Valquíria do Carmo Rodrigues Alves
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS “IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS”. VALQUIRIA DO CARMO ALVES MARTINS MANAUS 2012 VALQUIRIA DO CARMO ALVES MARTINS “IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS”. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador (a): Profª. Dr.ª MARIA PAULA GOMES MOURÃO MANAUS 2012 Ficha Catalográfica M386i Martins, Valquiria do Carmo Alves. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. / Valquiria do Carmo Alves Martins. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012. 62 f. : il. Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2012. Orientadora: Profa. Dra. Maria Paula Gomes Mourão 1. Doença febril aguda. I. Título. 2. Arbovírus 3. Diagnóstico molecular CDU: 614.4 Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva, lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA VALQUIRIA DO CARMO RODRIGUES ALVES “IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS.” Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. BANCA EXAMINADORA (ordem alfabética) CINTIA MARA COSTA DE OLIVEIRA LUIZ TADEU MORAES FIGUEIREDO MARIA PAULA GOMES MOURÃO RAJENDRANATH RAMASAWMY REGINA MARIA PINTO DE FIGUEIREDO Manaus, 14 de Setembro de 2012. . AGRADECIMENTOS A Deus, que me permitiu avançar em mais uma fase da minha vida. À minha família, que esteve sempre presente e me apoiando. Ao meu marido, Renato Silva Martins por todo amor, paciência. Aos meus filhos, Laís Alves Martins e Leonardo Alves. À querida Maria de Nazaré, que me ajuda todos os dias a cuidar da minha família e, muitas vezes, é mais mãe dos meus filhos do que eu mesma. À minha amada mãe, Maria da Penha Rodrigues Alves, que sempre esteve ao meu lado, não apenas nos momentos fáceis, mas, principalmente, nos difíceis, sempre em oração para que no final tudo desse certo. À minha orientadora, Prof.ª Dra. Maria Paula Gomes Mourão, pela paciência e confiança em investir na minha formação acadêmica. Aos colegas da Gerência de Virologia: Dra. Márcia, Dra. Regina, Dr. Vorney, Dra. Cintia, Liane, Elizabeth, Evaulino, João Bosto, Valéria, Natália, Caroline. Obrigada pelos conselhos, apoio, amizade e por compartilhar as minhas alegrias e também as minhas dificuldades. Em especial à Dra. Michele de Souza Barrionuevo, amiga, colega de trabalho e de jornada, pelo incentivo, paciência, ensinamentos e sábios conselhos e, principalmente, pela colaboração na elaboração desta dissertação. A todos os professores do Programa de Pós-Graduação Em Medicina Tropical / Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas, pelos ensinamentos, auxílio e amizade. Ao Prof. Dr. Rajendranath Ramasawmy pela paciência e confiança, pelos ensinamentos preciosos e pelas experiências compartilhadas. Ao Prof. Dr. Felipe Naveca, diretor do Instituto de Pesquisa Leônidas & Maria Deane (ILDM), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Manaus-Amazonas, pelos ensinamentos fundamentais em biologia molecular e apoio nas análises. Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo (USP-Ribeirão Preto) por ter gentilmente fornecido os vírus utilizados neste projeto. Ao Prof. Dr. Sergio Nozawa, pelo apoio teórico e por disponibilizar o laboratório de biologia aquática da Universidade Nilton Lins, Manaus-Amazonas, para análises de sequenciamento. Às minhas amigas Giselle Falabella e Raquel Falabella pela amizade, apoio e ajuda nos desenhos gráficos. À Fundação Centro de Controle em Oncologia do Estado do Amazonas, instituição na qual sou vinculada profissionalmente, a toda a sua Diretoria e, em particular à Gerência do Laboratório de Analises Clínicas, por me permitir traçar mais esta jornada. Agradeço, enfim, a todas as pessoas que contribuíram para a melhoria deste trabalho. RESUMO Os arbovírus são muitas vezes ligados a surtos em humanos e representam um grave problema de saúde pública. Em geral, podem causar sintomatologia, caracterizada por febre aguda, dor de cabeça, mialgias, artralgia, exantema, até doenças mais graves, tais como hepatite e encefalite. Na maioria dos casos, o diagnóstico diferencial entre os arbovírus pode ser difícil, especialmente na fase aguda da infecção, em que os sintomas são muito semelhantes. Estudos têm demonstrado a circulação de arbovírus em várias regiões do Brasil, durante epidemias, e mostrou a necessidade de um sistema de vigilância eficiente para controlar a entrada e a circulação de arbovírus. Em Manaus, a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) é uma instituição pioneira na implementação da vigilância de síndrome febril aguda indiferenciada. Este estudo, portanto, teve como objetivo estudar os casos de doença febril aguda indiferenciada, atendidos em um hospital terciário na Bacia Amazônica, durante a epidemia de dengue em Manaus. No período de 1° de janeiro a 31 de maio de 2011, foram incluídas no inquérito 677 amostras biológicas (soro) de pacientes com suspeita clínica de dengue, notificados à Gerência de Virologia da FMT-HVD, para confirmar o diagnóstico. Durante o período do estudo, todas as amostras foram testadas e confirmadas por PCR e Nested-PCR, usando primers específicos para Flavivirus (DENV 1-4, SLEV, BSQV, ILHV), Alphavirus (MAYV) e Orthobunyavirus (OROV). Após a purificação de ácido nucleico, de 38,4% (260/677) foram positivas para Flavivirus. Destes, DENV foi identificado em 100% das amostras, com 26 (10,0%) DENV-1, 120 (46,2%) DENV-2, 24 (9,2%) DENV-3, 77 (29, 2%) DENV-4, e co-infecções de: DENV-1/4 5 (1,9%); DENV-1/2 1 (0,4%) DENV-2/4 6 (2,3%) e DENV- 3/4 (0,4%). Uma análise comparativa das sequências dos quatro sorotipos circulantes mostra uma similaridade de 97-99% com as sequências referências depositadas no GenBank. De acordo com árvore filogenética tipo neighbor-joining, as sequências obtidas no estudo para Dengue-1 são pertencentes ao genótipo V; para Dengue-2 ao genótipo Asiático/americano; para Dengue-3 ao genótipo III; e para o Dengue-4 genótipo II. Todas as amostras foram negativas para os gêneros Alphavirus (MAYV) e Orthobunyavirus (OROV). Aumento da incidência de casos de dengue e a ocorrência dos quatro sorotipos podem propiciar o risco de novas epidemias e o aumento dos casos de dengue grave. No entanto, apenas o monitoramento de doenças endêmicas e emergentes, que causam doença febril aguda indiferenciada, pode fornecer as informações necessárias para as medidas políticas adequadas e a vigilância da saúde pública para a região. Palavras-chaves: Doença febril aguda, arbovírus, diagnóstico molecular, Amazonas. ABSTRACT Arboviruses often cause outbreak in humans and are a serious threat to public health. Clinical manifestations from arbovirus infection may range from mild symptoms , such as acute fever, headache, myalgia, artralgia or rash to severe disease as bleeding, hepatitis or encephalitis. In most cases, the clinical differential diagnosis between arboviruses can be difficult, especially in the acute phase of infection, where symptoms are very similar. Several studies have shown the circulation of arboviruses in various regions of Brazil during outbreaks and highlight the urgency of an efficient system of surveillance to monitor the entry and circulation of arboviruses. In Manaus, the Fundação de Medicina Tropical, Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) is the first hospital that implemented the surveillance of acute undifferentiated febrile syndrome. Here, the aim is to study the cases of acute undifferentiated febrile illness seen in the tertiary referral hospital FMT-HVD of the Brazilian Amazon Basin during the dengue epidemic in Manaus. From the first January to May 2011, 677 sera samples from patients with suspected dengue clinical manifestations were sent to the virology laboratory of the FMT-HVD to confirm diagnosis. All the samples underwent nucleic acids purification and submitted to PCR and nested PCR using specific primers for Flavivirus (DENV 1-4, SLEV, BSQV, ILHV), Alphavirus (MAYV) and Orthobunyavirus (OROV). Of the 677 samples tested by PCR and nested PCR, 260 (38.4%) were positive for Flavivirus. DENV was detected in all the 260 samples. Of these, 26 (10.0%) had DENV-1, 120 (46.2%) DENV-2, 24 (9.2%) DENV-3, 77 (29.2%) DENV-4, and co-infections of DENV-1/4, DENV-1/2, DENV-2/4, e DENV- ¾ were observed in 5 (1,9%), 1 (0,4%), 6 (2,3%) and 1 (0,4%) respectively. Nucleotides sequence comparative analysis of the four serotypes individually showed similarity ranging from 97 to 99% to each serotype sequence in the database of GenBank. Phylogenetics construction using the neighbor-joining methods revealed that the sequences obtained for DENV-1 belong to genotype-V while DENV—2 to the Asian/American genotype, DENV-3 to genotype III and DENV-4 to genotype II. Neither Alphavirus (MAYV) nor Orthobunyavirus (OROV) was detected in all the samples. The increasing incidence of dengue cases and the occurrence of the four serotypes simultaneously indicate the risk of new epidemics and increased cases of dengue hemorrhagic fever. However, only the monitoring of endemic and emerging diseases causing acute undifferentiated febrile illness can provide the information necessary for appropriate policy action and public health surveillance for the region. Keywords: Febrile disease, acute, arbovirus, molecular diagnosis, Amazonas. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus. 02 Figura 2: Ilustração da morfologia do virion de um Flavivirus e suas 04 principais proteínas estruturais. Figura 3: Esquema do genoma dos Flavivirus a partir de uma ORF. Figura 4: Fluxograma das manifestações clínicas causadas 04 pela 09 infecção do vírus Dengue. Figura 5: Ilustração da morfologia do virion de um Alphavirus e suas 15 principais proteínas estruturais. Figura 6: Ilustração da morfologia do virion da Família Bunyaviridae e 18 suas principais proteínas estruturais. Figura 7: Ilustração do genoma da Família Bunyaviridae. 19 Figura 8: Diagnóstico laboratorial das arboviroses. 22 Figura 9: Fluxograma da metodologia aplicada às amostras incluídas no 30 estudo. LISTA DE TABELA Tabela 1. Proteínas virais dos Flavivirus e sua função. 05 Tabela 2. Sinais de alarme e choque na infecção pelo vírus Dengue. 09 Tabela 3. Relação de arbovírus brasileiros em estudo. 29 Tabela 4. Relação das estirpes de arbovírus brasileiros que serão utilizadas 31 no estudo como controle positivo. Tabela 5. Relação de primers utilizados no estudo. 34 Tabela 6. Relação de sequências de vírus DENV utilizadas na análise 45 filogenética. LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS °C Graus Celsius 3’NC 3’Não codificante 5’NC 5’Não codificante BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSQV Vírus Bussuquara C Proteína do capsídeo cDNA DNA complementar CEP Comitê de Ética em Pesquisa CHIKV Vírus Chikungunya CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CPCV Vírus Cacipacoré DENV Vírus dengue DENV-1 Vírus Dengue sorotipo 1 DENV-2 Vírus Dengue sorotipo 2 DENV-3 Vírus Dengue sorotipo 3 DENV-4 Vírus Dengue sorotipo 4 DF Febre do dengue DG Dengue grave DHF Febre hemorrágica do dengue DNA Ácido desoxirribonucleico DNG Dengue não grave DNG(SA) Dengue não grave com sinais de alerta dNTP Desoxirribonucleosídeos trifosfatados ddNTP Didesoxirribonucleosídeos trifosfatados DSS Síndrome do choque do dengue E Proteína do Envelope E1 Proteína 1 do envelope viral E2 Proteína 2 do envelope viral E3 Polipeptídeo E3 ELISA Ensaio imunoenzimático FA Febre amarela FAS Febre amarela silvestre FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas FC Fixação do complemento FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado G1 Proteínas G1 do envelope viral G2 Proteínas G2 do envelope viral IF Imunofluorescência IFI Imunofluorescência indireta IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IGUV Vírus Iguape IH Inibição de hemaglutinação ILHV Vírus Ilhéus JEV Vírus da encefalite japonesa M Molar M Proteína da membrana MAYV Vírus Mayaro MgCl2 Cloreto de Magnésio MgSO4 Sulfato de Magnésio min. Minutos mL Mililitro mM Milimolar MS Mistério da Saúde N Proteína do nucleocapsídeo NASBA Nucleic acid sequence based amplification NB3 Nível três de biossegurança nm Nanômetros NS1 Proteína não estrutural 1 NS2a Proteína não estrutural 2a NS2b Proteína não estrutural 2b NS3 Proteína não estrutural 3 NS4a Proteína não estrutural 4a NS4b Proteína não estrutural 4b NS5 Proteína não estrutural 5 NSm Proteína não estrutural M nsP1 Proteína não-estrutural P1 nsP2 Proteína não-estrutural P2 nsP3 Proteína não-estrutural P3 nsP4 Proteína não-estrutural P4 NSs Proteína não estrutural S ORF Open Reading Frame OROV Vírus Oropouche pb Pares de base PCR Reação em Cadeia de Polimerase pmol Picomol PM Peso molecular PPSUS Programa de Pesquisa para o SUS PrM Proteína de Pré-membrana RNA Ácido Ribonucléico ROCV Vírus Rocio RT-PCR Reação da transcriptase reversa, seguida de Reação em cadeia de polimerase SLEV Vírus da encefalite de Saint Louis th Temperatura de hibridização TBEV Vírus da encefalite transmitida por carrapatos TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido td Temperatura de desnaturação te Temperatura de extensão TN Teste de neutralização UEA Universidade do Estado do Amazonas VEEV Vírus da encefalite equina venezuelana WNV Vírus do Nilo Ocidental YFV Vírus da Febre Amarela μl Microlitro μM Micromolar SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 01 1.1 Considerações gerais dos arbovírus ................................................... 01 1.2 Família Flaviviridae – Gênero Flavivirus.............................................. 03 1.2.1 Vírus da Febre amarela (YFV) ............................................................ 07 1.2.2 Vírus Dengue (DENV) ......................................................................... 07 1.2.3 Vírus Bussuquara (BSQV) .................................................................. 12 1.2.4 Vírus Cacipacoré (CPQV) ................................................................... 12 1.2.5 Vírus Ilhéus (ILHV) .............................................................................. 13 1.2.6 Vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) .......................................... 13 1.3 Família Togaviridae – Gênero Alphavirus............................................ 15 1.4 Família Bunyaviridae – Gênero Orthobunyavirus................................. 18 1.5 Diagnóstico laboratorial das arboviroses.............................................. 20 1.5.1 Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento nucleotídico... 22 2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 25 3 OBJETIVOS.................................................................................................. 26 3.1 Geral..................................................................................................... 26 3.2 Específico............................................................................................. 26 METODOLOGIA............................................................................................ 27 4.1 Modelo de estudo ................................................................................ 27 4.2 Universo de estudo............................................................................... 27 4.2.1 Local de estudo.................................................................................... 27 4.2.2 Definição de caso................................................................................. 27 4.2.3 População de estudo............................................................................ 27 4.2.4 Participantes......................................................................................... 28 4 4.3 Procedimentos...................................................................................... 28 4.3.1 Doenças em estudo e algoritmos de investigação e diagnóstico........ 28 4.3.2 Métodos de diagnóstico laboratorial..................................................... 31 4.3.2.1 Protocolo de extração de RNA............................................................. 32 4.3.2.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)............................................... 32 4.3.2.3 Primers................................................................................................. 33 4.3.2.4 Protocolo de PCR para identificação de Alphavirus ............................ 35 4.3.2.5 Protocolo de PCR para identificação de Flavivirus ............................. 37 4.3.2.6 Protocolo de PCR para identificação de Orthobunyavirus .................. 42 4.3.2.7 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação........................ 43 4.3.2.8 Sequenciamento nucleotídico.............................................................. 44 4.3.2.9 Análise da sequências.......................................................................... 45 4.3.3 Aspectos éticos.................................................................................... 47 4.4 Análise estatística dos resultados........................................................ 47 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 48 6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 49 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 50 8 ANEXOS........................................................................................................ 63 8.1 Equipe científica de apoio ao desenvolvimento do projeto.................. A 8.2 Ficha clínica padrão para o estudo...................................................... B 8.3 Certificado de aprovação – CEP/FMT-HVD......................................... C 8.4 Termo de consentimento livre e esclarecido....................................... D 8.5 Artigo científico ................................................................................... E 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Considerações gerais dos arbovírus Os arbovírus (arthropod-borne-virus) são vírus que podem ser transmitidos ao homem por vetores artrópodes (mosquitos, carrapatos, percevejos, entre outros) e estão frequentemente associados a surtos ou epidemias. Representando um sério problema de saúde pública, com implicações econômicas e sociais nos países tropicais (1). O Brasil é um país tropical de grande porte e um terço do seu território ainda é coberto por florestas tropicais e outros ecossistemas naturais, os quais fornecem condições ideais para ocorrência de diversas arboviroses, mantidas, em sua maioria, por complexos ciclos zoonóticos. Estes envolvem patógenos que normalmente circulam entre os animais não humanos, mas podem ser transmitido aos seres humanos (2). Em um ciclo de manutenção enzoótico, envolvendo aves, roedores e primatas, o que ocorre em hábitat silvestre. O vírus da Febre Amarela (YFV) é um exemplo. Entretanto, acidentalmente, de forma menos comum, podem ser transmitidos aos seres humanos (Figura 1) (3). Os arbovírus precisam de um hospedeiro — no qual são replicados — e de um vetor para a transmissão para outros organismos. A fêmea do mosquito, durante a hematofagia, adquire e transmite o vírus ao hospedeiro. A transmissão vertical pode ocorrer também, por via transovariana, na qual o artrópode infecta verticalmente parte de sua prole (4). De uma forma geral, as arboviroses podem causar desde sintomas leves, caracterizados por febre, cefaleia, mialgia, artralgia, exantema, até doenças mais graves, como aquelas que culminam com hemorragia, hepatite e encefalite, variando de acordo com o tipo de arbovírus responsável pela infecção (2). Na maioria das vezes, o diagnóstico clínico diferencial entre arboviroses pode ser difícil, sobretudo na fase aguda da infecção, quando os sintomas são muito parecidos (5). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 2 Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus. Descritos em três grandes categorias de ambientes: natural (florestas), modificado (rural ou agrícola) e humanos (urbanos). Este esquema é um modelo geral que pode ser adaptado de acordo com o patógeno, o(s) vetor (es), o(s) hospedeiro(s) e o meio ambiente em que eles ocorrem (3). A maioria dos arbovírus conhecidos tem o genoma constituído por ácido ribonucleico (RNA) e são classificados, por meio de um sistema universal baseado nas características físico-químicas, nas famílias: Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae (2). Reconhece-se ainda a existência de possíveis arbovírus, fazendo parte das famílias: Arenaviridae, Poxviridae, Herpesviridae e Coronaviridae, entre outras (6). Apesar de pertencerem a um grupo heterogêneo, aqueles de importância médica são agrupados em gêneros específicos. Os exemplos mais proeminentes de arboviroses emergentes incluem: vírus do Nilo Ocidental (WNV, Flavivirus), na América do Norte; o vírus da encefalite japonesa (JEV, Flavivirus), na Ásia; o vírus Chikungunya (CHIKV, Alphavirus), na região do Oceano Índico. Nas Américas o vírus da febre amarela, o vírus Oropouche, o vírus Mayaro e diversos outros arbovírus, causadores de encefalite, e principalmente, o vírus dengue (DENV, Flavivirus) em grande parte do mundo (4, 7). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 3 No Brasil, são conhecidas mais de 40 espécies de arbovírus causadores de doença humana e algumas delas estão associadas a epidemias em áreas urbanas. Destacam-se: o vírus Dengue (DENV), vírus Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV) e Rocio (ROCV) os quais têm sido responsáveis por 95% dos casos de arboviroses humanas no Brasil (6). Portanto, a maioria das arboviroses se concentra nos gêneros Flavivirus, Alphavirus e Orthobunyavirus. 1.2 Família Flaviviridae – Gênero Flavivirus A família Flaviviridae compreende os gêneros Flavivirus, Pestivirus e Hepacivirus. Os Flavivirus incluem um grupo de importantes arbovírus, responsáveis por considerável morbidade e mortalidade, pois podem causar doença encefálica grave, febre hemorrágica, hepatite e doença febril em humanos (8). Os Flavivirus compartilham características comuns quanto à morfologia dos virions, determinantes antigênicos e a organização genômica. Apresentam formato esférico, o envoltório mede cerca de 40-60 nm de diâmetro e inclui o nucleocapsídeo contendo aproximadamente 11.000 nucleotídeos. O genoma é constituído por RNA de fita simples, linear, de polaridade positiva, composto por uma região terminal não codificante 5’ (7-metilguanosina); por uma estrutura única de leitura aberta (ORF) — que contém mais de 10.000 nucleotídeos — e por uma região terminal não codificante 3’ que não é poliadenilado — elemento distintivo desta família. A poliproteína codificada pela cadeia aberta de leitura, após clivagem, libera três proteínas estruturais: o capsídeo viral (C), a pré-membrana (prM) e o envelope (E) e sete proteínas não estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4A, NS4B, NS5; das quais a NS5 apresenta a sequência mais conservada entre as várias espécies do gênero, conforme demonstrado nas (Figuras 2 e 3) (9, 10). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 4 Figura 2: Ilustração da morfologia do virion da família Flavivirus e suas principais proteínas estruturais. Viriões maduros contêm duas proteínas da membrana do vírus codificado (M e E), enquanto que partículas virais imaturas contêm uma proteína precursora de membrana. GENOMA – ESTRUTURA ÚNICA DE LEITURA ABERTA (ORF) Figura 3: Esquema do genoma dos Flavivirus a partir de uma ORF. http://expasy.org/viralzone/all_by_species/43.html As funções das proteínas virais ainda não foram totalmente estabelecidas. Sabe-se, entretanto, que as proteínas estruturais são incorporadas ao virion durante a maturação e liberação viral e as proteínas não estruturais são responsáveis pela Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 5 replicação nas células infectadas. As suas principais atividades conhecidas estão descritas na Tabela 1 (9, 11). Tabela 1: Proteínas virais dos Flavivirus e sua função. Proteína Função E Proteína responsável pela ligação do vírus na célula, bem como pela fusão com a membrana endossomal, sendo o maior determinante antigênico viral. C Juntamente com o RNA viral, forma o nucleocapsídeo viral e está envolvida no transporte da proteína prM (precursora da proteína M) ao retículo endoplasmático para ser glicosilada. M Proteína formada a partir do processamento de sua precursora prM, sendo uma proteína de membrana de partículas virais maduras. NS 1 Participa, de forma essencial, na replicação do RNA viral, pois estudos de mutagêneses em NS1 causaram diminuição drástica na replicação do RNA e produção viral. NS 2 Participa na replicação viral e pode estar associada à inibição de interferon. NS2B forma um complexo estável com a proteína NS3, agindo como um co-fator para a atividade serino-protease. NS 3 Proteína multifuncional, com atividade de serino-protease na sua porção aminoterminal, é uma RNA-helicase RNA-dependente. Além disso, codifica uma atividade de RNA trifosfatase com o propósito de desfosforilar a região 5’ terminal do genoma do RNA, antes da adição da CAP. NS 4 A e B As proteínas NS4 A e B são hidrofóbicas, associadas à membrana e pouco conservadas entre os Flavivirus. Acredita-se que são componentes da replicase por formarem complexos com NS2B e NS3. NS 5 A proteína NS5 é a maior das proteínas virais e altamente conservada entre os Flavivirus. Apresenta atividade de RNA polimerase RNA-dependente na região 9 carboxi-terminal e metiltransferase em sua porção aminoterminal. *E (Proteína do Envelope), M (Proteína da membrana), C (Proteína do capsídeo), NS1 (Proteína não estrutural 1), NS2 (Proteína não estrutural 2), NS3 (Proteína não estrutural 3), NS 4 a/b (Proteína não estrutural 4a/b), NS5(Proteína não estrutural 5)(8). A evolução dos Flavivirus e sua epidemiologia são largamente determinadas pelas necessidades ecológicas de seus hospedeiros vertebrados e invertebrados (Figura 1). Estes podem ser agrupados por sequências de nucleotídeos, distribuição geográfica e associações ecológicas. Com base no relacionamento antigênico cruzado estes vírus podem ser divididos em oito subgrupos, utilizando testes Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 6 específicos de neutralização. Estes grupos antigênicos são: Tick-borne encefalitis (TBEV), Rio Bravo, o JEV, Tyulenity, Ntaya, Uganda S, DENV e Modoc. Os Flavivirus brasileiros ILHV, ROCV, YFV, CPCV e IGUV não foram agrupados, de acordo com esta metodologia, pois não apresentaram reação significativa com outros Flavivirus (12). Alguns estudos filogenéticos, a fim de estabelecer relações genéticas entre os Flavivirus brasileiros, com base em alinhamento de nucleotídeos e sequências de aminoácidos do gene NS5, mostraram que os Flavivirus brasileiros estão agrupados em três ramos principais: 1) ramo do dengue — subdividido nos tipos 1, 2, 3 e 4; 2) o complexo JEV, incluindo SLEV, Cacipacoré, Bussuquara, Rocio, Ilhéus, Iguape; 3) o ramo do vírus da Febre Amarela. Os vírus relacionados com o vírus da encefalite japonesa (JEV) estão normalmente associados com mosquitos Culex spp, comumente ornitófilos, e tendem a causar infecções, como Iguape e Cacipacoré, apesar de nunca ser descrito como causa de doença humana. Os vírus Bussuquara e lhéus não foram descritos como causa de encefalite em humanos, mas, com base na sua estreita relação filogenética com o vírus Rocio e SLEV, poderiam ser causadores potenciais de infecções do sistema nervoso central em humanos (10, 13-15). Os Flavivirus, mesmo tirando a participação dos vírus dengue, são importantes causadores de doença em todo mundo, destacando-se um complexo identificado filogeneticamente por vírus zoonóticos de aves, são transmitidos por mosquitos culicídeos e, ao infectarem o homem, podem causar doença febril aguda ou meningoencefalite (16). Sabe-se que dos 11 Flavivirus, Brasil, nove foram isolados na região Amazônica. 2, DENV-3 e DENV-4, são: vírus da encontrados no Estes, além dos DENV-1, DENV- Febre Amarela (YFV), Bussuquara (BSQV), Cacipacoré (CPCV), vírus Ilhéus e vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) (17, 18). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 7 1.2.1 Vírus da Febre Amarela (YFV) O vírus da Febre Amarela foi causador de uma das doenças mais temidas, antes do desenvolvimento de uma vacina. Hoje, ele ainda infecta cerca de 200.000 pessoas por ano; nas regiões tropicais da África — onde ocorrem cerca de 90% dos casos — e representa um perigo significativo para os viajantes não vacinados para essas áreas. Esses números são amplamente reconhecidos e podem estar subestimados, devido à dificuldade de vigilância epidemiológica nas áreas endêmicas. O vírus da Febre Amarela, o protótipo do gênero Flavivirus, é transmitido em um ciclo envolvendo macacos e mosquitos (Haemagogus spp nas Américas e Aedes spp na África), mas os seres humanos também podem servir como hospedeiros acidentais para a infecção do mosquito. Apesar de a febre amarela urbana ter sido extinta no Brasil desde 1948, os recentes aumentos na densidade e distribuição de um possível vetor urbano — o mosquito Aedes aegypti — bem como o aumento das viagens aéreas aumentam o risco de introdução e propagação da febre amarela (19, 20). Um método eficaz para prevenir a febre amarela é a vacinação. Mas mesmo com uma extensiva campanha de vacinação e o alerta do perigo de se visitar áreas de risco sem cobertura vacinal, a partir dos anos 80 tem se verificado a reemergência da febre amarela silvestre no Brasil. De 1990 a 2010 ocorreram 587 casos, com 259 óbitos (44,1%). A maioria dos casos ocorreu na região Norte com 178 casos (30,3%). Os outros episódios ocorreram em 16 estados do Brasil. O estado com maior número isolado de casos foi Minas Gerais, com 104 casos (17,7 %). No Amazonas foram notificados 43 casos (7,3%), com 31 óbitos (72,1%). O agravo foi mais frequente em pessoas acima de 15 anos, do sexo masculino, em geral agricultores, madeireiros, pescadores e ecoturistas (21). 1.2.2 Vírus Dengue (DENV) O dengue é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde (OMS), 50-100 milhões de Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 8 pessoas são infectadas anualmente, dentre as quais cerca de 550 mil necessitam de hospitalização e 20 mil morrem em consequência da doença. O vírus Dengue (DENV) é o agente causador da febre do dengue clássica (DF), febre hemorrágica do dengue (DHF) e da síndrome do choque do dengue (DSS). O dengue clássico e a febre hemorrágica do dengue são, portanto, as arboviroses mais difundidas no mundo e constituem causa importante de morbidade e mortalidade, resultando em epidemias de impacto em saúde pública (22). O mosquito do gênero Aedes é o vetor transmissor ao homem. O aumento da expansão desse vetor está relacionado, proporcionalmente, à expansão dos grandes centros urbanos do Novo Mundo. Resultante desse fato, estão as grandes epidemias (3). Os DENVs são um conjunto de quatro diferentes sorotipos do vírus (DENV 14). Estes são distintos entre si, mas relacionados antigenicamente. A imunidade protetora induzida pelo vírus é duradoura e específica para cada sorotipo. Desta maneira, indivíduos que vivem em áreas endêmicas podem desenvolver, após a infecção, até quatro episódios de doença causada por DENV durante a vida. Uma imunidade cruzada entre os diferentes tipos sorotipos pode ocorrer em até seis meses após uma infecção natural (20, 23). A descrição clínica da infecção pelo vírus dengue é frequentemente realizada de forma polarizada: o dengue não grave (DNG) e o dengue grave (DG), podendo evoluir para um quadro de choque (Figura 4). O quadro clinico pode variar desde uma infecção assintomática a um quadro inespecífico com sintomas gerais como febre, cefaleia, náuseas, vômitos, dor retrorbital, mialgias, artralgia e erupção cutânea. Alguns sintomas (sinais de alerta) podem prenunciar gravidade, mesmo que não haja alterações laboratoriais características, tais como vômitos muito frequentes, dor abdominal, tonturas com hipotensão postural e hemorragias. Condições preexistentes (hipertensão arterial, diabetes, asma e gravidez) podem favorecer a evolução com gravidade (24). A presença de sinais de alarme deve ser ativamente pesquisada em todos os pacientes com suspeita de dengue, pois indica precocemente a possibilidade de Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 9 evolução para a gravidade. Os principais sinais estão listados na Tabela 2. Deve também ser dada atenção a sinais de choque durante a realização do exame físico (25). Figura 4: Fluxograma das manifestações clínicas causadas pelo infecção pelo vírus Dengue. Tabela 2: Sinais de alarme e choque na infecção pelo vírus Dengue. Dor abdominal intensa e contínua; Vômitos persistentes; Hipotensão postural e/ou lipotímia; Hepatomegalia dolorosa; Sinais de alarme Hemorragias importantes (hematêmese e/ou melena); Sonolência e/ou irritabilidade; diminuição da diurese; Diminuição repentina da temperatura corpórea ou hipotermia; Aumento repentino do hematócrito; Queda abrupta de plaquetas; Desconforto respiratório. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 10 Hipotensão arterial; pressão arterial convergente (PA diferencial < 20 mmhg); Sinais de choque Extremidades frias, cianose; Pulso rápido e fino; Enchimento capilar lento (> 2 segundos). Segundo a World Health Organization (2009), a incidência de dengue tem aumentado dramaticamente em todo o mundo nas últimas décadas. Mais de 2,5 bilhões de pessoas - mais de 40% da população mundial - estão agora em risco de dengue. A OMS estima que pode ser de 50-100 milhões de infecções de dengue em todo o mundo a cada ano. A doença tornou-se endêmica em mais de cem países da na África, nas Américas, no Mediterrâneo Oriental, Sudeste da Ásia e do Pacífico Ocidental. Sudeste da Ásia e as regiões ocidentais do Pacífico são as mais seriamente afetadas (26). Casos nas Américas, Sudeste Asiático e Pacífico Ocidental ultrapassaram 1,2 milhões de casos em 2008 e mais de 2,2 milhões em 2010. Recentemente, o número de casos notificados permanecem aumentando. Em 2010, 1,6 milhão de casos de dengue foram notificados apenas nas Américas, dos quais 49.000 eram graves. A maior parte da região se tornou hiperendêmica com relato de cocirculação de vários sorotipos (27). No Brasil, o aumento na incidência de dengue é especialmente ligado à dispersão e a níveis de infecção pelo Aedes aegypti. O dengue foi diagnosticado no Brasil, pela primeira vez, em Boa Vista, estado de Roraima. A partir de sinais, sintomas e laboratorial, em 1982, numa epidemia causada pelos sorotipos 1 e 4 (28). Na epidemia de 1986, a circulação do sorotipo DENV-1 foi detectada inicialmente no estado do Rio de Janeiro e se espalhou para seis estados em 1990. Naquele ano, a circulação de um novo sorotipo, DENV-2, foi detectado também no estado do Rio de Janeiro. Dez anos depois, o DENV-3 foi detectado, pela primeira vez, no estado do Rio de Janeiro e, posteriormente, no estado de Roraima, em novembro de 2001 (29). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 11 O número de casos confirmados acumulados no Brasil de 1998 a 2009 ultrapassou 4,3 milhões. No estado do Amazonas, os casos de dengue só começaram a ser notificados a partir de 1998 e até 2009 foram confirmados 66,3 mil casos. Em Manaus, no primeiro semestre de 2011, foram notificados 51.831 mil casos e 13 óbitos (30-32). Em relação ao dengue hemorrágico, a situação é de extrema preocupação devido ao aumento impressionante no número de casos nos últimos anos. O estabelecimento dos quatro sorotipos, nas Américas, aumenta a chance de formas graves da doença, bem como o aumento da incidência em crianças e adultos jovens (33, 34). De 1998 a 2000, foram notificados cerca de 26.000 casos de dengue no estado do Amazonas. No ano de 2001, durante uma grande epidemia, mais de 19.000 casos foram notificados. Naquele ano, a Gerência de Virologia da FMT-HVD isolou os DENV-1 e DENV-2, dentre estes, houve casos de febre hemorrágica (35). Em 2003 foi isolado, pela primeira vez no Amazonas, o DENV-3 de um paciente procedente da Bahia. Entretanto, na ocasião, muitos pacientes com sintomatologia sugestiva de dengue, mostraram-se negativos para este vírus nos exames específicos, sugerindo a ocorrência de infecções por outros arbovírus, dentre os quais se ressaltam os Flavivirus (36). O DENV-4 foi identificado, pela primeira vez em Manaus, durante um estudo realizado na FMT-HVD, no ano de 2008 (33). Mais recentemente, teve-se o conhecimento de epidemias silenciosas de febre por Oropouche (37, 38) e febre por Mayaro (39), demonstrando a importância do diagnóstico laboratorial sistemático dessas infecções entre os pacientes com síndrome febril aguda. Embora reconhecendo que o dengue é hoje uma das mais importantes flaviviroses, existem outros Flavivirus (vírus Bussuquara, Cacipacoré, Ilhéus e vírus da encefalite de Saint Louis) negligenciados. Apresentam quadro clínico bastante inespecífico, o qual pode ser compartilhado com inúmeras doenças infecciosas e não infecciosas, e tem sido pouco discutido na literatura médica (2). Alguns inquéritos soro epidemiológicos realizados demonstraram que mais de 30% Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 12 dos pacientes com suspeita clínica de síndrome febril aguda permaneceram sem diagnóstico (36, 40-44). Somente o monitoramento dos agravos emergentes causadores de doença febril aguda indiferenciada pode proporcionar as informações necessárias para a adequada ação de política pública e de vigilância em saúde para a região. 1.2.3 Vírus Bussuquara (BSQV) O BSQV foi isolado de mosquitos e de animais silvestres da região Amazônica, principalmente em roedores, como Proechimys spp. e mosquitos do gênero Culex. Isolado originalmente no estado do Pará, Brasil, em 1956, e pela primeira vez em humanos em 1971 (45). Um estudo realizado, em 1998, com jovens militares que viviam em áreas de risco, teve o objetivo de investigar a soro prevalência para Flavivirus. Foram analisadas 189 amostras de soros humanos provenientes de três localidades da Província de Formosa, fronteira com o Brasil e Paraguai, e em uma amostra foi confirmada ser positiva para Bussuquara pelo teste de neutralização (46). O vírus não tem sido relacionado a surtos, mas foi causa de doença febril aguda, produzindo: anorexia, dores articulares, calafrios, sudorese profusa e cefaleia relatados pelo paciente. O quadro perdurou por cerca de quatro dias (17) 1.2.4 Vírus Cacipacoré (CPQV) O vírus Cacipacoré foi isolado pela primeira vez em 1977, em pássaros na região Amazônica, mas ainda é desconhecida a associação de doença febril aguda relacionada ao vírus CPCV (17). Existem evidências de este vírus ter sido isolado em um paciente, morador do município de Theobroma, estado de Rondônia, com quadro clínico suspeito de leptospirose, que foi confirmado por sorologia (47, 48), No estado do Amazonas esse vírus já foi isolado de mosquito Aedes aegyptis (49). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 13 1.2.5 Vírus Ilhéus (ILHV) O vírus Ihéus foi isolado de Aedes sp. e Psorophora sp, capturados em 1944, na cidade de Ilhéus, no litoral leste do Brasil (50). ILHV ocorre em todo o Brasil, tendo diferentes artrópodes como vetores, porém o mosquito Psorophora ferox é provavelmente o mais importante. Aves silvestres têm sido implicadas como prováveis hospedeiros vertebrados do vírus, contudo foram também encontrados anticorpos em outros vertebrados, como roedores, marsupiais, morcegos e macacos, ou se isolou deles o vírus (17). A doença em humanos é encontrada em casos esporádicos, associados a exposições à floresta e o quadro clínico varia desde infecções assintomáticas até encefalite. A doença febril, responsável pela maioria dos casos reconhecidos, inicia subitamente com febre moderada ou elevada, cefaleia, calafrios, fotofobia, artralgia, mialgia e astenia, evoluindo em média por três a cinco dias, com recuperação completa e sem sequelas (51). Após o primeiro isolamento viral, inúmeros outros isolamentos de pacientes febris, de mosquitos e de uma grande variedade de animais, particularmente aves silvestres e morcegos. Esses dados foram obtidos no Equador, no Peru, na Guiana Francesa, na Colômbia, no Panamá, em Trinidad e no Brasil (44, 52-60). 1.2.6 Vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) O vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) foi inicialmente descrito nos Estados Unidos em St. Louis, Missouri, onde foi responsável por uma epidemia entre julho e outubro de 1933. Identificaram-se 1.095 casos com 201 óbitos. É amplamente distribuído nos Estados Unidos e nas Américas Central e do Sul, mantidos em ciclos de transmissão envolvendo mosquitos do gênero Culex spp e vários pássaros (61). Análises filogenéticas sugerem que o SLE foi introduzido na Argentina e transportados da África, a bordo de navios e se dispersou gradualmente para o norte da América (62). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 14 A doença é transmitida acidentalmente ao homem por mosquitos infectados, que normalmente se alimentam de sangue de pássaros. O início é caracterizado por sintomas semelhantes à gripe, podendo evoluir para meningites agudas ou subagudas com sinais neurológicos focais. Sintomas urinários podem ocorrer em até 25% dos pacientes. Comorbidades pré existentes como hipertensão, arteriosclerose, diabetes e alcoolismo crônico podem predispor a infecções graves ou fatais. O período de convalescença pode ser prolongado e é caracterizado por astenia, irritabilidade, tremores, insônia, depressão, perda de memória, dor de cabeça, sintomas esses com duração de até três anos (15). No Brasil foi isolado pela primeira vez no norte do país, em 1964, a partir de um pool de mosquitos Sabethes belisarioi coletados ao longo da rodovia BelémBrasília (63). Apesar da ampla distribuição de SLEV na região amazônica, verificada por evidência sorológica em aves e humanos, até o final de 2000, não existiam relatos de epidemia de encefalite devido ao vírus SLEV na região (17). Em 2005, foi documentado um grande surto de encefalite de St. Louis em Córdoba, Argentina (64). No mesmo ano, foi isolado o SLEV de um paciente febril suspeito de dengue, em São Pedro, Estado de São Paulo (65). No entanto, um surto de SLEV ocorreu concomitantemente com um grande surto de DENV-3 em São José do Rio Preto, Estado de São Paulo. Durante esta manifestação, alguns pacientes apresentaram manifestações hemorrágicas, identificadas por prova do laço positiva, petéquias e gengivorragia. Um paciente apresentou co-infecção de DENV-3 e SLEV (66, 67). Esta descoberta é também um alerta aos profissionais de saúde, devido à necessidade de maior investigação clínica e epidemiológica de doenças febris como no caso relatado. Infecções por SLEV podem ser reconhecidas ou confundidas com outras causadas por outros arbovírus, como o dengue. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 15 1.3 Família Togaviridae – Gênero Alphavirus A família Togaviridae compreende os gêneros Alphavirus e Rubivirus. O vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) é um Alphavirus e um importante patógeno humano. É também um sistema modelo para o estudo da estrutura, replicação e patogênese dos vírus deste gênero (4). Estruturalmente, são esféricos, de 60 a 70 nm de diâmetro, com um nucleocapsídeo icosaédrico envolvido em um envelope lipoproteico. O RNA é linear, de fita simples, com aproximadamente 4x106 daltons e poliadenilado. O genoma tem aproximadamente 11,7 Kb e comporta-se como RNA mensageiro. O envoltório lipoprotéico contém bicamada lipídica de origem celular, que é derivada da membrana plasmática da célula hospedeira. A proteína do capsídeo é organizada em hexons e pentons, que complementa a organização das glicoproteínas (68). Nos virions são encontrados três antígenos distintos: E1 e E2 (Glicoproteínas) e o C (Nucleoproteína), conforme demonstrado na (Figura 5). Figura 5: Ilustração da morfologia do virion da família Alphavirus e suas principais proteínas estruturais. (a) A poliproteína codificada pela cadeia aberta de leitura, após clivagem, libera três proteínas estruturas (C, pE2 e E1) e quatro não estruturais (nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4). (b-c) Envoltório, esférico, de cerca de 60-70 nm de diâmetro, onde estão representadas as glicoproteínas E1 e E2, o Nucleocapsídeo representado pela proteína N e a bicamada lipídica (4). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 16 O gênero Alphavirus constitui um grupo com 28 espécies de vírus, classificados antigenicamente em 4 complexos. No geral, são responsáveis por causar dois padrões distintos de doença: encefalite, com ou sem desmielinização, e doença febril, com artralgia persistente (69). Cada Alphavirus é responsável por apenas um destes tipos de doença, mas as síndromes clínicas não foram separadas geograficamente. Por exemplo, os alphavirus presentes na América do Sul são os vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus da encefalite equina do leste (EEEV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), Mayaro (MAYV), Una (UNAV), Pixuna (PIXV), Aura (AURAV), e Trocará (TROCV). Os três primeiros, como indicado por seus nomes, causam encefalite; MAYV e UNAV causam doença febril, que cursa com quadro de artrite prolongada e severa; ao passo que PIXV, AURAV e TROCV não são conhecidos por causar doença humana (70). O vírus Mayaro (MAYV) é um membro da família Togaviridae e gênero Alphavirus. Estudos moleculares recentes têm reconhecido duas linhagens de MAYV: genótipos D e L (71). Tem sido associado a uma doença semelhante ao dengue, com exantema, febre moderada a grave, com duração de 3-5 dias e artralgia. A artralgia permanece por várias semanas e afeta principalmente os tornozelos, pulsos e dedos, mas também pode afetar as articulações maiores. O MAYV é enzoótico para América do Sul e endêmico em áreas rurais. É mantido em ciclo silvestre envolvendo vertebrados, incluindo primatas não humanos e mosquitos Haemagogus janthinomys. Aves podem atuar como hospedeiros secundários, sendo importantes para a disseminação do vírus (68). A maioria das infecções por MAYV é esporádica e ocorre em pessoas com história de recentes atividades dentro ou próximo a florestas. Vários pequenos surtos têm sido relatados na região amazônica, normalmente limitados a áreas rurais próximas ou no interior de florestas, onde o vetor é encontrado. Na cidade de São Paulo, foi relatada a ocorrência de três casos de infecção por MAYV, em pacientes infectados enquanto pescavam em Camapuã, MS (72). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 17 Em fevereiro de 2008, um surto de febre por Mayaro ocorreu em um assentamento no município de Santa Bárbara, norte do Brasil. Os pacientes apresentavam erupção cutânea, febre e grave artralgia com duração de até sete dias. Imunoglobulina M contra MAYV foi detectada por ELISA em 36 pessoas. O vírus foi isolado, sequenciado e caracterizado como genótipo D em três pacientes (73). Em outro estudo realizado com pacientes atendidos na FMT-HVD, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2008, foram testados anticorpos IgM para MAYV e detectados em 33 amostras de 631 pacientes (5,2%). Os pacientes com IgM positiva apresentaram doença febril aguda com mais de cinco dias (39). Embora as taxas de anticorpos sejam encontradas em algumas comunidades rurais da bacia amazônica do Brasil, é difícil isolar MAYV, devido ao período relativamente curto de viremia. O MAYV pode ser transmitido por mosquitos do gênero Aedes e, assim, poderia se deslocar para cidades, em aves com viremia ou viajantes humanos, e se adaptar a um novo ciclo que poderia envolver o homem como reservatório. Neste contexto, os viajantes estão em risco de aquisição e importação desta doença, como ocorrido com um cidadão francês que apresentou doença reumática grave depois de visitar a Amazônia brasileira e um casal de holandeses que apresentou artralgia persistente, febre e erupção cutânea temporária após estadia no Suriname. Todos foram diagnosticados com infecção pelo vírus Mayaro (74, 75). Em casos de surtos de doença febril aguda por MAYV, SLEV, CHIKV e OROV, o diagnóstico laboratorial de casos suspeitos é fundamental, pois esses vírus não são facilmente diferenciados de outras doenças virais, como o dengue, e pode permanecer desconhecida a sua ocorrência (2). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 18 1.4 Família Bunyaviridae – Gênero Orthobunyavirus Os vírus deste gênero medem de 80 a 120 nm de diâmetro, apresentam capsídeo de simetria helicoidal, circundado por um envoltório lipoproteico com espículas superficiais. O genoma viral é constituído por três segmentos de RNA de fita simples (Small-S, Medium-M e Large-L), lineares e de simetria helicoidal, os quais codificam, respectivamente, proteínas estruturais do nucleocapsídeo (N), glicoproteínas do envelope (G1 e G2) e a proteína (L), além das proteínas não estruturais NSs e NSm (Figuras 6 e 7) (76). Figura 6: Ilustração da morfologia do virion da Família Bunyaviridae e suas principais proteínas estruturais. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/e/e7/BunyaviridaeSchema.jpg Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 19 Figura 7: Ilustração do genoma de virion da família Bunyaviridae. O Segmento L codifica a proteína L, uma RNA polimerase dependente de RNA; o segmento M codifica duas glicoproteínas de superfície G1, G2 e NSm que formam as espículas do envelope; e o segmento S codifica N e Ns do nucleocapsídeo.(77) O Orthobunyavirus de maior importância no Brasil é o vírus Oropouche (OROV), responsável pela febre por oropouche (78). Sorologicamente está incluído no grupo Simbu da classificação de CasaIs (79) e foi isolado pela primeira vez, em 1955, de amostra de um trabalhador florestal febril em Trinidad (80). Este vírus é mantido na natureza pelos ciclos silvestres e urbanos. No ciclo silvestre, preguiças, macacos e aves são os hospedeiros vertebrados e o Aedes serratus, o Culex quinquefasciatus e o Culicoides paraensis (maruim) vetores. No ciclo urbano, o vírus é transmitido de pessoa a pessoa, por meio da picada do Culicoides paraensis, amplamente disseminado em áreas tropicais e subtropicais das Américas (81). A febre por Oropouche é uma doença febril aguda, semelhante ao dengue, apresentando sintomatologia com: cefaleia, mialgia, artralgia, podendo até mesmo ser acompanhada de meningite asséptica. Alguns dias após o término do episódio febril inicial é comum se observar a recorrência dos sintomas, porém, em geral, com menor intensidade. Alguns pacientes podem exibir um quadro grave caracterizado por meningite linfoplasmocitária. A recuperação dos enfermos é completa, sem sequelas aparentes, mesmo nos casos mais graves (78). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 20 Dentre os arbovírus encontrados na Amazônia, após o vírus Dengue, o vírus Oropouche é o que tem sido isolado com mais frequência a partir de casos humanos. Acredita-se que cerca de 500.000 casos de infecção por OROV tenham ocorrido no Brasil nos últimos 48 anos. Em 2003 e 2004, vários casos de febre por Oropouche foram detectados em Parauapebas e Porto de Moz, no Estado do Pará (82). Ainda no Pará, após 26 anos da última epidemia de febre por Oropouche, foi realizada uma pesquisa sorológica e um estudo prospectivo de casos agudos febris em Magalhães Barata e Maracanã. Estes estudos mostraram uma prevalência de anticorpos para OROV de 76,9% e 73,3%, respectivamente; os menores de 15 anos foram os mais afetados; foi identificado o genótipo II, nos dois municípios (83). No Amazonas, em 2008, houve relato de um surto na região de Manaus, onde 20,3% dos pacientes com síndrome febril aguda, negativos para dengue, apresentavam anticorpos IgM anti-OROV (37), e em pacientes com quadro clínico de meningoencefalite (38). Nos últimos anos, a área de circulação e o potencial de epidemia por OROV têm aumentado. Em 2003, foi isolado em um pequeno primata — um sagui (Callithrix) — no estado de Minas Gerais, no sudeste do Brasil, longe da Amazônia (84). Considerando que vetores de OROV (Culicoides paraensis) ocorrem em áreas de baixa altitude nas Américas, a destruição ambiental, bem como as mudanças climáticas podem resultar em surtos nas grandes cidades do Brasil (2), além do fato de a circulação do OROV, provavelmente, ser esporádica e clinicamente silenciosa e, quando não associadas a surtos, é mais provável que sejam negligenciadas pelos serviços de vigilância epidemiológica (85). 1.5 Diagnóstico laboratorial das arboviroses O diagnóstico etiológico das arboviroses, tanto em amostras humanas como em animais, é realizado a partir de técnicas diretas e indiretas, que são aplicadas de acordo com o tempo de evolução do quadro clínico. Diagnóstico convencional é baseado em testes sorológicos de triagem para detectar a presença de anticorpos contra o vírus específico no soro do paciente. Muitas vezes, exige a comprovação de Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 21 um aumento na concentração de anticorpos a partir de uma amostra de sangue de fase aguda e uma amostra da fase de convalescência (chamada de amostras pareadas) (86). Em amostras do início da sintomatologia, em que é provável que o vírus ainda esteja em circulação, são utilizadas as técnicas de isolamento em cultura de células ou animais de laboratório, segue-se a detecção de antígeno através de métodos indiretos (imunofluorescência, ELISA, etc.) ou a detecção do genoma viral por técnicas moleculares (RT-PCR, NASBA, PCR em tempo real) (87, 88), (Figura 8). A partir de sete dias do início dos sintomas, é possível detectar a presença de anticorpos IgM (por ELISA, imunofluorescência ou inibição da hemaglutinação) que, dependendo do agente, apresentam diferentes períodos de persistência. Anticorpos da classe IgG podem ser detectados, geralmente, alguns dias depois que o IgM foi detectado (ELISA, neutralização em cultura de células, inibição da hemaglutinação, imunofluorescência), e estes anticorpos podem permanecer por longos períodos de tempo. Para as infecções recentes são necessários estudos sorológicos através da detecção de IgM e ausência de IgG na amostra (89). Entre as diferentes famílias virais reações cruzadas sorológicos devem ser ponderadas na interpretação dos resultados laboratoriais. Essas relações são reforçadas nas infecções secundárias ou sequencial, por arbovírus da mesma família, que geram uma resposta de memória imunológica com altos títulos de anticorpos. Já a imuno-histoquímica e os estudos histopatológicos são frequentemente úteis para o estudo de casos fatais, principalmente naqueles casos nos quais os resultados obtidos em outros testes foram pouco conclusivos (90). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 22 Figura 8: Diagnóstico laboratorial das arboviroses. 1.5.1 Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento nucleotídico Dada a incidência de doenças causadas por estes vírus e seu comportamento emergente, testes de laboratório se tornaram cada vez mais importantes. No entanto, o diagnóstico laboratorial da infecção pelos arbovirus continua a ser laborioso, pois o isolamento desses vírus é demorado e, para muitos deles, requer um laboratório com nível três de biossegurança. Os diferentes testes sorológicos de neutralização, com frequência, podem mostrar uma reatividade cruzada entre espécies. Por todas estas razões, o desenvolvimento de testes moleculares para esses agentes, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), tem atraído uma série de esforços e atenção (91). A técnica de PCR surgiu nos anos 80 como um método sensível, simples, rápido e específico, possibilitando a identificação de vírus, a partir de fluídos de Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 23 isolamento ou de materiais biológicos de pacientes. Consiste em uma reação de síntese de regiões específicas de DNA em ciclos repetidos. A cada ciclo, o número de fragmentos são duplicados e, após trinta ciclos, uma molécula é amplificada em mais de um bilhão de vezes. O método diagnóstico de infecções por arbovírus (nos vírus RNA) por meio da PCR deve ser precedido de transcrição reversa. Nesse caso, é necessário realizar uma etapa prévia à PCR: a síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA), tendo a molécula de RNA como molde — técnica de grande utilidade na detecção genômica diagnóstica de vários vírus RNA (5, 88, 90). A sensibilidade da metodologia do RT-PCR permite a detecção e identificação dos arbovírus tanto em artrópodes vetores, quanto em amostras clínicas, nos quais existem dificuldades de isolamento. Também é importante quando há necessidade de um diagnóstico rápido para o tratamento clínico e implicações no controle de epidemias ou de vetores, bem como a classificação taxonômica dos vírus que apresentem reações cruzadas nos testes sorológicos (5, 10, 92). A técnica de sequenciamento de DNA consiste na síntese in vitro de uma fita de DNA na presença de quatro diferentes nucleotídeos trisfosfatados terminadores de cadeia, os didesoxirribonucleosídeos trifosfatados: ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP, tendo como DNA-molde aquele cuja sequência deseja-se identificar. O sequenciamento nucleotídico é uma das ferramentas mais importantes no que se refere à caracterização de genes. A partir de produtos amplificados pela RT-PCR, permite analisar comparativamente as sequências obtidas com as de vários arbovírus — previamente conhecidos — ou até mesmo caracterizar um gene até então não conhecido (13, 14, 93, 94). Um novo método de sequenciamento de DNA, usualmente chamado de Pyrosequencing, foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences. Por meio deste método, pode-se sequenciar genomas de organismos diversos de uma maneira muito mais rápida e barata. No Pyrosequencing, a síntese de DNA ocorre através de um complexo de reações o qual inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 24 durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto, quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA, através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica, resultando na produção de ATP. Este leva à conversão enzimática da luciferina com emissão de fótons. À medida que os componentes da reação diminuem, um novo ciclo de reagentes é introduzido e então a incorporação de nucleotídeos específicos é avaliada de maneira sequencial (95). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 25 2. JUSTIFICATIVA Uma limitação da realização de vigilância das arboviroses é o caráter genérico de apresentação da doença. Enquanto a doença grave pode resultar em manifestações hemorrágicas ou doença neurológica, as arboviroses geralmente resultam em doença febril leve a moderada, muitas vezes assintomática. Particularmente no início de progressão da doença, os pacientes apresentam doença febril indiferenciada tornando o diagnóstico clínico pouco confiável. Em função da falta de apresentação clínica distinta e da diversidade dos agentes etiológicos, o suporte de laboratório tornou-se um componente crítico de programas eficazes de vigilância. Nesse aspecto, o emprego de métodos de biologia molecular, como a reação em cadeia de polimerase precedida de transcrição reversa do RNA viral (RT-PCR), permite o estabelecimento de um trabalho de rotina prático, rápido e seguro para o diagnóstico de arboviroses. Entretanto, são poucos os estudos utilizando tais métodos no diagnóstico de arboviroses brasileiras. Apesar da relevância para a saúde pública, pouco se sabe sobre a distribuição geográfica, o impacto relativo e os fatores de risco associados à infecção por arbovírus em muitas regiões do mundo. Diante das dificuldades e da necessidade de se diagnosticar precisamente e com rapidez as doenças causadas por vírus emergentes, na Amazônia Ocidental Brasileira, o presente trabalho pretende contribuir para a detecção de algumas espécies de arbovírus brasileiros, pertencente às famílias Flaviviridae, Bunyaviridae e Togaviridae utilizando-se métodos de biologia molecular. Somente o monitoramento dos agravos endêmicos e emergentes causadores de doença febril aguda indiferenciada podem proporcionar as informações necessárias para adequada ação de política pública e de vigilância em saúde para a região. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 26 3. OBJETIVOS 3.1 Geral Vigilância laboratorial da circulação de arbovírus em humanos, durante epidemia de dengue, em uma unidade terciária de saúde da Amazônia Ocidental Brasileira, durante epidemia de dengue, em 2011, na cidade de Manaus/AM. 3.2 Específicos • Detectar vírus da família Flaviviridae (DENV 1-4, BSQV, CPCV, ILHV e SLEV), Togaviridae (MAYV) e Bunyaviridae (OROV) pela reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa do RNA (RT-PCR); • Genotipar os arbovírus isolados; • Analisar as características clínicas, hematológicas e epidemiológicas (sexo, idade, ocupação e localidade) de cada agravo em estudo; • Detectar a ocorrência de co-infecções entre os arbovírus pesquisados; Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 27 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Modelo de Estudo Trata-se de um estudo descritivo retrospectivo, dos casos de doença febril aguda, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), durante surto de dengue ocorrido no período de 01 de Janeiro a 31 de Maio de 2011, na cidade de Manaus. 4.2 Universo de Estudo 4.2.1 Local de Estudo O estudo foi realizado na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, localizada em Manaus, capital do estado do Amazonas. A FMT-HVD é uma instituição pioneira na implantação da vigilância de síndromes febris agudas e, através da consolidação de um Ambulatório de Doença Febril Aguda, oferece um serviço de atendimento a todo paciente com quadro de doença febril aguda indiferenciada. 4.2.2 Definição de Caso Paciente com idade acima de um ano apresentando doença febril aguda com duração de até sete dias, acompanhada de dois ou mais dos seguintes sintomas inespecíficos: cefaleia, mialgia, artralgia, dor retro-orbitária, fotofobia, exantema, astenia, anorexia e mal-estar geral. 4.2.3 População de Estudo Para fins deste estudo foram consideradas exclusivamente as amostra de pacientes que apresentaram quadro clínico característico de doença febril aguda, independente de idade e sexo, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 28 Heitor Vieira Dourado, durante o surto de dengue na cidade de Manaus, cujo material biológico (soro) foi encaminhado à Gerência de Virologia para a elucidação diagnóstica da doença febril. 4.2.4 Participantes No período de 01 de janeiro a 31 de maio de 2011 foram incluídos na pesquisa 677 pacientes com suspeita clínica de dengue. Aqueles que atenderam a definição de caso foram convidados a participar da pesquisa e a assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), Anexo 8.4. 4.3 Procedimentos As amostras utilizadas na pesquisa foram selecionadas a partir da demanda espontânea da Gerência de Virologia da FMT-HVD. Essas amostras foram sistematicamente aliquotadas em três tubos estéreis de 1,0 mL, sendo devidamente identificados e em seguida conservados a -80ºC para análise sorológica e/ou molecular. Quando pertinente, foi feita uma revisão do prontuário informatizado dos pacientes. Os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais dos pacientes incluídos na pesquisa foram registrados em uma ficha clínica padrão para o estudo (Anexo 8.2). 4.3.1 Doenças em estudo e algoritmos de investigação e diagnóstico Os agravos avaliados nessa pesquisa foram as doenças causadas pelos arbovírus emergentes na região, listados na Tabela 3, seguindo o algoritmo de investigação e diagnóstico (Figura 9). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 29 Tabela 3: Relação de arbovírus brasileiros em estudo. FAMÍLIA Togaviridae GÊNERO Alphavirus VÍRUS (Abreviação) Mayaro (MAYV) Dengue (DENV) Flaviviridae Flavivirus Bussuquara (BSQV) Cacipacoré (CPCV) Ilhéus (ILHV) St. Luis Encephalitis (SLEV) Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV) Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 30 Figura 9: Fluxograma da metodologia aplicada às amostras incluídas no estudo. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 31 4.3.2 Métodos de diagnóstico laboratorial As atividades de investigação laboratorial em todas as fases do estudo aconteceram na Gerência de Virologia da FMT-HVD, com o apoio do Centro de Pesquisa Leônidas & Maria Deane (FIOCRUZ Amazônia) e Universidade Nilton Lins. Os arbovírus utilizados neste estudo, como controles positivos, estão listados na Tabela 4 e foram, gentilmente, cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Tadeu Morais Figueiredo, do Centro de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Tabela 4: Relação das estirpes de arbovírus brasileiros que serão utilizadas no estudo como controle positivo. FAMÍLIA Togaviridae GÊNERO Alphavirus VÍRUS (Abreviação) Mayaro (MAYV) ESTIRPES (Abreviação) BeAr 20290 DENV 1 Mochizuki Dengue (DENV) DENV 2 SpH 125367 DENV 3 RP41 Flaviviridae Bunyaviridae Flavivirus DENV 4 Boa Vista Bussuquara (BSQV) BeAn 4073 Ilhéus (ILHV) BeH 7445 St. Luis Encephalitis (SLEV) BeH 355964 Orthobunyavirus Oropouche (OROV) Be An 19991 Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 32 4.3.2.1 Protocolo de extração do RNA O RNA viral foi extraído a partir de 140 µl de amostra clínica (soro), utilizando o Qiamp Viral RNA kit (QIAGEN Inc., USA), de acordo com as recomendações do fabricante. O volume final obtido será de 40 µl. 4.3.2.2 Síntese de DNA complementar (cDNA) O método diagnóstico de infecções por arbovírus (nos vírus RNA), através da PCR, deve ser precedido de transcrição reversa (RT-PCR). Nesse caso, é necessário realizar uma etapa prévia à PCR, que é a síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA), tendo a molécula de RNA como molde. Assim como para qualquer síntese de DNA, nessa reação também é indispensável a utilização de um primer que anele com o RNA. Para a síntese de cDNA podem ser utilizados primers genéricos ou específicos. Em nosso estudo, utilizamos os primers genéricos tipo aleatórios (random primers). Após a extração do RNA pelo método de Qiamp Viral RNA kit, foi utilizado o RNA viral para síntese do cDNA, pela reação da transcrição reversa, composta de: • 5µl de RNA, ao qual foram adicionados 1,0µl de randon primers 2,1µg/ml (Promega, Madison WI, USA); • Segui-se incubação a 70ºC, por 5 minutos; • Resfriou-se a solução em gelo por aproximadamente 2 minutos; • Adiciona-se a solução (RNA/randon primers) os seguintes reagentes; Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 33 Componentes Vol. (µl) 1 Reação H2O 5,75 Solução tampão 2x 12,5 Enzima Transcriptase Reversa 5U/µl 0,5 Rnasin 40U/ µl (promega,USA) 0,25 Volume total 25 Após a adição dos reagentes ao RNA/randon primers, o material foi incubado no termociclador a 45ºC por 60 minutos. O cDNA obtido foi armazenado a -20 ºC. 4.3.2.3 Primers Os primers usados para detecção dos Alphavirus se ligam a regiões do gene da proteína nsP1, enquanto que os usados para detecção dos Flavivirus se ligam a regiões do gene da proteína NS5 e CprM, de acordo com o primer específico utilizado. Para detecção do OROV foram usados primers que se ligam no segmento S/Nucleoproteína do genoma viral. Estes primers estão descritos na Tabela 5. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 34 Tabela 5: Relação de primers utilizados no estudo. Primers Sequência (5'-3') Amplicon (pb) Referência Primers - Semi-nested-PCR para diagnóstico de Vírus Mayaro M2W (+) YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW cM3W(-) ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC 434 270 nMay (+) GGAAGTTGGCCAAGGC mFU1(+) Primers –Real-time PCR para diagnóstico de Flavivirus TACAACATGATGGGAAAGCGAGAGAAAAA 245 GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC CFD2 (-) FG 2(-) Primers –Multiplex PCR para diagnóstico de Flavivirus TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT 958 GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA nDENV1(-) CGTTTTGCTCTTGTGTGCGC 472b nDENV2(-) GAACCAGTTTGTTTDRTTTCATAGCTGCC 316b nDENV3(-) TTCCTCGTCCTCAACAGCAGCTCTCGCACT 659b FG 1(+) (5) a (93) (96) b nDENV4(-) GCAATCGCTGAAGCCTTCTCCC 222 nBSQ (-) AAG TGA CAC CTG TTC AGG GTA 388b nILH (-) TCC ACC GCT GAT CTG AGC CCG TGA 474b nSLE (-) ATT CTT CTC TCA ATC TCC GT 232b D1 D2 Primers Semi-nested-PCR para diagnóstico de Vírus Dengue TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG 511 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC TS1 CGTCTCAGTGATCCGGGGG 482c TS2 CGCCACAAGGGCCATGAACAG 119c TS3 TAACATCATCATGAGACAGAGC 290c TS4 CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA 392c (97) Primers – Nested-PCR para diagnóstico de Vírus Oropouche BUN-S (+) AGTAGTGTGCTCCAC BUN-C (-) AGTAGTATACTCCAC BS-S(+) GTGGGGTCCAATTTGC 700/ 1.100 (90) 300 BS-C(-) TGAACCCTATGCATCT a Com primer cM3W(-); b Com primer FG1(+); c Com primer D1(+); pb: pares de bases; (+) sensu; (-) anti-sensu Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 35 4.3.2.4 Protocolo de PCR para identificação de Alphavirus Para a detecção de agentes virais do gênero Alphavirus e o vírus Mayaro, será utilizada a estratégia desenvolvida por Bronzoni et al. (2005), com uma reação de PCR gênero-específico, seguida de uma Semi-nested-PCR espécie-específica, produzindo amplicons de 434 e 270 pb (96), de acordo com o protocolo. PCR Gênero-específico Alphavirus Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 12,1 Solução tampão 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 2 4 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM M2W 10 pmol 1 0,4 pmol cM3W 10 pmol 1 0,4 pmol 0,4 2 Taq Platinum 5U/ µl cDna 5 Total 25 U O protocolo da reação de PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 45 seg., hibridização a 45°C durante 45 seg., extensão a 72°C durante 45 seg. e extensão final a 72° C durante 7 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 36 Semi -nested-PCR -Vírus Mayaro Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 17,1 Solução tampão 10 x 2,5 1,0 X MgCl2 50 mM 1 2,0 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM cM3W 10 pmol 1 0,4 pmol nMay 10 pmol 1 4 pmol 0,4 2 U Taq Platinum 5U/ µl Amplicon 1 Total 25 O protocolo da reação de Nested-PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 28 ciclos de desnaturação a 94°C durante 45 seg., hibridização a 45°C durante 45 seg., extensão a 72°C durante 45 seg. e extensão final a 72°C durante 7 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 37 4.3.2.5 Protocolo de PCR para identificação de Flavivirus Etapa 1. As 677 amostras foram testadas para vírus DENV no protocolo desenvolvido por Lanciotti et al (1992). A primeira reação de PCR produziu cDNA de uma parte do genoma viral (CprM) de aproximadamente 511 pb (97). Seguida de Nested-PCR com primers específicos para determinação de cada sorotipo de dengue, de acordo com o protocolo seguinte: Componentes 1º PCR - Vírus Dengue Vol.(µl) 1 Reação Concentração Final H2O 15 Buffer 10x 2,5 1 MgCl2 50 mM 0,75 1,5 mM dNTP 10 mM 0,5 0,2 mM D1 10 nM (+) 0,5 0,3 mM D2 10 nM (-) 0,5 0,3 mM Taq Platinum 5U/ µl 0,25 1,25 U cDna 5 total 25 X O protocolo da reação de PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 2 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 38 Componentes Nested-PCR Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 27,0 Solução tampão 10x 5,0 1 MgCl2 50 mM 1,5 1,5 mM dNTP 10 mM 1,0 0,2 mM D1 10 nM 1,0 0,2 mM TS1 10 nM 1,0 0,2 mM TS2 10 nM 1,0 0,2 mM TS3 10 nM 1,0 0,2 mM D-4 10 nM 1,0 0,2 mM Taq Platinum 500 U 0,5 2,5 U amplicon Dil. 1:100 10,0 Total 50,0 X O protocolo da reação de Nested-PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min, seguido por 28 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 2 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 39 Etapa 2. Para a detecção de agentes virais do gênero Flavivirus, não Dengue, foi utilizada inicialmente a estratégia de triagem das amostras desenvolvida por Chao et al (2007): uma reação real-time transcriptase reverse PCR (RT-PCR) para rápida detecção de Flavivirus de interesse médico (93). Para a reação de real-time PCR utilizamos os kit de reagentes Maxima SYBR® GREEN/ROX Fermentas, de acordo com protocolo seguinte: Real-time-PCR - Gênero-específico Flavivirus Componentes Vol. (µl) 1 Reação H2O 7,5 Solução ponta para uso 2X 12,5 mFU1 10 pmol 1 CFD2 10 pmol 1 cDNA 3 Total 25 O perfil térmico da reação de PCR teve início a partir de desnaturação inicial a 95°C durante 15min., seguido por 45 ciclos a 95°C durante 15 segundo, e 48°C durante 3 minutos, Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 40 Etapa 3. As amostras negativas na reação de real-time PCR, foram testadas por outro protocolo para a detecção de agentes virais do gênero Flavivirus, estratégia desenvolvida por Bronzoni et al. (2005). Uma reação de PCR gêneroespecífico, produzindo amplicons de aproximadamente 958 pb (96), seguida de duas Multiplex-Nested-PCR espécie-específica com primers selecionados com base na sequência de nucleotídeos dos vírus de estudo. Na primeira M-N-PCR usamos Pool 1 primers de NDEN-1, NDEN-2, NDEN3 e NYF, juntamente com o primer FG1 (15μM cada). Na segunda M-N-PCR usamos Pool 2 de primers nSLE, nBSQ, nILH, nROC juntamente com o primer FG1 (15μM cada), de acordo com o protocolo seguinte: PCR Gênero-específica Flavivirus Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 12,3 Buffer 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 1 2 mM dNTP 10 Mm 1 0,4 mM FG1 15 nM (+) 1,5 0,9 mM FG2 15 nM (-) 1,5 0,9 mM Taq Platinum 5U/ µl 0,2 1 cDna 5 Total 25 U O protocolo da reação de Nested-PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min., hibridização a 53°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 2 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 41 M-N-PCR Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 12,3 Solução tampão 10x 2,5 1,0 X MgCl2 50 mM 2 4,0 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM Pool (1/2) Primer 15mM 4 2,4 mM 0,2 1 Taq Platinum 5U/ µl Amplicon 3 Total 25 U O protocolo da reação de PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min., hibridização a 53°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 2 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 42 4.3.2.6 Protocolo de PCR para identificação de Orthobunyavirus Para a detecção de agentes virais do gênero Orthobunyavirus, foi utilizada a estratégia desenvolvida por Moreli et al. (2002): uma reação de PCR gêneroespecífico, seguida de uma Nested-PCR espécie-específica com primers selecionados com base na sequência de nucleotídeos de vírus Oropouche segmento S, produzindo amplicons de aproximadamente 300 pb (90), de acordo com o protocolo seguinte: PCR – Gênero específico -Bunyavirus Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 15,1 Solução tampão 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 1 2 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM BUN-S 10 pmol 1 0,4 pmol BUN-C 10 pmol 1 0,4 pmol 0,4 2 Taq Platinum 5U/ µl cDna 3 Total 25 U O protocolo da reação de PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 1 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 43 Nested-PCR para vírus Oropouche Componentes Vol. (µl) 1 Reação Concentração Final H2O 17,1 Solução tampão 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 1 2 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM BS-S 10 pmol 1 0,4 pmol BS-C10 pmol 1 0,4 pmol 0,4 2 Taq Platinum 5U/ µl Amplicon 1 Total 25 U O protocolo da reação de Nested-PCR no termociclador teve início a partir de desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 25 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 1 min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos. 4.3.2.7 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação Todos os amplicons foram analisados por eletroforese, em gel de agarose a 1-2%. Para tanto, uma alíquota de 5,0µl do produto amplificado na reação de PCR foi adicionada a 2,0µl de solução tampão de amostra (0,5% azul de bromo fenol e 20% de glicerol), corado com brometo de etídeo (10mg/ml), aplicado no gel submerso em cuba horizontal de eletroforese, com solução tampão TBE 1X (89mM Tris; 89mM Ácido Bórico; 2mM EDTA), pH 8,4 (Fermentas life scienses, Luthuania), sob tensão elétrica de 100 Volts, aproximadamente por 70 minutos. Como controle negativo, foi utilizado o ”branco”. As bandas foram visualizadas sob a luz ultravioleta (UV) em uma câmara escura, equipada com transiluminador e a imagem foi registrada através de câmara fotográfica digital. O tamanho dos amplicons foi determinado em comparação com o marcador de peso molecular 100 pb (Fermentas life scienses, Luthuania). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 44 4.3.2.8 Sequenciamento nucleotídico Os amplicons obtidos na PCR foram sequenciados pelo método de interrupção da síntese da cadeia de nucleotídeo por dideoxinucleotídios, (98). A purificação dos produtos da PCR, a fim de se eliminar bases não incorporadas e reagentes excedentes, foi realizada utilizando as enzimas Exonuclease I e Shrimp Alkaline Phosphatase-SAP. Em linhas gerais, ao produto da PCR foram adicionados 10µL de solução Exo/Sap (0,025 µL Exonuclease I, 0,250 µL SAP e água Milli Q), depois incubado a 37ºC por 30 minutos e então a 95ºC por 5 minutos. A quantificação das concentrações do produto de PCR foi realizada no equipamento NanoDrop 2000/2000c, de acordo com o manual do equipamento. Definidas as concentrações para cada amostra, partimos para a reação de sequenciamento, utilizando os reagentes e protocolo “Big Dye® Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), segundo recomendações do fabricante. Na reação de sequenciamento foram utilizados 2,3 μL de solução ready reaction, 2 μL (80 ng) do produto de PCR purificado e 3,3 pmoles de oligonucleotídeos, ajustados com água livre de RNase e DNase para um volume final de 10 μL. A amplificação foi realizada em termociclador com o protocolo que consiste de 39 ciclos, cada um composto por etapas de desnaturação a 96ºC por 15 segundos, anelamento dos iniciadores a 50ºC por 1 minuto e extensão a 60ºC por 4 minutos. O produto final foi precipitado com a adição de 80µL de isopropanol 65% (álcool isopropílico, Merck). A mistura foi agitada, incubada por 15 minutos à temperatura ambiente e centrifugada a 4.000 rpm por 45 minutos. Ao final, o sobrenadante foi retirado e desprezado e, em seguida, o precipitado foi lavado com 80μL de etanol a 60% e centrifugado a 4.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi incubado a 60ºC por 10 minutos para a completa evaporação do etanol. O precipitado foi então reconstituído em 10 μL de solução de Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 45 formamida Hidi, então aquecida a 95ºC por 4 minutos e submetido à eletroforese no sequenciador automático. A leitura automática das sequências foi realizada no analisador modelo DNA analizer 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), em placas ópticas de 96 amostras. 4.3.2.9 Análise das sequências A análise das sequências obtidas neste estudo foi realizada por meio dos algoritmos do programa BioEdit Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0 (99). As sequências foram confrontadas com outras existentes no GenBank, Tabela 6, através do programa Mega 5 (100). As árvores filogenéticas tipo neighbor-joining, para os quatro sorotipos, foram construídas baseadas no fragmento da CprM com 450 pb. Com um boot-strap de 75%. Tabela 6: Relação de sequências de vírus DENV utilizadas na análise filogenética. Sorotipo País de origem DENV - 1 Tailândia Cambodia Estados Unidos Malásia Seychelles Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Argentina Venezuela Venezuela Isolado (ano) 1994 2001 2000 2007 2003 1990 1997 2000 2001 2001 2002 2005 2007 2000 1998 2008 Genótipo I I II III IV V V V V V V V V V V V Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. Genebank acession AY732480 AF309641 AF180817 EF457905 AB195673 AF226685 AF311956 FJ850070 AB519681 AF513110 FJ850075 FJ850084 FJ850090 AF514885 FJ639741 FJ850103 46 DENV - 2 DENV - 3 DENV - 4 Estados Unidos México Colômbia Tailândia Tailândia Nova guiné China Jamaica Brasil Estados Unidos Ilhas Virgens (EU) República Dominicana Venezuela Colômbia Estados Unidos Venezuela Indonésia China Polinésia Francesa Tailândia Brasil Brasil Seri-Lanca Brasil Brasil Tailândia Tailândia Tailândia Estados Unidos Venezuela Brasil Brasil Brasil 2006 2008 2008 1988 2002 1988 1999 2007 2008 2005 2005 V V V Ásia I Ásia I Ásia II Ásia II Asiático/Americano Asiático/Americano Asiático/Americano Asiático/Americano 2004 Asiático/Americano AB122022 2006 2004 1999 1992 2004 2000 1989 1998 2011 2004 2000 2003 2007 1997 1991 2000 1995 2006 2011 2012 2010 Asiático/Americano Asiático/Americano Americano Americano Cosmopolita Cosmopolita I II II III III III III III I II II II II II II Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. EU482591 GU131983 GQ868570 DQ181802 AJ487271 AF038403 AF204178 GQ199892 HM181971 EU687216 FJ898453 FJ639822 FJ024477 AF100465 AF100469 AY858035 AF276619 AY744677 AY676348 JN697379 EF629367 AY099336 EF643017 GU131877 AY618988 AY618990 AY618993 GQ199880 JN819406 JN559740 JN559741 JN983813 47 4.3.3 Aspectos éticos Este estudo faz parte do projeto “Doenças febris agudas em uma unidade terciária de saúde da Amazônia Ocidental Brasileira: estudos de epidemiologia, caracterização clínica e diagnóstica” PPSUS∕2009 EDITAL FAPEAM ∕SUSAM ∕MS ∕CNPq∕nº 007∕2009; da pesquisadora responsável Prof.ª Dr.ª Maria Paula Gomes Mourão. Foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da FMT-HVD e está de acordo com as normas previstas na resolução Nº 466/12, do Conselho Nacional de Saúde, aprovação nº 2015 (Anexo 8.3). 4.4 Análise estatística dos resultados Para análise estatística dos dados coletados, a partir das fichas epidemiológicas, foi criado um banco de dados no software Epi Info 3.5.1. As análises estatísticas dos dados são baseadas em descrição de frequências, prevalências e associações dos sorotipos com variáveis avaliadas como: distribuição dos sorotipos por zonas da cidade, sexo, idade, procedência, gravidade e dias de doença. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 48 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos e a discussão da pesquisa serão apresentados na forma de artigo científico. "Clinical and virological descriptive study in the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil" Este manuscrito foi enviado e aceito para a publicação na revista Public Library of Science one- PLOS ONE (fator de impacto 3.73, QUALIS A2 da CAPES na área da CIÊNCIAS BIOLÓGICAS III) (Anexo 8.5). Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 49 6. CONCLUSÃO Os resultados obtidos nos permitiu concluir que: • Os quatro sorotipos de Dengue circularam em Manaus, durante a epidemia ocorrida no ano de 2011. O sorotipo mais frequente foi o DENV-2 (46,2%), seguido pelo DENV-4 (29,2%). • A análise nucleotídica das sequências possibilitou a caracterização genotípica dos sorotipos, DENV 1-V, DENV 2- Asiático/Americano, DENV 3-III e DENV 4-II. • As co-infecções foram relacionadas com os sorotipos de vírus dengue, DENV1/4 5 (1,9%); DENV-1/2 1 (0,4%) DENV-2/4 6 (2,3%) e DENV- 3/4 (0,4%). • Na análise das amostras clínicas de pacientes, negativas para DENV, com síndrome febril indiferenciada, não houve detecção dos outros arbovírus (SLEV, BSQV, ILHV, MAYV e OROV). • O perfil clinico e laboratorial dos casos confirmados de dengue foi compatível com os descritos na literatura. • Neste estudo não foi possível estabelecer uma associação entre a severidade da doença e determinantes genéticos do vírus dengue. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas. 50 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Yuill TM. The ecology of tropical arthropod-borne viruses. 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Título Doutora Especialista Cintia Mara Costa de Oliveira Doutora Felipe Gomes Naveca Doutor Guilherme Augusto Pivoto João Especialista João Bosco Lima Gimaque Mestre Luiz Tadeu Moraes Figueiredo Doutor Michelle Souza Bastos Mestre Rajendranath Ramasawmy Doutor Regina Maria Pinto de Figueiredo Doutora Área de Atuação Função Médica Infectologista, Orientadora, desenho Pesquisadora da FMTdo estudo, análise HVD Coordenador da dos dados. proposta Farmacêutica/ Bioquímica Bióloga, Pesquisadora da FMT-HVD Microbiologista, Pesquisador em Saúde Pública, Fiocruz-AM Médico Residente Infectologista / FMTHVD FarmacêuticoBioquímico, Pesquisador da FMTHVD Médico, Pesquisador do Centro de Pesquisa em Virologia, FMRP/ USP. FarmacêuticoBioquímica, Pesquisadora da FMTHVD Genética molecular, Pesquisador Sênior da FMT-HVD Bióloga, Pesquisadora da FMT-HVD Aluna responsável pela execução projeto Colaboradora nos experimentos de PCR. Colaborador nos experimentos de PCR. Revisão dos prontuários Colaborador nos experimentos de PCR e Sorologia. Colaborador técnicocientífico. Colaboradora nos experimentos de PCR e Sorologia. Colaboradora nos experimentos de PCR. Colaboradora nos experimentos de PCR. 8.2 Ficha clínica padrão para o estudo FICHA CLÍNICA PADRÃO PARA O ESTUDO Paciente nº Prontuário: Idade anos Sexo: Procedência: Naturalidade: Telefone Bairro: M( ) F( ) Profissão: Febre? não ( ) sim ( ) Há quanto tempo? dias Cefaleia não ( ) sim ( ) Astenia não ( ) sim ( ) Mialgia não ( ) sim ( ) Anorexia não ( ) sim ( ) Artralgia não ( ) sim ( ) Mal-estar geral não ( ) sim ( ) Exantema não ( ) sim ( ) Dor retro-orbitária não ( ) sim ( ) Fotofobia não ( ) sim ( ) Outros sintomas: Exames específicos Exames de Biologia Molecular: Ht Dengue Hg Oropouche Plaquetas Mayaro Albumina St. Louis NS1 Bussuquara Cacipacoré Ilhéus . 8.3Certificado de aprovação - Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos . 8.4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido . . 8.5 Artigo científico Clinical and virological descriptive study in the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil Valquiria do Carmo Rodrigues Alves*2, Michele de Souza Bastos1, 2, Rajendranath Ramasawmy1, 2,3, Regina Pinto de Figueiredo1, João Bosco Lima Gimaque1, Wornei Silva Miranda Braga1,2, Mauricio Lacerda Nogueira1,4, Sergio Nozawa3, Felipe Gomes Naveca5, Luiz Tadeu Moraes Figueiredo1,6, Maria Paula Gomes Mourão*1, 2,3. Affiliations: 1. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Viera Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brazil. 2. Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Manaus, Amazonas, Brazil. 3. Universidade Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brazil 4. Faculdade de Medicina de São Jose do Rio Preto (FAMERP), São Jose do Rio Preto, São Paulo, Brazil 5. Instituto Leônidas & Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Manaus, Amazonas, Brazil 6. Centro de Pesquisas em Virologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil E-mail addresses: 1. Valquiria do Carmo Alves Martins – [email protected] 2. Michele de Souza Bastos – [email protected] 3. Rajendranath Ramasawmy – [email protected] 4. Regina Pinto de Figueiredo – [email protected] 5. João Bosco Lima Gimaque – [email protected] 6. Wornei Braga - [email protected] 7. Mauricio Lacerda Nogueira - [email protected] 8. Sergio Nozawa - [email protected] 9. Felipe Gomes Naveca – [email protected] 10. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo – [email protected] 11. Maria Paula Gomes Mourão – [email protected] * Corresponding author: Valquiria do Carmo Alves Martins, MD. Phone: +55 92 2127 3447 or +55 92 8128 6213 E-mail: [email protected] Address: Av. Pedro Teixeira, 25 - Gerência de Virologia Manaus – Amazonas – Brazil ZIP Code: 69040-000 . Abstract Background: Dengue is a vector-borne disease in the tropical and subtropical region of the world and is transmitted by the mosquito Aedes aegypti. In the state of Amazonas, Brazil during the 2011 outbreak of dengue all the four Dengue virus (DENV) serotypes circulating simultaneously were observed. The aim of the study was to describe the clinical epidemiology of dengue in Manaus, the capital city of the state of the Amazonas, where all the four DENV serotypes were co-circulating simultaneously. Methodology: Patients with acute febrile illness during the 2011 outbreak of dengue, enrolled at the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Viera Dourado (FMT-HVD), a referral centre for tropical and infectious diseases in Manaus, were invited to participate in a clinical and virological descriptive study. Sera from 677 patients were analyzed by RT-nested-PCRs for flaviviruses (DENV 1-4, Saint Louis encephalitis virus-SLEV, Bussuquara virus-BSQV and Ilheus virus-ILHV), alphavirus (Mayaro virus-MAYV) and orthobunyavirus (Oropouche virus-OROV). Principal Findings: Only dengue viruses were detected in 260 patients (38.4%). Thirteen patients were co-infected with more than one DENV serotype and six (46.1%) of them had a more severe clinical presentation of the disease. Nucleotide sequencing showed that DENV-1 belonged to genotype V, DENV-2 to the Asian/American genotype, DENV-3 to genotype III and DENV-4 to genotype II. Conclusions: Co-infection with more than one DENV serotype was observed. This finding should be warning signs to health authorities in situations of the large dispersal of serotypes that are occurring in the world. Key-words: Acute febrile illness, dengue, diagnosis by RT-PCR, dengue virus phylogeny, Brazil. . Introduction Dengue virus (DENV) infection may display either benign acute febrile illness or severe disease such as dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS) [1]. Over the last 31 years, Brazil has suffered successive outbreaks of dengue. The incidence of dengue continues to increase, and in the last decade 700,000 cases are reported per year. The mean age of severe dengue patients is decreasing. A high proportion of children are increasingly affected with severe disease [2]. In recent years, dengue outbreaks have displayed many atypical cases such as myocarditis, hepatitis, meningoencephalitis and acute kidney failure [3]. Fatality rates have also increased. In Manaus, the capital city of the Amazonas state, circulation of the four DENV serotypes was observed during the 2011 outbreak and is the only city to date to report co-circulation of all four DENV serotypes simultaneously in Brazil, providing a clear evidence of dengue hyperendemicity [4]. The occurrence of severe forms of dengue is commonly related to secondary infections leading to antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection in macrophages [5]. Alternatively, severe forms of dengue could be related to virus mutants that emerge as part of a natural selection process [6]. Molecular epidemiology studies have shown that DENV genome suffers mutations and may lead each virus serotype to differentiate into multiple genotypes [7]. This study describes the clinical epidemiology of dengue in a city where all the four DENV serotypes are co-circulated simultaneously and also provides the opportunity to compare clinical severity to DENV serotypes. The results of the arboviruses surveillance performed by FMT-HVD during a dengue outbreak in 2011 are shown. Simultaneous circulations of the four DENV serotypes and different clades were observed. Dengue co-infection seems to lead to more severe manifestations. Materials and Methods Study design . This is a clinical and virological descriptive study to correlate clinical data with DENV serotypes during the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil. Patients with dengue were recruited from January 2011 through May 2011. A total of 677 patients from Manaus seeking medical assistance at the FMT-HVD agreed to participate in the study. Setting All of the patients participating in this study are inhabitants of Manaus and were recruited at the FTM-HVD. The FMT-HVD, located in the Manaus city with almost a population of 2 million inhabitants, is the referral centre for acute febrile illness and tropical infectious diseases. Study sample Patients with acute febrile illness but negative for malaria by thick blood smear test and presenting any two of the following symptoms in the first visit: headache, myalgia, arthralgia or malaise, were invited to participate in the present study. All of the patients participating in the study signed a written informed consent form. Parents or responsible party of children less than 18 years were required to sign a written inform consent form. This study was approved by the internal review board of the Ethics Committee of the FMT-HVD under the register number 2015. Inclusion criteria Patients with acute febrile illness presenting fever less than 7 days were selected and classified according to the 2012 World Health Organization guidelines for dengue cases (http://www.who.int/denguecontrol/9789241504713/en/). Group I Dengue without warning signs - patients live in/travel to dengue endemic area, with fever and two of the following symptoms: nausea, vomiting, rash, aches and pains; tourniquet test positive; leukopenia. Group II . Dengue with warning signs - patients with abdominal pain or tenderness; persistent vomiting; clinical fluid accumulation; mucosal bleed; lethargy, restlessness; liver enlargement >2cm; increase in haematocrit concurrent with rapid decrease in platelet count. Group III Severe dengue – patients presenting severe plasma leakage leading to shock (DSS); fluid accumulation with respiratory distress; severe bleeding, and severe organ involvement including the liver (AST or ALT >1000U/dL); the central nervous system (impaired consciousness); and the heart [8]. The clinical classification of the patients with dengue was performed by the clinicians according to the 2012 WHO guidelines for dengue on the day of enrollment. All of the severe dengue patients were hospitalized and followed-up until discharge. Furthermore, patients were seen in outpatient clinics 48 hours and 6-7 days after hospital discharge for hospitalized patients. Non-hospitalized patients were seen twice, between 48 hours and 6 days after first clinical assessment. Biochemical and hematology analysis Blood sample was collected from all the patients on the day of presentation at the FMT-HVD. The biochemical tests were done with automatic analyzer CT 600i Wiener lab group apparatus while the hematological tests with the ABX pentra DX 120 HORIBA ABX Magnos bc. PCR screening Five mL of blood was collected from all the participants on the day of presentation at the FMT-HVD. Serum was separated and RNA was purified from 200µL using the QIAamp Viral RNA mini kit (Qiagen, Germany) according to the protocol of the kit. The extracted RNAs were stored at -70°C or immediately used for laboratory tests. cDNA was synthesized by reverse transcription (RT) with AccessQuick RT-PCR System kit (Promega, USA). The RT mixture consisted of 5 µl of RNA, 1 unit of the enzyme reverse transcriptase, 12.5μl of AccessQuick Master Mix (2x), 1μl of Random primer and 20U of RNase inhibitor (RNaseOUT -Invitrogen, . USA) in a final volume of 20μl completed with RNase free water. The mixture was incubated at 72°C for 5 minutes (min) and at 45oC for 60 min and stored at - 20°C until use. For determining the DENV serotype, the cDNA were tested by a semi-nested multiplex reverse transcription-PCR as described elsewhere [9]. Briefly, each cDNA was subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification with D1 and D2 primers for 35 cycles: 1 min at 94°C, 1 min at 55°C, and 1 min at 72°C, with a final extension for 10 min at 72°C. A second round of amplification was conducted with 10 µl (diluted 1:100) of the first reaction mixture, including DENV serotype-specific reverse primers (TS1–TS4), and the conserved forward primer D1. The same cycling parameters were used as in the first reaction. All negative samples underwent another screening for DENV and other flaviviruses using the real time RT-PCR with Maxima SYBR GREEN/ROX reagents (Fermentas) [10]. Negative samples by real time RT-PCR were also tested by a conventional RT-PCR with Flavivirus genera specific primers followed by multiplexnested-PCRs with species-specific primers [11]. After the first round of PCR with Flavivirus genera specific primers, nested-PCR primers specific for Dengue DENV 14, Saint Louis encephalitis virus-SLEV, Bussuquara virus-BSQV and Ilheus virusILHV, were used in the Multiplex-PCR. Precautions to avoid contamination were followed. Positive and negative controls were used in all reactions. Samples previously negative to dengue were also tested for alphaviruses using genera-specific primers followed by a Multiplex-Nested-PCR with speciesspecific primers, including those for MAYV as previously described elsewhere [12]. For orthobunyaviruses, the samples were tested using genera-specific primers followed by a Nested-PCR with OROV specific primers [13]. All the samples that showed co-infections were reprocessed for RNA purifications from another aliquot of sera and undergone the RT-nested PCR for DENV to confirm co-infections and to avoid any doubt of contaminations. Nucleotide sequencing and phylogenetics . Nucleotide sequencing of amplicons was performed after treatment with Exonuclease I (20U/µL) (BioLabs, New England) and Shrimp Alkaline Phosphatase-SAP (1U/µL) (Fermentas). Briefly, the purification mixture included amplicons, 10µL of Exo/SAP (0.025µL SAP, 0.250µL of Exonuclease I and 9.725 µL of Milli Q water). The mixture was incubated at 37°C for 30 min and 95°C for 5 min. Quantification of amplicons was performed in a NanoDrop 2000/2000c (Termo Scientific). Purified amplicons were directly sequenced using the Big dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, EUA), following instructions of the manufacturer in the automatic sequencer ABI 3130L (Applied Biosystems, EUA). Nucleotide sequences were analyzed by algorithms of the BioEdit Sequence Alignment software [14]. Nucleotide and putative amino acid sequences were compared to other sequences from GenBank for phylogenetic analysis by neighborjoining method using the Mega 5.05 software with 1000 bootstrap replications [15]. Gene Accession numbers: All the nucleotide sequences were submitted to GenBank and can be accessed with the following numbers: KF417476, KF417479, KF417480, KF417481, KF417478, KF417482, KF417477, KF417485, KF417484, KF417483, KF417488, KF417486, KF417489, KF417487, KF417490, KF417491, KF417496, KF417492, KF417493, KF417495, KF417494. Correlation of clinical data to DENV serotypes Laboratory findings and DENV serotypes were crossed blindly to the clinical status of all of the patients. Statistical analysis The Epi Info version 7.3.2 software was used for data handling. Descriptive analyses were performed to calculate means and standard deviation for continuous variable and relative frequency for categorical variable. Statistical analysis was performed using SPSS version 17.0. Chi-Square tests with Yates correction were performed for statistical comparison. Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval . (CI) were calculated by logistic regression to estimate the effect of co-infection or other clinical variables. Differences were considered significant at p ≤ 0.05. Results General characteristics of the study population A total of 677 patients with acute febrile illness and negative for malaria were included in the study. The mean age of the infected patients was 35.7± SD 15.7 (range 4 to 83 years) and 53.5% (139/260) were females. Molecular typing Molecular typing for DENV showed positivity for 260 (38.4%) patients. The DENV serotypes were as follows: 46.2% (120/260) had DENV-2, 29.% (77/260) DENV-4, 10.0% (26/260) DENV-1 and 9.2% (24/260) DENV-3. Thirteen had coinfections: 2.3% (6/260) had DENV-2/4, 1.9% (5/260) DENV-1/4, 0.4% (1/260) DENV-1/2 and 0.4% DENV-3/4. All samples were negative to other flaviviruses, and also negative to MAYV and OROV. The patients were from different regions of the city and comparison among the regions to DENV serotypes did not show any difference. The co-infected patients were also from different regions. Based on clinical presentation, dengue patients were classified as 192 dengue without warning signs cases, 45 severe dengue cases (DHF in 37 cases and 8 cases with neurological manifestations as somnolence, irritability and disorientation), and 23 dengue with warning signs cases. Clinical presentations of the dengue patients associated with DENV serotypes are shown in Table 1. Seven of the co-infected patients were classified as dengue with/without warning signs and the other six were hospitalized after initial evaluation. Co-infected patients with more than one DENV serotypes had more severe dengue (p=0.004) compared to mono-infected patients. The serology and the viral load were not performed and it is possible that many of the co-infected patients may be of secondary infections and developed severe disease. Comparison of the different DENV serotypes with severity of the disease showed no statistical difference. . Clinical manifestations associated with dengue serotypes and co-infections are shown in Table 2. Cutaneous rash was more frequent (p=0.003) among patients infected by DENV-1 or patients co-infected compared to patients infected with the other serotypes. Ocular pain (p=0.03) and hemorrhagic phenomena (p=0.01) were more frequent among patients co-infected with different serotype mixtures. Laboratory findings associated to clinical severity of dengue are shown in Table 3. Levels of albumin in plasma (p=0.03) and platelet counts <100.000/mm3 (p<0.01) were significantly related to severe dengue and dengue with warning signs respectively. Severe Dengue or minor hemorrhagic phenomena were prevalent among coinfected patients with an OR of 4.57 (p=0.004) and 9.09 (p<0.001) respectively as shown in Table 4. Other variables such as arthralgia, rash, ocular pain, alarm signs, platelets counts and serum albumin level were also statistically significant compared to mono-infected patients. In table 5 is described the individual data for each patient co-infected with emphasis in their clinical and epidemiological findings. Phylogenetics analysis Nucleotides sequencing of a fragment of 453 base pairs for the region of prMC of 21 samples (16 cases with dengue without warning signs, 3 with severe dengue and 2 with dengue with warning signs) were performed. Of the 21 samples, 7 were of DENV-1, 7 of DENV-2, 2 of DENV-3 and 5 of DENV-4. Nucleotide sequences were aligned and neighbor joining phylogenetic trees were generated for each DENV serotype, as shown at Figures 1, 2, 3 and 4. DENV-1 (Fig.1), DENV-2 (Fig.2), DENV3 (Fig.3) and DENV-4 (Fig. 4) belong to the genotype V, Asian/American genotype, genotype III and genotype II respectively. All the nucleotide sequences were submitted to NCBI and the corresponding GenBank accession numbers were generated (Supplementary Table S1, ALVES VCR 301013 STROBE). Discussion In the present study, 677 patients with suspected dengue fever were evaluated and through three different molecular techniques only DENV were detected in 260 patients. . All the four DENV serotypes were detected with the predominance of DENV-2 and DENV-4. Thirteen patients were co-infected with more than one DENV serotypes. The co-infected patients manifested severe dengue and dengue with warning signs compare to mono-infected patients. The clinical presentation of dengue without warning signs among co-infected patients was exuberant with cutaneous rash, arthralgia and ocular pain. No difference was observed between the DENV serotypes and severity of the disease. This is an important finding as DENV-2 in Brazil is related to severe disease [16,17]. Co-infection with more than one DENV serotypes has been gradually reported in the last decade. Rocco and colleagues (1998) were the first to report a case of co-infection by serotypes of DENV-1 and 2 in a 30-year-old resident of Miranda, MS, Brazil in 1996 and Lorono-Pino et al (1999) suggested that infections with more than one serotype should be excepted in hyperendemic areas [18,19]. Since then several other authors have been reporting DENV co-infections [20-22]. In this study, co-infections were observed in 13 patients. Different from three previous studies in Brazil where all the six co-infected reported patients were of dengue without warning signs [18,23,24], 61% (8/13) of the co-infected patients in this study had either severe dengue or dengue with warning signs. Some studies have shown that co-infection can cause severe disease. In a study conducted in India, six out of nine co-infected patients had DHF [25]. Altogether it can be suggested that concurrent infections by more than one serotype could influence the clinical expression of dengue. The presence of two DENV serotypes in an individual may possibly increase the DENV viremia levels compare to a mono-infected patient. The number of infected leucocytes in co-infected patients may be higher and can induce a large cytotoxicity phenomena leading to a cytokine storm and progress to severe disease. High viral load and secondary infections may also trigger the development of severe disease. The drawback in our study is that the serology and the viral load were not performed. It cannot be rule out that many of the patients were of secondary infections and developed severe disease. DENV can cause manifestations of central nervous system and an increasing number of cases have been reported in the last few years [26-29]. In the present . study, among 45 patients with severe dengue, eight had neurologic alteration (alteration in consciousness) and were not associated to any DENV serotype or coinfections. All of the patients with neurologic alteration recovered from the disease. These findings underscore the need to investigate dengue in patients with viral meningoencephalitis in Manaus and other endemic areas. Haematocrit, a parameter associated with capillary leak syndrome, was not significantly increased among patients with severe dengue and dengue with warning signs. It is possible that the oral rehydration therapy offered to all these patients has been started before installation of a marked capillary leak. This intervention certainly has reduced severe cases (only 1% among our patients) and fatalities. However, platelet counts under 100.000/mm3 were related to severe dengue patients and to dengue with warning signs. Manaus is relatively isolated from the rest of the country. To identify whether the DENV genotypes that are circulating in the country are similar in Manaus, nucleotide sequencing of the selected samples were performed. All the DENV-1 serotypes were of genotype V, the only genotype detected so far in Brazil [30]. The phylogenetic tree of DENV-1 (Fig. 1) displayed two distinct clades of genotype V from patients in this study, which is supported by a high bootstrap value. In our samples DENV genotypes and clades were not associated with severity of the disease and neither to any region of the city. However, the dataset is small and need to be further characterized to confirm this observation. In fact the co-circulation of different clades and/or clade replacement is related to high genetic diversity of that isolates and can lead to new distinct biological proprieties that may induce more severe disease. Recently, two complete distinct strains (both belonging to genotype V) of DENV-1 were observed in Brazil [30]. DENV-2 serotypes from Manaus were grouped with the Asian/American genotype that is more virulent than the indigenous American genotype and is also the predominant genotype in Brazil [16,31]. DENV-3 belonged to genotype III introduced from the Caribbean Islands and present in Brazil since the last 15 years [32,33]. All DENV-4 analyzed in this study belonged to genotype II. DENV-4 was first described in Manaus in 2008 [34]. It was found that this DENV-4 belonged to the genotype I, which is of Asian origin and was never described in the American Continent [34,35]. . Presently, probably, 2 genotypes (I and II) of DENV-4 are circulating in Manaus [36,37]. Conclusions The co-circulation of multiple serotypes or strains of dengue genotypes are becoming common in endemic region and may increase the risk of major epidemics as observed in Manaus during the 2011 outbreak where more than 50,000 cases of dengue virus infections were reported. Future studies with quantification of viruses and serology test will be needed to understand the mechanism of how co-infection with more than one DENV serotypes may lead to severe dengue disease in the city of Manaus. Autor Contributins Conceived and designed the experiments: VdCAM MdSB RR FGN LTMF MPGM. Performed the experiments: VdCAM MdSB RPdF JBLG SN FGN. Analyzed the data: VdCAM MdSB RR WSMB LTMF MPGM. Contributed reagents/materials/analysis tools: VdCAM MdSB RR RPdF SN FGN LTMF MPGM. Wrote the manuscript: VdCAM MdSB RR MLN LTMF MPGM. References 1. Gubler DJ (2002) The global emergence/resurgence of arboviral diseases as public health problems. Archives of medical research 33: 330-342. 2. Rocha LA, Tauil PL (2009) [Dengue in children: clinical and epidemiological characteristics, Manaus, State of Amazonas, 2006 and 2007]. Rev Soc Bras Med Trop 42: 18-22. 3. Figueiredo LTM (2012) Dengue in Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 45: 285-285. 4. Bastos M, S., Figueiredo RM, Ramasawmy R, Itapirema E, Gimaque JB, et al. (2012) Simultaneous circulation of all four dengue serotypes in Manaus, State of Amazonas, Brazil in 2011. Rev Soc Bras Med Trop 45: 393-394. . 5. 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Co-infections (DENV-1/2, DENVDENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 1/4, DENV-2/4 and Clinical presentation DENV-3/4) N % N % N % N % N % Dengue without warning 23 89 88 73 18 75 58 75 5 39 signs Total 192 Dengue with warning signs 2 8 9 8 4 17 6 8 2 15 23 Severe dengue 1 4 23 19 2 8 13 17 6 46* 45 Total 26 120 24 *p= 0.004 Comparison of co-infected patients to mono-infected patients. 77 13 260 B Table 2. Clinical aspects of dengue patients associated to the infecting virus serotype and co-infection. Clinical presentation DENV-1 N % DENV-2 N % DENV-3 N % DENV-4 N % Co-infection (DENV-1/2, DENV-1/4, DENV-2/4 and DENV3/4) N % Headache 6 23 49 41 10 42 30 39 9 Myalgia 5 19 43 36 9 36 30 39 9 Arthralgia 2 8 28 23 5 21 18 23 7 Rash 6 23 9 8 1 5 4 5 4 Ocular pain 4 15 28 23 9 38 15 20 7 Alarm signs 3 12 32 27 7 29 19 25 8 Hemorrhagic phenomena 1 4 21 18 5 21 10 13 8 *p<0.05 is considered statistically significant. Comparison of co-infected patients to mono-infected patients. 69 69 54 31 54 62 62 P value 0.09 0.05 0.03* <0.01* 0.03* 0.02* <0.01* C Table 3. Laboratory findings of dengue patients associated with classification of dengue severity Dengue Severe P without Dengue with warning signs warning signs dengue Value Variable N % N % N % Hemoconcentration (45% for males, 42% for females) 46 36 7 35 23 51 0.74 Platelet < 100 x103/µL 17 13 16 80 42 93 <0.01* Leucocytes < 3.0 x103/µL 36 29 2 29 2 17 0.66 Albumin < 3.5 g/dL 4 4 1 5 6 14 0.03* *p<0.05 is considered statistically significant. Comparisons between severe dengue patients to Dengue with/without warning signs patients. D Table 4. Dengue co-infection prevalence and associated variables. Variable N N+ (%) (95%IC) OR (95% CI) Total sample Severe dengue N Y Arthralgia N Y Rash N Y Ocular pain N Y Hemorrhagic phenomena N 260 13 (5.0) (2.4-7.6) - P value - 247 13 39 (15.8) 6 (46.20) 1 4.57 (1.43 -14.33 ) 0.004 247 13 53 (21.5) 7 (53.8) 1 4.27 (1.38-13.25) 0.013 247 13 20 (8.1) 4 (30.8) 1 5.04 (1.43-17.84) 0.023 247 13 56 (27.7) 7 (53.8) 1 3.98 (1.28-12.32) 0.018 247 37 (15.0) 1 Y 13 8 (61.5) 9.08 (2.82-29.28) Alarm signs N 247 61 (24.7) Y 13 8 (61.5) Platelet <100x103/µL N 182 66 (36.3) Y 11 9(81.1) Albumin < 3.5 g/dL N 144 8 (5.6) Y 11 3 (27.3) Odds Ratio (OR) were calculated by Chi-squared test. < 0.001 1 4.88 (1.54-15.47) 0.007 1 7.91 (1.66-37.71) 0.004 1 6.37 (1.41-28.75) 0.032 E Table 5. Clinical presentation of dengue in co-infected patients Patient 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Age/ Days Clinical Dengue Hemorrhagic Cavitary Abdominal Gallbladder Hospitalization Gender of fever diagnosis serotype (PCR) events effusion pain wall thickening 3 No 25/M I DENV-1/DENV-4 N N ND ND ND No 31/M I DENV-1/DENV-2 N N ND ND 5 Yes 17/F II DENV-2/DENV-4 Y N N Y 7 Yes 64/F III DENV-3/DENV-4 Y N Y N 3 Yes 38/M I DENV-1/DENV-4 Y N N N 4 Yes 27/M III DENV-2/DENV-4 Y Y Y Y 6 Yes 18/F III DENV-1/DENV-4 Y N Y N 4 Yes 61/F III DENV-2/DENV-4 N N N N ND No 45/F I DENV-1/DENV-4 N N ND ND ND No 36/F I DENV-2/DENV-4 N N ND ND 7 Yes 28/F III DENV-1/DENV-4 Y N N Y 4 Yes 17/F II DENV-2/DENV-4 Y N N N 6 Yes 40/M III DENV-2/DENV-4 Y Y Y N I: dengue without warning signs; II: dengue with warning signs; III: severe dengue; M: male; F: female; Y: yes; N: No; ND: no data F Figure Legends Figure 1. Phylogenetic tree of DENV-1. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure. Figure 2. Phylogenetic tree of DENV-2. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure. Figure 3. Phylogenetic tree of DENV-3. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure. Figure 4. Phylogenetic tree of DENV-4. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure. G Supporting Information Legends Table S1. Nucleotide sequences used for generating phylogenetic trees are registered in GenBank (NCBI, USA). ALVES VCR 301013 STROBE
