colonização radicular e promoção de crescimento vegetal por

ii
COLONIZAÇÃO RADICULAR E PROMOÇÃO
DE CRESCIMENTO VEGETAL POR RIZOBACTÉRIAS
ADRIANA NANÔ SOTTERO
Bióloga
Orientadora: Profa. Dra. Sueli dos Santos Freitas
Dissertação apresentada ao Instituto
Agronômico para obtenção do título
de Mestre em Agricultura Tropical e
Subtropical - Área de Concentração
em
Gestão
de
Recursos
Agroambientais.
Campinas
Estado de São Paulo
Maio – 2003
iii
Sottero, Adriana Nanô
Colonização radicular e promoção de crescimento
vegetal por rizobactérias / Adriana Nanô Sottero. –
Campinas, 2003.
viii, 47 p.
Orientadora: Dra. Sueli dos Santos Freitas
Dissertação (mestrado em agricultura
subtropical) – Instituto Agronômico.
tropical
e
1. Crescimento de plantas – RPCPs. 2. RPCPs
Colonização Radicular. I. Título.
CDD: 581.134
iv
Ao Gustavo, meu companheiro,
e a Giovanna, minha filha,
ofereço.
Aos meus pais Paulo e Regina,
pelo estímulo e carinho, e
a minha irmã dedico.
v
AGRADECIMENTOS
À Dra. Sueli dos Santos Freitas, pela excelente orientação neste trabalho, pela
dedicação e amizade.
Aos pesquisadores do Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do
Agronegócio na Horticultura do IAC, Dra. Arlete Marchi Tavares Melo, pelo
fornecimento das sementes de alface e pelas sugestões apresentadas sobre o cultivo
de alface, e Dr. Paulo E. Trani, pelo preparo do solo utilizado no experimento em
casa de vegetação.
À Dra. Maria Angélica Pizzinatto pelos ensinamentos prestados.
Às pesquisadoras do Setor de Microbiologia do Solo do IAC, Dra. Adriana
Parada Dias da Silveira e Maria Luiza C. O. Lombardi, pela amizade e incentivo.
Às funcionárias do Setor de Microbiologia do Solo do IAC, Rosana Gierts
Gonçalves, Maria Tereza Bueno Mangussi e Maria Leonilde Machado de Souza, pela
ajuda e agradável convivência.
Aos amigos do Setor de Microbiologia do Solo, Flávia Cristina Simões de
Barros, Vanessa Polon Donzeli, Sara Adrian Lopez de Andrade, Silvana Auxiliadora
Missola Critter, José Augusto Maiorano, Marinês Vieira e Soraya França pela
amizade e valiosa ajuda; pelos bons momentos compartilhados.
Às amigas Mirela Francabandiera, Deise Renata Gonzalez Agnani, Carolina
Pioto e Daniela Ribeiro Martins, pela amizade e incentivo na elaboração deste
trabalho.
Aos meus pais, Paulo Antônio Sottero e Maria Regina Nanô Sottero, por
sempre acreditarem mim e pelo constante apoio para esta conquista.
À minha irmã Renata Nanô Sottero, pelo carinho e compreensão em todos os
momentos.
Ao Gustavo Jorge Ferreira, pelo companheirismo, carinho e incentivo em
todos os momentos.
Ao Instituto Agronômico, pelo uso dos laboratórios e acolhida.
vi
À FUNDAG pelos oito meses de apoio financeiro.
iv
A todos que contribuíram para a elaboração deste trabalho.
5
SUMÁRIO
página
RESUMO.......................................................................................................vii
ABSTRACT..................................................................................................viii
1. INTRODUÇÃO............................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.....................................................................3
2.1 Promoção do crescimento por rizobactérias...............................................3
2.2 Modos de ação das rizobactérias................................................................4
2.3 Colonização radicular por rizobactérias.....................................................8
3. MATERIAL E MÉTODOS13
3.1 Isolamento e contagem de bactérias fluorescentes...................................13
3.2 Adaptação e teste do método para avaliação de colonização radicular....15
3.3 Promoção de crescimento por RPCPs .....................................................16
3.4 Isolamento de fungos do solo do experimento........................................18
3.5 Teste de antagonismo in vitro..................................................................18
3.6 Análise dos resultados..............................................................................19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................20
4.1 Isolamento e contagem de bactérias fluorescentes...................................20
4.2 Adaptação e teste do método para avaliação de colonização radicular....22
4.3 Promoção de crescimento por RPCPs .....................................................24
4.4 Isolamento de fungos do solo do experimento.........................................29
4.5 Teste de antagonismo in vitro...................................................................29
5. CONCLUSÕES..........................................................................................32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................33
ÍNDICE DE QUADROS
6
Quadro 1. Características químicas do substrato utilizado para o cultivo das plantas
em vasos....................................................................................................17
Quadro 2. Características químicas do substrato à base de esterco de galinha...........17
Quadro 3. Número de bactérias fluorescentes e não fluorescentes em meio B de King
a partir da rizosfera de duas cultivares de alface, Gizele e Vera,
provenientes
de
quatro
locais.
Médias
de
seis
repetições..................................................................................................20
Quadro 4. Origem dos isolados de bactérias do grupo fluorescente do gênero
Pseudomonas............................................................................................21
Quadro 5. Presença (+) ou ausência (-) de colonização radicular no sistema radicular
(SR)
e
na
região
do
colo
(CL)
de
alface,
in
vitro...........................................................................................................22
Quadro 6. Massa da matéria seca da parte aérea (M.S.Parte aérea), raízes (M.S.Raiz),
total (M.S.Total) e número de folhas de alface em presença de diferentes
isolados fluorescentes do gênero Pseudomonas.
Médias de cinco
repetições..................................................................................................24
Quadro 7. Presença (+) ou ausência (-) de antagonismo in vitro contra o fungo
Fusarium
sp.
em
meio
de
cultura
BDA
e
B.
de
King...........................................................................................................30
7
RESUMO
Colonização radicular e promoção de crescimento vegetal por rizobactérias
Interações rizosféricas de plantas e microrganismos podem influenciar a
produção agrícola de diversas culturas, inclusive a alface. Testou-se e adaptou-se um
método in vitro de seleção de bactérias colonizadoras de raiz para promoção de
crescimento em alface (Lactuca sativa). Sessenta e quatro isolados de rizobactérias,
todos do grupo fluorescente de Pseudomonas sp., de diversas origens, foram isolados
e testados quanto à capacidade de colonização radicular in vitro, em meio de cultura
ágar-água.
Considerou-se que a presença de uma névoa túrbida de aspecto
esbranquiçado ao longo e em volta da raiz indicava a colonização das raízes pela
bactéria. Avaliou-se também a possibilidade de a ocorrência de névoa em volta do
colo da plântula indicar a colonização bacteriana das raízes. Dos sessenta e quatro
isolados fluorescentes do gênero Pseudomonas, apenas oito resultaram em névoa ao
longo das raízes e trinta e oito colonizaram a região do colo.
Desenvolveu-se
também um experimento em casa de vegetação para verificar a capacidade desses
isolados em promover crescimento em plantas de alface. O substrato utilizado foi
formado por uma mistura de solo e esterco, semelhante ao usado pelos produtores.
De todos os isolados testados, doze promoveram o crescimento das plantas, sendo
que quatro diferiram da testemunha em relação à massa de matéria seca da raiz e
nove diferiram em relação ao número de folhas.
A maioria dos isolados que
promoveram o crescimento das plantas de alface apresentou colonização radicular na
região do colo, levando à conclusão de que esse pode ser um parâmetro útil em
avaliações da colonização radicular por esse grupo bacteriano. Para verificar se as
bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas podem ser antagonizar potenciais
fitopatógenos de alface, realizou-se um teste in vitro em meio B de King e em meio
BDA.
Apenas doze dos sessenta e quatro isolados testados apresentaram
antagonismo contra Fusarium sp, sendo que, desses, apenas três foram eficientes na
promoção de crescimento em plantas de alface.
8
ABSTRACT
Root colonization and plant growth promotion by rhizobacteria
The productivity of several crops, including lettuce, can be influenced by
plant growth promotion rhizobacteria (PGPR). An in vitro method was tested and
modified for the selection of root colonizer bacteria for growth enhancement in
lettuce (Lactuca sativa). Sixty four bacterial isolates of fluorescent pseudomonads
from rhizosphere of different plants were tested in vitro to verify their capability
colonize lettuce roots, in a water-agar medium. The presence of a turbid, milky and
narrow zone indicated root colonization by the bacteria. Eight isolates had colonized
the root system and thirty eight had colonized the region of the root collar, as could
be evaluated by visual means. A greenhouse trial was carried out to verify their
capability for growth promotion in lettuce. The substrate was a mixture of soil and
cattle manure, similar to the one used by producers. Twelve isolates had promoted
growth and colonized the root collar. All the isolates were tested to verify their
potential as biological control agents in lettuce for suppression of root pathogenic
fungus Fusarium sp. The antagonistic assay was performed in PDA medium and
King’s B medium. Eighteen percent of the isolates showed antagonistic effects in
vitro. Although 18% of isolates showed antagonistic activity against Fusarium sp.,
only three enhanced growth in lettuce.
Comentário: Sueli, além dos
isolados obtidos de alface,
tem os isolados obtidos por
você que não são de alface....
Por isso, anteriormente, havia
escrito isolados de diferentes
origens rizosféricas....
Comentário:
9
1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos do solo são de fundamental importância na agricultura.
Algumas bactérias do solo fixam o nitrogênio atmosférico convertendo-o em
nutrientes para as plantas.
Já outras bactérias podem transformar o nitrogênio
orgânico a amônio que depois é convertido a nitrato por outro grupo de organismos.
Os microrganismos também são responsáveis por diversas transformações químicas
envolvidas no processo de ciclagem de nutrientes para as plantas. Os mecanismos
por eles utilizados ainda precisam ser estudados, uma vez que diversos fatores, ainda
não conhecidos, estão envolvidos.
A produção agrícola pode ser influenciada pelos microrganismos de
diferentes maneiras, sendo uma delas a promoção do crescimento de plantas. Os
benefícios causados pelas rizobactérias promotoras do crescimento de plantas
(RPCPs) podem ser verificados em diversas culturas, entre as quais a alface (FREITAS
et al., 2003). Além disso, podem atuar como agentes no controle biológico de
doenças, uma vez que induzem resistência sistêmica em plantas, produzem
antibióticos e sideróforos que inibem o crescimento de vários patógenos
(RAMAMOORTHY et al., 2001). Essas bactérias associam-se a diversas plantas numa
relação não simbiótica.
A alface (Lactuca sativa), introduzida no país pelos portugueses no século
XVI, é atualmente a folhosa mais consumida pelos brasileiros. É uma hortaliça
tipicamente folhosa e apresenta um caule muito curto, não ramificado. As raízes são
do tipo pivotante, com ramificações finas e curtas.
As variedades cultivadas
pertencem a diferentes tipos comerciais: com folhas lisas ou crespas sem fechamento
de cabeça e com folhas grossas com fechamento de cabeça (NAGAI, 1993).
Após o desenvolvimento da cabeça, havendo alta temperatura e luminosidade,
a planta entra no ciclo reprodutivo, emitindo uma haste floral que termina em uma
inflorescência. O plantio pode ser realizado o ano todo, porém resultados de melhor
crescimento ocorrem em clima frio para ameno (NAGAI, 1993).
A produção nacional de alface é estimada em aproximadamente 312.000
toneladas por ano (IBGE, 1996). Apenas no Estado de São Paulo ocupa uma área de
10
7.859 hectares, com uma produtividade de 137.000 toneladas por ano, gerando mais
de 6.000 empregos (CEASA-CAMPINAS, 2002).
Os fertilizantes e defensivos químicos contribuíram nas últimas décadas para
o aumento da produção de alimentos no mundo todo. Porém, o uso exagerado e
inadequado desses produtos pode causar vários problemas à saúde e ao meio
ambiente. O solo e os lençóis de água podem ser atingidos diretamente por esses
produtos se usados de forma inadequada.
Para minimizar os efeitos descritos acima e os causados por patógenos na
produção de alface, o incentivo de agricultores a utilizar o controle biológico e
técnicas de controle integrado de doenças e pragas – como, por exemplo, as
rizobactérias – seria uma opção bastante viável e de baixo custo para uma produção
agrícola com qualidade. Pesquisas com RPCPs revelam um caminho para o aumento
da produção de diversas culturas, entre elas a alface. Além disso, a produção de
inoculantes de baixo custo com diminuição dos insumos químicos no controle de
diversos patógenos é também uma alternativa para a produção agrícola.
Na cultura da alface já se observaram, em condições de campo, aumentos
significativos na matéria fresca, quando as sementes foram tratadas com
Pseudomonas fluorescens e Bacillus pumilus (GASONI et al., 2001).
O presente trabalho teve por objetivos: contar e obter isolados de bactérias do
grupo fluorescente do gênero Pseudomonas em solo rizosférico; avaliar método de
colonização radicular de alface por bactérias; comparar a capacidade de colonização
radicular dos isolados bacterianos com a sua capacidade de promoção do crescimento
das plantas de alface e verificar se as bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas
podem antagonizar fitopatógenos potenciais de alface.
11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Promoção do crescimento por rizobactérias
As rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs), como o
próprio nome indica, são bactérias que vivem na rizosfera, ou seja, na região do solo
sob influência da raiz, e que promovem crescimento das plantas associadas numa
relação não simbiótica. O interesse por suas funções na rizosfera está aumentando
significativamente nas últimas décadas, pois os efeitos de quaisquer bactérias que
colonizem a rizosfera podem ser positivos, neutros ou, até mesmo, negativos em
relação à promoção de crescimento (NEHL et al., 1996). Portanto, a introdução de
rizobactérias promotoras de crescimento de plantas no solo traz benefícios diretos
para a produção agrícola e, ao mesmo tempo, uma alternativa de cultivo com menor
uso de insumos agrícolas (SCHROTH et al., 1982; LAVIE e STOTZKY, 1986).
Os gêneros bacterianos que mais se destacam como promotores de
crescimento são: Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Azospirillum e Azotobacter
(ZAADY et al., 1993; RODRÍGUEZ e FRAGA, 1999).
A maioria das RPCPs são
bactérias Gram-negativas (KLOEPPER, 1993), sendo que o grupo mais estudado das
RPCPs pertence ao gênero Pseudomonas, que, além de promoverem crescimento,
atuam como agentes no controle biológico de várias pragas e doenças (MISKO e
GERMIDA, 2002). Essas bactérias também são fortes competidoras na rizosfera pela
variedade de substâncias que podem utilizar, havendo espécies do gênero em
ambientes muito variados (NEHL et al., 1996; MISKO e GERMIDA, 2002).
Freqüentemente entre as RPCPs estão as bactérias do grupo fluorescente do gênero
Pseudomonas (KLOEPPER, 1993).
Os benefícios das RPCPs podem ser observados nas mais variadas espécies
vegetais como grão de bico, berinjela (KUMAR, 1998), alfafa (OLSEN e MISAGHI,
1981), beterraba (THRANE et al., 2000), rabanete (LEEMAN et al., 1995), sorgo
(CHIARINI et al., 1998), batata, alface (BAKKER et al., 1986; GASONI et al., 2001;
12
FREITAS et al., 2003); tomate (FREITAS e PIZZINATTO, 1991; HOFFAMANNHERGARTEN, 1998) e várias plantas ornamentais (YUEN e SCHROTH, 1986).
13
Essas bactérias estão presentes na rizosfera, revelando grande versatilidade
quanto aos nutrientes requeridos por elas, o que pode contribuir para uma vantagem
competitiva em relação aos outros grupos de microrganismos que colonizam habitats
específicos ao longo da raiz (BURR e CAESAR, 1985).
As populações microbianas, pela diversidade de substratos metabólicos que
podem utilizar, podem variar de cultivar para cultivar, em função das diferenças na
exsudação radicular.
Genótipos vegetais e isolados diferentes variam em sua
interação: diferentes condições do habitat – nesse habitat considerados tanto o clima
quanto o solo ou substrato em que se desenvolvem as plantas – levam a alterações
metabólicas importantes que podem influenciar a maneira como plantas e
microrganismos interagem. Se houver uma alteração no padrão exsudativo da planta,
o mesmo isolado e o mesmo genótipo vegetal podem interagir de maneira diferente.
FREITAS et al. (2003), por exemplo, observaram instabilidade nos efeitos dos isolados
fluorescentes de Pseudomonas sp. sobre plantas de alface, atribuindo essa variação,
pelo menos em parte, às mudanças ocasionadas pelos diferentes substratos usados.
Inversamente, DIGAT et al. (1990) inocularam diferentes variedades de alface e
tomate com um isolado de Pseudomonas fluorescens e observaram que, ainda que as
condições ambientais fossem semelhantes para todas as interações, as respostas
quanto à promoção do crescimento variaram.
2.2 Modos de ação das rizobactérias
A promoção de crescimento pode ser o resultado de diversos mecanismos
como: controle biológico pela competição por nutrientes com o patógeno, produção
de sideróforos e antibióticos, resistência induzida a doenças e promoção de
crescimento diretamente pela produção de fitormônios e aumento da disponibilidade
de nutrientes pela fixação de nitrogênio ou solubilização de fósforo (KLOEPPER,
1993; NEHL et al., 1996; WHIPPS, 2000). Ainda que isso não esteja diretamente
ligado a sua atividade de promoção de crescimento, bactérias fluorescentes do gênero
Pseudomonas já foram relatadas como eficientes na degradação de poluentes
14
recalcitrantes – processo conhecido como rizorremediação, apresentando resultados
um tanto significativos (YEE et al., 1998).
O crescimento das plantas pode ser aumentado pela supressão dos
microrganismos do solo que são deletérios para o seu desenvolvimento.
Uma
maneira pela qual esse modo de ação pode se expressar é pela produção de
sideróforos, substâncias que quelam o ferro na rizosfera, tornando-o indisponível
para outros componentes da microbiota (TIENTZE et al., 1981; BURR e CAESAR, 1985;
MEYER et al., 1987). Esses compostos são produzidos em baixas concentrações de
ferro e são definidos como agentes quelantes de baixa massa molecular (300-1000
daltons), específicos para o íon férrico (NEILANDS, 1984, 1995). A produção de
sideróforos é influenciada por uma variedade de fatores, tais como a concentração de
íon férrico, a natureza e a concentração de fontes de carbono e nitrogênio, o teor de
fosfatos, o valor de pH e a temperatura (O’SULLIVAN e O’GARA, 1992). Em geral,
em solos alcalinos e calcários, a concentração do íon férrico livre é sempre limitante
e ele não está disponível para os microrganismos ou as plantas (SANTIAGO, 1999).
Nessas condições, algumas bactérias do gênero Pseudomonas produzem
sideróforos amarelo-esverdeados solúveis em água denominados pioverdinas ou
pseudobactinas (SCHER e BAKER, 1982; LEONG, 1986).
KLOEPPER et al. (1980)
demonstraram que um isolado de Pseudomonas fluorescens apresentou antagonismo
contra as bactérias Erwinia carotovora e Escherichia coli em meio B de KING et al.
(1954), que é deficiente em ferro.
O crescimento vegetal também pode ser estimulado de forma mais direta,
pelo aumento na disponibilidade de nutrientes para as plantas, pela solubilização de
fosfato inorgânico e pela mineralização de fosfato orgânico. Diferentes gêneros
bacterianos, como Pseudomonas, Bacillus e Agrobacterium, possuem habilidade para
solubilizar fosfatos de compostos inorgânicos (RODRÍGUEZ e FRAGA, 1999).
CHABOT et al. (1996 a,b) testaram microrganismos solubilizadores de fosfato,
como Pseudomonas spp. e Rhizobium leguminosarum, para verificar seu potencial
como RPCP em alface e milho. A solubilização de fosfato por essas bactérias
pareceu ser um mecanismo importante para a promoção de crescimento da planta em
um solo moderadamente fértil e em outro muito fértil, por causa do aumento da
disponibilidade do nutriente. Em ambos os estudos, o rizóbio mostrou-se o mais
15
eficiente na promoção de crescimento, ainda que bactérias desse grupo sejam
estudadas como fixadoras simbióticas de nitrogênio em leguminosas. Já DE SILVA et
al. (2000) relataram que o tratamento de amoreiras com P. fluorescens aumentou a
área foliar em 60 % e o diâmetro do pecíolo em duas vezes em relação ao controle.
Porém, a eficiência da inoculação pode variar com o tipo de solo e a cultivar
(RODRÍGUEZ e FRAGA, 1999).
Recentemente, o uso de RPCPs como indutoras de resistência sistêmica
contra diferentes patógenos de plantas vem demonstrando bons resultados em
determinadas condições de campo (WEI et al., 1991, 1996; LIU et al., 1995;
VISWANATHAN e SAMIYAPPAN, 2002 a,b). Entende-se por indução de resistência
sistêmica o aumento da capacidade de defesa da planta contra diversos patógenos
após estimulação apropriada, tornando-a mais resistente (RAMAMOORTHY et al.,
2001).
A indução de resistência sistêmica está diretamente ligada a alterações
bioquímicas e estruturais na planta (ARAÚJO, 2001).
A utilização de isolados nativos de RPCPs como indutores da defesa das
plantas pode ser a resposta para o aumento de suas aplicações e oferece um caminho
prático para transmitir imunização (RAMAMOORTHY et al., 2001). Há relatos de
indução de resistência sistêmica a diversos patógenos em várias culturas, como
contra murcha de Fusarium em cravo (VAN PEER et al., 1991), pepino (LIU et al.
1995 a,b) e rabanete (LEEMAM et al., 1995), antracnose causada por Colletotrichum
orbiculare em pepino (WEI et al., 1991,1996), podridão vermelha causada por
Colletotrichum falcatum em cana-de-açúcar (VISWANATHAN e SAMIYAPPAN, 2002
a,b) e até mesmo contra o vírus da necrose em tabaco (MAURHOFER et al., 1994,
1998). NANDAKUMAR et al. (2000) demonstraram ainda que apenas uma aplicação
de P. fluorescens na cultura do arroz foi capaz de induzir resistência sistêmica contra
o fungo Rhizoctonia solani, uma vez que a bactéria impediu o crescimento miceliano
e a incidência da doença.
Outros trabalhos relatam o envolvimento de
lipopolissacarídeos, modificações estruturais e bioquímicas, síntese de fitoalexinas,
produção de ácido salicílico e outros compostos na indução de resistência sistêmica
(RAMAMOORTHY et al., 2001).
No controle de nematóides, as RPCPs induzem resistência sistêmica alterando
os exsudatos radiculares ou induzindo a produção de substâncias repelentes que
16
afetam a atração dos nematóides ou o reconhecimento da planta hospedeira
(OOSTENDORP e SIKORA, 1990). O tratamento de sementes de alface e tomate com
Pseudomonas sp. e Bacillus cereus mostrou-se eficiente no controle biológico do
nematóide Meloidogyne incognita (HOFFMANN-HERGARTEN et al., 1998).
Ainda quanto ao controle de doenças, BAGNASCO et al. (1998) isolaram três
subespécies de P. fluorescens que podem atuar como agentes de controle biológico
da raiz de Lotus corniculatus contra Pythium ultimum e R. solani. O tratamento de
sementes de tomate e pimenta com Pseudomonas spp. fluorescentes resultou no
aumento de produção e controle do crescimento miceliano do fungo Phythium
aphanidermatum, responsável pelo “damping-off” ou tombamento de plântulas.
Além disso, as culturas apresentaram uma redução significativa na incidência da
doença tanto em casa de vegetação como em condições de campo (RAMAMOORTHY
et al., 2002).
Um experimento realizado com 62 isolados de Pseudomonas spp.
fluorescentes obtidos de diversas culturas mostrou que alguns isolados apresentaram
antagonismo contra Pythium spp., Botrytis cinerea, Phytophthora nicotianae e
Fusarium oxysporum in vitro. Os isolados de rizosfera de morango, alface, beterraba
e limão foram os que tiveram maior porcentagem de antagonismo (SARATHCHANDRA
et al., 1993). Ainda que os testes de antagonismo in vitro nem sempre apresentem o
mesmo resultado in vivo (FREITAS e PIZZINATTO, 1991), há que defenda o seu uso,
com base no fato de que a detecção de isolados com características antagônicas
eficientes poderiam facilitar uma primeira seleção, já que freqüentemente se trabalha
com um grande número de isolados (LUCON e MELO, 1999).
Outro modo de ação é a produção de antibióticos e compostos voláteis como
o HCN (TOMASHOW e WELLER, 1995; BAGNASCO et al., 1998).
O antibiótico
viscosinamide, produzido por P. fluorescens, foi responsável pelo encistamento do
zoósporo do fungo P. ultimum em beterraba. A presença do antibiótico faz com que
a proliferação do fungo seja inibida pela diminuição tanto do crescimento das hifas
como da motilidade do zoósporo na rizosfera (THRANE et al., 2000).
O HCN apresenta um grande potencial no controle biológico de ervas
daninhas, e muitas RPCPs podem produzir esse composto (KREMER e SOUISSI,
2001). KUMAR (1998) demonstrou que 3 isolados de Pseudomonas fluorescentes
17
apresentaram antibiose in vitro contra 7 fungos e 2 bactérias patogênicas em meio B
de King, deficiente em ferro. Sementes de grão de bico, berinjela, soja e tomate,
tratadas com esses isolados, obtiverem aumento na área foliar e no comprimento da
raiz, além de aumentos significativos na matéria fresca e seca.
Alguns isolados de P. fluorescens podem produzir fitormônios, como é o caso
do isolado CHA0 que produz ácido indolacético (AIA). Quando essas bactérias
foram modificadas em laboratório para aumentar a produção de AIA, estimularam
crescimento da planta de pepino em 20 %. Porém, a alta concentração do fitormônio
não foi capaz de inibir o fungo causador da podridão de raiz (BEYELER et al., 1999).
A eficiência das bactérias P. fluorescens como RPCPs e sua ação antagonista
contra Fusarium spp. pode ser aumentada pela aplicação de fertilizante nitrogenado.
Mudas de centeio que receberam essas bactérias tiveram um aumento significativo da
matéria seca foliar. Porém, o melhor efeito da promoção de crescimento e do
controle contra o fungo ocorreu quando o centeio crescia em solo fertilizado com
uma mistura de NO3- e NH4+ (KUREK e JAROSZUK-SCISEL, 2002).
2.3 Colonização radicular por rizobactérias
Um dos grandes problemas nas pesquisas com RPCPs e um assunto bastante
citado por diversos autores é a inconstância dos resultados (WELLER e
ZABLOTOWICZ, 1987; CHANWAY et al. 2000; FREITAS et al., 2003).
Uma das hipóteses para essa falta de constância seria a inabilidade dos
organismos introduzidos de se moverem do local de inoculação (semente) e de se
estabelecerem efetivamente na rizosfera e na superfície da raiz dessas plantas
(SUSLOW, 1982). STURZ e NOWAK (2000) sugerem que, se as bactérias fossem
endofíticas, a inconstância dos resultados seria menor, uma vez que não estariam
vulneráveis às condições do solo e do ambiente ou também não estariam sujeitas à
competição por nutrientes na rizosfera (MARIANO, 2001). Na literatura, há vários
trabalhos com bactérias eficientes na promoção de crescimento e no controle
biológico de nematóides que são endofíticas (HALLMANN et al., 1995; SHISHIDO et
al., 1999; CHANWAY et al., 2000).
18
O estabelecimento bacteriano na rizosfera é uma condição fundamental para
que o microrganismo possa interagir com a planta. Além disso, é necessário que a
bactéria se espalhe ao longo da raiz e não perca a capacidade de sobreviver e
multiplicar-se de maneira competitiva em relação à comunidade nativa (WELLER,
1988). A colonização radicular é um processo muito complexo, pois diferentes
microrganismos estão sujeitos a diversos fatores bióticos e abióticos, como umidade
do solo, luz, exsudação radicular etc. (CHIARINI et al., 1997; BENIZRI et al., 2001).
Outra hipótese para a inconstância dos resultados seria a promoção do
crescimento baseada no controle de patógenos subclínicos, cujos sintomas não são
evidentes: assim, se o patógeno não estiver presente, a planta não apresentará
doenças e, consequentemente, não haverá promoção de crescimento (WELLER e
ZABLOTOWICZ, 1987).
WELLER e ZABLOTOWICZ (1987) ainda afirmam que o
método de inoculação e as interações entre o genótipo da planta e a bactéria podem
contribuir para o insucesso dos resultados.
BAKER e DÉFAGO (1987) citam vários trabalhos em que a instabilidade
genética pode ser comprometedora para a inconstância dos resultados no controle
biológico de fitopatógenos por rizobactérias. Eles acreditam que os microrganismos
podem mudar sua constituição genética para melhor se adaptarem às condições in
vitro.
Em alguns casos, pode haver perda da virulência ou das características
genéticas após uma ou duas repicagens. Os agentes de controle biológico, segundo
os mesmos autores, são também afetados pelo meio ambiente em que vivem. A
umidade do solo, pH e temperatura, por exemplo, são fatores que influenciam o
desempenho dos microrganismos.
Os resultados ainda podem apresentar variações quando a quantidade de
matéria orgânica for alta ou quando a bactéria estudada não for competitiva o
suficiente com a microbiota nativa (HOWELL e OKON, 1987). Além disso, fatores
nutricionais do solo podem ser limitantes na competição entre bactérias, podendo
resultar numa ausência de colonização radicular em função do deslocamento
bacteriano para regiões mais abundantes em nutrientes (BRANDÃO, 1989). FREITAS
et al. (2003) obtiveram diferentes respostas quando isolados Pseudomonas sp. foram
submetidos a diferentes substratos com diferentes concentrações de nutrientes.
19
É na rizosfera, pela presença dos mais diversos exsudatos radiculares, que se
concentra o maior número de microrganismos.
A exsudação radicular também
determina quais organismos vão residir naquela rizosfera, como também, gerar
benefícios físicos e químicos para as plantas (NEHL et al., 1996). Um exemplo
desses benefícios é a produção de mucilagem no sistema radicular, reduzindo a
descamação das raízes e melhorando o contato entre as raízes e a solução do solo
(NEHL et al., 1996). Atualmente, as mudanças da composição dos exsudatos por
causa da estrutura e do funcionamento da comunidade microbiana do solo são pouco
compreendidas (KUREK e JAROSZUK-SCISEL, 2002). Contudo, um motivo provável
para a não-promoção de crescimento por um isolado bacteriano decorre de sua falta
de habilidade e agressividade em colonizar a rizosfera de uma espécie vegetal
(JJEMBA e ALEXANDER, 1999).
Na tentativa de monitorar o processo de colonização radicular por
rizobactérias, vários pesquisadores desenvolveram técnicas in vitro. HABE e UESUGI
(2000) colocaram sementes de tomate, previamente desinfestadas, em tubos de
ensaio contendo meio nutritivo MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) modificado sem
fonte de carbono. Após a germinação, as plântulas receberam inóculo de bactérias a
1 cm do colo e foram incubadas em sala de crescimento para observação do processo
de colonização radicular. As avaliações foram feitas visualmente, utilizando uma
escala de notas que variou entre “nenhuma colonização” e “total colonização”.
Outros pesquisadores comprovaram a existência da colonização radicular pelo
método do plaqueamento (GUPTA et al.1995; CHANWAY et al., 2000), ou pela
visualização em microscópio eletrônico (CHIN-A-WOENG et al. 1997; DEKKERS et al.,
2000).
ROMEIRO et al. (1999) submeteram sementes de tomate a suspensões
bacterianas por 24 hs. Essas sementes foram transferidas para tubos de ensaio
contendo apenas meio ágar-água. Devido à transparência do meio, a observação do
crescimento bacteriano em volta e ao longo da raiz foi feita visualmente. Os autores
afirmam que é um método bastante promissor na seleção de rizobactérias promotoras
de crescimento ou que apresentam potencial como agentes de controle biológico.
Já SIMONS et al. (1996), na tentativa de estudar melhor o processo de
colonização radicular, desenvolveram um sistema gnotobiótico.
Nesse sistema,
sementes esterilizadas são germinadas após incubação numa suspensão bacteriana
20
com 107 ou 108 ufcs. mL-1 por 15 minutos. Depois da inoculação, as sementes são
colocadas 5 mm abaixo da superfície em uma coluna de 10 cm de areia de quartzo,
umedecida com uma solução nutritiva sem adição de fonte de carbono. Depois de
sete dias de crescimento em câmara climatizada, a planta é removida. A raiz é
dividida em dois segmentos, que são agitados em solução tampão de fosfato salino
para remover as bactérias. A colonização é avaliada pela contagem do número de
bactérias depois de submeter à raiz a agitação por 20 minutos na solução tampão.
Algumas bactérias fixadoras de nitrogênio comportam-se como promotoras
de crescimento, podendo ser incluídas entre as RPCPs. Os mecanismos de ação
dessas bactérias são os mesmos já conhecidos para outras rizoabactérias (ANTOUN et
al., 1998). ANTOUN et al. (1998) citam trabalhos em que as bactérias dos gêneros
Rhizobium e Bradyrhizobium aumentaram significativamente a produção de milho,
feijão, trigo e aveia.
Outros autores demonstraram também que algumas bactérias do gênero
Pseudomonas estimularam a nodulação de leguminosas por Rhizobium spp. e
Bradyrhizobium spp. (GRIMES e MOUNT, 1987; POLONENKO et al., 1987).
No
entanto, BAGNASCO et al. (1998) não obtiveram o mesmo sucesso com seus isolados.
Eles sugeriram que o efeito positivo ocorreu pela proteção das raízes contra
patógenos menores, o que não necessariamente levou a uma promoção de
crescimento. Patógenos menores são microrganismos parasitas ou saprofíticos que
causam prejuízos para as plantas, porém os sintomas das doenças nem sempre são
aparentes ou óbvios (WELLER e ZABLOTOWICZ, 1987). A exclusão desses patógenos,
por meio das RPCPs, implicaria num melhor crescimento da planta (FREITAS e
PIZZINATTO, 1991).
Algumas bactérias, como Bacillus spp., Burkholderia spp. e Pseudomonas
spp., também podem estimular o desenvolvimento de micorrizas de diversas
maneiras. Trabalhos relatam a interação dessas bactérias com fungos micorrízicos
arbusculares, favorecendo o crescimento de plantas de feijão (SILVEIRA et al., 1995),
milho e batata (VOSÁTKA e GRYNDLER, 1999). Num outro estudo, a colonização
radicular e a atividade do fungo micorrízico Glomus mosseae mantiveram-se
inalteradas na presença de isolados de Pseudomonas fluorescens, mesmo que a
presença do fungo tenha aumentado população bacteriana na rizosfera (EDWARDS et
21
al., 1998). Isolados de Pseudomonas spp. e Serratia spp. também podem inibir a
colonização radicular por fungos micorrízicos; porém, quando analisadas sozinhas
sem o fungo micorrízico, estimularam o crescimento radicular em 67 % em relação à
testemunha (BENDING et al., 2002).
A solarização do solo pode ser também uma opção para selecionar
rizobactérias eficientes na promoção de crescimento de plantas ou no controle
biológico de pragas e doenças (FREITAS, 2001). GAMLIEL e STAPLETON (1993)
observaram que o número de Pseudomonas spp.fluorescentes era de 6 a 10 vezes
maior nas raízes de alface em solo solarizado do que em solo não solarizado. A
supressão de patógenos e a promoção de crescimento foram maiores no solo
solarizado por causa do aumento populacional da bactéria na rizosfera e nas raízes de
alface. Em outro estudo, GAMLIEL e KATAN (1991) verificaram que a porcentagem
de colonização radicular em tomate foi maior em solo solarizado. Inicialmente, a
solarização reduziu a comunidade de Pseudomonas spp. fluorescentes no solo,
porém, após o plantio, a colonização radicular ocorreu rapidamente na rizosfera e nas
raízes das plantas de tomate. A exsudação radicular é um fator predominante para
esse rápido crescimento na rizosfera (FREITAS, 2001).
O entendimento das interações bacterianas e os fatores que influenciam seu
estabelecimento na rizosfera podem melhorar a eficiência das RPCPs. Além disso, o
estabelecimento de métodos simples de seleção de rizobactérias promotoras do
crescimento de plantas pode agilizar a obtenção e a aplicação de isolados eficientes
em larga escala com diminuição de insumos agrícolas.
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Isolamento e contagem de bactérias
Foram amostrados solos rizosféricos de duas cultivares de alface (Lactuca sativa) de quatro produtores na cidade
de Campinas, cujas propriedades foram denominadas Parque Ceasa, Santa Genebra, São Benedito e São Marcos. As
cultivares amostradas foram ‘Vera’, na propriedades São Benedito e São Marcos, e ‘Gizele’, em Parque Ceasa e Santa
Genebra.
Todas as propriedades apresentam uma pequena área e as atividades caracterizam-se pela agricultura familiar.
Segundo os produtores, as áreas de cultivo das propriedades apresentavam as seguintes características:
•
Parque Ceasa: o local apresenta solo de várzea, sendo que a área de cultivo foi preparada com grande
quantidade de matéria orgânica. O sistema de plantio é rotativo para o cultivo de hortaliças e frutos.
•
Santa Genebra: o local apresentava um substrato orgânico, devido ao uso continuado de compostos
orgânicos. O cultivo predominante é o de hortaliças folhosas, que vem sendo realizado há 20 anos no
mesmo local.
•
São Benedito: na época da coleta, o solo estava bastante argiloso e
compactado; além de apresentar pouca matéria orgânica. O cultivo de
hortaliças, nesta propriedade, não é permanente, tendo sido cultivadas,
anteriormente, outras espécies, tais como milho, cana-de-açúcar e
feijão.
•
São Marcos: a área apresentava um substrato predominantemente
orgânico, devido ao uso continuado de adubos e compostos orgânicos.
A utilização de fertilizantes químicos no local é mínima. O sistema
rotativo é feito com outras hortaliças folhosas, porém predomina o
cultivo de alface.
23
A cultivar ‘Vera’ foi o resultado do cruzamento entre as cultivares ‘Verônica’ e ‘Slow Bolting’. Apresenta folhas
crespas de coloração verde-clara brilhante; além disso, as folhas basais são mais curtas e mais largas que as da cultivar
‘Verônica’. No entanto, apresenta um menor número de folhas. Seu ciclo varia de 50 a 70 dias, da semeadura ao ponto
ideal de colheita no mercado, dependendo da região e da época do cultivo. É uma cultivar resistente ao florescimento
prematuro em cultivos de verão; entretanto, é mais sensível à queima de bordas das folhas. Em relação ao cultivo de
inverno a campo aberto, apresenta excelente desempenho, como também em cultivo hidropônico durante o ano inteiro
(DELLA VECCHIA, 1999).
A cultivar ‘Gizele’ também apresenta folhas crespas bastante vigorosas. É uma cultivar tolerante ao pendoamento
precoce e apresenta excelente uniformidade entre as plantas. Oferece um bom rendimento na colheita, sendo bastante
resistente ao transporte. O número médio de folhas é 35 e seu ciclo varia de 70 a 80 dias. O plantio pode ser feito durante
o ano todo. A cultivar ‘Gizele’ é resistente ao vírus do mosaico da alface e ao míldio (AGRISTAR, 2003).
As raízes de plantas dessas variedades, previamente lavadas, foram cortadas e
colocadas em 100 mL de solução esterilizada de MgSO4.7H2O 0,01M em frasco
tampado. A seguir, agitou-se o frasco por 20 minutos. Prepararam-se diluições a
partir de 1 mLl da suspensão de solo assim obtida em 9 mL MgSO4.7H2O 0,01M até
a diluição 10-5. Posteriormente, espalhou-se 0,1 mL das diluições desejadas, com
auxílio da alça de Drigalski, em placas com meio B de KING et al. (1954) em
duplicata para obter isolados de bactérias fluorescentes e realizar sua contagem. As
placas foram mantidas a 28 – 30oC por período suficiente para se observar o
crescimento das colônias. As colônias fluorescentes foram enumeradas sob luz com
comprimento de onda próximo do ultravioleta. Depois, prosseguiu-se a contagem de
bactérias não fluorescentes, normalmente, com o contador.
As bactérias fluorescentes desenvolvidas no meio B, que se apresentavam
como colônias aparentemente puras, foram transferidas para novas placas com o
mesmo meio de cultura para observar fluorescência e pureza pela visualização
macroscópica e em microscópio óptico.
As células das Pseudomonas spp.
fluorescentes são bastonetes tipicamente curtos, móveis, com flagelo e Gramnegativos (STANIER et al., 1966).
Os isolados obtidos foram numerados seqüencialmente. Quando obtidos de um
mesmo espécime da planta, receberam o mesmo número seguido de uma letra do
alfabeto. Isolados com números diferentes provêm de plantas diferentes.
3.2 Avaliação de colonização radicular
Testou-se o método sugerido por ROMEIRO et al. (1999) para avaliação de
colonização radicular, em que a forma de se comprovar a colonização das raízes é
visual. Os autores propõem que as sementes sejam imersas em uma suspensão
24
bacteriana por 24 horas e, em seguida, transferidas para tubos de ensaio com ágarágua 0,8 %. Quando o sistema radicular se desenvolver, dentro do ágar, é possível
visualizar-se o crescimento bacteriano por transparência, ao longo e em volta das
raízes.
As sementes de alface utilizadas foram da cultivar ‘Brasil 221’ que faz parte
do banco de germoplasma do Instituto Agronômico (IAC). A cultivar é do tipo
manteiga com cabeças compactas que pesam cerca de 300g. As folhas são tenras,
de coloração verde clara e não apresentam antocianina. Além disso, a “Brasil 221”
é uma cultivar bastante resistente ao vírus de mosaico e ao calor (NAGAI, 1979),
características muito procuradas por produtores que realizam o cultivo orgânico.
Essas sementes foram desinfetadas com solução de hipoclorito de sódio a
2,5 % por um minuto e depois lavadas com um litro de água destilada e esterilizada.
Após serem tratadas, foram colocadas para germinar em placas de Petri com
algodão e papel de filtro umedecido. As placas foram embrulhadas com papel
alumínio para que a germinação ocorresse no escuro.
Depois de 24 h, as sementes germinadas foram colocadas numa suspensão
bacteriana (água destilada esterilizada + bactéria) por 10 minutos, numa tentativa de
diminuir o tempo necessário para a aplicação do teste. Com o auxílio de uma alça de
platina, as sementes foram retiradas e secas em papel de filtro e, a seguir, colocadas
em tubos de ensaio – uma semente por tubo – contendo meio agar-água a 0,6 % para
observar a colonização radicular. Foram feitas cinco repetições de cada tratamento
de inoculação. A observação da colonização radicular foi feita visualmente. Notouse a ocorrência de uma névoa túrbida de aspecto esbranquiçado ao longo e em volta
da raiz. Considerou-se que a presença dessa névoa indicava a colonização das raízes
pelas bactérias, conforme sugerido por ROMEIRO et al. (1999).
No entanto,
observou-se também, em alguns tubos de ensaio, a ocorrência de névoa na região do
colo, independentemente da presença de névoa no sistema radicular. Como não se
encontrou menção na literatura de que a colonização da região do colo poderia ser
indicadora da presença da bactéria no sistema radicular, optou-se por considerá-la,
também, como possível indicação de colonização radicular. Assim, a colonização
radicular, neste trabalho, foi registrada de duas maneiras: uma era a presença dessa
25
névoa em volta do sistema radicular e a outra, a presença dessa névoa próxima à
região do colo, em adaptação do método original.
Depois disso, a plântula foi retirada do tubo de ensaio com meio ágar-água, o
sistema radicular foi separado da parte aérea 2 cm abaixo do colo e colocado em
meio B de King para observar fluorescência após 24 - 48 horas. A ocorrência de
fluorescência no meio de cultura confirmava a presença de bactérias do grupo
fluorescente do gênero Pseudomonas.
Os 52 isolados bacterianos obtidos no experimento indicado no item 3.1,
juntamente com 12 isolados previamente estudados (FREITAS, 1994a), foram
utilizados no teste de colonização radicular.
Para o registro dos resultados
considerou-se como positivo o crescimento em 4 ou 5 dos tubos e como negativo a
ausência do crescimento em 4 ou 5 dos tubos.
Registrou-se também como
colonização parcial quando havia crescimento em 2 ou 3 parcelas.
A seguir, fez-se a comparação entre a capacidade de colonização das raízes e a
de promoção de crescimento.
3.3 Promoção de crescimento por RPCPs
Foi instalado, em casa de vegetação, um experimento com plantas de alface
no período de 29/7/2002 a 24/9/2002. O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado com cinco repetições.
Os vasos, com capacidade de 0,5 L, continham o substrato normalmente
usado pelos produtores de mudas (TRANI, comunicação pessoal). O solo utilizado
para o preparo desse substrato foi um Latossolo Vermelho Distrófico Típico, situado
no Campo Experimental Central do IAC na cidade de Campinas. No preparo do
substrato para os vasos, utilizou-se um metro cúbico desse solo peneirado (d = 1,10)
contendo 1.200 g de calcário fino (80 % PRNT), 800 g de superfosfato triplo em pó
(40 % P2O5), 150 g de sulfato de potássio (50 % K2O) e 330 litros de substrato
orgânico à base de esterco de galinha.
Esse substrato orgânico havia sido
previamente preparado com um mistura de 60 litros de solo superficial retirado do
26
horizonte B do mesmo Latossolo Vermelho Distrófico Típico e de 10 litros de
esterco de galinha peneirado em peneira com malha de 5 mm, ficando com densidade
aparente igual a 0,7.
As características químicas do substrato para os vasos estão apresentadas no
Quadro 1 e as características químicas do substrato à base de esterco de galinha, no
Quadro 2.
Quadro 1. Características químicas do substrato utilizado para o cultivo das plantas
em vasos.
SUBSTRATO DOS VASOS
M.O.
-3
pH
V
g.dm
CaCl2
%
28
6,9
97
K
Ca
Mg
H+Al
S.B.
CTC
-3
------------------mmolc.dm ------------0,9 335,0 40,0
13,0
P
B
Cu
Fe
Mn
Zn
-3
-----------------mg.dm ----------------
384,9 398,2 1524,0 0,66 13,0 12,0 15,0 24,4
Quadro 2. Características químicas do substrato à base de esterco de galinha
SUBSTRATO À BASE DE ESTERCO DE GALINHA
pH
Umid M.O.
%
6,0
35,1
C
N
P
K
S
Ca
Mg
Fe
--------------------------g.kg-1---------------------------------387,0 225,0
26,7 31,8 0,9
B
Cu
Mn
Zn
------------mg.kg-1-----------
5,0 69,6 4,0 6,0 28,5 1000,5 947,0 820,0
As sementes, antes de serem plantadas, foram desinfetadas com hipoclorito
de sódio a 2,5 % por um minuto e depois secas em papel de filtro esterilizado, em
câmara de fluxo laminar. Foram colocadas 4 sementes por vaso. Dois dias após o
plantio, as sementes receberam o inóculo de cada um dos 64 isolados bacterianos
cultivados em tubos de ensaio com meio B sólido por 24 horas. Para o preparo do
inóculo, o crescimento das bactérias da superfície dos tubos foi raspado com alça de
platina e transferido para frascos de Erlenmeyer com 100 mL de MgSO4.7H2O
0,01M. A testemunha, sem inoculação, recebeu a mesma quantidade em volume – 8
mL – da solução esterilizada de MgSO4.7H2O 0,01M. Foram utilizados os isolados
cuja obtenção está descrita no item 3.1 e 12 isolados previamente estudados
27
(FREITAS, 1994a).
Catorze dias após a primeira inoculação, as plantas foram
reinoculadas, como já descrito anteriormente.
O desbaste foi efetuado no 25o dia, ficando somente uma planta por vaso. Por
volta, do 37o dia cada vaso recebeu um grama de nitrocálcio, pois as plantas se
mostravam amareladas. Foram mantidas nos vasos por 56 dias, tempo necessário
para que se observassem diferenças de crescimento, mas sem que houvesse o
comprometimento da raiz pelo espaço disponível. Após a colheita foi determinada a
matéria seca da parte aérea e da raiz e o número de folhas.
3.4 Isolamento de fungos do solo do experimento
A partir de suspensões do solo onde foi desenvolvido o experimento descrito
no item 3.3, procedeu-se ao isolamento de fungos em meio de Martin (TUITE, s.d.),
visando à obtenção de eventuais patógenos para utilização em teste de antagonismo
in vitro.
Foram amostrados 10 g de solo sem esterco e sem bactéria e colocados em
90 mL de solução esterilizada de MgSO4.7H20 0,01M em frasco tampado. Agitou-se
o frasco por 20 minutos. A seguir, prepararam-se diluições de 1 mL da suspensão
anterior de solo em 9 mL de MgSO4.7H20 0,01M até a diluição 10-5. Posteriormente,
espalhou-se 0,1 mL das diluições em placas de Petri contendo meio de Martin em
duplicata. As placas foram mantidas a 28 - 30oC por período suficiente para se
observar crescimento do fungo. Os fungos que se apresentavam em colônias puras
foram transferidos para tubo inclinado contendo meio BDA. O mesmo procedimento
foi realizado com o solo com esterco.
3.5 Teste de antagonismo in vitro
O fungo Fusarium sp., obtido no procedimento descrito no item 3.4, foi
confrontado com os 64 isolados bacterianos, para verificar a ocorrência de
antagonismo in vitro. Dos 10 fungos isolados, utilizou-se apenas o Fusarium sp. por
28
ser um possível patógeno. Os outros constituíam-se em saprófitas habitualmente
encontrados no solo.
Um disco de meio de cultura contendo crescimento miceliano do fungo foi
transferido para o centro das placas de Petri em meio B de King e em meio BDA em
duplicata. As placas foram mantidas a 28 ± 2oC por 48 horas. As bactérias foram
mantidas em crescimento por 24 h em meio B de King a 28 ± 2oC e, em seguida,
foram transferidas em 4 pontos eqüidistantes entre si e do centro da placa. As
colônias do fungo, antes da inoculação bacteriana, apresentavam 3 cm de diâmetro.
As placas foram mantidas em incubadora, nas mesmas condições, novamente por 24
– 48 hs.
O meio B de King possui baixa concentração de ferro, favorecendo a
produção de sideróforos. O meio BDA foi utilizado, pois, como possui alta
concentração de ferro, evita a produção de sideróforos, sem, contudo, impedir a de
antibióticos.
A avaliação foi feita visualmente pelo confronto com placas controle, pela
ocorrência ou não de antagonismo. O antagonismo pode ser evidenciado pela
formação de halos de inibição, a forma mais comumente utilizada, ou quando ocorre
alguma limitação do crescimento do fungo pela bactéria.
3.6 Análise dos Resultados
A análise de variância dos resultados do experimento em vasos em casa de
vegetação foi feita pelo teste F e a comparação de médias, pelo teste unilateral de
Dunnett.
29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento e contagem de bactérias
Os resultados da contagem de rizobactérias estão no quadro 3.
Quadro 3. Número de bactérias fluorescentes e não fluorescentes em meio B de
King a partir da rizosfera de duas cultivares de alface, Gizele e Vera, provenientes de
quatro locais. Médias de seis repetições.
Bactérias fluorescentes
Bactérias não fluorescentes
(ufcs x 107.g-1 de raízes secas)a
(ufcs x 109.g-1 de raízes secas)
Cultivar Vera
São Benedito
3,74(1)
3,33
São Marcos
0,92
1,58
Coeficiente de
60
31
variação (%)
Cultivar Gizele
Parque Ceasa
4,00
2,35
Santa Genebra
4,80
1,66
Coeficiente de
27
6
variação (%)
(1)
Médias originais transformadas em log x + 1 para análise da variância.
Locais
(a)
ufcs: unidades formadoras de colônia
Não houve diferenças estatísticas nos números de bactérias fluorescentes e de
não fluorescentes, indicando que, apesar de as propriedades apresentarem históricos
de cultivo diferentes, o número de bactérias fluorescentes e não fluorescentes não foi
influenciado, em nenhuma das cultivares amostradas. No entanto, pode-se observar
que o coeficiente de variação foi bastante alto, mesmo levando-se em conta que os
dados foram transformados em logaritmo, procedimento utilizado para uniformizar
dados de contagens. Esse é um fenômeno bastante comum em amostragens em
campo, uma vez que as condições são pouco uniformes e podem resultar em grandes
variações, mesmo quando em pequenas distâncias.
30
Depois da contagem, prosseguiu-se com o isolamento das bactérias
fluorescentes.
Foram isoladas 52 bactérias fluorescentes.
No Quadro 4, estão
relacionados todos os isolados bacterianos utilizados neste estudo e suas origens,
sendo que 12 destes foram obtidos por FREITAS (1994), totalizando 64 isolados.
Quadro 4. Origem dos isolados de bactérias do grupo fluorescente do gênero
Pseudomonas.
Isolados
Ps- 21A(1)
Ps- 31B(1)
Ps- 41A(1)
Ps- 42B(1)
Ps- 43B(1)
Ps- 44B(1)
Ps- 70(1)
Ps- 80(1)
Ps- 85(1)
Ps- 91(1)
Ps- 92(1)
Ps- 221(1)
Ps- 851A
Ps- 851B
Ps- 851C
Ps- 851D
Ps- 852A
Ps- 852B
Ps- 852C
Ps- 852D
Ps-853A
Ps-853B
Ps- 854A
Ps- 854B
Ps- 855B
Ps- 855C
Ps- 856A
Ps- 856B
Ps- 857A
Ps- 857B
Ps- 857C
Ps- 858
(1)
Origem
Rizosfera de Algodoeiro
Rizosfera de Milho
Rizosfera de Soja
Isolados
Ps- 859
Ps- 860
Ps- 861A
Ps- 861B
Ps- 862A
Ps- 862B
Rizosfera de Citrus
Ps- 863
Rizosfera de Couve
Ps- 864A
Rizosfera de Alface
Ps- 864B
Rizosfera de Pimentão
Ps- 864C
Ps- 865A
Solo Solarizado
Ps- 865B
Rizosfera de alface
Ps- 865C
Cultivar Vera (São Benedito) Ps- 865D
Ps- 866A
Ps- 866B
Ps- 867
Ps- 868
Ps- 869A
Ps- 869C
Ps- 869D
Ps- 870A
Ps- 870B
Ps- 870C
Ps- 871A
Ps- 871B
Ps- 871C
Ps- 872
Rizosfera de alface
Ps- 873A
Cultivar Gizele (Santa
Ps- 873C
Genebra)
Ps- 873D
Ps- 874
Isolados obtidos por FREITAS (1994a
Origem
Rizosfera de alface
Cultivar Gizele (Santa
Genebra)
Rizosfera de alface
Cultivar Gizele (Parque
Ceasa)
Rizosfera de alface
Cultivar Vera (São Marcos)
32
4.2 Adaptação e teste do método para avaliação de colonização radicular
Os resultados do teste de colonização radicular em alface estão presentes no
Quadro 5. Dos 52 isolados de bactérias do gênero Pseudomonas obtidos das duas
cultivares de alface e os 12 previamente estudados, apenas 8 colonizaram a plântula
de alface ao longo das raízes; isto é, no que se convencionou, neste trabalho, chamar
de sistema radicular, o que representa 12 % do total de isolados.
Quadro 5. Presença (+) ou ausência (-) de colonização no sistema radicular (SR) e
na região do colo (CL) de alface, in vitro.
Colonização
Colonização
Colonização
Colonização
Isolados
Isolados
Isolados
SR CL
SR CL
SR CL
SR CL
(1)
Ps- 21A
- Ps- 852A +
+ Ps- 859
+/+ Ps- 867
+/+
Ps- 31B
+
+ Ps- 852B +
+ Ps- 860
+ Ps- 868
+/+
Ps- 41A
+ Ps- 852C +/+ Ps- 861A
+ Ps- 869A +/+
Ps- 42B
+ Ps- 852D + Ps- 861B +/+ Ps- 869C +/+
Ps- 43B
+ Ps-853A +/- Ps- 862A
+/- Ps- 869D
+
Ps- 44B
+/- +/- Ps-853B
+/- Ps- 862B
+/- Ps- 870A
+/Ps- 70
+ Ps- 854A +/- Ps- 863
+/- Ps- 870B +/+
Ps- 80
+/- Ps- 854B +/+ Ps- 864A
+ Ps- 870C
+
+
Ps- 85
+ Ps- 855B + Ps- 864B
+
+ Ps- 871A
+
+
Ps- 91
+/- Ps- 855C +/- Ps- 864C +/+ Ps- 871B
+
Ps- 92
+ Ps- 856A +/- Ps- 865A
+/- Ps- 871C
Ps- 221
+/+ Ps- 856B - Ps- 865B +/+ Ps- 872
Ps- 851A - Ps- 857A - Ps- 865C +/+ Ps- 873A
+
+
Ps- 851B
- Ps- 857B - Ps- 865D +/+ Ps- 873C
+
+
Ps- 851C
- Ps- 857C - Ps- 866A
+ Ps- 873D
+/Ps- 851D +/- Ps- 858
+/- +/- Ps- 866B +/+ Ps- 874
+/+
(1)
+ → colonização radicular em 4 ou 5 parcelas
Isolados
- → sem colonização radicular em 4 ou 5 parcelas
+/- → colonização radicular em 2 ou 3 parcelas
33
No entanto, um maior número de bactérias colonizaram a região do colo, isto
é, houve uma maior ocorrência de bactérias na região próxima ao colo da planta do
que no sistema radicular. Dos 64 isolados, 38 colonizaram a região do colo, num
total de 59 %.
Os oito isolados que colonizaram totalmente o sistema radicular, de acordo
com a avaliação que considerou a presença de névoa ao longo das raízes, também
foram positivos na avaliação da colonização na região do colo. Dos dezoito isolados
que colonizaram parcialmente o sistema radicular, dezessete resultaram em
colonização positiva na região do colo, sugerindo que mesmo a colonização parcial,
da maneira como foi definida neste trabalho, pode ser indicadora da capacidade das
bactérias em colonizarem o colo (Quadro 5).
A partir desses resultados, verifica-se que as bactérias testadas apresentaram
formas de colonização diferentes, ou seja, algumas bactérias colonizaram o sistema
radicular, outras o colo ou, ainda, os dois. HABE e UESUGI (2000) também
observaram diferenças na colonização e verificaram que o número de bactérias que
colonizaram o rizoplano (sistema radicular) foi maior que de bactérias que
colonizaram a rizosfera.
UESUGI (2003) sugeriu que a concentração de bactérias na região próxima ao
colo da planta, mas sem nenhuma colonização ao longo das raízes, pode indicar um
isolado bacteriano com baixa capacidade colonizadora, que, por ter maiores
34
necessidades de oxigênio, desloca-se para a superfície em busca de oxigênio,
resultando em falha na colonização geral das raízes.
Vale ressaltar ainda que a ausência de fonte de carbono no meio utilizado,
composto apenas por ágar e água, permitiu o desenvolvimento somente das bactérias
que conseguem sobreviver utilizando os exsudatos radiculares da plântula de alface
ou que são quimiotaticamente atraídas (HABE e UESUGI, 2000). Bactérias do gênero
Pseudomonas, como as utilizadas neste trabalho, são conhecidas como habitantes de
rizosfera, o que explica a sua capacidade de usar exsudatos radiculares (NEHL et al.,
1996; MISKO e GERMIDA, 2002). O estabelecimento do microrganismo na rizosfera
garante sua interação com a planta, mesmo que esta relação seja prejudicial
(FREITAS, 1994b).
O método de monitoramento in vitro da colonização radicular é eficiente para
selecionar possíveis agentes de controle biológico in vivo ou promotores de
crescimento (ROMEIRO et al., 1999; HABE e UESUGI, 2000). A eficácia do método
está ligada ao fato de permitir a avaliação rápida de um grande número de isolados.
4.3 Promoção de crescimento por RPCPs
35
Dos 64 isolados de Pseudomonas sp. testados, doze – cerca de 18% do total –
promoveram o crescimento das plantas, sendo que 4 isolados diferiram da
testemunha em relação à massa de matéria seca da raiz e 9 diferiram em relação ao
número de folhas (Quadro 6).
Quadro 6. Massa da matéria seca da parte aérea (M.S.Parte aérea), raízes
(M.S.Raiz), total (M.S.Total) e número de folhas de alface em presença de diferentes
isolados fluorescentes do gênero Pseudomonas. Médias de cinco repetições.
Isolados
Testemunha
Ps - 21A
Ps - 31B
Ps - 41A
Ps - 42B
Ps - 43B
Ps - 44B
Ps - 70
Ps - 80
Ps - 85
Ps - 91
Ps - 92
Ps - 221
Ps - 851A
Ps - 851B
Ps - 851C
Ps - 851D
Ps - 852A
Ps - 852B
Ps - 852C
Ps - 852D
Ps - 853A
Ps - 853B
Ps - 854A
Ps - 854B
Ps - 855B
Ps - 855C
Ps - 856A
Ps - 856B
Ps - 857A
Ps - 857B
Ps - 857C
M.S.Parte Aérea (g)
2,00
2,06
1,96
1,99
1,79
2,16
1,54
1,84
1,82
1,83
1,34*
2,05
1,61
1,87
1,86
2,27
2,03
1,51
1,72
2,04
2,14
1,96
2,17
1,82
2,28
1,94
1,92
1,32*
1,77
1,97
1,95
1,88
M.S.Raiz(g)
1,51
1,41
2,86*
1,91
1,97
2,3
2,19
1,43
2,90*
1,06
1,66
2,16
1,55
2,39
2,18
2,55
2,59
2,92*
2,40
2,11
2,65
2,15
3,00*
1,96
2,43
2,40
2,22
1,89
1,90
2,74
2,11
1,74
M.S. Total (g)
3,52
3,47
4,82
3,90
3,76
4,46
3,74
3,27
4,72
2,89
3,00
4,21
3,16
4,26
4,03
4,82
4,62
4,43
4,12
4,15
4,79
4,11
5,17
3,78
4,71
4,34
4,14
3,21
3,68
4,70
4,06
3,63
No Folhas
19,40
20,00
20,00
22,00
18,60
20,20
19,00
20,20
21,20
20,40
18,60
21,20
19,80
21,20
20,20
22,60
20,80
20,60
21,00
21,20
22,40
21,80
23,60*
22,80
23,20*
21,80
23,00
18,00
19,60
20,60
22,20
21,60
36
Continua...
Quadro 6. Continuação.
Isolados
Ps - 858
Ps - 859
Ps - 860
Ps - 861A
Ps - 861B
Ps - 862A
Ps - 862B
Ps - 863
Ps - 864A
Ps - 864B
Ps - 864C
Ps - 865A
Ps - 865B
Ps - 865C
Ps - 865D
Ps - 866A
Ps - 866B
Ps - 867
Ps - 868
Ps - 869A
Ps - 869C
Ps - 869D
Ps - 870A
Ps - 870B
Ps - 870C
Ps - 871A
Ps - 871B
Ps - 871D
Ps - 872
Ps - 873A
Ps - 873C
Ps - 873D
Ps - 874
M.S. Parte Aérea (g)
1,66
2,08
2,13
2,19
1,98
1,81
1,92
2,37
1,70
1,87
2,28
2,11
1,83
2,00
2,26
2,17
2,32
2,17
2,26
2,32
1,51
1,98
2,12
1,83
1,98
1,68
2,24
1,80
2,13
1,86
2,19
1,70
2,2
M.S. Raiz (g)
2,07
1,71
1,97
2,15
1,62
1,47
1,46
2,16
1,25
1,61
1,77
2,39
2,12
2,30
2,64
2,07
2,18
2,13
2,19
2,48
1,17
2,40
2,65
2,27
1,83
2,64
1,81
1,60
2,37
2,15
2,04
1,85
1,93
M.S. Total (g)
3,74
3,79
4,10
4,34
3,59
3,28
3,38
4,53
2,95
3,48
4,05
4,50
3,95
4,31
4,90
4,24
4,50
4,30
4,44
4,80
2,68
4,38
4,78
4,10
3,81
4,32
4,06
3,40
4,49
4,01
4,23
3,55
4,12
No folha
20,40
21,60
22,80
24,40*
23,60*
21,00
21,40
22,80
19,40
22,20
23,20*
23,00
22,80
22,00
22,40
23,20*
23,20*
23,00
21,40
23,00
19,20
22,40
23,00
21,20
22,00
21,80
23,00
20,60
23,60*
21,80
25,00*
22,00
22,80
Médias seguidas por * diferem da testemunha pelo teste unilateral de Dunnett a 5%.
Quanto à massa de matéria seca da raiz, observou-se que os isolados Ps-31B,
Ps-80, Ps-852A e Ps-853B estimularam o desenvolvimento radicular das plantas de
37
alface. SILVEIRA et al. (1995) obtiveram resultados semelhantes quando plantas de
feijão receberam isolados de Pseudomonas sp. CHIARINI et al. (1998), por sua vez,
obtiveram aumentos significativos tanto na massa da matéria fresca da parte aérea
como da raiz quando plantas de sorgo receberam inóculo contendo isolados de
Pseudomonas fluorescens ou de Burkholderia cepacia.
GASONI et al. (2001)
obtiveram respostas positivas apenas em relação à massa da matéria fresca em
plantas de alface. Os resultados da colonização radicular (Quadro 5) mostram que,
dos quatro isolados, Ps-31B e Ps-852A colonizaram tanto o sistema radicular quanto
à região do colo, enquanto que Ps-80 e Ps-853B colonizaram somente a região do
colo e, ainda assim, parcialmente.
Quanto ao número de folhas, os isolados Ps-853B, Ps-854B, Ps-861A, Ps861B, Ps-864C, Ps-866A, Ps-866B, Ps-872 e Ps-873C foram significativos em
relação à testemunha. Quase todos os isolados, com a única exceção do isolado Ps872, apresentaram habilidade para colonização da região do colo, mesmo que parcial
(Quadros 5 e 6).
O isolado Ps-853B mostrou-se o isolado mais eficiente quanto à promoção de
crescimento na cultura da alface, sendo o único que diferiu da testemunha e foi
benéfico para as duas variáveis testadas, quanto à massa de matéria seca da raiz e ao
número de folhas. Mesmo sendo um bom promotor de crescimento, os resultados
sobre a colonização radicular mostram que o isolado colonizou parcialmente a região
do colo, indicando que as formas de avaliação utilizadas aqui podem não ser as
melhores. No entanto, se a colonização da região do colo for considerada uma
indicação positiva da presença da bactéria no sistema radicular, as avaliações aqui
levadas em conta podem se constituir em ferramentas úteis para definir a colonização
radicular.
O isolado Ps-872, que foi promotor de crescimento em relação ao número de
folhas, não apresentou colonização radicular no sistema radicular e na região do colo,
nem parcialmente, indicando limitações no método utilizado para detectar a
colonização radicular ou, ainda, o isolado pode ser um colonizador endofítico,
38
situação em que sua presença não seria detectada externamente às raízes.
Na
literatura, há trabalhos sobre isolados de Pseudomonas spp. e Bacillus spp. que
colonizam endofiticamente plântulas de abeto (SHISHIDO et al., 1999; CHANWAY et
al., 2000). Essas bactérias, por colonizarem internamente os tecidos da raiz, podem
ser mais efetivas como RPCPs, pois não estariam vulneráveis às condições do solo e
do ambiente (STURZ e NOWAK, 2000).
Os isolados Ps-91 e Ps-856A foram prejudiciais em relação à testemunha
quando se considerou a massa de matéria seca da parte aérea. Ambos os isolados
colonizaram parcialmente a região do colo (Quadros 5 e 6).
Essa observação
corrobora a utilidade do método para avaliação da colonização, uma vez que, para a
expressão do efeito prejudicial, também se faz necessária a colonização radicular.
FREITAS et al. (2003) obtiveram o mesmo resultado com o próprio isolado Ps-91 em
um experimento com areia esterilizada. O isolado mostrou-se patogênico, matando
todas as plantas. Porém, num outro experimento realizado em solo com adição de
esterco, o mesmo se comportou como promotor de crescimento. Neste trabalho, as
plantas não foram irrigadas com solução nutritiva, como nos experimentos acima,
sugerindo que quantidades diferentes de nutrientes podem afetar a exsudação
radicular do cultivar, alterando o comportamento dos isolados, conclusão a que já
haviam chegado FREITAS et al. (2003).
Pelo Quadro 6, constata-se que os isolados bacterianos não promoveram
crescimento das plantas de alface, comparando-se as massas de matéria seca da parte
aérea e total da testemunha.
Quanto aos isolados obtidos por FREITAS (1994a), apenas dois promoveram o
crescimento das plantas e o isolado obtido da rizosfera de pimentão (Ps-91)
apresentou efeito negativo sobre o crescimento. Os dois promotores de crescimento,
Ps-31B e Ps-80, foram originalmente obtidos de milho e couve, respectivamente.
Considerando-se a origem dos isolados utilizados, ambas as cultivares, tanto
‘Vera’ quanto ‘Gizele’, forneceram os mesmos números de promotores de
crescimento, cinco em cada cultivar. Porém, os isolados da cultivar ‘Gizele’ foram,
39
na sua maioria, promotores de crescimento em relação ao número de folhas. Já os
outros, da cultivar ‘Vera’, promoveram tanto o crescimento das raízes quanto
aumentaram o número de folhas. Os isolados Ps-43B, Ps-44B, Ps-80, Ps-85, Ps-91,
Ps-92, Ps-221 foram promotores de crescimento em relação à matéria seca da parte
aérea no experimento realizado por FREITAS et al. (2003). Todos os isolados
colonizaram a região do colo, sendo que o Ps-44B, Ps-80, Ps-91 colonizaram
parcialmente e dois colonizaram o sistema radicular. Já os isolados PS-21A, Ps-41A,
Ps-42B e Ps-70 tiveram o mesmo desempenho dos resultados aqui observados, ou
seja, não foram promotores de crescimento em relação à matéria seca da parte aérea.
Com exceção do isolado Ps-21A, todos os outros colonizaram a região do colo. Dos
isolados obtidos por FREITAS (1994a), o isolado Ps-31B revelou-se ser promotor de
crescimento, contrariando as observações realizadas por FREITAS et al. (2003), nas
quais o isolado não diferiu da testemunha em relação à matéria seca da parte aérea. O
isolado apresentou colonização tanto no sistema radicular como na região do colo
(Quadro 5). Não houve especificidade entre os isolados utilizados neste experimento,
pois isolados obtidos de rizosfera de outras plantas apresentaram capacidade de
promoção crescimento de alface.
Os demais isolados não mostraram habilidade em promover crescimento
vegetal. Uma hipótese para a não-promoção de crescimento seria a ausência de
colonização radicular como ocorreu com os isolados Ps-851A, Ps-851B, Ps-851C,
Ps-856B, Ps-857A, Ps-857B, Ps-857C e Ps-871C (Quadro 5). Outra hipótese seria a
planta não apresentar patógenos menores ou, ainda, o método de inoculação não ter
sido eficaz (WELLER e ZABLOTOWICZ, 1987). É claro que a hipótese referente aos
patógenos menores só tem sentido se o modo de ação desses isolados for pela
inibição a esse tipo de patógenos.
Os isolados Ps-852B, Ps-864B, Ps-870C, Ps-871A e Ps-873A colonizaram
tanto as raízes quanto à região do colo, porém não promoveram crescimento das
plantas de alface (Quadros 5 e 6). Esse fato indica que as bactérias apresentaram um
comportamento neutro em relação à planta ou que ocorreram modificações genéticas
40
para que essas bactérias se adaptassem melhor, influenciando seu desempenho na
promoção de crescimento (BAKER e DÉFAGO, 1987). Uma microbiota nativa mais
competitiva que os isolados testados também pode influenciar a colonização
radicular.
Analisando-se o conjunto de dados, observa-se que entre os 54 isolados que
colonizaram a região do colo – 16 dos quais apenas parcialmente – e os 26 que
colonizaram as raízes – 18 dos quais apenas parcialmente –, somente no caso da
inoculação do isolado Ps-872 não foi constatada névoa nem no colo nem nas raízes,
apesar de se ter constatado interação com a planta. Alguns isolados que interagiram
com a planta, benéfica ou prejudicialmente, somente tiveram sua presença detectada
pela visualização de névoa na região do colo.
Uma vez que a promoção do
crescimento só pode se expressar se houver colonização radicular, isto é,
estabelecimento da interação de microrganismo e planta, pode-se concluir que a
avaliação da colonização radicular pela observação da névoa na região do colo é
suficiente para indicar a ocorrência dessa interação.
Embora os efeitos sejam benéficos, ainda não são conhecidos os mecanismos
de ação dessas bactérias, o que dificulta o seu uso em larga escala.
4.4 Isolamento de fungos do solo do experimento
De acordo com o procedimento descrito no item 3.4, foram isolados dez
fungos do solo. Desses dez, dois pertencem ao gênero Penicillium e os demais, aos
gêneros Fusarium, Trichoderma, Aspergillus e Rhizopus. A identificação dos fungos
foi realizada pela visualização macroscópica e microscópica pela observação de
lâminas em microscópio óptico.
A identificação de 4 fungos não foi possível.
Assim, o único utilizado no teste de antagonismo foi o do gênero Fusarium, um
patógeno potencial, enquanto os outros constituem-se em saprófitas normalmente
encontrados no solo.
41
4.5 Teste de antagonismo in vitro
Os resultados do teste de antagonismo in vitro estão no Quadro 7. Apenas 12
de 64 isolados de Pseudomonas testados, 18,75 % do total, apresentaram
antagonismo in vitro contra o fungo Fusarium sp.
Nesse teste, o antagonismo
expressado por esses isolados mostrou-se fraco. A formação do halo de inibição não
ocorreu e as bactérias apenas impediram o crescimento do fungo por cima delas,
sugerindo uma possível competição por nutriente.
Dos 12 isolados, somente os isolados Ps-864C, Ps-866A e Ps-866B
promoveram o crescimento da planta de alface (Quadro 6). O isolado Ps-866B
apresentou antagonismo tanto em meio BDA quanto em meio B de King, sugerindo
que a inibição do crescimento do fungo ocorreu, provavelmente, pela produção de
antibiótico (Quadro 7). Por ser pobre em ferro, o meio B de King estimula a
produção de sideróforo, o que não ocorre em BDA. Já os outros dois isolados (Ps864C e Ps-866A) apresentaram antagonismo apenas no meio BDA. Os três isolados
ocorreram na região do colo, sendo que os isolados Ps-864C e Ps-866B apresentaram
colonização parcial das raízes (Quadro 5).
Apenas 3 isolados promoveram o
crescimento e antagonizaram o fungo. Esse resultado sugere que o efeito dos outros
não seja por inibição a Fusarium.
Quadro 7. Presença (+) ou ausência (-) de antagonismo in vitro contra o fungo
Fusarium sp. em meio de cultura BDA e B. de King.
Isolados
Ps- 21A
Ps- 31B
Ps- 41A
Ps- 42B
Ps- 43B
Ps- 44B
Ps- 70
Ps- 80
Meio de cultura
BDA
B. de King
-
+
-
Isolados
Ps- 859
Ps- 860
Ps- 861A
Ps- 861B
Ps- 862A
Ps- 862B
Ps- 863
Ps- 864A
Meio de cultura
BDA
B. de King
+
-
42
Ps- 85
Ps- 91
Ps- 92
Ps- 221
Ps- 851A
Ps- 851B
Ps- 851C
Ps- 851D
Ps- 852A
Ps- 852B
Ps- 852C
Ps- 852D
Ps-853A
Ps-853B
Ps- 854A
Ps- 854B
Ps- 855B
Ps- 855C
Ps- 856A
Ps- 856B
Ps- 857A
Ps- 857B
Ps- 857C
Ps- 858
+
+
+
+
+
-
+
-
Ps- 864B
Ps- 864C
Ps- 865A
Ps- 865B
Ps- 865C
Ps- 865D
Ps- 866A
Ps- 866B
Ps- 867
Ps- 868
Ps- 869A
Ps- 869C
Ps- 869D
Ps- 870A
Ps- 870B
Ps- 870C
Ps- 871A
Ps- 871B
Ps- 871D
Ps- 872
Ps- 873A
Ps- 873C
Ps- 873D
Ps- 874
+
+
+
-
+
+
+
-
+ → fraco antagonismo, com o fungo evitando crescer sobre a colônia bacteriana
- → ausência de antagonismo, com crescimento fúngico sobre a colônia bacteriana
Já no experimento realizado por LUCON e MELO (1999), 94 isolados
apresentaram atividade antagônica contra a Erwinia carotovora, sendo que 41 (43,61
% total) foram capazes de reduzir a severidade da doença em tubérculos de batata
nos testes in vivo.
Quanto aos isolados obtidos por FREITAS (1994a), apenas dois apresentaram
antagonismo, sendo que o Ps-85 expressou antagonismo nos dois meios (Quadro 7).
Entretanto, esse isolado não foi eficiente como promotor de crescimento (Quadro 6),
reafirmando os dados da literatura nos quais um isolado pode apresentar
comportamentos diferenciados in vitro e in vivo (FREITAS e PIZZINATTO, 1991;
FREITAS, 1994 ab). Já o isolado Ps-44B colonizou parcialmente o sistema radicular e
a região do colo (Quadro 5), foi antagonista ao fungo no meio B de King e não
promoveu crescimento.
43
Já os isolados Ps-851D, Ps-852B, Ps-852C, Ps-857C, Ps-864A, Ps-865A e Ps871B, mesmo expressando antagonismo ao fungo e colonizando a região do colo,
não foram eficientes como promotores de crescimento (Quadros 5,6 e 7).
BAGNASCO et al. (1998) obtiveram resultados similares de antagonismo in vitro
contra Pythium ultimum e Rhizoctonia solani. De 541 isolados de Pseudomonas spp.
fluorecentes, apenas 20 apresentaram atividade antagônica, sendo que três
apresentaram os melhores resultados.
Num outro experimento, realizado por
FREITAS e PIZZINATTO (1997), 83% dos isolados de Pseudomonas sp. apresentaram
antagonismo ao Colletotrichum gossypii.
Os resultados aqui apresentados mostraram que não houve um paralelo entre a
atividade antagônica in vitro dos isolados com a promoção de crescimento nas
plantas de alface.
44
5. CONCLUSÕES
1. Ocorreram bactérias do grupo fluorescente de Pseudomonas sp. em todas
as propriedades amostradas mas seus números não foram influenciados pelas
condições de cultivo.
2. É possível utilizar o método de avaliação da colonização radicular por
meio da visualização de névoa na região do colo da planta como um
indicador da presença da bactéria.
3. A maioria dos isolados obtidos foi capaz de colonizar a região do colo,
porém nem todos promoveram o crescimento nas plantas de alface.
4. As bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas apresentaram
antagonismo in vitro contra Fusarium sp., de modo não determinado; não
houve paralelo entre a promoção do crescimento e o antagonismo in vitro.
45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRISTAR. Disponível em: <http://www.agristar.com.br/descrtp/alface-gizele.htm>
Acesso em: 08. abril. 2003
ANDRADE, D.S.; HAMAKAWA, P.J. Estimativa do número de células de rizóbio
no solo e inoculantes por infecção de plantas. In: Hungria, M.; Araújo, R.S.
(Eds). Manual de Métodos Empregados em Estudos de Microbiologia Agrícola.
1. ed. Brasília: Embrapa - SPI, 1994. cap. 3, p. 63-94.
ANTOUN, H.; BEAUCHAMP, C.J., GOUSSARD, N.; CHABOT, R.; LALANDE,
R. Potencial of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth
promoting rhizobacterian on non-legumes: effect on radishes (Raphanus sativus
L.). Plant and Soil, v. 204, p. 57-67, 1998.
ARAÚJO, W. L. Microrganismos endofíticos no controle biológico. In: REUNIÃO
DE CONTROLE BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS, 7., 2001. Bento
Gonçalves. Anais... Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2001. p. 1-7.
BAGNASCO, P.; DE LA FUENTE, L.; GUALTIERI, G.; NOYA, F.; ARIAS, A.
Fluorescent Pseudomonas spp. as biocontrol agents against forage legume root
pathogenic fungi. Soil Biology and Biochemistry, v. 30, n. 10/11, p.1317-1322,
1998.
BAKER, R.; DÉFAGO, G. Enviromental aspects of growth promotion resulting from
biological control. In: FIRST INTERNATIONAL WORKSHOP ON PLANT
GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA, 1., 1987, Orillia. Proceedings of
the First International Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria.
Orillia: Kloepper, J., 1987. p. 17-22.
46
BAKKER, P.A.H.M.; LAMERS, J.G.; BAKKER, A.W.; MARUGG, J.D.;
WEIBEEK, P.J.; SCHIPPERS, B. The role of siderophores in potato tuber yield
increase by Pseudomonas putida in a short rotation of potato. Journal of Plant
Pathology, v. 92, p. 249-256, 1986.
BENDING, G.D.; POOLE, E.J.; WHIPPS, J.M.; READ, D.J. Characterisation of
bacteria from Pinus sylvestris-Suillus luteus mycorrhizas and their effects on
root-fungus interactions and plant growth. FEMS Microbiology Ecology, v. 39, p.
219-277, 2002.
BENIZRI, E.; BAUDOIN, E.; GUKERT, A. Root colonization by inoculated plant
growth-promoting rhizobacteria. Biocontrol Science and Technology, v. 11, n. 5,
p. 557-574, 2001.
BEYELER, M.; KEEL, C.; MICHAUX, P.; HASS, D. Enhanced production of
indole-3-acetic acid by a genetically modified strain of Pseudomonas fluorescens
CHAO effects root growth of cucumber, but does not improve protection of plant
against Pythium root rot. FEMS Microbiology Ecology, v. 28, p. 225-233, 1999.
BRANDÃO, E.M. Isolamento e seleção de rizobactérias promotoras de crescimento
em milho, Piracicaba, 1989. 133p. Tese de Mestrado – Escola Superior de
Agricultura Luíz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba.
BURR, T.J.; CAESAR, A. Beneficial plant bacteria. CRC Critical Reviews in Plant
Sciences, Boca Raton, v. 2, n. 1, p. 1-20, 1985.
47
CEASA-CAMPINAS.
Cultura
da
Disponível:
alface.
<http://www.ceasacampinas.com.br/pd01b.htm>. Acesso em: 02 mar. 2002.
CHABOT, R.; ANTOUN, H.; CESCAS, M.P. Growth promotion of maize and
lettuce by phosphate-solubilizing Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli.
Plant and Soil, v. 184, n. 2, p. 311-321, 1996a.
CHABOT, R.; ANTOUN, H.; KLOEPPER, J.W.; BEAUCHAMP, C.J. Root
colonization of maize and lettuce by bioluminescent Rhizobium leguminosarum
biovar phaseoli. Applied and Environmental Microbiology, v. 62, n. 8, p. 27672772, 1996b.
CHANWAY, C.P.; SHISHIDO, M.; NAIRN, J.; JUNGWIRTH, S.; MARKHAM, J.;
XIAO, G.; HOLL, F.B. Endophytic colonization and field responses of hybrid
spruce seedlings after inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria.
Forest Ecology and Management, v. 133, p. 81-88, 2000.
CHIARINI, L; BEVIVINO, A; TABACCHIONI, S; DALMASTRI, C. Inoculation
of Burkholderia cepacia, Pseudomonas fluorencens and Enterobacter sp. on
Sorghum bicolor: root colonization and plant growth promotion of dual strain
inocula. Soil Biology and Biochemistry, v. 30, p. 81-87, 1997.
CHIN-A-WOENG,
T.F.C.;
DE
PRIESTER,
W.;
VAN
DER
BIJ,
A.J.;
LUGTENBERG, B.J.J. Description of the colonization of a gnotobiotic tomato
rizosphere by Pseudomonas fluorencens biocontrol strain WC365 using scanning
electron microscopy. Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 86, p. 10-79,
1997.
48
DELLA VECCHIA, P.T.; KOCH, P.S.; KIKUCHI, M. Vera: Nova cultivar de alface
crespa resistente ao florescimento prematuro. Horticultura Brasileira, Brasília, v.
17, n. 2, p. 171, 1999.
DE SILVA, A.; PATTERSON, K.; ROTHROCK, C.; MOORE, J. Growth promotion
of Highbush Blueberry by fungal and bacterial inoculants. Hortscience v. 35, p.
1228-1230, 2000.
DEKKERS, L.C.; MULDERS, I.H.M.; PHOELICH, C.C.; CHIN-A-WOENG,
T.F.C.; WIJFJES, A.H.M.; LUGTENBERG, B.J.J. The sss colonization gene of
the tomato-fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici biocontrol strains
Pseudomonas fluorencens WC365 can improve root colonization of other wild
type Pseudomonas bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.13, p.11771183, 2000.
DIGAT, B.; GAUDILLAT, M.; LABADIE, J.M. Susceptibility of various tomato
and lettuce genotypes of plat-growth-promoting Pseudomonas. Symbiosis, v. 9, p.
295-303, 1990.
EDWARDS, S.G., YOUNG, J.P.N.; FITTER, A.H. Interactions between
Pseudomonas fluorencens biocontrol agents and Glomus mosseae, an arbuscular
mycorrhizal fungus within the rhizosphere. FEMS Microbiology Letters, v. 166,
p. 297-303, 1998.
49
FREITAS, L.G. Rizobactérias versus nematóides. In: REUNIÃO DE CONTROLE
BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS, 7., 2001, Bento Gonçalves. Anais...
Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2001. p. 25-35.
FREITAS, S.S. Rizobactérias e suas interações com plantas e microrganismos.
Piracicaba, 1994a. 112p. Tese (Doutorado em Solos e Nutrição de plantas) –
Escola Superior de Agricultura Luíz de Queiroz, Universidade de São Paulo,
Piracicaba.
FREITAS, S.S. Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCPS). In:
Hungria, M.; Araújo, R.S. (Eds). Manual de Métodos Empregados em Estudos de
Microbiologia Agrícola. 1. ed. Brasília: Embrapa - SPI, 1994b. cap. 18, p. 369376.
FREITAS, S.S.; DE MELO, A.M.T.; DONZELI, V.P. Promoção de crescimento de
alface por rizobactérias. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 27, n.
1, p. 61-70, 2003.
FREITAS, S.S.; PIZZINATTO, M.A. Interações de Pseudomonas sp. e Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici na rizosfera de tomateiro (Lycopersicon esculentum).
Summa Phytopathologica, v. 17, n. 2, p. 105-112, 1991.
FREITAS, S.S.; PIZZINATTO, M.A. Ação de rizobactérias sobre a incidência de
Colletotrichum gossypii e promoção de crescimento em plântulas de algodoeiro
(Gossypium hirsutum). Summa Phytopathologica, v. 23, p. 36-41, 1997.
50
GASONI, L.; COZZI, J.; KOBAYASHI, K.; YOSSEN, V.; ZUMELZU, G.;
BABBITT, S.; KAHN, N. Yield response of lettuce and potato to bacterial fungal
inoculants under field conditions in Cordoba (Argentina). Journal of Plant
Diseases and Protection, v. 108, p. 530-535, 2001.
GRIMES, H.D.; MOUNT, M.S. Influence of Pseudomonas putida on nodulation of
Phaseolus vulgaris. Soil Biology and Biochesmistry, v. 6, p. 27-30, 1987.
GUPTA, S.; ARORA, D.K.; SRIVASTAVA, A.K. Growth promotion of tomato
plants by rhizobacteria and imposition of energy stress on Rhizoctonia solani.
Soil Biology and Biochemistry, v. 27, n. 8, p. 1051-1058, 1995.
HABE, M.H.; UESUGI, C.H. Método in vitro para avaliar a capacidade colonizadora
de bactérias em raízes de tomateiro. Fitopatologia Brasileira, v. 25, p. 657-660,
2000.
HALLMANN, J.; KLOPPER, J.; RODRÍGUEZ-KÁBANA, R.; SIKORA, R.A.
Endophytic rhizobacteria as antagonistics of Meloidogyne incognita on
cucumber. Phytopathology, v. 85, p. 1136, 1995.
HOFFMANN-HERGARTEN, S.; GULATI, M.K.; SIKORA, R.A. Yield response
and biological control of Meloidogyne incognita on lettuce and tomato with
rhizobacteria. Journal of Plant Diseases and Protection, v. 105, n. 4, p. 349-358,
1998.
HOWELL, C. R.; OKON, Y. Recent results of greenhouse and field trials on
bacterial-induced plant growth promotion with no obvious symptoms of plant
51
disease. In: FIRST INTERNATIONAL WORKSHOP ON PLANT GROWTHPROMOTING RHIZOBACTERIA, 1., 1987, Orillia. Proceedings of the First
International Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. Orillia:
Kloepper, J., 1987. p. 29-33.
HUNGRIA, M. Coleta de nódulos e Isolamento de Rizóbios. In: ______.; Araújo,
R.S. (Eds). Manual de Métodos Empregados em Estudos de Microbiologia
Agrícola. 1 .ed. Brasília: Embrapa - SPI, 1994. cap. 2, p. 45-62.
IBGE.
Censo
Agropecuário:
Brasil,
1996.
Disponível
em:
<http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp>. Acesso em: 10. nov. 2002.
JJEMBA, P.K., ALEXANDER, M. Possible determinants of rhizosphere competence
of bacteria. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 31, n. 4, p. 623-632, 1999.
KING, E.O.; WARD, M.K.; RANEY, D.E. Two simple media for the demonstration
of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 44,
p. 301-304, 1954.
KLOEPPER, J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents.
In: Soil Microbial Ecology, Applications in Agricultural and Environmental
Management. New York: Ed. FBJ meeting, 1993. p. 255-274.
KLOEPPER, J.W.; LEONG, J.; TIENTZE, M., SCHROTH, M.N. Enhanced plant
growth by siderophores produced by plant growth promoting rhizobacteria.
Nature, v. 286, p. 885-886, 1980.
52
KREMER, R.J.; SOUISSI, T. Cyanide production by rhizobacteria and potential for
suppression of weed seedling growth. Current Microbiology, v. 43, n. 3, p. 182186, 2001.
KUMAR, B.S.D. Disease suppression and crop improvement through fluorescens pseudomonads isolated from cultivated
soils. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 14, n. 5, p. 735-741, 1998.
KUREK, E.; JAROSZUK-´SCISEL, J. Rye (Secale cereale) growth promotion by
Pseudomonas fluorescens strains and their interactions with Fusarium culmorum
under various soil conditions. Biological Control, 2002.
LAVIE, S.; STOTZKY, G. Interactions between clay minerals and siderophores
affect the respiration of Histoplasma capsulatum. Applied and Environmental
Microbiology, v. 51, p. 74-79, 1986.
LEEMAN, S.; DEN OUDEN, F.M.; VAN PELT, J. A.; DIRKX, F.P.M.; STEIJL, H.
Iron availability affects induction of systemic resistence to Fusarium wilt of
radish by Pseudomonas fluorescens. Phytopathology, v. 86, p. 149-155, 1996.
LEEMAN, S.; VAN PELT, J. A.; DEN OUDEN, F.M.; HEINSBROEK, M.;
BAKKER, P.A.H.M.; SCHPPERS, B. Induction of systemic resistence against
Fusarium wilt of radish by lipopolysaccharides of Pseudomonas fluorescens.
Phytopathology, v. 85, p. 1021-1027, 1995.
LEONG, J. Siderophores: their biochemistry and possible role in biocontrol of plant
pathogens. Annual Review of Phythopathology, v. 24, p. 187-209, 1996.
53
LIFSHITZ, R.; RENNIE, R.J. Mechanisms of bacterial-induced plant growth
promotion in the absence of disease symptoms: physiology and molecular biology.
In:
FIRST
INTERNATIONAL
WORKSHOP
ON
PLANT
GROWTH-
PROMOTING RHIZOBACTERIA, 1., 1987, Orillia. Proceedings of the First
International Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. Orillia:
Kloepper, J., 1987. p.41-43.
LIU, L; KLOEPPER, J. W.; TUZUN, S. Induction of systemic resistence in
cucumber against Fusarium wilt by plant growth promoting rhizobacteria.
Phytopathology, v. 85, p. 695-698, 1995a.
LIU, L; KLOEPPER, J. W.; TUZUN, S. Induction of systemic resistence in
cucumber against angular leaf spot by plant growth promoting rhizobacteria.
Phytopathology, Sant Paul, v. 85, p. 843-847, 1995b.
LUCON, C.M.M.; MELO, I.S. Seleção de rizobactérias antagônicas a Erwinia
carotovora
subsp.
atroseptica,
em
tubérculos
de
batata.
Summa
Phytopathologica, v. 25, p. 132-136, 1999.
MARIANO, R.L.R. Potencial de bactérias endofíticas para utilização na agricultura.
In: REUNIÃO DE CONTROLE BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS, 7.,
2001. Bento Gonçalves. Anais... Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2001.
p. 7-24.
MAURFHOFER, M.; HASE, C.; MEUWLY, P.; MÉTRAUX, J.P.; DÉFAGO, G.
Induction of systemic resistance of tobacco to tobacco necrosis virus by root –
colonizing Pseudomonas fluorencens strain CHAO: Influence of the gac A gene
and pioverdine production. Phytopathology, Sant Paul, v. 84, p. 39-146, 1994.
54
MAURFHOFER, M.; REIMMANN, C.; SACHERER, S.P.; HEEB, S.; HAAS, D.;
DÉFAGO, G. Salicylic acid biosynthetic genes expressed in Pseudomonas
fluorescens strain P3 improve the induction of systemic resistance in tobacco
agains tobacco necrosis virus. Phytopathology, Sant Paul, v. 88, p. 678-684,
1998.
MEYER, J.M.; STINTZI, A.; DE VOS, D.; CORNELIS, P.; TAPPE, R.; TARAZ,
K.; BUDZIKIEWICZ, H. Use of siderophores to type pseudomonads: the three
Pseudomonas aeruginosa pyoverdine systems. Microbiology, v. 43, p. 35-43,
1997.
MISKO,
A.L.;
GERMIDA,
J.J.
Taxonomic
and
functional
diversity
of
pseudomonads isolated from the roots of field-grown canola. FEMS
Microbiology Ecology, Canadá, v. 42, p. 399-407, 2002.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays in
tobacco tissue cultures. Physiologie Plantarum, v. 15, p. 473-497, 1962.
NAGAI, H. Obtenção de novos cultivares de alface (Lactuca sativa) resistentes ao
mosaico e ao calor. Revista de Olericultura, Brasília, v. 17, p. 27-28, 1979.
NAGAI, H. Hortaliças. In: FurlanI, A.M.C.; Viégas, G.P. (Eds) Melhoramento de
Plantas no Instituto Agronômico. Campinas, 1993. p.195-203.
55
NANDAKAMUR, R.; BABU, S.; VISWANATHAN, R.; RAGUCHANDER, T.;
SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistence in rice against sheath blight
disease by Pseudomonas fluorencens. Soil Biology and Biochemistry, v. 33, p.
603-612, 2001.
NEHL, D.B.; BROWN, J.F. Deleterius rhizosphere bacteria: an integrating
perspective. Applied Soil Ecology, v. 5, p. 1-20, 1996.
NEILANDS, J.B. Metodology of siderophores. Structure and Bonding, v. 58, p. 124, 1984.
NEILANDS, J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport
compounds. The Journal of Biological Chemistry, v. 270, p. 26 723-26 726,
1995.
OLSEN, N.W.; MISAGHI, I.J. Plant growth promoting activity of heat-killed cells of
Pseudomonas fluorescens. Phytopatholoby, Sant. Paul, v. 71, p. 1006, 1981.
OOSTENDORP, M.; SIKORA, R.A. In vitro interrelationship between rhizosphere
bacteria and Heterodera schachtii. Review of Nematology, v. 13, n. 3, p. 269-274,
1990.
O’SULLIVAN, D.B.; O’GARA, F. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved
in suppression of plant root pathogens. Microbiological Reviews, v. 56, p. 662676, 1992.
56
POLONENKO, D.R.; SCHER, F.M.; KLOEPPER, J.W.; SINGLETON, C.A.,
LALIBERTE, M.; ZALESKA, I. Effects of root colonization bacteria on
nodulation of soybean roots by Bradyrhizobium japonicum. Canadian Journal of
Microbiology, v. 33, p. 498-503, 1987.
RAMAMOORTHY, V; RAGUCHANDER, T.; SAMIYAPPAN, R. Enhancing
resistence of tomato and hot pepper to Pythium diseases by seed treatment with
fluorescent pseudomonads. European Journal of Plant Pathology, v. 108, n. 5, p.
429-441, 2002.
RAMAMOORTHY,
V;
VISWANATHAN,
R.;
RAGUCHANDER,
T.;
PRACKASAM, V.; SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistence by plant
growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases. Crop
Protection, v. 20, n. 1, p. 1-20, 2001.
RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bactéria and their role in plant
growth promotion. Biotechnology Advances, v. 17, p. 319-339, 1999.
ROMEIRO, R.S.; TAKATSU, A.; UESUGI, G.H.; MOURA, A. G.; SILVA, H.S.A.
Um método simples para seleção de rizobactérias com capacidade de promover
colonização de raízes e suas implicações na indução de resistência a
enfermidades e na promoção de crescimento de plantas. In: CONGRESSO
ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE FITOPATOLOGIA 32., 1999,
Curitiba. Resumos... Curitiba: [s.n.], 1999.
57
SANTIAGO, M.F. Estudo de substâncias de baixa massa molar que mimetizam as
fenoloxidases com aplicações em tratamentos de efluentes industriais. Campinas,
1999. 122p. Tese (Doutorado em Ciências) – UNICAMP
SARATHCHANDRA, U.; DUGANZICH, D.; BURCH, G. Occurrence of antifungal
fluorescent Pseudomonas spp on some horticultural and pastoral plants. New
Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, v. 21, n. 3, p. 267-272,
1993.
SCHER, F.M.; BAKER, R. Effect of Pseudomonas putida and a synthetic iron
chelator on induction of soil suppressiveness to Fusarium wilt pathogens.
Phythopathology, v. 72, p. 1567-1573, 1982.
SCHROTH, M.N.; HANCOCK, J.G. Disease supressive soil and root colonizing
bacteria. Science, v. 216, p. 1376-1381, 1982.
SHISHIDO, M.; BREUIL, C.; CHANWAY, C.P. Endophytic colonization of spruce
by plant growth-promoting rhizobacteria. FEMS Microbiology Ecology, v. 29, p.
191-196, 1999.
SILVEIRA, A.P.D.; FREITAS, S.S.; SILVA, L.R.C.; LOBARDI, M.L.C.O.;
CARDOSO, E.J.B.N. Interações de micorrízas arbusculares e rizobactérias
promotoras do crescimento em plantas de feijão. Revista Brasileira de Ciência do
Solo, Campinas, v. 19, p. 205-211, 1995.
SIMONS,
M.;
VANDERBIJ,
A.J.;
BRAND,
I.;
DE
WEGWER,
L.A.;
WIJFFELMAN, C.A.; LUGTENBERG, B.J.J. Gnobiotic system for studying
58
rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria.
Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 9, n. 7, p. 600-607, 1996.
STAINER,
R.Y.;
PALLERONI,
N.J.;
DOUDOROFF,
M.
The
aerobic
Pseudomonads: a taxonomic study. Journal of General Microbiology, v. 43, p.
159-271, 1966.
STURZ, A.V.; NOWAK; J. Endophytic communities of rhizobacteria and the
strategies required to create yield enhancing associations with crops. Applied Soil
Ecology, v. 15, p. 183-190, 2000.
SUSLOW, T.V. Role of root colonizing bacteria in plant growth. In: MOUNT, M.S.;
LARY, G.H. (Eds.). Phytopathogenic Prokaryotes. London: Academic Press, v.2,
1982. p.187-223
THRANE, C.; NIELSEN, T.H.; NIELSEN, M.N.; SORENSEN, J.; OLSSON, S.
Viscosinamide-producing Pseudomonas fluorescens DR54 exerts a biocontrol
effect on Pythium ultimum in sugar beet rhizosphere. FEMS Microbiology
Ecology, v. 33, p. 139-146, 2000.
TIENTZE, M., et al. Structure of ferric Pseudobactin a siderophore from a plant
growth promoting Pseudomonas. Biochemistry, v. 20, p. 6446-6457, 1981.
TOMASHOW, L.S.; WELLER, D.M. Current concepts in use of introduced bacteria
for biological disease control: mechanisms and antifungal metabolites. In:
STACEY, G.; KEEN, N. Plant Microbe Interactions, New York, v. 1, 1995. p.
187-235.
59
TUITE, J. Plant Pathological Methods. Minneapolis: Burgues Plublishing Company,
[s.d.], 239 p.
UESUGI, C.H. Informação sobre colonização radicular [mensagem pessoal].
Mensagem recebida por [email protected]> em 31 mar. 2003.
VAN PEER, R.; NIEMANN, G.J.; SCHIPPERS, B. Induced resistance and
phytoalexin accumulation in biological control of Fusarium wilt of carnation by
Pseudomonas sp strain WCS 417r. Phytopathology, v. 81, p. 728-733, 1991.
VISWANATHAN, R.; SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistance by plant
growth
promoting
rhizobacteria
against
red
rot
disease
caused
by
Collectotrichum falcatum went in sugarcane. Proceedings of Sugar Technology
Association of India, v. 61, p. 24-39, 2002a.
VISWANATHAN, R.; SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistence by
fluorescent pseudomonads against red rot disease of sugarcane caused by
Colletotrichum falcatum. Crop Protection, v. 21, p. 1-10, 2002b.
VOSÁTKA, M.; GRYNDLER, M. Treatment with culture fraction from
Pseudomonas putida modifies the development of Glomus fistulosum mycorrhiza
and the response of potato and maize plants to inoculation. Applied Soil Ecology,
v. 11, p. 245-251, 1999.
WEI, G.; KLOEPPER, J.W.; TUZUN, S. Induction of systemic resistance of
cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth
promoting rhizobacteria. Phytopathology, v. 81, p. 1508-1512, 1991.
60
WEI, G.; KLOEPPER, J.W.; TUZUN, S. Induction of systemic resistence to
cucumber diseases and increased plant growth by plant growth promoting
rhizobacteria under fields conditions. Phytopathology, v. 86, p. 221-224, 1996.
WELLER, D.M.; ZABLOTOWICZ, R. Recent results from field and greenhouse
trials on biological control pf diseases with obvious, visual and typical
symptoms.
In:
FIRST
INTERNATIONAL
WORKSHOP
ON
PLANT
GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA, 1., 1987, Orillia. Proceedings of
the First International Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria.
Orillia: Kloepper, J., 1987. p. 10-16.
WHIPPS, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. Journal of
Experimental Botany, v. 52, p. 487-511, 2001.
YEE, D.C.; MAYNARD, J.A.; WOOD, T.K. Rhizoremediation of trichloroethylene
by a recombinant, root-colonizing Pseudomonas fluorescens strain expressing
toluene ortho-monooxygenase constitutively. Applied and Environmental
Microbiology, v. 64, n. 1, p. 112-118, 1999.
YUEN, G.Y.; SCHROTH, M.N. Interactions of Pseudomonas fluorescens strain E6
with ornamental plants and its effect on the compositon of root-colonizing
microflora. Phytopathology, Saint Paul, v. 76, p. 176-180, 1986.
ZAADY, E.; PEREVOLOTSKY, A.; OKON, Y. Promotion of plant
growth by inoculum with aggregated and single cell suspensions of
61
Azospirillum brasilense Cd. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 25, p. 819-823, 1993.