GENÉTICA MOLECULAR E HUMANA Doença de Huntington´s Inicialmente conhecida por chorea coreografia ou dança; Os doentes apresentam movimentos constantes de torção ou rotação bruscos no Corpo Epidemiologia A prevalência global é de 5,7 casos por 100 000 pessoas entre pessoas da Europa Ocidental, América do Norte e Australianos, e de 0,40 casos por 100 000 entre asiáticos; Sintomas Evidente entre os 30 e os 50 anos de idade, mas pode aparecer a qualquer idade, desde a infância até à terceira idade Inicia-se por alterações subtis da personalidade, cognição e aptidões físicas: • Alterações na capacidade de memória e julgamento, bem como dificuldades em guiar, apreender, lembrar, responder ou tomar decisões; • Com a progressão da doença, as capacidades intelectuais ficam cada vez mais comprometidas, movimentos incontroláveis, dificuldade em falar, estados depressivos, alucinações e distúrbios obsessivo-compulsivos. Patogénese Resulta da degeneração, geneticamente programada, dos neurónios Gene responsável – IT15 (cromossoma 4) Gene IT15 regula, controla e codifica a produção de uma proteína huntingtin Essencial para o normal funcionamento cerebral; A sequência CAG é repetida várias vezes produção de uma proteína anormal O nº de repetições está associado à idade de aparecimento dos primeiros sintomas; Modo de transmissão Distúrbio autossómico dominante; Cada descendente tem 50% de probabilidade de herdar o gene; Pode surgir de forma espontânea alteração esporádica do gene para a HD (raro). Diagnóstico Exame médico, neurológico e psicológico e por uma história familiar detalhada. Os testes genéticos podem ser usados para confirmar ou excluir o diagnóstico. 1 Tratamento Não existe cura para esta doença nem nenhuma estratégia para impedir a sua progressão. Os objetivos do tratamento são retardar o aparecimento dos sintomas e manter o doente autónomo e ativo durante o maior período de tempo possível, através de terapia farmacológica; Polineuropatia Amiloidótica Familiar Conhecida por Paramiloidose ou Doença dos Pezinhos; Identificada nos anos 50 pelo Professor Corino de Andrade Epidemiologia • • • • Maior prevalência na Póvoa de Varzim e Vila do Conde; 90.3 por 100000 pessoas; Início da doença aos 20-30 anos; Conduz à morte em 10-12 anos após início dos sintomas. Sintomas • • • • • • Perda da destreza motora, de sensibilidade táctil e da dor (polineuropatia periférica); Problemas cardíacos (hipotensão ortostáticas, arritmias, obstruções auriculoventriculares); Disfunção eréctil e urinária; Disfunções gastro-intestinais; Disfunções renais; Perturbações oculares. Patogénese Substituição de uma Adenina por uma Guanina, no exão 2 ⟶ levando à substituição de um Valina por uma Metionina na posição 30 (TTR Val30Met); Deposição sistémica de fibras de amiloide de transtirretina mutada ⟶ principalmente no sistema nervoso periférico ⟶ degenerescência axonal; Inicia-se pelas fibras de menor diâmetro, tanto mielinizadas como não mielinizadas, sendo as fibras de maior diâmetro afetadas em casos mais avançados; 2 O contacto direto dos depósitos de amiloide com as células de Schwann não produz desmielinização; Modo de transmissão • • • Distúrbio autossómico dominante; Existem casos em que os portadores não manifestam a doença; Cada descendente tem 50% de probabilidade de herdar o gene. Diagnóstico • • • Avaliação Clínica – Neurofisiológica; Análise histológica; Análise Genética e identificação da mutação (TTR Val30Met). Tratamento Tratamento Farmacológico; Transplante Hepático: • O fígado é um grande produtor de TTR; • O transplante de fígado diminui os altos níveis anormais de proteína no sangue; • O período de manifestação antes da doença condiciona o tratamento. Diagnóstico genético pré-implantatório e o diagnóstico pré-natal Diagnóstico pré-natal ⟶ identifica os fetos portadores da doença, na condição de uma possível interrupção da gravidez, sendo necessário o prévio consentimento informado dos progenitores. Este é realizado através de uma amniocentese, que permite detetar a proteína anormal (TTR Met30), às 14/16 semanas de gestação. Diagnóstico genético pré-implantatório ⟶ embriões obtidos por fertilização in vitro. No terceiro dia de desenvolvimento, são removidas uma ou duas células (blastómeros), por biopsia e posteriormente avaliados PCR ou FISH. Os embriões geneticamente normais são depois transferidos para o útero materno. Fibrose Cística Epidemiologia É uma das doenças genéticas mais letais; Varia entre os diferentes grupos étnicos: • • Afro-americanos ⟶ 1:15000; Caucasianos ⟶ 1:3500; Foi considerada uma doença infantil ⟶ aumento das taxas de sobrevivência ⟶ 10 para 30-40 anos. 3 Sintomas • • • • • • • Pele muito salgada; Tosse persistente; Apetite excessivo ⟶ baixo ganho de peso; Infeções respiratórias; Estômago hiperacídico; Esterilidade masculina; Osteoporose. Patogénese Provocada por uma mutação num único gene localizado no cromossoma 7; Codifica uma proteína de 1480 aa- CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator); Nas células normais a CFTR funciona como um canal permitindo a passagem de iões CL-; A CFTR deficiente não deixa passar os iões originando um desequilibro salino produção de um muco espesso e pegajoso. Modo de transmissão Distúrbio autossómico recessivo; Manifesta-se em descendentes que herdaram 2 cópias alteradas; Quando ambos os progenitores possuem uma cópia alterada: • • • 25% de probabilidade de herdar 2 cópias alteradas e herdar a doença; 25% de probabilidade de herdar 2 cópias normais; 50% probabilidade de herdar uma cópia alterada e 1 normal – portador. Diagnóstico Sintomatologia típica da FC “Teste do Suor” – em que mede a quantidade de sal do suor; Complementado por testes genéticos; Tratamento Não tem cura, mas pode fazer-se: • • • Terapias com mucolíticos; Terapias anti-inflamatórias e anti-microbianas; Transplante do pulmão; Distrofia Muscular de Duchenne Epidemiologia A mais comum e também a mais grave das distrofias musculares; 1,7 - 4,2 por cada 100000 pessoas; 4 A prevalência poderá não representar totalmente a realidade da doença pois muitas vezes as pessoas afetadas morrem ainda antes dos 20 anos; Sintomas Iniciam geralmente entre 1-6 anos de idade; Enfraquecimento progressivo dos músculos das pernas e da pélvis; Perda de massa muscular; Fadiga, possibilidade de comprometimento intelectual, contrações musculares, hipertrofia dos músculos do crânio, deficiências respiratórias e cardíacas; Aos 12 anos, a maioria dos doentes andarão de cadeira de rodas. Patogénese Delecção no cromossoma X Xp21; Mutação do gene responsável pela codificação da proteína Distrofina – proteína chave do citoesqueleto; A distrofina está presente na parte citoplasmática da membrana muscular, ligando citoesqueleto interno à matriz extracelular; Anomalias na ligação entre estes complexos leva a alguns tipos de distrofias musculares, incluindo a DMD. Modo de transmissão Distúrbio recessivo ligado ao cromossoma X As mulheres são raramente afetadas; As filhas das portadoras podem transmitir o gene alterado para os filhos; Os filhos de uma mãe portadora têm 50% de probabilidade de terem DMD; As filhas de uma mãe portadora têm 50% de probabilidade de serem portadoras. Diagnóstico • • • • • Testes serológicos à creatinofosfoquinase (CPK) Exames neurológicos Electromiografia Biópsia muscular Testes genéticos Tratamento Não tem cura, mas pode fazer-se: • • • Fisioterapia Terapias farmacológicas Tratamento cirúrgico 5 Inativação do Cromossoma X No início do desenvolvimento embrionário um dos cromossomas X de cada célula fica inativado Corpúsculo de Barr (X heterocromático) (é visível ao microscópio óptico como um ponto escuro perimembranar no núcleo); Processo aleatório nos humanos; Se uma ♀ é heterozigótica para um gene localizado no cromossoma X pode expressar um alelo em determinadas regiões do corpo e outro alelo noutras partes do corpo; Mosaicismo Reversível – Na meiose é reativado para a formação dos gâmetas; Exemplo – Displasia ectodérmica anidrótica Modo de transmissão: Distúrbio recessivo ligado ao cromossoma X ♂ - não têm glândulas sudoríparas; ♀- podem apresentar mosaicismo (áreas do corpo com glândulas sudoríparas e outras sem). 6 Interação Génica Para um gene ter influência num fenótipo precisa de agir concertadamente com: • • • Ambientes genéticos específicos Ambiente externo (temperatura, nutrição, poluentes, stress…) Ambiente interno (carga hormonal) Nas células, as interações entre genes manifestam-se por interações físicas entre: • • • Proteínas - proteínas Proteínas e DNA Proteínas e RNA 1 gene diferentes vias de desenvolvimento pleiotropia 1 fenótipo resultado de diferentes genes Interação génica simples e epistasia Alelos mutantes de aproximadamente 12 genes diferentes podem conferir este fenótipo. 7 Teste de diagnóstico para alelos Teste de complementação Expressão de um fenótipo: 1) 1 ou mais alelos de um gene 2) Genes diferentes Exemplo: 2 mutações • Produzem o mesmo fenótipo • Serão mutações no mesmo locus? • Serão mutações diferentes em loci diferentes? Teste de complementação Determinar se dois mutantes recessivos com fenótipos semelhantes apresentam mutações no mesmo gene ou em genes distintos. Cruzamos as duas linhas mutantes: • • Se for no mesmo gene - F1 toda mutante; Se em genes diferentes - F1 toda selvagem: o Ocorreu complementação o Cada indivíduo possui, para cada mutação, 2 alelos diferentes Determinar se dois mutantes recessivos com fenótipos semelhantes apresentam mutações no mesmo gene ou em genes distintos. Proporções diíbridas modificadas Interação de genes 1) Em vias metabólicas diferentes 2) Na mesma via 1) Genes que interagem em vias metabólicas diferentes: Fenótipo produzido por 2 pigmentos separados sob controlo génico: o+ - laranja o – proteína ausente b+ - preto b – proteína ausente Ex: Cor da pele das cobras do milharal o+/o; b+/b x o+/o; b+/b o+/-; b+/- ⟶ selvagem (preto e laranja); o/o; b+/- ⟶ preta; o+/-; b/b ⟶ laranja; o/o; b/b ⟶ albino 4 fenótipos na proporção 9:3:3:1 8 2) Interação de genes na mesma via Proporções fenotipícas diferentes: geralmente existem dois ou três fenótipos resultantes das várias combinações de classes fenotípicas F2 origina proporção fenotípicas modificada (diferentes de 9:3:3:1) Exemplo: F2 proporção modificada 9:3:4 EPISTASIA Um alelo de um gene mascara a expressão dos alelos de outro gene Neste exemplo: se o gene B mascara o efeito do gene A, então o gene B é epistático em relação A EPISTASIA RECESSIVA o alelo recessivo b é epistático para o alelo a EPISTASIA DOMINANTE o alelo dominante W é epistático para os alelos y ou Y SUPRESSORES O alelo de um gene reverte o efeito de uma mutação noutro gene restabelecendo um fenótipo normal • • • Este tipo de interação pode ser verificada através de uma alteração nas razões fenotípicas; Usualmente, apenas dois fenótipos segregam e não três, como na epistasia; Supressores recessivos ou dominantes. SUPRESSÃO ≠ EPISTASIA 9 Penetrância Percentagem de indivíduos com um determinado genótipo que exibem o fenótipo associado a esse genótipo; Um indivíduo pode ter um dado genótipo, mas não expressar o genótipo correspondente, devido a modificadores, genes epistáticos ou supressores no resto do genoma, ou devido ao efeito modificador do ambiente. Expressividade Medida para descrever a gama de expressão fenotípica - extensão pela qual um dado alelo é expresso ao nível fenotípico • • Na prática, a expressividade mede a intensidade do fenótipo; É influenciada pelas condições ambientais e pelo fundo genético (expressividade variável) Ligação Factorial e Mapa Cromossómico 2 genes em diferentes pares de cromossomas; Segregação independente (Lei de Mendel de Segregação Independente); Genes localizados no mesmo cromossoma têm tendência a ser herdados juntos porque o cromossoma é transmitido como uma unidade; E se houver crossing-over? Crossing-over – Recombinação; A ocorrência de crossing-overs produz cromatídeos recombinantes e pode ser usada para mapear (localizar) genes num cromossoma; 10 Genes em ligação factorial: se a probabilidade de passarem juntos para a descendência for maior do que se segregassem independentemente; Quanto mais próximos > a probabilidade de não ocorrer crossing-over; Quanto mais afastados > a probabilidade da ocorrência de crossing over; Se dois alelos dominantes (selvagens) estão no mesmo cromossoma e os dois alelos recessivos ou mutantes estão no cromossoma homólologo; Ligação diz-se em fase de acoplamento; Gâmetas recombinantes: Ab e aB Se o alelo dominante de um locus e o alelo recessivo de outro locus estão localizados no mesmo cromossoma; Ligação diz-se em fase de repulsão; Gâmetas recombinantes: AB e ab Desvio da proporção pela 2ª Lei de Mendel Classes com menor frequência são as que possuem apenas um alelo dominante; Morgan: sugere que os genes responsáveis pelos 2 fenótipos estão localizados no mesmo par de cromossomas; Sugere que durante a meiose os cromossomas homólogos emparelham podendo trocar partes dos cromossomas – crossing-over; Frequência de Quiasmas 11 • • • Um par de cromossomas em sinapse: 4 cromátides – tétrade; Numa tétrade ocorre pelo menos um quiasma; Quanto mais comprido o cromossoma, maior será o número de quiasmas; Frequência de quiasmas entre 2 loci génicos depende da distância entre os dois loci; A frequência de gâmetas recombinantes formados por um dado genótipo é uma reflexão direta da frequência com que quiasma ocorre entre os dois genes; Frequência de Quiasmas: Quiasma entre dois loci génicos Quando um quiasma se forma entre dois loci, somente metade dos produtos meioticos será do tipo recombinante; A frequência de quiasma é duas vezes a frequência de produtos recombinantes Permutas múltiplas 2 crossing-over entre dois loci (A e C) – produtos são do tipo parental; A fim de identificarmos as permutas temos de usar um terceiro locus génico – locus B; Se existir uma probabilidade de permuta entre (A e B) e (B e C) a probabilidade de permuta dupla será o produto das duas probabilidades independentes; A probabilidade de formação de um quiasma entre dois loci que se encontram muito afastados é de 100%: • • 50% dos gâmetas são do tipo parental 50% dos gâmetas dão do tipo recombinante 12 Quando um indivíduo dihíbrido é submetido a um cruzamento teste a previsão da proporção para a descendência é de 1:1:1:1 igual à prevista quando os genes se encontram em cromossomas diferentes; Mapeamento genético Cálculo da distância entre 2 genes ligados; Unidade de distância (centimorgan) é uma expressão da probabilidade de recombinação a qual varia segundo a distância entre os genes: 1 centimorgan (CM) = 1% de recombinação Mapeamento genético: Cruzamento teste para 3 pontos Corresponde ao cruzamento de um triplo heterozigótico com um triplo recessivo; Pode ocorrer mais do que um crossing-over; Para que ocorram dois crossing-over é necessário que os genes estejam separados por pelo menos 5cM. Exercícios: Suponha que no cruzamento teste de indivíduos trihibridos com o genótipo ABC/abc se obteve a seguinte descendência: ABC/abc 36% abc/abc 36% Abc/abc 9% aBc/abc 9% ABc/abc 4% abC/abc 4% AbC/abc 1% aBc/abc 1% 1. Indicar os fenótipos parentais: ABC/abc e abc/abc 2. Indique os que têm permuta simples: Abc/abc 9% aBc/abc 9% ABc/abc 4% abC/abc 4% 13 3. Indique os que têm permuta dupla Abc/abc 1% aBc/abc 1% 4. Determinar a distância entre A-B a. Contar todas as permutas que ocorrem nessa região b. Parental é: AB ou ab c. Recombinantes Ab ou aB d. Assim, a Frequência de recombinantes (A-B) = 9% + 9% + 1% + 1% = 20% e. Distância A-B = 20 cM 5. Determinar a distância entre B-C Frequência de recombinantes (B-C) = 4% + 4% + 1% + 1% = 10% Distância A-B = 20 cM 6. Determinar a distância entre A-C d (a-C) = 10 cM + 20 cM = 30cM 7. Desenhar o mapa cromossómico 14 Citogenética Alterações cromossómicas numéricas Euploidia Euploidia – Perda ou ganho de genomas completos (ex: n, 2n, 3n, 4n – poliploidias) Poliploidia: • • • Comum nas plantas; Rara entre os animais (anfíbios, répteis, peixes); Letal nos humanos: o Mola hidatiforme parcial ou completa; o Abortos espontâneos – 1º trimestre; o Mosaicismo (3n/2n)– sobrevivência muito reduzida (retardação motora e cerebral profunda). Aneuploidia Aneuploidia – Diminuição ou aumento de apenas alguns cromossomas no cariótipo (ex: trissomia 2n+1, monossomia 2n-1) Mais frequentes em humanos: • • Não disjunção meiótica; Não disjunção mitótica. 1. Não disjunção meiótica 15 2. Não disjunção mitótica Mosaicismo Trissomias autossómicas viáveis • • • Trissomia 18 (Síndrome de Edwards); Trissomia 13 (Síndrome de Patau); Trissomia 21 (Síndrome de Down). 16 Aneuploidias ligadas ao X/Y • • Síndrome de Turner (Monossomia X); Síndrome de Klinefelter (47, XXY ou 48, XXYY). Trissomia 21 • • • • • Incidência aumenta com a idade materna: o 1:20 > 45 anos; o 1:95 > 40 anos; o 1:300 > 35 anos; o 1:1000 > 20 anos. 95% dos casos derivam da não disjunção meiótica; Risco aumentado de aborto espontâneo; Cariótipo: 47, +21; Diagnóstico pré-natal: o Líquido amniótico; o Biópsia das vilosidades coriónicas; o Diagnóstico pré-natal não invasivo FENÓTIPO • Atraso do crescimento intrauterino; • Baixa estatura; • Face larga e achatada; • Olhos com pregas epicânticas; • • • • • Língua protuberante e lábios grossos; Tonicidade muscular fraca; Atraso cognitivo (QI: 20-85); Anomalias cardíacas; Sobrevida diminuída. 17 Trissomia 13 – Síndrome de Patau Sobrevida: • • • • 45% dos casos morrem no 1º mês; 70% em 6 meses; 86% em 12 meses; Muitos poucos sobrevivem mais de 5 anos. Formas: • • • 75% - 80% são trissomias; 20% têm translocações; Alguns apresentam mosaicismo. Trissomia 18 – Síndrome de Edwards Fenótipo: • • • • • Baixo peso; Dismorfias faciais; Defeitos cardíacos; Anomalias dos membros; Malformações abdominais. Síndrome de Turner (Monossomia X) • • • • • 2/3 com retenção do X materno; Incidência 1/1500-2500; 15% abortos espontâneos; Cerca de 50% apresentam mosaicismo; 99% dos embriões não mosaicos são perdidos durante o 1º trimestre de gravidez. 18 Síndrome de Klinefelter • • • • • • • • • • 47, XXY; 48, XXYY; Mosaicismo; Outras formas raras (48, XXXY; 49, XXXYY) Hipogonadismo; Azoospermia; Testículos atróficos; Ginecomastia; Dificuldades de aprendizagem; Estatura elevada. Alterações estruturais cromossómicas • • • • Deleção; Duplicação; Inversão; Translocação. Rutura e união: • • • Espontâneas; Induzidas (ex: radiação); Crossing-over ilegítimo (ocorre em células somáticas, após emparelhamento entre segmentos de DNA repetitivo). 19 Deteção de anomalias estruturais Citogenética: • • Bandeamento diferencial. Citogenética: o 1. Colheita de células (qualquer tecido); o 2. Manutenção das células em cultura num meio com fitohemaglubina; o 3. Adição de colchicina para parar a divisão celular em metáfase; o 4. Fixar as células; o 5. Digestão com tripsina; o 6. Coloração com Giemsa. • Citogenética molecular: o Análise por microarrays Hibridação in situ: • Utilização de sondas complementares á região de DNA alvo: o Fluorescente (FISH); o o Colorimétrica (CISH); Radioatividade. 20 Mecanismos de rearranjos cromossómicos Deleção • • • • • • • • Efeito da deleção depende do tamanho e da região atingida; Deleção intragenénica leva à inativação do gene; Usualmente são deleções mutagénica tendo consequências graves; Fragmentos deletados são acêntricos – sem centrómeros, sendo estes perdidos durante a divisão celular; Deleções: o Desequilíbrio do genoma; o Possibilidade de efeito letal; o Revelação de alelos recessivos – Expressão fenotípica; o Compensação pelo outro alelo – Deleção viável. Ex: Síndrome do Cri du chat o Deleção terminal no cromossoma 5; o Choro – Mio de gato; o Face de lua; o Atraso mental. Nem todas as células do tumor mostram as deleções indicadas; Geralmente existe uma mistura de mutações cromossómicas diferentes num dado tumor. 21 Duplicações • • • Cópia extra de uma região cromossómica; As cópias podem estar localizadas adjacentes uma à outra; Ex: Crossing-over desigual o O crossing-over das regiões emparelhadas assimetricamente pode levar a uma triplicação em tandem de uma região cromossómica. Inversão • • • • • Rutura em dois locais de um cromossoma e subsequente ligação do fragmento cromossómico no sentido inverso (180º); Alteração estrutural equilibrada – Não altera a quantidade de material genético; Rutura cromoccómica intragénica – Gene não viável; Localização do centrómero: Crossing-over dentro da ansa de inversão: o Ligação dos centrómeros homólogos – ponte dicêntrica; o Produção de fragmento acêntrico (perdido durante a anafase); o Foram formados dois cromossomas alterados com duplicações e deleções; o Um cromossoma com uma sequência invertida. 22 Translocação • • Recíproca (Mais comum) Podem alterar: o O tamanho do cromossoma; o A posição do centrómero. • Recíproca: o Não há perda de material genético levando a uma translocação balanceada; o Comportamento genético da translocação recíproca: ▪ Emparelhamento dos homólogos (formação de tétradas); As translocações, inversões e deleções produzem uma esterilidade parcial pela geração de produtos meióticos não equilibrados; Rutura em dois cromossomas acrocêntricos não homólogos; Fusão resultante das ruturas: o Formação de dois cromossomas metacêntricos, um grande e um pequeno; A perda do cromossoma pequeno (fragmento) leva á conversão de dois pares de cromossomas acrocêntricos num par de metacêntricos; Exs: o Síndrome de Down familiar; o Translocações encontradas consistentemente em tumores sólidos. • • • • • Técnicas de Genética Molecular • • • • • • • Extração de DNA/RNA; PCR; Variantes da PCR; Análise dos produtos da PCR; Sequenciação – Projeto genoma humano; Genotipagem; Análise de Polimorfismos – SNP. Sequenciação – Método de Sanger • • • • Determinação da sequência de nucleótidos que compõem um fragmento de DNA; Envolve a síntese de novo de uma série de cadeias simples de DNA, usando como molde a cadeia de DNA que se quer sequenciar; A síntese começa sempre num ponto definido (por um primer) e termina por incorporação de nucleótidos terminadores; As cadeias sintetizadas são terminadas prematuramente nos vários tamanhos possíveis; 23 • Nucleótidos terminadores: o Derivados didesoxi dos nucleótidos normais – não possuem um grupo hidroxilo na posição 3’ da desoxorribose – impedindo as ligações fosfodiestéricas do DNA; o A ligação de ddA, ddC, ddG ou ddT termina adição de novos nucleótidos na cadeia recémsintetizada. Sequenciação de Nova Geração (NGS) • • • • • • • • • • • Fragmentação do DNA; Adição de dois adaptadores diferentes às terminações 5’ e 3’ de todas as moléculas. Desnaturação das cadeias – Cadeia simples; As cadeias associam-se à “flow cell”, que possui oligonucleótidos complementares aos dois adaptadores; Amplificação em ponte; Formação de uma molécula de cadeia dupla; Desnaturação; Adição de bases que emitem fluorescência; Identificação da base; Alinhamento dos dados; Vantagens: o Sensibilidade e especificidade superiores; o Maior rapidez; o Diminuição dos custos em reagentes; o A análise de genes adicionais sem aumento de custos; o Avaliação de vários loci no mesmo chip; Desvantagens: o Preço dos equipamentos 24 Projeto Genoma Humano • • • • • Iniciou-se em 1990 com James Watson; Consorcio internacional coordenado do Instituto de Saúde (NIH) dos Estados Unidos e a partir de 1993 pelo geneticista Francis Coliins; O projeto originalmente foi planeado para ser complementado em 15 anos, mas o desenvolvimento da tecnologia acelerou o seu final para 2003; Objetivos: o Identificar todos os genes humanos; o Determinar a sequência dos cerca de 3,2 biliões de pares de bases compõem o genoma do Homo sapiens; o Armazenar a informação em bancos de dados; o Desenvolver ferramentas de análise dos dados; o Transferir a tecnologia relacionada ao projeto para o setor privado; Resultados: o O genoma humano contem 3,2 biliões de nucleotídeos; o O tamanho médio dos genes é de 3000 bases, mas varia muito, sendo o maior deles o gene da distrofina com 2,4 milhões de pares de bases; o A função de cerca de 50% dos genes descobertos é desconhecida; o A sequência do genoma humano é de 99,9% exatamente a mesma em todas as pessoas; o O cromossoma 1 tem o maior nº de genes – 3168 e o cromossoma Y, o menor – 344; o Algumas sequências específicas foram associadas com numerosas doenças e disfunções (ex: cancro da mama, doenças musculares, surdez e cegueira); o Existem milhares de locais nos quais há diferença de apenas uma base –> Potencial associação a doenças cardiovasculares, diabetes, artrite e cancro. Polimorfismos – Análise genética e forense • • • • • • SNPs – Single-nucleotide polymorphisms; VNTRs – Variable number tandem repeats; STRs – Short Tandem Repeat; Diferenças na sequência de bases sem consequências patológicas diretas; Frequência na população geralmente > a 1%; Podem criar ou eliminar locais de reconhecimento de enzimas de restrição Restrictom fragment lenght polymorphism (RFLPs) 25 VNTRs • • • Os loci de VNTR são sequências de 1-5 Kb; Nº variável de uma unidade de 15100 nucleótidos; DNA fingerprinting; STRs • • • Os loci de STR são sequências de 150 pb; Nº variável de uma unidade repetitiva de <10 nucleótidos; DNA fingerprinting RFLPs – SNP Genotipagem 26 Clonagem de Genes e DNA Recombinante Transfeção Gene repórter 27 Organismos geneticamente modificados Indústria farmacêutica • • • • A insulina humana, torna-se o primeiro medicamento geneticamente modificado aprovado pela Food and Drug Administrations (FDA); Os oligonucleótidos sintéticos que codificam as cadeias A e B da insulina são inseridas em vetores distintos; Os vetores são introduzidos nas células hospedeiras (E.coli), onde a proteína de fusão βgalactosidase/insulina é sintetizada e acumulada; As cadeias de insulina são libertadas da βgalactosidase e são misturadas de forma a formarem proteínas de insulina funcionais. Vacinas orais • • • Vacinas orais – Alimentos geneticamente modificados, capazes de produzir vacinas; Um agente causador de doença é introduzido num vetor, que é inserido numa célula vegetal; Ingestão da planta contendo uma proteína codificada pelo gene patogénico despoleta uma reação imunológica, conferindo imunidade a futuras infeções. Animais 28 Humanos • Primeiro tratamento de terapia génica em humanos: o Imunodeficiência recessiva rara, caracterizada por uma deficiência da enzima adenosina desaminase (ADA) • Ex vivo o As células alvo são retiradas do organismo; o Correção do defeito genético nas células isoladas; o Seleção das células geneticamente corrigidas; o Transplantação para o individuo • In vivo o Os genes são introduzidos diretamente nas células alvo, ou seja, no tecido do indivíduo a ser tratado; o É importante a forma de administração e que o produto seja entregue na sua forma intacta (não degradada) 29 • • • Vetores para terapia génica: o Produção fácil; o Imunologicamente inertes; o Especificidade para p tecido alvo; o Capacidade de transportar genes grandes ou pequenos; o Replicação ou Integração; o Podem ser: ▪ Virais: • Elevada taxa de transferência genética; • Podem ser imunogénicos; • Difíceis de produzir em larga escala; ▪ Não virais: • Lipossomas; • DNA “nu”; • Transferência genética menos efetiva; • Sem limitações quanto ao tamanho de genes; • Não imunogénicos; • Fácil fabrico. Exs de terapias em desenvolvimento: o Cancro ▪ Utiliza-se uma bateria de genes que são muito eficazes a matar as células se forem expressos no local certo e a níveis adequados. Por exemplo: • Inserção de genes supressores tumorais; • Imunoterapia, com o objetivo de intensificar a reação do sistema imunológico aos antigénios tumorais; • Viroterapia oncolítica: Vírus capazes de replicar exclusivamente em células tumorais e que a sua rápida replicação acaba por provocar a lise celular. o Fibrose Cística ▪ Doença genética de transmissão autossómica recessiva; ▪ Uma mutação no gene regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR); ▪ Terapia génica: • A restituição de uma cópia funcional do gene CFTR; • Pequenas quantidades de CFTR funcional são suficientes para prevenir os principais sintomas da doença. ▪ Nota: • O grande nº de tecidos alvo e a existência de secreções em alguns desses tecidos dificulta o acesso dos vetores às células afetadas. Terapias aprovadas: o China (2003) - Gendicine™ - adenovírus no qual a região E1 é substituída pelo gene do p53 humano- tratamento do carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço; o China (2005) - Oncorine™ - adenovírus condicionalmente replicativo para o tratamento do cancro nasofaríngeo refratário avançado; 30 o o Rússia (2011) - Neovasculgen®- plasmídeo que contém o gene do fator de crescimento do endotélio vascular, através do qual há o estímulo para a angiogénese - doença arterial periférica; EMA (2012) – alipogene tiparvovec ou Glybera® – vector viral adenoassociado que expressa a lipase lipoproteica no tecido muscular para o tratamento da deficiência severa desta enzima. Doenças complexas • • • • Doenças complexas – Apresentam diferentes causas; Doenças multifatoriais – Ampla variedade de fatores ambientais e genéticos que reduzem ou aumentam a suscetibilidade de um indivíduo a uma determinada doença; Ex: o Esclerose múltipla Como se estudam os efeitos genéticos/ambientais de uma dada doença? o Estudos de: ▪ Família; ▪ Gémeos: • Apresentam várias limitações: o Mutações somáticas; o Alterações epigenéticas; o Padrão de inativação do cromossoma X; ▪ Indivíduos adotados: • Separação de gémeos • Pesquisas com reduzido nº de indivíduos; • A separação pode não ser permanente. Genética do cancro • • • Todos os cancros são doenças genéticas; Pequena minoria dos cancros são doenças hereditárias; Alterações génicas (ex: alteração de uma única base, rearranjos cromossómicos, amplificações, deleções, aneuploidias); 31 • • Alterações génicas simultâneas; As mutações ocorrem predominantemente em células somáticas – sem transmissão á descendência; • Causas: o Ambiente; o Genes; o Acaso. Mutações: o Reparação dos danos no DNA; o Divisão celular; o Apoptose; o Diferenciação celular; o Invasão • • • • • • Acumulação de mutações; Proliferação das células geneticamente instáveis; Heterogeneidade tumoral – Diversidade de células presentes no tumor; Deficiente reparação do DNA: o Ciclo celular; o Apoptose. Genes envolvidos no cancro: o Oncogenes e Proto-oncogenes; o Genes supressores tumorais; o Genes envolvidos na reparação do DNA. 32 Oncogenes e Proto-oncogenes Oncogenes • • • • • Genes que promovem o cancro – Aceleram a proliferação e a divisão celular; Codificam oncoproteínas; Derivam de proto-oncogenes; Necessária a mutação de apenas um alelo; Ex: Proteína Ras: o Mais de 30% dos tumores humanos contêm mutações nas proteínas ras; o As proteínas ras alternam entre uma forma inativada (ligada ao GDP) e ativa (ligada ao GTP); o Mutações no gene ras levam à ativação permanente das proteínas ras, ativando a via de sinalização mitogénica, que por sua vez, leva à divisão celular. Genes supressores tumorais • • • • • Regulam os checkpoints do ciclo celular; Iniciam a apoptose; Quando mutados levam á proliferação celular descontrolada e/ou sobrevivência celular, fazendo com que ocorra uma acumulação de mutações; 2 alelos estão mutados; Ex: p53 o Em células normais: ▪ p53 está inativo e é mantido em baixa quantidade pela ligação do MDM2 ao TAD; ▪ A ligação de ubiquitina ao terminal carboxílico – degradação no proteasoma; o Nas células em stress: ▪ MDM2 dissocia-se da TAD, ocorrendo a perda de ligação à ubiquitina, como tal, os níveis de p53 aumentam promovendo a transcrição de genes que controlam a apoptose e proliferação celular. Carcinogénese viral • • 15% dos cancros humanos; Exs: o Vírus Epstein-Barr; o HPV. 33 Predisposição genética para o cancro – fatores hereditários • • • • • • • Na maioria dos casos a mutação num dos alelos não é suficiente para despoletar a doença; Requer a mutação (somática) da outra cópia do gene – perda de heterozigotia; Observam-se frequentemente mutações em outros genes associados; Exs: o Polipose Adenomatosa Familiar do Cólon ▪ Síndrome hereditário autossómico dominante, causado por mutações no gene APC; ▪ Responsável por <1% de todos os carcinomas do cólon e recto; ▪ Herança de uma cópia mutante do gene APC (braço longo do cromossoma 5); ▪ Mutações subsequentes (ex: deleções, pontuais e frameshift) – transformação maligna; o Cancro de mama e ovário; o Carcinoma do cólon e recto hereditário não associado a polipose (CCRHNP) ou Síndrome de Lynch; o Síndrome de Cowden (PTEN); o Síndrome Li-Fraumeni (p53); o Cancro gástrico difuso hereditário; Risco: o Cancro em 2 ou mais membros da mesma família; o Idade prematura de diagnóstico; o Tumores primários múltiplos; o Cancros bilaterais, quando o órgão afetado é par ou duplo (ex: mama); o Presença de vários cancros no mesmo paciente; o Constelação de tumores e de outra anormalidades benignas e/ou compatíveis com uma síndrome de cancro específico (ex: mama e ovário); o Transmissão vertical da doença (de uma geração á seguinte – de pais para filhos); Teste preditivo: o Colheita de sangue; o Não mostra alterações genéticas – O risco desse indivíduo de desenvolver o cancro é idêntico ao da população geral; o Aconselhamento genético deve ser feito por um especialista em Genética Médica; Viver com a mutação: o Programas de vigilância, exames periódicos, cirurgias profiláticas; o Alteração do sedentarismo, com a promoção do aumento de cuidados com a alimentação, exercício físico, abolição de consumos; o Procura de estabilidade emocional e redução do stress. 34
