Genética-Resumo-2ª-frequência

GENÉTICA MOLECULAR E HUMANA
Doença de Huntington´s
Inicialmente conhecida por chorea  coreografia ou dança;
Os doentes apresentam movimentos constantes de torção ou rotação bruscos no Corpo
Epidemiologia
A prevalência global é de 5,7 casos por 100 000 pessoas entre pessoas da Europa
Ocidental, América do Norte e Australianos, e de 0,40 casos por 100 000 entre asiáticos;
Sintomas
Evidente entre os 30 e os 50 anos de idade, mas pode aparecer a qualquer idade, desde a
infância até à terceira idade
Inicia-se por alterações subtis da personalidade, cognição e aptidões físicas:
• Alterações na capacidade de memória e julgamento, bem como dificuldades em guiar,
apreender, lembrar, responder ou tomar decisões;
• Com a progressão da doença, as capacidades intelectuais ficam cada vez mais
comprometidas, movimentos incontroláveis, dificuldade em falar, estados depressivos,
alucinações e distúrbios obsessivo-compulsivos.
Patogénese
Resulta da degeneração, geneticamente programada, dos neurónios
Gene responsável – IT15 (cromossoma 4)
Gene IT15  regula, controla e codifica a produção de uma proteína  huntingtin  Essencial
para o normal funcionamento cerebral;
A sequência CAG é repetida várias vezes  produção de uma proteína anormal
O nº de repetições está associado à idade de aparecimento dos primeiros sintomas;
Modo de transmissão
Distúrbio autossómico dominante;
Cada descendente tem 50% de probabilidade de herdar o gene;
Pode surgir de forma espontânea  alteração esporádica do gene para a HD (raro).
Diagnóstico
Exame médico, neurológico e psicológico e por uma história familiar detalhada. Os testes
genéticos podem ser usados para confirmar ou excluir o diagnóstico.
1
Tratamento
Não existe cura para esta doença nem nenhuma estratégia para impedir a sua progressão.
Os objetivos do tratamento são retardar o aparecimento dos sintomas e manter o doente
autónomo e ativo durante o maior período de tempo possível, através de terapia
farmacológica;
Polineuropatia Amiloidótica Familiar
Conhecida por Paramiloidose ou Doença dos Pezinhos;
Identificada nos anos 50 pelo Professor Corino de Andrade
Epidemiologia
•
•
•
•
Maior prevalência na Póvoa de Varzim e Vila do Conde;
90.3 por 100000 pessoas;
Início da doença aos 20-30 anos;
Conduz à morte em 10-12 anos após início dos sintomas.
Sintomas
•
•
•
•
•
•
Perda da destreza motora, de sensibilidade táctil e da dor (polineuropatia periférica);
Problemas cardíacos (hipotensão ortostáticas, arritmias, obstruções
auriculoventriculares);
Disfunção eréctil e urinária;
Disfunções gastro-intestinais;
Disfunções renais;
Perturbações oculares.
Patogénese
Substituição de uma Adenina por uma Guanina, no exão 2 ⟶ levando à substituição de um
Valina por uma Metionina na posição 30 (TTR Val30Met);
Deposição sistémica de fibras de amiloide de transtirretina mutada ⟶ principalmente no
sistema nervoso periférico ⟶ degenerescência axonal;
Inicia-se pelas fibras de menor diâmetro, tanto mielinizadas como não mielinizadas, sendo as
fibras de maior diâmetro afetadas em casos mais avançados;
2
O contacto direto dos depósitos de amiloide com as células de Schwann não produz
desmielinização;
Modo de transmissão
•
•
•
Distúrbio autossómico dominante;
Existem casos em que os portadores não manifestam a doença;
Cada descendente tem 50% de probabilidade de herdar o gene.
Diagnóstico
•
•
•
Avaliação Clínica – Neurofisiológica;
Análise histológica;
Análise Genética e identificação da mutação (TTR Val30Met).
Tratamento
Tratamento Farmacológico;
Transplante Hepático:
• O fígado é um grande produtor de TTR;
• O transplante de fígado diminui os altos níveis anormais de proteína no sangue;
• O período de manifestação antes da doença condiciona o tratamento.
Diagnóstico genético pré-implantatório e o diagnóstico pré-natal
Diagnóstico pré-natal ⟶ identifica os fetos portadores da doença, na condição de uma
possível interrupção da gravidez, sendo necessário o prévio consentimento informado dos
progenitores. Este é realizado através de uma amniocentese, que permite detetar a proteína
anormal (TTR Met30), às 14/16 semanas de gestação.
Diagnóstico genético pré-implantatório ⟶ embriões obtidos por fertilização in vitro. No
terceiro dia de desenvolvimento, são removidas uma ou duas células (blastómeros), por
biopsia e posteriormente avaliados PCR ou FISH. Os embriões geneticamente normais são
depois transferidos para o útero materno.
Fibrose Cística
Epidemiologia
É uma das doenças genéticas mais letais;
Varia entre os diferentes grupos étnicos:
•
•
Afro-americanos ⟶ 1:15000;
Caucasianos ⟶ 1:3500;
Foi considerada uma doença infantil ⟶ aumento das taxas de sobrevivência ⟶ 10 para 30-40
anos.
3
Sintomas
•
•
•
•
•
•
•
Pele muito salgada;
Tosse persistente;
Apetite excessivo ⟶ baixo ganho de peso;
Infeções respiratórias;
Estômago hiperacídico;
Esterilidade masculina;
Osteoporose.
Patogénese
Provocada por uma mutação num único gene localizado no cromossoma 7;
Codifica uma proteína de 1480 aa- CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator);
Nas células normais a CFTR funciona como um canal  permitindo a passagem de iões CL-;
A CFTR deficiente não deixa passar os iões originando um desequilibro salino  produção de
um muco espesso e pegajoso.
Modo de transmissão
Distúrbio autossómico recessivo;
Manifesta-se em descendentes que herdaram 2 cópias alteradas;
Quando ambos os progenitores possuem uma cópia alterada:
•
•
•
25% de probabilidade de herdar 2 cópias alteradas e herdar a doença;
25% de probabilidade de herdar 2 cópias normais;
50% probabilidade de herdar uma cópia alterada e 1 normal – portador.
Diagnóstico
Sintomatologia típica da FC  “Teste do Suor” – em que mede a quantidade de sal do suor;
Complementado por testes genéticos;
Tratamento
Não tem cura, mas pode fazer-se:
•
•
•
Terapias com mucolíticos;
Terapias anti-inflamatórias e anti-microbianas;
Transplante do pulmão;
Distrofia Muscular de Duchenne
Epidemiologia
A mais comum e também a mais grave das distrofias musculares;
1,7 - 4,2 por cada 100000 pessoas;
4
A prevalência poderá não representar totalmente a realidade da doença pois muitas vezes as
pessoas afetadas morrem ainda antes dos 20 anos;
Sintomas
Iniciam geralmente entre 1-6 anos de idade;
Enfraquecimento progressivo dos músculos das pernas e da pélvis;
Perda de massa muscular;
Fadiga, possibilidade de comprometimento intelectual, contrações musculares, hipertrofia dos
músculos do crânio, deficiências respiratórias e cardíacas;
Aos 12 anos, a maioria dos doentes andarão de cadeira de rodas.
Patogénese
Delecção no cromossoma X  Xp21;
Mutação do gene responsável pela codificação da proteína Distrofina – proteína chave do
citoesqueleto;
A distrofina está presente na parte citoplasmática da membrana muscular, ligando
citoesqueleto interno à matriz extracelular;
Anomalias na ligação entre estes complexos leva a alguns tipos de distrofias musculares,
incluindo a DMD.
Modo de transmissão
Distúrbio recessivo ligado ao cromossoma X
As mulheres são raramente afetadas;
As filhas das portadoras podem transmitir o gene alterado para os filhos;
Os filhos de uma mãe portadora têm 50% de probabilidade de terem DMD;
As filhas de uma mãe portadora têm 50% de probabilidade de serem portadoras.
Diagnóstico
•
•
•
•
•
Testes serológicos à creatinofosfoquinase (CPK)
Exames neurológicos
Electromiografia
Biópsia muscular
Testes genéticos
Tratamento
Não tem cura, mas pode fazer-se:
•
•
•
Fisioterapia
Terapias farmacológicas
Tratamento cirúrgico
5
Inativação do Cromossoma X
No início do desenvolvimento embrionário um dos cromossomas X de cada célula fica
inativado  Corpúsculo de Barr (X heterocromático) (é visível ao microscópio óptico como
um ponto escuro perimembranar no núcleo);
Processo aleatório nos humanos;
Se uma ♀ é heterozigótica para um gene localizado no cromossoma X  pode expressar um
alelo em determinadas regiões do corpo e outro alelo noutras partes do corpo;
Mosaicismo
Reversível – Na meiose é reativado para a formação dos
gâmetas;
Exemplo – Displasia ectodérmica anidrótica
Modo de transmissão: Distúrbio recessivo ligado ao
cromossoma X
♂ - não têm glândulas sudoríparas;
♀- podem apresentar mosaicismo (áreas do corpo com
glândulas sudoríparas e outras sem).
6
Interação Génica
Para um gene ter influência num fenótipo precisa de agir concertadamente com:
•
•
•
Ambientes genéticos específicos
Ambiente externo (temperatura, nutrição, poluentes, stress…)
Ambiente interno (carga hormonal)
Nas células, as interações entre genes manifestam-se por interações físicas entre:
•
•
•
Proteínas - proteínas
Proteínas e DNA
Proteínas e RNA
1 gene  diferentes vias de desenvolvimento  pleiotropia
1 fenótipo  resultado de diferentes genes  Interação génica simples e epistasia
Alelos mutantes de aproximadamente 12 genes diferentes podem conferir este fenótipo.
7
Teste de diagnóstico para alelos
Teste de complementação
Expressão de um fenótipo:
1) 1 ou mais alelos de um gene
2) Genes diferentes
Exemplo: 2 mutações
• Produzem o mesmo fenótipo
• Serão mutações no mesmo locus?
• Serão mutações diferentes em loci diferentes?
Teste de complementação
Determinar se dois mutantes recessivos com fenótipos semelhantes apresentam mutações no
mesmo gene ou em genes distintos.
Cruzamos as duas linhas mutantes:
•
•
Se for no mesmo gene - F1 toda mutante;
Se em genes diferentes - F1 toda selvagem:
o Ocorreu complementação
o Cada indivíduo possui, para cada mutação, 2 alelos diferentes
Determinar se dois mutantes recessivos com fenótipos semelhantes apresentam mutações no
mesmo gene ou em genes distintos.
Proporções diíbridas modificadas
Interação de genes
1) Em vias metabólicas diferentes
2) Na mesma via
1) Genes que interagem em vias metabólicas diferentes:
Fenótipo produzido por 2
pigmentos separados sob controlo
génico: o+ - laranja
o – proteína ausente b+
- preto
b – proteína ausente
Ex: Cor da pele das cobras do
milharal
o+/o; b+/b x o+/o; b+/b
o+/-; b+/- ⟶ selvagem (preto e
laranja);
o/o; b+/- ⟶ preta;
o+/-; b/b ⟶ laranja;
o/o; b/b ⟶ albino
4 fenótipos na proporção 9:3:3:1
8
2) Interação de genes na mesma via
Proporções fenotipícas diferentes: geralmente existem dois ou três fenótipos resultantes das
várias combinações de classes fenotípicas
F2  origina proporção fenotípicas modificada (diferentes de 9:3:3:1)
Exemplo:
F2  proporção modificada 9:3:4
EPISTASIA
Um alelo de um gene mascara a expressão dos alelos de outro gene
Neste exemplo: se o gene B mascara o efeito do gene A, então o gene B é epistático em
relação A
EPISTASIA RECESSIVA
o alelo recessivo b é epistático para o alelo a EPISTASIA DOMINANTE
o alelo dominante W é epistático para os alelos y ou Y
SUPRESSORES
O alelo de um gene reverte o efeito de uma mutação noutro gene  restabelecendo um
fenótipo normal
•
•
•
Este tipo de interação pode ser verificada através de uma alteração nas razões
fenotípicas;
Usualmente, apenas dois fenótipos segregam e não três, como na epistasia;
Supressores recessivos ou dominantes.
SUPRESSÃO ≠ EPISTASIA
9
Penetrância
Percentagem de indivíduos com um determinado genótipo que exibem o fenótipo associado a
esse genótipo;
Um indivíduo pode ter um dado genótipo, mas não expressar o genótipo correspondente,
devido a modificadores, genes epistáticos ou supressores no resto do genoma, ou devido ao
efeito modificador do ambiente.
Expressividade
Medida para descrever a gama de expressão fenotípica - extensão pela qual um dado alelo é
expresso ao nível fenotípico
•
•
Na prática, a expressividade mede a intensidade do fenótipo;
É influenciada pelas condições ambientais e pelo fundo genético (expressividade
variável)
Ligação Factorial e Mapa Cromossómico
2 genes em diferentes pares de cromossomas;
Segregação independente (Lei de Mendel de Segregação Independente);
Genes localizados no mesmo cromossoma têm tendência a ser herdados juntos porque o
cromossoma é transmitido como uma unidade;
E se houver crossing-over? Crossing-over – Recombinação;
A ocorrência de crossing-overs produz cromatídeos recombinantes e pode ser usada para
mapear (localizar) genes num cromossoma;
10
Genes em ligação factorial: se a probabilidade de passarem juntos para a descendência for
maior do que se segregassem independentemente;
Quanto mais próximos > a probabilidade de não ocorrer crossing-over;
Quanto mais afastados > a probabilidade da ocorrência de crossing over;
Se dois alelos dominantes (selvagens) estão no mesmo
cromossoma e os dois alelos recessivos ou mutantes estão no
cromossoma homólologo;
Ligação diz-se em fase de acoplamento;
Gâmetas recombinantes: Ab e aB
Se o alelo dominante de um locus e o alelo recessivo de outro
locus estão localizados no mesmo cromossoma;
Ligação diz-se em fase de repulsão;
Gâmetas recombinantes: AB e ab
Desvio da proporção pela 2ª Lei de Mendel
Classes com menor frequência são as que possuem apenas um alelo dominante;
Morgan: sugere que os genes responsáveis pelos 2 fenótipos estão localizados no mesmo par
de cromossomas;
Sugere que durante a meiose os cromossomas homólogos emparelham podendo trocar partes
dos cromossomas – crossing-over;
Frequência de Quiasmas
11
•
•
•
Um par de cromossomas em sinapse: 4 cromátides – tétrade;
Numa tétrade ocorre pelo menos um quiasma;
Quanto mais comprido o cromossoma, maior será o número de quiasmas;
Frequência de quiasmas entre 2 loci génicos depende da distância entre os dois loci;
A frequência de gâmetas recombinantes formados por um dado genótipo é uma reflexão
direta da frequência com que quiasma ocorre entre os dois genes;
Frequência de Quiasmas: Quiasma entre dois loci génicos
Quando um quiasma se forma entre dois loci, somente metade dos produtos meioticos será
do tipo recombinante;
A frequência de quiasma é duas vezes a frequência de produtos recombinantes
Permutas múltiplas
2 crossing-over entre dois loci (A e C) – produtos são do tipo parental;
A fim de identificarmos as permutas temos de usar um terceiro locus génico – locus B;
 Se existir uma probabilidade de permuta entre (A e B) e (B e C) a probabilidade de
permuta dupla será o produto das duas probabilidades independentes;
A probabilidade de formação de um quiasma entre dois loci que se encontram muito afastados
é de 100%:
•
•
50% dos gâmetas são do tipo parental
50% dos gâmetas dão do tipo recombinante
12
 Quando um indivíduo dihíbrido é submetido a um cruzamento teste a previsão da
proporção para a descendência é de 1:1:1:1  igual à prevista quando os genes se
encontram em cromossomas diferentes;
Mapeamento genético
Cálculo da distância entre 2 genes ligados;
Unidade de distância (centimorgan) é uma expressão da probabilidade de recombinação a
qual varia segundo a distância entre os genes:
1 centimorgan (CM) = 1% de recombinação
Mapeamento genético: Cruzamento teste para 3 pontos
Corresponde ao cruzamento de um triplo heterozigótico com um triplo recessivo;
Pode ocorrer mais do que um crossing-over;
Para que ocorram dois crossing-over é necessário que os genes estejam separados por pelo
menos 5cM.
Exercícios:
Suponha que no cruzamento teste de indivíduos trihibridos com o genótipo ABC/abc se obteve
a seguinte descendência:
ABC/abc 36%
abc/abc 36%
Abc/abc 9%
aBc/abc 9%
ABc/abc 4%
abC/abc 4%
AbC/abc 1%
aBc/abc 1%
1. Indicar os fenótipos parentais:
ABC/abc e abc/abc
2. Indique os que têm permuta simples:
Abc/abc 9%
aBc/abc 9%
ABc/abc 4%
abC/abc 4%
13
3. Indique os que têm permuta dupla
Abc/abc 1%
aBc/abc 1%
4. Determinar a distância entre A-B
a. Contar todas as permutas que ocorrem nessa região
b. Parental é: AB ou ab
c. Recombinantes Ab ou aB
d. Assim, a Frequência de recombinantes (A-B) = 9% + 9% + 1% + 1% = 20%
e. Distância A-B = 20 cM
5. Determinar a distância entre B-C
Frequência de recombinantes (B-C) = 4% + 4% + 1% + 1% = 10%
Distância A-B = 20 cM
6. Determinar a distância entre A-C
d (a-C) = 10 cM + 20 cM = 30cM
7. Desenhar o mapa cromossómico
14
Citogenética
Alterações cromossómicas numéricas
Euploidia
Euploidia – Perda ou ganho de genomas completos (ex: n, 2n, 3n,
4n – poliploidias)
Poliploidia:
•
•
•
Comum nas plantas;
Rara entre os animais (anfíbios, répteis, peixes);
Letal nos humanos:
o Mola hidatiforme parcial ou completa;
o Abortos espontâneos – 1º trimestre;
o Mosaicismo (3n/2n)– sobrevivência muito
reduzida (retardação motora e cerebral
profunda).
Aneuploidia
Aneuploidia – Diminuição ou aumento de apenas alguns
cromossomas no cariótipo (ex: trissomia 2n+1,
monossomia 2n-1)
Mais frequentes em humanos:
•
•
Não disjunção meiótica;
Não disjunção mitótica.
1. Não disjunção meiótica
15
2. Não disjunção mitótica
Mosaicismo
Trissomias autossómicas viáveis
•
•
•
Trissomia 18 (Síndrome de Edwards);
Trissomia 13 (Síndrome de Patau);
Trissomia 21 (Síndrome de Down).
16
Aneuploidias ligadas ao X/Y
•
•
Síndrome de Turner (Monossomia X);
Síndrome de Klinefelter (47, XXY ou 48, XXYY).
Trissomia 21
•
•
•
•
•
Incidência aumenta com a idade
materna:
o 1:20 > 45 anos;
o 1:95 > 40 anos;
o 1:300 > 35 anos;
o 1:1000 > 20 anos.
95% dos casos derivam da não
disjunção meiótica;
Risco aumentado de aborto
espontâneo;
Cariótipo: 47, +21;
Diagnóstico pré-natal:
o Líquido amniótico;
o Biópsia das vilosidades coriónicas;
o Diagnóstico pré-natal não invasivo
FENÓTIPO
• Atraso do crescimento intrauterino;
• Baixa estatura;
• Face larga e achatada;
• Olhos com pregas epicânticas;
•
•
•
•
•
Língua protuberante e lábios
grossos;
Tonicidade muscular fraca;
Atraso cognitivo (QI: 20-85);
Anomalias cardíacas;
Sobrevida diminuída.
17
Trissomia 13 – Síndrome de Patau
Sobrevida:
•
•
•
•
45% dos casos morrem no 1º mês;
70% em 6 meses;
86% em 12 meses;
Muitos poucos sobrevivem mais de 5 anos.
Formas:
•
•
•
75% - 80% são trissomias;
20% têm translocações;
Alguns apresentam mosaicismo.
Trissomia 18 – Síndrome de Edwards
Fenótipo:
•
•
•
•
•
Baixo peso;
Dismorfias faciais;
Defeitos cardíacos;
Anomalias dos membros;
Malformações abdominais.
Síndrome de Turner (Monossomia X)
•
•
•
•
•
2/3 com retenção do X materno;
Incidência 1/1500-2500;
15% abortos espontâneos;
Cerca de 50% apresentam
mosaicismo;
99% dos embriões não mosaicos são
perdidos durante o 1º trimestre de
gravidez.
18
Síndrome de Klinefelter
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
47, XXY;
48, XXYY;
Mosaicismo;
Outras formas raras (48, XXXY; 49, XXXYY)
Hipogonadismo;
Azoospermia;
Testículos atróficos;
Ginecomastia;
Dificuldades de aprendizagem;
Estatura elevada.
Alterações estruturais cromossómicas
•
•
•
•
Deleção;
Duplicação;
Inversão;
Translocação.
Rutura e união:
•
•
•
Espontâneas;
Induzidas (ex: radiação);
Crossing-over ilegítimo (ocorre em células somáticas, após emparelhamento entre
segmentos de DNA repetitivo).
19
Deteção de anomalias estruturais
Citogenética:
•
•
Bandeamento diferencial.
Citogenética:
o 1. Colheita de células (qualquer
tecido);
o 2. Manutenção das células em cultura
num meio com fitohemaglubina;
o 3. Adição de colchicina para parar a
divisão celular em metáfase;
o 4. Fixar as células;
o 5. Digestão com tripsina;
o 6. Coloração com Giemsa.
•
Citogenética molecular:
o Análise por microarrays
Hibridação in situ:
•
Utilização de sondas complementares á região de DNA alvo:
o Fluorescente (FISH);
o
o
Colorimétrica (CISH);
Radioatividade.
20
Mecanismos de rearranjos cromossómicos
Deleção
•
•
•
•
•
•
•
•
Efeito da deleção depende do tamanho e da região atingida;
Deleção intragenénica leva à inativação do gene;
Usualmente são deleções mutagénica tendo consequências graves;
Fragmentos deletados são acêntricos – sem centrómeros, sendo estes perdidos
durante a divisão celular;
Deleções:
o Desequilíbrio do genoma;
o Possibilidade de efeito letal;
o Revelação de alelos recessivos –
Expressão fenotípica;
o Compensação pelo outro alelo –
Deleção viável.
Ex: Síndrome do Cri du chat
o Deleção terminal no cromossoma 5;
o Choro – Mio de gato;
o Face de lua;
o Atraso mental.
Nem todas as células do tumor mostram as
deleções indicadas;
Geralmente existe uma mistura de mutações
cromossómicas diferentes num dado tumor.
21
Duplicações
•
•
•
Cópia extra de uma região
cromossómica;
As cópias podem estar localizadas
adjacentes uma à outra;
Ex: Crossing-over desigual
o O crossing-over das regiões
emparelhadas
assimetricamente pode levar
a uma triplicação em tandem
de uma região cromossómica.
Inversão
•
•
•
•
•
Rutura em dois locais de um cromossoma e subsequente ligação do fragmento
cromossómico no sentido inverso (180º);
Alteração estrutural equilibrada – Não altera a quantidade de material genético;
Rutura cromoccómica intragénica – Gene não viável;
Localização do centrómero:
Crossing-over dentro da ansa de inversão:
o Ligação dos centrómeros homólogos – ponte dicêntrica;
o Produção de fragmento acêntrico (perdido durante a anafase);
o Foram formados dois cromossomas alterados com duplicações e deleções;
o Um cromossoma com uma sequência invertida.
22
Translocação
•
•
Recíproca (Mais comum)
Podem alterar:
o O tamanho do
cromossoma;
o A posição do
centrómero.
•
Recíproca:
o Não há perda de material genético
levando a uma translocação balanceada;
o Comportamento genético da
translocação recíproca:
▪ Emparelhamento dos homólogos
(formação de tétradas);
As translocações, inversões e deleções produzem
uma esterilidade parcial pela geração de
produtos meióticos não equilibrados;
Rutura em dois cromossomas acrocêntricos não
homólogos;
Fusão resultante das ruturas:
o Formação de dois cromossomas metacêntricos, um grande e um pequeno;
A perda do cromossoma pequeno (fragmento) leva á conversão de dois pares de
cromossomas acrocêntricos num par de metacêntricos;
Exs:
o Síndrome de Down familiar;
o Translocações encontradas consistentemente em tumores sólidos.
•
•
•
•
•
Técnicas de Genética Molecular
•
•
•
•
•
•
•
Extração de DNA/RNA;
PCR;
Variantes da PCR;
Análise dos produtos da PCR;
Sequenciação – Projeto genoma humano;
Genotipagem;
Análise de Polimorfismos – SNP.
Sequenciação – Método de Sanger
•
•
•
•
Determinação da sequência de nucleótidos que compõem um fragmento de DNA;
Envolve a síntese de novo de uma série de cadeias simples de DNA, usando como
molde a cadeia de DNA que se quer sequenciar;
A síntese começa sempre num ponto definido (por um primer) e termina por
incorporação de nucleótidos terminadores;
As cadeias sintetizadas são terminadas prematuramente nos vários tamanhos possíveis;
23
•
Nucleótidos terminadores:
o Derivados didesoxi dos nucleótidos normais –
não possuem um grupo hidroxilo na posição 3’
da desoxorribose – impedindo as ligações
fosfodiestéricas do DNA;
o A ligação de ddA, ddC, ddG ou ddT termina
adição de novos nucleótidos na cadeia recémsintetizada.
Sequenciação de Nova Geração (NGS)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Fragmentação do DNA;
Adição de dois adaptadores diferentes às
terminações 5’ e 3’ de todas as moléculas.
Desnaturação das cadeias – Cadeia simples;
As cadeias associam-se à “flow cell”, que
possui oligonucleótidos complementares aos
dois adaptadores;
Amplificação em ponte;
Formação de uma molécula de cadeia dupla;
Desnaturação;
Adição de bases que emitem fluorescência;
Identificação da base;
Alinhamento dos dados;
Vantagens:
o Sensibilidade e especificidade superiores;
o Maior rapidez;
o Diminuição dos custos em reagentes;
o A análise de genes adicionais sem aumento de custos;
o Avaliação de vários loci no mesmo chip;
Desvantagens:
o Preço dos equipamentos
24
Projeto Genoma Humano
•
•
•
•
•
Iniciou-se em 1990 com James Watson;
Consorcio internacional coordenado do Instituto de Saúde (NIH) dos Estados Unidos e a
partir de 1993 pelo geneticista Francis Coliins;
O projeto originalmente foi planeado para ser complementado em 15 anos, mas o
desenvolvimento da tecnologia acelerou o seu final para 2003;
Objetivos:
o Identificar todos os genes humanos;
o Determinar a sequência dos cerca de 3,2 biliões de pares de bases compõem o
genoma do Homo sapiens;
o Armazenar a informação em bancos de dados;
o Desenvolver ferramentas de análise dos dados;
o Transferir a tecnologia relacionada ao projeto para o setor privado;
Resultados:
o O genoma humano contem 3,2 biliões de nucleotídeos;
o O tamanho médio dos genes é de 3000 bases, mas varia muito, sendo o maior
deles o gene da distrofina com 2,4 milhões de pares de bases;
o A função de cerca de 50% dos genes descobertos é desconhecida;
o A sequência do genoma humano é de 99,9% exatamente a mesma em todas as
pessoas;
o O cromossoma 1 tem o maior nº de genes – 3168 e o cromossoma Y, o menor –
344;
o Algumas sequências específicas foram associadas com numerosas doenças e
disfunções (ex: cancro da mama, doenças musculares, surdez e cegueira);
o Existem milhares de locais nos quais há diferença de apenas uma base –>
Potencial associação a doenças cardiovasculares, diabetes, artrite e cancro.
Polimorfismos – Análise genética e forense
•
•
•
•
•
•
SNPs – Single-nucleotide polymorphisms;
VNTRs – Variable number tandem repeats;
STRs – Short Tandem Repeat;
Diferenças na sequência de bases sem consequências patológicas diretas;
Frequência na população geralmente > a 1%;
Podem criar ou eliminar locais de reconhecimento de enzimas de restrição
Restrictom fragment lenght polymorphism (RFLPs)
25
VNTRs
•
•
•
Os loci de VNTR são sequências de
1-5 Kb;
Nº variável de uma unidade de 15100 nucleótidos;
DNA fingerprinting;
STRs
•
•
•
Os loci de STR são sequências de 150 pb;
Nº variável de uma unidade repetitiva de <10 nucleótidos;
DNA fingerprinting
RFLPs – SNP Genotipagem
26
Clonagem de Genes e DNA Recombinante
Transfeção
Gene repórter
27
Organismos geneticamente modificados
Indústria farmacêutica
•
•
•
•
A insulina humana, torna-se o primeiro
medicamento geneticamente modificado aprovado
pela Food and Drug Administrations (FDA);
Os oligonucleótidos sintéticos que codificam as
cadeias A e B da insulina são inseridas em vetores
distintos;
Os vetores são introduzidos nas células hospedeiras
(E.coli), onde a proteína de fusão βgalactosidase/insulina é sintetizada e acumulada;
As cadeias de insulina são libertadas da βgalactosidase e são misturadas de forma a
formarem proteínas de insulina funcionais.
Vacinas orais
•
•
•
Vacinas orais – Alimentos geneticamente
modificados, capazes de produzir vacinas;
Um agente causador de doença é introduzido num vetor, que é inserido numa célula
vegetal;
Ingestão da planta contendo uma proteína codificada pelo gene patogénico despoleta
uma reação imunológica, conferindo imunidade a futuras infeções.
Animais
28
Humanos
• Primeiro tratamento de terapia génica em humanos:
o Imunodeficiência recessiva rara, caracterizada por uma deficiência da enzima
adenosina desaminase (ADA)
•
Ex vivo
o As células alvo são retiradas
do organismo;
o Correção do defeito genético
nas células isoladas;
o Seleção das células
geneticamente corrigidas;
o Transplantação para o
individuo
•
In vivo
o Os genes são introduzidos diretamente nas
células alvo, ou seja, no tecido do indivíduo a
ser tratado;
o É importante a forma de administração e que
o produto seja entregue na sua forma intacta
(não degradada)
29
•
•
•
Vetores para terapia génica:
o Produção fácil;
o Imunologicamente inertes;
o Especificidade para p tecido alvo;
o Capacidade de transportar genes grandes ou pequenos;
o Replicação ou Integração;
o Podem ser:
▪ Virais:
• Elevada taxa de transferência genética;
• Podem ser imunogénicos;
• Difíceis de produzir em larga escala;
▪ Não virais:
• Lipossomas;
• DNA “nu”;
• Transferência genética menos efetiva;
• Sem limitações quanto ao tamanho de genes;
• Não imunogénicos;
• Fácil fabrico.
Exs de terapias em desenvolvimento:
o Cancro
▪ Utiliza-se uma bateria de genes que são muito eficazes a matar as
células se forem expressos no local certo e a níveis adequados. Por
exemplo:
• Inserção de genes supressores tumorais;
• Imunoterapia, com o objetivo de intensificar a reação do
sistema imunológico aos antigénios tumorais;
• Viroterapia oncolítica: Vírus capazes de replicar exclusivamente
em células tumorais e que a sua rápida replicação acaba por
provocar a lise celular.
o Fibrose Cística
▪ Doença genética de transmissão autossómica recessiva;
▪ Uma mutação no gene regulador de condutância transmembranar da
fibrose cística (CFTR);
▪ Terapia génica:
• A restituição de uma cópia funcional do gene CFTR;
• Pequenas quantidades de CFTR funcional são suficientes para
prevenir os principais sintomas da doença.
▪ Nota:
• O grande nº de tecidos alvo e a existência de secreções em
alguns desses tecidos dificulta o acesso dos vetores às células
afetadas.
Terapias aprovadas:
o China (2003) - Gendicine™ - adenovírus no qual a região E1 é substituída pelo
gene do p53 humano- tratamento do carcinoma espinocelular da cabeça e
pescoço;
o China (2005) - Oncorine™ - adenovírus condicionalmente replicativo para o
tratamento do cancro nasofaríngeo refratário avançado;
30
o
o
Rússia (2011) - Neovasculgen®- plasmídeo que contém o gene do fator de
crescimento do endotélio vascular, através do qual há o estímulo para a
angiogénese - doença arterial periférica;
EMA (2012) – alipogene tiparvovec ou Glybera® – vector viral adenoassociado
que expressa a lipase lipoproteica no tecido muscular para o tratamento da
deficiência severa desta enzima.
Doenças complexas
•
•
•
•
Doenças complexas – Apresentam diferentes causas;
Doenças multifatoriais – Ampla variedade de fatores ambientais e genéticos que
reduzem ou aumentam a suscetibilidade de um indivíduo a uma determinada doença;
Ex:
o Esclerose múltipla
Como se estudam os efeitos genéticos/ambientais de uma dada doença?
o Estudos de:
▪ Família;
▪ Gémeos:
• Apresentam várias limitações:
o Mutações somáticas;
o Alterações epigenéticas;
o Padrão de inativação do cromossoma X;
▪ Indivíduos adotados:
• Separação de gémeos
• Pesquisas com reduzido nº de indivíduos;
• A separação pode não ser permanente.
Genética do cancro
•
•
•
Todos os cancros são doenças genéticas;
Pequena minoria dos cancros são doenças hereditárias;
Alterações génicas (ex: alteração de uma única base, rearranjos cromossómicos,
amplificações, deleções, aneuploidias);
31
•
•
Alterações génicas simultâneas;
As mutações ocorrem predominantemente em células somáticas – sem transmissão á
descendência;
•
Causas:
o Ambiente;
o Genes;
o Acaso.
Mutações:
o Reparação dos danos no DNA;
o Divisão celular;
o Apoptose;
o Diferenciação celular;
o Invasão
•
•
•
•
•
•
Acumulação de mutações;
Proliferação das células geneticamente instáveis;
Heterogeneidade tumoral – Diversidade de células presentes no tumor;
Deficiente reparação do DNA:
o Ciclo celular;
o Apoptose.
Genes envolvidos no cancro:
o Oncogenes e Proto-oncogenes;
o Genes supressores tumorais;
o Genes envolvidos na reparação do DNA.
32
Oncogenes e Proto-oncogenes
Oncogenes
•
•
•
•
•
Genes que promovem o cancro –
Aceleram a proliferação e a divisão
celular;
Codificam oncoproteínas;
Derivam de proto-oncogenes;
Necessária a mutação de apenas um
alelo;
Ex: Proteína Ras:
o Mais de 30% dos tumores
humanos contêm mutações nas
proteínas ras;
o As proteínas ras alternam entre uma forma inativada (ligada ao GDP) e ativa
(ligada ao GTP);
o Mutações no gene ras levam à ativação permanente das proteínas ras,
ativando a via de sinalização mitogénica, que por sua vez, leva à divisão celular.
Genes supressores tumorais
•
•
•
•
•
Regulam os checkpoints do ciclo celular;
Iniciam a apoptose;
Quando mutados levam á proliferação
celular descontrolada e/ou sobrevivência
celular, fazendo com que ocorra uma
acumulação de mutações;
2 alelos estão mutados;
Ex: p53
o Em células normais:
▪ p53 está inativo e é mantido em baixa quantidade pela ligação do
MDM2 ao TAD;
▪ A ligação de ubiquitina ao terminal carboxílico – degradação no
proteasoma;
o Nas células em stress:
▪ MDM2 dissocia-se da TAD, ocorrendo a perda de ligação à ubiquitina,
como tal, os níveis de p53 aumentam promovendo a transcrição de
genes que controlam a apoptose e proliferação celular.
Carcinogénese viral
•
•
15% dos cancros humanos;
Exs:
o Vírus Epstein-Barr;
o HPV.
33
Predisposição genética para o cancro – fatores hereditários
•
•
•
•
•
•
•
Na maioria dos casos a mutação num dos alelos não é suficiente para despoletar a
doença;
Requer a mutação (somática) da outra cópia do gene – perda de heterozigotia;
Observam-se frequentemente mutações em outros genes associados;
Exs:
o Polipose Adenomatosa Familiar do Cólon
▪ Síndrome hereditário autossómico dominante, causado por mutações
no gene APC;
▪ Responsável por <1% de todos os carcinomas do cólon e recto;
▪ Herança de uma cópia mutante do gene APC (braço longo do
cromossoma 5);
▪ Mutações subsequentes (ex: deleções, pontuais e frameshift) –
transformação maligna;
o Cancro de mama e ovário;
o Carcinoma do cólon e recto hereditário não associado a polipose (CCRHNP) ou
Síndrome de Lynch;
o Síndrome de Cowden (PTEN);
o Síndrome Li-Fraumeni (p53);
o Cancro gástrico difuso hereditário;
Risco:
o Cancro em 2 ou mais membros da mesma família;
o Idade prematura de diagnóstico;
o Tumores primários múltiplos;
o Cancros bilaterais, quando o órgão afetado é par ou duplo (ex: mama);
o Presença de vários cancros no mesmo paciente;
o Constelação de tumores e de outra anormalidades benignas e/ou compatíveis
com uma síndrome de cancro específico (ex: mama e ovário);
o Transmissão vertical da doença (de uma geração á seguinte – de pais para
filhos);
Teste preditivo:
o Colheita de sangue;
o Não mostra alterações genéticas – O risco desse indivíduo de desenvolver o
cancro é idêntico ao da população geral;
o Aconselhamento genético deve ser feito por um especialista em Genética
Médica;
Viver com a mutação:
o Programas de vigilância, exames periódicos, cirurgias profiláticas;
o Alteração do sedentarismo, com a promoção do aumento de cuidados com a
alimentação, exercício físico, abolição de consumos;
o Procura de estabilidade emocional e redução do stress.
34