DENV-2

Virologia, Epidemiologia e
Diagnóstico Laboratorial
UFF
28 de Abril de 2011
Flávia Barreto dos Santos, PhD
Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
[email protected]
Família Flaviviridae
Gênero Flavivirus




Causa DC e FHD
É um arbovirus
Transmitidos por mosquitos
Possui 4 sorotipos distintos (DENV-1, 2, 3, 4)
Organização da Partícula e Genoma Virais
Nucleocapsídeo
M
Bicamada
Lipídica
E
prM
30-50nm
RNA fita simples (+)
3 ptns estruturais
7 ptns não- estruturais
Vírus Dengue
Alguns fatos...

Cada sorotipo confere imunidade sorotipo específica
permanente e contra outros sorotipos por curto período

Todos os sorotipos podem causar doença grave e fatal

Variação genética dentro dos sorotipos (Genótipos)

Algumas variantes genéticas (Genótipos) parecem ser
mais virulentas e possuir maior potencial epidêmico
Vetores Hospedeiros
 Mosquitos do gênero Aedes.
 Nas Américas, a espécie Aedes aegypti é a responsável
pela transmissão do dengue.
 Aedes albopictus, um importante vetor na Ásia.
Aedes aegypti
Aedes albopictus
Aedes aegypti

O vírus Dengue é transmitido por fêmeas do
mosquito infectado

Principalmente se alimenta durante o dia

Possui hábitos domésticos

Coloca
os
ovos
e
gera
larvas
preferencialmente em recipientes artificiais.
Replicação dos Vírus Dengue
(monócitos, macrófagos, linfócitos B, células endoteliais e dendríticas
ssRNA(+)
genômico
ENDOCITOSE
Nucleocapsídeo é
liberado no
citoplasma
Síntese de molde
de ssRNA (-)
Progênies de
ssRNA (+)
Helicase + RNA
polimerase RNAdependente &
Cofatores
ADSORÇÃO
Vírus – Célula
hospedeira
via
receptor
celular
DESNUDAMENTO
Proteínas
Não-estruturais
Diminuição do pH
ssRNA(+)
poliproteína
Fusão da membrana
do vírus
Ptn E sofre mudança
conformacional
Proteases virais
e celulares
Proteínas
Estruturais
TRADUÇÃO
Mediada pelo CAP
MONTAGEM
MORFOGÊNESE
VIRAL
CITOPLASMA
Ocorre no
RER
do
nucleocapsídeo
LIBERAÇÃO
Via secretora
do Complexo
de Golgi
CITOPLASMA
Replicação dos
Vírus Dengue
ADSORÇÃO
Vírus – Célula
hospedeira
via
receptor
celular
Monócitos,
Macrófagos
Linfócitos B
Células Endoteliais
Células Dendríticas
Citoplasma
Barth OM, 2000
Replicação dos
Vírus Dengue
ENDOCITOSE
pH ÁCIDO
Rearranjo de dímeros
trímeros
LIBERAÇÃO DO
NUCLEOCAPSÍDEO
63.000X
Barth OM, 2000
Replicação dos
Vírus Dengue
ÚCLEO
ETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
RUGOSO
MORFOGÊNESE VIRAL
Montagem da particula
viral associada ao
retículo endoplasmático
rugoso
ITOCÔNDRIA
40.000X
Barth OM, 2000
Replicação dos
Vírus Dengue
LIBERAÇÃO
Via secretora do
Complexo de Golgi
48000X
Barth OM, 2000
Rico-Hesse (1990) definiu esses “genótipos” como grupos de vírus que apresentam
uma divergência em sua sequência nucleotídica menor que 6% dentro de uma
determinada região do genoma viral (junção E/NS1).
Weaver & Vasilakis (2009)
V
Filipinas (1956), Japão (1973), China (1980) América do Sul (2002-2004)
Infecção por
Dengue
Grau
Assintomática
Sintomática
I
Grau II
Febre
indiferenciada
Dengue
Clássico
Com
manifestações
hemorrágicas
Sem
manifestações
hemorrágicas
Febre do
Dengue
Hemorrágico
Sem choque
Grau III
Grau IV
Com Choque
(SCD)
• Febre acompanhada de
sintomas inespecíficos. A única
manifestação hemorrágica é o
teste de torniquete positivo.
• Sangramento espontâneo, além das
manifestações apresentadas no Grau
I. Geralmente sangramentos na pele
e outras formas de sangramento.
• Insuficiência circulatória manifestada
por pulso rápido e fraco, redução da
pressão do pulso ( 20mmHg) ou
hipotensão, com a pele pegajosa e
fria, inquietação
• Choque profundo com pressão
arterial e pulso não detectáveis.
Necessidade de Revisão da
Classificação da OMS
 Foi em grande parte baseada em estudos em crianças na Tailândia na
década de 60
 Insatisfação devido a dificuldade de uso em diversas situações
 Ex.:casos de choque sem plaquetopenia
 Pacientes que evoluem a óbito sem apresentarem os critérios
estabelecidos
 É insuficiente para contemplar os casos graves
 Ex.:
casos
que
apresentam
manifestações neurológicas.
comprometimento
hepático
e
Classificação dos casos de dengue de acordo com observações do DENCO (OMS, 2009)
RESPOSTA IMUNE NAS INFECÇÕES POR
DENGUE
Infecção Secundária
(início dos sintomas)
(início dos sintomas)
Níveis de anticorpos e antígeno
Infecção Primária
IgG
Vírus
Vírus
IgM
NS1
NS1
Tempo
IgM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
>10
Diagnóstico Laboratorial do Dengue
Isolamento Viral
• Cultura de células de mosquito A. albopictus clone
C6/36
Detecção de ácido nucléico viral
• RT-PCR, PCR em tempo real
Sorologia
• Mac-ELISA,IgG-ELISA,Captura de antígeno NS1,
Kits comerciais, PRNT
Histopatologia e Imunohistoquímica
Kits comerciais para o diagnóstico do dengue
Coleta e Processamento de Amostras para
o Diagnóstico Laboratorial do Dengue
Tipo de
Espécime
Soro de fase
aguda
Soro de fase
convalescente
Momento da
Coleta
De 0-5 dias após o
início dos sintomas
Entre os dias 6-21 após o
início dos sintomas
Tipo de
Análise
Isolamento viral,
métodos sorológicos,
moleculares e captura
de NS1
Métodos
sorológicos
Isolamento Viral
(Igarashi, 1978)
Cultura de células de mosquito A.
albopictus clone C6/36
Imunofluorescência Indireta
Anticorpos Monoclonais tipoespecíficos (Gubler et al., 1984)
MAC-ELISA (PanBio)
Captura de anticorpos IgM
Substrato
Placa
IgG-ELISA
Detecção de anticorpos IgG
Dias após o início dos sintomas Resposta
< 5 dias 6 – 9 dias > 10 dias Imune
Substrato
Título
IgG
Anticorpo
Secundário
Anti-IgG
Soro paciente
IgG
Antígeno Dengue
Fluido
hiperimune
Placa
Primária
< 160
< 10,240
< 40,960
> 160
> 10,240
> 40,960 Secundária
RT- PCR para a Tipagem dos vírus Dengue
(Lanciotti et al, 1992)
Segunda etapa de amplificação – Nested PCR
Transcrição reversa e primeira etapa de
amplificação
D1
CAPSIDEO
DENV
RNA
5’
cDNA
D2
1 hora/ 42ºC
TS2
3’
5’
3’
511 pb
produto
3’
5’
3’
D1
5’
prM
3’
5’
Amplicon DENV-1 (482 bp)
Amplicon DENV-4 (392 bp)
30sec/ 94ºC
1 min / 55ºC
2 min / 72ºC
5’
3’
produto
511 pb
Amplicon DENV-3 (290 bp)
35 ciclos
Amplicon DENV-2 (119 bp)
3’
5’
TS3
TS4
TS1
DETECÇÃO DE DENV-3 POR RT-PCR E/OU ISOLAMENTO VIRAL
INVESTIGAÇÃO DE ÓBITOS, RIO DE JANEIRO, 2002
18
16
14
12
17
10
8
6
7
4
4
2
3
1
2
1
0
Fígado
Pulmão Cérebro
Rim
Baço
Líquor
Soro
PCR em Tempo Real (real time PCR)
Detecta sequências específicas de produto de PCR conforme estas se
acumulam em tempo real durante o processo de amplificação por PCR.
RNA
Investigação de Casos Fatais por Dengue
Rio de Janeiro, 2002
PCR em Tempo Real em 11 espécimes de cérebros de casos fatais
6/11
3/11
2/11
0/11
Isolamento Viral Imunohistoquímica
RT-PCR PCR em Tempo Real
Platelia NS1
(Biorad Laboratories)
Solução de
Parada
Substrato (TMB)
Unidade
BioRad
RESULTADO
Anti-NS1 mAb
HRP
Soro Paciente
(Ag NS1)
Anti-NS1 mAb
< 0,5
negativo
INTERPRETAÇÃO
Não há evidencia do
antígeno NS1 do
dengue.
0,5 ≤ a <1,0
inconclusivo
Amostra considerada
dúbia quanto a
presença do antígeno
NS1 dengue.
≥ 1.0
positivo
Presença do antígeno
NS1 do dengue.
NS1 Ag STRIP
(Biorad Laboratories)
Resultado Positivo
Resultado Negativo
Prova Inválida
Sensibilidade dos testes de captura de NS1 de acordo com
o número de dias de sintomas (n=220)
Sensibilidade total dos testes de captura de NS1 em
relação ao diagnóstico por MAC-ELISA, isolamento viral e
RT-PCR, de acordo com o número de dias de sintomas
SD BIOLINE DENGUE DUO TEST
Teste de uma etapa para detecção de NS1 e IgG/IgM em soro ou
plasma
2cassetes: Dengue NS1 Ag test e Dengue IgG/IgM test
RR
AP
 Novembro de 2008 :pactuadas 68
Unidades Sentinela para
CE
PB
PE
AC
monitoramento viral, utilizando o
RO
teste NS1 como triagem
GO
MG
ES
MS
SP
PR
 Total: 25 municípios em16 Estados
SE
BA
RJ
Epidemiologia do
Dengue

Novas estimativas:

~70-500 milhões de pessoas contraem a doença

Cerca de 3,6 bilhões de pessoas (55% da população mundial)
vivem em risco de contrair a doença

124 países endêmicos
Mudança na distribuição dos sorotipos
de dengue nos últimos 30 anos
Distribuição global dos
sorotipos de vírus dengue,
1970
Mackenzie et al., 2004
Distribuição global dos sorotipos de
vírus dengue, 2004
Casos de Dengue Clássico nas Américas,
1980–2009*
http://www.paho.org/English/AD/DPC/CD/dengue.htm
1998
741,865
BRASIL
(535,388)
~73%
2002
1.015.420
BRASIL
(780,644)
~80%
2008
865.697
BRASIL
(734.384)
~85%
2007
630,000
BRASIL
(560,000)
~90%
2009*
480.909
BRASIL
(332.083)
~69%
Belém
1989- DENV-2
Caso Importado
Roraima
1982 - DENV-1
DENV-4
2010-DENV-4
Rio de Janeiro
São Paulo
1998- DENV-3
Caso Importado
1986 - DENV-1
1990 - DENV-2
2000 - DENV-3
Casos notificados e Hospitalizações*
por Dengue no Brasil, 1986-2007
900000
Casos notificados
Hospitalizações
50000
700000
600000
40000
500000
DENV3
400000
300000
200000
30000
20000
DENV1
DENV2
100000
0
10000
0
86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07
Hospitalizações
Casos notificados
800000
60000
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2009
Casos de DC: 529.237
FHD: 2.271 e 154 óbitos
DCC: 5.952 e 144 óbitos
Nordeste: 170.674
DEN 1
DEN 2
DEN 3
Sudeste: 152.119
Centro-Oeste: 125.722
DEN 1, DEN 2
DEN 2, DEN 3
DEN 1, DEN 2, DEN 3
Without positive
Without virus circulation
Source: CGLAB/SVS/MS
Norte: 70.399
Sul: 10.323
Fonte: SVS-MS
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2010*
Isolamento
DENV-4
Casos NOTIFICADOS de DC:
942.153
Casos CONFIRMADOS:
482.284
FHD: 2.271
Óbitos : 367
Predomínio DENV-1
Isolamento DENV-4
Até a 26º SE (03/07/2010)
Fonte: SVS-MS
ISOLAMENTO DO DENGUE TIPO 4 NO BRASIL
2010
três casos confirmados de DENV 4 no
município de Boa Vista, classificados
clinicamente como dengue clássica. Houve
evolução para cura sem necessidade de
internação de nenhum dos casos.
data de inicio dos sintomas do primeiro
caso:26.06.2010
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2011*
Casos NOTIFICADOS de DC: 254.734
Casos graves:2.208 confirmados
Óbitos : 95 confirmados
Predomínio DENV-1
Dispersão DENV-4
(RR,AM,PA,PI,BA,RJ,SP,PE)
Região Sudeste - 81.179; 32%
Região Norte – 76.671; 30%,
Região Nordeste - 47.404; 19%
Região Sul - 28.445; 11%
Região Centro-Oeste 21.035; 8%
Até março de 2011
Fonte: SVS-MS
Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2011
Introdução do DENV-4
1800
DENV-1
1627
DENV-2
DENV-3
DENV-4
1600
1400
1188
1200
957
1000
800
615
600
532
200
448
378
400
77
2007
446
363
0
0
580
63
32
2008
2009
2010
12
79
9
2011
76
Incidência de dengue no Brasil, 2010-2011
Dengue no Brasil por Regiões, 1982–2011*
450000
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul
Centro-Oeste
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
•Até março 2011
•Fonte:SVS/MS
Vigilância Epidemiológica
do Dengue
no Rio de Janeiro
Introdução do Vírus Dengue no Estado
do Rio de Janeiro
Região
Metropolitana
1986
DENV-1
1990
DENV-2
2000
DENV-3
Fatores responsáveis pela
ocorrência de epidemias de
dengue no Rio?
Crescimento sem precedentes
da população
Urbanização não planejada e
não controlada
Abastecimento de água e
tratamento de resíduos
inadequados
Ausência no controle efetivo do
mosquito
Aumento na disseminação do
vírus
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2008
Re-emergência do DENV-2
Sorotipos de Dengue circulantes no Rio de Janeiro,
2001-2009
Re-emergência do Dengue tipo 2
160
DENV-1
DENV-2
DENV-3
8
140
7
120
6
100
5
80
4
60
3
40
2
20
1
0
J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D
2001
2002
0
J
F
M
A
J
J
A
S
O
N
D
J
F
M
A
2004
2003
70
M
DENV-2
50
40
30
20
10
0
M
M
J
2006
S
N
J
M
M
J
2007
S
N
J
M
M
J
2008
J
J
A
2005
60
J
M
S
N
J
M
M
J
2009
S
N
S
O
N
D
Impacto da re-emergência do DENV-2
Casos Notificados de Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2007-2008*
2007
SES/SVS
2008
Impacto da re-emergência do DENV-2
Internações por Dengue por mês no Estado do Rio de
Janeiro, 2007-2008*
2007
2008
Percentual de Internações (%)
Percentual de Internações por Dengue de
acordo com faixa etária, 2001-2008
< 15 ANOS
100
>=15 ANOS
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2001
2002
2003
2004
Ano
2005
2006
2007
2008
Dengue no Rio de Janeiro:2002-2008
Casos notificados, FHD, Internações e óbitos,
Ano
2002
2003
2004
2005
2006
2007
Notificados
285702
9460
2936
3140
30567
67275
FHD
1689
48
5
17
77
21
2008
250026
1632
Fonte: SESDEC-RJ/SAS/SVS/CVE/DDT/GDTVZ * Dados sujeitos à revisão
Internações Óbitos
2397
91
540
3
533
0
326
5
1431
17
452
46
13808
181
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2007-2008
Experiência do Laboratório de
Flavivirus, IOC - FIOCRUZ
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2008
Laboratório de Flavivírus IOC/FIOCRUZ

Casos confirmados/ estudados: 310 / 754

Sorotipos identificados:
(41 %)
DENV-2: 138
DENV-3: 68
ÓBITOS
Óbitos confirmados / estudados: 73/146
Virus identificados:
DENV-2 : 46
DENV-3: 4
(50%)
(92 %)
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
DENV-2
DENV-3
Primária
Secundária
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2009-2011
Re-emergência do DENV-1
Introdução do DENV-4
Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2010
Emergência do DENV-1
1800
DENV-1
DENV-2
DENV-3
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
2007
2008
2009
2010
Vigilância Epidemiológica de Dengue,2011
Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
RT- PCR (Tipagem de DENV)
DENV-1
482pb
DENV-4 ?
DENV-1
DENV-3
DENV-2
Repetição
da extração do RNA do material original
Amplificação
com primers tipo-específicos separados
Sequenciamento
Isolamento
do genoma
viral em cultura de células
DENV-4
392pb
DENV-3
290pb
DENV-2
119pb
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Até a 16ª semana epidemiológica de 2011 (23 de abril): 63.996 casos notificados
+500% em relação 2010
41 municípios (44,6%) : alta incidência
25 municípios (33,5%) : média incidência
28312
30000
25000
17312
20000
12719
15000
10000
5654
5000
0
Jan
Fev
Mar
Abr
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Sorotipos circulantes
Fonte: Lacen-RJ e FIOCRUZ/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 20 ABR 2011 e sujeitos à revisão.
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Distribuição dos Óbitos e Casos Graves Confirmados
Casos Notificados no Estado do Rio de Janeiro,
2009-2011*
2009
30000
2010
201128312
25000
20000
17312
15000
12719
10000
5654
5000
3330
1445
5348
25062052
3312
2142
1247
0
Jan
Fev
Mar
Fonte: SINANNET/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 27 ABR 2011 e sujeitos à revisão.
Abr
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
Total
confirmados/ Total recebidos: 207/677 (30.6%)
Isolamento viral e/ou PCR: 80 DENV-1
20 DENV-2
6 DENV-4*
*2 casos (+) de Niterói em 27/04/2011 por PCR
Óbitos:
20/41 (48.8%) – 10 DENV-1 e 2 DENV-2

Não há uma tratamento específico

Indica-se repouso e hidratação
Vacina contra a dengue?

Não há uma vacina licenciada no momento.

Maior Desafio:
Necessidade do desenvolvimento de 4 vacinas que sejam
combinadas em uma única (tetravalente)
Induza um nível de proteção permanente e contra infecção
por qualquer um dos 4 sorotipos.
Vacinas candidatas para dengue em desenvolvimento
Tipo de Vacina
Fabricantes
Viva atenuada
Viva atenuada
WRAIR/GSK Biologicals*
Viva atenuada,quimérica
NIAID, NIH
Viva atenuada,quimérica
Acambis/Sanofi Pasteur*
Viva atenuada,quimérica
CDC/ InViragen*
Vírus Inativado
Subunidade
WRAIR
DNA
Navy Medical Research Center
Mahidol Universidade/Sanofi Pasteur
Hawaii Biotech
Revisado em Whitehead et al., 2007
Vacina contra a dengue?
+ adiantada: Sanofi Pasteur
envolve o Núcleo de Doenças Infectocontagiosas da Universidade
Federal do Espírito Santo e 11 países tropicais.
Administração de 3 doses, com intervalo de 6 meses.
Meta: ter produto no mercado em 2015
Bio-Manguinhos (Fiocruz), RJ-em parceria com a GlaxoSmithKline
Instituto Butantan (SP) -com os Institutos Nacionais de Saúde dos
EUA (NIH)
Obrigada !