risco de transmissão do vírus da anemia infecciosa

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
RISCO DE TRANSMISSÃO DO VÍRUS DA ANEMIA
INFECCIOSA EQUINA POR EQUÍDEOS ERRANTES NO
MUNICÍPIO DE MOSSORÓ-RN.
Paulo Henrique Cavalcante
Médico Veterinário
Mossoró – RN - BRASIL
Julho de 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
RISCO DE TRANSMISSÃO DO VÍRUS DA ANEMIA
INFECCIOSA EQUINA POR EQUÍDEOS ERRANTES NO
MUNICÍPIO DE MOSSORÓ-RN.
Paulo Henrique Cavalcante
Orientador: Prof. Dr. Sidnei Miyoshi Sakamoto
Dissertação apresentada à Universidade Federal
Rural do Semi-Árido – UFERSA, Campus de
Mossoró, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Mossoró – RN - BRASIL
Julho de 2009
Ficha catalográfica preparada pelo setor de classificação e
catalogação da Biblioteca “Orlando Teixeira” da UFERSA
C376r
.
Cavalcante, Paulo Henrique
Risco de transmissão do vírus da Anemia Infecciosa
Equina por eqüídeos errantes no Município de Mossoró-RN. /
Paulo Henrique Cavalcante. -- Mossoró: 2009.
45f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal: Área de
concentração em Sanidade animal) – Universidade Federal
Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de Pós-Graduação.
Orientador: Prof.º Dr. Sc. Sidnei Miyoshi Sakamoto
1.Anemia infecciosa eqüina. 2.Animais errantes. 3.ELISA.
4. IDGA. I.Título.
CDD:636.10896
Bibliotecária: Marilene Santos de Araújo
CRB-5/1033
Paulo Henrique Cavalcante
RISCO DE TRANSMISSÃO DO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA POR
EQUÍDEOS ERRANTES NO MUNICÍPIO DE MOSSORÓ-RN
Dissertação apresentada à Universidade Federal
Rural do Semi-Árido – UFERSA, Campus de
Mossoró, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
.
APROVADA EM: 17/07/2009.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof. Dr. Sidnei Miyoshi Sakamoto (UFERSA)
Orientador
___________________________________________________
Prof. Dr. Raimundo Alves Barrêto Júnior (UFERSA)
Conselheiro
____________________________________________________
Prof. Dr. Franklin Riet Correa Amaral (UFCG)
Conselheiro
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
PAULO HENRIQUE CAVALCANTE – Nascido no Município de Mossoró-RN
no dia 27/03/1983, Médico Veterinário graduado pela Universidade Federal Rural do
Semi-Árido (UFERSA) em 2005.2, onde foi monitor de duas disciplinas e bolsista do
CNPq durante um ano, recebendo ao final do curso uma declaração de primeiro
lugar da turma concluinte. Em 2007 foi selecionado pelo Programa em PósGraduação em Ciência Animal pela UFERSA, defendendo seu título em Julho de
2009. Em agosto de 2008 é aluno do Curso de Pós-Graduação em Diagnóstico e
Cirurgia de Eqüinos pela Faculdade de Jaguariúna. Desde o final de sua graduação,
trabalha como Médico Veterinário Autônomo de Grandes Animais atuando a nível de
campo no Município de Mossoró-RN e regiões circunvizinhas nos seguintes ramos:
Clínica e Cirurgia de Grandes Animais.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por continuar iluminando meu caminho todos os dias
da minha vida.
Aos meus pais José Everaldo Cavalcante e Maria Alves Ferreira Cavalcante
pelo apoio incondicional em todas as minhas decisões e por mostrar que somos
capazes de conseguir tudo que queremos.
Aos meus queridos irmãos Cynthia Renée Cavalcante e Fábio Eduardo
Cavalcante pela boa convivência em casa e pela união que cada dia que passa nos
mostram que somos verdadeiramente felizes.
À meu cunhado do coração Marcelo Pinheiro Costa pelo respeito e boa
convivência com toda minha família.
À minha querida e amada sobrinha Maria Fernanda pelo amor derramado em
nossos corações com o seu nascimento.
Ao meu orientador Dr. Sidnei Miyoshi Sakamoto que aceitou mais uma vez a
proposta de trabalharmos juntos e pelos ensinamentos passados a mim em todas as
nossas conversas.
À minha querida “quase orientadora” Dra. Valéria Veras de Paula e ao meu
amigão Dr. Raimundo Alves Barrêto Júnior, pela confiança depositada em mim, pelo
apoio nas minhas decisões e pelo incentivo.
À Clarissa Barbosa de Freitas pelo excelente convívio, pela sua calma e
personalidade forte, mostrando que ainda existem pessoas maravilhosas nesse
mundo.
Aos meus quase irmãos Talles Vinícios e Israel Gustavo pela companhia em
todas as horas (aí sim posso dizer que são “Pau pra toda obra”) e pelos bons
momentos vividos no “Grupo Cavalcante de Vaquejada”.
À minhas “companheiras de trabalho”: Ariana Paiva e Isabella Oliveira
(diretamente de ODB), pela confiança depositada em mim e pelas inúmeras e
incontáveis ajudas no meu trabalho.
À Valéria Amanda, principalmente pelos conselhos sempre bem vindos.
Aos professores Jean Berg e Carlos Iberê por estarem sempre dispostos a
ajudarem.
Aos funcionários do HOVET: Seu Alcides, Dr. Paulinho, Erinaldo, Airton,
Glênia, Marluce, Seu Zé Rosado e André, por todos os dias de boa convivência e
brincadeiras nas horas vagas.A Rômulo Cerqueira Leite, chefe do Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da UFMG, por colocar a
disposição o laboratório para realização dos exames.
Aos professores Marcos Bryan Heinemann e Andrey Pereira Lage e seus
orientados e orientadas pelo apoio logístico e amizade.
Ao professor Jenner Karlysson Pimenta dos Reis, líder do Retrolab, pela
tecnologia e pelo seu conhecimento passado.
À Prefeitura Municipal de Mossoró e seus funcionários (Carlinhos, Nazareno e
Irenilson), por disponibilizar os animais para as coletas de sangue e pela ajuda na
mesmas.
E por fim, a todos os animais, com atenção especial aos EQUÍDEOS, por
serem o maior motivo pra que eu possa correr atrás dos meus objetivos e ser um
excelente Médico Veterinário, podendo assim retribuir todas as alegrias passadas
por esses animais.
I
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO __________________________________________________________________ 1
2 OBJETIVOS____________________________________________________________________ 3
3 REVISÃO DE LITERATURA _______________________________________________________ 4
3.1 ETIOLOGIA __________________________________________________________________ 4
3.2 EPIDEMIOLOGIA _______________________________________________________________ 5
3.2.1 Ocorrência ______________________________________________________________ 5
3.2.2 MODOS DE TRANSMISSÃO ______________________________________________________ 6
3.3 PATOGÊNESE ________________________________________________________________ 6
3.4 SINAIS CLÍNICOS ______________________________________________________________ 8
3.5 DIAGNÓSTICO ________________________________________________________________ 9
3.5.1 Imunodifusão em Agar gel (IDGA) __________________________________________ 10
3.5.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ________________________________ 11
3.5.3 Outros Métodos de Diagnóstico ____________________________________________ 12
4 MATERIAL E MÉTODOS ________________________________________________________ 13
4.1 CRITÉRIO DE INCLUSÃO NO ESTUDO _________________________________________ 13
4.3 REALIZAÇÃO DOS TESTES __________________________________________________ 15
4.3.1 IDGA _________________________________________________________________ 15
4.3.2 ELISA rgp90 ___________________________________________________________ 15
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ______________________________________________________ 16
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ___________________________________________________ 17
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________________ 24
II
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%
Porcentagem
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AIE
Anemia Infecciosa Equina
C-ELISA
Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dpi
Dias pós-inoculação
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FC
Frequência cardíaca
FR
Frequência Respiratória
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
IDGA
Imunodifusão em Gel de Àgar
MAPA
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
ºC
Graus Celsius
OIE
Office Internacional des Épizooties
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PMM
Prefeitura Municipal de Mossoró
RNA
Ácido Ribonucleico
UFERSA
Universidade Federal Rural do semi-árido
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
VAIE
Vírus da Anemia Infecciosa Equina
WB
Western Blotting
III
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Análise de concordância entre os testes sorológicos, realizados por IDGA e
ELISA para o diagnóstico da AIE em asininos, equinos e muares de Mossoró-RN
(2009). ___________________________________________________________ 20
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Rebanho de equinos, asininos e muares no Brasil e no Nordeste segundo
o IBGE (2007). A) Número de animais; B) Participação da Região Nordeste no
rebanho nacional em números relativos. ______________________________________ 1 Figura 2 – Eqüídeos errantes nas ruas de Mossoró-RN. Fonte: Cavalcante, 2008. 13 Figura 4 – Modelo da ficha de cadastro dos animais __________________________ 14 Figura 5 – Equideos errantes incluído no estudo classificados por espécie e sexo.
Mossoró-RN, 2009________________________________________________________ 17 Figura 6 – Box Plot apresentando a dispersão da idade dos animais conforme a
espécie. _________________________________________________________________ 17 Figura 7 – Distribuição em mediana e quartis da idade dos animais agrupados por
espécie. _________________________________________________________________ 19 Figura 8 - Curral de recolhimento de animais errantes da PMM, onde paralelamente
às colheitas, foi realizado exame físico dos animais para verificar associação entre
achados clínicos e resultados dos testes sorológicos. Fonte: Cavalcante, 2009. __ 21 LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Elementos genéticos e fases abertas de leitura (orf’s*) localizados no
genoma do VAIE 31 ________________________________________________________ 4 Quadro 2 - População de eqüinos, asininos e muares segundo Censo Agropecuário
de 2007 (IBGE, 2007). ____________________________________________________ 31 Quadro 3 - Informações colhidas dos eqüídeos errantes em Mossoró-RN, 2009. __ 32 IV
RISCO DE TRANSMISSÃO DO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA POR
EQUÍDEOS ERRANTES NO MUNICÍPIO DE MOSSORÓ-RN.
CAVALCANTE, Paulo Henrique. Risco de transmissão da Anemia Infecciosa Equina
por Equídeos Errantes no Município de Mossoró-RN. 2009. 44f. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal: Produção e Sanidade Animal) - Universidade Federal
Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2009.
RESUMO: Este trabalho teve como objetivo detectar a ocorrência e avaliar o
risco potencial de transmissão da Anemia Infecciosa Eqüina (AIE) em eqüídeos,
principalmente asininos e muares errantes de Mossoró. Durante um período de nove
meses, foram colhidas amostras de soro, de 33 equinos, 112 asininos e cinco
muares e realizada pesquisa sorológica pelas provas de IDGA e ELISA (antígeno
recombinante rgp90). Dos 150 animais analisados, todos os quatro soros positivos
na IDGA foram positivos também no ELISA mas, seis soros adicionais foram
positivos apenas no ELISA. Estes resultados conflitantes podem ser justificados
porque asininos e muares produzem títulos de anticorpos contra o vírus da AIE
abaixo do limiar de detecção da IDGA. Adicionalmente, sabe-se que anticorpos
contra gp90 são detectados precocemente e em títulos mais altos que p26. Discutese as conseqüências da falta de um teste diagnóstico oficial confiável para a AIE em
asininos e muares e propõe-se medidas a serem aplicadas aos eqüídeos errantes.
Palavras Chave: Anemia Infecciosa Eqüina, IDGA, ELISA, gp90, animais errantes
V
ERRANT EQUIDS AS A RISK OF TRANSMISSION OF EQUINE INFECTIOUS
ANEMIA VIRUS IN MOSSORÓ-BRAZIL.
CAVALCANTE, Paulo Henrique. Errant equids as a risk of transmission of Equine
Infectious Anemia Virus in Mossoró-Brazil. 2009. 44Pp. Thesis (Master’s degree In
Animal Science: Animal Production and Animal Health) - Universidade Federal Rural
do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2009.
Abstract - In order to detect the occurrence and evaluates the potential risk of
equine infectious anemia (EIA) transmission between equids, mainly errant mules
and donkeys from Mossoró. During a period of nine months, serum samples were
collected from 33 horses, 112 donkeys and five mules. Serological survey were
performed by AGID and ELISA (recombinant antigen rgp90). All four sera positive in
AGID were positive in the ELISA, but six additional sera were positive only in ELISA.
These misclassification may be explained because donkeys and mules produce
antibodies titers to EIA virus below the threshold of AGID. Moreover, it is known that
antibodies against gp90 are detected early and in higher concentrations than p26. It
discusses the consequences of the lack of a reliable official diagnostic test for EIA in
donkeys and mules and proposed measures to be applied to errant equids.
Keywods: equine infectious anemia, IDGA, ELISA, gp90, errant animals
1
1 INTRODUÇÃO
Dados recentes estimam a população total de eqüídeos no Brasil (Anexo 1)
em 8.110.655 animais, distribuídos como 5.602.053 (69,1 %) equinos, 1.163.316
(14,3 %) asininos e 1.343.279 (16,6 %) muares. O Nordeste alberga 39,2% dos
eqüídeos no país, porém contribuindo com 91,4 % dos asininos justificando-os como
espécie símbolo da região.
Figura 1 – Rebanho de equinos, asininos e muares no Brasil e no Nordeste segundo o IBGE
(2007). A) Número de animais; B) Participação da Região Nordeste no rebanho nacional em
números relativos.
6.000.000
5.000.000
4.000.000
Brasil
Nordeste
3.000.000
2.000.000
1.000.000
0
Equino
Asinino
Muar
Seguindo um fenômeno não isolado, a equideocultura no Município de
Mossoró vem crescendo a cada dia, incentivada principalmente pela prática das
vaquejadas, um esporte muito difundido no Nordeste, sendo as mesmas
consideradas "Grandes Eventos Populares", atraindo um público numeroso onde
quer que aconteçam 49.
Entretanto, a anemia infecciosa equina (AIE) é hoje, um grande obstáculo
para o desenvolvimento desta atividade, por ser uma doença transmissível e
incurável, acarretando prejuízos aos proprietários que necessitam do trabalho
desses animais e aos criadores interessados na melhoria das raças, além de impedir
o acesso ao mercado internacional 1.
2
Também conhecida como febre dos pântanos, a AIE foi a primeira doença
animal associada a um vírus
31
e embora os estudos se concentrem em cavalos e
pôneis., considera-se que todos os eqüídeos são susceptíveis
13
, representando
atualmente sua doença infecciosa mais importante. Uma vez que um animal é
exposto ao vírus da AIE (VAIE), assume-se que ele se tornará positivo em uma
prova sorológica para a detecção de anticorpos contra antígenos do agente e esta
condição permanecerá por toda a vida do animal. Esta premissa é o alicerce para a
vigilância da doença.
O rebanho de equídeos do Município de Mossoró mantém-se numa média de
aproximadamente
2470
animais
desde
1990,
sendo
este
composto
aproximadamente por 49% de asininos, 36% de equinos e 15% de muares 8. Porém,
como observado em muitas cidades da Região Nordeste, encontram-se à margem
do Censo oficial, animais soltos nas vias públicas. Os então chamados animais
errantes são classificados em: sem controle (abandonados ou sem dono) e semicontrolados (animais que vivem soltos, apesar de terem proprietário)
56
. A Prefeitura
Municipal de Mossoró, dispõe de um serviço de recolhimento diário desses animais,
cumprindo rotas pré-determinadas (próximos às rodovias e vias principais), bem
como são apreendidos animais em qualquer outro ponto da cidade mediante
solicitação ou denúncia. Os animais são alocados em um curral coletivo, onde
esperam por seus respectivos donos durante um período de até seis dias. Caso não
sejam resgatados, são libertados em local ermo.
Entretanto, este trabalho é pioneiro na abordagem do risco sanitário potencial
de equídeos errantes, principalmente asininos e muares cujas informações são
escassas e tem como objetivo estabelecer um banco de soros para a identificação
de animais infectados, primeiramente pelo vírus da AIE e, posteriormente fazer o
diagnóstico de outros agentes etiológicos.
3
2 OBJETIVOS
Geral:
¾ Detectar a ocorrência e avaliar o risco potencial de transmissão da AIE em
eqüídeos, principalmente asininos e muares errantes de Mossoró;
¾ Estabelecer um banco de informações e de amostras biológicas para o
diagnóstico de outros patógenos de eqüídeos.
Específicos
¾ Realizar pesquisa sorológica para o VAIE em eqüídeos errantes no Município
de Mossoró-RN pelas provas de IDGA e ELISA (antígeno rgp90)
¾ Propor medidas de prevenção e controle da AIE aplicável aos eqüídeos
errantes;
4
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Etiologia
O vírus da AIE (VAIE) foi não apenas o primeiro “agente filtrável” a ser
associado com infecção animal como também esteve perto de ter sido o primeiro
vírus descoberto, com sua descrição por Vallée e Carré em 1904 pouco tempo
depois do vírus do mosaico do tabaco, embora seu caráter contagioso já tivesse sido
constatado por Anginiard em 1859 10, 31.
O VAIE pertence à família Retroviridae
todos os equídeos
24
4, 53
e gênero Lentivirus
10
. Acomete
. Seu genoma é composto por duas fitas simples de RNA não
complementares de 8,2 kb — o menor e mais simples entre os lentivirus. Um resumo
dos elementos, bem como das fases abertas de leitura contidos no genoma viral
está apresentado no Quadro 1, conforme revisão de Leroux (2004) 31.
Quadro 1 Elementos genéticos e fases abertas de leitura (orf’s*) localizados no genoma do
VAIE 31
orf*
Proteína
Função
p26 – capsídeo
envoltório em torno do nucleocapsídeo
p15 – matriz
face interna do envelope
Gag
p11 nucleocapsídeo
proteínas ligantes de RNA
p9
transcriptase reversa
Pol
integração no genoma hospedeiro
integrase
protease
superfície externa interação
vírusgp90
do envelope
receptor e penetração
Env
na célula
gp45
transmembrana
Tat
controle da replicação e propriedades
Tat
patogênicas
Rev
Ver
S2
S2
U3’
LTR (região de
elemento
seqüência promotora – regulação da
R
terminação
não
transcrição e mediação da integração no
longa)
transcrito
genoma hospedeiro
U5’
*orf: open reading frame – fase aberta de leitura
As funções dos fatores e elementos enumerados no Quadro 1 estão descritos
na seção 3.3 – Patogênese.
5
3.2 Epidemiologia
3.2.1 Ocorrência
A AIE é uma enfermidade cosmopolita mas, devido à sua transmissão por
insetos vetores, predomina em climas quentes e úmidos
48
. Há poucos estudos de
prevalência planejados, ficando os dados limitados a relatórios de exames
sorológicos dos laboratórios oficiais. Sabe-se que muitos animais não são
diagnosticados, tendo como exemplo, a França, onde somente 12 mil animais são
testados anualmente a partir de uma população estimada de 350 mil animais
31
ea
pesquisa sorológica é feita visando o controle da movimentação animal, mais do que
para um programa sistemático de vigilância epidemiológica 25.
No Brasil, os primeiros relatos da doença datam de 1950, mas apenas em
1967, a AIE foi oficialmente reconhecida através de lesões anatomopatológicas de
animal necropsiado no Jockey Clube do Rio de Janeiro 44.
Um estudo de prevalência da AIE no Estado do Acre, no período de 1986 a
1996, foi realizado por análise de dados secundários referentes a 9963 animais
submetidos ao teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) provenientes de
1891 propriedades. As prevalências calculadas foram 14,5% para propriedades e
7,5% para animais 55.
No Município de Uruará-PA, localizado na Amazônia Oriental, foram
pesquisadas as soroprevalências de diversas doenças, entre elas a AIE. A partir de
uma população de 2069 propriedades
rurais, foram estimadas por amostragem
prevalências de 53% de propriedades com pelo menos um animal soropositivo e de
17,71% para animais 20.
As amostras de sangue, de 6540 eqüídeos de 1940 rebanhos foram
coletadas no período de setembro de 2003 a março de 2004, nos 853 municípios do
Estado de Minas Gerais. Foram utilizados dois testes de laboratório em seqüência:
ELISA com antígeno recombinante gp90, e IDGA. As prevalências foram de 5,3%
(IC=4,3 a 6,3%) para rebanhos e de 3,1% (IC=2,2 a 3,9%) para animais. O Estado
de Minas Gerais foi considerado área endêmica para AIE. As mais altas
prevalências para rebanhos e para animais foram encontradas na região
6
Norte/Noroeste, seguida pela região Vale do Mucuri/Jequitinhonha 1.
3.2.2 Modos de transmissão
O vírus é transmissível a todos os equídeos, sem que haja qualquer
preferência por raça, sexo e idade, através da picada de insetos hematófagos, como
a mosca dos estábulos (Stomoxys calcitrans) e a mosca dos cervos (Chrysops spp)
como as mais incriminadas
16
e fontes iatrogênicas, tais como: agulhas, seringas,
esporas, freios, arreios ou outros utensílios contaminados com sangue infectado.
Eqüinos febris e com outros sinais clínicos de AIE têm título mais elevado de
viremia e muito maior probabilidade de servir como fonte de transmissão da doença
que os portadores inaparentes. O titulo de vírus dos eqüinos infectados sofre
redução considerável entre os episódios clínicos, momentos em que a sua
propensão a doença diminui. O vírus da AIE pode cruzar a placenta, havendo relatos
de transmissão in útero 50.
A infecção intra-uterina pode ocorrer e resultar no abortamento ou nascimento
de potros infectados, que frequentemente morrem dentro de dois messes 48.
Outra forma de transmissão é via leite e/ou colostro, que ocorre comumente
se a mãe sofre uma reação febril aguda, acompanhada de viremia com alto título 28.
O vírus também é capaz de invadir através das mucosas bucal e nasal
intactas, feridas e, mesmo, pele intacta, mas essas portas são provavelmente de
menor importância nos surtos a campo. A transmissão da infecção de eqüino a
eqüino parece possível através de swabs usados para coletar saliva para testes de
doping. Ela pode ser transmitida no sêmen de garanhão infectado 48.
3.3 Patogênese
O VAIE é macrófago-trópico e o receptor celular para ele é membro da família
de proteínas receptoras para Fator de Necrose Tumoral
65
. As interações funcionais
entre o receptor e a proteína gp90 foram mapeados recentemente
66
. Estes estudos
7
são importantes porque sabe-se que a gp90 apresenta uma superfície com domínios
variáveis e conservados. A análise da reatividade desses peptídeos contra o soro de
pôneis
infectados
experimentalmente
demonstrou
que
a
resposta
contra
determinantes antigênicos contidos nos domínios conservados da gp90 apareceu
antes e com títulos mais elevados do que anticorpos contra determinantes
apresentados nos domínios variáveis. Estas observações contribuem para explicar o
estabelecimento do controle imunológico das infecções pelo VAIE
viremia associados ao desenvolvimento de quasispécies
5, 17
14, 22, 32, 33, 35
com ciclos de
.
Variações na seqüência LTR também são importantes na formação de
quasispécies durante infecções persistentes
34
tecidos durante infecções crônicas inaparentes
e na compartimentalização em
40, 52
. Alterações nesta seqüência
podem desenvolver linhagens com virulência acentuada
11, 41
. Aplicando infecção
experimental em pôneis, avaliou-se que durante a fase aguda da doença, o sítio
predominante de infecção e replicação foi o baço, que contribuiu com 90% da carga
viral, mas na fase inaparente, outros tecidos serviram para manutenção do vírus
(fígado, medula e córtex renais, linfonodos periféricos e medula óssea)
19
. Além dos
macrófagos, células endoteliais podem ser infectadas, gerando a hipótese de
estarem envolvidas na formação do edema que pode estar associado à infecção.
Estas células também podem ser persistentemente infectadas servindo como
reservatório para o vírus nas fases subclínicas da infecção 39.
Monócitos do sangue podem ser infectados, mas a transcrição viral é limitada
até a célula se diferenciar em macrófagos teciduais - um fenômeno chamado de
"cavalo de Tróia. Esta regulação ocorre provavelmente pela ligação das seqüências
LTR virais com fatores de transcrição celulares
52
. Outros fatores relatados na
regulação da atividade viral são: i) atividade dUTPase está presente no gene Pol e é
importante para a eficiência da replicação viral em macrófagos in vitro e in vivo,
conforme demonstrado em estudo com vírus mutante deficiente daquela atividade 35;
ii) atividade de transativação de Tat influencia eventos regulatórios da expressão
gênica e infectividade do VAIE e depende de interações com fatores de transcrição
célula-específicos 15, 38.
Em potros experimentalmente infectados foram quantificados anticorpos
imunoprecipitantes e, aqueles que reconheceram gp90 e gp45 apresentaram títulos
10 a 100 vezes maiores que para proteína estrutural interna p26. Baixos níveis de
anticorpos neutralizantes apareceram 23 a 46 dias pós-infecção, demonstrando que
8
altos níveis de atividade anti-glicoproteínas não têm ação antiviral 45.
Nas fases iniciais da infecção, o controle da viremia coincide com o
aparecimento de linfócitos T citotóxicos, o que ocorre antes do aparecimento de
anticorpos neutralizantes. Em cavalos portadores, o tratamento com drogas
imunossupressoras resultam em viremia antes que mudanças nos títulos de
anticorpos neutralizantes ocorram
43
. Assim, o controle imunológico da infecção
durante o estágio clinicamente inaparente parece depender de uma combinação
complexa de mecanismos do sistema imunológico que funciona plenamente maduro
de 6 a 8 meses pós-infecção 18, 35, 67.
3.4 Sinais Clínicos
O vírus causador da AIE é o único no grupo dos lentivirus em que há uma
febre aguda inicial com uma viremia associada, seguida por ciclos recorrentes da
doença e, finalmente, um período assintomático prolongado 12.
A doença se manifesta clinicamente de diferentes formas, sendo possível a
reversão de uma forma a outra, a qualquer instante. Os sintomas gerais nos casos
agudos e subagudos são de febre intermitente oscilando entre 39 e 41˚C, anorexia,
fraqueza, anemia, e a morte poderá ocorrer entre 10 e 30 dias após o inicio dos
sintomas. Ainda na forma aguda da doença, os animais jovens podem apresentar
forte prostração e andar cambaleante. Pode-se notar palidez de mucosas e
hemorragias petequiais, ou ainda icterícia e edema nas partes baixas do corpo 12.
Nos casos crônicos ativos, o eqüino apresenta períodos de febre de 1 a 7
dias e, a seguir, podem voltar a normalidade por algumas semanas, para,
posteriormente, principalmente sob condições de estresse e de má nutrição,
manifestar novamente os sintomas. Eventualmente, sob condições de intenso
estresse, o quadro pode voltar a forma aguda e a doença provocar a morte do
animal. Os períodos de melhora do quadro clinico e recaídas podem se prolongar
por muito tempo, ou mesmo os casos crônicos serem assintomáticos, transformando
o cavalo em portador inaparente sem qualquer sinal da doença 12.
Os
achados
clinicopatológicos
e laboratoriais em mulas, infectadas
naturalmente ou experimentalmente com o VAIE, foram similares aqueles
9
observados em cavalo e pôneis 61.
A terapia prolongada com corticosteróides pode causar recidiva e mesmo na
ausência de doença clinica
43
, os animais infectados desempenham sua função de
modo menos eficiente do que os não-infectados. Os animais infectados apresentam
também um considerável aumento de volume do baço que pode ser detectável pelo
reto e as éguas prenhes podem abortar 48.
Durante um ensaio, foram infectados experimentalmente pôneis (Equus
caballus) e asininos com duas cepas do VAIE de virulências distintas. Observou-se
durante 365 dias que os quatros pôneis inoculados apresentaram sinais clínicos da
doença (vários episódios de febre, anorexia, depressão, caquexia, declínio do
número de plaquetas e do valor do hematócrito) a partir de 17 dpi. Os asininos não
apresentaram nenhuma manifestação clínica durante o período do experimento (365
dias), independente da cepa inoculada, com exceção de declínio transitório de
plaquetas entre os dias 24 à 59 dpi 13.
Duas mulas livres do vírus foram inoculadas com 10 ml de sangue total de
outra mula naturalmente infectada com o VAIE. Esses animais infectados
experimentalmente apresentaram alguns sinais clínicos sugestivos da AIE (como
febre, anorexia, depressão) em contraste com os dois infectados naturalmente, dos
quais um deles apresentou sinais clínicos da AIE após seis dias de observação,
sendo então eutanasiado, sugerindo influência da dose infectante e reforçando o
conceito sobre a capacidade desta espécie se apresentar como portador inaparente,
pelo menos durante o período de observação 61.
3.5 Diagnóstico
Considerando que mais de 95% dos animais infectados pelo vírus da AIE são
portadores assintomáticos, o diagnóstico laboratorial assume um papel decisivo no
controle e prevenção da AIE, pois seu programa oficial de controle determina a
eutanásia dos animais infectados 8.
Conforme artigo de revisão de Issel e Cook (1993)
25
, embora tenha sido o
primeiro vírus animal descoberto, o insucesso nas tentativas de cultivo do agente em
mais de meio século seguinte à sua descoberta, em 1904, culminou numa
10
defasagem no conhecimento em relação a outros lentivirus e, por conseqüência, no
desenvolvimento de técnicas de diagnóstico. Tentativas como teste de precipitação,
desenvolvido por Russell e colaboradores, e de fixação de complemento, por Kono e
Kobayashi, ambos publicados em 1966, não tiveram grande aceitação por falta e
acuraria ou de praticidade. No início dos anos 1970, os antígenos do VAIE eram
extraídos do baço de cavalos inoculados ou cultivados em leucócitos eqüinos. A
aplicação do procedimento aperfeiçoado por Ouchterlony – dupla difusão em Agar –
provou-se efetiva 9.
3.5.1 Imunodifusão em Agar gel (IDGA)
A adaptação do método de Ouchterlony para diagnosticar a AIE foi
amplamente aceita e padronizada internacionalmente. Batizada como teste de
Coggins, em homenagem ao seu criador, a IDGA é a prova padrão-ouro da
Organização Mundial de Saúde Animal (OIE)
3, 37, 47
, bem como pelo Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para o diagnóstico de AIE, o qual
somente poderá ser realizado em laboratórios credenciados pelo MAPA 8.
O IDGA, utilizado no diagnostico da doença desde 1970, detecta anticorpos
contra a proteína p26 do core viral que é antigenicamente estável, com domínios
altamente conservados entre os isolados do VAIE e imunodominante 7, 23, 26, 47.
Quando o animal é infectado, o vírus replica em células da linhagem
monócito-macrófago e são lançados na corrente sangüínea antes da manifestação
da febre ou outro sintoma. Esta primeira viremia ocorre cinco a sete dias pós
infecção (d.p.i.). O eqüino infectado produz resposta humoral detectável em 12 d.p.i.
mas se torna positivo para a IDGA entre 15 e 45 d.p.i 24.
Apesar da facilidade de execução, não é um teste rápido, pois a leitura é feita
em 48 horas. Outra limitação seria os resultados falsos negativos ou duvidosos,
principalmente quando se trata de muares e asininos que normalmente possuem
baixíssimos níveis de viremia 44.
Duas mulas livres do vírus foram inoculadas com 10 ml de sangue total de
outra mula naturalmente infectada com o VAIE. Esses animais infectados
experimentalmente apresentaram alguns sinais clínicos sugestivos da AIE (como
11
febre, anorexia, depressão) em contraste com os dois infectados naturalmente, dos
quais um deles apresentou sinais clínicos da AIE após seis dias de observação,
sendo então eutanasiado, sugerindo influência da dose infectante e reforçando o
conceito sobre a capacidade desta espécie se apresentar como portador inaparente,
pelo menos durante o período de observação 61.
Conforme citado anteriormente (item 3.4), um experimento acompanhando
mulas inoculadas com sangue de outra mula naturalmente infectada, observou-se
que esses animais, apesar de terem apresentados alguns sinais clínicos sugestivos
da AIE, foram negativos à pesquisa de anticorpos específicos pelo IDGA até 30 dias
pós-inoculação (dpi) 61.
Em outro trabalho, dois asininos e quatro pôneis foram infectados
experimentalmente com o VAIE, resultando em três pôneis positivos à IDGA no 21
d.p.i. e um no 23 d.p.i. Entre os asininos, um apresentou uma fraca reação positiva
no 49 d.p.i. e o outro no 42 d.p.i. 13.
3.5.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Durante os últimos anos, a detecção de anticorpos contra o VAIE pelo ELISA
tem sido descrita e usada em alguns países onde este teste é comercializado em
vários formatos
37
. Nos Estados Unidos (USA) alguns ELISAs foram aprovados pelo
US Department of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service
(USDA:APHIS) em 1990 como métodos de teste equivalentes para a diagnostico de
AIE. Estudos para validação do teste indicaram boa concordância, apontando, em
alguns casos, maior sensibilidade para o ELISA. Um soro de eqüino sabidamente
positivo para AIE foi testado e continuou sendo diagnosticado como positivo pelo
ELISA até a diluição de 1/1600, ao contrário da IDGA, que apresentou resultado
positivo até a diluição de 1/100 46.
Um ELISA utilizando gp90 recombinante foi desenvolvido por Reis (1997) e
demonstrou ser mais eficiente do que o ELISA com antígeno p26
58
, pois detectou
anticorpos para o VAIE mais precocemente em animais infectados, apresentou boa
correlação com os resultados do teste de IDGA e foi recomendado como teste de
triagem em levantamentos sorológicos 36, 51.
12
O teste ELISA indireto com a proteína gp90 recombinante (rgp90) tem sido
utilizado em MG e no Laboratório de Retroviroses - Retrolab. Este teste possui
vantagens frente ao IDGA por detectar os anticorpos anti-gp90, que são os primeiros
a aparecerem no sangue e os mais abundantes, diminuindo o número de resultados
falso-negativos. É considerado um método sensível para detectar anticorpos antiVAIE, possibilitando o teste de muitas amostras ao mesmo tempo com resultados
obtidos dentro de 4 a 5 horas 36.
3.5.3 Outros Métodos de Diagnóstico
Até mesmo quando ambos os testes (IDGA e C-ELISA) tem sido usados por
serem boas ferramentas de diagnóstico, diversos fatores podem contribuir para
resultados conflitantes que precisa ser confirmado usando um teste de diagnóstico
seguro e altamente específico. O Western Blot, de uso mais experimental, é aplicado
como um teste diagnóstico confirmatório para doenças virais, por ser um teste
altamente sensível e específico 2.
A reação em cadeia da polimerase tem sido proposta como método de
diagnóstico confirmatório para a AIE e outras retroviroses. A especificidade do teste
é geralmente satisfatória quando são usados iniciadores dirigidos a uma região
conservada no genoma do VAIE
29, 30
. A PCR para detecção de DNA proviral do
VAIE é sensível e específica para identificar cavalos em estágio subclínico, como
também cavalos recentemente infectados em processo de montagem de resposta
imune 23, 25, 30, 42, 54, 61, 63.
Um ensaio baseado em polarização fluorescente foi desenvolvido usando um
peptídeo da gp45. Esta tecnologia se baseia na detecção de diferença na emissão
de fluorescência emitida por uma molécula pequena como é o peptídeo marcado
com o fluorógeno e a emissão pelo mesmo peptídeo marcado formando um
complexo com um anticorpo específico 62.
13
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CRITÉRIO DE INCLUSÃO NO ESTUDO
No curral de recolhimento da Prefeitura Municipal de Mossoró os animais são
distribuídos aproximadamente da seguinte forma: 65% de asininos, 22% de eqüinos,
10% de bovinos e 3% de muares. Durante um período de nove meses, Foram
colhidas amostras de sangue de eqüídeos errantes (Figura 2), para separação do
soro, de eqüídeos totalizando 33 eqüinos, 112 asininos e cinco muares.
Figura 2 – Eqüídeos errantes nas ruas de Mossoró-RN. Fonte: Cavalcante, 2008.
Para cada animal foi feita uma ficha de cadastro (Figura 3) para alimentar o
banco de dados, dividida em três partes: i) identificação do animal (número, idade,
sexo, espécie e o local onde foi recolhido); ii) exame clínico do animal - frequência
cardíaca (FC), frequência respiratória (FR), temperatura retal (TR), anormalidades
em pele, mucosas e linfonodos; iii) resenho para individualização dos animais.
As idades foram estimadas pela modificação na face oclusal (mesa dentária,
de ovalada à biangular) pela erupção continuada dos dentes e pelo desgaste de
14
seus elementos constituintes
59
e, para a identificação. os animais foram ferrados a
®
frio, usando o Marfix , com os números registrados nas fichas, pois, a maioria dos
asininos apresenta o mesmo padrão de pelagem sem marcas ou sinais suficientes
para permitir a identificação.
Figura 3 – Modelo da ficha de cadastro dos animais
®
Hidróxido de sódio a 22%, Laboratório BraVet
15
4.3 REALIZAÇÃO DOS TESTES
Os testes (IDGA e ELISA) foram realizados no Laboratório de Retroviroses Retrolab no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da UFMG.
4.3.1 IDGA
A IDGA foi realizada com kit comercial contendo antígeno p26 e soro padrão
positivo do fabricante IDEXX, lote 03878-FB564 de 14.06.2008. Foi aplicado o
protocolo adaptado no Retrolab – metodologia clássica de Coggins e Norcross com
algumas modificações - e descrito por Motta
27
. Foi preparado um gel de agar Noble
a 1% em tampão borato (0,15 M H3BO3; pH 8,6 ajustado com NaOH) fundido em
microondas e distribuído (4,5mL) em lamina para microscopia. Após sua
solidificação, o ágar foi perfurado com um furador próprio, formando sete orifícios
eqüidistantes: um central e seis periféricos cada qual com volume aproximado de
25μL. O antígeno foi depositado no orifício central e, nos orifícios periféricos, foram
alternados os soros teste com o controle positivo. As laminas prontas foram
incubadas em câmaras úmidas com solução fenolada a 1% e mantidas a
temperatura ambiente por 48 horas e a leitura feita a olho nu ou com o auxilio de
uma fonte de luz indireta sob um fundo escuro para a verificação da presença de
uma linha de precipitação entre o antígeno e os soros testes em continuidade
(identidade) com as linhas formadas entre o controle positivo e o Antígeno.
4.3.2 ELISA rgp90
Foi seguido o protocolo preconizado por Reis (1997)
51
. A proteína
recombinante rgp90 foi diluída em tampão carbonato 50 mM (pH 9,6) na
concentração de 0,5 µg/cavidade e incubada (100 µl por poço) em placas ELISA
(Nunc-Immuno Plate Maxisorp) por 18 horas a 4ºC. As placas foram lavadas por
16
duas vezes com PBS-Tween 0,05% (pH 7,6) e incubadas por no mínimo uma hora
com solução de bloqueio PBS-Tween 0,05% (200 µl por poço) acrescida de leite em
pó desnatado a 5%. Nova lavagem foi realizada (3 vezes) e o soro incubado na
diluição de 1:50 (4 µl de soro em 196 µl de PBS-Tween 0,05% + 1% leite) por uma
hora a temperatura ambiente. Para a diluição do soro foram utilizadas placas
próprias para diluição com 96 cavidades e em seguida as amostras diluídas foram
transferidas para a placa ELISA adsorvida previamente com a proteína
recombinante rgp90. As placas foram novamente lavadas com solução de PBSTween 0,05% por três vezes e incubadas com solução de conjugado na diluição de
1:7500 (coelho anti Ego eqüina-peroxidase SIGMA) em PBS-Tween 0,05% + 1%
leite em pó (100 µl por poço) por 1 hora a temperatura ambiente. Após nova
lavagem com PBS-Tween 0,05% por 3 vezes, 100 µl do substrato foi adicionado:
solução de ortofenilenodiamino (OPD) (0,5 mg/ml), 20 µl de peróxido de hidrogênio
(H2O2) em 10 ml de tampão fosfato citrato (pH 5,0) por 10 minutos a temperatura
ambiente. A reação foi interrompida com 40 µl de solução de ácido sulfúrico a 0,5 N
e a densidade ótica lida em leitor de ELISA a um comprimento de onda de 492 nm.
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi utilizado o software de domínio público Epi Info versão 3.4.1 * para a
construção do banco de dados e testes estatísticos (Qui quadrado, Qui-quadrado de
Mantel Haenzel e análises de risco: risco relativo e odds ratio) quando aplicáveis.
Outros programas estatísticos foram empregados de acordo com o teste, cuja
escolha foi definida pela natureza da variável analizada: se qualitativa – como
espécie e sexo – ou quantitativa – como idade. Neste último caso, foi necessário
decidir por testes paramétricos ou não paramétricos na dependência de haver ou
não distribuição normal, o que foi avaliado pelo teste Kolmogorov-Smirnov. Os
programas utilizados foram: Minitab® 15.1.0.0. † , Statistica 8.0 ‡ e InStat 3.06 §
*
Centers for Disease Control and Prevention - CDC
Minitab;
‡
StatSoft
§
Graphpad Software
†
17
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve diferença estatística na proporção de machos e fêmeas, tanto nos
eqüinos quanto nos asininos. Nos muares, esta análise não foi feita em virtude da
pouca quantidade de animais (Figura 4).
Figura 4 – Equideos errantes incluído no estudo classificados por espécie e sexo. MossoróRN, 2009
Conforme pode-se observar na Figura 5, valores de idade extremos de alguns
indivíduos influenciaram no resultado da média, impossibilitando a análise com este
parâmetro. A distribuição desta variável não apresentou distribuição normal,
portanto, as comparações foram feitas pelo tese Kruskal-Wallis (não paramétrico).
Houve diferença estatisticamente significante (p<0,008) dos muares em
relação a eqüinos e asininos que, por sua vez, não apresentaram diferença
significante entre eles, o que pode ser observado na Figura 66, mostrando a
distribuição por quartis.
Figura 5 – Box Plot apresentando a dispersão da idade dos animais conforme a espécie.
18
Os asininos apresentaram uma mediana (6,0) menor que os eqüinos (8,0) e
estes tiveram uma amplitude maior de distribuição com maior número relativo de
animais no último quartil. Tal fato pode ser explicado pela diferença de trabalho
desempenhado por essas espécies e pelo seu modo de criação. Os eqüinos são
mais aproveitados que os asininos no trabalho e, por conseqüência, circulam em
menor número soltos nas ruas. Adicionalmente, observou-se no decorrer desta
pesquisa que muitos dos eqüinos recolhidos pela prefeitura são resgatados por seus
donos, mostrando que são animais semi-controlados e que ainda estão servindo
como força de trabalho. Porém, embora não tenham ocorrido animais reincidentes
na amostra estudada, sabe-se por relato pessoal que muito dos animais resgatados
voltam ao curral durante o mês, pois os proprietários soltam-nos nas ruas
novamente.
Mais lentos no trabalho, os asininos são aproveitados apenas na ausência de
eqüinos e muares, o que pode explicar seu maior número nas vias públicas,
provavelmente se reproduzindo nesta condição, dado o número representativo de
animais jovens, repondo a população de susceptíveis.
19
Os muares foram representados em menor número e com indivíduos mais
velhos, possivelmente por serem híbridos (inférteis) e, em função de sua resistência,
apresentarem rendimento e longevidade no trabalho superior que as outras duas
espécies. Desta forma, os muares, quando abandonados, o são mais tardiamente.
No pantanal mato-grossense, há fazendeiros substituindo os cavalos de serviço por
muares devido a sua maior resistência em apresentar sintomas da AIE
44
. Na
situação epidemiológica encontrada ali, com regiões apresentando prevalência de
até 50%, torna-se menos relevante o fato dos muares estarem ou não infectados,
mas não se pode dizer o mesmo dos animais em Mossoró.
Figura 6 – Distribuição em mediana e quartis da idade dos animais agrupados por espécie.
Box Plot da idade agrupada por espécie
24
22
20
18
16
idade (anos)
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
asinino
equino
muar
25%-75%
Non-Outlier Range
Outliers
Extremos
espécie
Dos 150 animais analisados, todos os quatro soros positivos na IDGA foram
positivos também no ELISA mas, seis soros adicionais foram positivos apenas no
ELISA (Tabela 1). Estes resultados conflitantes podem ser justificados porque
asininos e muares produzem títulos de anticorpos contra o VAIE abaixo do limiar de
20
detecção da IDGA. De fato, quando testados por Western blot, as amostras
discordantes apresentaram concentrações baixas de anticorpos contra o antígeno
p26, que é o marcador da IDGA ** . Adicionalmente, sabe-se que anticorpos contra
gp90 antígeno empregado no ELISA são detectados precocemente e em títulos
mais altos que p26
25, 36, 51
. Consequentemente, não se pode descartar que os
resultados ora apresentados sejam de animais infectados recentemente.
Tabela 1 – Análise de concordância entre os testes sorológicos, realizados por IDGA e
ELISA para o diagnóstico da AIE em asininos, equinos e muares de Mossoró-RN (2009).
IDGA
Eqüinos
Asininos
Muares
TOTAL
ELISA
P
N
P
2
0
2
N
0
31
31
P
2
4
6
N
0
106
106
P
0
2
2
N
0
3
3
TOTAL
4
146
150
Apesar do estresse sofrido por esses animais nas ruas e até mesmo no curral
de recolhimento após a apreensão — sem cuidados adequados, sem alimentação
nem fonte de água limpa, com superlotação e muitas vezes brigas entre os animais
(Figura 7), fatores
suficientes para recrudescimento da viremia
12, 43
, não foi
observado nenhum quadro clínico sugestivo da AIE. Os animais que por ventura já
estivessem infectados no momento da coleta seriam portadores crônicos
assintomáticos. Outros que se infectassem após a apreensão, durante o
confinamento, não teriam tempo hábil para a manifestação dos sintomas até sua
liberação ou resgate, tampouco o período em que os animais recolhidos
permanecem cativos (até sete dias) permitiriam, na maioria dos casos, a detecção
de anticorpos específicos pelos testes sorológicos a gp90 é detectável em 7 dpi 25.
**
Relato pessoal (Reis, 2009), dados não publicados
21
Figura 7 - Curral de recolhimento de animais errantes da PMM, onde paralelamente às
colheitas, foi realizado exame físico dos animais para verificar associação entre achados
clínicos e resultados dos testes sorológicos. Fonte: Cavalcante, 2009.
Conforme relacionado no Anexo 2, dos animais positivos (seis asininos, dois
muares e dois eqüinos), apenas os asininos de número 23 e 92 apresentaram pêlos
grandes e sem brilho e o primeiro apresentou mucosas hipocoradas. Ambos
apresentaram temperatura retal dentro dos limites normais, mas conforme descrito
no experimento de Cook et al., (2001)
13
, asininos inoculados com o VAIE não
demonstraram picos febris em nenhum momento durante os 365 dias de
observação, diferentemente dos pôneis que apresentaram vários picos febris, com
alguns chegando até mais de 41° C.
Outros animais, soro-negativos, apresentaram a mesma sintomatologia dos
animais 23 e 92, o que pode ter como causa outros fatores, por exemplo: verminose
(exame não realizado), má alimentação crônica e idade avançada. Desta forma,
embora não se possa afirmar que os sinais apresentados tenham sido em
decorrência da infecção pelo VAIE, curiosamente, estes foram os asininos positivos
para o ELISA e o IDGA.
Na forma como os resultados se apresentaram, ou seja, o pequeno número
de animais positivos para qualquer dos testes utilizados não permitiu o cálculo dos
parâmetros bayesianos como sensibilidade, especificidade e valores preditivos.
Porém, baseado no desempenho dos dois testes descritos em estudos anteriores
1,
22
36, 44, 51, 55
, assumiu-se como falsos negativos os resultados da IDGA para asininos e
muares quando o resultado do ELISA for positivo. Existe relato de recrudescimento
de um surto de AIE em eqüinos na França, seis anos após ter sido controlado,
devido a um jumento falso negativo à IDGA
63
. O ELISA não é prova aceita
oficialmente no Brasil, mas por não consumir o tempo de processamento da IDGA e
ser mais sensível, poderia ser empregado como teste de triagem para eqüinos ou
como prova de eleição para asininos e muares.
É notória a importância do serviço de recolhimento dos animais sem controle
ou semi-controlados pois a apreensão realizada pela Polícia Rodoviária Federal
contribuiu para diminuir 17% os acidentes envolvendo animais nas rodovias federais
no Rio Grande do Norte
64
. Porém, é necessário estudar alternativas e ponderar
sobre o risco de serem recolhidos animais de diferentes pontos da cidade e mantêlos agrupados em um mesmo local para que, logo em seguida, sejam soltos. Não se
pode descartar a possibilidade de que algum desses animais previamente infectados
atuem como fonte de infecção para outro que será solto ou resgatado por um
proprietário que tenha outros animais, podendo estabelecer novas cadeias de
transmissão, já que o curral, principalmente na época chuvosa (época em que a
proliferação de vetores responsáveis pela transmissão da AIE é maior), pode ser um
local maior de disseminação entre esses animais.
A falta de um teste diagnóstico oficial confiável para asininos e muares faz
com que não haja instrumento legal para aplicação de medidas de controle. A
adaptação de programas de educação sanitária já bem descritos para pequenos
animais
56
podem propor medidas importantes como: posse responsável; controle
populacional; substituir animais de trabalho infectados no caso de proprietários sem
recursos financeiros.
Os dados apresentados neste trabalho sugerem um risco potencial de
transmissão do VAIE que não pôde ser quantificado devido ao tamanho reduzido da
amostra. O tempo em que os animais recolhidos permanecem cativos mas a
ampliação do período de colheita e a inclusão de testes moleculares deverão
fornecer mais informações sobre o tamanho da população de eqüídeos errantes, a
prevalência da doença, viremia e subpopulações virais para o rastreamento da
origem da transmissão.
23
6 CONCLUSÕES
¾ A AIE está presente nos eqüídeos errantes de Mossoró
¾ Para os eqüinos, os testes ELISA e IDGA podem ser aplicados em série: o
primeiro como triagem e o segundo, confirmatório para o diagnóstico da AIE.
¾ O teste ELISA e IDGA devem ser aplicados em paralelo para o diagnóstico da
AIE em muares e asininos, tendo o ELISA como prova de eleição para estas
espécies.
¾ Os equideos errantes representam risco potencial para a equideocultura de
Mossoró, principalmente para a AIE, por existir animais portadores
assintomáticos da doença transitando livremente perto das fazendas.
¾ Apesar de ser uma medida que diminui a quantidade de acidentes nas ruas, o
recolhimento dos animais em um curral coletivo, pode favorecer a
disseminação da doença entre esses animais, por não serem adotada
medidas sanitárias associadas a esse serviço
24
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30
ANEXOS
31
ANEXO A
Quadro 2 - População de eqüinos, asininos e muares segundo Censo Agropecuário de 2007 (IBGE, 2007).
ANO
Região
Geográfica
Brasil
Nordeste
Rio Grande do Norte
Mossoró – RN
Tipo de rebanho
Equino
Asinino
Muar
Equino
Asinino
Muar
Equino
Asinino
Muar
Equino
Asinino
Muar
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
5.831.533
5866780
5.831.341
5.831.817
5.801.055
5.774.493
5.828.376
5.787.250
5787249
5749117
5602053
1.248.507
1232750
1.236.401
1.242.177
1.239.025
1.217.122
1.208.660
1.196.324
1191533
1187419
1163316
1.294.507
1292412
1.335.771
1.347.855
1.345.656
1.339.161
1.345.389
1.358.419
1388665
1386015
1343279
1.433.495
1413760
1.408.397
1.400.180
1.403.297
1.391.596
1.405.484
1.412.432
1423693
1428543
1430408
1.155.561
1136010
1.139.054
1.141.294
1.138.847
1.115.485
1.106.510
1.092.301
1085775
1080158
1063012
655.171
653787
687.571
690.331
686.987
676.182
671.039
675.461
689968
691019
687523
34.591
36982
37.314
38.618
38.213
39.933
39.614
40.338
41979
43550
42933
56.806
54332
56.394
60.089
59.677
63.300
63.341
63.068
62586
57738
57955
15.873
18976
19.599
20.686
20.910
21.108
20.868
20.900
21848
21894
21277
940
916
943
896
905
980
821
830
900
1050
1086
1.050
1023
1.051
1.208
1.290
1.320
1.462
1.500
1235
1180
1275
370
362
372
357
360
376
341
350
392
450
486
31
32
ANEXO B
Quadro 3 - Informações colhidas dos eqüídeos errantes em Mossoró-RN, 2009.
Animal
Idade
(anos)
Sexo
FC FR Temp
1
6
fêmea
32
16
36,0
normocoradas asinino
2
4,5
macho
40
20
36,8
normocoradas asinino
3
4
5
0,7
fêmea
fêmea
52
40
40
20
37,6
37,5
normocoradas asinino
hipocoradas asinino
5
0,65
macho
48
20
38,2
hipocoradas
asinino
6
9
fêmea
36
20
37,5
hipocoradas
equino
7
8
9
10
11
18
5
3
13
3
fêmea
fêmea
macho
fêmea
fêmea
60
44
48
52
36
28
20
28
60
16
37,8
39,0
38,5
38,2
37,0
normocoradas
hipocoradas
normocoradas
normocoradas
normocoradas
muar
equino
equino
equino
equino
12
13
macho
36
16
37,8
normocoradas
equino
13
12
macho
28
20
37,5
normocoradas asinino
14
6
fêmea
32
20
36,5
hipocoradas
asinino
15
18
fêmea
40
20
37,4
normocoradas
muar
16
19
fêmea 120 24
37,5
normocoradas
muar
17
18
19
20
21
4
5
8
15
4,5
macho
fêmea
fêmea
macho
fêmea
48
40
44
44
60
20
20
16
28
36
37,5
37,4
37,8
37,5
37,4
normocoradas asinino
normocoradas asinino
hipocoradas
equino
normocoradas equino
normocoradas asinino
22
6
macho
40
20
37,8
hipocoradas
asinino
23
10
macho
40
28
37,5
hipocoradas
asinino
24
15
macho
44
32
37,8
ictéricas
asinino
25
6
fêmea
44
28
37,6
26
6
macho
32
24
37,7
27
3
macho
44
24
38,0
normocoradas asinino
28
4
fêmea
44
20
36,9
normocoradas asinino
29
2,5
fêmea
40
16
36,5
normocoradas asinino
30
15
fêmea
42
20
36,8
normocoradas
31
7
fêmea
40
20
36,9
normocoradas asinino
32
7
macho
42
13
36,4
33
5
fêmea
48
21
36,8
normocoradas asinino
34
1,5
macho
30
16
36,4
normocoradas asinino
Mucosas
Espécie
normocoradas asinino
hipocoradas
hipocoradas
equino
muar
asinino
ELISA
IDGA
Data Da
Colheita
Local da
Colheita
Sto
Antonio
Sto
negativo negativo 22/fev/08
Antonio
negativo negativo 22/fev/08 Boa Vista
negativo negativo 22/fev/08 Paredões
Sto
negativo negativo 22/fev/08
Antonio
Nova
negativo negativo 22/fev/08
Betânia
negativo negativo 26/fev/08 Paredões
negativo negativo 29/fev/08
Centro
negativo negativo 29/fev/08
Centro
negativo negativo 29/fev/08
Centro
negativo negativo 29/fev/08 Redenção
Nova
negativo negativo 29/fev/08
Betânia
Bom
negativo negativo 29/fev/08
Jardim
Bom
negativo negativo 29/fev/08
Jardim
Costa e
positivo negativo 29/fev/08
Silva
Sto
negativo negativo 29/fev/08
Antonio
negativo negativo 04/mar/08 Boa Vista
negativo negativo 04/mar/08 Paredões
negativo negativo 04/mar/08 Boa Vista
negativo negativo 04/mar/08 Boa Vista
negativo negativo 04/mar/08
Pintos
Sto
negativo negativo 04/mar/08
Antonio
Nova
positivo positivo 04/mar/08
Betania
Nova
negativo negativo 08/mar/08
Betania
Bom
negativo negativo 08/mar/08
Jardim
Costa e
negativo negativo 08/mar/08
Silva
Bom
negativo negativo 08/mar/08
Jardim
Sto
negativo negativo 28/mar/08
Antonio
Sto
negativo negativo 28/mar/08
Antonio
Bom
positivo negativo 28/mar/08
Jardim
Sto
negativo negativo 28/mar/08
Antonio
Nova
negativo negativo 28/mar/08
Betania
Sto
negativo negativo 28/mar/08
Antonio
Bom
negativo negativo 28/mar/08
Jardim
negativo negativo
11/fev/08
33
Animal
Idade
(anos)
Sexo
FC FR Temp
35
15
fêmea
40
18
36,0
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
36
7
fêmea
60
32
37,0
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
37
15
fêmea
48
18
37,3
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
38
1,5
fêmea
60
20
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
39
4
macho
52
12
37,2
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
40
18
macho
24
18
36,8
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
41
1,5
fêmea
80
30
37,0
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
42
9
macho
36
16
36,8
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
43
15
macho
40
16
37,2
normocoradas asinino positivo negativo 28/mar/08
44
12
macho
37
16
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
45
13
macho
40
16
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
46
8
macho
28
16
37,0
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
47
7
macho
28
12
36,8
normocoradas asinino
negativo negativo 28/mar/08
48
2,5
fêmea
44
25
37,2
normocoradas
equino
negativo negativo
04/abr/08
49
14
fêmea
52
20
37,4
normocoradas
equino
negativo negativo
04/abr/08
50
17
macho
44
16
37,4
hipocoradas
equino
negativo negativo
04/abr/08
51
7
macho
39
23
37,7
normocoradas
equino
negativo negativo
04/abr/08
52
7
macho
42
35
37,8
normocoradas
equino
positivo positivo
04/abr/08
53
54
2,5
2
fêmea
fêmea
51
39
23
23
37,4
38,0
normocoradas
normocoradas
equino
equino
negativo negativo
negativo negativo
04/abr/08
04/abr/08
55
3,5
macho
31
26
38,4
normocoradas asinino
negativo negativo
04/abr/08
56
12
macho
55
30
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo
04/abr/08
57
6
macho
36
24
38,5
normocoradas asinino
negativo negativo
26/abr/08
58
10
macho
24
20
36,4
normocoradas asinino
negativo negativo
26/abr/08
59
60
61
62
18
4
2
18
macho
macho
macho
macho
36
18
36
36
20
24
20
40
36,2
37,0
37,2
37,4
normocoradas
normocoradas
normocoradas
normocoradas
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
26/abr/08
26/abr/08
26/abr/08
26/abr/08
63
2,5
macho
36
36
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
26/abr/08
64
65
2,5
3,5
macho
macho
48
36
32
24
37,6
37,1
hipocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo
negativo negativo
26/abr/08
26/abr/08
66
8
macho
32
28
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
26/abr/08
67
68
15
2,5
macho
macho
32
40
28
20
37,7
37,7
normocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo
negativo negativo
26/abr/08
26/abr/08
69
1,5
fêmea
44
28
37,3
asinino
negativo negativo
26/abr/08
70
71
3,5
9
macho
macho
44
32
36
28
37,8
37,6
hipocoradas asinino
normocoradas muar
negativo negativo
negativo negativo
26/abr/08
26/abr/08
Mucosas
hipocoradas
Espécie
asinino
asinino
asinino
asinino
ELISA
IDGA
Data Da
Colheita
Local da
Colheita
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Pintos
Bom
Jardim
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Nova
Betania
Bom
Jardim
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Costa e
Silva
Redenção
Nova
Betânia
Abolição I
Abolição I
Sto
Antonio
BR-304
Sto
Antonio
Bom
Jardim
BR-304
Barrinha
Paredões
Aeroporto
Alto S.
Manoel
Barrinha
BR-304
Bom
Jardim
Redenção
BR-304
Sto
Antonio
Aeroporto
Aeroporto
34
Animal
Idade
(anos)
Sexo
FC FR Temp
72
12
fêmea
40
32
73
1,5
macho
40
74
12
fêmea
75
1,5
76
ELISA
IDGA
Data Da
Colheita
Mucosas
Espécie
37,3
normocoradas
equino
negativo negativo
26/abr/08
32
37,4
normocoradas
equino
negativo negativo
26/abr/08
35
22
37,6
normocoradas
equino
negativo negativo 08/mai/08
macho
39
20
38,2
normocoradas
equino
negativo negativo 08/mai/08
2,5
fêmea
42
24
37,6
hipocoradas
equino
negativo negativo 08/mai/08
77
2,5
macho
46
18
36,8
normocoradas asinino
negativo negativo 08/mai/08
78
14
fêmea
32
16
38,5
hipocoradas
equino
negativo negativo 08/mai/08
79
80
13
22
macho
macho
32
44
16
24
37,8
38,4
hipocoradas
normocoradas
equino
equino
negativo negativo 14/mai/08
positivo positivo 14/mai/08
81
12
fêmea
48
16
38,0
normocoradas
equino
negativo negativo 14/mai/08
82
4
macho
32
20
37,5
normocoradas asinino
negativo negativo 21/mai/08
83
12
fêmea
36
20
38,0
normocoradas asinino
negativo negativo 21/mai/08
84
2,5
macho
32
20
37,1
normocoradas asinino
negativo negativo 21/mai/08
85
86
1,75
3
fêmea
fêmea
48
40
36
24
37,7
37,4
normocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo 21/mai/08
negativo negativo 21/mai/08
87
3,5
fêmea
36
48
38,0
normocoradas asinino
negativo negativo 21/mai/08
88
7
fêmea
36
24
38,0
normocoradas asinino positivo negativo 21/mai/08
89
8
fêmea
32
16
37,8
normocoradas
equino
negativo negativo 21/mai/08
90
3,5
fêmea
36
20
37,9
normocoradas
equino
negativo negativo 21/mai/08
91
1,5
macho
39
17
36,7
normocoradas asinino
negativo negativo
10/jun/08
92
18
fêmea
62
20
37,4
normocoradas asinino positivo positivo
10/jun/08
93
7
macho
26
13
37,1
normocoradas asinino
negativo negativo
10/jun/08
94
12
macho
39
12
37,0
normocoradas
equino
negativo negativo
10/jun/08
95
12
macho
42
14
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
10/jun/08
96
97
98
13
2,5
18
fêmea
fêmea
fêmea
30
55
30
15
22
19
36,8
37,4
37,4
normocoradas asinino
normocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo
negativo negativo
negativo negativo
10/jun/08
10/jun/08
10/jun/08
99
6
fêmea
51
33
38,0
hipocoradas
asinino
negativo negativo
10/jun/08
100
12
macho
24
12
37,5
hipocoradas
asinino
negativo negativo
10/jun/08
101
4,5
macho
18
36
37,8
hipocoradas
asinino
negativo negativo
10/jun/08
102
1,6
macho
44
32
37,6
normocoradas asinino
negativo negativo
10/jun/08
103
14
macho
28
24
37,7
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
104
18
macho
36
20
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
105
3
macho
40
28
37,9
normocoradas asinino positivo negativo
24/jul/08
106
2,5
macho
36
20
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
107
2
macho
44
20
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
Local da
Colheita
Sta
Delmira
Sta
Delmira
Bom
Jardim
Aeroporto
Sta
Delmira
Aeroporto
Sto
Antonio
Abolição I
Abolição I
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sta
Delmira
Paredões
Paredões
Nova
Betânia
Sto
Antonio
Aeroporto
Abolição
IV
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Centro
Sto
Antonio
Pintos
Pintos
Paredões
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Nova
Betânia
Sto
Antonio
Paredões
Alto S.
Manoel
Sta
Delmira
Sto
Antonio
Redenção
35
Animal
Idade
(anos)
Sexo
Data Da
Colheita
Local da
Colheita
108
109
18
2,5
macho
macho
32
44
24
24
37,7
37,7
normocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo
negativo negativo
24/jul/08
24/jul/08
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
37,2
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
20
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
24/jul/08
32
24
38,0
normocoradas
equino
negativo negativo
24/jul/08
fêmea
40
24
38,2
normocoradas
equino
negativo negativo
24/jul/08
12
macho
28
20
37,0
normocoradas
equino
negativo negativo
24/jul/08
116
18
fêmea
48
24
36,7
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
117
3
macho
32
19
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
118
1,5
macho
46
24
38,2
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
119
18
macho
42
20
36,6
120
2
macho
36
14
36,7
121
15
macho
28
15
37,2
hipocoradas
asinino
negativo negativo 15/ago/08
122
18
macho
38
20
36,9
hipocoradas
asinino
negativo negativo 15/ago/08
123
124
125
9
2,5
3
macho
fêmea
macho
48
38
42
26
15
18
39,2
37,4
36,6
normocoradas asinino
normocoradas equino
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
negativo negativo 15/ago/08
negativo negativo 15/ago/08
126
12
macho
43
24
37,5
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
127
3
macho
28
20
38,3
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
128
4,5
macho
54
24
39,4
129
15
macho
38
12
130
7
fêmea
40
131
5
macho
132
2,5
133
Redenção
Redenção
Bom
Jesus
Bom
Jesus
Sto
Antonio
Nova
Betânia
Alto S.
Manoel
Alto S.
Manoel
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Pintos
30 de
setembro
Sta
Delmira
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Paredões
Centro
Abolição I
Sto
Antonio
Pintos
Alto S.
Manoel
Nova
Betânia
Abolição
III
Sto
Antonio
Sto
Antonio
30 de
setembro
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Belo
Horizonte
Sto
Antonio
110
12
macho
32
24
37,6
111
12
macho
32
24
112
1,75
macho
40
113
7
fêmea
114
13
115
FC FR Temp
Mucosas
hipocoradas
Espécie
ELISA
IDGA
asinino
negativo negativo 15/ago/08
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
ictéricas
asinino
negativo negativo 15/ago/08
39,0
normocoradas asinino
negativo negativo 15/ago/08
44
37,5
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
32
24
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
fêmea
44
30
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
6
macho
40
30
37,6
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
134
6
macho
36
24
38,0
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
135
2
macho
40
19
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
136
2,5
macho
40
23
37,6
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
137
7
macho
30
17
37,7
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
138
8
macho
43
25
36,8
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
139
8
fêmea
45
28
37,6
normocoradas asinino
negativo negativo 29/ago/08
140
8
macho
28
19
37,8
normocoradas
negativo negativo 29/ago/08
141
6
fêmea
40
18
37,5
normocoradas asinino positivo negativo
equino
19/set/08
36
Animal
Idade
(anos)
Sexo
FC FR Temp
142
4
fêmea
44
24
39,5
143
18
fêmea
42
18
36,5
144
7
fêmea
56
14
145
18
macho
32
146
147
148
18
7
2
macho
fêmea
macho
149
6
150
2,5
Mucosas
Espécie
normocoradas asinino
ELISA
IDGA
Data Da
Colheita
negativo negativo
19/set/08
asinino
negativo negativo
19/set/08
38,2
normocoradas asinino
negativo negativo
19/set/08
24
37,4
normocoradas asinino
negativo negativo
19/set/08
28
56
72
14
32
48
38,2
37,2
36,9
hipocoradas asinino
normocoradas asinino
normocoradas asinino
negativo negativo
negativo negativo
negativo negativo
19/set/08
11/out/08
11/out/08
fêmea
42
24
37,8
normocoradas asinino
negativo negativo
11/out/08
fêmea
64
36
37,3
negativo negativo
11/out/08
hipocoradas
hipocoradas
asinino
Local da
Colheita
Sto
Antonio
Sto
Antonio
Abolição
III
Alto S.
Manoel
Redenção
Redenção
Pintos
Costa e
Silva
30 de
setembro