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Patologia Molecular
Carlos Alberto Pereira Vaz
Técnico Superior de Laboratório
[email protected]
O que é a Patologia Molecular?
A Patologia Molecular foi definida como a
aplicação clínica e laboratorial da
tecnologia dos ácidos nucléicos na
elucidação, diagnóstico e monitorização
de estados patológicos e na avaliação das
condições não patológicas
Objectivos da Patologia Molecular?
• Técnicas e princípios básicos do diagnóstico
molecular assim como a organização dos
laboratórios de diagnóstico molecular;
• Oncologia molecular incluindo ensaios de DNA
para estudos dos rearranjos genéticos dos
linfócitos T e B, análise de translocações,
estudos de oncogenes, mutações genéticas em
vários tipos de cancros (mama e cólon);
• Testes moleculares para doenças genéticas
Objectivos da Patologia Molecular?
• Patologia molecular das doenças infecciosas
(necessidade cada vez mais frequente de testes
rápidos para vírus latentes como HIV e HCV,
bem como organismos de crescimento lento
como o bacilo da tuberculose;
• Testes de grupos sanguíneos e
histocompatibilidade molecular (tipologia do
DNA para os antigénios MHC utilizados nos
estudos e histocompatibilidade e transplantes);
Objectivos da Patologia Molecular?
• Testes de identidade forense por análise
do DNA.
DNA
Replicação do DNA
Mutações no DNA
• Pontual – Substituição de um único par de
bases (Anemia falciforme)
• Deleção/Inserção – Remoção/adição de codões
de aa em múltiplos de três (Distrofia muscular
de Beker)
• Deleção/Inserção – de codões de aa sem
múltiplos de três; resulta na modificação do
molde de leitura e uma sequência de
codificação do aa completamente diferente a
partir da mutação
Mutações no DNA
• Amplificação – Aumento no numero de
sequências de repetição no DNA (Síndrome do
X frágil)
• Translocação – Troca intercromossómica de
grandes segmentos cromossómicos (Leucemia
mielocítica crónica)
Técnicas de análise de DNA
aplicadas a diagnóstico
PCR
• A PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia)
é uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial selectiva de uma
quantidade reduzida de DNA de uma única
célula.
• Esta técnica revolucionou o mundo científico e
as suas aplicações são imensas: é usada no
diagnóstico médico, mapeamento genético,
detecção de doenças hereditárias, clonagem de
genes, testes de paternidade, identificação de
“impressões digitais” genéticas…
PCR
• Os resultados da PCR são úteis no diagnóstico,
prognóstico, determinação da terapia a ser
utilizada, e até mesmo na avaliação da
susceptibilidade a doenças.
• A PCR é frequentemente utilizada na detecção
de polimorfismos, mutações pontuais e infecção
por microrganismos bacterianos ou virais antes
da exteriorização patológica da sua presença.
PCR
• É particularmente importante na detecção do
SIDA, pois consegue detectar o vírus HIV nas
primeiras semanas após a infecção e mais
rapidamente do que o método normalmente
utilizado, o teste ELISA.
DGGE
• A electroforese em gel de gradiente
desnaturante (DGGE) é um método de
separação electroforético baseado em
diferenças no comportamento de desnaturação
de fragmentos de DNA de cadeia dupla.
• A DGGE é uma poderosa técnica de análise
genética que pode ser usada para detectar
directamente modificações de uma única base e
polimorfismos em DNA genómico, DNA clonal e
DNA amplificado por PCR.
DGGE
• Algumas das mais valiosas utilidades da DGGE na
genética humana são a detecção directa de
mutações numa única base causadoras de doença,
a detecção de polimorfismos com sondas de DNA e
a descoberta dos pontos de desnaturação de
fragmentos de DNA.
• A DGGE é também um dos métodos de pesquisa
genética de mutações responsáveis pelo síndrome
de neoplasia endócrina múltipla tipo1 (MEN1), uma
doença autossómica dominante, caracterizada por
tumores endócrinos da glândula pituitária anterior,
glândulas paratiroides e pâncreas.
RFLP
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) é
uma técnica em que os organismos podem ser
diferenciados pela análise de padrões derivados da
clivagem do seu DNA.
• Para a detecção de RFLP’s, pode ser usada a
metodologia de “Shouthern Blotting”, descrita em
1975 por Edmund Southern. Após restrição
enzimática os fragmentos de DNA genómico são
sujeitos a electroforese em gel e posteriormente
transferidos para um suporte sólido de nitrocelulose
através do arrastamento por capilaridade
RFLP
• Após hibridação com sondas radioactivas este
processo possibilita a identificação, entre
milhares de fragmentos de restrição obtidos, de
sequências bem determinadas.
• Com o aumento da informação da sequência
genética um grande número de doenças
genéticas podem ser determinadas através da
análise do RFLP
Hibridação in situ
• A hibridação in situ é um método que permite
identificar o locus cromossómico onde se
localiza uma determinada sequência de DNA
previamente clonada. Este método tem como
princípio a complementaridade das bases que
reage a organização de DNA.
• O DNA de um esfregaço metafásico e o DNA de
uma sonda são transformados em sequências
monocatenares através da desnaturação e
posteriormente são postos em contacto em
condições de hibridação.
Hibridação in situ
• Assim a sonda vai hibridizar com a sequência
cromossómica onde se localizam as bases
complementares. Visto que a sonda é
previamente marcada (com um fluorocromo), o
local de ligação torna-se visível o que permite
identificar especificamente o local do
cromossoma onde se localiza o gene ou a
sequência não codificadora em causa.
VNTR
• O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
é uma metodologia que se baseia na existência
de uma sequência repetitiva específica activa
em diferentes indivíduos de uma população ou
nos dois homólogos diferentes do cromossoma
num indivíduo diplóide.
• Permite auxiliar no diagnóstico de determinadas
doenças, nomeadamente: diabetes tipo I,
fenilcetonúria, cancro, entre outras. Constitui um
contributo na investigação forense na análise de
impressões digitais.
Doenças Genéticas
• Foram até à presente data identificadas
6000 a 7000 doenças genéticas….
Bibliografia
•
Arneson, W., Brickell, J. Clinical Chemistry A Laboratory Perspective. F. A.
Davis Company 1st edition (2007)
•
Burnett, D., Crocker, J. The Science of Laboratory Diagnosis. John Wiley &
Sons Ldt, 2nd edition (2005)
•
Burtis, Carl A. Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry. Saunders
Elsevier, 6th edition (2008)
•
Guyton, A. C. Textbook of Medical Physiology. Saunders Elsevier, 11th
edition (2006)
•
Henry, J. B. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais.
Editora Manole Lda, 19ª edição (1999)
•
Ravel, R. Laboratório Clínico: Aplicações Clínicas dos Dados Laboratoriais.
Guanabara Koogan, 6ª edição (1997)
•
Wallach, J. Interpretation of Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins,
8th edition (2007)