Amplificaçao Clonagem e Expressao de Regioes - pgbioexp

Amplificação, Clonagem e Expressão de Regiões
dos Genes E1 e E2 das Proteínas de Envelope (E)
do Vírus Mayaro em Sistema Procariótico.
DENISE DE OLIVEIRA RESENDE MARQUES
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Biologia
Experimental
do
Núcleo de Saúde da Universidade Federal de
Rondônia como requisito para obtenção do
titulo de mestre em Biologia Experimental.
Área de concentração: Virologia
Porto Velho-RO
Novembro-2006
2
Amplificação, Clonagem e Expressão de Regiões
dos Genes E1 e E2 das Proteínas de Envelope (E)
do Vírus Mayaro em Sistema Procariótico.
DENISE DE OLIVEIRA RESENDE MARQUES
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Biologia
Experimental
do
Núcleo de Saúde da Universidade Federal de
Rondônia como requisito para obtenção do
titulo de mestre em Biologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Hildebrando P. da Silva.
Co-Orientador: Msc Eduardo Rezende Honda.
Porto Velho-RO
Novembro-2006
3
Catalogação Biblioteca Central/ Unir
M3573a
Marques, Denise de Oliveira Resende
Amplificação, clonagem e expressão de regiões dos genes
E1 e E2 das proteínas de envelope(E) do Vírus Mayaro em
sistema procariótico./ Denise de Oliveira Resende
Marques,Orientador Luiz Hildebrando Pereira da Silva. –
Porto Velho, 2006.
68 f.
Dissertação(mestrado em Biologia Experimental)Universidade
Federal de Rondônia.
1. Virologia molecular 2. Infecções viróticas 3. Vírus
Mayaro- variação I. Título
CDU: 578.2
4
Candidato (a):
DENISE DE OLIVEIRA RESENDE MARQUES
Título da Dissertação: Amplificação, Clonagem e Expressão de Regiões
dos Genes E1 e E2 das Proteínas de Envelope (E)
do Vírus Mayaro em Sistema Procariótico.
A Comissão julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação
de Mestrado, em sessão pública realizada em 16/11/2006, considerou
o(a) candidato(a):
( X ) Apto(a)
(
1) Examinador(a): Paulo Afonso Nogueira
2) Examinador(a): Sergio Oliveira de Paula
3) Presidente (a): Luiz Hildebrando Pereira da Silva
) Inapto(a)
5
DEDICATÓRIA:
Aos meus pais: Elton e Neusa, pelas
angústias e preocupações que passaram por
minha causa, por terem dedicado suas vidas
à nossa família, pelo amor, carinho e
estímulo que me ofereceram;
Aos meus filhos: José Paulo, João
Marcos e Pedro Henrique pelo apoio, amor e
compreensão;
À minha irmã, Luciana, que apesar da
distância esteve sempre ao meu lado;
Dedico-lhes
gratidão.
esta
conquista
como
6
“É preciso ousar para dizer cientificamente que
estudamos,
aprendemos,
ensinamos,
conhecemos nosso corpo inteiro.
Com sentimentos,
Com as emoções,
Com os medos,
Com a paixão e também
Com a razão crítica. Jamais com esta apenas.
É preciso ousar para jamais dicotomizar o cognitivo do emocional.”
Paulo Freire
7
HOMENAGENS ESPECIAIS
“Amigo é coisa pra se guardar, do lado esquerdo do peito...”(Milton Nascimento)
Ao meu grande amigo, Eduardo Honda, sem o qual não seria possível esta conquista.
Pela orientação... desorientação... apoio, amizade, cumplicidade, tolerância, paciência
e compreensão. E daqui a muitos anos, quando estivermos bem “experientes” vou me
lembrar de você como alguém que de maneira direta contribuiu para que eu
conseguisse alcançar este sonho;
Ao meu amigo, Milton Luiz Moreira- Secretário de Estado da Saúde/Rondônia, que
mesmo sem acreditar que é possível tornar realidade um grande sonho e acima de
tudo ser feliz, me ofereceu apoiou irrestrito a decisão de buscar o conhecimento e pelo
exemplo de dedicação ao trabalho;
A Dra Fátima Santos, pela ajuda, correções, carinho e encorajamento em todos os
momentos.
8
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo cuidado especial em todas as horas e por me permitir esta ousadia;
As colegas Daniele e Aldha, pela amizade, apoio, incentivo e companheirismo;
Ao Tony, que apesar de nossos desentendimentos sempre foi um amigo especial
disposto a me ouvir e me emprestar o ombro nos momentos difíceis;
A Patrícia, pela amizade e por partilharmos do mesmo desespero com Bioquímica;
Ao Dhélio, Belgrano e Quésia pela amizade;
Ao Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva e Dra Vera Engracia pelo incentivo à
pesquisa e pelo exemplo pessoal de perseverança e competência;
Ao Dr. Mauro Tada, pelo apoio a minha decisão de enfrentar o mestrado;
Aos técnicos e estagiários do Laboratório de Insumos Diagnósticos do CEPEM que
participaram na realização dos testes para esta pesquisa;
A todos que não foram citados mas que direta ou indiretamente, colaboraram na
execução
deste
MUITO OBRIGADA!
trabalho
e
na
concretização
de
um
sonho,
o
meu
9
LISTA DE TABELAS
TABELA 01- Casos notificados de dengue em Rondônia, por município,
26
no período de 2004 a 2005.
TABELA 02- Genoma do Vírus Mayaro utilizadas no alinhamento com
35
auxílio do programa CLUSTAL W para construção dos
primers.
TABELA 03- Seqüência de Iniciadores de cadeia (Primers) utilizados para
amplificação das regiões E1 e E2 do vírus MAY, Alphavírus.
38
10
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1- Casos notificados da dengue,em Rondônia, no período de
2004 a 2005.
27
11
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01- Desenho esquemático de Alphavírus.
22
FIGURA 02- Ciclo de infecção dos Alphavírus.
23
FIGURA 03- Análise por Bioinformática da Seqüência de Aminoácidos (aa) da
36
Proteína E1 do vírus MAY. Hidrofilicidade (Azul); Antigenicidade
(Róseo) e Probabilidade de estar na superfície (Amarelo).
FIGURA 04- Análise por Bioinformática da Seqüência de Aminoácidos (aa) da
36
Proteína E2 do Vírus Mayaro. Hidrofilicidade (Azul). Antigenicidade
(Róseo) e Probabilidade de está na superfície (Amarelo).
FIGURA 05- Representação esquemática do Vetor de Clonagem pGEM T Easy
40
(Promega-USA).
FIGURA 06- Eletroforese em gel agarose 1,5% do produto da PCR para
47
Amplificação do fragmento do gene E1 e E2 MAY.
FIGURA 07- Eletroforese em gel agarose 1,5% do produto do PCR para
48
Amplificação do fragmento do gene E1 e E2 MAY.
FIGURA 08- Eletroforese em gel agarose 1,5% da Digestão do Miniprep pGEM
49
T Easy com Fragmento E2 de MAY.
FIGURA 09- Eletroforese em gel agarose 1,5% da digestão do miniprep do
50
vetor de expressão pRSET A com Kpn I e Bam HI, mostrando o
fragmento E1 de Mayaro
FIGURA 10- Eletroforese em gel agarose 1,5% da digestão do miniprep do
51
vetor de expressão pRSET A com Kpn I e Bam HI, mostrando o
fragmento E2 de Mayaro
FIGURA 11- Gel de Poliacrilamida SDS/PAGE 12% mostrada o extrato bruto da
lise das bactérias BL-21 com os plasmideos recombinantes E1 e
E2
52
12
ABREVIATURAS
CEPEM- Centro de Pesquisas em Medicina Tropical
CHIK- Vírus Chikungunya
CF- Casos Confirmados
DC- Casos Descartados
cDNA- DNA complementar
DNA- Ácido Desoxiribonucleico
DMSO- Dimetil Sulfóxido
EDTA-Ácido Etileno Diaminico
GEVEA- Gerência de Vigilância Epidemiológica
Hg- Haemagogus
IEC- Instituto Evandro Chagas
IPEPATRO- Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais de Rondônia
IPTG-Isopropiltioglicolato
LB –Luria Bertoni
MAY- Vírus Mayaro
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase
PGEM T Easy-Vetor de Clonagem “AT –Promega-USA.
13
pRSET-Vetor Expansão Procarioto- INVITROGEN-USA
RIFI-Reação de Imunofluorescência Indireta
RT- Transcriptase Reversa
RT- PCR- Transcriptase Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase
RNA- Ácido Ribonucleico
SINAN- Sistema Nacional de Notificação
TAE-Tris Ácido Bórico- EDTA
14
RESUMO
As doenças febris agudas acompanhadas de exantemas são de difícil
diagnóstico, tanto clinico como laboratorial, pela variedade de prováveis agentes
etiológicos envolvidos com essas síndromes febris como também pelo fato de muitos
desses agentes ainda não serem caracterizados, principalmente na região Amazônica.
O vírus Mayaro foi isolado pela primeira vez em 1954 do sangue de cinco pacientes
febris em Trinidad  Tobago. A sintomatologia clinica dessa arbovirose limita-se a uma
doença febril aguda, com intensa artralgia seguido por um “rash” maculopapular,
podendo ser confundida com os sintomas da dengue em áreas onde essas duas
arboviroses são endêmicas. Usando programas computacionais (PROTEAN e
ANTHEPROT) para mapear regiões com potenciais antigênicos das proteínas de
envelope, localizamos duas regiões com potenciais antigênicos, amplificamos por RTPCR essas regiões respectivas nos genes que codificam para essas proteínas E1 e E2 e
expressamos essas proteínas recombinantes em sistema de expressão procariótico. A
utilização de ferramentas de bioinformática na área de biotecnologia possibilitou a
determinação de regiões específicas diminuindo o tempo e custo na pesquisa. As
proteínas E1 e E2 foram expressas, purificadas e estão prontas para serem utilizadas
como antígeno em ensaios imunoenzimáticos.
Palavras-chave: Arbovírus, Mayaro, Sistema Procariótico, Proteínas recombinantes.
15
ABSTRACT
The acute fevered illnesses accompanied by rash has difficult diagnosis, clinical
and laboratory as well, because of the variety of probable etiological agents involved
with these fevered syndromes and because of the fact that many of those agents are not
characterized yet, mainly at Amazonian region. The Mayaro virus was isolated for the
first time in 1954 from the blood of five fevered patients in Trinidad & Tobago. The
clinical symptom of this arbovirus infection is just an acute fevered illness with intense
joint’s inflammation followed by a stained cutaneous rash and can be confused with the
Dengue symptoms where these arborvirus infection are endemic. Using computerized
programs (PROTEAN and ANTHEPROT) to map regions with potentials envelope
proteins antigenic, we localized two regions with potential antigenic and also enlarged
by RT-PCR these respective regions in the genes which codify for these E1 and E2
proteins and expressed these recombining proteins in a prokaryotic expression system.
The use of bioinformatics tools in biotechnology area made the specific region
identification possible, reducing the research time and costs. The E1 and E2 proteins
were expressed and purified and are ready to be used like antigen in immunoenzymatic
trials.
Key words: Arbovirus, Mayaro, Prokaryotic System, Recombining Proteins.
16
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE GRÁFICOS
LISTA DE FIGURAS
ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1- Introdução
17
1.1- Histórico
17
1.2- Agente Etiológico
19
1.3- Agente Vetorial
22
1.4- Epidemiologia
25
1.5- Fisiopatogenia
27
1.6- Manifestações Clinicas
29
1.7- Definição de Caso
29
2- Objetivos
31
2.1- Objetivo Geral
31
2.2- Objetivo Específico
31
3- Materiais e Métodos
32
3.1- Sementes Virais
32
3.2- Replicação Viral
32
3.3- Extração de RNA por TRIzol®
33
3.4- Confecção do DNA Complementar (cDNA.)
34
3.4.1- Transcrição Reversa – RT
34
3.4.2- Analise das Regiões Antigênicas das Proteínas Estruturais E1 e E2 do Vírus
34
17
Mayaro por Bioinformática
3.4.3- Amplificação dos Fragmentos dos Genes E1 e E2 da Proteína Estrutural do
37
Vírus Mayaro por Reação em Cadeia da Polimerase – PCR
3.5- Eletroforese do Produto de PCR.
3.5.1- Gel de Agarose 1,5%.
3.6- Purificação dos Fragmentos E1 e E2 do Gel.
3.6.1- Purificação dos Fragmentos Utilizando QIAquick Gel Extraction Kit
38
38
39
39
(QIAGEN-USA)
3.7- Ligação dos Fragmentos Purificados em Vetor de Clonagem. (pGEM T
39
Easy-Promega - USA)
3.8- Preparo de Células Competentes para Transformação
40
3.9- Transformação das Células Competentes
41
3.10- Extração Plasmidial Utilizando Perfectprep Plasmid Mini. ( Eppendorf –
42
USA)
3.11- Análise dos DNAs Plasmidiais Extraídos
42
3.12- Digestão dos Plasmídeos com Enzimas de Restrição Kpn I e Bam H I
43
3.13- Eletroforese dos Produtos de Digestão
43
3.13.1- Gel de Agarose 1,5%
3.14- Subclonagem dos Fragmentos E1 e E2 em Vetor de Expressão Procarioto(
43
43
pRSET – Invitrogen-USA)
3.15- Transformação das Ligações pRSET A com E1 e E2 de Mayaro em BL-21
44
(DE3)
3.16- Expressão das Proteínas Recombinantes E1 e E2 de Vírus Mayaro.
44
3.17- Gel de SDS/PAGE a 12% para Verificação das Proteínas Expressas E1 e
45
E2 em Sistema Procarioto
3.18- Purificação das Proteínas Recombinantes E1 e E2
4- Resultados
45
46
4.1- Isolamento Viral
46
4.2- Resultado da Extração de RNA.
46
4.3- Resultado da Amplificação por Transcriptase Reversa - RT.
46
4.4- Amplificação por PCR das Regiões do Gene E1 e E2 do Vírus MAY.
47
18
4.5- Resultado da Digestão do Vetor de Clonagem com Kpn I e BAM H I
47
4.6- Subclonagem dos Fragmentos E1 e E2 do Vírus Mayaro em Vetor de
49
Expressão Procariótico (pRSET– Invitrogen-USA).
4.7- Expressão das Proteínas E1 e E2 de Mayaro em Sistema Procariótico
51
pRSET.
5- Discussão
53
5.1 Análises por Bioinformática das Proteínas E1 e E2.
54
5.2 Expressão de Proteínas Recombinantes.
52
6- Conclusão
57
7- Referências Bibliográficas
58
19
1- INTRODUÇÃO
1.1- Histórico
A região amazônica, devido a suas características ambientais e de ocupação
humana, apresenta situação epidemiológica peculiar. Esta diferenciação é dada, tanto
por bases ecológicas naturais, como pelas formas de ocupação e exploração (Ávila Pires, 1989). Possui uma gama de enfermidades com sintomatologias semelhantes e
dificuldades no diagnóstico, fazendo com que todas, sejam nomeadas como “viroses”.
As viroses humanas representam importante causa de morbi-mortalidade em
nosso meio, apesar dos avanços alcançados tanto relacionados à abordagem profilática
como terapêutica. Esta problemática complexa, na maioria das vezes, são
desencadeadas por atividades humanas que modificam o meio ambiente, em especial
pela pressão demográfica (Wilson et al., 1994).
As arboviroses são doenças exantemáticas, naturalmente transmitidas por
artrópodes, sendo motivo de grande preocupação para o Ministério da Saúde no Brasil,
por apresentar sintomatologia que muitas vezes é confundida com outras doenças, o
que dificulta o tratamento, além de afetar centenas de milhares de pessoas anualmente
com grandes perdas sócio-economicas para população e o país. Entre as mais
importantes em termos epidemiológicos, estão: mayaro, febre amarela, dengue,
oropouche, rocio e as outras arboviroses com encefalite e sintomas sem diagnóstico
confirmatório. Sendo que o mayaro, rocio e a febre amarela, estão presentes
20
especialmente em zonas rurais da região norte. (Casals & Whitman L,1957; Hall et
al.,1991).
A designação de arbovírus não possui qualquer significado taxonômico. A
palavra é formada pela primeira sílaba das duas palavras “arthropod-born”, acrescida
da palavra vírus. As doenças causadas por arbovírus formam um grupo heterogêneo,
mas com características sintomatológicas e epidemiológicas semelhantes.
São considerados arbovírus, os vírus transmitidos na natureza, principalmente
mediante a transmissão biológica entre os hospedeiros vertebrados susceptíveis,
através de artrópodes hematófagos, ou entre estes por via transovariana, como no caso
de Aedes Stegomyia aegyti e Aedes Stegomyia albopictus (WHO,1985). Este termo,
“vírus transmitido por artrópodes” foi utilizado pela primeira vez em 1942. Mais tarde,
em 1963, o “International Commitee for Taxonomy of Viruses” (ICTV) decidiu denominar
este grupo de vírus, (maior até então conhecido) por arbovírus. Constituem-se num
grupo ecológico de vírus, e alguns tipos representam importantes problemas de saúde
pública em regiões tropicais e subtropicais em todo mundo, inclusive no Brasil, sendo
prevalentes principalmente na região norte. Embora o número de espécies desses
arbovírus conhecidos que afetam o homem seja baixo, o impacto econômico e social
causado é grande pelo elevado numero de casos durante surtos epidêmicos.
(Vasconcelos et al., 1992).
O vírus Mayaro foi isolado pela primeira vez em 1954 do sangue de cinco
pacientes febris em Trinidad  Tobago, desde então, o vírus vem sendo responsável
21
por diversos surtos da infecção na América do Sul, em paises como: Brasil e Bolívia.
(Casals & Whitman, 1957; Lopes, et al., 1978; Pinheiro & Dias,1967).
1.2- Agente Etiológico
Os vírus (palavra proveniente do latim, que significa veneno) são seres
microscópicos, com capacidade de replicação, visíveis apenas ao microscópio
eletrônico, constituído por duas classes de substâncias químicas: ácido nucléico (que
pode ser DNA ou RNA) e proteínas. São seres acelulares (que não possuem estrutura
celular) e precisam de células que os hospedem, por não apresentarem metabolismo
independente, sendo todos os vírus parasitas intracelulares obrigatórios.
São responsáveis por uma série de doenças, podendo variar de uma doença
febril aguda limitada, até doenças crônicas graves, como as hepatites. O vírus invade
uma célula e assume o controle da maquinaria celular, fazendo com que ela trabalhe
quase que exclusivamente para produzir novos vírus. A infecção viral geralmente causa
profundas alterações no metabolismo celular, podendo levar à morte das células
afetadas. Os vírus têm capacidade de infectar bactérias, fungos, plantas e animais
(incluindo o homem). Fora da célula hospedeira, os vírus não manifestam nenhuma
atividade vital e se houver alguma célula compatível à sua disposição, um único vírus é
capaz de originar em pouco tempo, centenas de novos vírus.
No século XIX e a primeira parte do século XX a denominação de vírus foi usada
como sinônimo de agentes infecciosos de todas as classes. Beijerinck, ao descobrir o
vírus do tabaco o chamou “contagium vivum fluidum” (líquido vivo contagioso). Próximo
aos anos 30, os cientistas utilizavam rotineiramente o termo “virus filtrables” para referir-
22
se a qualquer agente que passasse através de um filtro suficiente para reter bactérias.
Atualmente, os vírus são definidos como agentes infecciosos compostos por uma ou
várias moléculas de RNA ou DNA, cobertos por uma capa protéica, e em muitas
ocasiões por coberturas complexas que se derivam da membrana da célula-hospedeira.
Os vírus transmitem sua informação genética, de uma célula hospedeira para
outra usando enzimas da própria célula hospedeira para a replicação e incorporação da
informação genética dos vírus ao genoma da célula-hospedeira. Alguns vírus integram
seus ácidos nucléicos de uma forma latente e persistente. Outros vírus transformam a
característica genética das células hospedeiras, afetando seus mecanismos de controle
de crescimento, podendo transformá-las em células cancerosas.
A classificação dos vírus é feita baseada em suas propriedades biológicas,
físicas e químicas. Sendo os principais critérios: tipo do ácido nucléico (DNA ou RNA);
número de fitas do ácido nucléico e sua composição; polaridade ou genoma; simetria
do nucleocapsídeo; presença ou ausência de envelope; mecanismo de replicação e
expressão do genoma viral.
Os arbovírus estão associados às encefalites e são transmitidos através da
picada das fêmeas de mosquitos. A definição de arbovírus mais recente, diz que são
vírus animais, transmitidos biologicamente entre vertebrados suscetíveis, por intermédio
de artrópodes hematófagos. Estes vírus provocam viremia no vertebrado, multiplicandose nos tecidos dos artrópodes infectados, sendo posteriormente inoculados a um novo
vertebrado não imune. Este grupo de vírus foi, recentemente, dividido em cinco famílias
23
distintas: Togaviridae (Alphavirus), Flaviviridae (Flavivirus), Bunyaviridae (Bunyavirus) e
Reoviridae (Reovirus).( Pringle, C.R.,1998).
Entre as famílias mais importantes destacam-se:
A família Flaviviridae divide-se em três gêneros: Flavivirus, Pestivirus e
Hepacivirus. Os vírus agrupados no gênero Flavivirus provocam muitas doenças em
seres humanos, como dengue, encefalites, febre amarela, entre outras.
A família Togaviridae divide-se em gêneros, causadores das encefalites eqüinas
do leste, encefalite venezuelana, das febres Chikungunya e Mayaro.
O vírus causador da febre do Mayaro (MAY) é esféricos, envelopado, com
aproximadamente 60 nm de diâmetro, possuem RNA linear de fita única com
aproximadamente 11kb. É um arbovírus com similaridade antigênica ao vírus
Chikungunya (CHIK). A maioria é relativamente frágil, não resistindo à dissecação,
portanto são dependentes dos vetores para serem transmitidos. De tal forma que esta
dependência tende a limitá-los às regiões tropicais e subtropicais. Estes vírus
apresentam ciclos de vida complexos e replicam-se em ambos hospedeiros primários,
secundários e artrópodes, isto faz com que a erradicação das doenças causadas por
eles seja praticamente impossível.
Os reservatórios naturais do vírus Mayaro são provavelmente algumas espécies
de micos e macacos, embora pássaros possam atuar como hospedeiros secundários,
visto que apresentam uma alta prevalência de anticorpos contra este vírus (Anderson et
al., 1957; Pinheiro et al., 1986; Vasconcelos, 1992).
24
FIGURA 01- Desenho esquemático de Alphavirus
O vírus Mayaro é endêmico na Amazônia e taxas de anticorpos são diretamente
proporcionais a população que mantêm contato com as áreas de florestas. A imunidade
para Mayaro aumenta com a idade. Em inquéritos soro-epidemiologicos, as taxas de
anticorpos para esse vírus variam na região Amazônica entre 10 e 60% dependendo da
população estudada. Nas tribos indígenas, entre 20 a 47% da população possuem altas
taxas de anticorpos contra esse vírus. Embora, a população da região possua altas
taxas de anticorpos, é extremamente difícil isolar o vírus, devido ao curto tempo de
viremia, durante o qual não se consegue diagnosticar a doença, passando confundida
com outras virores com sintomatologia semelhante (Vasconcelos, et al., 1992).
1.3- Agente Vetorial
A associação de mosquitos com doenças humanas, como malária, dengue, febre
amarela e outras têm sugerido diversas investigações sobre comportamento desses
insetos em relação à transmissão das doenças. (Barbosa, et al.,1993)
Os mosquitos além de vetores são os reservatórios do vírus, desde que uma vez
infectados assim permanecem por toda sua vida, ao contrário dos macacos que, como
25
os homens, ao se infectarem morrem ou se curam e ficam imunes para sempre.
Portanto os macacos atuam somente como hospedeiros amplificadores da virose
(WHO, 1985; Vasconcelos, 2002).
Os principais vetores do vírus Mayaro são os mosquitos do gênero Haemagogus,
e Mansonia, embora vetores alternativos, como Culex e Aedes, já tenham sido
apontados (Pinheiro, 1981).
FIGURA 02: Ciclo de infecção dos Alphavírus
Mosquitos do gênero Haemagogus são pertencentes à família Culicidae. Vivem
em florestas, as fêmeas são hematófagas vorazes, picando e alimentando-se durante
todo o dia. Quando a densidade das espécies aumenta consideravelmente, podem
deixar a floresta por pequenas distâncias à procura de alimento. Usualmente habitam a
copa das árvores e por esta razão são acrodendrófilas. As larvas são encontradas
habitando buracos nos troncos das árvores e em enternódios de bambus. Algumas
espécies como Hg. Spegazzinii e Hg. janthinomys são as principais vetoras dessa
26
arbovirose .Estes insetos são raramente encontrados em habitações humanas ou no
ambiente peridomiciliar. O Hg. janthinomys é o mais importante na transmissão da
febre do Mayaro. Este é um mosquito que apresenta a maior distribuição geográfica,
mas que possui hábitos estritamente silvestres, ou seja, só pica o indivíduo quando este
adentra a floresta em qualquer atividade. Sua importância epidemiológica reside na
transmissão de patógenos em ambientes florestais. Esta espécie apresenta as
condições favoráveis para a transmissão do vírus. É primatófilo, ou seja, se alimenta
preferencialmente no macaco e secundariamente no homem, e apresenta atividade
diurna, período em que a maioria dos que adoece da enfermidade realiza suas
atividades na floresta. Tais características demonstram sua habilidade em transmitir não
só Mayaro, como também é considerado como o maior vetor de febre amarela das
Américas (Vasconcelos, 2002).
Os mosquitos do gênero Aedes são importantes vetores na transmissão de
diversos vírus causadores de doenças que concentram atualmente grande atenção em
saúde pública, tais como o vírus Dengue e o vírus da Febre Amarela. Outras doenças
como Mayaro e Oropouche, vírus causadores de Encephalites e a filária, Dirofilaria
immitis podem ser eventualmente transmitidas pelo Aedes albopictus (Travassos da
Rosa et al.,1982; Marques,1998; Vélez,1998).
Os mosquitos têm seguramente um papel importante na propagação do vírus,
pois seus movimentos são consideráveis. Experiência de soltura e captura mostraram
que Hg janthinomys pode percorrer 11,5 km (Hervé & Travassos da Rosa, 1983).
27
1.4- Epidemiologia
Os primeiros isolamentos do vírus Mayaro, foram obtidos de cinco pacientes
febris em Trinidad, na América Central em 1954. A
partir daí, o vírus tem sido
associado a surtos febris na Bolívia, Colômbia, Panamá e Peru (Rosa, et al,1998).
No Brasil, as quatro epidemias, reportadas como mais importantes, foram
detectadas no estado do Pará, em Guamá 1955, em Belterra, 1978, em Conceição do
Araguaia em 1981 e Benevides em 1991. Fora do estado Pará dois surtos epidêmicos
foram registrados: em 1987 e 1991 nos estados de Goiás e Tocantins (Vasconcelos e
Travassos da Rosa, dados não publicados). Desde então, tem sido isolado de humanos
e animais silvestres, principalmente nas fronteiras da região amazônica.
Em 1998, a Fundação de Medicina Tropical de Manaus realizou pesquisa
sorológica para todos os pacientes que apresentaram síndromes febris agudas
indiferenciadas, dos 8.557 casos somente 40% foram positivos para dengue e 26%
foram positivos para outras doenças exantemáticas virais como rubéola, sarampo,
parvovirus, oropouche e mayaro (Figueiredo, et al.,2004).
Dados do SINAN no Estado de Rondônia, nos anos de 2004 e 2005, referentes a
todos os casos notificados como suspeitos de dengue, os quais apresentavam os
seguintes sintomas clínicos: febre, cefaléia, exantema, mialgia, diarréia, artralgia, dor
retro-orbital, náuseas e vômitos, foram analisados, conforme Tabela 1.
28
TABELA 01: CASOS NOTIFICADOS DE DENGUE EM RONDÔNIA, POR MUNICÍPIO,
NO PERÍODO DE 2004 A 2005.
Municípios
2004
2005 Total
CF DC CF DC
Alta Floresta d'Oeste
0
Alto Paraíso
17 2
0
2
21
Alvorada do Oeste
0
2
0
2
Ariquemes
17 54 66 30 167
Cabixi
6
Cacoal
0 10 7
0
1
5
4
17
16
185 126 117 94 522
Candeias do Jamari
1
5
6
8
20
Castanheiras
0
0
0
2
2
Cerejeiras
0
0
3
4
7
Colorado do Oeste
15 13 4 17 49
Costa Marques
3
0
1
Cujubim
0
0
4 16 20
Espigão d'Oeste
0
2 25 12 39
Guajará-Mirím
0 10 0
Jaru
19 17 38 11 85
Ji-Paraná
11 6 21 8
46
Mirante da Serra
7
1
0
8
Monte Negro
0
0
3 10 13
Nova Brasilândia
1
0
1
Novo Horizonte do Oeste 0
0
3
6
3
2
0
0
6
10
Ouro Preto do Oeste
17 13 5 22 57
Pimenta Bueno
17 5
Porto Velho
86 103 49 82 320
Presidente Médici
5 11 24 6
46
Rio Crespo
0
0
0
1
Rolim de Moura
0
3
1 16 20
São Miguel do Guaporé
0
0
1 10 11
Vilhena
23 8 64 40 135
Total
429 381 458 410 1678
Fonte: SINAN/GEVEA/SESAU/RO
6
3
1
31
CF: Casos confirmados
DC: Casos descartados
29
Em 2004, de 887 casos notificados, somente 429 foram confirmados
laboratorialmente para dengue e em 2005 de 791 foram confirmados apenas 458.
Todos os pacientes apresentavam o mesmo quadro clínico, o que demonstra que uma
parte dos casos descartados para dengue poderia ser diagnosticado positivos para a
febre do Mayaro, ou outro arbovirose que não dengue.
GRÁFICO 01: CASOS NOTIFICADOS DE DENGUE,EM RONDÔNIA,
NO PERÍODO DE 2004 a 2005
887
791
900
800
700
600
429
500
381
458
410
400
300
200
100
0
2004 CONFIRMADO
1
2004 DESCARTADO
2005 CONFIRMADO
2005 DESCARTADO
total CONFIRMADO
total DESCARTADO
Fonte: SINAN/GEVEA/SESAU/RO
1.5- Fisiopatogenia
O vírus Mayaro apresenta a propriedade de multiplicar-se em células de
vertebrados, induzindo modificações na síntese de macromoléculas da célula
hospedeira, acompanhadas de alterações morfológicas da membrana celular que
culminam em lise celular. Em células de mosquito (Ae. albopictus), a infecção ocorre de
maneira persistente, não sendo, portanto, observadas modificações na síntese de DNA,
RNA e proteínas das células hospedeiras (De Meneses & Rebello, 2001).
30
O genoma dos Alphavírus é formado por RNA fita simples, polaridade positiva,
não-segmentado, de aproximadamente 11 Kb, associado a 240 cópias de uma proteína
denominada C (30kDa), formando um capsídeo de simetria icosaédrica. Este
nucleocapsídeo é recoberto por um envelope lipoprotéico, oriundo da membrana
plasmática da célula hospedeira, onde estão inseridas as glicoproteínas E1 (54 kDa) e
E2 (52 kDa), sob a forma de heterodímeros, constituindo as espículas virais (Mezencio
et al.,1990; Mezencio & Rebello, 1993).
O RNA genômico (42S) funciona como RNA mensageiro ( RNAm ) para as
proteínas não-estruturais, sendo traduzido nas poliproteínas p123 e p124 que são
clivadas, dando origem a quatro proteínas não-estruturais (nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4),
necessárias à replicação do RNA viral. As proteínas não-estruturais formam o complexo
de replicação responsável pela formação inicial de várias fitas de RNA genômico de
polaridade negativa (42S) que, por sua vez, servem como molde para a síntese de
novas fitas de RNA genômico de polaridade positiva (RNA 42S+) e de RNA
subgenômico 26S, também de polaridade positiva. O RNA subgenômico (26S) serve
como RNAm para a tradução das proteínas estruturais do vírus, as quais são
sintetizadas sob a forma de uma poliproteína, dando origem à proteína do capsídeo
(proteína C) e às proteínas p62, 6K e E1. A proteína C possui atividade autoproteolítica,
realizando sua própria clivagem durante a tradução, a partir do polipeptídio nascente
(Strauss & Strauss,1994).
31
1.6- Manifestações Clínicas
A sintomatologia clinica dessa arbovirose tem duração de 3 a 5 dias, limita-se a
uma doença febril aguda, apresentando artrite, vômito, vertigem, diarréia, além de ser
caracterizada por intensa artralgia, principalmente nos joelhos, tornozelos e nas
pequenas articulações das extremidades, seguido por
lesões maculopapular. Tais
sintomas podem ser confundidos com os de dengue, principalmente em áreas onde
essas duas arboviroses são endêmicas ( Pinheiro,1967; Hoch,1981).
Posterior a febre, os sintomas podem persistir por alguns meses e
ocasionalmente a poliartrite é um fator incapacitante.
Com exceção da artralgia, que persiste em alguns pacientes, por dois meses,
todas as manifestações clínicas duram entre 3 a 10 dias. Podem ocorrer lesões nas
pernas, peito, costas e pernas, e estas quando aparecerem, podem ser vistas mais em
crianças que em pessoas adultas (Pinheiro et al,1996).
1.7- Definição de Caso
As doenças febris agudas acompanhadas de exantemas, de um modo geral são
de difícil diagnóstico, tanto clinico como laboratorial pela variedade de prováveis
agentes etiológicos envolvidos com essas síndromes febris.
As mais conhecidas arboviroses causadas por vírus do gênero Alphavírus são: a
encefalite eqüina venezuelana, encefalite eqüina do leste, Chikungunya, Ross River,
Sindbis e Mayaro que apresentam sintomatologia semelhante, o que dificulta o
diagnóstico clínico e o reconhecimento da enfermidade.
32
O diagnóstico de MAY consiste no isolamento viral em células C6/36, reação de
imunofluoescência indireta (RIFI), reação em cadeia da polimerase (PCR) e Mac-Elisa,
porém, todas essas metodologias necessitam de técnicos altamente qualificados e
estrutura física adequada para execução (Hoch, 1981; Iverson,1989; Travassos da
Rosa, 1982).
O kit Mac Elisa usado para diagnóstico sorológico dessa virose é importado,
chegando a custar por volta de 8 dólares o teste, e nem sempre está disponível
comercialmente no Brasil. O antígeno utilizado nesse método imunológico é o vírus
total, purificado de culturas celulares.
Com a possibilidade da obtenção de proteínas recombinantes por técnicas de
biologia molecular e engenharia genética, foram analisadas duas proteínas de envelope
(E1 e E2) do vírus mayaro por ferramentas de bioinformática para mapear regiões que
apresentam maior potencial antigênico,para tanto, amplificaremos essas regiões
correspondentes no genoma do vírus por RT-PCR e expressaremos esses peptídeos
em sistema procariótico, visando à utilização dessas proteínas para elaboração de kit
nacional para diagnóstico ou levantamento soro-epidemiológico dessa arbovirose.
33
2- OBJETIV0S
2.1- Objetivo Geral
Analisar por bioinformática as proteínas de envelope E1 e E2 do vírus Mayaro,
localizar regiões com potenciais antigênicos, amplificar por RT-PCR essas regiões
respectivas dos genes que codificam para essas proteínas E1 e E2 e expressar essas
proteínas recombinantes em sistema de expressão procariótico.
2.2- Objetivos Específicos
2.2.1- Cultivar o vírus Mayaro em cultura de células de insetos C6/36 para
isolamento do RNA viral;
2.2.2- Amplificar os genes das proteínas do Envelope (E1 e E2) do vírus Mayaro
através de técnica de RT-PCR, com uso de “primers” específicos para
amplificação desses genes;
2.2.3- Clonar em vetor de clonagem pGEM T Easy (Promega-USA) os “amplicons”
obtidos por RT-PCR;
2.2.4- Subclonar em sistema de expressão procariótico pRSET ( Invitrogen – USA)
os fragmentos obtidos a partir da digestão enzimática dos vetores de clonagem
para expressão dessas proteínas recombinantes;
2.2.5- Expressar essas proteínas recombinantes em sistema procariótico.
34
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Sementes Virais
A amostra do vírus Mayaro foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr. Benedito Antonio
Lopes da Fonseca, chefe do Laboratório de Virologia Molecular, da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
3.2- Replicação Viral
Para a replicação viral, foram cultivadas em garrafas de 75 cm3 (Corning, USA),
células de mosquito Aedes albopictus, clone C6/36 (Figueiredo, 1990) em meio
Leibowitz-15 (L-15) (Gibco BRL, USA), suplementadas com, 10% de Soro Fetal Bovino
(Gibco BRL, USA) e 50g/ml de antibiótico gentamicina (Gibco BRL, USA). Manteve as
células em estufa BOD a 28ºC e visualizou-se em microscópio invertido (Nikon, USA)
diariamente até a formação de monocamadas celular confluente.
Para inoculação da amostra do vírus, diluiu-se em meio L-15 a amostra liofilizada
e adicionou 250µl da diluição às células C6/36, incubou-se por 1 hora a 28 ºC. Após
esse período de incubação foi acrescentado 4ml do meio L-15 completo nas garrafas e
armazenadas na estufa a 28 ºC durante 7 dias, para que ocorresse a replicação viral.
As
monocamadas
celulares
inoculadas
eram
inspecionadas
diariamente
em
microscópio invertido (Nikon, USA) para detecção da presença de efeito citopático ou
não. No sétimo dia, alicotou-se em tubos de criopreservação e armazenou-se em
freezer -70 C até extração do RNA viral.
35
3.3- Extração de RNA por TRIzol®
Trata-se de um método baseado na utilização de solução monofásica de fenol e
isotiocianato de guanidina para fins de extração e isolamento de RNA total a partir de
células e tecidos. Obtém-se ao final, RNA total isolado e livre de proteínas e de DNA
(Chomcynski et al., 1987).
Para
este
método
foi
utilizado
o
seguinte
protocolo,
inicialmente
foi
homogeneizado 300µl da amostra de fluído celular com 750µl do reagente TRIzol®
(Invitrogen-USA), a mistura foi agitada em vortex e incubada por 5 minutos em
temperatura ambiente (TA). Adicionou-se 200µl de clorofórmio e agitou-se novamente
no vortex, em seguida foi centrifugado a 14.000 rpm em centrífuga refrigerada, por 15
minutos, a 4°C. Após a centrifugação separou-se a fase aquosa transparente superior,
sobrenadante. Precipitou-se o RNA com 30µl de acetato de sódio e 500µl de
isopropanol e centrifugou-se a 12.000 rpm em centrífuga refrigerada, por 10 minutos, a
4°C. Desprezou-se o sobrenadante de isopropanol e em seguida foi adicionado 500µl
de etanol 75% gelado para lavagem, desprezou-se novamente todo etanol e em
seguida centrifugou-se por 15 minutos a 30°C em concentrador (Eppendorf-USA). Ao
final o RNA foi suspenso em 30µl de água ultrapura para volume final e estocado a 20°C até o uso.
36
3.4- Confecção do DNA Complementar (cDNA)
3.4.1- Transcrição Reversa – RT
Após a extração foi realizada a transcrição reversa a partir dos extratos de RNA
para a confecção da fita de DNA complementar (cDNA). Incubou-se 5µl do RNA
extraído com 3µg de primer randômico pd(N)6 (Gibco BRL, USA), 1µl de dNTPs 10mM
(Gibco BRL, USA). Aqueceu-se as amostras por 5 minutos a 65°C, em seguida
acrescentou-se 4µl do tampão Buffer 5x (Gibco BRL, USA), 2µl DTT 0.1M, 200U/µl
Superscript (Gibco BRL, USA), 10U/µl de inibidor RNase (Gibco BRL, USA) e
completou-se com água ultra-pura volume para 20µl, em seguida incubou-se por 1 hora
a 42°C e ao final por 10 minutos a 70°C para desnaturação da enzima transcriptase
reversa.
3.4.2- Analise das Seqüências Antigênicas das Proteínas Estruturais E1 e E2 do
Vírus Mayaro por Bioinformática
Para análise das proteínas estruturais E1 e E2 do vírus Mayaro fez-se uma
pesquisa no “GenBank” de seqüências do genoma desse vírus (Tabela 02). Analisando
essas seqüências utilizando o programa (DNAstar-USA) para traduzir, alinhar e
desenhar os primers para amplificar as regiões que irão codificar os peptídeos com os
maiores potenciais antigênicos das proteínas estruturais E1 e E2 mapeado por
bioinformática.
37
O gene que codifica a proteína estrutural E1 do MAY tem aproximadamente 1307
nucleotídeos, quando traduzido codifica uma proteína de aproximadamente 435
resíduos de aminoácido. O gene E2 tem aproximadamente 1265 nucleotídeos, dando
aproximadamente 421 aa quando traduzido. Utilizou-se essa seqüência de amonoácido
após
tradução
pelo
DNAstar
Edit
Seq.
e
determinamos
uma
região
de
aproximadamente 272 amonoácido correspondente a região com maior antigenicidade,
hidrofilicidade e probabilidade de se apresentar na superfície. O mesmo foi realizado
para proteína E2. (Figura 03 e 04).
Tabela 02- Genoma do Vírus Mayaro utilizada no alinhamento com auxilio
do programa CLUSTAL W para desenho dos “primers”.
ACCESS
GenBank N
Referencias Bibliográficas
AF237947
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, CCS, Bloco C sl.045 – Ilha do Fundão, Rio de
Janeiro, RJ 21909-900, Brasil.
NC_003417
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, CCS, Bloco C sl.045 – Ilha do Fundão, Rio de
Janeiro, RJ 21909-900, Brasil.
38
FIGURA 03- Análise por Bioinformática da Seqüência de Aminoácidos (aa) da
Proteína E1 do Vírus Mayaro. Hidrofilicidade (Azul); Antigenicidade (Róseo) e
Probabilidade de estar na superfície (Amarelo).
FIGURA 04- Análise por Bioinformática da Seqüência de Aminoácidos (aa) da
Proteína E2 do Vírus Mayaro. Hidrofilicidade (Azul); Antigenicidade (Róseo) e
Probabilidade de estar na superfície (Amarelo).
3.4.3- Amplificação dos Fragmentos dos Genes E1 e E2 da Proteína Estrutural do
Vírus Mayaro por Reação em Cadeia da Polimerase – PCR
39
Para amplificação do genoma viral foi realizada uma RT-PCR utilizando dois
pares de primers ( tabela 03) a partir da definição da região do genoma que codifica
para as proteínas que apresentaram as melhores características antigênicas conforme
tabela 02 e 03. Para facilitar a subclonagem em vetor de expressão procariótico pRSET
(Invitrogen-USA) adicionou-se sítios de restrição nos primers, tanto da região E1 quanto
E2 conforme tabela 03.
Para a amplificação por PCR, misturou-se 5l
de cDNA com 50nM de
iniciadores específicos para cada região do genoma, sense e anti-sense, 0,2 mM de
desoxinucleotídeos, 1,5mM de MgCl2, 2,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen - USA)
e solução tampão até completar volume para 50l. Cada amostra assim preparada foi
inserida em termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, USA). Os ciclos
efetuados para os fragmentos E1 e E2 foram ao todo 35, cada ciclo constituído por
temperaturas de 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto. Ao término
dos 35 ciclos, foi realizada uma extensão final a 72°C por 10 minutos.
40
Tabela 03- Seqüência de Iniciadores de Cadeia (Primers) utilizados para
amplificação das regiões E1 e E2 de Mayaro.
Região Seqüência 5’3’
Genoma
E1 Vírus 5’-atGGATCCtacgagcacacggcaattatt-3’
Mayaro
5’-atGCTACCggcgcagttcatggctcggac-3’
Enzimas Tamanho
Restrição Amplicon
Bam HI
816 pb
Kpn I
E2 Vírus 5’-atGGATCCagcactgcaaatcattttaat-3’
Mayaro
5’-atGCTACCtgtagcttcgcgtttaccgct-3
Bam HI
849 pb
Kpn I
3.5- Eletroforese do Produto da PCR
3.5.1- Gel de Agarose 1,5%
Para verificar se houve amplificação adequada dos amplicons desejados, 5l de
cada amostra foram submetidos à eletroforese (100V; 400W; 30 minutos) em gel de
agarose a 1,5%, em solução tampão TAE contendo 0.09M de Tris base, 0,09M de ácido
bórico e 0,002M de EDTA. Após 30 minutos de corrida, o gel foi tratado em solução de
brometo de etídio a 1l/ml, por 15 minutos, e observado em transluminador ultravioleta.
Os amplicons foram então comparados a um marcador de peso molecular de 1 Kb pb
de DNA (Invitrogen -USA) para análise relativa ao tamanho.
As bandas (E1 e E2) do tamanho correspondente aos fragmentos dos genes de
interesse foram cortadas do gel de agarose e purificadas.
41
3.6- Purificação dos Fragmentos E1 e E2 do Gel de Agarose
3.6.1- Purificação dos Fragmentos Utilizando QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN-USA)
As bandas correspondentes aos fragmentos amplificados foram cortados do gel
de agarose, colocados em tubo tipo eppendorf e adicionou-se 300l de “QG
Solubilization buffer”, incubou-se a temperatura de 50C por 5 minutos para
solubilização da agarose, em seguida adicionou-se 150l de álcool isopropilico e
incubou-se a temperatura ambiente por 5 minutos.Adicionou-se todo o volume na
coluna fornecida no kit, centrifugou-se por 1’ a 8000 rpm, descartou-se o sobrenadante
e lavou-se a coluna com 750l de “Buffer PE Wash” , centrifugou-se novamente por
8000 rpm por 1’ novamente, descartou-se o sobrenadante, identificou-se outro tubo
eppendorf e ressuspendeu-se em 40 l de “Buffer EB Elution buffer”.
3.7- Ligação dos Fragmentos Purificados em Vetor de Clonagem. (pGEM T EasyPromega - USA)
Utilizou-se o kit para clonagem pGEM T Easy, (Promega-USA) para clonar os
fragmentos E1 e E2 do MAY. Para ligação, utilizou-se 0,5 l do vetor, 1,0l do produto
de purificação contendo aproximadamente 220 ng de DNA (E1 ou E2), 2,5l de
tampão de ligase, 1l de ligase, incubou-se em banho a 16C por 40 minutos, retirouse do banho e estocou-se a –20 C.
42
Figura 05- Representação Esquemática do Vetor de Clonagem pGEM T Easy
(Promega-USA)
3.8- Preparo de Células Competentes para Transformação
O preparo de células competentes seguiu a metodologia descrita por MESSING
(1979). Cepas de bactérias E. coli BL-21 (DE3) e TOP 10 F’ estocadas a –70oC em
meio LB/DMSO 10% (Dimetilsulfóxido) foram semeadas em placas LB/agar 1.5%/,
34g/ml de clorafenicol ou tetraciclina respectivamente e incubadas a 37oC por 18
horas. Uma colônia de cada foi inoculada em 5 ml de meio LB líquido para crescimento
durante 18-20 horas a 37oC em agitação constante (250 rpm/minutos) e 0.5 ml da
cultura foi inoculada em 50 ml de meio LB/Tetra. As culturas foram coletadas em fase
exponencial de crescimento e determinada quando a absorbância a 600 nm estava
entre 0.45 e 0.55 nm D.O. As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 5.000
43
rpm, por 10 minutos a 4oC, e logo em seguida suspensa em 25 ml de solução de CaCl2
50mM. Após 30 minutos de incubação em gelo, as bactérias foram novamente
centrifugadas e o sedimento suspenso em 1 ml de CaCl2 50mM. Para armazenamento
por longo tempo foram adicionadas 10% de DMSO e a preparação distribuída em
alíquotas de 200l, congeladas em banho de etanol/gelo seco e posteriormente
estocadas a –70oC.
3.9- Transformação das Células Competentes
As bactérias competentes cepa TOP 10 F’ foram transformadas com DNA
plasmideal utilizando a metodologia descrita por Sambrock, et al. (1989) com algumas
modificações. Brevemente, 2l da reação de ligação ou 0.1 ng de DNA de plasmídeo
pGEM T Easy com inserto foram adicionadas a 50l da suspensão de bactérias
competentes, a mistura foi colocada em gelo por 20 minutos. Após este período, as
células foram mantidas a 42oC por 60 segundos e novamente retornadas ao gelo por 2
minutos quando foram acrescentados 200 l de meio S.O.C (GIBCO-BRL). As
preparações foram incubadas a 37oC por 30 minutos, em agitação constante (120
rpm/minuto) para crescimento bacteriano e posteriormente semeadas em placas de LBagar 1,5% suplementadas com ampicilina (100 g /ml). As placas continham
adicionalmente IPTG/X-gal (0.5 mM/ 40 g/ml). Incubamos por 12 horas a 37  C.
As colônias brancas ou azuis claras das placas LB-agar/IPTG/X-gal, foram
colônias escolhidas ao acaso e
plasmideal.
foram processadas para isolamento do DNA
44
3.10- Extração Plasmideal Utilizando Perfectprep Plasmid Mini ( Eppendorf – USA)
Transferiu-se os 1,5 ml das bactérias crescidas em LB/ampicilina para tubos
eppendorf, centrifugou por 2 minutos a 8000 rpm, descartou o sobrenadante, adicionou
100l da solução 1, homogeneizou vigorosamente, adicionou 150l de solução 2 e
100l da solução 3, homogeneizou a solução resultante e centrifugou por 30 segundos,
transferiu a parte liquida para as colunas que foram fornecidas junto com o kit,
adicionou 450 l de “Binding Matrix Suspension”, homogeneizou e centrifugou por 60
segundos a 8000 rpm, descartou o filtrado, adicionou 400l de solução de purificação,
agitou essa mistura e centrifugou como nas etapas anteriores, transferiu as colunas
para tubos eppendorf novos, adicionou 60l de tampão de eluição, homogeneizou,
centrifugou, recolheu o filtrado e estocou a -20C.
3.11- Análise dos DNAs Plasmidiais Extraídos
Cada colônia selecionada nas placas de LB/Agar foi cultivada em 2 ml de meio
LB/ampicilina a 37oC por 18 horas, em agitação constante (280 rpm/minuto) e os
plasmídeos foram extraídos usando o procedimento de mini-preparação descrito em
Sambrock, et al,1989.
Os produtos da digestão dos DNAs plasmideais foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1,5%. Os plasmídeos foram identificados como
recombinantes quando o inserto foi isolado pela digestão dupla com as enzimas Kpn I e
Bam HI.
45
3.12- Digestão dos Plasmídeos com Enzimas de Restrição Kpn I e Bam H I
Para verificar se os plasmídeos extraídos pelo “Miniprep” estavam com o inserto,
digeriu-se com enzimas de restrição Kpn I e Bam H I (Invitrogen-USA). Utilizou-se 3 l
do produto de miniprep, 1l de tampão 4 , 0,8l de Kpn I, 0,4 de Bam H I e água q.s.p
10l, incubou-se a 37C por 2 horas.
3.13- Eletroforese dos Produtos de Digestão
3.13.1-Gel de Agarose 1,5%.
Para verificar a clonagem do inserto ao vetor de clonagem pGEM T Easy
(Promega-USA) foram usadas as enzimas de restrição Kpn I e Bam H I, em função dos
amplicons terem sítios para ambas
enzimas,
posteriormente correu-se em gel de
agarose 1,5% para verificar se houve a ligação do inserto ao vetor. Os produtos de
digestão foram então comparados a um marcador de 1 kb de DNA (Invitrogen -USA)
para análise relativa ao tamanho do fragmento clonado após coloração do gel com
brometo de etídeo e visualização em luz ultravioleta.
3.14- Subclonagem dos Fragmentos E1 e E2 em Vetor de Expressão Procariótico (
pRSET – Invitrogen-USA)
Os fragmentos obtidos pela digestão dos vetores de clonagem (pGEM T EasyUSA) foram purificados do gel de agarose e em seguida ligados no vetor de expressão
procariótico (pRSET- Invitrogen-USA ). Digeriu-se o pRSET “A” com Bam HI e Kpn I.
Adicionou 2,5 l do tampão 2,5x, 1,5l de pRSET, 1,5 l de Inserto (E1 ou E2) e 1 l de
46
T4 DNA ligase, incubou-se por 1 hora a temperatura ambiente, em seguida estocou-se
a – 20 C.
3.15- Transformação das Ligações pRSET A com E1 ou E2 de Mayaro em BL-21
(DE3)
As bactérias E. Coli cepas BL-21 foram feitas competentes juntamente com as
cepas TOP 10 F’ pela metodologia do cloreto de cálcio, como descrito anteriormente.
Adicionou-se 2,5 l de ligação em um eppendorf de 1,5 ml, adicionou-se 50 l de
bactérias competentes (BL-21), incubou-se em gelo por 20 minutos, em seguida
colocou-se em banho térmico a 42C por 1 minuto, retornando ao gelo imediatamente
por 10 minutos. Adicionou-se 120 l de meio S.O.C. e incubou a 37C por 30 minutos,
plaqueando em seguida em LB/Agar/ com 100 g de ampicilina por ml e incubou-se
novamente a 37C por 14 horas. No dia seguinte selecionou-se 6 colônias de cada
placa para extração plasmideal para confirmação de inserto por restrição enzimática.
3.16- Expressão das Proteínas Recombinantes E1 e E2 de Vírus Mayaro
Os plasmideos recombinantes que foram confirmados por restrição enzimática
foram retransformados em BL-21 (DE3) para expressão das proteínas. Uma colônia de
cada placa (E1 e E2) foi pré-inoculado em 5 ml de meio LB/liquido com 100 g/ml de
ampicilina. No dia seguinte, adicionou-se 1 ml do pré-inóculo em 100 ml de meio LB
liquído/ampicilina e cresceu a 37C em incubadora de agitação a 120 rpm até 0,5 DO
em filtro de 600 nm. Após atingir a D.O, induziu-se com IPTG numa concentração final
47
de 10mM/ml. Centrifugou-se as culturas celulares em tubos tipo Falcon de 50 ml por
5000 rpm por 10 minutos, descartou-se o sobrenadante e suspendeu-se o “pellet” com
2 ml de PBS Triton X 100 1%, acrescentando 1 g/ml de lisozima, incubando a 37 C
por 10 minutos, seguiu-se com 5 ciclos de congelamento rápido com azoto liquído e
descongelamento em banho-maria 37C, passando o lisado por uma seringa de 5 ml
com agulha 27 x 14 mm por 10 vezes para lise do DNA genômico. Acrescentou-se
mais 2 ml PBS/Triton X 100 1% em cada tubo e centrifugou-se novamente por 10
minutos. Separou-se o sobrenadante do “pellet” em tubos tipo falcon de 15 ml e diluiuse o pellet em 2 ml de Urea 8M.
3.17- Gel de Poliacrilamida SDS/PAGE a 12% para Verificação das Proteínas
Expressas E1 e E2 em Sistema Procariótico
As amostras “pellet” e sobrenadante das proteínas E1 e E2, induzidos com IPTG
ou não, foram aplicadas em gel SDS 12 % para confirmação de expressão das
mesmas. Após corrida eletroforetica, o gel foi corado com “coomassie blue” em seguida
descorado para retirada do excesso de corante e fotografado.
3.18- Purificação das Proteínas Recombinantes E1 e E2
Os extratos brutos obtidos a partir da lise das bactérias foram passadas em
colunas de níquel para purificação dessas proteínas recombinantes pelas caudas de
histidina.
48
4- RESULTADOS
4.1- Isolamento Viral
Após inoculação do vírus mayaro em garrafas de cultura celular de 75 cm3
(C6/36) para replicação viral, essas foram observadas diariamente em microscópio
invertido (Nikon, USA) para verificação de alterações na morfologia celular (efeito
citopático), indicando a presença de infecção viral. Observou-se um discreto aumento
celular e presença de raras células em forma de sincício.
4.2- Resultado da Extração do RNA Viral
Após sete dias de inoculação do vírus nas culturas de células C6/36, extraiu-se o
RNA do sobrenadante. As duas amostras foram extraídas por TRIzol® (Invitrogen-USA)
conforme protocolo do fabricante.
4.3- Resultado da Amplificação por Transcriptase Reversa - RT
Após a extração do RNA das duas amostras inoculadas em culturas, esses
foram submetidos à transcrição reversa (RT) para formação do cDNA
“primers” randômicos pDN6 (Invitrogen-USA) e
total com
posteriormente amplificados pela
técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os pares de primers
específicos para região E1 e E2 do vírus MAY.
49
4.4- Amplificação por RT-PCR das Regiões do Gene E1 e E2 do Vírus MAY
As duas amostras extraídas foram amplificadas pela técnica de PCR utilizando
os primers para região E1 e E2, amplificando fragmentos de 816 pb para E1 e 849 pb
para E2, coluna 2 e 3. Como controle positivo para o vírus, utilizou-se um par de primers
para gênero alphavírus, 400 pb coluna 1, controle negativo uma amostra de cDNA de
Dengue 3, coluna 4 e controle negativo da PCR uma amostra sem cDNA, coluna 5.
1
M
2
3
4
5
816 pb
849 pb
400 pb
Fig. 06. Eletroforese em gel agarose 1,5% do produto da RT- PCR para Amplificação
do fragmento do gene E1 e E2 vírus MAY. M= Marcador Peso molecular 1kb; 1= 400
pb;
2= 816 ; 3= 849 ; 4= DENV 3 ; 5= CT(-)
4.5- Resultado da Digestão do Vetor de Clonagem com Kpn I e BAM H I.
Os fragmentos correspondentes a E1 e E2 de vírus MAY após eletroforese do
produto da RT- PCR foram recortados do gel de agarose, purificados e ligados em vetor
de
clonagem
(pGEM
T
Easy-Promega-USA).
Para
verificar
se
os
insertos
50
correspondentes aos fragmentos E1 e E2 de vírus MAY estavam clonados, digeriu-se
com as enzimas de restrição Kpn I e Bam H I, devido a presença de sítios de restrição
nos primers sense e anti-sense respectivamente, utilizados na RT-PCR. A figura 07
mostra cinco plasmídeos digeridos, correspondentes ao fragmento do gene E1, com
tamanho de 816 pb.
Na figura 08, cinco plasmídeos digeridos com as mesmas
enzimas, mostrando que os fragmentos E2 de 849 pb foram clonados.
M
1
2
3
4
5
816 pb
Fig. 07 - Eletroforese em gel agarose 1,5% da Digestão do Miniprep pGEM T Easy
com Fragmento E1 de vírus MAY. M= Marcador 1kb; 1= 816 pb;2=816 pb ; 3= 816 pb;
4= 816; 5=816
51
M
1
2
3
4
5
849 pb
Fig. 08 - Eletroforese em gel agarose 1,5% da Digestão do Miniprep pGEM T Easy
com Fragmento E2 de vírus MAY. M= Marcador 1kb; 1= 849 pb; 2=849 pb ; 3= 849 pb;
4= 849; 5=849.
4.6- Subclonagem dos Fragmentos E1 e E2 do Vírus MAY em vetor de expressão
procariótico (pRSET– Invitrogen-USA)
Após confirmação de inserção dos fragmentos E1 e E2 de Mayaro no vetor de
clonagem (pGEM T Easy - Promega-USA) por restrição enzimática, um fragmento de
cada clone foi recortado do gel de agarose e purificado. Juntamente com a digestão dos
vetores de clonagem, digeriu-se o vetor de expressão procariótico pRSET (Frame A)Invitrogen-USA), purificando juntamente com os fragmentos retirados do pGEM T Easy.
Após purificação de todos os fragmentos e confirmação da purificação por eletroforese
e gel de agarose, os fragmentos foram ligados no vetor de expressão e transformados
em células competentes TOP 10 F’. As colônias transformadas foram crescidas em 2 ml
52
de meio LB/Amp com 100 g/ml de ampicilina por 18 horas e feita a extração dos
plasmídeos (MiniPrep). Para confirmação do inserto no vetor de expressão, digeriu-se
com Kpn I e Bam HI. Os plasmídeos recombinantes com os respectivos insertos E1 e E2
foram retransformados em células competentes E. coli cepa BL –21 para expressão das
proteínas recombinantes.
M
M
1
2
3
4
5
6
816 pb
Fig. 09 - Eletroforese em gel agarose 1,5% da digestão do miniprep do vetor de
expressão pRSET A com Kpn I e Bam HI, mostrando o fragmento E1 de Mayaro. M=
Marcador peso molecular de 1kb; colunas de 1- 6= Fragmentos de. 816 pb
53
M 1
2
3
4
5
6 M
849 pb
Fig. 10- Eletroforese em gel agarose 1,5% da digestão do miniprep do vetor de
expressão pRSET A com Kpn I e Bam HI, mostrando o fragmento E2 de Mayaro. M=
Marcador peso molecular de 1kb; colunas de 1-6= Fragmentos de. 816 pb
4.7- Expressão das Proteínas E1 e E2 de Mayaro em Sistema Procariótico pRSET
Após transformação dos plasmideos recombinantes (pRSET + E1 ou E2) em BL21, inoculou-se em agitador a 37º C com agitação constante de 180 rpm uma colônia de
cada clone em 5 ml de meio LB/Amp 100 ug/ml durante 14 horas. No dia seguinte, foi
inoculado 1 ml da bactéria transformada em 100 ml de meio LB/Amp deixando crescer
por 3 horas, até atingir uma DO de 0,5 nm em filtro de 600 nm. Após atingir a DO,
induziu-se com IPTG para concentração final de 1 mM/ml e outro Erlemeyer não
induziu, sendo utilizado como controle negativo. Após a indução, deixou-se por 2 horas
e em seguida fez-se a lise das bactérias para obtenção das proteínas de interesse.
54
1
2
3
4
5
35kDa
36.5 kDa
35,5kDa
Figura 11- Gel de Poliacrilamida SDS/PAGE 12% mostrando o extrato bruto da lise das
bactérias BL-21 com os plasmideos recombinantes E1 e E2 . Coluna 1 = Marcador peso
molecular de proteína; coluna 2= pellet do extrato bruto sem indução E1 de MAY; coluna
3= pellet do extrato bruto sem indução de E2 de MAY; coluna 4= pellet do extrato bruto
com indução de E1 de MAY; coluna 5= pellet do extrato bruto com indução de E2 de
MAY.
55
5- DISCUSSÃO
No Brasil, as doenças infecciosas são muito abrangentes e as possibilidades de
surgimento de novos agentes de infecção em humanos são variadas, em função da alta
diversidade da fauna e flora nacional. Algumas doenças ganharam importância como
emergentes no país, mas em seguida não foram diagnosticados mais casos. Entre elas
está a encefalite pelo vírus Rocio (apresentou surto no litoral sul de São Paulo, em
1975); a febre negra de Lábrea (que apareceu na Amazônia ocidental na mesma
época); a síndrome hemorrágica de Altamira, relacionada a picada do pium ou
borrachudo, inseto da família simuliidae e a infecção pelo vírus Sabiá (identificado em
Cotia, Estado de São Paulo na década de 80)(Dégallier et al,1989).
As glicoproteínas são componentes majoritários do envelope viral do vírus MAY,
apresentando funções importantes, tais como; adsorção com os receptores celulares
no processo de liberação das partículas virais através da superfície celular. Diversos
autores têm mostrado que o bloqueio da seqüência das reações de glicosilação
interfere, de modo acentuado, com a propagação de diversos vírus animais (Cash;
Hendershot; Bishop, 1980).
A febre do MAY é uma doença viral aguda limitada, transmitida por insetos com
manifestações clínicas tais como: febre, calafrios, rache cutâneo, mialgia e intensa
artralgia. O MAY apresenta sintomas que confundem com os sintomas do dengue,
sendo difícil o diagnóstico onde essas duas doenças ocorrem simultaneamente. A partir
de seu isolamento em 1954, algumas epidemias por esse vírus foram descritas; em
56
1955 no Brasil, Bolívia e outros casos relatados no Surimane, Guiana Francesa, Peru e
em Trinidad & Tobago(Casals & Whitman, 1957; Lopes, et al., 1978; Pinheiro &
Dias,1967).
Embora o ciclo silvestre principal do vírus MAY seja igual ao da febre amarela
(Herve et al. 1986), envolvendo macacos e mosquitos do gênero Haemagogus e
exprimindo-se através de epidemias simultâneas (Hoch et al. 1981; Pinheiro et al.
1981), o MAY tem sido também, evidenciados em aves (41 espécies distintas),
marsupiais diurnos e répteis.
5.1- Análises por Bioinformática das Proteínas E1 e E2
Com o avanço na predição de estruturas de proteínas por métodos
computacionais, a bioinformática ganha lugar de destaque como ferramenta para
desenvolvimento de estudo nas ciências biológicas. De acordo com Rost & Sander
(1996), o crescimento dos bancos de dados irá possibilitar avanços nos métodos de
predição, os quais se encontram com níveis razoáveis de acerto quando aplicados em
característica de uma dimensão, como p. ex., predição da estrutura secundária,
acessibilidade do resíduo e a localização de hélices transmembrana.
De acordo com Claros et al (1997) assim como os softwares tornaram-se
importantes ferramentas de pesquisa nos campos da química combinatorial e do
desenho de drogas, as redes neurais têm sido muito utilizadas para a resolução de
problemas em biologia molecular, com especial atenção quanto aos métodos de
predição de sítios de clivagem e na identificação de peptídeos sinal. Segundo M. Shah
57
et al, 2003, com o advento da tecnologia do DNA recombinante, a explosão no número
de sequências primárias catalogadas em combinação com o incremento dos bancos de
dados de estruturas proteicas, está levando à popularização dos algoritmos preditivos
computacionais. Esta utilização de bancos de dados para acesso remoto, foi relatada
por Atwell et al (1995), que utilizaram um servidor WWW(word wide web) local para
organizar sequências de DNA e proteínas freqüentemente usadas em pesquisas, para
acesso público ou privado. Estes autores listam várias vantagens deste procedimento,
dentre as quais pode-se citar: 1) é um meio fácil de armazenar sequências para
utilizações futuras; 2) os arquivos podem ser para acesso público na Internet ou privado
por requerimento de uma senha de acesso ou password; 3) as sequências podem ser
acessadas à partir de plataformas múltiplas, os arquivos podem ser acessados
remotamente de qualquer computador na Internet, utilizando um formato simples no
arquivamento das sequências, o que simplificaria o manuseio e arquivamento dos
dados; 4) e a possibilidade de links para arquivos remotos que poderiam ser
adicionados junto aos arquivos locais.
Usando programas computacionais (PROTEAN e ANTHEPROT) para mapear
regiões com potenciais antigênicos das proteínas de envelope E1 e E2 do vírus MAY
determinou-se um fragmento de aproximadamente 31 KDa para E1 que apresentou as
seguintes características: alta antigenicidade, hidrofilicidade e alta probabilidade de se
apresentar na superfície, o mesmo estudo foi feito para proteína E2 com a determinação
de um fragmento de aproximadamente 32 KDa. Ambas as proteínas são glicosiladas. A
a opção de expressar em sistema procariótico foi devido a utilização de apenas parte
58
dessas proteínas, o que esperou-se não interferir no reconhecimento pelos anticorpos
contra
essas
proteínas
recombinantes
e
suas
utilizações
como
antígenos
recombinantes para diagnóstico da febre do MAY por métodos imunoenzimáticos.
De acordo com Van Regenmortel (1996), a habilidade em predizer a localização
exata dos sítios antigênicos em proteínas permanece parcialmente limitada porque os
algoritmos para predição reduzem a complexidade dos epítopos aos modelos lineares,
unidimensionais. Ora, observou-se por estudos de anticorpos monoclonais que os
epítopos por eles reconhecidos muitas vezes eram conformacionais, constituídos por
variações de sequências peptídicas compostas por unidades distantes na seqüência
primária da proteína. A redução de um sistema protéico com quatro estruturas para
representações bi ou tridimensionais, inevitavelmente distorceria a percepção da
natureza dinâmica dos epítopos. M. Shah et al, 2003, concluíram que existe evidência
experimental para confirmar ou predizer as conformações proteicas que podem ser
geradas utilizando-se bibliotecas de peptídeos para analisar anticorpos monoclonais.
5.2- Expressão de Proteínas Recombinantes
Grande parte dos esforços despendidos na expressão de proteínas heterólogas,
visando obtê-las em quantidade adequada para posterior purificação e cristalização, se
concentra na experimentação de sistemas de expressão alternativos, incluindo
bactérias, leveduras, células de insetos e no uso dessas proteínas de fusão como
antígenos em ensaios imunoenzimáticos para diagnóstico das mais diversas doenças
infecciosas e parasitarias, além de poderem também ser utilizadas para estudo de
fisiopatologia.
59
6- CONCLUSÃO
6.1- O sistema de expressão procariótico de proteínas recombinantes é uma
alternativa viável e barata para produção de insumos diagnóstico de uma serie de
doenças infecciosas e parasitarias, como a febre do MAY;
6.2- A utilização dessas proteínas recombinantes de MAY abre perspectivas para
esclarecimento de algumas viroses muito comum na nossa região sem um diagnóstico
preciso;
6.3- O mapeamento de epitopos por bioinformática possibilita a determinação de
regiões com alto potencial de antigenicidade e imunogenicidade, diminuindo o tempo e
custos nas pesquisas biotecnológicas;
6.4- As proteínas se apresentaram insolúveis, porém estamos trabalhando com
algumas técnicas descritas na literatura para solubilização dessas mesmas e sua
renaturação, antes de utilizá-las em ensaios imunoenzimáticos;
6.5 As proteínas E1 e E2 que foram expressas e purificadas estão prontas a
serem utilizadas como antígenos em ensaios imnunoenzimáticos (ELISA e Western
Blott);
6.6- Essas proteínas serão utilizadas para imunizações de coelhos para testar a
sua imunogenicidade e produção de anticorpos policlonais para essa arbivirose.
60
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