIC
apresenta dependência do número de alelos e suas respectivas frequências. Sendo
assim, o PIC não deve ser o único fator utilizado para eleger um marcador ou
descartá-lo (MOAZAMI-GOUDARZI et
al.,
1994). São
considerados
muito
informativos os valores superiores a 0,5, mediamente informativos entre 0,5 e 0,25 e
pouco informativos quando inferiores a 0,25 (BOTSTEIN et al., 1980).
Segundo Falconer (1987), para que uma população esteja em equilíbrio de
Hardy-Weinberg é necessário que ela seja grande, com acasalamento ao acaso,
com ausência de migração, mutação e seleção, sendo assim, tanto as frequências
alélicas como as genotípicas são constantes de geração em geração, e as
frequências genotípicas são determinadas pelas frequências alélicas. Deste modo,
qualquer alteração das condições citadas acima, promove o desvio às proporções
equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Esse desvio pode ser quantificado pela expressão:
Qualquer desvio significativo do equilíbrio indicará que na população existe
consanguinidade significativa, que a população pode estar subdividida ou com
presença de fluxo gênico de outra população (MENEZES et al., 2006).
Wright (1951) propôs a teoria da estatística F para medir os desvios das
frequências genotípicas em populações subdivididas através de três parâmetros: FIS,
FIT e FST. No qual, o FIT é o coeficiente de consanguinidade nos indivíduos do
conjunto populacional, o FST é o coeficiente de consanguinidade entre populações
(devido à subdivisão) e FIS é o coeficiente de consanguinidade intra-populacional
(OLIVEIRA et al., 2006).
O FST mede o grau de divergência entre populações, descreve a proporção de
variância dentro de uma espécie devida à subdivisão populacional e é inversamente
proporcional ao fluxo gênico. Os valores de FST variam de 0 (não há diferenças
genéticas entre as populações) a 1 (fixação de diferentes alelos nas populações). O
FIS é considerado o coeficiente de endogamia calculado como média de todos os
22
indivíduos de todos os fragmentos populacionais e o FIT corresponde à endogamia
da população total. Se os valores de FIS e FIT forem negativos ou próximos de zero,
existe variabilidade genética na população devido ao excesso de indivíduos
heterozigotos (WRIGHT, 1965).
A distância genética é a medida do grau de diferenciação entre dois grupos
populacionais. Se não há diferença entre as populações a distância é considerada
zero. No entanto, se as duas populações não tiverem alelos em comum em todos os
locos, a distância se aproxima de um. As medidas de distâncias genéticas são úteis
para reconstrução das relações históricas e filogenéticas entre grupos e no estudo
da estrutura genética dentro da espécie (NEI, 1987). Na literatura encontram-se
diversas medidas de distâncias genéticas, tais como as distâncias de Nei (D
(distância padrão), D´(distância máxima) e Dm (distância mínima) (NEI, 1973), a
distância de Rogers (ROGERS, 1972), distância de Kimura 2-parâmetros (KIMURA e
OHTA, 1978), distância de Reynolds (REYNOLDS et al., 1983), Cavalli-Sforza
modificada (DA) de Nei et al. (1983), distância de Tamura e Nei (TAMURA e NEI,
1993), dentre outras medidas.
Uma vez estabelecidas às distâncias, as análises de grupamento podem ser
utilizadas para classificar n elementos diversos (populações, indivíduos, etc.),
avaliados por um conjunto de p caracteres ou variáveis, a partir de uma medida de
distância entre os elementos (DIAS, 1998). As árvores de distância (dendrogramas)
são representações gráficas ou mapas da matriz de distância, obtidas com estas
técnicas. Existem diferentes critérios para construção de árvores a partir de uma
matriz de distância. Os mais utilizados são o Unweighted pair group method with
arithmetic means (UPGMA) e o Neighbor-joining (NJ) (EDING e LAVAL, 1999).
O método UPGMA baseia-se no agrupamento sucessivo de pares de táxons,
de acordo com o nível de similaridade. O fundamento desse método é comparar os
táxons mais semelhantes (menores distâncias) e agrupá-los. Nei et al. (1983)
compararam diferentes métodos para construir árvores filogenéticas, sendo
observado que o UPGMA comportava-se melhor quando as taxas de substituição
eram as mesmas para todas as árvores. Desta forma, deve-se assumir que as taxas
de substituição sejam iguais para que o método possa ser utilizado.
O método de NJ, desenvolvido por Saitou e Nei (1987), é utilizado para
identificar os pares mais próximos ou vizinhos, populações ou grupos de populações
(unidades taxonômicas), de forma que se minimize a longitude total da árvore. Para
23
se identificar os vizinhos é necessário reduzir o número de unidades até restarem
três, assim obtém-se uma árvore sem raiz. O NJ é um método aplicado para dados
puramente aditivos, onde a distância entre cada par de unidades taxonômicas é a
soma das longitudes dos ramos que as unem na árvore.
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Amostragem
Amostras de pêlo de 96 animais da raça Anglonubiana “puros de origem” (PO)
foram coletadas em fazendas que se destinam a multiplicação de reprodutores para
a comercialização de genética da raça Anglonubiana no entorno de Teresina, onde
se localiza o centro de dispersão da raça no Piauí. Estas coletas foram realizadas no
Centro Norte do Estado do Piauí (Figura 2). Visto que é maior a contribuição dos
reprodutores na variabilidade genética da raça, foram amostrados preferencialmente
os reprodutores dos rebanhos, bem como machos jovens destinados a reprodução.
As coletas aconteceram nos municípios de Angical (7 machos e 17 fêmeas), José de
Freitas (11 machos e 13 fêmeas), Teresina (10 machos e 14 fêmeas) e Campo
Maior (11 machos e 13 fêmeas) totalizando 24 animais de cada localidade. Foram
extraídos bulbos capilares da região dorsal e da cauda de cada animal, colocados
em envelopes identificados por animal e por proprietário/município e acondicionados
em freezer até o momento da extração do DNA.
Figura 2: Mapa do estado do Piauí, destacando os locais de coleta das amostras. Fonte:
modificado do Wikipédia, 2012.
25
3.2. Extração do DNA
Para a extração do DNA recolheu-se aproximadamente 20 bulbos de pêlo de
cada animal. Estes foram colocados em microtubos, onde foram adicionados 100µL
de solução de extração (40 mL de água Milli-Q e 4 g de Chelex-100). Em seguida,
as amostras foram incubadas a 95 ºC, durante 20 minutos, sendo posteriormente
centrifugadas a 14000 g por 3 minutos. O sobrenadante contendo o DNA genômico
foi transferido para um novo microtubo e as amostras foram armazenadas a -20 ºC
até o momento das análises.
3.3. Marcadores Microssatélites
Foi utilizado um painel com 25 marcadores microssatélites, recomendados pela
FAO (2004) para estudo de diversidade genética em animais domésticos. A
identificação, procedência e condições de reação de cada marcador estão descritas
na Tabela 1. Dentre os marcadores descritos na Tabela 1, grande parte é de origem
bovina e ovina. Apenas os marcadores CSRD247 e SRCRSP8 são de origem
caprina. A conservação de sítios microssatélites entre espécies relacionadas é
comum, possibilitando aproveitar primers (heterólogos), que foram desenvolvidos
para uma determinada espécie e que podem ser utilizados para outra
filogeneticamente próxima (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
As reações da PCR foram preparadas de acordo com os seguintes reagentes,
3 µL de DNA, 1,5 µL de tampão para PCR (1X), 0,6 µL de MgCl2 (2 mM), 1,2 µL de
dNTP (0,2 µM), 0,6 µL de BSA (0,4 mg/mL) 1,2 µL de Taq DNA-polimerase (1U),
0,3 µL de cada Primer (0,1 µM) e água ultrapura até completar o volume final de 15
µL. Os produtos foram preparados em placas para PCR de 96 poços, com as
amplificações realizadas em um termociclador MJ Research PTC-100 de acordo
com os seguintes ciclos: desnaturação inicial de 10 minutos a 94 ºC; 35 ciclos:
desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, seguida de anelamento do primer em
temperatura de acordo com a Tabela 2 por 45 segundos e, 30 segundos a 72 ºC
para extensão. Após o término dos ciclos a reação prosseguiu com um período de
10
minutos
a
72
ºC
para
a
extensão
final.
26
Tabela 1: Microssatélites com suas respectivas, sequências direta e reversa, tamanho em pares de base (pb) esperados, temperatura de anelamento
recomendada e referências bibliográficas.
Microssatélite
Sequência direta e reversa
Variação de tamanho
esperada (pb)
Temperatura de anelamento
recomendada(°C)
Referências
bibliográficas
BM6506
D: GCACGTGGTAAAGAGATGGC
R: AGCAACTTGAGCATGGCAC
190-228
55
Bishop et al.,1994
BM8125
D: CTCTATCTGTGGAAAAGGTGGG
R: GGGGGTTAGACTTCAACATACG
100-128
50
Bishop et al.,1994
BM1818
D: AGCTGGGAATATAACCAAAGG
R: AGTGCTTTCAAGGTCCATGC
250-290
58
Li et al., 2002
BM1329
D: TTGTTTAGGCAAGTCCAAAGTC
R: AACACCGCAGCTTCATCC
153-185
55
Bishop et al.,1994
CSRD247
D: GGACTTGCCAGAACTCTGCAAT
R: CACTGTGGTTTGTATTAGTCAGG
208-250
58
FAO, 2004
CSRM60
D:AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA
R:AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG
79-85
60
Moore et al., 1994
ETH10
D: GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA
R: CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC
200-230
55
Solinas et al., 1993
ETH225
D: GATCACCTTGCCACTATTTCCT
R: ACATGACAGCCAGCTGCTACT
130-165
55
Barendse et al., 1994
HAUT27
D: TTTTATGTTCATTTTTTGACTGG
R: AACTGCTGAAATCTCCATCTTA
125-160
57
Thieven et al., 1997
HSC
D: CTGCCAATGCAGAGACACAAGA
R: GTCTGTCTCCTGTCTTGTCATC
270-306
55
ISAG, 2002
INRA023
D: GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC
R:TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTCA
185-230
58
Li et al., 2002
INRA063
D: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC
R: AAACCACAGAAATGCTTGGAAG
153-185
58
Vaiman et al., 1994
Continua
27
Tabela 1: Microssatélites com suas respectivas, sequências direta e reversa, tamanho em pares de base (pb) esperado, temperatura de anelamento
recomendada e referências bibliográficas. (conclusão)
Microssatélite
Sequência direta e reversa
Variação de tamanho
esperada (pb)
Temperatura de anelamento
recomendada (°C)
Referências
bibliográficas
INRA05
D: CTTCAGGCATACCCTACACCACATG
R: AAATATTAGCCAACTGAAAACTGGG
125-155
55
Vaiman et al., 1994
INRA06
D: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC
R: AAACCACAGAAATGCTTGGAAG
153-185
55
Bishop et al.,1994
D: GCTTGCTACATGGAAAGTGC
R: CTAAAATGCAGAGCCCTACC
253-295
58
Luikart et al., 1999
MAF209
D:GATCACAAAAAGTTGGATACAACGTGG
R:TCATGCACTTAAGTATGTAGGATGCTG
100-125
55
Luikart et al., 1999
MAF065
D: AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG
R: CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG
110-152
58
Luikart et al., 1999
McM527
D: GTCCATTGCCTCAAATCAATTC
R: AAACCACTTGACTACTCCCCAA
150-190
58
ISAG, 2002
D: CAAGACAGGTGTTTCAATCT
R: ATCGACTCTGGGGATGATGT
85-135
55
Mommens et al., 1994
D:GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC
R: GACTCTAGAGGATCGCAAAGAACCAG
140-170
58
Yang et al., 1999
D: CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG
R: CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG
130-180
56
Yang et al., 1999
OarFCB11
D:GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC
R: GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC
120-160
55
Yang et al., 1999
SRCRSP8
D: TGCGGTCTGGTTCTGATTTCAC
R: CCTGCATGAGAAAGTCGATGCTTAG
210-260
55
Luikart et al., 1999
D: AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG
R: AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG
235-265
55
Moore et al., 1994
D: CCCTCCTCCAGGTAAATCAGCR:
AATCACATGGCAAATAAGTACATAC
130-180
55
Georges et al., 1992
ILSTS011
MM12
OarFCB48
OarFCB304
SPS115
TGLA122
28
3.4. Genotipagem
O sucesso das PCRs foi primeiramente checado em eletroforese em gel de
agarose a 1%. As amostras que obtiveram amplificações consistentes, com bandas
bem definidas, foram posteriormente genotipadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 7%. O gel foi corado pelo método da prata seguindo procedimento
que envolve fixação com ácido acético, coloração com nitrato de prata 0,1% e
revelação em carbonato de sódio (CAETANO-ANOLLÉS e GRESSHOFF, 1994). O
tamanho dos alelos foi determinado com o auxílio do ladder de 10pb (InvitrogenTM).
Os genótipos obtidos para cada indivíduo foram avaliados e anotados manualmente.
3.5. Análise estatística
O número de alelos por loco (A), frequências alélicas, heterozigosidade
observada (Ho), heterozigosidade esperada (He) e Polymorphism Information
Content (PIC) (BOTSTEIN et al., 1980) foram calculados pelo Excel Microsatellite
Toolkit (MSTOOLS) (PARK, 2001). O programa GDA v.1.0 (LEWIS e ZAYKIN, 2012)
foi utilizado para a identificação de alelos privados. A riqueza alélica corrigida para o
tamanho amostral (Ar) foi calculada pelo programa FSTAT v.1.2 (GOUDET, 1995).
O teste para verificar se cada loco está de acordo com as proporções
esperadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg foram calculados por meio do
programa Genepop v.3.1 (RAYMOND e ROUSSET, 1995), bem como a correção de
Bonferroni com nível nominal de 5% de probabilidade. A presença e frequência de
alelos nulos foram determinadas pelo programa MicroChecker 2.2.3 (VAN
OOSTERHOUT et al., 2004).
A estruturação genética foi verificada através das estatísticas de Nei (1973,
1987) calculadas pelo programa FSTAT v.1.2 (GOUDET, 1995). A interpretação dos
resultados foi realizada como descrito para as estatísticas F de Wright (1931), por
serem análogas às estatísticas de Nei (HOLSINGER e WEIR, 2009).
A matriz de distância genética de Rogers (1972) modificada por Wright (1978)
foi obtida pelo programa TFPGA v.1.3 (MILLER, 1997) e usada na construção de
dendrograma com o programa NTSYS-pc v. 2.1 (ROHLF, 2000) pelo critério de
agrupamento UPGMA (SOKAL e MICHENER, 1958).
29
Foi utilizado o programa STRUCTURE (PRITCHARD et al., 2000) para definir
o número de grupos (K) mais provável nas amostras, por meio de métodos
bayesianos, sem informações a priori sobre a origem das amostras, com o objetivo
de visualizar a estrutura genética das mesmas. Foram usados os seguintes
parâmetros: 300.000 simulações de Cadeias de Markov Monte Carlo; burn in de
500.000; modelo de ancestralidade com miscigenação (admixture); e modelo de
frequências alélicas correlacionadas. O K variou de 1 a 12 e a determinação do K
mais provável em relação aos propostos foi realizada utilizando valores de ΔK,
proposto por Evanno et al. (2005).
30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos
25
microssatélites
propostos,
foram
escolhidos
oito
locos
que
apresentaram amplificações mais consistentes: ILSTS11, ETH225, McM527,
INRA23, ETH10, OarfCB304, OarfCB48 e MAF209 (Figuras 3 e 4), sendo estes
escolhidos no estudo para a caracterização da raça nos rebanhos com seleção de
reprodutores.
O número de alelos por loco variou de dois a seis para estes marcadores
(Tabela 2).
Figura 3: Teste para amplificação dos locos McM527 e ETH10 (10 amostras cada) em gel de
agarose 1%.
Figura 4: Gel de acrilamida 7% do loco INRA23 (A) e OarfCB48 (B) mostrando seus
respectivos alelos (indicado pelas setas azuis) e setas vermelhas indicando o ladder 10pb.
31
As
medidas de riqueza alélica para cada loco também mostraram
concordância com os resultados obtidos para o número absoluto de alelos (Tabela
2).
Tabela 2: Número de alelos por loco (A), riqueza alélica (Ar), valor PIC, heterozigosidade esperada
(HE), heterozigosidade observada (HO) e frequência de alelos nulos (θ) para os oito locos analisados.
Locos
A
Ar (média)
PIC
He
Ho
Θ
ILSTS11
3
2,159
0,1316
0,1407
0,1290
0,0094
ETH225
3
2,356
0,2025
0,2243
0,0000
0,1707
McM527
3
3,000
0,5467
0,6290
0,3516
0,1621
INRA23
5
4,942
0,7223
0,7663
0,4565
0,1901
ETH10
4
3,504
0,4454
0,5313
0,4268
0,0407
OarfCB304
6
5,501
0,6068
0,6492
0,3793
0,1660
OarfCB48
5
4,440
0,6470
0,7067
0,4194
0,1569
MAF209
2
2,000
0,3650
0,4831
0,5385
-0,0416
Média
3,88
3,4877
0,4584
0,5163
0,3376
0,1068
O número médio de alelos por loco foi 3,88, sendo que valores semelhantes
já foram encontrados em outros estudos com cabras Alpina Ibex (MAUDET et al.,
2002). Barker (1994), relata que, são necessários no mínimo quatro alelos para
diminuir o efeito do erro padrão para o cálculo de distância genética entre as
populações. No loco MAF209 foram encontrados apenas 2 alelos, sendo esse loco
inicialmente descrito em ovinos. Porém, apesar do baixo nível de polimorfismo em
caprinos, este marcador vem sendo citado em outros estudos com estes animais
(LUIKART et al., 1999; MENEZES et al., 2006). Estes trabalhos, em conjunto com os
resultados obtidos no presente estudo demonstram que esse loco deve se encontrar
em uma região de baixa variabilidade genética em caprinos.
Além deste loco, dos oito marcadores aqui utilizados, outros três
apresentaram menos de quatro alelos (Tabela 2). Assim, estes marcadores
preencheram todos os critérios estabelecidos pela FAO (2004) para o estudo de
diversidade genética em animais domésticos, exceto o número mínimo de alelos,
32
refletindo a baixa diversidade entre os principais reprodutores utilizados. No entanto,
um dos fatores que podem ter promovido o baixo nível de polimorfismo pode ter
sido, justamente, o tamanho amostral reduzido utilizado no trabalho. Segundo Li et
al. (2002) ambas as variáveis (tamanho amostral e número de alelos observado)
estão correlacionadas. Outros fatores podem ter influenciado no baixo nível de
polimorfismo encontrado. Dentre eles a transferibilidade dos marcadores, já que são
originários de outras espécies de ruminantes. Uma alternativa viável seria o
desenvolvimento de marcadores para a raça Anglonubiana, desta forma,
possibilitando um alto nível de polimorfismo. De acordo com Gonela (2003), ao se
trabalhar com marcadores heterólogos é de se esperar uma redução no número de
alelos observados. Além disso, os animais amostrados podem ter uma base
genética estreita, contribuíndo para o baixo nível de polimorfismo.
Tabela 3: Número médio de alelos por loco (A), riqueza alélica (Ar), valor PIC, heterozigosidade
esperada (HE), heterozigosidade observada (HO) e número de indivíduos amplificados (N)
considerando os oito locos para as quatro populações analisadas.
Populações
A (médio)
Ar (média)
PIC
He
Ho
N
(amplificados)
Angical do Piauí
3,38
3,352
0,383
0,436
0,295
23
José de Freitas
3,38
3,345
0,418
0,478
0,333
24
Teresina
3,00
2,876
0,364
0,432
0,382
24
Campo Maior
3,25
3,244
0,449
0,517
0,241
24
Média
3,25
3,204
0,403
0,466
0,313
23,75
A hererozigosidade média esperada e o valor de PIC foi de 0,313 e 0,403,
respectivamente (Tabela 3), mostrando que os marcadores utilizados foram
mediamente polimórficos considerando cada população estutada.
A distribuição da frequência alélica para os oito locos comparando os
genótipos das quatro populações analisadas neste estudo encontra-se ilustrada na
Figura 5. As oscilações, perdas ou fixação dos alelos podem surgir a partir da ação
da deriva genética ou seleção, isto é o que provavelmente está acontecendo nos
rebanhos estudados, pois existe a seleção dos melhores reprodutores, como
33
Figura 5: Histograma das frequências alélicas dos oito locos SSR estudados nas quatro populações de caprino Anglonubiano amostradas. O eixo Y indica
as frequências alélicas e o eixo X o número de alelos alelos encontrados. Legenda: azul (Angical), vermelho (José de Freitas), verde (Teresina) e roxo
(Campo Maior).
34
também eventos como o afunilamento genético devido a doenças e a venda dos
animais.
Foram encontrados três alelos privados, sendo um para o loco ILSTS11 (274)
que foi encontrado no rebanho de Teresina, um para o loco ETH225 (184) no
rebanho de José de Freitas e um para o loco OarfCB48 no rebanho de Angical. No
entanto, uma análise com amostragem mais abrangente será necessária para
comprovar a ausência destes alelos nas outras populações.
Os valores de PIC variaram de 0,1316 a 0,7223 (Tabela 2). Os locos
McM527, INRA23, OarfCB304 e OarfCB48 tiveram PIC acima de 0,5 sendo
considerados informativos, portanto, mais indicados para o estudo da diversidade
genética de caprinos Anglonubianos. No entanto, como já mencionado, outros
fatores devem ser considerados para a escolha do marcador (MOAZAMIGOUDARZI et al., 1994). Os demais marcadores foram considerados medianamente
informativos.
As proporções ao equlíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) dos locos para cada
população de caprino Anglonubiano está representado na Tabela 4. Os locos
ETH10, OarfCB304 e MAF209 mostraram-se em EHW em todas as populações,
quando consideradas isoladamente. Menezes et al. (2006) também encontrou o loco
OarfCB304 em equilíbrio de Hardy-Weinberg para todas as populações de cabras
brasileiras estudadas. O número de locos que apresentaram desvios significativos
do equilíbrio de Hardy-Weinberg foi reduzido, levando em conta cada população. Na
população de Teresina todos os locos estão de acordo com as proporções ao EHW,
podendo indicar a ocorrência de acasalamentos aleatórios na população, bem como
baixo fluxo gênico (ausência de introgressão de animais geneticamente distintos
oriundos de outras localidades em período recente). Segundo Menezes et al. (2006)
o número pequeno de microssatélites em desvio ao EHW podem ser esperados
tanto em populações comerciais, com acasalamento dirigido (o caso estudado),
como para populações ameaçadas de extinção. Considerando o valor total, apenas
os locos ILSTS11, ETH10 e MAF209 se encontraram em EHW. Os desvios
significativos do EHW podem ter sido causados pela não amplificação ou presença
de alelos nulos, por migração ou fluxo gênico, ou ainda pelo tamanho amostral das
populações. Em concordância com estas hipóteses, os resultados da análise no
35
software MicroChecker indicaram evidências de alelos nulos para todos os locos que
apresentaram desvios significativos para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg. De acordo
com as análises realizadas, é possível que o equilíbrio possa ser alcançado na
presença dos alelos não amplificados.
Tabela 4: Teste exato de aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p-valor) para cada loco dentro
de cada população (valores não significativos encontram-se em negrito)
Locos
Angical
ILSTS11
1,0000*
ETH225
0,0222
José de Freitas
Teresina
Campo Maior
Total
-
1,0000*
1,0000*
0,4265*
*
0,0000
-
0,0000
0,0000
McM527
0,0000
0,3729
*
0,0000
0,0000
INRA23
0,0054
*
0,0056
0,0000
ETH10
1,0000
*
1,0000
*
OarfCB304
0,0264*
OarfCB48
1,0000
MAF209
0,6527
*
0,6816
0, 0191
*
0,2047
*
0,6496
1,0000
*
0,1073
0,4333*
0,1027*
0,1867*
0,0000
*
0,0026
0,6666
*
0,0000
*
0,0341
*
0,5381
*
0,2829
*
0,0894
*
0,3916
*
*
O valor nominal a 5% de probabilidade foi 0,00625.
“-“ alelo fixado; analise não realizada.
Estes resultados poderiam, também, explicar os baixos valores de
heterozigosidade média observada (0,3376), variando de nenhuma heterozigosidade
para o loco ETH225 até 0,5385 para o loco MAF209 (Tabela 2).
A estruturação genética entre as populações foi investigada pela estatística
de Nei para cada loco (Tabela 5). O coeficiente de diferenciação genética corrigido
(GST’) para os oito locos estudados através de bootstrapping, com intervalo de
confiança de 95%, diferiu de zero, mostrando diferença significativa entre as
populações estudadas. O valor de GST’ médio indicou que 11,9% da variação
genética observada está estruturada entre populações e 88,1% dentro das
populações analisadas (Tabela 5). Esse fato provalvelmente pode ser explicado pelo
rodízio, troca ou venda dos animais (reprodutores) nas populações. De acordo com
36
Laval et al. (2000), nas populações comerciais, a migração tem efeito maior do que a
mutação ou deriva genética na redução da diferenciação genética entre populações.
Dos locos analisados 37,5% dos locos tivevam GST’ maior que 0,1. Os valores
variaram de 0,032 no loco INRA23 e 0,309 para o loco ETH10.
Tabela 5: Estrutura genética das populações de caprinos da raça Anglonubiana através das
estatísticas de Nei (1973) para os 8 locos analisados.
Loco
GST’
GIS
ILSTS11
0,080
0,023
ETH225
0,096
1,000
McM527
0,115
0,383
INRA23
0,032
0,389
ETH10
0,309
-0,089
OarfCB304
0,042
0,402
OarfCB48
0,170
0,317
MAF209
0,091
-0,198
Média
0,119
0,279
GST = estimativa de diferenciação entre as populações e GIS = deficiência ou excesso de
heterozigotos.
A diversidade genética entre as populações considerando cada população foi
de 0,468 (Tabela 6), indicando média diferenciação entre as mesmas. O valor médio
de GIS e FIS para todos os locos foi de 27% indicando deficiência de heterozigotos.
Barker et al. (2001) encontrou FIS de 23% estudando raças asiáticas. Segundo esses
autores, esses resultados podem ser explicados devido a subdivisão das
populações, presença de alelos nulos, seleção contra heterozigoto, amostragem
incorreta e fluxo de genes de uma população externa. No entanto, os locos ETH10 e
MAF209 tiveram valores negativos (-0,089 e -0,198, respectivamente). O loco
37
ETH225 mostrou GIS de 100%, porém, o resultado reflete apenas o fato de que
todos os indivíduos eram homozitos para o mesmo.
Tabela 6: Estrutura genética das populações de caprinos da raça Anglonubiana considerando cada
população.
Populações
DST
FIS
Angical do Piauí
0,437
0,329
José de Freitas
0,481
0,307
Teresina
0,433
0,118
Campo Maior
0,521
0,345
Média
0,468
0,273
DST= diversidade genética; FIS= índice de fixação
Os locos que apresentaram GIS altos, também apresentaram desvios
significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Caso os desvios sejam comprovados,
isto pode refletir a ocorrência de seleção dirigida para essas populações ou efeitos
de deriva.
Tabela 7: Matriz das distâncias genéticas de Rogers (1972) modificada por Wright (1978), das quatro
populações (diagonal inferior). Distâncias geográficas em km entre os municípios (diagonal superior).
Angical
Angical
José de Freitas
Teresina
Campo Maior
172,5
123,8
201,3
52
70,3
José de Freitas
0,2213
Teresina
0,2747
0,2952
Campo Maior
0,2699
0,3352
80,7
0,2489
A maior distância genética foi entre os rebanhos de José de Freitas e Campo
Maior (0,3352) e a menor entre os rebanhos de Angical e José de Freitas (0,2213)
38
(Tabela 7). Essas distâncias não estão de acordo com as distâncias geográficas. No
entanto, os baixos valores obitidos, juntamente com os resultados mostrados para a
estimativa de GST’ mostram que a diferenciação entre as populações estudadas é
apenas incipiente. Este fato seria explicado pela alta frequência com que ocorrem as
troca de animais ou rodizio de reprodutores entre as fazendas já que esses
municípios ficam próximos uns dos outros.
De acordo com as análises de UPGMA, os rebanhos de Angical e José de
Freitas estão mais próximos geneticamente do que os rebanhos de Teresina e
Campo Maior (Figura 6). As relações observadas na Figura 6 são semelhantes aos
valores encontrados na matriz de distância genética, o que mostra a possibilidade de
maior fluxo gênico entre os rebanhos de Angical e José de Freitas. Os valores de
bootstrap foram baseados em 10.000 reamostragens, sendo encontrados valores
menores que 0,5.
Figura 6: Dendrograma construído para o método UPGMA para as quatro populações de
Anglonubianos estudadas.
39
Figura 7: Dendrograma dos indivíduos como unidades taxônomicas pelo método UPGMA. Cor
determinada pelo programa STRUCTURE (azul = José de Freitas; vermelho = Teresina; verde =
Angical + Campo Maior). a = Angical, jf = José de Freitas, t = Teresina e cm = Campo Maior.
40
O dendrograma da Figura 7 mostra os indivíduos como unidades
taxonômicas. A identificação do genótipo no dendrograma foi definida com a cor
determinada pelo programa STRUCTURE para o grupo em que se enquadra o
indivíduo. Observa-se a formação de três grupos (verde, azul e vermelho), no qual,
verifica-se fluxo gênico entre os indivíduos das populações. E esse fato, ocorre
possivelmente devido a proximidade geográfica dessas populações.
O programa STRUCTURE foi utilizado com simulações de populações
variando de K = 1 a K = 12 e mostrou que o melhor valor de ΔK para explicar o
conjunto de dados fornecidos foi igual a 3 (ln P(X/K)= -1239,28) (Figura 8). O
programa STRUCTURE possui a capacidade de inferir o número provável de
subpopulações mesmo quando a diferenciação genética entre os grupos é baixa e
utilizando um número de locos relativamente pequeno (LATCH et al., 2006 e
SERRANO et al., 2009) (Figura 9).
Figura 8: Representação gráfica do ΔK mais provável de acordo com Evanno, et. al.
(2005).
41
Figura 9: Designação das populações de Anglonubiano usando a estrutura baseada na
alocação das amostras para K=3. 1- Angical, 2- José de Freitas, 3-Teresina, 4- Campo Maior.
Os rebanhos de José de Freitas (clusters azul) e de Teresina (clusters
vermelho) apresentaram maior homogeneidade, quando comparados aos rebanhos
de Angical e Campo Maior. Provavelmente devido à pequena quantidade de animais
dos rebanhos, podendo resultar em alta taxa de endogamia. A proximidade
geográfica entre os rebanhos levaria a uma baixa diferenciação entre as populações,
fato encontrado nas populações estudadas. Desta forma houve pouca estruturação
das populações estudadas. A diferenciação presente aconteceu provavelmente,
devido à interferência humana através de cruzamentos dirigidos entre os animais
destas populações.
Nos rebanhos avaliados, por se tratar de animais puros, é comum a circulação
de reprodutores entre eles, diferindo do que foi afirmado por Rocha et. al (2007)
quanto a não ser prática comum no Nordeste a troca de reprodutores entre
rebanhos. Outro aspecto importante, é que os rebanhos estudados comercializam
animais de reprodução em Feiras Agropecuárias, logo necessitam de animais com
padrão racial bem definido, ou seja, é importante a manutenção do fenótipo da raça,
logo fixar alelos. Desta forma, os rebanhos são bem próximos. Castelo Branco
(2011) também comenta que a maioria dos produtores de caprinos utiliza animais de
reposição do próprio rebanho, ou adquirem reprodutores para reposição,
provenientes de outros rebanhos, recorrendo à compra dos mesmos.
Assim, a reduzida diferenciação genética entre os rebanhos pode ser explicada
pela origem dos animais. Entretanto, em relação à formação dos rebanhos, convém
considerar a afirmação de Silva et al. (2011), que estudando a caracterização
zoosanitária da caprinocultura na microrregião de Teresina, afirmaram que para
42
formar os rebanhos de Teresina, Piauí, 93% das criações de caprinos utilizaram
animais provenientes do próprio estado. Na formação dos rebanhos, também, foram
usados animais provenientes de outros estados, sendo que os mais citados foram
Bahia, Ceará, Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Sul. Em 13,3% dos casos,
mostrou-se comum a aquisição dos animais de dois ou mais estados.
43
5. CONCLUSÕES
Dos oito marcadores analisados neste estudo, apenas quatro apresentaram
alto polimorfismo. Este fato pode ter ocorrido devido a três fatores, baixa
amostragem utilizada no estudo devido a preferencia em amostrar os reprodutores e
machos destinados a reprodução, da transferibilidade dos marcadores utilizados ou
da base genética estreita dos animais amostrados.
Foi possível observar por meio de diferentes medidas, que as populações
estudadas apresentam maior variabilidade dentro dos rebanhos do que entre eles.
Desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg para alguns locos e
valores de GIS positivos demonstram haver um nível de homozigose maior do que o
esperado. Este resultado pode indicar a existência de acasalamentos preferenciais e
seleção dirigida, tornado essas populações cada vez mais homogêneas.
Mesmo nestas condições, observou-se um processo inicial de estruturação
entre os reprodutores e fêmeas estudados, sendo indicado um princípio de divisão
dos animais em três grupos existentes no Centro Norte do Piauí. As trocas de
animais e o rodízio de reprodutores aliados à pequena distância geográfica entre as
localidades amostradas explicariam tal padrão encontrado.
O desenvolvimento de mais marcadores microssatélites específicos para raça
Anglonubiana seria uma alternativa viável para contornar o problema de baixo
polimorfismo e probabilidade de exclusão insatisfatória.
44
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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