Interferências do Campo Elétrico Alternado Externo em Células

Interferências do Campo Elétrico
Alternado Externo em Células
Tumorais e Normais
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia.
Área de Concentração: Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. Durvanei Augusto Maria
São Paulo
2010
RESUMO
Terra, A.C. Interferências do Campo Elétrico Alternado Externo em células tumorais e
normais. 138 f. [Dissertação]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo, São Paulo; 2010.
Os campos elétricos alternados de frequência intermediária (10KHz a 1MHz) e baixa
intensidade têm efeitos inibitórios sobre o crescimento de várias linhagens celulares de
tumores humanos e murinos. O objetivo geral do presente trabalho é conhecer os efeitos
biológicos da aplicação externa de Campos Elétricos Alternados de intensidades de 10V e 5V
nas frequências de 200kHz, 1Mhz e 2Mhz; em culturas de células de melanoma murino
(B16F10) e fibroblastos humanos normais (FN1), durante 24 horas. Foram estudados os
efeitos biológicos antiproliferativos e pró-apoptóticos através das seguintes análises:
Citometria de Fluxo para identificar a distribuição das populações celulares nas fases do ciclo
celular, Colorimétrico MTT para avaliar a viabilidade celular e Peroxidação Lipídica para
avaliar a produção de radicais livres lipídicos poliinsaturados. Os resultados mostraram que
em fibroblastos humanos normais o campo elétrico alternado induziu efeito antiproliferativo,
indutor de necrose e apoptose, porém em menor efeito tóxico quando comparado às células
de melanoma (B16F10), principalmente na frequência de 200kHz. Por outro lado, na
frequência de 2MHz e intensidade 10V, as células de melanoma presentes no sobrenadante e
aderentes expressaram diferencialmente número de células mortas por apoptose (Anexina-V)
e caspase-3 fosforilada. Os diferentes efeitos produzidos entre as duas linhagens estudadas
atentam para o fato de que a compreensão dos mecanismos biofísicos da regulação do reparo
e da proliferação celular envolve fenômenos celulares e vias de sinalização altamente
complexas.
Palavras-chave: Campo elétrico alternado. Melanoma. Atividade proliferativa. Ciclo
celular. Apoptose. Citotoxicidade. Caspase-3.
ABSTRACT
Terra, A.C. Effects of External Alternated Eletric Field on tumor and normal
cells. 2010. 138 p. Master thesis (Biotechnology) – Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo,São Paulo, 2010.
Electric fields of alternating intermediate frequency and low intensity have inhibitory
effects on the growth of various tumor cell lines. The objective of this study was to
evaluate the biological effects of external application of external alternating electric
field (CEAE) intensities of 10V and 5V in the frequency 200kHz, 1MHz and 2MHz; in
cultured murine melanoma cells (B16F10) and human fibroblasts normal (FN1). We
studied the antiproliferative and pro-apoptotic by flow cytometry to identify the
distribution of cell populations in the phases of the cell cycle, Colorimetric MTT to
evaluate cell viability and lipid peroxidation to evaluate the production of free radicals
lipid acids. The results showed that in fibroblasts (FN1) the normal CEAE induced
antiproliferative effect, inducing apoptosis and necrosis, but at a lower cytotoxic
potential when applied to melanoma cells (B16F10), mainly in the frequency of 200
kHz. Moreover, the frequency of 2MHz and intensity 10V, the melanoma cells in
supernatant and the members expressed differentially number of dead cells by
apoptosis and caspase-3 phosphorylated. The different effects between the two
strains studied to undermine the fact that understanding the biophysical mechanisms
of regulation of repair and cell proliferation involves cellular phenomena and
signaling pathways highly specific and complex.
Key-words: Alternated electric field. Melanoma. Proliferative activity. Cell cycle.
Apoptosis. Cytotoxicity. Caspase-3.
1. INTRODUÇÃO
23
1.1 Câncer de pele melanoma
O melanoma é um câncer de pele potencialmente letal, capaz de produzir
metástases; podendo se originar na derme normal, porém, na maioria das vezes
origina-se de uma pinta já existente. Algumas características destas pintas que
aumentam as chances de se transformarem em melanoma podem ser avaliadas
pela chamada regra do ABCD, onde:
A – Assimetria; B - Bordas ou limites que se tornam irregulares, mal definidas
em relação à pele adjacente; C - Cor que se altera de marrom para negro, por
variação de tonalidade ou aparecimento de áreas negras, brancas, azuis ou
vermelhas; e D - Diâmetro - igual ou maior que 0,6 cm (Figura 1).
Figura 1 - Melanoma maligno.
Fonte: WHO - World Health Organization.
Disponível em: http//www.who.int/uv/health/uv_health2/en/index1.html.
O melanoma origina-se a partir dos melanócitos (produtores de melanina),
encontrados na camada basal da epiderme e responsáveis pela pigmentação da
pele, dos pêlos e cabelos e da íris dos olhos.2
Segundo o Instituto Nacional de Câncer (Inca), embora só represente 4% dos
tipos de câncer de pele, o melanoma é o mais grave devido à sua alta possibilidade
de metástase. A letalidade do câncer de pele melanoma é elevada, porém sua
incidência é baixa. São cerca de 6 mil novos casos por ano no país, segundo a
Estimativa de Incidência de Câncer no Brasil.
Normalmente os melanócitos produzem melanina lentamente por diversas
reações bioquímicas. Estas etapas podem ser alteradas por influências externas
24
como luz solar (UV-A, UV-B), aquecimento, exposição a ambientes com metais
pesados e radiação ionizante fazendo com que as células transformem-se em
células malignas. Desta maneira, os melanócitos têm papel fundamental na
proteção da pele aos efeitos prejudiciais da radiação UV. Pessoas sem melanócitos
funcionais e com distúrbios pigmentares, como vitiligo e albinismo são
hipersensíveis à radiação UV. 3
A pigmentação da pele ocorre através da síntese de melanina, que resulta de
sucessivas reações oxidativas do aminoácido tirosina. Existem dois tipos de
melanina, a eumelanina (preta e marrom) e a feomelanina (amarela e vermelha),
produzidas a partir da tirosina pela enzima tirosinase. A tirosinase é sintetizada nos
ribossomos e transportada, via retículo endoplasmático, para o complexo de Golgi,
de onde se originam vesículas que contém a enzima. Estas vesículas são
chamadas pré-melanossomos. No interior destes pré-melanossomos, a tirosinase
produz a melanina a partir da tirosina. Quando a vesícula está completamente
repleta de melanina, ela passa a ser chamada de melanossomo. A tirosinase está
envolvida nos dois primeiros passos da síntese de pigmentos, a partir da
dopaquinona a melanina formada pode ser a eumelanina ou a feomelanina. Embora
a oxidação da tirosina pela tirosinase seja requerida para a síntese de ambos os
tipos de pigmentos, a ativação do receptor 1 da melanocortina (MC1R) promove a
síntese da eumelanina às expensas da feomelanina.3 Durante este processo são
geradas substâncias altamente reativas, podendo levar ao estresse oxidativo e às
alterações no DNA, podendo desencadear um processo de carcinogênese.4
O melanoma cutâneo é uma neoplasia potencialmente letal, com grande
possibilidade de cura se diagnosticado precocemente. No estágio inicial, o
melanoma pode ser extirpado por incisão da lesão primária, e a cirurgia também
pode remover as metástases em linfonodos regionais.5 Porém, pacientes com
melanoma metastático, em locais distantes do tumor primário, têm um prognóstico
desfavorável, com sobrevida de seis a dez meses, em média.6
O melanoma é uma doença extremamente agressiva, com potencial
metastático e resistência a agentes quimioterápicos e à morte celular por
apoptose.6,7 Uma alternativa promissora no tratamento do melanoma maligno pode
ser a manipulação da via apoptótica como tentativa de impedir o desenvolvimento
25
de metástases, através do desenvolvimento de novas terapias antitumorais que
tenham este mecanismo como alvo terapêutico.
1.2 Linhagens celulares
As pesquisas na área de Oncologia buscam terapias adjuvantes que sejam
cada vez mais eficientes no controle do crescimento do tumor gerando o mínimo
dano possível ao tecido normal.
O presente trabalho avaliou os efeitos biológicos resultantes da aplicação de
campos elétricos alternados externos (CEAE), em células normais não
transformadas ou não imortalizadas, e em células tumorais, a fim de compará-los;
abrindo novas possibilidades para terapias adjuvantes antitumorais que provoquem
o menor dano possível ao tecido normal. Foram utilizadas duas linhagens celulares,
uma linhagem na qual se pretende causar um mínimo dano durante o tratamento, a
linhagem de fibroblastos humanos normais (FN1) não imortalizada, estável e com
número definido de divisões celulares; e a segunda linhagem, de células tumorais
de melanoma murino (B16F10). A linhagem FN1 foi escolhida por ser uma linhagem
de células normais e estáveis durante o seu cultivo, e foram estabelecidas no
laboratório, o que facilitou a análise dos resultados. Além deste fato, no tratamento
in vivo de melanomas humanos ou murinos utilizando a metodologia proposta neste
trabalho, os fibroblastos normais estariam expostos, o que torna imprescindível
conhecer os efeitos sobre este tipo celular. Pesquisas médicas utilizam animais
como cobaias, pois as células de camundongos reagem a tratamentos de forma
muito semelhante às células humanas, permitindo uma gama maior de linhagens
estudadas e consequentemente um amplo espectro de resultados. A linhagem
B16F10 foi escolhida por seu cultivo em laboratório apresentar rápido crescimento,
facilitando a rotina da pesquisa, e também porque in vivo ela é altamente
metastática, sendo uma linhagem com grande variedade de estudos nas áreas de
biologia celular e molecular8; além de ser uma linhagem radioresistente6, 7; portanto
de grande interesse para o estudo de novas terapias de tratamento.
1.3 Campos Elétricos
26
Uma carga elétrica provoca a formação de uma região de ação de um campo
elétrico que exerce uma força capaz de ser sentida por outra carga9.
Campos elétricos também são gerados por indução eletromagnética que é o
surgimento de um campo elétrico resultante de um campo magnético variável. Os
campos elétricos utilizados neste trabalho não foram gerados por indução
eletromagnética, mas foram gerados através de um capacitor plano de chapas
paralelas alimentado por um gerador de funções.
Capacitores são utilizados para armazenar carga elétrica e energia; e são
constituídos por dois condutores isolados (placas ou chapas) entre si, mas próximos
um do outro e carregados com cargas elétricas de sinais opostos através de uma
bateria ou gerador9. A figura 2 mostra um capacitor plano de placas paralelas
semelhante ao utilizado neste trabalho10.
Figura 2- O Capacitor plano de chapas paralelas carregado com
cargas de sinais opostos através de uma bateria ou gerador.
Fonte: TIPLER, P. Eletricidade e Magnetismo. 3° Edição, 1995.
Entre os condutores estabelece-se um campo elétrico E cujo valor dependerá
da diferença de potencial V (ddp) e da distância d que as separa segundo a
fórmula:
V = E.d
(1)
As linhas do campo se direcionam no sentido das cargas positivas para as cargas
negativas10, conforme a figura 3.
27
Figura 3 - Direcionamento do campo elétrico entre um capacitor de chapas
planas paralelas.
Fonte: TIPLER, P. Eletricidade e Magnetismo. 3° Edição.
A corrente elétrica no circuito é denominada corrente contínua quando as
cargas elétricas se deslocam sempre no mesmo sentido, do pólo positivo da fonte
de tensão para o seu pólo negativo - chamado sentido convencional. As correntes
contínuas são fornecidas pelas pilhas (também chamadas baterias), lanternas ou
pelas baterias usadas em no-breaks para suprir a energia elétrica na falta da
energia de corrente alternada, ou em automóveis, onde se utiliza a energia elétrica
apenas para dar partida no motor11, 12.
Entretanto as correntes elétricas distribuídas pelas grandes companhias
elétricas, em quase todas as cidades do mundo, não são corrente contínuas.
Quando ligamos um aparelho elétrico em uma tomada, o campo elétrico
estabelecido no fio condutor muda periodicamente de sentido. Consequentemente
as cargas elétricas no fio oscilarão, deslocando-se ora em um sentido, ora em
sentido contrário. Então a corrente elétrica (assim como o campo elétrico) muda
periodicamente de sentido, sendo por este motivo denominada corrente
alternada11,12.
28
A frequência (f) da rede elétrica no Brasil, nos Estados Unidos e no Canadá é
de 60 hertz, isto quer dizer que nestas correntes as cargas elétricas no condutor
executam 60 vibrações completas em cada segundo (60 ciclos por segundo).
Nos países da Europa e da América Latina a frequência da rede elétrica é de 50
hertz (cinquenta ciclos por segundo)11,12.
Os campos elétricos alternados (CEA) são gerados por uma tensão alternada
senoidal, isto é, por uma tensão que varia com o tempo segundo a função seno, da
seguinte maneira:
V(t) = Vm. sen (w . t)
(2)
Onde:
t é o tempo em segundos
Vm é a tensão máxima, também chamada tensão de pico
w é a frequência angular relacionada à frequência f pela relação:
w = 2. π. f
(3)
A figura 4 mostra um gráfico da variação harmônica (descreve uma função seno) da
tensão V em função do tempo11:
V(t) =Vm sen (w t)
Figura 4 - A variação do potencial elétrico em função do tempo e da
frequência,
descrevendo uma função seno.
Fonte: Adaptado de VUOLO, J.H. Complemento de Física Experimental –
1ª Parte.
29
1.4 Efeitos Biológicos dos Fenômenos Elétricos e Eletromagnéticos
As células vivas são compostas por íons, moléculas carregadas ou
polarizadas e organelas que geram correntes elétricas e campos elétricos em torno
de 0-10 kV/cm, e membranas celulares cujos campos elétricos podem chegar à
ordem de 105 V/cm. 13
O bioeletromagnetismo surgiu após a descoberta da indução eletromagnética
por Michael Faraday, no final de 1700. Logo após vieram os famosos experimentos
do físico e médico italiano Luigi Galvani, que mostrou em patas de sapo a conexão
entre eletricidade e contração muscular. Depois veio Alessandro Volta, físico italiano
que interpretou os experimentos de Galvani de maneira diferente. São os eletrodos
metálicos e não o tecido muscular o gerador de energia elétrica. Polêmica vigorosa
e ferrenha entre os dois, para sabermos hoje em dia que ambos tinham sua parcela
de razão: o músculo gera eletricidade (Galvani) e o metal também (pilha de Volta).
A partir da invenção da pilha de Volta, em 1800, desenvolveram-se inúmeras
aplicações médicas utilizando corrente contínua. D'Arsonval, provavelmente, foi o
primeiro a estudar os efeitos fisiológicos da corrente alternada e dos campos
elétricos e magnéticos variáveis.14
A utilização dos campos eletromagnéticos na fisioterapia e na reabilitação
(como o ultra-som) apresenta efeitos térmicos e não-térmicos, com efeitos
dependentes dos parâmetros frequência e intensidade.14
A inibição ou estimulação de processos celulares por processos
eletromagnéticos é de grande interesse na biologia molecular e na biotecnologia,
não apenas para estabelecer os mecanismos básicos desta interação, mas por
suas aplicações em diferentes alvos como proliferação celular, reações enzimáticas,
vias de morte celular e transporte de membrana.
Envolvidas por dupla camada lipídica, as moléculas de proteína intermediam
a maioria das funções da membrana, inclusive as funções de transporte de
moléculas específicas para dentro ou para fora da célula. A membrana celular atua
como sensor na recepção dos estímulos externos.
Os organismos vivos respondem aos estímulos ambientais e stress (incluindo
os campos eletromagnéticos) promovendo mudanças celulares e moleculares
30
dependentes da duração da exposição, da penetração no tecido e do aquecimento,
que se relaciona à frequência e intensidade do estímulo. Além destes fatores, as
repostas celulares também dependem do tipo de campo (estático ou alternado), tipo
de onda (senoidal, quadrada, etc) e das condições biológicas e do tipo de células
expostas.15
Em 1976 já era possível a análise de uma diversidade de técnicas para
osteogênese eletricamente estimulada.16
Além das correntes contínuas, com valores entre pico e miliàmperes, foram
utilizadas correntes contínuas variáveis17, correntes pulsadas18, 20 e correntes
alternadas com formas de onda semelhante àquelas desenvolvidas no osso por
deformação.19, 20
Dúvidas ainda existem sobre os mecanismos pelos quais altas e extremas
frequências dos campos eletromagnéticos na faixa de 900MHz a 1800MHz,
incluindo a telefonia móvel celular, agem em nível biológico celular e molecular.21
1.4.1 Efeitos Biológicos dos Campos Elétricos Estáticos Externos
Campos elétricos estáticos na média de 22kV/m podem arrepiar os cabelos e
serem percebidos por pessoas situadas sobre uma superfície isolante.Em
ambientes secos a percepção ocorre por volta de 30kV/m.22,23
Embora eletricamente neutros, os átomos e moléculas submetidos a um
campo elétrico externo são afetados por este. Quando um átomo ou molécula
apolar (o centro da carga elétrica está no centro do átomo ou molécula) é submetido
a um campo elétrico externo, as cargas positivas e negativas se separam até que a
força atrativa entre ambas equilibra as forças provocadas pelo campo elétrico
externo, surgindo um momento de dipolo induzido na mesma direção do campo
elétrico. As moléculas polares (o centro das cargas positivas não coincidem com o
centro das negativas), como as moléculas da água e do HCl, possuem um momento
de dipolo permanente. Ao serem submetidas por um campo elétrico uniforme (CEU)
surge um torque que gira a molécula alinhando-a na direção do campo10, conforme
ilustrado na figura 5.
31
Figura 5: Molécula polar (dipolo) que sob ação do CEU efetua
movimento giratório, tendo seu momento de dipolo alinhado na direção
do campo elétrico.
Fonte: TIPLER, P. Eletricidade e Magnetismo. 3° Edição.
Dentre as alterações moleculares causadas pela aplicação do campo elétrico
estático externo, ressaltam-se24,25 :
• orientação de dipolos permanentes gerando mudanças topográficas
nas moléculas;
• mobilidade e difusão de cargas de condução (prótons,elétrons e íons)
que se orientam na direção do campo elétrico aplicado, originando
uma corrente elétrica que produz um novo campo elétrico intrínseco;
• íons podem ser ligados ou desligados de proteínas;
• polarização das cargas elétricas intracelulares. Normalmente estas
cargas permanecem espalhadas nas células e atraem-se pela
oposição das polaridades, anulando-se. Após a aplicação de um
campo elétrico estático externo, as cargas se alinham formando
dipolos permanentes que geram um novo campo elétrico.
32
Campos elétricos estáticos aplicados externamente às culturas celulares
tendem a alinhá-las perpendicularmente às linhas de campo ou modificar a sua
forma, alongando-as.21 (Figura 6).
A
Figura 6 – (A) Morfologia celular de fibroblastos humanos normais e (B)
Alinhamento e alongamento após a aplicação de Campo Elétrico Estático de 5V/cm
após 3 horas.
Fonte: Adaptado de Funk, R. H. W et al, 2008.
1.4.2 Efeitos biológicos dos Campos Elétricos Alternados (CEA)
O CEA tem uma gama de efeitos em tecidos vivos.
A frequências muito baixas (<1kHz) estimulam tecidos através da
despolarização de membrana26, o crescimento ósseo e a cura de fraturas.27
Contudo, enquanto a frequência dos campos elétricos aumenta, o efeito
estimulatório diminui e a partir da ordem de MHz o efeito biológico dominante se
torna o aquecimento.28, 29,30
B
33
Kirson et al31 mostrou que CEAs de baixa intensidade, frequência
intermediária (100kHz – 1Mhz), transmitidos por eletrodos implantados (aplicados
internamente conforme a figura 7) não provocam o aquecimento como efeito
biológico, mas possuem efeitos específicos nas células em divisão, interferindo na
orientação do fuso mitótico e destruindo as células durante a clivagem; efeitos
dependentes da orientação do eixo da mitose versus o eixo do vetor campo
elétrico.31
A
Células
Placas de
cultura
Oscilador
Amplificador
B
Camundongo
Oscilador
Amplificador
Eletrodos
Isolados
Tumor
Figura 7: Esquema Experimental da aplicação do CEA por eletrodos
internos em (A) cultura celular e (B) em camundongos.
Fonte: Modificado de Kirson et al, 2009.
Foram verificados efeitos inibitórios sobre a razão de crescimento de várias
linhagens celulares dos seguintes tumores humanos: melanoma Patrícia C, os
gliomas U-118 e U-87, pulmão H-1299, mama MDA 231, próstata PC3; e murinos:
melanoma B16F1 e os gliomas F-98, C-6 e RG2. 31
O efeito não-térmico afeta as células em divisão, enquanto as quiescentes são
deixadas intactas, agindo de duas maneiras:
1. Atrasando as células durante o processo mitótico.
2. Destruindo as células durante a citocinese.
34
A figura 8 mostra células de B16F1 expostas aos CEA. Na figura 8-A é visível
o atraso na divisão celular, pois um processo de mitose leva menos do que uma
hora, esta célula é vista estacionada por 3 horas. Em B e C ocorrem dois exemplos
de desintegração durante a citocinese. Nas fotos centrais (30 minutos) forma-se a
clivagem e nas do lado direito (50 minutos e 60 minutos), a desintegração celular.
A
A
B
C
A
Figura 8 - Efeitos dos Campos Elétricos Alternados em células de
melanoma B16F1.
Na figura A, a divisão celular em 2 horas e 3 horas.
Fonte: Kirson et al, 2004.
Os resultados mostraram que a frequência que causa maior efeito antiproliferativo
depende do tipo de célula.31
Em recente trabalho, Kirson (2009)32 aplicou eletrodos externos em tumores
metastáticos pulmonares de melanoma B16F10 em ratos e tumores VX-2 em
35
coelhos conforme ilustra a figura 9. Os eletrodos encapados com leucoplast ® foram
presos às peles depiladas dos coelhos por hidrogel, na direção perpendicular um do
outro.
A
B
Figura 9 – Localização dos eletrodos em a) ratos e b) coelhos.
Fonte : Adpatado de Kirson et al,2009.
O tratamento contínuo durante sete dias reduziu significativamente o tamanho e o
número das metástases comparativamente ao grupo controle, como mostra a figura
10.32
A
Figura 10 – Metástase do melanoma maligno em pulmões de ratos
a) tratados e b) do grupo controle. Fonte: Modificado de Kirson et al, 2009.
B
36
1.5 Ciclo Celular
O processo que envolve a formação de novas células a partir de divisões de
uma única célula é denominado Ciclo Celular.
Resumidamente, o Ciclo Celular é composto por uma série ordenada de fases
sequenciais: Intérfase (fases G1, S, G2) e Mitose (fase M). 33
•
G1 (gap1) é o intervalo entre a mitose que originou a célula e a fase S;
durante a fase G1 a célula cresce e sintetiza as enzimas necessárias à
síntese do DNA.
•
S é a fase de síntese do DNA.
•
G2 (gap 2) é o intervalo entre a fase S e a mitose que dará origem a duas
células filhas; durante a fase G2 a célula está se preparando para a divisão
mitótica em duas células-filhas.
•
M é a fase mitótica, um processo contínuo formado por cariogênese
(divisão do núcleo) e citocinese (divisão do citoplasma). 34
Figura 11: Eventos principais do ciclo celular dos eucariotos.
Fonte : Lodish, H. Biologia Celular e Molecular – 5° Ed.
37
1.5.1 Regulação do ciclo celular
É absolutamente impossível que uma célula entre em mitose ou divida o seu
DNA, se o mesmo não tiver sido previamente duplicado, sendo também preciso
garantir que uma vez duplicado ele não venha ser reduplicado. Por isto existem os
pontos de controle ou “checkpoints”, que permitem verificar a reparação de DNA
danificado e a captação de sinais extracelulares que regulam a proliferação
celular.35
As fases do ciclo celular são controladas por enzimas denominadas ciclinas.
O princípio básico da regulação do ciclo celular é a cascata de fosforilação,
desfosforilação, síntese e degradação das CDKs (quinases dependentes de ciclina)
cuja subunidade regulatória são as ciclinas, e as concentrações destas aumentam
ou diminuem de acordo com a progressão das células ao longo do ciclo celular.
A fase G1 é a fase em que se dá a preparação para a duplicação do DNA, e a
fase mais longa do ciclo celular (demora em média 10 horas). Nesta fase existe o
ponto de restrição que só é ultrapassado se houver sinais ambientais favoráveis, é
um ponto de controle que detecta danos no DNA. Este ponto é regulado por
complexos de CDK4 e CDK6 e pelas ciclinas do tipo D (D1, D2, D3). Mais tarde em
G1 se expressa a ciclina E ligando-se à CDK2, levando à duplicação do DNA. Não
havendo o ponto de restrição, a célula duplicaria o seu DNA mesmo na ausência de
condições extra e intracelulares, duplicando o seu DNA continuamente danificado e
levando a uma descontrolada entrada na fase S e à proliferação celular.36
Durante a fase G1 há também a possibilidade da célula entrar num período
designado por G0, uma pequena ramificação da fase G1, na qual a célula sai do
ciclo celular num estado especializado e de não-divisão. Durante esta fase as
células são altamente móveis, sintetizam proteínas e curiosamente as células em
G0 podem voltar a entrar em G1, caso existam estímulos favoráveis para que isso
aconteça.
38
Figura 12 – Regulação do Ciclo Celular pelas Ciclinas e CDK´s
Fonte: Alberts et al, Fundamentos da Biologia Celular.
Na fase S ocorre a duplicação do DNA, pois para ocorrer a mitose a célula deve
ter o dobro da quantidade de DNA para a fim de distribuir equitativamente o seu
material genético para as duas células filhas. A replicação do DNA ocorre com a
ajuda de proteínas, à medida que essas proteínas vão replicando o DNA, elas vão
sendo inativadas de forma a impedir que o DNA que está sendo replicado volte a
ser replicado. A progressão da replicação do DNA durante a fase S é mediada pelos
complexos CDK2-ciclina A.
Depois da fase S temos a fase G2 ou Gap 2, na qual a célula se prepara para a
mitose. É a última oportunidade para corrigir os erros que provêm da replicação de
DNA e evitar que a exposição a um determinado ambiente possa influenciar a
qualidade e a fidelidade da mitose. Por isso existe o segundo checkpoint evitando
assim que a célula duplique o seu DNA quando danificado. Nesta fase o controle é
realizado pelo complexo CDK1/ciclina B.
Este checkpoint atua de forma a dar tempo à célula para corrigir esses danos, e
há duas possibilidades de ocorrência:
39
•
suicídio celular designado por apoptose;
•
ou a célula terá de regular o DNA danificado, e impedir que este entre
em mitose.
A ausência deste checkpoint pode também levar ao aparecimento de câncer. Se
antes da mitose houver danos no DNA, como uma mutação que induza a célula a
entrar em ciclo e a dividir-se, a célula é induzida a dividir-se muito mais rapidamente
que as células vizinhas, invadindo outros tecidos, levando à metastatização.
Além do ponto de restrição, falamos do ponto de controle que detecta erros no
DNA. Neste caso os danos no DNA levam à ativação dos genes reguladores da
proteína p53. A p53 é chamada de supressor tumoral, já que quando está presente
de alguma forma, protege e regula a entrada em ciclo e a sua divisão, daí a sua
importância na diminuição do acúmulo de mutações no DNA em G1.
Outra transição chave é a Transição G2-M, ou seja, a entrada em Mitose.
A entrada em mitose pode ser vista como o ponto alto do ciclo celular. A mitose
inicia-se através da condensação do DNA da cromatina, que leva à formação de
cromossomos que têm uma única missão: se organizarem no núcleo e alinharem-se
formando a chamada placa metafásica. A placa metafásica vai determinar a entrada
da célula em Anáfase, o momento crítico da mitose, quando a célula distribuirá o
conteúdo genético.
Quando os cromossomos são duplicados na fase S, as duas cópias de cada
cromossomo replicado permanecem firmemente ligadas como cromátides-irmãs
idênticas. Os primeiros sinais visíveis de que uma célula está para entrar na fase M
é a progressiva compactação dos cromossomos replicados, os quais são
visualizados
como
estruturas
filamentosas
–
num
processo
denominado
condensação cromossômica. A segregação dos cromossomas replicados é
desencadeada por uma complexa maquinaria do citoesqueleto com muitas partes
em movimento – o fuso mitótico. Este é constituído por microtúbulos e proteínas
associadas, que puxam os cromossomos-filhos para os pólos do fuso mitótico e
distanciam os pólos.37
As quatro divisões didáticas da mitose são fases que descrevem as alterações
morfológicas e a movimentação dos cromossomos durante o processo.
40
•
Prófase - Duplicação dos cromossomos
•
Metáfase - Os cromossomos alinham-se no equador da célula
•
Anáfase - O aparelho mitótico captura os cromossomos e os
conduz para os pólos opostos da célula em divisão através dos
microtúbulos de tubulina
•
Telófase - Forma-se uma membrana nuclear em torno de cada
grupo de cromossomos
Durante a prófase os cromossomos iniciam o processo de condensação e
formam o fuso mitótico. Esta fase termina com a ruptura do envoltório nuclear.
Na metáfase os cromossomos dispõem-se na zona equatorial da célula,
atingindo o grau máximo de condensação. A seguir, na anáfase, os cromossomosfilhos migram para os pólos opostos, deslocamento que depende dos microtúbulos
de tubulina, porque sua não polimerização faz com que as mitoses estacionem
nesta fase.38
Na telófase os cromossomos-filhos chegam aos pólos e ocorre a
reconstituição dos núcleos e a divisão do citoplasma (citocinese), originando enfim,
duas células-filhas.
1.5.2 Mecanismos de morte celular
As células frequentemente praticam o suicídio, num processo conhecido
como apoptose, marcado por uma sequência bem definida de alterações
morfológicas. Esta capacidade é essencial para o próprio funcionamento do
organismo. Uma falha neste mecanismo pode estar por trás de muitas doenças.
O girino elimina a cauda durante a sua metamorfose em sapo; mamíferos
eliminam incontáveis neurônios enquanto o seu sistema nervoso se desenvolve. Os
microscopistas têm identificado os principais sinais que distinguem esta morte
fisiológica de uma destruição acidental como é a necrose.39
41
A morte de células por necrose ocorre quando são severamente danificadas,
por desastre físico ou privação de oxigênio, por exemplo. O inchaço das células é
um diagnóstico decisivo. Assim as organelas internas e as células como um todo
incham e se rompem. Esses efeitos ocorrem porque injúrias impedem as células de
controlar seus fluidos e o seu equilíbrio iônico; a água e as partículas pesadas
(especialmente íons de sódio e cálcio) que são normalmente bombeados para fora
da célula agora ficam circulando dentro da mesma. Outro diagnóstico é a
inflamação: macrófagos circulantes e outros glóbulos brancos do sistema
imunológico vão em direção às células necrosadas e as digerem. A inflamação
auxilia na limitação da propagação da infecção e na remoção dos restos de tecidos,
mas a atividade e as secreções dos glóbulos brancos podem danificar os tecidos
sadios vizinhos, algumas vezes de maneira extensiva.
Diferentemente da necrose, no processo de apoptose não ocorre inchaço ou
aumento do tamanho das células. As células moribundas se retraem causando a
perda da aderência com a matriz extracelular e com as células vizinhas. As
organelas internas retêm as suas estruturas, mas o núcleo (que na necrose sofre
pouca alteração) muda drasticamente. A cromatina (o DNA cromossômico com
suas respectivas proteínas) sofre condensação e se concentra junto à membrana
nuclear, que se mantém intacta. A seguir, a membrana celular forma
prolongamentos (blebs) e o núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela
membrana nuclear. Os blebs se rompem originando estruturas contendo o conteúdo
celular, chamadas corpos apoptóticos, que são ingeridos pelas células vizinhas
incluindo os macrófagos, presentes em todos os tecidos sem incitar uma resposta
inflamatória. Na pele, os queratinócitos são gerados pelos seus precursores numa
camada deste tecido: tais precursores migram então para a superfície, formando
camadas de células mortas que substituem seus conteúdos por queratina e
adquirem impermeabilidade à água. Tais células mortas formam a camada protetora
da pele e frequentemente sofrem descamação, sendo substituídas por outras. 39
A maioria das células manufatura um conjunto de proteínas que pode servir
como armas de autodestruição. Desde que a célula seja útil ao organismo, ela
reprime sua maquinaria de autodestruição (o desencadeamento dessas proteínas).
Se, entretanto, a célula se torna infectada ou maligna ou se ela compromete a
42
saúde do organismo, as proteínas letais começam a ser desencadeadas para dar
início ao processo de suicídio.40
São descritos dois mecanismos distintos de efetivação da apoptose : a via
extrínseca e a via intrínseca, conforme ilustra a figura 13.
o
Figura 13: Mecanismo de apoptose através da via extrínseca (FAS, TNF) e
intrínseca (mitocondrial).
Fonte: Anazetti e Melo, 2007.
Via extrínseca é iniciada via receptores de morte da superfamília rTNF
(receptores do fator de necrose tumoral) que incluem FAS/CD95, rTNFR-1 e TRAIL;
caracterizados por um domínio extracelular rico em cisteína, possibilitando o
reconhecimento de seus ligantes. Estes ligantes específicos sinalizam a formação
de um complexo indutor de morte, que recruta a caspases-8, que irá ativar a
caspase-3, iniciando o processo apoptótico.
A via intrínseca é ativada por fatores extra ou intracelulares como a privação
de fatores de crescimento, hipóxia ou danos no DNA. Estes fatores convergem para
a mitocôndria, causando alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial e
liberação do citocromo c para o citosol, que se liga a dATP, Apaf-1 e pró-caspase-9,
formando o complexo apoptossomo. A caspase-9 ativa (iniciadora) pode então
clivar as caspases efetoras subsequentes (2, 3, 6, 7, 8, 9, e 10).41, 42
Portanto, a ativação da caspase-9 mediada pelo citocromo c serve como um
mecanismo de amplificação de sinais durante o processo apoptótico.43,44
43
A via mitocondrial também envolve a ativação de um membro pró-apoptótico
da família Bcl-2 (Bax, Bid). Membros pró e anti-apoptóticos da família Bcl-2 regulam
a liberação de citocromo c a partir da membrana mitocondrial interna. Os membros
anti-apoptóticos da família Bcl-2 inibem a morte celular por apoptose impedindo a
formação de poros na membrana mitocondrial, e consequentemente inibem o
extravasamento do citocromo c para o citosol.45 Níveis elevados de proteínas
dessa família de genes bloqueiam a apoptose (Bcl-2 e Bcl-x) e outras promovem-na
(Bax, Bad e Bak). Os genes anti-apoptóticos da família Bcl-2 são promotores da
sobrevivência celular por inibirem a ocorrência da apoptose.46,47
A proteína Bcl-2 está localizada na membrana mitocondrial externa de
diferentes tipos celulares, como os epitélios capazes de proliferação e morfogênese.
Dentre as suas atuações está o bloqueio da liberação de citocromo c pela
mitocôndria após estímulo apoptogênico, impedindo, portanto, a ativação das
caspases.48
A proteína Bax pode produzir heterodímeros com a Bcl-2 (Bax/Bcl-2) ou
homodímeros (Bax/Bax), desta forma, Bcl-2 suprime a morte celular quando
heterodimerizada com Bax; por outro lado, o homodímero Bax/Bax promove
apoptose. O mecanismo de controle da apoptose pelos genes da família Bcl-2
envolve a formação de poros na membrana mitocondrial, permitindo a interação de
várias proteínas envolvidas na regulação da morte celular.45,47
A proteína p53 participa da regulação do ponto de checagem de G1. Danos
no DNA promovem a ativação da p53, resultando na parada do ciclo celular em G1
e iniciando o reparo do DNA. Quando os danos ao DNA não são passíveis de
reparo, ocorre a ativação da apoptose. Mutações no gene p53 resultam em um
descontrole do ponto de checagem de G1, possibilitando que as células danificadas
progridam para a fase S sem reparar as lesões ou impedindo o mecanismo de
apoptose.48,49 Em mais da metade de todos os tumores sólidos, incluindo o
pulmonar, do colo e de mama, houve perda da proteína p53, ou então ocorreu a
formação de uma proteína semelhante porem ineficaz.49
Os melanócitos produzem o pigmento melanina, o qual escurece outras
células da pele protegendo-as contra a ação dos raios solares. Se os melanócitos
perecem facilmente, as outras células correm perigo. Por esta razão os melanócitos
devem produzir grandes quantidades de Bcl-2. Mesmo quando os melanócitos se
44
tornam geneticamente danificados, eles são menos propensos a cometer suicídio
do que outras células da pele, e são mais propensos, quando malignos, a formar
tumores agressivos que se espalham rapidamente.6,7
Muitos tumores são resistentes aos efeitos da quimioterapia e da
radioterapia, doravante consideradas terapias capazes de destruir os tumores
diretamente, matando as células malignas por necrose. As células que morrem por
apoptose o fazem frequentemente pela ativação da p53. Células em que faltam a
p53, ou que produzem altos níveis da proteína inibidora Bcl-2, podem se tornar
“acostumadas” aos efeitos dos tratamentos contra o câncer e prosperar em
metástase.6
6.CONCLUSÃO
Para os fibroblastos humanos normais:
•
O CEAE não alterou a capacidade de adesão, formação de
prolongamentos, formação de agregados multicelulares e vacuolização;
•
As células FN1 são sensíveis a produção lipídeos peroxidados em
condições basais (controle) em relação à linhagem de melanoma
B16F10; após a aplicação do CEAE ocorreu efeito inibitório na produção
de LPO pelas células FN1;
•
Nenhuma das frequências e intensidades mostraram-se citotóxicas;
•
A porcentagem de células com DNA fragmentado (apoptóticas)
aumentou na frequência de 1MHz e em maiores proporções na
frequência de 200kHz;
•
O tratamento mostrou-se como um efeito antiproliferativo, reduzindo as
populações celulares das fases quiescente, mitótica e de síntese;
•
As células aderidas submetidas à 2MHz – 10V mostraram redução na
apoptose com elevação da expressão da caspase 3 e grande aumento
na expressão de PI (Necrose). As células do sobrenadante
apresentaram aumento da expressão da Anexina V e grande expressão
da caspase 3, sugerindo anoikis.
•
À frequência de 200kHz houve redução da morte celular por apoptose e
necrose no sobrenadante, mas as células aderentes mostraram um
pequeno aumento de ambas as populações celulares, que associadas à
redução da expressão da caspase 3 sugerem outras vias de morte
celular.
Para as células de melanoma B16F10:
•
Na frequência de 200kHz – 5 V foram observados efeitos tóxicos, como
o desprendimento das células, a formação de agregados multicelulares
no sobrenadante e a inibição da capacidade proliferativa;
•
Funcionalmente, houve indução da formação e liberação de radicais
livres peroxidados (MDA), a partir dos lipídeos de membrana celular.
•
O CEAE mostrou efeito indutor da produção de LPO nas frequências de
200kHZ e 2MHz 5V.
•
Houve elevação da proporção de células apoptóticas na frequência de
200 kHz - 5V e mais significativamente na frequência de 2MHz - 10V;
•
Efeitos diversos nas populações do ciclo celular foram encontrados,
exceto para a frequência de 200kHz – 5V, os resultados mostraram
resposta inibitória sobre as células em divisão celular (G2/M);
•
A expressão da AnexinaV e da caspase-3 aumentaram
significativamente nas frequências de 2MHz e 200kHz, sugerindo
possíveis relações entre os efeitos da produção de LPO, a provável
desorganização do citoesqueleto e a morte celular por anoikis.
Conclusão Geral:
•
As células de FN1 foram menos prejudicadas pelos efeitos do CEAE do
que as células de melanoma B16F10, sugerindo uma nova possibilidade
terapêutica no tratamento do melanoma, que dependerá de novos
estudos utilizando os CEAE, com mais detalhamento sobre a cinética
celular e as vias de morte associadas.
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