Resumo - nupeb

Ao meu orientador, Ieso de Miranda Castro, pela oportunidade de trabalho, investimento e
todo auxílio prestado.
Ao meu co-orientador e chefinho do coração, Evanguedes Kalapothakis, com quem trabalho
desde o 5º período da graduação, há mais de cinco anos, e com quem aprendi tudo o que
sei praticamente de trabalho de bancada, cotações, preparação de artigos científicos,
projetos, cursos e - principalmente - como me comportar profissionalmente perante
jornalistas e fotógrafos do EM! Muito obrigada por tudo, chefe!
Ao pessoal do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos da UFOP, Ana
Maria, André, Liz, Luciano, Michele, Totola e Zézé, por toda a ajuda, ânimo, bom humor e
hospitalidade.
Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do ICB-UFMG:
- Alessandra, Ana Carolina Campi, Fabíola, Ju, Marluce e Valéria, pelo companheirismo,
pelas brincadeiras, pelas dicas e quebra-galhos.
- Às minhas amigonas, Carolina Campolina, Flávia, Simone e Thaís, por tantos anos de boa
convivência, por tudo o que passamos juntas, por serem do jeito que são e terem me
ensinado, cada uma de sua maneira, coisas tão especiais. Vão ficar saudades, meninas!
- Ao Lorde do nosso laboratório: Gabriel. Sempre prestativo, gentil e com questionamentos
muito inteligentes... O único companheiro da ala masculina do nosso chefe por um bom
tempo.
- E também à nova geração do lab, Ana Luíza, Arthur, Flavinha, Kika e, em especial, ao
Higgor, que têm me ajudado muito nesta etapa final da tese. Boa sorte para vocês!
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP e, em especial, aos
Professores Rogélio Lopes Brandão e Elio Hideo Babá.
Ao Professor Carlos Chavéz-Olórtegui e todos os seus alunos.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
E por fim, aos casais: Natasha e Cláudio e Cláudia e Rodrigo, que sempre me receberam
com os braços abertos em suas casas em Porto Alegre, me emprestaram o computador
umas mil vezes para eu escrever e imprimir a tese e que, sem dúvida, farão às vezes da
minha “família” nesta minha nova cidade. Muito obrigada!
"Só sei que nada sei".
SÓCRATES
Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de
veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de
toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas
seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de
buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas
em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível,
modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional.
Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade,
trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola.
Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de
uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou
toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho
do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por
biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto
para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes
quantidades.
Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional
e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O
sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas
químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao
homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o
dos inseticidas químicos.
Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema
de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1
(previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do
baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após
infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e
LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus
recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia
inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus
selvagens.
Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a
expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso
possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto
aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na
pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
In order to get an overview of all Loxosceles intermedia venom gland transcripts, we
performed a clustering analysis of 268 cDNA sequences available in our laboratory. The 136
singlets and 33 consensus sequences generated after alignment, allowed the identification
by database searches of several distinct genes/proteins in the gland. We analyzed these
sequences, classified them in functional categories (biological function) and, whenever
possible, predicted their 3D structure by homology.
Moreover, aiming the production of highly efficient bioinsecticides, our group has
worked with insecticidal toxins. Recently, we located and characterized, by chromatography
of L. intermedia crude venom and screening of its venom gland cDNA library, lethal toxins to
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): a plague which attacks the Brazilian corn
culture since harvesting to storage. Due to practical limitations to get from the crude venom a
high rate of previously identified neurotoxins, the use of expression systems to study
heterologous genes becomes necessary.
Baculovirus is one of the most studied heterologous systems used worldwide as a
resource for combating pests. They are powerful, versatile and provide advantages
concerning finance, ecology and human health.
In this manner, we subcloned genes of the insecticidal toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1
(previously identified from L. intermedia venom gland) in baculovirus expression vectors. The
construction’s success of the recombinant virus was verified after insects cells infection and
also by PCR. The expression of LiTx1, LiTx2 and LiD1 toxins was verified by RT-PCR, SDSPAGE and Western Blotting. Bioassays with the recombinant virus LiTx1 and LiTx2 in S.
frugiperda larvae showed their insecticidal efficacy, with life-time reduction of this plague
when compared to the wild virus.
We believe recombinant baculovirus herein generated will allow a large scale
expression of L. intermedia toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1. This will conduce to
characterization studies of the action mechanisms of these toxins and also will permit their
use as tools to basic researches in ionic channels and physiologic processes.
PÁGINA
1. INTRODUÇÃO
1
1.1 Análises bioinformáticas
1
1.2 Inseticidas químicos x Bioinseticidas
3
1.3 As aranhas
7
1.3.1 Comentários gerais
7
1.3.2 Composição geral do veneno
8
1.3.3 Toxinas inseticidas
10
1.4 Aranhas do gênero Loxosceles
12
1.4.1 Comentários gerais
12
1.4.2 Composição geral do veneno
16
1.4.3 Toxinas inseticidas
19
1.5 Os baculovírus
20
1.6 Expressão de toxinas em sistema baculovírus
23
2. OBJETIVOS
26
2.1. Geral
26
2.2. Específicos
26
3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
28
4. MATERIAIS
29
4.1. Equipamentos
29
4.2. Programas
30
4.3. Reagentes
30
4.3.1 Antibióticos
30
4.3.2 Meios de cultura
31
4.3.3 Soluções
32
4.3.4 Tampões
34
4.3.5 Outros
35
PÁGINA
4.4. Linhagens celulares
36
4.5. Genótipo das linhagens bacterianas hospedeiras
36
5. MÉTODOS
37
5.1 Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
38
Loxosceles intermedia
5.1.1
Obtenção das seqüências
38
5.1.2
Tratamento das seqüências
39
5.1.3
Agrupamento das seqüências
39
5.1.4
Anotação dos uniques
40
5.1.5
Classificação manual dos uniques em categorias funcionais
42
5.1.6
Análises biológicas dos uniques classificados em categorias
44
funcionais
5.1.7
Modelagem molecular dos uniques
44
5.2 Veneno bruto de L. intermedia
44
5.3 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia
45
5.4 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L.
45
intermedia
5.5 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no
46
vetor de transferência pSynXIV VI+ X3 do sistema de expressão
baculovírus
5.5.1 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e
46
LiTx2
5.5.2 Purificação do produto de PCR
50
5.5.3 Clonagem do produto de PCR de LiTx1 e LiTx2 no vetor de
51
®
clonagem pCR 2.1-TOPO
®
5.5.4 Transformação de bactérias por eletroporação
53
5.5.5 PCR de colônias
54
5.5.6 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep)
55
®
®
56
5.5.8 Seqüenciamento automático capilar
56
5.5.7 Digestão do vetor pCR 2.1-TOPO contendo a região madura de
LiTx1 ou LiTx2 com EcoR I
PÁGINA
5.5.9 Purificação dos fragmentos da região madura de LiTx1 e LiTx2
57
obtidos pela digestão do vetor pCR 2.1-TOPO com EcoR I
5.5.10 Digestão do vetor pSynXIV VI+ X3 do sistema de expressão
57
baculovírus com EcoR I
5.5.11 Ligação do fragmento da região madura de LiTx1 ou LiTx2 no
59
+
vetor pSynXIV VI X3
5.5.12 Precipitação do produto de ligação
60
5.5.13 Transformação de bactérias por eletroporação
60
5.5.14 PCR de colônias
60
5.5.15 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep)
61
5.5.16 Seqüenciamento automático capilar
62
5.6 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema
63
baculovírus
5.6.1 Co-transfecção
63
5.6.2 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes
64
vSynLiTx1 e vSynLiTx2 em culturas celulares
5.6.3 Verificação por RT-PCR da presença de RNAs mensageiros dos
67
vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2 em culturas
celulares
5.6.4 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por
69
SDS-PAGE
5.6.5 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por
70
Western Blotting
5.7 Bioensaio com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2
71
5.8 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia
71
5.8.1 Ensaio hemolítico
72
5.8.2 SDS-PAGE
72
5.8.3 Western Blotting
73
5.8.4 Seqüenciamento de proteínas
73
5.9 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de
73
transferência pFastBacTM1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
5.9.1 Atividade tóxica do veneno bruto de L. intermedia em linhagens
celulares de inseto
73
PÁGINA
5.9.2 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiD1
74
5.9.3 Purificação do produto de PCR
76
5.9.4 Clonagem do produto de PCR de LiD1 no vetor de clonagem
76
®
pGEM -T Easy
5.9.5 Precipitação do produto de ligação
78
5.9.6 Transformação química de bactérias
78
5.9.7 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep)
78
®
5.9.8 Digestão do vetor pGEM -T Easy contendo a região madura de
79
LiD1 com BamH I
5.9.9 Purificação do fragmento da região madura de LiD1 obtido pela
79
digestão do vetor pGEM -T Easy com BamH I
5.9.10 Digestão do vetor pFastBacTM 1 do sistema de expressão
79

Baculovírus Bac-to-Bac com BamH I
5.9.11 Ligação do fragmento da região madura de LiD1 no vetor
pFastBac
TM
81
1
5.9.12 Precipitação do produto de ligação
81
5.9.13 Transformação química de bactérias
81
5.9.14 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep)
82
5.9.15 Digestão do vetor pFastBac
TM
1 contendo a região madura de
82
5.9.16 PCR para confirmação da correta orientação do inserto LiD1 no
82
LiD1 com BamH I
TM
vetor pFastBac
1
5.9.17 Seqüenciamento automático capilar
83
5.10 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema baculovírus
84
5.10.1 Transposição
84
5.10.2 Isolamento do DNA do bacmídeo recombinante
85
5.10.3 Análise do DNA bacmídeo
86
5.10.4 Transfecção de células Sf9 com o DNA bacmídeo recombinante
88
5.10.5 Amplificação do estoque viral
88
5.10.6 Extração de DNA de vírus secretados e não secretados
89
5.10.7 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes LiD1
89
no sistema baculovírus
5.10.8
Infecção
de
recombinantes
células
de
inseto
com
partículas
virais
89
PÁGINA
5.10.9 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por
90
SDS-PAGE e Western Blotting
6. RESULTADOS
6.1
91
Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
91
Loxosceles intermedia
6.1.1
Obtenção das seqüências
91
6.1.2
Tratamento das seqüências
91
6.1.3
Agrupamento das seqüências
91
6.1.4
Anotação dos uniques
91
6.1.5
Classificação dos uniques
93
6.1.6
Análises biológicas dos uniques classificados em categorias
95
funcionais
6.1.7
Modelagem molecular dos uniques
101
6.2 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia
104
6.3 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L.
104
intermedia
6.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no
105
+
vetor de transferência pSynXIV VI X3 do sistema de expressão
baculovírus
6.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema
111
baculovírus
6.6 Bioensaio com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2
116
6.7 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia
117
6.8 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de
121
TM
transferência pFastBac 1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
6.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema baculovírus
7. DISCUSSÃO
7.1Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
Loxosceles intermedia
126
131
131
PÁGINA
7.2 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia
136
7.3 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L.
137
intermedia
7.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no
138
+
vetor de transferência pSynXIV VI X3 do sistema de expressão
baculovírus
7.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema
139
baculovírus
7.6 Bioensaio com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2
141
7.7 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia
142
7.8 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de
145
transferência pFastBacTM1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
7.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema baculovírus
146
7.10 Considerações finais
148
8. CONCLUSÕES
151
9. PERSPECTIVAS
153
10. ANEXOS
154
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
157