Epidemiologia molecular do vírus da raiva no estado do Pará no

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DO VÍRUS DA RAIVA NO ESTADO DO PARÁ NO PERÍODO DE
2000 A 2005: EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
(DESMODUS ROTUNDUS)
Molecular epidemiology of rabies virus in Para state during 2000 to 2005:
emergence and transmission by hematophagous bats (Desmodus rotundus)
Taciana Fernandes Souza Barbosa1, Elizabeth Salbé Travassos da Rosa2,
Daniele Barbosa de Almeida Medeiros3, Livia Medeiros Neves Casseb4,
Armando de Sousa Pereira5, Alberto Lopes Begot6, Reynaldo J. S. Lima6,
Márcio Roberto Teixeira Nunes7, Pedro Fernando da Costa Vasconcelos8
RESUMO
A ocorrência recente de surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos
Desmodus rotundus vem sendo registrada no Estado do Pará desde 2004. Neste artigo,
é realizado um estudo retrospectivo de caracterização genética de 37 cepas do vírus
rábico de diferentes mamíferos, incluindo o homem, isoladas de 2000 a 2005, de
diferentes regiões paraenses. Foi obtido o seqüenciamento nucleotídico parcial do gene
N e construída árvore filogenética baseada no método Neighbor-Joining. A análise
filogenética determinou a formação de cinco clades principais e agrupou as cepas
isoladas no Estado do Pará em três distintas clades: clade I, cepas da variante antigênica
3 (VAg3), comumente encontrada nos morcegos D. rotundus; clade II, cepa relacionada
à VAg3, porém com topologia diferenciada isolada de morcego frugívoro Uroderma
bilobatum; e clade IV, cepas da variante antigênica 2 (VAg2), comumente isoladas de
cães domésticos. No Pará, no período estudado, circularam as variantes VAg2 e
VAg3. A VAg3 da clade I se encontra subdividida em três linhagens virais (I-a, I-b, e
I-c) associadas à distribuição geográfica: duas delas (I-a e I-b) circulam no continente
nas regiões paraenses do Sudeste, Nordeste e Baixo Amazonas, enquanto a linhagem
I-c restringe-se à ilha do Marajó. A associação dos dados genéticos com os ecológicos
fornece uma melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva no Estado do
1
Mestranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da Universiadade Federal do Pará. Seção
de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas, Belém, Brasil. Endereço: Avenida
Almirante Barroso 492 - Marco - CEP: 66090-000 - E-mail: [email protected]
2
Doutoranda em Biologia Parasitária/FIOCRUZ.
3
Doutoranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários pela Universidade Federal do Pará.
4
Mestranda em Patologia das Doenças Tropicais pela Universidade Federal do Pará.
5
Técnico da Seção de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas.
6
Médico Veterinário. Especialista em Saúde Pública pela Escola Nacional de Saúde Pública RJ/UFPA.
Secretaria Executiva de Saúde Pública do Estado do Pará.
7
Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Pesquisador da Seção de Arbovirologia e
Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas.
8
Doutor em Medicina. Pesquisador e chefe da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do
Instituto Evandro Chagas.
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TACIANA FERNANDES SOUZA BARBOSA, ELIZABETH SALBÉ TRAVASSOS DA ROSA, DANIELE BARBOSA DE
ALMEIDA MEDEIROS, LIVIA MEDEIROS NEVES CASSEB, ARMANDO DE SOUSA PEREIRA, ALBERTO LOPES BEGOT,
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Pará e sugere que duas distintas variantes antigênicas isoladas do vírus da raiva foram
associadas com a transmissão da doença por morcegos hematófagos entre 2000 e
2005. Finalmente, foi demonstrado neste estudo a presença de pelo menos três distintas
linhagens genéticas da VAg3 no estado, e a emergência de uma possível nova variante,
que foi isolada de um morcego frugívoro U. bilobatum capturado na localidade de
Ajará, município de Portel, durante o surto ocorrido em 2004.
PALAVRAS-CHAVE
Epidemiologia molecular, vírus da raiva, morcegos hematófagos
ABSTRACT
The occurrence of human rabies outbreaks transmitted by bites of the vampire bats
Desmodus rotundus have been recently reported in the Para state. In this work a retrospective
study was conducted in order to genetic characterize thirty-seven rabies virus strains
obtained from different hosts (including humans), time (between 2000 and 2005) and
geographic regions of the Para state. The N gene nucleotide sequences were partially
obtained from all studied strains and used for phylogenetic reconstruction by the
Neighbor-joining method. The phylogenetic analysis depicted five major clades (I to
V) and grouped the strains isolated in the Para state in three distinct clades: clade I
related to strains associated with the hematophagous bat Desmodus rotundus antigenic
variant (AgV3); clade II, which included a single strain isolated from a frugivorous bat
(Uroderma bilobatum); and clade IV represented by the dog-related antigenic variant
strains (AgV2). Within the clade I, three distinct lineages (I-a, I-b, and I-c) were
identified and their dispersion appeared to be geographically related: two of them
(I-a and I-b) were found in the continental area of the Para state (Southeast, Northeast
and Baixo-Amazonas regions), whereas the lineage I-c was restricted to the Marajo
Island. The association of genetic and ecological data provided a better understand of
the molecular epidemiology of rabies virus strains isolated in the Para state suggesting
that two distinct antigenic variants have been associated with bat-transmitted rabies
cases between 2000 and 2005. Finally, it was demonstrated in this study the presence of at
least three distinct AgV3 genetic lineages in the region, and the emergence of a possible
new antigenic variant distinct from AgV3 strains isolated from the Uroderma bilobatum
bat captured in the Portel municipality where rabies outbreak was reported in 2004.
KEY WORDS
Molecular epidemiology, rabies virus, hematophagous bats
1. INTRODUÇÃO
A raiva é uma encefalite viral aguda, progressiva e incurável (Rupprecht
et al., 2002). O agente causador é um vírus de RNA neurotrópico, o vírus da
raiva, que pertence à ordem Mononegavirales, família Rabdoviridade e gênero Lyssavírus
(Dietzschold et al., 1996; Wagner & Rose 1996; Wu et al., 2002; Fauquet et al.,
2005; Finke & Conzelmann, 2005). Morfologicamente, o vírus da raiva é
semelhante a um projétil, com aproximadamente 180 nm de comprimento por
75 nm de diâmetro (Tordo & Badrane, 2003; Gonçalves J. L. S. et al., 2002;
Woldehiwet, 2002; Guyatt et al., 2003; Fauquet et al., 2005).
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EPIDEMIOLOGIA
MOLECULAR DO VÍRUS DA RAIVA NO ESTADO DO
PARÁ
2000 A 2005:
(DESMODUS ROTUNDUS)
NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
A organização genômica do vírus da raiva consiste de um ácido ribonucléico
de fita única, sentido negativo, não segmentado. Cinco genes (3’-N-P-M-G-L-5’)
monocistrônicos estão relacionados a cinco proteínas virais, são elas:
Nucleoproteína (N); Fosfoproteína (P); Proteína Matriz (M); Glicoproteína (G); e
RNA-Polimerase (L) (Fauquet et al., 2005).
Com o advento de técnicas moleculares, foram realizados numerosos estudos
baseados em comparações na seqüência nucleotídica dos genes N e G, e de
pseudogenes (Ψ) de numerosos isolamentos de Lyssavirus, que permitiram a
identificação e caracterização de sete genótipos (GTs), denominados GT1 a GT7
(Badrane et al., 2001), quais sejam: vírus da raiva Clássico (RV, GT1); Lagos bat virus
(LBV, GT2) (Boulger & Porterfield, 1958); Mokola virus (MOKV, GT3) (Shope et al.,
1970); Duvenhage virus (DUVV, GT4) (Meredith et al., 1971); European bat lyssavirus
tipo 1 (EBLV-1, GT5); (Amengual et al.,1997); European bat lyssavirus, tipo 2 (EBLV2, GT6) (Lumio et al, 1986); e Australian bat lyssavirus (ABLV, GT7) (Gould et al.,
2002; Guyatt et al., 2003).
A raiva é uma enfermidade que ocorre de maneira endêmica em diversos
países do mundo, e seu ciclo epidemiológico pode ser didaticamente dividido em:
ciclo urbano, ciclo rural, silvestre terrestre e silvestre aéreo (Velasco-Villa et al., 2006).
O ciclo urbano é principalmente mantido pelos cães e sua transmissão ocorre de
cão para cão, e este é considerado o principal transmissor de raiva para o
homem, constituindo, esta forma, um grave problema de saúde pública, devido
ao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de companhia
(Rezende et al., 1997; Fernandes, 2001).
O ciclo rural é mantido principalmente no campo por morcegos hematófagos,
que transmitem o vírus em especial para animais de produção. Das três espécies
de morcegos hematófagos existentes no Brasil, Desmodus rotundus é o mais importante
transmissor da doença em herbívoros (Uieda et al., 1998; Rezende et al., 1997;
Fernandes, 2001; Gonçalves M. A. S. et al., 2002).
No ciclo silvestre terrestre, a transmissão do vírus ocorre entre animais, como
raposa, lobo, guaxinim, macaco e quati. É o ciclo de maior prevalência nos países
desenvolvidos, em especial nas regiões em que a raiva urbana está sob controle.
O ciclo silvestre aéreo ocorre entre as diferentes espécies de morcegos, hematófagos
ou não, e apresenta, atualmente, grande importância na manutenção e disseminação
do vírus. Por serem os únicos mamíferos que voam, se deslocando em velocidade,
os morcegos têm a capacidade de transpor grandes distâncias e barreiras geográficas
(Wada et al., 2004).
O ataque de morcegos hematófagos a humanos parece comum em algumas
regiões da América Latina. No Brasil, ano de 1986, município de Boca da Mata,
Estado de Alagoas, na região nordeste, dois casos de raiva humana transmitidas
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por morcegos hematófagos foram registrados. Entre os anos de 1990 e 1992,
foram registrados mais seis casos humanos no Estado da Bahia, sendo um
ocorrido no município de Pintadas, três no município de Aporá e dois casos
no município de Conde (Scheneider & Santos-Burgoa, 1995; Gonçalves
M. A. S, et al., 2002).
Mais recentemente, nos anos de 2004 e 2005, foi relatada a ocorrência de
mais três surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos, no
Estado do Pará. Os primeiros surtos ocorreram nos meses de março e maio de
2004, nos municípios de Portel (mesorregião do Marajó), onde foram relatados
15 óbitos, sendo 10 confirmados laboratorialmente, e Viseu (mesorregião
Nordeste), com seis óbitos, dois dos quais confirmados laboratorialmente. O
terceiro surto ocorreu em junho de 2005, no município de Augusto Corrêa,
onde ocorreram 15 óbitos e 10 foram confirmados por análises laboratoriais
(Wada et al., 2004; Travassos da Rosa et al., 2006). Neste mesmo ano, foram
relatados outros surtos nos municípios de Godofredo Viana, Cândido Mendes,
Carutapera e Turiaçú, Estado do Maranhão, com uma ocorrência de 24 casos
humanos (Brasil, 2005) (Figura 1).
No presente estudo, nós descrevemos a caracterização genética de 37 cepas
de vírus rábico isoladas no Estado do Pará, de diferentes espécies animais incluindo
o homem, ocorridas no período de 2000 a 2005.
Figura 1
Mapa dos estados do Pará e Maranhão onde ocorreram surtos de raiva humana transmitida
por morcegos hematófagos nos anos de 2004 e 2005. Fonte: Ministério da Saúde, Secretaria
de Vigilância em Saúde, 2005.
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NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. AMOSTRAS
O total de 37 cepas do vírus da raiva foram caracterizadas geneticamente neste
estudo (Tabela 1), sendo as mesmas obtidas a partir de tecido nervoso humano e
animal, recebidas pelo laboratório de Diagnóstico de Raiva, da Seção de
Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. Os casos foram
provenientes das seguintes mesorregiões do Estado do Pará: Baixo Amazonas; Marajó;
Metropolitana de Belém; Nordeste Paraense; Sudeste Paraense; e Sudoeste Paraense.
Tabela 1
Relação das cepas do vírus da raiva examinadas neste estudo, isoladas no Estado do Pará,
2000 a 2005, e outras previamente publicadas.
Continua
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Tabela 1 (Continuação)
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EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
2.2. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
As amostras estudadas foram inicialmente diagnosticadas como positivas para
a raiva pela Técnica de Imunofluorescência Direta (IFD) para a detecção de
antígenos virais, e/ou Prova Biológica (PB) obtendo-se o isolamento do vírus rábico.
2.3. EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL E OBTENÇÃO DO DNA COMPLEMENTAR (CDNA)
O RNA viral das 37 amostras foi extraído utilizando o método do reagente
TRIZOL LS (Invitrogen, San Diego, EUA) a partir de uma suspensão preparada
com 1g do tecido nervoso macerado em 1000 µL da suspensão de albumina
bovina a 0,75% em Solução Salina Tamponada, de acordo com as instruções
do fabricante.
A obtenção do cDNA foi feita utilizando a técnica de transcrição Reversa
seguida da Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (RT-PCR), na qual obtevese a amplificação parcial do gene N, mediante RT-PCR em dois passos (Barbosa
et al., 2008). O par de iniciadores específicos utilizados, RABV NF (G G A A G A
G A T A A G A A G A A T G T T T G) e RABV NR (T T G G A G C T G A
C T G A G A C A T A), foram desenhados com base em regiões altamente
conservadas do gene N de diferentes cepas virais e com capacidade de hibridizar
na posição compreendida do nucleotídeo 868 ao 1359. O produto obtido foi
estimado em 491 pb.
Para a obtenção do DNA complementar (cDNA), inicialmente realizou-se a
reação de transcrição reversa (RT) ajustada para o volume final de 10ML, constituída
por: 5µL de RNA (~2-5 ng) e 5µL da mistura de reação que inclui tampão RT 1x
(250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 15mM MgCl2; 0,1 mM EDTA), 0,5
mM dNTP, 10mM, DTT, 10 U/µL de enzima RT (Superscript-II, Reverse
Transcriptase, Invitrogen San Diego, CA); 2,5 µM do iniciador 868 NF
(5’-GGAAGAGATAAGA AGAATGTTTG-3´), e 20 U de inibidor de RNAse
(RNaseOUT – Invitrogen). A RT foi processada em um ciclo de 42ºC durante
90 minutos.
A amplificação do produto da RT foi realizada pela técnica de PCR,
cujo volume da reação foi ajustado para 25µL, contendo: 5µL do produto da
RT (cDNA) e 20 µL da mistura de reação constituída por tampão de PCR
10x (250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 0,1 mM EDTA); 1,5
mM MgCl 2 , 0,2 µM dNTPs, 1 µM de cada iniciador (NF) e 1359 NR
(5´-TTGGAGCTGACTGAGACATA-3´) e 0,05U/µL de DNA polymerase
(Platinum Taq DNA Polymerase). A reação de PCR foi executada com 35 ciclos,
cada um composto por ciclos de 94°C/40 segundos, 55°C/40 segundos, e 74°C/
1 minuto, seguidos de um ciclo adicional de extensão de 72°C/10 minutos. Os
amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,5%, sendo estes produtos
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posteriormente purificados utilizando o kit comercial QIAquick Gel Extraction (Qiagen,
Valência, EUA), de acordo com instruções do fabricante.
2.5. SEQÜENCIAMENTO NUCLEOTÍDICO
A obtenção das seqüências nucleotídicas a partir dos cDNA purificados foi
realizada utilizando o kit ABI PRISM Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster
City, EUA), cujas reações foram processadas em seqüenciador automático, modelo
ABI PRISM 377 (Applied Biosystens).O seqüenciamento foi realizado utilizando
o mesmo par de iniciadores empregados nas reações de RT e PCR.
2.6. ANÁLISE FILOGENÉTICA
As seqüências nucleotídicas das 37 amostras de vírus da raiva foram alinhadas
entre si e com outras seqüencias homólogas disponíveis no banco de dados do
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando o programa Clustal X (Thompson
et al., 1997). As árvores filogenéticas foram construídas usando os métodos de
agrupamento de vizinhos (Neighbor Joining: NJ) (Saitou & Nei, 1987) e máxima
parcimônia (MP) (Swofford, 1999), implementados nos programas computacionais
Mega 3.0 (Kumar, 2004) e PAUP 4.0 (Swofford, 1999). Valores de confidência
foram calculados baseados na divergência nucleotídica de cepas do vírus rábico
isoladas de morcegos, cães, raccon e cepas laboratoriais (vírus fixo), sendo tais valores
determinados em < 3% e < 1% para o grupamento das cepas em clades e subclades, respectivamente.
3. RESULTADOS
3. 1. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL E ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS
O genoma do vírus rábico isolado nas 37 amostras utilizadas neste estudo
foram amplificadas pela técnica de RT-PCR, obtendo-se produtos, que após
seqüenciamento nucleotídico geraram seqüências parciais do gene N com aproximadamente 490 nt e determinadas entre as posições 868 e 1359 do genoma do
vírus da raiva. As seqüências obtidas foram analisadas pelo programa BLAST
search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e identificadas como cepas do vírus da raiva
pertencentes às variantes antigênicas 3 (VAg3) e 2 (VAg2) relacionadas a morcegos
hematófagos da espécie Desmodus rotundus e ao cão doméstico, respectivamente.
3. 2. ANÁLISE FILOGENÉTICA RELACIONADA A VARIANTES ANTIGÊNICAS
A filogenia comparativa foi realizada entre as 37 cepas seqüenciadas neste
estudo e cepas do vírus da raiva provenientes de outros estados brasileiros, cepas
de vírus fixos (AV01; GeneBank: X13357 e CVS: GeneBank: D42112); bem
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NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
como com cepas da variante de “raccoon” (GeneBank: U27218, U27219, U27220
e U27221). A filogenia mostrou a relação de todas as cepas analisadas com o
genótipo I do vírus rábico, sendo separadas em cinco clades principais relacionadas
às distintas variantes antigênicas segundo os critérios de inclusão em clades (divergência genética < 3%) e sub-clades (divergência genética < 0,9%) (Figura 2):
Clade I – cepas relacionadas VAg3 (bootstrap > 80%); Clade II – uma única
cepa isolada de morcego Uroderma bilobatum (Quiropt 18867), capturado na localidade de Ajará, município de Portel, Estado do Pará (bootstrap > 86%); Clade
III cepas relacionadas à variante de “raccoon” (bootstrap > 99%) – Clade IV
cepas relacionadas à VAg2 (bootstrap > 95%); Clade V cepas de vírus fixos
(bootstrap >99%). Embora a amostra do U. bilobatum esteja geneticamente
relacionada às cepas da VAg3 associadas a D. rotundus (Clade I), essa forma uma
clade isolada, o que parece constituir uma nova variante, uma vez que o valor
de divergência genética de 5% foi superior ao valor limítrofe para a formação
de clades (3%).
3. 3. ANÁLISE FILOGENÉTICA RELACIONADA À DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
Quanto à distribuição geográfica, observa-se que dentro da Clade I são
identificadas três subclades distintas (I-a, I-b e I-c), sustentadas por um elevado
valor de bootstrap (>70%) e valores de inclusão de grupo < 0,9%. Observouse a formação de dois grupos geográficos distintos: o grupo Continental, o
qual compreende duas linhagens circulantes representadas pelas subclades
I-a e I-b, cuja divergência genética entre elas é de 1,5%; e o grupo da Ilha
do Marajó onde circula a linhagem relacionada na subclade I-c e que
apresenta uma divergência genética de 2,5% e 2% com as linhagens I-a e I-b,
respectivamente (Figura 2).
Na subclade I-a foram agrupadas as amostras provenientes das mesorregiões
do Baixo Amazonas, representada pela amostra de Belterra (Bov 14664); nordeste
paraense, dos municípios de Augusto Correa, Bragança e Viseu; e sudeste paraense
(municípios de Eldorado dos Carajás, Conceição do Araguaia, Marabá e Xinguará),
além das amostras provenientes do sudeste brasileiro. Enquanto que a subclade I-b,
na qual estão relacionadas as cepas isoladas de morcegos frugívoros do gênero
Artibeus sp. (BR-AL1, BR-AL-2, BR-AL3 e BR-AP1), encontram-se agrupadas quatro
amostras da mesorregião nordeste do Pará, sendo três cepas de Augusto Correa
(Hum 22931, Hum 22899 e Hum 22903) e uma de Viseu (Hum 19222), e duas
amostras da mesorregião do sudeste paraense, sendo uma amostra de São João do
Araguaia (Sui 17738) e uma de Jacundá (Eq 18727). Na subclade I-c encontram-se
agrupadas todas as amostras da mesorregião do Marajó, incluindo os isolamentos
do surto de Portel e uma cepa de Breves (Bov 19671).
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Figura 2
Análise filogenética construída pelo método de NJ utilizando seqüências parcias do gene N
de cepas do VR isoladas no Estado do Pará entre os anos de 2000 a 2006. Valores
acimade cada nó correspondem aos percentuais de bootstap. O valor representado na escala
correspondente a divergência genética de 20% (0,02).
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NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
A clade IV pode ser dividida em duas subclades (bootstrap > 90%, valor de
inclusão de 0 a 0,5%), cujo valor de divergência genética entre elas é de 2,5%. Na
subclade IV-a, estão agrupadas todas as amostras do Pará e uma amostra da
região nordeste do Brasil (Hum 428M), enquanto que na subclade IV-b agrupamse as cepas isoladas nos estados de Goiás, Minas Gerais e São Paulo. As amostras
de VAg-2 provenientes do Estado do Pará foram isoladas das mesorregiões Baixo
Amazonas (municípios de Oriximiná e Santarém), Metropolitana de Belém
(município de Belém), Nordeste do Pará (municípios de Ipixuna do Pará, Mãe do
Rio, Peixe-boi, Salinópolis e Viseu), Sudeste do Pará (municípios de Dom Eliseu,
Jacundá, Marabá, Itupiranga e Ulianópolis) e Sudoeste do Pará (município de
Rondon do Pará).
3. 4. ANÁLISE FILOGENÉTICA X ANÁLISE TEMPORAL E DE HOSPEDEIRO
Nos anos de 2004 e 2005, a maioria dos isolamentos do vírus da raiva foi
proveniente dos municípios de Portel (2004), Viseu (2004) (Travassos da Rosa et al.,
2006) e Augusto Correa (2005) (Barbosa et al., 2008), os quais foram identificados
como VAg3. Esses resultados caracterizam os três surtos ocorridos nestes municípios
como sendo associados a morcegos hematófagos (D. rotundus). Entre os isolamentos
obtidos, observou-se uma grande variedade de hospedeiros infectados (bovinos,
felinos, eqüinos, humanos, quirópteros e suínos). A identificação da VAg3 na
amostra Fel 23167 isolada de um felino procedente de Augusto Correa, que foi
caracterizada tanto a nível genético quanto através da tipificação antigênica por
painel de anticorpos monoclonais (AcM), demonstra a circulação dessa variante
em diversas espécies animais. Um ano após o surto de Viseu, ainda detectou-se a
circulação da VAg3 da linhagem I-a nesse município, a partir de isolamentos de
uma amostra humana (Hum 23433) e de duas bovinas (Bov 23625 e Bov 23717),
muito embora tenha sido também identificada uma cepa de VAg2 de uma
amostra canina (Can 22186).
4. DISCUSSÃO
É notória, de longa data, a distribuição cosmopolita do genótipo I do vírus da
raiva, bem como o seu impacto na saúde pública e na economia mundial, por
promover números significativos de óbitos em humanos e animais de interesse
econômico, respectivamente (Belotto, 2001; Rupprecht et al., 2002). Por isso, o
genótipo I do vírus rábico continua sendo objeto de vários estudos, muito embora
inúmeras pesquisas realizadas tenham melhorado o entendimento sobre esse agente
viral. De fato, vários aspectos do ciclo biológico, modo de transmissão, caracterização molecular e epidemiologia, produção de vacinas, dentre outros têm sido
amplamente descritos e recentemente revistos (Rupprecht et al., 2002).
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Por outro lado, os estudos moleculares do vírus rábico têm claramente
demonstrado a importância da obtenção de seqüências nucleotídicas que
possibilitem traçar estratégias moleculares para uma detecção rápida, sensível e
específica do vírus rábico. Em termos de filogenia, o gene N vem sendo
amplamente utilizado mostrando-se eficaz em ressaltar pequenas variações
filogenéticas que permitem a identificação dos diferentes genótipos virais (Heaton
et al., 1997) o que tem permitido uma abordagem mais completa da caracterização
viral e o reconhecimento do relacionamento das espécies hospedeiras e também
sua distribuição geográfica, contribuindo de forma decisiva na compreensão
da epidemiologia molecular da raiva (Kissi et al., 1995; Nadin-Davis, 1998;
Badrane et al., 2001).
O complexo ciclo de manutenção do vírus rábico envolve diversos hospedeiros,
que apresentam uma estreita relação às variantes antigênicas específicas, determinadas
através de um painel de AcM produzidos pelo CDC/Atlanta(EUA). No Brasil,
são encontradas quatro variantes: VAg2, VAg3, VAg4 e VAg6. Na espécie canina
(Canis familiaris) é comumente identificada a VAg2. A VAg 3 é característica de
morcego hematófago da espécie Desmodus rotundus, também sendo comumente
encontrada em animais de produção (bovino, eqüino, suíno, caprino, etc.), visto
que o D. rotundus apresenta um hábito alimentar eletivo, obtendo preferencialmente sangue desses animais. As variantes VAg4 e VAg6 têm sido encontradas em
morcegos insetívoros das espécies Tadarida brasiliensis e Lasiurus cinereus, respectivamente (Favoretto et al., 2002; Diaz et al., 1994). O homem e os felinos domésticos
são considerados hospedeiros acidentais, podendo ser infectados pelas variantes
VAg2 e VAg3, sendo que cães e morcegos hematófagos D. rotundus são os principais
transmissores dessas variantes, respectivamente (Kobayashi et al., 2006). O estudo
realizado com amostras isoladas no Estado do Pará corrobora os dados da literatura,
onde se verifica a circulação da variante VAg2 entre humanos (Hum 11950 e
Hum 13597) e gatos domésticos, além do cão, e da variante VAg3 das espécies
humana, felina (Fel 23167), bovina, eqüina e suína.
A análise filogenética dos 37 isolamentos estudados identificou linhagens
distintas entre as variantes circulantes no Pará, demonstrando uma importante
correlação dessas linhagens com a distribuição geográfica, dentro do estado e em
relação ao restante do país. Com efeito, todas as amostras de VAg2 do Estado do
Pará estudadas, independente da mesorregião, são estreitamente relacionadas entre
si e com a amostra VAg2 proveniente do nordeste brasileiro (Hum 428M; GeneBank:
AY563516), o que se deve, provavelmente, à proximidade geográfica do Pará
com o estado nordestino do Maranhão e o intenso fluxo de imigrantes e seus
animais domésticos entre as duas regiões (Norte-Nordeste). Tais amostras, por sua
vez, são claramente distintas da linhagem VAg2 circulante no centro-oeste e
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PARÁ
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(DESMODUS ROTUNDUS)
NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
sudeste do país, sugerindo que ambos os grupos filogenéticos (IV-a e IV-b)
apresentam origem evolutiva diferente.
Quanto a VAg3, o filograma mostrou um ancestral comum que deu origem a
três linhagens no Estado do Pará, sendo duas circulantes na região continental e
uma restrita à ilha do Marajó. Os dados demonstraram que na parte continental
do Pará circulam duas linhagens da variante de D. rotundus: uma (I-b) que se
relacionou às amostras isoladas de morcegos frugívoros do gênero Artibeus,
capturados no Estado de São Paulo, em 1998 (Shoji et al., 2004) e uma outra (I-a)
isolada de morcegos D. rotundus capturados também no Estado de São Paulo (Ito
et al., 2003). Ambas as linhagens encontram-se circulantes nas mesorregiões
Nordeste e Sudeste do Estado do Pará, muito embora possa se observar uma
predominância da linhagem I-a, sobretudo nas amostras isoladas nos municípios
de Augusto Correa e Viseu.
A inserção da amostra Bov 19671 proveniente do município de Breves
juntamente com as amostras do surto de Portel, em 2004, ambos os municípios
localizados na mesorregião paraense do Marajó, reforça a idéia de que a Ilha do
Marajó constitui um nicho singular para a manutenção do ciclo silvestre aéreo do
vírus da raiva com a circulação de uma linhagem distinta da VAg3, como foi
descrito em outros trabalhos (Travassos da Rosa et al., 2006; Barbosa et al., 2008).
Interessante, além da VAg3, pode estar circulando no Marajó uma possível nova
variante antigênica (Quiropt 18867) isolada a partir de um morcego frugívoro da
espécie Uroderma bilobatum capturado na localidade de Ajará, em Portel, durante a
ocorrência do surto em 2004. Vale ressaltar que essa informação baseia-se tanto
na tipificação antigênica, visto que esta amostra apresentou um padrão de leitura
diferenciado das variantes antigênicas circulantes na América Latina, reagindo
com os oito AcM disponíveis (C1, C4, C9, C10, C12, C15, C18, e C19), quanto
pelo seqüenciamento parcial do gene N, já que a análise filogenética sugeriu que
esta amostra está relacionada com a variante de D. rotundus, porém apresentando
divergência genética suficiente para ser considerada como uma nova variante.
Os dados da literatura têm mostrado que morcegos frugívoros são hospedeiros
de variantes antigênicas específicas, tal como a VAg4 identificada em morcegos
da espécie Tadarida brasiliensis e a VAg6 identificada em morcegos Lasiurus cinereus
(Uieda, 1998; Velasco-Villa et al., 2006). Vale ressaltar que com base no estudo
das caracterizações antigênicas têm sido sugeridas possíveis novas variantes como
observado para a amostra de sagüi Callithrix jacchus isolado no Estado do Ceará
(Morais et al., 2000; Favoretto et al., 2001). É interessante assinalar, no entanto,
que para confirmação da hipótese de uma nova variante do vírus da raiva circulando
na ilha do Marajó, estudos adicionais tornam-se necessários, incluindo a
caracterização molecular completa do gene N.
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De acordo com dados da Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS),
Belotto (2003) cita que entre os anos de 1995 e 2000 os morcegos hematófagos
ocuparam o segundo lugar na transmissão da raiva humana na América Latina,
superados apenas pelos cães, e ainda mostraram que, no período, foram notificados
105 casos de raiva humana transmitida por D. rotundus nas Américas, representando
20% do total. A emergência dos casos de raiva transmitida por morcegos deve-se
em parte à melhoria das ações dos programas de controle da raiva de animais
domésticos, o que permitiu a redução progressiva do número de casos positivos,
principalmente de cães. Em decorrência disso, o morcego tem emergido como o
mais importante transmissor da raiva atualmente na América Latina, como tem
sido descrito para os países que controlam a raiva transmitida pelos animais
domésticos (Rupprecht, et al., 2002; Toporovski et al., 2005).
Esta situação também se reflete no Brasil, e, em particular, no Estado do
Pará, que, com base em um levantamento atualizado da raiva realizado no período
de 2000 a 2005, foi demonstrada uma importante diminuição do número de
casos de raiva humana relacionados ao cão e um aumento considerável de casos
associados à transmissão por morcego (Travassos da Rosa, comunicação pessoal/
IEC), conseqüência dos surtos notificados nos municípios paraenses de Viseu e
Portel, em 2004 (Travassos da Rosa et al., 2006), e Augusto Correa, em 2005
(Barbosa et al., 2008).
Finalmente, a associação de dados genéticos e ecológicos pode fornecer
informações mais precisas e melhorar o entendimento a respeito da evolução do
vírus rábico e, talvez, explicar a emergência de novas variantes e linhagens
genéticas deste agente viral como resultado de fatores seletivos associados ao
hospedeiro, auxiliar na prevenção de futuros surtos de raiva, bem como auxiliar
na melhora e desenvolvimento de medidas de controle mais eficazes para a região.
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J A N E I R O , 15 (3): 329 - 348, 2007
EPIDEMIOLOGIA
MOLECULAR DO VÍRUS DA RAIVA NO ESTADO DO
PARÁ
2000 A 2005:
(DESMODUS ROTUNDUS)
NO PERÍODO DE
EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS
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