Transleitura do códon de parada prematura do alelo CYP2C19*3
Propaganda
56º Congresso Brasileiro de Genética Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010 Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2 273 Transleitura do códon de parada prematura do alelo CYP2C19*3: um modelo farmacogenético Fuchshuber-Moraes, M1; Carvalho, MA1,2; Carvalho, RS1,2 3; Rimmbach, C4; Rosskopf, D4 Suarez-Kurtz, G1 Laboratório de Farmacologia - Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Biotecnologia - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro 3 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – Universidade Federal do Rio de Janeiro 4 Institut für Pharmakologie – Universität Greifswald [email protected] 1 2 Palavras-chave: Mutação nonsense, transleitura, aminoglicosídeos, parada prematura, farmacogenética Introdução: Mutações nonsense são responsáveis por diversos casos de doenças genéticas, tais como a fibrose cística e a distrofia muscular de Duchenne. Estudos demonstram que os aminoglicosídeos são capazes de induzir os ribossomos a transleitura de códons de parada prematura (transleitura), permitindo assim a elongação da cadeia completa da proteína e parcial recuperação da atividade biológica da proteína. O alelo farmacogenético CYP2C19*3 é caracterizado por um códon de parada prematura, originado a partir do polimorfismo G6363A, que dá origem a uma proteína inativa. Objetivo: Investigar o efeito de aminoglicosídeos como indutores de transleitura do códon de parada prematura do alelo farmacogenético CYP2C19*3. Metodologia: O alelo CYP2C19*3 foi gerado por mutagênese sítio-dirigida a partir do alelo selvagem. Estes foram clonados no vetor de expressão pQCXIH fusionados a egfp na porção C-terminal e as construções transfectadas em linhagem celular HeLa. Os clones celulares de expressão estável foram obtidos por pressão seletiva. A expressão gênica foi medida por Real Time RTPCR e Western blotting. A indução de transleitura foi realizada por tratamento das células com G418 e gentamicina em concentrações variadas por 48 horas e as análises realizadas por técnicas de citometria de fluxo, imunoblotting e microscopia de epifluorescencia. Resultados: As análises de expressão gênica mostram que as células transfectadas com as construções CYP2C19/egfp apresentam expressão dos alelos investigados quanto ao mRNA. Em relação à expressão de proteínas, células transfectadas com a construção pQCXIH-CYP2C19*WT/egfp apresentaram expressão detectável, o que não ocorreu com o alelo variante, uma vez que a mutação introduz um códon de parada prematura, produzindo uma proteína truncada. Os ensaios de transleitura demonstram que após os tratamentos, as células portadoras do alelo variante apresentaram expressão detectável da proteína de cadeia completa por todas as técnicas aplicadas, sendo este efeito de dose-resposta. Conclusões: O modelo gerado para o estudo é aplicável aos ensaios de transleitura e, de acordo com os resultados obtidos, os aminoglicosídeos são agentes indutores de transleitura do códon de parada prematura do alelo CYP2C19*3. A próxima etapa será a validação do modelo para estudos de farmacologia clínica, avaliando a atividade enzimática da proteína obtida após o processo de transleitura. Apoio financeiro: INCA/FAF/CNPq/CAPES
