Apresentação do PowerPoint - SOL
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Pontifícia Universidade Católica de Goiás Departamento de Biologia Disciplina: Bioinformática Bio1015 Conceitos e Técnicas em Biologia Molecular Prof. Macks Wendhell Gonçalves, Msc [email protected] REPLICAÇÃO DO DNA A base para a replicação do DNA está na complementaridade das bases. QUÍMICA DA SÍNTESE DE DNA Adição de um desoxirribonucleosídeo na extremidade 3’OH em uma cadeia de polinucleotídica (fita iniciadora). REPLICAÇÃO DO DNA Síntese de DNA catalisada pela DNA-polimerase REPLICAÇÃO DO DNA Forquilhas de replicação PROCESSO DE REPLICAÇÃO DO DNA Fita descontínua Fita contínua - Helicases SSBs Primase DNA-polimerase Topoisomerase DNA-ligase TRANSCRIÇÃO Classes de RNA - RNA mensageiro (mRNA) RNA transportador (tRNA) RNA ribossômico (rRNA) Pequenos RNA nucleares (snRNA) Micro RNA (miRNA) Pequenos RNA de interferência (siRNA) Tipos de RNA pol. - RNA polimerase I - RNA polimerase II - RNA polimerase III Existem duas classes gerais de RNA: as que codificam proteínas (mRNA) e as que são funcionais como RNA. Os RNA funcionais participam de uma variedade de processes celulares, incluindo a síntese de proteínas (tRNA, rRNA), RNA de processamento (snRNA), regulação da expressão genica (miRNA) e defesa do genoma (siRNA). TRANSCRIÇÃO DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito TRANSCRIÇÃO ELETROFORESE • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa - Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica - Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) - Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular ELETROFORESE, ETAPAS 1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese 4.Coloração 5. Análise dos resultados PREPARAÇÃO DO GEL Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS Definição do mapa das amostras por canaleta CORRIDA DO GEL • Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel COLORAÇÃO DAS MOLÉCULAS • Brometo de etídio • Agente intercalante do DNA (Carcinogênico) • Composto fluorescente à luz UV • Gel de agarose • Prata • Gel SDS-PAGE • Poliacrilamida • Gel Eletroforese • Melhor resolução PCR Reação em Cadeia da Polimerase REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR A PCR é uma técnica pela qual moléculas de DNA ou cDNA são amplificadas milhares ou milhões de vezes in vitro. Thomas D. Brock foi o primeiro a isolar o T. aquaticus Yellowstone National Park Thermus aquaticus PROCEDIMENTOS DA PCR Tampão Mg2+ DNA Polimerase (Taq-Polimerase) dNTPs DNA (sequência alvo) Termociclador Eppendorf 2 Primers (Oligonucleotídeos iniciadores) PROCEDIMENTOS DA PCR DNA molde: deve estar livre de impurezas uma vez que estas podem inibir a reação de PCR Solução tampão • Tris: mantém o pH da solução estável • Ions de K+, Na+ e NH4+ otimizam as condições da reação • Soro de albumina de bovino: atua como proteína estabilizadora • Íon Magnésio: - Baixa concentração: pouco ou nenhum produto - Elevada concentração: baixa especificidade. Primers • Baixa concentração: induz má polimerização • Elevada concentração: induz o aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers PROCEDIMENTOS DA PCR APLICAÇÕES DA PCR Quantidade de DNA reduzida (Genética forense) Detecção de genes e sondas Montagem de bibliotecas genômicas Sequenciamento de DNA e/ou cDNA Faça sua própria PCR http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
