consequências e evolução da plasticidade fenotípica em plantas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
KARINY CARI NASCIMENTO
CONSEQUÊNCIAS E EVOLUÇÃO DA PLASTICIDADE FENOTÍPICA
EM PLANTAS DIANTE DE DISTINTOS CENÁRIOS SIMULADOS DE
MUDANÇAS GLOBAIS
Maringá, PR
2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
KARINY CARI NASCIMENTO
CONSEQUÊNCIAS E EVOLUÇÃO DA PLASTICIDADE FENOTÍPICA
EM PLANTAS DIANTE DE DISTINTOS CENÁRIOS SIMULADOS DE
MUDANÇAS GLOBAIS
Projeto apresentado ao Curso de Doutorado do
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Comparada, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor.
Orientadora:
Prof.ª Dr. Lindamir Hernandez Pastorini
Maringá, PR
2015
RESUMO
Devido aos crescentes impactos provocados pelas mudanças globais, o conhecimento das
características que influenciam na sobrevivência dos organismos diante desse cenário,
subsidiando medidas de conservação mais eficazes, é um dos maiores desafios da ecologia
atual. A capacidade de aclimatação possibilitada pela plasticidade fenotípica é um mecanismo
proposto para favorecer os organismos em meio a essas modificações, sendo que além das
respostas em curto prazo, a evolução da plasticidade também pode ser direcionada pelas
características ambientais. Plantas são extremamente plásticas, e respondem diferencialmente
as essas alterações de acordo seus traços funcionais. O estabelecimento das plantas depende,
dentre outros fatores, da disponibilidade de água e da concentração de nitrogênio no solo, os
quais têm sofrido diversas alterações resultantes das atividades antrópicas, podendo selecionar
organismos com maior capacidade de aclimatação a essas alterações. Apesar dessa hipótese,
pouca atenção tem sido direcionada para testar empiricamente qual é a influência da
plasticidade fenotípica na sobrevivência das espécies e como ocorrerá sua evolução em meio à
intensificação de eventos extremos e imprevisíveis, uma vez que sobre condições estressantes
a plasticidade pode se tornar mal adaptativa. Diante disso, o objetivo desse estudo será avaliar
a influencia da plasticidade fenotípica na sobrevivência das espécies em meio às mudanças
globais e como ocorrerá sua evolução nesse cenário. Para isso será conduzido um
experimento fatorial com diferentes condições de água e nitrogênio, simuladas com base nas
previsões para as mudanças globais e utilizados três pares de espécies congêneres com
amplitude de distribuição distinta, sugerindo diferentes níveis de plasticidade. Os pares serão
formados por gramíneas Panicum millegrana e P. tricholaenoides, herbáceas Porophyllum
ruderale e P. obscurum e arbóreas Schinus terebinthifolius e S. weinmannifolius para inclusão
de diferentes traços funcionais, possibilitando assim maior generalização dos resultados. A
evolução da plasticidade será avaliada mediante seleção de P. ruderale em quatro condições:
Constante, Variável previsível, Variável imprevisível e Variável extremo. Com essa pesquisa
espera-se contribuir para a orientação de medidas de proteção mais eficazes focadas em
espécies com maior ou menor grau de plasticidade, sejam estas economicamente importantes
ou não, e para o melhor entendimento dos processos de seleção sobre a mesma.
Palavras-chave: Água; Nitrogênio; Aclimatação; Seleção; Traços funcionais.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 4
2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................... 6
3. OBJETIVO GERAL.................................................................................................... 6
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................... 7
5. HIPÓTESES................................................................................................................. 7
6. METODOLOGIA......................................................................................................... 8
6.1
Área de estudo........................................................................................................ 8
6.2
Coleta de dados e materiais vegetais.................................................................... 9
6.3
Experimento 1........................................................................................................ 9
6.4
Experimento 2........................................................................................................ 11
6.5
Experimento 3........................................................................................................ 16
6.6
Avaliação morfoanatômica................................................................................... 16
7. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO............................................................................ 18
8. REFERÊNCIAS............................................................................................................ 18
4
1. INTRODUÇÃO
As condições ambientais estão sendo profundamente modificadas pelas atividades
humanas, as quais tem se intensificado nas últimas décadas, levando ao rompimento do
equilíbrio prístino entre extinção e especiação, de forma que a sobrevivência de muitas
espécies está ameaçada. Devido ao caráter direcional da intervenção humana (GUTSCHICK;
BASSIRIRAD, 2003; IVES; CARPENTER, 2007), conhecer quais características
influenciam na sobrevivência dos organismos diante desse cenário, subsidiando medidas de
conservação mais eficazes, é um dos maiores desafios da ecologia atual (NICOTRA et al.,
2010).
A plasticidade fenotípica, que representa a capacidade de um determinado genótipo
produzir diferentes fenótipos em resposta ao ambiente (AGRAWAL, 2001; LUSK et al., 2008;
GIANOLI; VALLADARES, 2012), tem sido apontada como vantajosa considerando o seu
papel no aumento do nicho das espécies (SULTAN et al., 1998) e na maior sobrevivência sob
novas condições (LLORET et al., 2012). No entanto, em meio às modificações humanas das
condições
ambientais,
a
vantagem
atribuída
pela
plasticidade,
ainda
é
incerta
(VALLADARES et al., 2000; CALLAWAY; PENNINGS; RICHARDS, 2003; GIANOLI,
2004; SULTAN, 2007; CRISPO et al., 2010).
Além das respostas em curto prazo, as condições ambientais podem mudar a direção
da seleção natural sobre a plasticidade fenotípica (SULTAN, 1995; VALLADARES et al.,
2000). Isso porque, a plasticidade adaptativa, ou seja, com consequências positivas para o
fitness, é maior em ambientes heterogêneos em relação aos mais constantes ou homogêneos
(DONOHUE et al., 2001; CALLAWAY; PENNINGS; RICHARDS, 2003; GIANOLI, 2004).
Entretanto, quando a heterogeneidade ocorre de forma severa ou imprevisível, impondo uma
condição estressante, a plasticidade pode se tornar mal adaptativa (SULTAN, 2007; CRISPO
et al., 2010).
Plantas são extremamente plásticas (CALLAWAY; PENNINGS; RICHARDS, 2003)
e respondem diferencialmente as variações ambientais de acordo com os traços funcionais que
possuem (VIOLLE et al., 2007). As mudanças globais, que incluem ações generalizadas e
ações locais com efeitos globais, alteram diversas propriedades do ambiente (MATESANZ;
GIANOLI; VALLADARES, 2010), que interferem direta ou indiretamente na abundância dos
recursos utilizados pelas plantas, na estabilidade e previsibilidade dos sistemas nos quais essas
se encontram.
A disponibilidade de água é um dos fatores ambientais mais determinantes para a
colonização e sobrevivência das plantas, influenciando tanto suas respostas em curto prazo
5
como a evolução da plasticidade fenotípica (GIANOLI, 2004). O regime de precipitação
global tem sofrido alterações com intensidade e consequências indeterminadas (OKI et al.,
2006). O aumento da precipitação em altas latitudes, o decréscimo da precipitação em regiões
subtropicais (ZHANG et al., 2007) e a intensificação de eventos climáticos extremos
(ALLAN; SODEN, 2008) são as principais tendências observadas.
Além das variações de precipitação a quantidade de nutrientes no solo, na água e na
atmosfera também tem sido alterada. Em condições naturais, o nitrogênio é o macronutriente
mais limitante nos ambientes terrestres (VITOUSEK, 1982; GRUBER; GALLOWAY, 2008).
No entanto, nas últimas décadas vem ocorrendo grande aumento nas concentrações desse
elemento (BASSIRIRAD, 2000), fato diretamente ou indiretamente ligado às atividades
humanas, como a incorporação de adubos no solo por práticas agrícolas (TILMAN et al.,
2001) e a queima de combustíveis fósseis (GALLOWAY et al., 1995). Existem ainda muitas
incertezas sobre as respostas das espécies diante dessas modificações, sendo que a capacidade
de aclimatação, possibilitada pela plasticidade fenotípica, pode ser determinante para a
sensibilidade diferencial das plantas em relação às mesmas (BASSIRIRAD, 2000).
Embora seja um mecanismo proposto para possibilitar a sobrevivência das espécies
em meio às mudanças globais (VALLADARES et al., 2007), pouca atenção tem sido
direcionada para testar experimentalmente qual é a influência da plasticidade fenotípica na
sobrevivência das espécies e como ocorrerá sua evolução diante desse cenário (MATESANZ;
GIANOLI; VALLADARES, 2010).
A comparação entre espécies com distintos graus de plasticidade, submetidas a
diferentes condições de água e nitrogênio, pode ser muito promissora nesse aspecto,
especialmente utilizando plantas congêneres e traços funcionais variados. A utilização de
espécies congêneres permite minimizar os efeitos genéticos para a variação da plasticidade
interente ao distanciamento filogenético das mesmas. Associado a isso, experimentos com
plantas que apresentam diferentes traços funcionais, possibilitam uma maior generalização
dos resultados, considerando que esses traços podem influenciar em suas respostas ao
ambiente, acarretando maior ou menor tolerância às essas variações.
Procedimentos de seleção também são de grande utilidade porque, embora a
evolução da plasticidade tenha sido comprovada (GIANOLI, 2004), os fatores que conduzem
a essa evolução são pouco conhecidos. Os efeitos da previsibilidade e da intensidade das
variações ambientais dificilmente podem ser separados em campo. Isso é especialmente
problemático considerando que condições extremas e imprevisíveis são cada vez mais comuns
e não se sabe como a plasticidade evoluirá diante desse cenário (GUTSCHICK;
6
BASSIRIRAD, 2003; MATESANZ; GIANOLI; VALLADARES, 2010).
Para determinar qual é a influencia da plasticidade fenotípica na sobrevivência das
espécies em meio às mudanças globais será conduzido um experimento fatorial com
diferentes simulações de água e nitrogênio, baseadas em previsões para as mudanças globais.
Serão utilizados três pares de espécies congêneres com amplitude de distribuição distinta,
sugerindo diferentes níveis de plasticidade. Os pares serão formados por gramíneas Panicum
millegrana e P. tricholaenoides, herbáceas Porophyllum ruderale e P. obscurum e arbóreas
Schinus terebinthifolius e S. weinmannifolius para uma maior diferenciação de traços
funcionais. A evolução da plasticidade fenotípica será avaliada em um experimento de
seleção, no qual P. ruderale será cultivada em diferentes níveis de variabilidade ambiental.
Sendo assim, o desenvolvimento desse estudo poderá contribuir para a orientação de medidas
de proteção mais eficazes focadas em espécies com maior ou menor grau de plasticidade,
sejam estas economicamente importantes ou não, e para o melhor entendimento dos processos
de seleção sobre a mesma.
2. JUSTIFICATIVA
O acúmulo de nitrogênio e as desordens de precipitação são componentes
importantes das mudanças globais e acredita-se que a plasticidade fenotípica pode favorecer
as plantas diante desse cenário. Nesse contexto, a comparação de espécies congêneres com
distintos graus de plasticidade, submetidas a diferentes condições de água e nitrogênio, se
torna de extrema importância para determinar qual é a influencia da plasticidade fenotípica
em meio a essas variações. A partir desses dados, esse estudo contribuirá para a orientação de
medidas de proteção mais eficazes, focadas em espécies com maior ou menor grau de
plasticidade. Estes resultados também poderão ser aplicados para espécies economicamente
importantes, indicando quais culturas seriam mais sensíveis a esses componentes das
mudanças globais. Da mesma forma, apesar das evidências sobre o aumento da plasticidade
em ambientes variáveis, a influência da previsibilidade e da intensidade dessas variações na
evolução da plasticidade permanece incerta. Considerando que variações extremas e
imprevisíveis tem se intensificado nos últimos anos, conhecer como ocorrerá sua evolução
nessas condições possibilitará previsões mais claras sobre a plasticidade desses organismos.
3. OBJETIVO GERAL
Avaliar qual a influência da plasticidade fenotípica para a sobrevivência das espécies
em meio às mudanças globais e como ocorre sua evolução sob cenários ambientais distintos.
7
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Quantificar o crescimento e a produção de inflorescências de seis espécies com
distintos potenciais plásticos cultivadas em diferentes condições de água e nitrogênio;
Relacionar as características mensuradas em ambas às espécies com o ajuste dessas no
ambiente;
Determinar se o potencial plástico das espécies influencia seu desempenho no
ambiente;
Avaliar se em meio às alterações das condições ambientais espécies com maior ou
menor grau de plasticidade serão favorecidas;
Orientar iniciativas de proteção mais eficazes focadas em espécies com maior ou
menor grau de plasticidade;
Quantificar o crescimento e a produção de sementes de indivíduos de P. ruderale
selecionados em condições constantes, variáveis previsíveis, variáveis imprevisíveis e
variáveis extremas em duas condições teste simultaneamente;
Comparar os resultados obtidos com a população natural dessa espécie;
Identificar se ocorre e como ocorre a evolução em curto prazo da plasticidade
fenotípica sob essas condições;
Avaliar a germinabilidade de sementes de P. ruderale e P. obscurum;
Verificar se a plasticidade da espécie influência na germinação de suas sementes;
Analisar qualitativamente e quantitativamente a morfoanatomia de folhas e raízes nas
espécies P. ruderale e P. obscurum cultivadas em diferentes condições de água e
nutrientes.
5. HIPÓTESES
Hipótese 1. A maior distribuição fitogeográfica das espécies P. millegrana, P. ruderale e S.
terebinthifolius em relação as suas respectivas congêneres decorre do maior nível de
plasticidade manifestado pelas primeiras;
Hipótese 2. A plasticidade fenotípica influencia as respostas das espécies às mudanças
globais;
Hipótese 3. O maior potencial plástico favorecerá as espécies P. millegrana, P. ruderale e S.
terebinthifolius quando as variações ambientais estiverem dentro dos seus respectivos limites
de tolerância;
8
Hipotese 4. Em condições de grande estresse onde essa capacidade de aclimatação é
diminuída e os custos de sua manutenção se tornam maiores, a plasticidade fenotípica será
mal adaptativa;
Hipótese 5. A plasticidade fenotípica está sujeita a mecanismos evolutivos;
Hipótese 6. Sua evolução ocorrerá de maneira diferencial de acordo com o ambiente de
seleção;
Hipótese 7. O fitness das plantas obtidas das sementes produzidas em condições constantes
será maior nessa condição;
Hipótese 8. Os distintos potenciais plásticos serão manifestados desde a germinação;
Hipótese 9. A plasticidade fenotípica diferencial ocorrerá para a morfoanatomia de folhas e
raízes.
6. METODOLOGIA
O desenvolvimento desse projeto consistirá na realização de três experimentos e na
análise morfoanatômica, sendo as espécies utilizadas relativas a cada procedimento. Os
procedimentos corresponderão a diferentes capítulos da tese.
6.1 Área de estudo
O Parque Estadual de Vila Velha (PEVV) possui área de 3.803,28 ha, localizando-se
no município de Ponta Grossa, PR, nos limites aproximados 25º12’20”-25º15’50”S e
49º57’50”-50º03’10”W, na região dos Campos Gerais (SCHWARTSBURD; LABIAK, 2007).
De acordo com a classificação de Köeppen, essa região possui tipo climático Cfb –
clima subtropical úmido mesotérmico (CERVI et al., 2007), com média de temperatura do
mês mais quente inferior a 22 ºC, caracterizando um verão brando, e do mês mais frio inferior
a 18 ºC, com ocorrência de geadas severas, sem estação seca definida, porém, com menor
umidade no período do inverno; sua altitude varia de 800 a 1.100 m (SCHWARTSBURD;
LABIAK, 2007).
No interior do PEVV estão presentes três formações geológicas distintas, sendo
essas: Arenito Furnas, Folhelos Ponta Grossa e Arenito Itararé (BODZIAK JÚNIOR;
MAACK, 1946). Essas são rochas sedimentares paleozóicas, sendo as duas primeiras datadas
do período Devoniano e a última do período Carbonífero (IAP, 2004).
A variedade tipológica de solos encontrada nesse ambiente (MELO et al., 2004;
SCHWARTSBURD; LABIAK, 2007), onde predominam solos sedimentares antigos
derivados de arenitos e folhelhos (IAP, 2004), que deram origem a várias galerias e
9
afloramentos rochosos distintos (MELO et al., 2004; SCHWARTSBURD; LABIAK, 2007),
resulta-se possivelmente, do controle de circulação da água de infiltração, drenagem e erosão
do solo, propiciada pelo substrato rochoso e o relevo da região (UEPG, 2003).
O PEVV encontra-se no domínio da floresta ombrófila mista, savana gramíneo
lenhosa, com contribuição da floresta ombrófila densa, e localiza-se próximo as áreas de
floresta estacional semidecidual (CERVI et al., 2007). Em sua extensão podem ser
diferenciadas distintas zonas de vegetação atribuídas à variedade de condições de umidade e
tipos de solos características desse ambiente.
6.2 Coleta de dados e materiais vegetais
Serão identificadas as espécies P. millegrana, P. tricholaenoides, P. ruderale, P.
obscurum, S. terebinthifolius e S. weinmannifolius das quais serão coletados órgãos
reprodutivos para herborização e sementes para o cultivo experimental. As sementes serão
coletadas de 10 indivíduos por espécie, em média.
A identificação em família, gêneros e espécies seguirá padrões da taxonomia clássica,
feita com base em caracteres morfológicos, utilizando-se vários exemplares, com auxílio de
literatura específica.
O material botânico será coletado em campanhas, sendo observada a presença de
frutos maduros. Serão coletadas partes reprodutivas do material botânico (flor e fruto em
diferentes estágios de desenvolvimento), com ajuda de tesoura de poda manual. Estas
amostras serão levadas para o laboratório de Botânica da Universidade Estadual de Maringá
(UEM), onde serão herborizadas (FIDALGO; BONONI, 1989) e depositados no HUEM
(Herbário da Universidade Estadual de Maringá).
A coleta de sementes será realizada manualmente para os três experimentos da maior
quantidade de indivíduos e populações possíveis.
6.3 Experimento 1. Cultivo em casa de vegetação
Para testar as hipóteses 1, 2, 3 e 4 será montado um experimento com três fatores,
sendo esses: espécie, água e nitrogênio. Esses fatores serão divididos em seis níveis para
espécie, quatro níveis para água e dois níveis para nitrogênio.
Espécies - Panicum millegrana é uma gramínea que ocorre em toda extensão do território
brasileiro incluindo áreas antropizadas. As mesmas características botânicas são
compartilhadas por P. tricholaenoides, no entanto apesar desta ter uma ampla distribuição é
comparativamente menor do que a anterior (FORZZA et al., 2010), sendo que para ambas
10
faltam informações botânicas básicas. Porophyllum ruderale, conhecida popularmente como
arnica, é herbácea, anual (TAKEDA; FARAGO, 2001), com reprodução por sementes
ocorrendo em cerca de 120 dias de idade (FONSECA; CASALI; BARBOSA, 2007).
Potencialmente capaz de sobreviver em ambientes modificados é referida como ruderal e
daninha (FERREIRA; LACA-BUENDIA, 1978). P. obscurum, congenérica a P. ruderale é
bastante similar a anterior, com exceção ao seu caráter infestante, encontrando-se poucas
informações a seu respeito. Schinus terebinthifolius conhecida popularmente como aroeirapimenteira é uma espécie arbórea muito promissora para práticas de recuperação de áreas
degradadas (SABBI; ÂNGELO; BOEGER, 2010). Foi introduzida intencionalmente no sul da
Florida (EUA) onde se tornou invasora, sendo que as características de rápido crescimento,
fácil aclimatação e alelopatia a atribuíram grande vantagem sobre as espécies nativas
(MORTON, 1978). S. weinmannifolius possui as mesmas características citadas para S.
terebinthifolius, no entanto ocorre em um menor número de ambientes (FORZZA et al., 2010)
e não tem históricos de invasora.
Água - Baseado nas tendências observadas para precipitação serão feitas três simulações. Para
simulação de ambientes com aumento de precipitação as plantas serão irrigadas
alternadamente a cada 24 h em uma semana e a cada 48 h na semana seguinte. Ambientes
com decréscimo de precipitação serão alcançados com irrigação semanal alternada entre 72 h
e 1 vez por semana. Já, no tratamento de condições extremas as plantas receberão irrigação a
cada 12 h em uma semana e ausência de irrigação na semana seguinte (GIANOLI, 2004).
Como controle as plantas serão irrigadas a cada 48 h em uma semana e 72 h na semana
seguinte. Os tratamentos diferirão apenas na frequência de irrigação, a qual será feita com um
irrigador automático instalado de forma a fornecer a mesma quantidade de água para todas as
plantas no tratamento, sendo estes isolados com sacos plásticos para aumentar a
especificidade do procedimento.
Nitrogênio - O substrato utilizado será areia lavada e mistura Provaso na proporção 4:1, que
consistirá na concentração normal de nitrogênio (controle), esta mistura será comparada aos
solos não antropizados no interior do PEVV onde as espécies ocorrem, sendo realizadas
correções com acréscimo de areia ou de mistura comercial se necessário. A simulação de
ambientes antropizados se dará pela avaliação do solo de áreas cultivadas, sendo adicionada
uma quantidade de nitrato para igualar ao valor obtido. A aplicação será feita manualmente de
acordo com a necessidade. Foi escolhido o nitrato e não o NPK, devido à característica
11
limitante e a elevada interferência humana sobre as quantidades de nitrogênio. A determinação
dos nutrientes do solo será realizada pelo laboratório de química da UEM.
Condução do experimento - Para condução desse experimento, serão coletadas sementes,
mínimo de 500 por espécie no PEVV, do maior número de indivíduos e populações possíveis.
Essas serão postas para germinar simultaneamente nos sacos plásticos, duas a cinco sementes
por saco, para garantir a germinação, sendo realizado o desbaste caso mais de uma semente
germine. A irrigação será realizada a cada 24 h até a expansão dos eofilos. Posteriormente as
plântulas serão submetidas aos respectivos regimes de irrigação. Os sacos plásticos de 18x30
cm serão marcados diferencialmente, de acordo com o tratamento e a espécie. O experimento
será totalmente casualizado, sendo as plântulas sorteadas aleatoriamente entre os tratamentos
e cultivadas durante a realização do experimento, montado na estufa anexa ao T-10 da UEM.
As plantas terão seu posicionamento aleatorizado no transplante das plântulas e 60 dias após
esse momento para as espécies gramíneas e herbáceas e 150 dias após para as espécies
arbóreas. Ou seja, na metade do período de cultivo em ambos os grupos, para evitar a
influencia de fatores relacionados ao posicionamento das plantas no experimento.
Variáveis mensuradas - Serão mensurados: biomassa fresca e seca da planta, raiz e parte
aérea, comprimento da raiz e parte aérea, razão raiz parte aérea e número de inflorescências
por planta. Estas serão obtidas após a floração das plantas, sendo tomadas de 30 indivíduos de
cada espécie para cada tratamento.
Análise dos dados - Para avaliar se as espécies apresentam plasticidade será utilizado um
índice de plasticidade fenotípica, que varia de zero a um, o qual será calculado para cada
característica mensurada, como a diferença entre o valor máximo e o mínimo entre os dois
tratamentos extremos, dividido pelo valor máximo obtido (VALLADARES et al., 2000).
O efeito das espécies, água e nutrientes, juntamente com suas interações, será testado
com uma ANOVA trifatorial. A normalidade do conjunto dos dados será avaliada através do
teste de Shapiro-Wilk, enquanto a homocedasticidade será testada pelo teste de Levene. Os
testes serão realizados no software Statistica 7.0.
6.4 Experimento 2. Seleção da plasticidade fenotípica em quatro ambientes modelos
O experimento de seleção (figura 1) será utilizado para testar as hipóteses 5, 6 e 7.
Este será montado anteriormente ao experimento 1 na casa de vegetação experimental da
UEM. Somente a espécie P. ruderale será utilizada, considerando o seu fácil cultivo e o
maior conhecimento sobre o seu tempo de reprodução, sendo esse bastante curto (cerca de
12
120 dias) (FONSECA; CASALI; BARBOSA, 2007), o que permitirá a seleção de um maior
número de gerações.
Figura 1. Visão geral do experimento e protocolo de seleção. Na estufa, as plantas serão cultivadas em
diferentes ambientes com regimes de irrigação específicos (Constante I, Variável previsível, Variável
imprevisível e Variável extremo), sendo obtidas sementes do maior número de gerações possíveis. Cinquenta
indivíduos escolhidos aleatoriamente serão utilizados para fundar cada linhagem em cada geração. Sementes da
população natural serão utilizadas para comparação (Controle). Efeitos ambientais maternos serão minimizados
na penúltima geração onde as plantas serão cultivadas em condições idênticas (Comum). Na última fase do
experimento (Teste), as sementes de todas as gerações experimentais e das populações naturais serão divididas
entre dois ambientes (Constante I e Constante II), sendo a plasticidade medida como a diferença das
características avaliadas entre os mesmos (modificado de STANTON; ROY; THIEDE, 2000).
Para amostragem de uma maior variedade de genótipos, a coleta de sementes para
esse experimento será realizada em diversos locais, e não apenas no Parque Estadual de Vila
Velha, já que a variabilidade genética é um dos pressupostos para que ocorra a seleção,
tornando os resultados mais confiáveis. As sementes serão coletadas de 50 populações
separadas entre 3 km a 450 km, no estado do Paraná. Serão coletadas sementes de um a dois
indivíduos para cada população, mínimo de 50 sementes por população, totalizando 2.500
sementes. Parte dessas sementes (1.500), somente as que consistirão no controle desse
experimento, serão colocadas sob lâmpada incandescente (40W) para secagem por uma
semana, e então armazenadas em sacos pretos sob temperatura ambiente a fim de assegurar a
máxima viabilidade até sua utilização (KLEIN; FELIPPE, 1991).
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Ambientes modelos
Constante I - Para simulação de populações que ocorrem em ambientes constantes ou
homogêneos, onde teoricamente a plasticidade deve ser menor, as plantas de P. ruderale serão
cultivadas em condições fixas de água, sendo irrigadas a cada 48 h durante toda realização do
experimento.
Variável previsível - A simulação de ambientes variáveis e previsíveis se dará através da
alternância cíclica das plantas entre distintos períodos de irrigação. Essas serão irrigadas a
cada 24 h durante cinco dias, a cada 72 h durante nove dias, a cada 48 h durante 10 dias e a
cada 72 h durante seis dias, repetindo o ciclo por cinco vezes a cada geração. Dessa forma, as
sementes coletadas em condições variáveis simularão populações que ocorrem em ambientes
heterogêneos onde se espera que a plasticidade seja maximizada caso haja algum mecanismo
seletivo sobre a plasticidade fenotípica nesses indivíduos.
Variável imprevisível - Ambientes variáveis imprevisíveis serão simulados por meio da
alternância aleatória das plantas entre os mesmos períodos de irrigação citados para o
ambiente Variável previsível. O tempo total de cada frequência de irrigação ao fim da geração
(150 dias) será igual ao utilizado no ambiente previsível (SCHEINER, 2002).
Variável extremo – Para simular condições ambientais extremas, as plantas serão irrigadas a
cada 12 h durante cinco dias, sem irrigação durante nove dias, a cada 48 h durante 10 dias e
sem irrigação durante seis dias, repetindo esse ciclo cinco vezes durante a geração de forma a
evitar o confundimento dos fatores imprevisibilidade e intensidade.
Sistematizações
Irrigação - Para todos os tratamentos as plantas receberão a mesma quantidade de irrigação
ao fim do experimento (75 períodos de irrigação), diferindo apenas na previsibilidade e na
severidade dessa distribuição.
Substrato - O substrato (igual ao descrito para o experimento 1) será o mesmo para todos os
ambientes modelos, não recebendo adição de nitrogênio.
Cruzamentos - Assim que constatado o início do florescimento serão realizadas polinizações
cruzadas aleatórias, ensacando as flores que receberem e doarem grãos de pólen até o fim do
período de floração. Os cruzamentos serão feitos de forma manual com auxilio de um pincel,
sendo todas as polinizações realizadas dentro do respectivo tratamento. Para assegurar a
eficácia do procedimento, minimizado a contaminação genética entre os tratamentos, será
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utilizado um pincel para cada tratamento, os quais serão isolados por meio de plásticos
transparentes, sendo o jaleco trocado para a realização do processo em cada tratamento
(STANTON; ROY; THIEDE, 2000).
Posicionamento - Para evitar a influência de outros efeitos não controlados durante a
realização do experimento, como fatores advindos da localização das plantas na estufa, os
blocos que consistirão em cada tratamento terão seu posicionamento aleatorizado no plantio
das sementes e 60 dias após esse momento. Os procedimentos descritos acima serão utilizados
para todas as gerações.
Coleta de sementes - As sementes serão retiradas de todos os indivíduos dos tratamentos
escolhidos (mínimo de 500 sementes por tratamento), na proporção relativa ao número de
sementes produzidas, a fim de simular as condições naturais onde indivíduos com maior
número de sementes fornecem maior contribuição genética para as próximas gerações. Essas
sementes serão coletadas de todas as gerações (três gerações). Dessa forma as sementes serão
preservadas até a última coleta para o teste de plasticidade.
Plantio - A cada novo plantio, as sementes serão postas para germinar simultaneamente nos
sacos plásticos, cinco sementes por saco, para garantir a germinação, sendo realizado o
desbaste caso mais de uma semente germine. Essas serão mantidas sob as mesmas condições
irrigadas a cada 24 h até a expansão dos eofilos para então serem submetidas aos respectivos
regimes de irrigação. Os sacos plásticos (número de 200 a 1200 de acordo com a etapa do
experimento) de 18x30 cm serão marcados diferencialmente, de acordo com o tratamento e
geração. Plântulas reservas serão mantidas em 3 sacos extras para cada tratamento caso haja
necessidade de reposição de plantas que morrerem ao longo do experimento.
Ambientes auxiliares
Controle - O ambiente controle será o de ocorrência natural da espécie, ou seja, representará a
plasticidade “selvagem” da população sem sofrer nenhuma manipulação experimental. Para
isso serão utilizadas as sementes coletadas das populações de P. ruderale em campo, retiradas
da mesma amostra utilizada para o cultivo experimental em casa de vegetação, as quais
estarão armazenadas em sacos pretos (como descrito anteriormente) para manter a máxima
viabilidade até sua utilização no experimento. Essas pertencerão, portanto, a mesma fonte
genética dos indivíduos cultivados experimentalmente, permitindo uma comparação confiável
da plasticidade natural com a selecionada ao fim do experimento.
15
Comum - Para minimizar o impacto dos efeitos maternos (ROACH; WULFF 1987;
GALLOWAY, 1995; KAWECKI; EBERT, 2004), na geração antecedente ao teste, todas as
plantas serão distribuídas aleatoriamente e cultivadas em um ambiente comum, sendo
irrigadas a cada 72h.
Constante II - Será simulado também um segundo ambiente com condições constantes a fim
de possibilitar a comparação entre a plasticidade dos indivíduos advindos da população
natural e das respectivas gerações e tratamentos de P. ruderale. Isso porque, a plasticidade
fenotípica será obtida pela diferença das características mensuradas em cada grupo quando
esses estiverem expostos a duas condições constantes distintas. Dessa forma, as plantas de P.
ruderale serão cultivadas em condições fixas de água, irrigadas a cada 12h, sendo mantidas a
concentrações altas de nitrogênio, determinadas com um experimento piloto.
Teste de plasticidade
Para condução desse teste as sementes serão separadas de acordo com sua fonte de
coleta, ou seja, retiradas da população em campo e dos indivíduos selecionados de acordo
com o tratamento e geração.
Dessa forma, as sementes serão transferidas para os sacos plásticos individuais
distribuídos aleatoriamente entre as duas condições constantes, sendo utilizado o mesmo
número de sementes de cada fonte para ambas as condições. Assim, a plasticidade obtida será
resultante das diferenças nas características avaliadas entre os indivíduos expostos aos
tratamentos constante I e constante II.
Variáveis mensuradas - Serão mensurados: biomassa fresca e seca da planta, raiz e parte
aérea, comprimento da raiz e parte aérea, razão raiz parte aérea e número de frutos por planta.
Estas medidas serão obtidas após a frutificação das plantas, sendo tomadas de 50 indivíduos
para a população natural e para cada linhagem e geração nos ambientes Constante I e
Constante II.
Análise dos dados - Para testar a ocorrência de evolução da plasticidade fenotípica será
utilizado um índice de plasticidade fenotípica, que varia de zero a um, o qual será calculado
para cada característica mensurada, como a diferença entre o valor máximo e o mínimo entre
os diferentes tratamentos, dividido pelo valor máximo obtido (VALLADARES et al., 2000).
16
6.5 Experimento 3. Germinação
O experimento de germinação será conduzido para testar a hipótese 8, sendo
estabelecidos três fatores, espécies (P. ruderale e P. obscurum), luz (escuro constante e
fotoperíodo de 12h) e temperatura (15ºC, 20°C, 25°C e 30°C). Para tal, serão utilizadas
câmaras de germinação com temperatura e fotoperíodo controlados e alumínio para envolver
as placas de Petri no tratamento de escuro, no qual as sementes serão examinadas sob luz
verde de segurança.
As sementes coletadas de P. ruderale e P. obscurum no PEVV serão levadas para o
laboratório de Fisiologia da UEM, onde serão distribuídas aleatoriamente em placas de Petri
recobertas com duas folhas de papel Germitest, umedecidas com água destilada, sendo
utilizadas amostras de 100 sementes por tratamento, distribuídas em cinco repetições de 20
sementes (OLIVEIRA; PIÑA-RODRIGUES; FIGLIOLIA, 1989; GARCIA; DINIZ, 2003).
Caso não haja ampla disponibilidade de sementes, a amostragem será reduzida, utilizando-se
no mínimo cinco sementes por repetição.
Os testes serão realizados, inicialmente, em temperatura de 25°C, sob fotoperíodo
de 12h e escuro contínuo. Posteriormente, será verificada a germinabilidade das sementes
sob as diferentes temperaturas procedendo-se como acima descrito. A germinação será
avaliada diariamente sendo consideradas germinadas as sementes que apresentarem 3mm de
protrusão da raiz primária.
Variáveis mensuradas - Com os resultados obtidos serão calculados a porcentagem de
germinação, índice de velocidade de germinação, tempo médio de germinação (FERREIRA;
BORGHETTI, 2004) e coeficiente de uniformidade da germinação (CUG) (SANTANA;
RANAL, 2004).
Análise dos dados - O efeito das espécies, luz e da temperatura, juntamente com suas
interações, será testado com uma ANOVA trifatorial. A normalidade do conjunto dos dados
será avaliada através do teste de Shapiro-Wilk, enquanto a homocedasticidade será testada
pelo teste de Levene. Os testes serão realizados no software Statistica 7.0.
6.6 Avaliação morfoanatômica - Folhas e raízes
A avaliação morfoanatômica será feita para o teste da hipótese 9, utilizando-se os
indivíduos de P. ruderale e P. obscurum cultivados no experimento 1 quando as plantas
atingirem a maturidade (presença de estruturas reprodutivas).
17
Morfologia - serão coletadas cinco folhas do nó padronizado da planta de 10 indivíduos de
cada tratamento para as duas espécies, totalizando 160 folhas. Estas serão prensadas entre
jornais e secas em estufa até o alcance de um peso constante.
Variáveis mensuradas - Serão obtidos a massa seca foliar (gramas) em balança analítica de
precisão e a área foliar (cm2) com o programa Image-Pro Plus. Dividindo-se a área pela
massa seca da folha será obtida a área foliar específica (AFE).
Anatomia - serão analisados os nomofilos e as raízes das plantas de P. ruderale e P.
obscurum, sendo utilizadas cinco réplicas de cada órgão para cada combinação. A análise
será feita em microscópio de luz, sendo o material fixado em glutaraldeído (JOHANSEN,
1940; KRAUS; ARDUIN, 1997), armazenado em álcool 70% (JOHANSEN, 1940),
desidratado em série alcoólico etílica, incluído em historresina Leica e secionado em
micrótomo de rotação. As seções serão feitas no limbo (região mediana) do nó padronizado
da planta e nas raízes (região apical) e coradas com azul de toluidina (O’BRIEN; FEDER;
MCCULLY, 1964).
Variáveis mensuradas - Os nomofilos terão determinados a espessura da folha, a espessura
da cutícula/camada cuticular, epiderme de ambas as faces, o mesofilo e os parênquimas
paliçádico/esponjoso. Para tal, serão efetuadas três medidas por indivíduo em diferentes
seções utilizando-se do programa Image-Pro Plus no qual serão mensuradas as imagens
previamente fotografadas com as escalas específicas para cada caso. Para as raízes serão
mensurados área total da raiz, área do cilindro central, diâmetro dos vasos do xilema e área
de espaços intercelulares do parênquima. Em três seções por indivíduo será mensurado o
diâmetro de três vasos e de três espaços intercelulares com programa Image-Pro Plus
utilizando-se imagens previamente fotografadas com as escalas específicas para cada caso.
Análise dos dados - O efeito das espécies, água e dos nutrientes, juntamente com suas
interações, será testado com uma ANOVA trifatorial. A normalidade do conjunto dos dados
será avaliada através do teste de Shapiro-Wilk, enquanto a homocedasticidade será testada
pelo teste de Levene. Os testes serão realizados no software Statistica 7.0.
18
7. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
Atividades/Semestres
1°Sem.
2°Sem.
1°Sem.
2°Sem.
1°Sem.
2°Sem.
1°Sem.
2°Sem.
1°Sem.
2015
2015
2016
2016
2017
2017
2018
2018
2019
Coleta: sementes
X
X
Revisão bibliográfica
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Realização experimento 1
X
X
X
Realização experimento 2
X
X
X
Realização experimento 3
X
Análise morfoanatômica
X
X
X
X
Análise dos dados
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Redação da tese
X
X
X
Entrega da tese
X
Defesa da tese
X
8. REFERÊNCIAS
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