Texto Completo

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado em Nanociências
JERUSA GOI BARRIOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SUSPENSÕES CONTENDO
NANOCÁPSULAS DE ADAPALENO COM DIFERENTES NÚCLEOS OLEOSOS
Santa Maria, RS
2010
JERUSA GOI BARRIOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SUSPENSÕES CONTENDO
NANOCÁPSULAS DE ADAPALENO COM DIFERENTES NÚCLEOS OLEOSOS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Nanociências do Centro Universitário
Franciscano de Santa Maria como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Nanociências.
Orientadora: Profa Dra MARTA PALMA ALVES
Santa Maria, RS
2010
Ficha Catalográfica
B163d
Barrios, Jerusa Goi
Desenvolvimento e caracterização de suspensões
contendo nanocápsulas de adapaleno com diferentes
núcleos oleosos / Jerusa Goi Barrios; orientação Marta
Palma Alves. – Santa Maria, 2010.
103f.: il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro
Universitário Franciscano.
1.Acne 2.Adapaleno 3.Nanocápsulas
4. Caracterização 5. Liberação in vitro 6. Modelagem
cinética 7. Óleo de melaleuca I. Alves, Marta Palma.
II. Título.
CDU 616.53-002:62-181.4
Elaborada pela Bibliotecária Zeneida Mello Britto CRB10/1374
Dedico este trabalho para as pessoas
que sempre estiveram ao meu lado.
“O segredo é não correr atrás das borboletas...
É cuidar do jardim para que elas venham até você”
(Mário Quintana)
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais... Pelo exemplo de ser quem são. Que souberam calar nos momentos em que
eu queria ficar só, que souberam respeitar o meu silêncio, as minhas dúvidas e angústias. O
meu muito obrigada por apenas saber que estariam ao meu lado dizendo sempre que posso
tudo que realmente quero e que sou capaz de fazer tudo aquilo que desejo, pois acreditam na
minha capacidade.
A minha irmã, Sabrina... Por acreditar que a Nanotecnologia é o caminho do futuro, até
mesmo quando nem eu mais acreditava. Apesar da distância que nos separa, obrigada por
estar sempre perto, ainda que em pensamento. Contigo aprendi que trabalho duro,
perseverança e honestidade são as ferramentas ideais para atingir as nossas metas.
Ao Jonas... Pelas viagens que me ausentei, pelas festas que não fui, pelas noites que eu virava
na frente do computador. Obrigada por entender que tudo isso é uma fase que faz parte do
meu, do nosso, crescimento. Obrigada por estar ao meu lado diariamente e por ser o
companheiro que eu escolhi para a vida inteira.
A Marta... Pela orientação durante os 2 anos de mestrado, pela paciência, pelas brigas (que
não foram poucas) e pelos incansáveis conselhos para seguir em frente.
A incansável Isabel... Que permito chamá-la de minha “co-orientadora”. Foi ela que me
orientou quando estava totalmente perdida, que me ensinou cálculos e fórmulas, que me
acalmou nas horas de descontrole, que simplesmente se calava para me ouvir chorar. Ouso
dizer, querida Isabel, que sem a tua presença diária ao meu lado, este trabalho não seria
possível. O meu eterno agradecimento pelos 6 anos de dedicação e amizade.
A Maura... Por estar ao meu lado em todos os momentos durante esses intermináveis dois
anos de mestrado. Sempre com uma palavra consoladora, um sorriso ainda que desesperador
ou apenas um silêncio que me dava forças para seguir em frente. O meu muito obrigada pelas
divertidas conversas no balcão do setor de certificados e por dividir comigo as dúvidas,
angústias e alegrias da vida de mestranda. Obrigada por apenas saber que poderia contar
contigo até mesmo nos momentos em que tu não estava presente.
A Gabi Barbosa... Pelas conversas e apoio nos momentos de alegria, tristeza e indecisões
nessa longa caminhada. Por dividir comigo as horas desesperadoras onde pensamos em
desistir, pelas sábias palavras de incentivo, pelo sorriso sincero e principalmente pela amizade
de longa data.
A Danizinha... Pelas conversas, dúvidas, questionamentos, solidariedade, troca de
experiências e pelo crescimento pessoal que tivemos com tudo que passamos juntas.
As fiéis seguidoras do adapaleno, Marcinha e Gabriela Farias... Agradeço pela ajuda,
disponibilidade e boa vontade nos testes diários e principalmente por dividirem comigo as
dúvidas, incertezas e angústias com os nossos projetos.
A professora Sandra Cadore... Que foi a minha luz no fim do túnel. Com seus vastos
conhecimentos em química e CLAE me deu a dica certa no momento em que nem eu mais
acreditava que conseguiria.
A professora Renata Raffin... Que chegou para finalizar este trabalho com inteligência,
sabedoria e paciência. De forma brilhante, me auxiliou na modelagem matemática dos
resultados, dando o toque que faltava para essa dissertação ter um diferencial. Obrigada por
sempre ter uma explicação para as minhas inúmeras dúvidas e questionamentos.
A professora Solange Fagan... Por entender a dor e a delícia de ser um mestrando.
A professora Luciane e ao Marcos... Por sempre me receber com um sorriso no rosto, ainda
que eu fosse pedir alguma coisa impossível. Muito obrigada pelos cálculos, pelas dicas de
CLAE, pelo empréstimo do laboratório, por simplesmente me tratarem bem e fazer com que
eu me sentisse a vontade toda vez que entrava no laboratório.
Ao Júnior... Principalmente pela paciência. Foram centenas de vials, milhares de leituras e
uma identificação única das minhas amostras que só ele entendia. Obrigada pela
disponibilidade de tempo, paciência e boa vontade.
As professoras Silvia Guterres e Adriana Pohlmann da Rede de
Nanotecnologia/Nanocosméticos (CNPq/MCT-UFRGS)... Pelo apoio, ajuda e incentivo.
A Luana Fiel da UFRGS... Pela disponibilidade de tempo e por toda a ajuda no então
desconhecido Turbiscan.
A professora Solange Hoelzel, Daniele Ferrari e ao pessoal do laboratório de
Nanotecnologia... Existem pessoas em nossas vidas que nos deixam felizes pelo simples fato
de terem cruzado o nosso caminhado. Algumas percorrem ao nosso lado, outras apenas vemos
entre um passo e outro. A todas elas agradeço pelos dois anos de convivência diária.
Aos amigos que a vida me presenteou e que torceram pela minha sobrevivência. A todos resta
dizer... Muito Obrigada!
RESUMO
A acne é uma das condições inflamatórias mais comuns que afetam a pele. Existem diversos
fármacos para o tratamento da acne, porém apesar dos benefícios desses tratamentos na sua
forma livre, existem efeitos adversos comuns a eles, principalmente quando aplicados
topicamente. Dentre estes fármacos, destaca-se o adapaleno com ação comedolítica e efeitos
sobre o processo anormal de queratinização e diferenciação epidérmica, fenômenos presentes
na acne vulgar. O presente trabalho teve como objetivo, preparar nanocápsulas poliméricas
(NC) de adapaleno através do método de deposição interfacial do polímero pré-formado
utilizando diferentes núcleos oleosos (Miglyol® e óleo de melaleuca). As suspensões foram
caracterizadas através da determinação do pH, diâmetro de partícula, índice de polidispersão,
potencial zeta, taxa de associação e doseamento do fármaco. A estabilidade foi determinada
em diferentes temperaturas e frente à luz UVA; estudos de liberação in vitro e análises de
modelagem matemática dos perfis cinéticos de liberação foram realizados comparando-se
suspensões contendo NC de adapaleno e nanodispersões, sem a presença do polímero. As
formulações foram armazenadas em temperatura ambiente (25 °C), geladeira (-4 °C) e estufa
(40 °C) durante 3 meses e analisadas nos tempos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias após preparação.
Tanto as suspensões contendo NC com Miglyol® (NC-AD-Miglyol®) como as NC com óleo
de melaleuca (NC-AD-Melaleuca) apresentaram pH ácido, diâmetro de partícula inferior a
300 nm e potencial zeta negativo. A taxa de associação do adapaleno na NC-AD-Melaleuca
foi de 95,4% enquanto na NC-AD-Miglyol® foi 84,1%. Através do doseamento do ativo,
concluiu-se que as NC-AD-Melaleuca exercem efeito estabilizante maior que as demais
formulações. O prazo de validade estimado para a NC-AD-Melaleuca foi superior quando
comparado à nanodispersão (ND) e a NC-AD-Miglyol®. A modelagem matemática
demonstrou que a ND e a NC-AD-Miglyol® seguiram um perfil cinético segundo o modelo
monoexponencial com tempo de meia-vida de 3,53 e 8,43 horas, respectivamente. Já a
suspensão NC-AD-Melaleuca seguiu modelo biexponencial com tempo de meia-vida para a
fase rápida de 4,07 horas e 230,6 horas para a fase sustentada. Pode-se concluir que o
adapaleno na formulação NC-AD-Miglyol® encontra-se em grande parte mais externamente
nas NC enquanto na NC-AD-Melaleuca, o fármaco encontra-se dissolvido no núcleo oleoso
das NC, sugerindo dessa forma, uma liberação sustentada. Avaliou-se a fotoestabilidade do
adapaleno nanoencapsulado com Miglyol® e óleo de melaleuca frente à irradiação por UVA e
concluiu-se que a nanoencapsulação com óleo de melaleuca aumenta a estabilidade do ativo,
protegendo-o da degradação. Em análises por espalhamento múltiplo de luz, as suspensões
apresentaram tendência à sedimentação, porém a NC-AD-Miglyol® demonstrou mais
probabilidade à desestabilização. A validação da metodologia apresentou resultados
satisfatórios para todos os parâmetros analisados. Através dos resultados obtidos, pode-se
concluir que a suspensão contendo NC-AD-Melaleuca apresentou melhores características
físico-químicas e de estabilidade, representando melhor viabilidade tecnológica para a área
farmacêutica.
Palavras-chave: Acne, adapaleno, nanocápsulas, caracterização, liberação in vitro,
modelagem cinética, óleo de melaleuca.
ABSTRACT
Acne is one of the most common inflammatory conditions affecting the skin. There are
several drugs to treat it, but despite the benefits of these treatments in their free form, there are
common side effects to them, especially when applied topically. Among these drugs is the
adapalene with comedolitic action and effects on the abnormal process of keratinization and
epidermal differentiation, phenomena present in acne vulgaris. This study aimed to prepare
polymer nanocapsules of adapalene through the method of interfacial deposition of preformed
polymer using different oil cores (tea tree oil and Miglyol®). The suspensions were
characterized by determining the pH, particle diameter, polidispersion rate, zeta potential,
association rate and dosage of the drug. The stability was determined at different temperatures
and under light UVA. In vitro release studies and analysis of mathematical modeling of
kinetic release profiles were carried out by comparing suspensions containing adapalene
polymer nanocapsules and nanodispersions and without the presence of the polymer. The
formulations were stored at room temperature (25 ° C), refrigerator (-4 ° C) and oven (40 ° C)
for 3 months and analyzed at 0, 7, 15, 30, 60 and 90 days after preparation. Both suspensions
containing Miglyol® polymer nanocapsules (NC-AD-Miglyol®) as the tea tree oil polymer
nanocapsules (NC-AD-tea tree oil) showed acidic pH, particle diameter below 300 nm and
zeta potential negative. The rate of association of adapalene in the NC-AD-tea tree oil was
95.4% while the NC-AD-Miglyol® was 84.1%. The dosage of the drug showed that the NCAD-tea tree oil exerts a greater stabilizing effect than the other formulations. The shelf life
estimated for the NC-AD-tea tree oil was higher when compared to nanodispersion (ND) and
NC-AD-Miglyol®. Mathematical modeling showed that the ND and NC-AD-Miglyol®
followed a kinetic profile, according to the mono-exponential model with half-lives of 3.53
and 8.43 hours. On the other hand, NC-AD-tea tree oil suspension followed a bi-exponential,
model with half-lives of 4.07 hours for the fast phase and 230.6 hours for the sustained phase.
Therefore, we can say that the adapalene formulation NC-AD-Miglyol® locates largely more
externally in the polymer nanocapsule, while in the NC-AD-tea tree oil, it is dissolved in the
oil core of the polymer nanocapsule, suggesting a sustained release. We evaluated the
photostability of adapalene nanocoated with Miglyol® oil and tea tree oil under UVA
irradiation, and concluded that the nanoencapsulation with tea tree oil increases the stability
of the active, offering increased protection it from degradation. In analysis by multiple
scattering of light, the suspensions showed a tendency of sedimentation, but the NC-ADMiglyol® proved to be more likely to destabilization. The validation of the method was
satisfactory for all parameters analyzed. Though the results obtained, it can be concluded that
the suspension containing NC-AD-tea tree oil showed better physical and chemical
characteristics and stability, representing best technological feasibility fot the pharmaceutical
area.
Keywords: Acne, adapalene, nanocapsules, characterization, in vitro release, kinetics
modeling, tea tree oil.
LISTA DE SIGLAS
AHA – Alfa-Hidroxiácido;
ACN – Acetonitrila;
ANOVA – Análise de Variância;
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária;
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
DP – Desvio Padrão;
DPR – Desvio Padrão Relativo;
ES – Estufa;
FDA – Food and Drug Administration;
GE – Geladeira;
ICH – International Conference on Harmonization;
Kp – Coeficiente de permeabilidade;
MSC – Critério de Seleção de Modelo;
NC – Nanocápsulas;
NC-BR-Miglyol® – Nanocápsulas brancas com Miglyol®;
NC-AD-Miglyol® – Nanocápsulas contendo adapaleno e Miglyol® como núcleo oleoso;
NC-BR-Melaleuca – Nanocápsulas brancas com óleo de melaleuca;
NC-AD-Melaleuca – Nanocápsulas contendo adapaleno e óleo de melaleuca como núcleo
oleoso;
ND – Nanodispersão;
nm – Nanômetros;
P. acnes – Propionibacterium acnes;
PB – Peróxido de Benzoíla;
PCL – Poli (ε-caprolactona);
r2 – Coeficiente de correlação;
TA – Temperatura ambiente;
THF – Tetrahidrofurano;
UV – Radiação Ultravioleta;
UV/Vis – Radiação Ultravioleta na região do visível;
UVA – Radiação na Região do Ultravioleta A.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Componentes utilizados na preparação das suspensões contendo NC de
adapaleno ................................................................................................................................ 43
Tabela 2 - Valores referentes ao pH das suspensões contendo NC-AD-Miglyol® durante 90
dias .......................................................................................................................................... 53
Tabela 3 - Valores referentes ao pH das suspensões contendo NC-AD-Melaleuca durante 90
dias .......................................................................................................................................... 54
Tabela 4 - Valores referentes ao diâmetro médio e índice de polidispersão das partículas
contendo NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca durante 90 dias ........................................ 58
Tabela 5 - Valores referentes ao potencial zeta inicial e final das suspensões contendo
NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca ................................................................................. 60
Tabela 6 - Teor de adapaleno na nanodispersão e nas suspensões contendo NC-AD-Miglyol®
e NC-AD-Melaleuca no período de 90 dias ............................................................................ 65
Tabela 7 - Valores referentes ao fluxo e à concentração total liberada de adapaleno para a
forma nanoencapsulada e forma nanodispersa (n = 5) ............................................................ 71
Tabela 8 - Modelagem cinética dos perfis de liberação da nanodispersão e da suspensão
contendo NC-AD-Miglyol® assumindo cinética monoexponencial ....................................... 74
Tabela 9 - Modelagem cinética monoexponencial e biexponencial do perfil de liberação da
suspensão contendo NC-AD-Melaleuca ................................................................................. 75
Tabela 10 - Percentuais equivalentes às concentrações de adapaleno em UV em função do
tempo após irradiação UVA .................................................................................................... 78
Tabela 11 - Condições cromatográficas usadas na quantificação do adapaleno em suspensões
contendo NC ........................................................................................................................... 82
Tabela 12 - Média das áreas referentes às diferentes concentrações de adapaleno para
elaboração da curva de calibração por CLAE ......................................................................... 84
Tabela 13 - Valores experimentais obtidos para o ensaio de repetibilidade para a quantificação
do adapaleno em CLAE (n = 6) .............................................................................................. 85
Tabela 14 - Valores experimentais para o ensaio de precisão intermediária obtidos por
analistas diferentes para a quantificação do adapaleno em CLAE (n = 3) ............................. 86
Tabela 15 - Valores experimentais obtidos para o teste de exatidão do adapaleno ................ 87
Tabela 16 - Análise de variância (ANOVA) correspondente as áreas obtidas na determinação
da curva analítica do adapaleno para validação ...................................................................... 88
Tabela 17 - Análise de variância (ANOVA) correspondente as áreas obtidas na determinação
da curva analítica do adapaleno para estudos de liberação ..................................................... 88
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ilustração da interdisciplinaridade entre as áreas de conhecimento utilizadas para a
realização deste trabalho ......................................................................................................... 20
Figura 2 - Camadas da pele humana ....................................................................................... 21
Figura 3 - Estrutura química do adapaleno ............................................................................. 33
Figura 4 - Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas .................................. 36
Figura 5 - Metolodologia ........................................................................................................ 42
Figura 6 - Representação esquemática do princípio de funcionamento do Turbiscan® ......... 45
Figura 7 - Massa de PCL após imersão na mistura de adapaleno e óleo de melaleuca por
42 dias ..................................................................................................................................... 51
Figura 8 - Suspensão A (nanodispersão), suspensão B (NC-AD-Miglyol®) e suspensão C
(NC-AD-Melaleuca) ............................................................................................................... 52
Figura 9 - Estabilidade das NC-AD-Miglyol® em relação ao pH .......................................... 54
Figura 10 - Estabilidade das NC-AD-Melaleuca em relação ao pH ....................................... 55
Figura 11 - Comparação do tamanho de partícula no final do experimento (90 dias) das
suspensões NC-AD-Miglyol® NC-AD-Melaleuca ................................................................. 56
Figura 12 - Variação do backscattering das suspensões NC-AD-Miglyol® e NC-ADMelaleuca ................................................................................................................................ 62
Figura 13 - Concentração de adapaleno em TA durante 90 dias de experimento .................. 66
Figura 14 - Concentração de adapaleno em GE durante 90 dias de experimento .................. 66
Figura 15 - Concentração de adapaleno em ES durante 90 dias de experimento ................... 67
Figura 16 - Curva de calibração do adapaleno obtida por CLAE .......................................... 69
Figura 17 - Perfil de liberação da ND, NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca até atingirem o
platô (46 horas) ....................................................................................................................... 72
Figura 18 - Modelagem monoexponencial da nanodispersão e da NC-AD-Miglyol® ........... 74
Figura 19 - Modelagem monoexponencial e biexponencial da NC-AD-Melaleuca .............. 76
Figura 20 - Teor de adapaleno em NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca em função do
tempo sob exposição à luz UVA ............................................................................................ 77
Figura 21 - Cromatograma da suspensão branca (a) e da suspensão contendo NC de
adapaleno (b) .......................................................................................................................... 83
Figura 22 - Curva de calibração do adapaleno obtido por CLAE .......................................... 84
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 18
2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................ 21
2.1 PELE ................................................................................................................................. 21
2.2 ACNE ............................................................................................................................... 22
2.3 ATIVOS UTILIZADOS PARA O TRATAMENTO DA ACNE .................................... 26
2.3.1 Antibióticos Sistêmicos ................................................................................................. 27
2.3.2 Antibióticos Tópicos ..................................................................................................... 28
2.3.3 Peróxido de Benzoíla ..................................................................................................... 28
2.3.4 Tretinoína ...................................................................................................................... 29
2.3.5 Isotretinoína ................................................................................................................... 29
2.3.6 Ácido Azelaico .............................................................................................................. 31
2.3.7 Alfa-Hidroxiácido (AHA) ............................................................................................. 31
2.3.8 Tazaroteno ..................................................................................................................... 32
2.3.9 Óleo de Melaleuca ......................................................................................................... 32
2.3.10 Adapaleno .................................................................................................................... 34
2.4 NANOTECNOLOGIA ..................................................................................................... 35
2.5 ESTABILIDADE ............................................................................................................. 37
2.6 LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS ...................................................................................... 38
3 METODOLOGIA .............................................................................................................. 41
3.1 MATÉRIAS-PRIMAS, SOLVENTES E OUTROS MATERIAIS ................................. 41
3.2 APARELHOS, EQUIPAMENTOS E OUTROS MATERIAIS ...................................... 41
3.3 MÉTODOS........................................................................................................................ 42
3.3.1 Teste de inchamento do polímero .................................................................................. 43
3.3.2 Preparação das suspensões ............................................................................................ 43
3.3.3 Caracterização físico-química das suspensões de NC contendo adapaleno .................. 44
3.3.3.1 Determinação do pH ................................................................................................... 44
3.3.3.2 Distribuição do tamanho médio das partículas e índice de polidispersão .................. 44
3.3.3.3 Potencial Zeta ............................................................................................................. 45
3.3.3.4 Avaliação de espalhamento múltiplo de luz ............................................................... 45
3.3.3.5 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais ................................................. 46
3.3.3.6 Construção da curva analítica ..................................................................................... 46
3.3.3.7 Determinação da taxa de associação .......................................................................... 47
3.3.4 Determinação do perfil de degradação das suspensões contendo adapaleno nanodisperso
e nanoencapsulado .................................................................................................................. 47
3.3.5 Estudos de liberação in vitro ......................................................................................... 47
3.3.5.1 Análise dos resultados da liberação............................................................................. 48
3.3.6 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos.............................................................................. 48
3.3.7 Avaliação da estabilidade das suspensões frente à exposição à radiação UVA ............ 49
3.3.8 Análise estatística dos resultados .................................................................................. 50
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 51
4.1 TESTE DE INCHAMENTO DO POLÍMERO ................................................................ 51
4.2 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES .............................................................................. 52
4.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES DE NC CONTENDO
ADAPALENO ........................................................................................................................ 52
4.3.1 Determinação do pH ...................................................................................................... 53
4.3.2 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão ................... 56
4.3.3 Determinação do potencial zeta ..................................................................................... 59
4.3.4 Análises de espalhamento múltiplo de luz .................................................................... 61
4.4 DOSEAMENTO DO ADAPALENO .............................................................................. 63
4.4.1 Construção da curva analítica para doseamento ............................................................ 63
4.4.2 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais .................................................... 64
4.4.3 Taxa de associação ........................................................................................................ 67
4.5 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE DEGRADAÇÃO .................................................. 68
4.6 ESTUDOS DE LIBERAÇÃO IN VITRO ......................................................................... 69
4.6.1 Construção da curva analítica para realização dos estudos de liberação ....................... 69
4.6.2 Análises dos resultados de liberação ............................................................................. 70
4.7 AJUSTE DE CURVAS DOS PERFIS CINÉTICOS ....................................................... 73
4.8 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES FRENTE À EXPOSIÇÃO À
RADIAÇÃO UVA ................................................................................................................. 77
5 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 81
ANEXOS ................................................................................................................................ 96
ANEXO 1 - Validação da metodologia analítica para doseamento do adapaleno em
suspensões de NC ................................................................................................................... 97
ANEXO 2 - Análise de variância dos valores obtidos da curva analítica do adapaleno ...... 103
1 INTRODUÇÃO
A pele humana é composta por três camadas: epiderme (camada superficial), derme e
hipoderme (gordura subcutânea) (HERNANDEZ e MERCIER-FRESNEL, 1999). Uma das
condições inflamatórias mais comuns que afetam a pele a nível de epiderme e derme é a acne
(VLACHOU e LICHYSHYN, 2006).
Predominantemente observada em adolescentes, pode afetar homens e mulheres em
idade entre 25-40 anos (VLACHOU e LICHYSHYN, 2006). É uma doença da unidade
pilossebácea e ocorre com o aumento da secreção de sebo pelas glândulas sebáceas,
provocando o aparecimento de pontos negros denominados comedões, principalmente no
rosto, costas, peito e ombros (HABIF et al., 2002; HABIF, 2005).
Existem diversos fármacos eficazes para o tratamento tópico e sistêmico da acne que
atuam nos diferentes estados de evolução das lesões e que podem ser usados isoladamente ou
em associações (em função das características individuais do paciente) (VAZ, 2003). Porém,
apesar dos benefícios terapêuticos desses tratamentos na sua forma livre, existem efeitos
adversos comuns a eles, principalmente quando aplicados topicamente (LEYDEN, 1998).
Além disso, alguns fármacos são altamente instáveis frente a oxigênio, luz e temperatura
(TASHTOUSH et al., 2007).
Dentre os fármacos empregados para o tratamento da acne, o adapaleno é uma
alternativa tópica bastante utilizada nesse tipo de lesão, podendo resolver muitos problemas
que limitam o tratamento com retinóides tópicos por um período prolongado. Esse fármaco
reduz a irritação da pele e tem uma atividade comedolítica e anti-inflamatória apropriada,
além de apresentar menos efeitos colaterais que os retinóides (HEMIELEWSKI, 2008).
Acredita-se que o adapaleno incorporado em sistemas nanoestruturados tenha seu
índice terapêutico aumentado, seus efeitos adversos ainda mais reduzidos por propiciar um
tratamento diretamente no local da afecção, além de ter uma proteção das nanoestruturas
frente a possíveis degradações (BARRAT, 2000).
O desenvolvimento tecnológico de novas formas farmacêuticas, como as suspensões
coloidais poliméricas, tem sido a estratégia mais promissora para aumentar a penetração de
fármacos através da pele (ALVAREZ-ROMÁN et al., 2004).
19
A nanotecnologia compreende um novo paradigma na ciência, em que as dimensões e
propriedades dos materiais são tratadas em escala nanométrica. Tais materiais passam a
apresentar novos comportamentos ou propriedades diferentes daquelas observadas em escala
macroscópica (BONACIN, 2009).
No âmbito farmacêutico, está envolvida no desenvolvimento e otimização de sistemas
carreadores de fármacos através do estudo de estruturas denominadas nanopartículas
(YOKOYAMA e OKANO, 1996). As nanopartículas poliméricas (nanocápsulas e
nanoesferas) são sistemas carreadores de fármacos que apresentam diâmetros em nanoescala
(inferiores a 1 µm), diferindo-se entre si segundo a composição e a organização estrutural
(SCHAFFAZICK et al., 2003).
Nesse contexto, conhecendo-se as potencialidades das nanopartículas em direcionar o
fármaco para o local de ação, reduzir seus efeitos adversos e proteger o fármaco frente a
diferentes processos de degradação, este trabalho está focado no desenvolvimento,
caracterização e avaliação da estabilidade de suspensões contendo nanocápsulas poliméricas
de adapaleno utilizando diferentes núcleos oleosos (Miglyol® e óleo de melaleuca).
Quando se trata de nanociências, não existem fronteiras entre a física, química,
matemática, biologia ou farmácia. Trata-se de uma área da ciência altamente interdisciplinar,
conforme pode ser observado na figura 1. Portanto, este trabalho, abrange diferentes áreas do
conhecimento, refletindo muito bem o caráter interdisciplinar do curso de Mestrado em
Nanociências.
20
Figura 1: Ilustração da interdisciplinaridade entre as áreas de
conhecimento utilizadas para a realização deste trabalho.
O presente experimento teve como objetivo, preparar nanocápsulas poliméricas
contendo adapaleno através do método de deposição interfacial do polímero pré-formado
utilizando diferentes núcleos oleosos. As suspensões poliméricas contendo adapaleno foram
caracterizadas através da determinação do pH, diâmetro de partícula, índice de polidispersão,
potencial zeta, taxa de associação e doseamento do fármaco. A estabilidade das suspensões de
nanocápsulas contendo adapaleno foi determinada em diferentes temperaturas e frente à luz
UVA; estudos de liberação in vitro e análises de modelagem matemática dos perfis cinéticos
de liberação foram realizados comparando-se as suspensões contendo nanocápsulas de
adapaleno e as nanodispersões do mesmo, sem a presença do polímero.
21
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 PELE
A pele representa uma via atrativa e acessível para administração de substâncias,
principalmente em função dos problemas associados com outras rotas como a via oral e
parenteral. Apresenta vantagens como o mínimo efeito sistêmico e a possibilidade de
vetorização somente para a área afetada, quando o efeito tópico é desejado (ASBILL e
MICHNIAK, 2000; FOLDVARI, 2000; GUTERRES et al., 2007).
É o órgão mais extenso do corpo humano e corresponde a cerca de 5% do peso total,
apresentando variações de espessura e valores de pH de acordo com cada região
(VIGLIOGLIA, 1989; PEYREFITTE et al., 1998). Considerada
como
órgão,
possui
arquitetura complexa, apresentando múltiplas e precisas funções. Constitui, antes de tudo, a
primeira linha de defesa contra agressões do meio ambiente, não sendo de maneira nenhuma
uma barreira instransponível (PEYREFITTE et al., 1998; RANGEL, 1998).
A pele humana compõe-se de três camadas (figura 2), sendo estas, a epiderme celular,
estratificada e avascular na superfície; a derme subjacente formada por tecido conjuntivo na
camada média e a hipoderme, tecido conjuntivo adiposo na camada profunda (HERNANDEZ
e MERCIER-FRESNEL, 1999).
Figura 2: Camadas da pele humana (PEYREFITTE et al., 1998)
A epiderme é constituída por um epitélio de revestimento estratificado pavimentoso,
sendo a camada mais externa do tecido cutâneo (AZZINI, 1999). Possui uma espessura que
22
varia de 0,8 mm na palma das mãos até 0,006 mm nas pálpebras (ANSEL et al., 2000). É um
epitélio versátil, cujas células se multiplicam, diferenciam e renovam-se periodicamente
(VIGLIOGLIA, 1989).
O estrato córneo é a camada mais externa da epiderme, sendo formado por 10 a 15
camadas de corneócitos envolvidos por lipídios extracelulares, apresentando uma espessura
que varia entre 10 e 20 µm. Devido a sua elevada organização estrutural e hidrofobicidade, o
estrato córneo atua como a principal barreira para a penetração de substâncias aplicadas
topicamente, assim como um reservatório para formulações aplicadas por esta via
(FERNANDEZ et al., 2000; FOLDVARI, 2000).
A derme é definida como um tecido resistente e elástico que proporciona resistência
física ao corpo frente à agressões e fornece nutrientes à epiderme (RIBEIRO, 2006). Possui
cerca de 3 a 5 mm de espessura, sendo composta por uma densa matriz de tecido conectivo no
qual predominam feixes de fibras de colágenos, elastinas e reticulares. Além disso,
encontram-se, também, os apêndices cutâneos, glândulas sebáceas, sudoríparas, folículos
pilosos e nervos (WILLIAMS e DARRY, 1992; BENY, 2000).
A hipoderme, segundo Peyrefitte e colaboradores (1998), é a camada mais profunda da
pele, formada por uma variedade de tecido conjuntivo denominado de tecido adiposo, que
entre outras funções, é responsável pelo armazenamento de nutrientes e energia para o
organismo.
Nesse contexto, conclui-se que a eficácia terapêutica de um fármaco aplicado na pele
depende, principalmente, de sua habilidade de penetração, podendo assim exercer a atividade
farmacológica desejada (BONINA et al., 2001). Segundo Vlachou e Lichyshyn (2006), uma
das condições inflamatórias crônicas mais comuns que afetam a pele relaciona-se com a acne.
2.2 ACNE
A acne é uma das doenças de pele mais comuns em todo o mundo. Trata-se de uma
doença frequente, autolimitada, multifatorial que acomete os folículos sebáceos (SETTE et
al., 2009), ou seja, as unidades compostas pela glândula sebácea e pelo (HASSUN, 2000).
De fácil diagnóstico, não compromete gravemente a saúde do indivíduo, mas pode
prejudicar o bem-estar e o desenvolvimento emocional, levando à diminuição da auto-estima
23
e a modificações comportamentais (TEIXEIRA e FRANÇA, 2007). Isto pode ser observado
em estudos realizados por Sá (2000), que investigou através de um questionário padrão e
relatos espontâneos, atitudes comportamentais relacionadas à acne. Foram registrados
episódios de ansiedade, manipulação frequente das lesões, desgosto por ter acne, medo das
lesões nunca cessarem, insatisfação e constrangimento. Sá (2000) concluiu que o temor pelo
não desaparecimento da acne leva ao manuseio das lesões com frequência, além da busca de
tratamentos inadequados, o que pode perpetuar a doença.
Segundo Cordain e colaboradores (2002), não existe perfil epidemiológico universal
da acne. Embora seja menos frequente em orientais e negros, ela atinge todas as raças
(WINSTON e SHALITA, 1991; STEINER et al., 2003). Sua importância deve-se a alta
prevalência, variando entre 35% e 90% nos adolescentes, com incidência de 79% a 95% entre
os adolescentes do Ocidente (CORDAIN et al., 2002).
A elevada frequência da acne na prática clínica diária torna essa dermatose uma das
mais estudadas no âmbito médico-científico internacional, com mais de 1.500 artigos
científicos específicos indexados já publicados (COSTA et al., 2008).
Acomete ambos os sexos, embora mais precoce na adolescência feminina, é o sexo
masculino que apresenta as formas mais intensas e mais graves da acne (RAMOS E SILVA et
al., 2003). Nas mulheres, a presença de acne pode estar diretamente relacionada ao ciclo
menstrual e, muitas vezes, associada a disfunções hormonais (TEIXEIRA e FRANÇA, 2007;
SETTE et al., 2009). Habitualmente aparece na puberdade quando a estimulação androgênica
promove a hiperprodução de sebo, com hiperqueratinização folicular, colonização por
bactérias (Propionibacterium acnes) e inflamação local (ZOUBOLIS et al., 2005).
O conhecimento dos mecanismos implicados na etiopatogenia da acne visa à melhor
compreensão da dermatose e, consequentemente, abordagem terapêutica, racional e adequada
(HASSUN, 2000). Segundo Walton e colaboradores (1998), são quatro os principais fatores
implicados na patogênese da acne, profundamente inter-relacionados:
- Produção de sebo pelas glândulas sebáceas: para que as glândulas sebáceas se tornem ativas
é preciso que sejam estimuladas pelos hormônios sexuais andrógenos produzidos pelas
gônadas e adrenais (CUNLIFFE e SIMPSON, 1998). O aumento da produção de sebo
provoca aumento de secreção sebácea pela glândula. Sabe-se, atualmente, que essas taxas se
24
correlacionam com níveis elevados de severidade da acne (HASSUN, 2000). O sebo é o fator
patogênico na acne, sendo irritante e comedogênico, principalmente quando o P. acnes
prolifera e modifica seus componentes (HABIF, 2005). É uma mistura de lipídios,
principalmente, colesterol, esqualeno, cera, ésteres esteróides, triglicérides e ácidos graxos
livres (DOWNING et al., 1969). Conforme Horrobin (1989), o papel de cada um desses
lipídios na patogênese da acne não é totalmente elucidado, mas acredita-se que os ácidos
graxos livres, acumulando-se no infundíbulo glandular por longo período teriam a capacidade
de irritar o epitélio desse, acarretando, assim, hiperqueratinização, e por fim, inflamação.
- Hiperqueratinização folicular: Dos fatores etiopatogênicos da acne, a comedogênese,
resultado da hiperqueratinização folicular, é um dos mais importantes (HONEYMAN, 2001).
Essa alteração no processo de descamação que ocorre nos queratinócitos do ducto folicular,
conhecida como comedogênese, é o fator central no desenvolvimento da acne e tem esse
nome por determinar a formação de microcomedões (HASSUN, 2000). Quando o
microcomedão se forma, observa-se uma redução da concentração de ácido linoléico, cuja
deficiência em animais acarreta descamação. Quanto maior a gravidade da acne, menor é a
concentração de ácido linoléico no sebo e a taxa de ácido linoléico, no período da puberdade,
diminui na proporção inversa do número de lesões acneicas. Portanto, segundo Costa e
colaboradores (2008), a redução dos níveis de ácido linoléico parece ser o elemento
primordial na comedogênese.
- Colonização bacteriana do folículo: P. acnes é uma bactéria gram-positiva, anaeróbia, do
gênero Corynebacterium, que faz parte da biota normal residente da pele, sendo o principal
microorganismo envolvido na etiopatogenia da acne vulgar (COSTA et al., 2008). A bactéria
se prolifera quando ocorre hiperprodução sebácea pela glândula e quando há influência de
fatores como tensão de oxigênio, pH e aporte nutricional. Dessa forma, algumas substâncias
são produzidas, como lípases e fosfatases. As lipases são capazes de hidrolisar os triglicérides
do sebo, originando ácidos graxos livres que, por sua vez, são comedogênicos, irritam o
revestimento folicular e podem levar à ruptura do folículo com liberação de seu conteúdo na
derme adjacente. A partir daí, neutrófilos atraídos pela presença de material intrafolicular
ingerem o P. acnes sem o destruir. Ocorre produção e liberação de hidrolases, pelo P. acnes,
que leva à destruição tecidual (HASSUN, 2000).
- Liberação de mediadores da inflamação: Quando o folículo piloso se obstrui, ocorre a
proliferação de várias bactérias, principalmente a do P. acnes. O aumento deste
25
microorganismo induz à quimiotaxia de neutrófilos, liberação de enzimas hidrolíticas, dano ao
epitélio folicular e extravasamento do material da glândula sebácea para a derme. Assim, o
processo inflamatório se estabelece com a formação de pápulas, pústulas e nódulos presentes
na acne (GONTIJO et al., 2003).
Embora não seja elemento etiopatogênico fundamental no surgimento da acne, os
hormônios exercem papel que pode ser vital para o surgimento e/ou manutenção do quadro
dessa dermatose em alguns de seus portadores (COSTA et al., 2008). A associação entre
hormônios e acne é estudada há vários anos. Strauss e Pocchi correlacionaram em 1969 os
níveis aumentados de testosterona com a acne. Lawrence e colaboradores (1981) observaram
relação entre aumento de androgênios e acne, hirsutismo e distúrbios menstruais. Em 1987,
Reingold e Rosenfield avaliaram os níveis séricos de testosterona livre em mulheres entre 18
e 21 anos e observaram aumento dos androgênios em 1/3 das pacientes (TEIXEIRA e
FRANÇA, 2007).
Relatos prévios enfatizaram que os principais hormônios envolvidos no processo
acneico são: hormônio luteinizante, hormônio folículo estimulante, prolactina, testosterona,
testosterona livre, dihidroepiandrosterona e androstenediona. O estudo das alterações
hormonais, além de servir de subsídio para um diagnóstico preciso, permite melhor
entendimento da patogênese da doença (TEIXEIRA e FRANÇA, 2007).
Segundo Sampaio e Rivitti (2001), a acne é classificada clinicamente em quatro graus:
- Grau I: É a forma mais leve da acne. Não inflamatória, pois a colonização pela bactéria P.
acnes ainda não aconteceu. Caracterizada pela presença de comedões (cravos) fechados ou
abertos (PRUNIÉRAS, 1994; HABIF, 2005). Quando o aprisionamento do sebo e das
bactérias fica abaixo da superfície cutânea, um comedão fechado ou cravo branco está
formado (ACNE, 2008). Já um comedão aberto conhecido como cravo preto, ocorre se o
orifício folicular se dilata, mas normalmente não resulta em inflamação (PRUNIÉRAS, 1994;
HABIF, 2005). Um cravo preto ocorre quando o sebo e as bactérias aprisionadas estão
parcialmente abertos à superfície e ficam escurecidas devido à melanina, o pigmento da pele.
Os cravos pretos podem durar muito tempo, a não ser que a sua saída seja acelerada por
pressões na superfície da pele (ACNE, 2008). Um cravo preto ou um cravo branco podem
liberar o seu conteúdo à superfície e curar, ou a parede do folículo pode romper, originando a
acne inflamatória. O comedão fechado de poro pequeno é o precursor das pápulas, pústulas e
26
cistos da acne inflamatória (PRUNIÉRAS, 1994; HABIF, 2005).
- Grau II: É a acne inflamatória ou pápulo-pustulosa, quando as pápulas (lesões sólidas) e
pústulas (lesões líquidas de conteúdo purulento) se associam aos comedões. Uma pápula
ocorre quando há uma ruptura na parede folicular. É consequência de um comedão inflamado
(CAMPBELL et al., 2003; ACNE, 2008). Já uma pústula é formada vários dias mais tarde,
tratando-se de uma bolha contendo glóbulos brancos (leucócitos) que fazem seu caminho até a
superfície da pele (CAMPBELL et al., 2003; ALTMAN et al., 2007). Este processo é o que as
pessoas costumam referir-se como espinha (ACNE, 2008).
- Grau III: Acne nódulo-abscedante, quando se somam os nódulos (lesões sólidas mais
exuberantes). Uma lesão completamente inflamada pode por vezes originar um colapso ou
romper, ocasionando uma inflamação severa na pele circundante e, às vezes, envolver
folículos vizinhos. Essas lesões são chamadas de nódulos ou cistos (ACNE, 2008). O nódulo
é uma formação sólida, com 0,5 a 1 cm de diâmetro, que pode ser elevada. Algumas vezes,
ele parece formar-se abaixo da superfície cutânea e pressionar para cima podendo ser muito
dolorido ao toque (ALTMAN et al., 2007; ACNE, 2008).
- Grau IV: É a chamada acne conglobata, na qual há formação de abcessos e fístulas. É uma
forma da acne cística crônica, intensamente inflamatória onde as áreas relacionadas contêm
uma mistura de comedões duplo (dois cravos pretos que se comunicam sob a pele), pápulas,
pústulas, abscessos e cistos comunicantes (GONTIJO et al., 2003; HABIF, 2005).
Segundo Sampaio e Bagatin (2008), a acne sempre deve ser tratada, o mais
precocemente possível, independente da idade do paciente, evitando assim, a evolução para as
formas inflamatórias que podem deixar cicatrizes e desencadear repercussões psicossociais
sérias, com impacto negativo na qualidade de vida desses indivíduos.
O tratamento depende da gravidade da acne a qual se relaciona com o aspecto físico,
efeitos psicológicos, duração da moléstia, insucesso com tratamentos anteriores e presença de
cicatrizes (LEBWOHE et al., 2004).
2.3 ATIVOS UTILIZADOS PARA O TRATAMENTO DA ACNE
Antes da década de 1940 não havia tratamento efetivo para a acne. Aguardava-se a
cura espontânea ou prescreviam-se as poucas opções existentes como ativos tópicos de baixa
27
eficácia, tratamentos sistêmicos ineficazes ou radioterapia, que levava à atrofia da pele e das
glândulas sebáceas, porém causava efeitos adversos sérios e tardios (SAMPAIO e BAGATIN,
2008).
A partir deste período, passou-se a usar, por via sistêmica, os quimioterápicos e
antibióticos como as tetraciclinas, eritromicina, sulfas e os corticóides. Já entre 1960 e 1990,
produtos tópicos eficazes foram sendo introduzidos no tratamento da acne vulgar, tais como
peróxido de benzoíla (1965), retinóides como a tretinoína (1972), antibióticos como a
eritromicina e a clindamicina (1983) e ácido azeláico (1985) (SAMPAIO e BAGATIN, 2008).
Os objetivos do tratamento da acne são corrigir as anormalidades da maturação
folicular, reduzir a produção de gordura, diminuir a colonização por P. acnes e reduzir a
inflamação. As intervenções farmacológicas disponíveis para alcançar esses objetivos incluem
apresentações tópicas e sistêmicas (STRAUSS et al., 2007). A terapia tópica é indicada em
acne ligeira a moderada, enquanto formas mais graves com pequenos nódulos (0,5-1 cm),
gânglios (> 1 cm), quistos ou cicatrizes exigem uma terapia sistêmica (KRAUTHEIM e
GOLLNICK, 2003).
2.3.1 Antibióticos sistêmicos
Vaz (2003) concluiu que os antibióticos sistêmicos usados em combinação com
fármacos tópicos permitem o controle da acne nas suas formas mais severas. Os antibióticos
orais habitualmente utilizados são: tetraciclina, doxiciclina, minociclina, eritromicina e
clindamicina. Esses fármacos estão indicados no tratamento da acne inflamatória, e atuam
através da diminuição da população de P. acnes nas unidades pilossebáceas.
Depois de iniciado o tratamento por via oral, o mesmo deve ser mantido por um
mínimo de seis a oito meses, devendo ser esclarecido claramente aos pacientes, antes de
iniciar o tratamento, para evitar as desistências precoces e assegurar a eficácia terapêutica
(VAZ, 2003).
O tratamento a longo prazo com antibióticos sistêmicos é seguro e não requer
monitorização laboratorial. Para aumentar a eficácia e diminuir as recidivas, deve ser iniciado
com doses elevadas que serão diminuídas gradativamente (ao longo de dois a quatro meses)
quando atingido o controle da doença, e deve ser mantido durante alguns meses com a dose
mais baixa que permite o controle da situação (USATINE et al., 1999).
28
Vaz (2003) em estudos realizados com terapia sistêmica verificou um aumento da
frequência de P. acnes resistentes a antibióticos, o que se associa a falências terapêuticas,
buscando-se alternativas tópicas como tratamento de escolha.
2.3.2 Antibióticos tópicos
Os antibióticos tópicos são indicados na acne inflamatória leve, sendo a tetraciclina, a
clindamicina e a eritromicina os mais utilizados. Estes agentes reduzem a população de
P. acnes sobre a superfície da pele e, em especial no folículo, reduzindo assim os ácidos
graxos livres da superfície cutânea dos lipídeos (KRAUTHEIM e GOLLNICK, 2003)
devendo ser aplicados apenas nas áreas afetadas, 1 ou 2 vezes ao dia (VAZ, 2003).
Na antibioticoterapia tópica, a eritromicina leva nítida vantagem sobre a tetraciclina e
a clindamicina, devido a sua elevada eficácia, sua grande ação sobre o P. acnes, e também por
possível ausência de sensibilização da pele (PEREIRA et al., 1985).
As vantagens da antibioticoterapia tópica em contraste com os fármacos orais são a
redução do risco de efeitos adversos sistêmicos, a prevenção de resistência na seleção da
microflora, a entrega direta à zona afetada e a alta tolerabilidade local (KRAUTHEIM e
GOLLNICK, 2003). Porém, apresenta como desvantagem o aumento de estirpes resistentes
aos antibióticos orais respectivos (VAZ, 2003).
2.3.3 Peróxido de Benzoíla (PB)
Thiboutot e colaboradores (2007) definem o peróxido de benzoíla como um agente
antimicrobiano seguro e efetivo no tratamento da acne. Sua apresentação varia de 1 a 10%,
demonstrando atividade bactericida potente e rápida contra o P. acnes, sem evidência do
desenvolvimento de resistência.
É muito eficaz na acne inflamatória, embora também possua alguma atividade
comedolítica. Esse fármaco libera radicais livres de oxigênio que oxidam as proteínas
bacterianas, tendo um efeito bactericida sobre o P. acnes. A redução da população bacteriana
leva à diminuição da produção de ácidos graxos livres (comedogênicos e irritantes) e de
fatores quimiotáticos (que medeiam o processo inflamatório). Também parece reduzir o
tamanho das glândulas sebáceas (VAZ, 2003).
29
Vaz (2003) relata ainda que o PB reduz as lesões inflamatórias em cerca de 4 semanas,
e o tratamento deve ser mantido, na maioria dos casos, durante 12 semanas.
2.3.4 Tretinoína
Desde 1972, quando o ácido trans-retinóico, mais comumente conhecido como
tretinoína, foi lançado nos Estados Unidos, tem sido bem sucedido o tratamento da acne com
retinóides tópicos, porém a instabilidade desse composto quando incorporado nas
formulações, atrasou a sua disponibilidade para uso comercial (ROSSO, 2002).
A tretinoína é o fármaco tópico de escolha para o tratamento da acne não-inflamatória.
Atua através do aumento da renovação celular da epiderme e da diminuição da coesão das
células queratinizadas, causando fragmentação e expulsão do microcomedão, convertendo os
comedões fechados em abertos. O uso da tretinoína condiciona um adelgaçamento do estrato
córneo, levando a uma maior susceptibilidade da pele a danos causados pelo sol, vento, frio
ou secura, e diminuindo a tolerância a adstringentes, álcool e sabonetes para a acne (VAZ,
2003).
Os efeitos adversos mais comuns da tretinoína consistem em eritema e ressecamento,
que podem ocorrer nas primeiras semanas de uso (KATSUNG, 2003). O tratamento dura de 4
a 6 semanas e além de causar hiperemia e efeito descamativo na pele, produz uma protusão
dos comedões para a superfície através de um processo inflamatório, havendo uma
exacerbação das lesões pré-existentes, assim como daquelas que ainda estavam inertes
(GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Estudos sugerem que esse fármaco possa aumentar o potencial tumorigênico da
irradiação ultravioleta. Levando em consideração esse fato, os usuários de ácido retinóico
devem ser aconselhados a evitar ou a minimizar a exposição à luz solar e a utilizar um filtro
solar protetor (GUIRRO e GUIRRO, 2002; KATSUNG, 2003).
2.3.5 Isotretinoína
A isotretinoína é um composto retinóide, derivado sintético não aromático da vitamina
A, quimicamente conhecida como ácido 13-cis-retinóico (USP 30, 2007). Faz parte do grupo
dos retinóides de primeira geração (ABULAFIA, 1990), devendo ser preservada em
compartimentos hermeticamente fechados, protegidos da luz e a baixas temperaturas (USP 30,
30
2007). É um isômero da tretinoína (13-trans-retinóico), possuindo um índice terapêutico 2,5
vezes maior (KATSUNG, 2003; MACHADO et al., 2003; PIQUERO, 2004).
A isotretinoína é empregada particularmente no tratamento da acne cística e nodular e
como inibidor da proliferação de células neoplásicas, por exercer efeito regulador sobre a
diferenciação celular (GABISON, 1989; WHITE,1999; DINIZ, et al., 2002).
Segundo Amichai e colaboradores (2006), sua introdução no início dos anos 80
revolucionou o tratamento da acne, mais precisamente no ano de 1982 quando seu uso foi
permitido pelo FDA. A isotretinoína pode ser tão poderosa na melhoria da vida dos pacientes
como os seus efeitos adversos, também podem ser tão potentes (MEADOWS, 2001).
Para sua prescrição oral é obrigatório o exame clínico dermatológico minucioso e a
avaliação laboratorial inicial, compreendendo exame hematológico completo e dosagens de
colesterol, triglicérides e transaminases hepáticas. No seguimento do tratamento, faz-se exame
clínico mensal ou sempre que necessário, e para as mulheres, prescreve-se um
anticoncepcional oral (SAMPAIO e BAGATIN, 2008).
A dosagem de isotretinoína, no tratamento da acne severa e resistente às terapias
convencionais, varia de 0,5 a 2 mg/kg/dia por 16 a 24 semanas (ALLEN e BLOXHAM, 1989;
WHITE, 1999; MARTINDALE, 2007).
O uso terapêutico desse retinóide é limitado, devido à variedade de seus efeitos
adversos (CORTESI et al., 1994). A maioria desses efeitos adversos envolve a pele e
membranas mucosas, sistema nervoso, músculo-esquelético, hematopoiético e linfático,
gastrintestinal, cardiorespiratório e geniturinário (MARTINDALE, 2007).
Segundo Cortesi e colaboradores (1994), a elevada toxicidade, destacando-se o
potencial teratogênico, é um dos fatores limitantes da aplicação na terapêutica dos retinóides.
Quando administrada no primeiro trimestre de gestação, a isotretinoína pode ocasionar
abortos espontâneos ou má formação do feto, sendo esta também observada quando a
gestação ocorre dentro de 4 meses após o término do tratamento (MARTINDALE, 2007).
Outro fator que limita seu uso é a sua baixa estabilidade química, pois ela é altamente
instável e sua meia-vida depende, principalmente, das condições de estocagem, como
temperatura, oxigênio e luz (GATTI et al., 2000; TASHTOUSH et al., 2007).
31
Devido a essa grande instabilidade dos retinóides frente à luz, estudos são relatados na
literatura (LIMA, 2007; DINIZ, 2008; FELIPPI, 2008) visando melhorar a estabilidade desses
fármacos através de sistemas como lipossomas, nanocápsulas, nanoemulsões e inclusão de
ciclodextrinas (FELIPPI, 2008).
2.3.6 Ácido Azelaico
O ácido azelaico é indicado no tratamento da acne não-inflamatória e inflamatória,
possuindo propriedades comedolíticas e bactericidas. Atua normalizando a queratinização
folicular e reduzindo a concentração de P. acnes na unidade pilossebácea (VAZ, 2003).
Pode ser aplicado isoladamente 2 vezes ao dia, ou 1 vez ao dia em associação com
tretinoína. É uma boa opção para pacientes com pele seca e/ou clara, pois é hidratante, não
provoca fotossensibilidade, causa uma irritação cutânea mínima e reduz a hiperpigmentação
pós-inflamatória. Deve-se ter cuidado nos pacientes com pele escura, pois esses podem
desenvolver hipopigmentação (VAZ, 2003). Nas primeiras semanas de uso pode ocorrer
prurido, sensação de queimadura e de picada, que tendem a desaparecer com o seguimento do
tratamento (USATINE et al., 1999).
2.3.7 Alfa-Hidroxiácidos (AHA)
Os AHA são ácidos derivados de frutos que ocorrem naturalmente, como os ácidos
glicólico, láctico, tartárico e glucônico. Desses, os mais frequentemente utilizados em
cosméticos são o ácido glicólico e o ácido láctico (HERMITTE, 1992). Essas substâncias têm
sido utilizadas em dermatologia há mais de quarenta anos, principalmente como agentes de
descamação (peeling) e emolientes da pele (SMITH, 1995; GUTERRES e NARDIN, 1999).
AHA são utilizados no tratamento da acne não-inflamatória (KAMINSKY, 1990;
BRODY et al., 1996; GUTERRES e NARDIN, 1999) devido à capacidade dos mesmos em
diminuir a coesão dos corneócitos em baixas concentrações e provocar separação dos
queratinócitos e epidermólise em concentrações mais elevadas, o que fornece a razão
fundamental para o seu uso em formulações tópicas (VAN SCOTT e YU, 1989;
KAMINSKY, 1990; CLARK, 1996; GUTERRES e NARDIN, 1999).
Peelings químicos superficiais utilizando altas concentrações de ácido glicólico, por
exemplo, causam, geralmente dentro de 3 a 5 minutos, o branqueamento das pápulas, pústulas
32
e comedões (VAN SCOTT e YU, 1989). Ocorre também epidermólise subcorneal que pode
conduzir a descamação espontânea de pústulas, com desprendimento dos queratinócitos,
revestimento do epitélio folicular e descida ao ducto da glândula sebácea devido a mais rápida
penetração do ácido através da fina epiderme e do estrato córneo sobre a pústula (VAN
SCOTT e YU, 1989; CLARK, 1996; GUTERRES e NARDIN, 1999).
Uma regressão da acne é observada, aproximadamente após 3 a 4 semanas de
aplicação diária de AHA, embora o estado da pele possa realmente piorar nas duas semanas
iniciais de tratamento (VAN SCOTT e YU, 1989; CLARK, 1996; GUTERRES e NARDIN,
1999).
2.3.8 Tazaroteno
Tazaroteno é o primeiro de uma nova família de retinóides tópicos com receptores
seletivos acetilênicos (SHALITA et al., 1999). É um pró-fármaco, convertido na forma ativa,
ou seja, ácido livre (ácido tazarotênico) através da dissociação do éster na pele. O ácido
tazarotênico é o único metabólito conhecido do tazaroteno com ação retinóide (CHIVOT,
2005).
Regula a expressão genética de maneira específica e, dessa forma, modula a
proliferação celular, hiperplasia e diferenciação celular no folículo pilossebáceo (CHIVOT,
2005), além de ter um efeito anti-inflamatório (FOSTER et al., 1998) sendo, por isso, muito
usado para o tratamento da acne.
O tazaroteno é encontrado na forma de gel a 0,05% e 0,1%, apresentando como efeitos
adversos irritação, escamação, eritema, ressecamento, queimadura, ardência e coceira na pele.
Esses efeitos adversos são mais comuns na primeira e segunda semana de terapia e podem ser
minimizados alternando os dias de aplicação e diminuindo a concentração do produto
(CHIVOT, 2005).
2.3.9 Óleo de Melaleuca
Obtido das folhas da planta Melaleuca alternifolia (REICHLING et al., 2006),
encontra-se distribuído em regiões subtropicais e tropicais, principalmente na Austrália
(BARROSO et al., 1991; VIEIRA et al., 2004). Possui boas propriedades de penetração
tecidual (ALTMAN, 1989; SIMÕES et al., 2002) e alguns estudos (BASSETT et al., 1990;
33
CARSON e RILEY, 1994; SEYED et al., 1999) referem esse óleo para o tratamento da acne.
Sua constituição química é bem conhecida, composto de hidrocarbonetos terpênicos
(CARSON et al., 2006), sendo o terpinen-4-ol, o principal responsável por suas propriedades
medicinais, principalmente antifúngicas, anti-inflamatórias, antisépticas e antibacterianas,
garantindo-lhe importância comercial há mais de 60 anos (RUSSEL e SOUTHWELL, 2002;
CABOI et al., 2002; VIEIRA et al., 2004).
Basset e colaboradores (1990) realizaram um dos primeiros estudos clínicos rigorosos
avaliando a eficácia do óleo de melaleuca a 5% no tratamento da acne, comparando-o com
peróxido de benzoíla também a 5%. Os autores descobriram que ambos os tratamentos
reduziram o número de lesões tanto não-inflamatórias como inflamatórias. Embora o grupo
com peróxido de benzoíla tenha tido um desempenho significativamente melhor e com menos
oleosidade na pele, o grupo tratado com óleo de melaleuca apresentou um início de ação mais
lento e demostrou menos efeitos adversos, como menor prurido e ressecamento.
O óleo de melaleuca pode ser incorporado como ingrediente ativo em formulações
tópicas utilizadas para tratamento de diversas infecções cutâneas, dentre elas, a acne
(CARSON et al., 2006).
2.3.10 Adapaleno
Com o nome químico 6-[3-(1-adamantyl)-4-methoxyphenyl]-2-naphtoic acid, fórmula
molecular C28H28O3 e massa molar de 412,52 g/mol, o adapaleno (figura 3) é um retinóide de
terceira geração (IRBY et al., 2008) derivado do ácido naftóico (TRICHARD et al., 2008).
Figura 3: Estrutura química do adapaleno (MILLIKAN, 2001).
É o primeiro composto retinóide tópico aprovado para o tratamento da acne vulgar,
desde a introdução da tretinoína em 1972 (MILLIKAN, 2001; ROSSO, 2002). Sua utilização
34
como retinóide tópico (Differin®) encontra-se no mercado desde 1996. A eficácia e segurança
do adapaleno foram estabelecidas em estudos clínicos de Liu e Xiang (2006). Tornou-se
amplamente utilizado devido a sua eficácia e perfil de tolerabilidade favorável quando em
comparação com outros retinóides tópicos (IRBY et al., 2008). Esse fármaco não só ajuda a
prevenir a formação de novas lesões de acne, mas também contribui para as lesões que já
estão presentes (PHARMACEUTICAL NEWS, 2007).
Apresenta alta afinidade por lipídeos cutâneos, sendo altamente estável ao oxigênio, à
luz e não demonstrando reatividade química. Assim como a tretinoína, une-se a receptores
nucleares para o ácido retinóico, porém, ao contrário dessa, não se une a proteína
transportadora de ácido retinóico. Essas propriedades formam a base de sua ação direta e
rápida em comparação com a tretinoína. Quando aplicado topicamente, é comedolítico e
também possui efeitos sobre o processo anormal de queratinização e diferenciação
epidérmica, fenômenos presentes na patogenia da acne vulgar. Seu mecanismo de ação pode
ser a indução da diferenciação normal das células epiteliais foliculares, o que provocaria
menor formação de comedões (P.R. Vade-mécum, 2006/2007).
Apresenta-se na forma de loção ou gel a 0,1%, aplicado uma vez ao dia, sendo mais
eficaz para pacientes com acne vulgar a moderada, podendo atingir concentrações mais
elevadas na unidade pilossebácea (RAMOS E SILVA et al., 2003; KATSUNG, 2003). Na
forma tópica de gel atua no fundo dos poros para controlar o acúmulo de sebo e células que
levam à formação de acne. Segundo Kawashima e colaboradores (2008) esse tratamento uma
vez ao dia reverte a descamação folicular anormal e as respostas inflamatórias envolvidas na
patogênese da acne.
Adapaleno tópico está descrito como substância retinóica pela ANVISA, e de acordo
com a Resolução nº. 33, de 14 de janeiro de 2000, está sujeito a venda sob prescrição médica
sem retenção de receita (BRASIL, 2005).
Independente do tratamento, antes de iniciar qualquer terapia para acne, é necessário
chamar a atenção para o comprometimento dos pacientes, uma vez que o sucesso terapêutico
é altamente dependente da dedicação do paciente durante um período prolongado de tempo
(GOLLNICK e SCHRAMM, 1998). Além disso, ao unirmos nanotecnologia a esses ativos
utilizados para a acne, esperamos que o tratamento obtenha resultados mais favoráveis e
sempre que possível definitivos.
35
Acredita-se que o desenvolvimento de um sistema nanoestruturado com adapaleno
possa aumentar a eficácia terapêutica desse ativo direcionando-o ao local da afecção e
minimizando ainda mais seus efeitos adversos. Desta forma, experimentos contendo ativos
com base nanotecnológica tornam-se de grande importância para o desenvolvimento de
formulações mais estáveis e seguras para que o produto exerça a ação terapêutica adequada.
2.4 NANOTECNOLOGIA
Nanotecnologia é o conjunto de ações que envolve pesquisa, desenvolvimento e
inovação sendo obtida graças às especiais propriedades da matéria organizada a partir de
estruturas de dimensões nanométricas (FERNANDES DE SÁ et al., 2004).
O ano de referência para o nascimento da nanotecnologia é 1959, onde o físico
Richard Feynman proferiu na Reunião Anual da American Physical Society, a palestra “Há
mais espaço lá embaixo”. O termo Nanotecnologia foi utilizado pela primeira vez em 1974
pelo professor Norio Taniguchi da Universidade de Tóquio, e indica uma unidade igual a 10-9
(VIEGAS e ALMEIDA, 2009).
Devido ao tamanho reduzido que atua esta tecnologia pode-se sintetizar a matéria da
forma que for mais adequada à utilização desejada. Modifica-se o arranjo de átomos e
moléculas, visando-se um produto final mais resistente, mais leve, mais preciso, mais puro e
mais adequado. Nesse sentido, a nanotecnologia possui o poder de revolucionar a forma com
que se imagina, trata e manuseia a formação de materiais (PINA et al., 2005).
O que leva a nanotecnologia a ter uma multiplicidade de aplicações, é a possibilidade
de convergência das diferentes áreas como a química, a biologia e a física. Devido a esse
caráter multidisciplinar, acredita-se que a nanotecnologia tenha o potencial de revolucionar
áreas científicas e tecnológicas. Especificamente quando essa tecnologia é aplicada às
ciências da vida, recebe o nome de nanobiotecnologia (FRONZA et al. 2007). Nessa área, as
nanoestruturas mais estudadas são as nanopartículas (lipídicas e/ou poliméricas), os
lipossomas, os dendrímeros, os nanotubos de carbono e os pontos quânticos (quantum dots)
(VAUTHIER et al., 2003).
Por isso, a produção de micro e nanopartículas nos últimos anos, tem sido relatada
como uma alternativa promissora, pois promovem um direcionamento a sítios específicos,
garantindo um melhor controle de liberação do fármaco, bem como o seu efeito terapêutico.
36
Podendo a isto acrescer uma melhor adesão do paciente à terapia (CARDOSO, 2009).
Nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam
diâmetros entre 10 nm e 1000 nm (SOPPIMATH et al., 2001; SCHAFFAZICK et al., 2003).
Dependendo do processo de preparação, podem-se obter dois tipos de estruturas, as
nanoesferas e as nanocápsulas (figura 4), as quais diferem entre si, segundo a composição e
organização estrutural (SCHAFFAZICK et al., 2003).
Figura 4: Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas (SANTOS et al., 2006)
As nanocápsulas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor de
um núcleo oleoso, podendo o fármaco estar dissolvido nesse núcleo e/ou adsorvido à parede
polimérica. Entretanto, as nanoesferas não apresentam óleo em sua composição e são
formadas por um núcleo sólido formado por uma rede polimérica, sendo caracterizadas pela
presença de uma estrutura matricial, onde o fármaco pode ficar retido ou adsorvido (WEISS,
2001; SCHAFFAZICK et al., 2003).
Vários métodos para a preparação de nanopartículas estão descritos na literatura,
dentre os quais se destaca o método de deposição do polímero pré-formado proposto por Fessi
e colaboradores (1989). Neste método, o polímero biodegradável é dissolvido em um solvente
orgânico juntamente com o componente oleoso (no caso de NC), o tensoativo lipofílico e o
ativo a encapsular. A fase oleosa é vertida sobre a fase aquosa, a qual é composta de água e
tensoativo hidrofílico. Dessa mistura originam-se, de forma espontânea, as nanopartículas,
com diâmetros médios entre 200 a 500 nm (WEISS, 2001; SCHAFFAZICK et al., 2003;
GUTERRES et al., 2007). Fazer uso de tensoativos nas suspensões de nanocápsulas é
importante para a estabilidade do sistema, pois previne a agregação das partículas durante o
armazenamento (FESSI et al., 1989; QUINTANAR-GUERRERO et al., 1998). A vantagem
desse método é a obtenção espontânea, simples, eficiente e reprodutível de pequenas
partículas com elevada capacidade de encapsulação (WEISS, 2001; SCHAFFAZICK et al.,
37
2003; GUTERRES et al., 2007).
Uma alternativa para mascarar propriedades físico-químicas, melhorar a interação
fármaco/membrana e facilitar a absorção cutânea é fazer uso de polímeros para encapsulação
de ativos. Dentre os polímeros utilizados a PCL se destaca devido a sua biocompatibilidade,
biodegradabilidade e propriedades mecânicas, por ser um polímero semicristalino que possui
degradação mais lenta quando comparado aos polímeros amorfos (GUTERRES et al., 2007).
Desse modo, é possível aumentar a eficácia de algumas substâncias em função do
aumento da concentração da mesma em sítios específicos e/ou a redução dos efeitos tóxicos
em sítios não-específicos (KREUTER, 1994).
Para garantir que esses sistemas nanoestruturados sejam quimicamente estáveis devese realizar a caracterização físico-química dos sistemas de interesse.
2.5 ESTABILIDADE
Estudar a estabilidade de produtos cosméticos e farmacêuticos fornece dados
importantes que indicam o grau relativo de um produto nas diversas condições a que possa
estar sujeito, desde sua produção até o fim de sua validade. Essa estabilidade é relativa, pois
varia com o tempo e em função de fatores que aceleram ou retardam alterações nos
parâmetros do produto (BRASIL, 2004).
Segundo o Guia de Estabilidade da ANVISA (2004), determinar a instabilidade de
uma determinada amostra contribui para orientar o desenvolvimento da formulação e
adequação do material de acondicionamento. Pode fornecer subsídios para o aperfeiçoamento
das formulações, estimar o prazo de validade e fornecer informações para a sua confirmação,
auxiliar no monitoramento da estabilidade organoléptica, físico-química e microbiológica,
produzindo informações sobre a confiabilidade e segurança dos produtos.
Segundo relatado por Schaffazick e colaboradores (2003), as suspensões coloidais não
possuem tendência à separação de fases, pois o processo de sedimentação é lento para
partículas de tamanho reduzido, sendo minimizado ainda, pelo movimento Browniano.
Porém, com o tempo, as suspensões tendem a se sedimentar devido à aglomeração das
partículas do sistema. Muitos são os fatores que influenciam a estabilidade das suspensões
38
coloidais como, por exemplo, a adsorção de moléculas ativas à superfície das nanopartículas e
a presença de tensoativos adsorvidos.
Ainda há poucos estudos referentes à determinação da estabilidade de nanopartículas
contendo diferentes fármacos, não sendo específico na literatura testes característicos para
estes sistemas (LOSA et al., 1993; CALVO et al., 1996; MOLPECERES et al., 1997;
LACOULONCHE et al., 1999; SCHAFFAZICK et al., 2002; POHLMANN et al., 2002).
Portanto, é fundamental avaliar a estabilidade química dos polímeros sob diferentes
condições de armazenagem (MAGENHEIM e BENITA, 1991; MOLPECERES et al., 1997).
O tamanho de partícula, o potencial zeta, a distribuição da massa molar do polímero, o teor de
fármaco e o pH são parâmetros físico-químicos que podem ser utilizados para monitorar a
estabilidade das suspensões coloidais poliméricas (FESSI et al., 1989; LOSA et al., 1993;
GUTERRES et al., 1995; CALVO et al., 1996; LACOULONCHE et al., 1999).
2.6 LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS
O desenvolvimento de novos sistemas de liberação foi influenciado principalmente
pelo estudo de novos tensoativos sintéticos e pela maior compreensão da estrutura e função da
pele em relação à absorção percutânea, tendo sido intensamente estudado, ao longo dos anos
(NACHT, 1995; MAGDASSI, 1997; GUTERRES et al., 2005).
Segundo Sato e colaboradores (2007), a liberação de um ativo a partir de um veículo
pode ser analisada determinando-se o coeficiente de partição óleo/água. Entretanto, estudos de
liberação in vitro proporcionam dados mais significativos para compreensão desses sistemas.
Ao longo da fase de desenvolvimento de produtos nanotecnológicos é indicado
empregar o procedimento de liberação in vitro para selecionar excipientes para as
formulações, proporcionando uma atividade terapêutica adequada. Pode-se considerar que os
estudos de liberação proporcionam dados valiosos sobre as particularidades estruturais do
veículo e a capacidade desse em liberar os fármacos (SATO et al., 2007).
Em produtos dermatológicos, onde é desejável que o fármaco administrado tenha
pequeno fluxo e alta retentividade através das membranas (TOUITOU et al., 1998), estes
estudos in vitro são realizados de modo que o fármaco seja liberado da formulação onde está
39
veiculado, e se difunda através de uma membrana para uma solução receptora, a qual deve
garantir condições termodinâmicas favoráveis ao fármaco (LÓPEZ et al., 1998).
Segundo Yokoyama e Okano (1996), fármaco vetorizado é definido como uma
substância que tem uma liberação seletiva para sítios fisiológicos específicos, órgãos, tecidos
ou células, onde a atividade farmacológica é requerida.
Dentre os sistemas propostos, encontram-se as nanocápsulas. Em se tratando de
produtos cosméticos, a substância ativa, ao invés de ser adicionada diretamente no veículo
cosmético, ou seja, na forma livre, é encapsulada em vesículas nanométricas (GUTERRES,
2005). Nos últimos anos, sistemas utilizando micro ou nanopartículas para liberação de
fármacos, foram desenvolvidos como uma das estratégias mais promissoras para alcançar o
local específico de atuação (ALVES, 2006).
Tanto a liberação imediata, como a liberação sustentada têm sido relatadas para
descrever o comportamento dos sistemas nanoestrutrados. No caso dos produtos de aplicação
tópica, ambas as características são interessantes, a liberação imediata pode ser útil para
melhorar a penetração de uma substância e a liberação sustentada é importante para
substâncias ativas potencialmente irritantes em concentrações elevadas ou que devam suprir a
pele por um período prolongado de tempo (JENNING et al., 2000).
A liberação do fármaco a partir das nanopartículas depende da dessorção do fármaco
da superfície das partículas, da difusão do ativo através da matriz das nanoesferas, da difusão
através da parede polimérica das nanocápsulas, da erosão da matriz polimérica ou da
combinação dos processos de difusão e erosão (SOPPIMATH et al., 2001).
Atualmente existe um grande interesse na liberação seletiva de fármacos, em vista
disso, sistemas carreadores têm sido bastante estudados com objetivo de melhorar a
seletividade e a eficiência das formulações (MONACO, 2000). Análises farmacocinéticas de
liberação in vitro, partindo de sistemas nanoestruturados, têm colaborado para o entendimento
sistemático e quantitativo de fármacos vetorizados (ALVES et al., 2007).
Segundo Gomara e colaboradores (2004), a base dos experimentos in vitro é definir as
pequenas quantidades de fármaco que atravessam as membranas ou que ficam retidos nas
mesmas. Para isso, a utilização de um método analítico sensível, o qual possa viabilizar o
experimento, é de grande importância.
40
As vantagens dos métodos in vitro é que as condições de estudo podem ser
controladas, não havendo interferentes biológicos, além de não serem dispendiosos e
facilmente realizáveis (CHIEN, 2005; ALLEN et al., 2007). Os estudos in vitro têm sido uma
ferramenta muito valiosa e determinante na avaliação do comportamento de formulações de
uso tópico, diante das inúmeras variáveis que comprometem o processo de fabricação.
Através deles podem-se obter dados que possibilitam um maior entendimento dos fatos
ocorridos, desde a aplicação na pele, liberação do fármaco da forma farmacêutica, retenção e
absorção cutânea (CAMPOS, 1994, NOKHODCHI et al., 2003).
3 METODOLOGIA
3.1 MATÉRIAS-PRIMAS, SOLVENTES E OUTROS MATERIAIS
- Acetona P.A - Nuclear®;
- Acetonitrila grau CLAE - J.T. Baker®;
- Ácido fosfórico P.A - Nuclear®;
- Adapaleno - Pharma Nostra®;
- Membrana em polivinilideno 0,45 µm de poro - Millipore®;
- Metanol grau CLAE - J.T. Baker®;
- Monoestarato de sorbitano (Span 60®) - Sigma Aldrich®;
- Óleo de Melaleuca - Via Farma®;
- Poli (ε-caprolactona) Mw = 65000 - Aldrich®;
- Polissorbato 80 (Tween 80®) - Via Farma®;
- Tetrahidrofurano grau CLAE - J.T. Baker®;
- Triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico (Miglyol® 810) - Via Farma®.
3.2 APARELHOS, EQUIPAMENTOS E OUTROS MATERIAIS
- Aparato vertical de célula tipo Franz, acoplado com banho-maria e chapa de agitação –
Quimiserve®;
- Balança analítica AX 200 - Shimadzu®;
- Câmara climatizada TE 4001 - Tecnal®;
- Câmara de fonte luminosa - Byko-Spectra - Gardner®;
- Centrífuga TDL80-2B - Centribio®;
- Coluna cromatográfica – Lichrospher® 100 RP – 18,250 mm, 4,0 mm, 5 µm - Merck®;
- Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu – CLAE – equipado com bomba modelo
LC-10AD, detector com comprimento de onda variável UV/Vis modelo SPD-10Avp,
controlador SLC-10Avp, integrador automático computadorizado com software Class VP® e
injetor automático SIL-10-Avp, forno para coluna CTO-10Asvp Shimadzu;
- Evaporador rotatório 801 - Fisatom®;
- Potenciômetro - Digimed®;
- Vórtex P56 - Phoenix®;
- Zetasizer® – Nano-ZS – Malvern®;
- Turbiscan® - modelo Lab, Formulaction®.
42
3.3 MÉTODOS
A metodologia utilizada neste trabalho está resumida em um esquema que pode ser
observado na figura abaixo (figura 5).
Figura 5: Metolodologia.
43
3.3.1 Teste de inchamento do polímero
A obtenção de filmes de poli (ε-caprolactona) foram realizados através da dissolução
completa do polímero em clorofórmio e subsequente evaporação total do solvente orgânico.
Filmes com cerca de 275 mg foram imersos em uma solução de adapaleno e óleo de
melaleuca com concentração equivalente a suspensão de nanocápsulas (0,3 mg/mL). Os
filmes foram afastados do contato do óleo, secos suavemente com papel absorvente e pesados
em balança analítica nos tempos 0, 2, 4, 6, 14, 21, 28, 35 e 42 dias. O teste foi realizado em
triplicata (PAESE, 2008).
3.3.2 Preparação das suspensões
O método utilizado para obtenção das suspensões coloidais de nanocápsulas (NC) foi
o método de deposição interfacial do polímero pré-formado (FESSI et al., 1989). A
composição das suspensões está descrita na Tabela 1.
Tabela 1: Componentes utilizados na preparação das suspensões contendo NC de adapaleno.
NC-BRMiglyol®
NC-ADMiglyol®
NC-BRMelaleuca
NC-ADMelaleuca
ND
-
0,03 g
-
0,03 g
0,03 g
1,0 g
1,0 g
1,0 g
1,0 g
-
0,766 g
0,766 g
0,766 g
0,766 g
-
3,102 g
3,102 g
-
-
-
-
-
3,102 g
3,102 g
-
267 mL
267 mL
267 mL
267 mL
267 mL
Polissorbato 80
0,766 g
0,766 g
0,766 g
0,766 g
0,766 g
Água destilada
533 mL
533 mL
533 mL
533 mL
533 mL
Constituintes*
Fase Orgânica
Adapaleno
Poli (ε-caprolactona)
(PCL)
Monoestearato de
sorbitano
Miglyol® 810
Óleo
De Melaleuca
Acetona
Fase Aquosa
* Volume final de 100 mL; NC-BR-Miglyol®: Nanocápsulas brancas com Miglyol®; NC-AD-Miglyol®:
Nanocápsulas contendo adapaleno e Miglyol® como núcleo oleoso; NC-BR-Melaleuca: Nanocápsulas brancas
com óleo de melaleuca, NC-AD-Melaleuca: Nanocápsulas contendo adapaleno e óleo de melaleuca como núcleo
oleoso; ND: Nanodispersão.
44
Os componentes das fases orgânica e aquosa foram pesados, colocados em béquer e
mantidos, separadamente, sob agitação magnética por uma hora em banho-maria em
temperatura de 40 °C até completa dissolução. Após, a fase orgânica foi vertida sobre a fase
aquosa, com auxílio de um funil, sob agitação moderada.
Após a formação imediata das NC, a suspensão foi mantida sob agitação durante 30
minutos. A suspensão foi concentrada a um volume final de 100 mL em um evaporador
rotatório para eliminação do solvente orgânico e ajuste da concentração final de adapaleno,
sendo a mesma correspondente a 0,3 mg/mL de suspensão.
Foram preparadas suspensões brancas, sem a adição de adapaleno, e nanodispersões
(tabela 1), através do método já descrito anteriormente.
3.3.3 Caracterização físico-química das suspensões contendo NC de adapaleno
As
suspensões
contendo
nanocápsulas
foram
preparadas
em
triplicata
e
acondicionadas em frascos de vidro âmbar, com batoque e tampa rosqueável e mantidas à
temperatura ambiente, geladeira (-4 °C) e estufa (40 °C) por três meses. Além do aspecto
físico destas suspensões, elas também foram caracterizadas de acordo com pH, distribuição de
tamanho médio das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta, teor do ativo, taxa de
associação e análises de espalhamento múltiplo de luz em equipamento Turbiscan® Lab.
3.3.3.1 Determinação do pH
A determinação do pH foi realizada em potenciômetro (Digimed®) previamente
calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0 e as medidas foram realizadas diretamente nas
suspensões. Os resultados foram expressos pela média de três determinações.
3.3.3.2 Distribuição do tamanho médio das partículas e índice de polidispersão
As determinações de diâmetro médio e do índice de polidispersão das nanopartículas
em suspensão foram realizadas através de espalhamento de luz dinâmico. As suspensões
foram diluídas 500 vezes (v:v) em água Milli-Q®, no equipamento Zetasizer®, Nano-ZS da
Malvern. Os resultados foram determinados através da média de três repetições.
45
3.3.3.3 Potencial Zeta
O potencial zeta das suspensões de nanocápsulas foi obtido através da técnica de
mobilidade eletroforética no aparelho Zetasizer®, Nano-ZS da Malvern. As amostras foram
previamente diluídas 500 vezes (v:v) em cloreto de sódio 10 mM e filtradas em membrana
com poros de 0,45 µm. Os resultados foram expressos em milivolts (mV) a partir de uma
média de três determinações.
3.3.3.4 Avaliação de espalhamento múltiplo de luz
As suspensões NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca foram submetidas à análise em
Turbiscan LAb® para verificação de possíveis fenômenos de instabilidade. Através desse
equipamento é possível determinar a ocorrência de fenômenos como cremagem,
sedimentação, coalescência e mesmo a homogeneidade da amostra. O Turbiscan® consiste de
uma fonte de luz de infravermelho próximo e de dois detectores que agem de forma
sincronizada. Desta forma, o detector de transmissão recebe informações da luz transmitida
através do produto (T) e o detector de backscattering mede a luz refletida (BS) pelo produto
(figura 6) (LEMARCHAND et al., 2003).
Figura 6: Representação esquemática do princípio de funcionamento do Turbiscan®
(Adaptado de DAOUD-MAHAMMED et al., 2007)
As suspensões contendo NC de adapaleno, foram analisadas através de Turbiscan
LAb® por 1 hora e 30 minutos à temperatura de 25 0C, com varreduras a cada 5 minutos. Para
cada análise utilizou-se 20 mL das suspensões. Essas análises foram realizadas no Laboratório
de Química Orgânica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
46
3.3.3.5 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais
As suspensões coloidais foram tratadas com acetonitrila (ACN), tetrahidrofurano
(THF) e metanol (2,5:5,0:2,5 mL) com objetivo de dissolver o polímero e liberar o ativo
contido no interior das nanocápsulas.
O doseamento do adapaleno foi realizado através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) segundo metodologia validada (conforme anexo).
As análises foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, utilizando-se detector
UV/VIS 284 nm, coluna Lichropher 100 RP-18 (5 µm, 250 x 4 mm), pré-coluna do mesmo
material (5 µm), fase móvel isocrática de metanol e água em uma proporção 95:5 (v/v), com
pH aparente de 3,0 ajustado com ácido fosfórico, volume de injeção de 20 µL e fluxo de
1,0 mL/min.
Os resultados obtidos, através das áreas dos picos, foram aplicados na curva de
calibração (10, 15, 20, 25, 30 µg/mL) e calculados através da equação da reta. O teor de
adapaleno em cada suspensão foi expresso em µg/mL e porcentagem (%).
O método foi validado segundo Resolução n°. 899 da ANVISA (BRASIL, 2003) em
termos de especificidade, linearidade, precisão, limite de detecção e de quantificação e
exatidão.
3.3.3.6 Construção da curva analítica
Para construção da curva analítica, foi pesado o equivalente a 25 mg de adapaleno,
sendo o volume completado com ACN, THF e metanol (5,0:15:5,0 ml) em um balão de
25 mL. A partir dessa solução (1000 µg/mL), a curva analítica foi construída nas
concentrações de 10, 15, 20, 25 e 30 µg/mL, utilizando-se metanol como solvente. O
procedimento foi realizado em triplicata.
As áreas médias, correspondentes a três determinações para cada diluição de
adapaleno, foram plotadas no eixo das ordenadas e as concentrações (µg/mL), no eixo das
abscissas.
47
3.3.3.7 Determinação da taxa de associação
A concentração de ativo associado às nanocápsulas foi determinada por CLAE,
levando em consideração a diferença entre a concentração total de adapaleno na formulação e
a concentração presente na fase aquosa da suspensão. A concentração total foi determinada
segundo item 3.3.3.4. A determinação do ativo livre, presente na fase aquosa da suspensão,
foi realizada utilizando filtro Microcron® - Millipore 10,000 Å, através de ultrafiltraçãocentrifugação, das suspensões durante 30 minutos a 10.000 rotações por minuto (rpm),
obtendo-se 100 µL de filtrado. A concentração de adapaleno não associado (livre) foi
quantificada empregando-se as mesmas condições descritas para a determinação da
concentração total de adapaleno. Estas determinações foram realizadas, em triplicata, para
todas as suspensões contendo nanocápsulas de adapaleno.
3.3.4 Determinação do perfil de degradação das suspensões contendo adapaleno nanodisperso
e nanoencapsulado
A determinação do perfil de degradação, adaptada de Breier e colaboradores (2006),
foi realizada pela técnica de doseamento de acordo com o item 3.3.3.4 através do tempo em
que 90% da concentração original do fármaco é degradada (t90), de acordo com a equação de
ordem zero abaixo:
t90 = 0,1 Co/k
onde: Co = concentração do fármaco no tempo zero em TA;
k = constante observada para o modelo cinético selecionado através do programa
Scientist® (MicroMath Scientific Software, Inc.).
3.3.5 Estudos de liberação in vitro
Estudos de liberação in vitro foram realizados utilizando uma célula de difusão
vertical do tipo Franz com um compartimento receptor com capacidade em torno de 6,0 mL e
uma área de difusão de 3,14 cm2 (FRANZ, 1975; VENTER et al., 2001).
Foi utilizado para este experimento membranas de acetato de celulose com poros de
0,45 µm da Millipore®. As membranas foram hidratadas em água destilada por 24 horas antes
do experimento. Após esse tempo, foram montadas as células de difusão, onde a membrana
48
foi mantida em contato com uma solução receptora de tampão fosfato pH 6,4, segundo
metodologia descrita por Jain e Ahmed (2007). Este meio foi conservado a uma temperatura
de 37 °C, circulando água pela jaqueta do compartimento inferior, sendo constantemente
agitado com uma barra magnética teflon-coberta. As amostras (0,5 mL) foram colocadas na
parte superior da membrana e em intervalos de tempo pré determinados (de 1 em 1 hora)
foram coletados 2 mL da solução receptora por um período de 10 horas. Após as 10 horas, as
amostras foram coletadas de 12 em 12 horas até atingir um platô (46 horas). A cada retirada
desta solução, foi recolocado novamente 2 mL de solução receptora na célula de difusão e as
amostras foram analisadas de acordo com o item 3.3.3.4.
Para análise de cada formulação, cinco células de difusão tipo Franz foram
utilizadas, obtendo-se desta forma cinco repetições.
3.3.5.1 Análise dos resultados da liberação
A quantidade de fármaco difundida através da membrana foi plotada em função do
tempo e análises de regressão linear foram estudadas para determinação do fluxo do fármaco
para cada formulação (HUANG et al., 1995; WAGNER e KOSTKA, 2001).
O coeficiente de permeabilidade Kp (cm/h), foi dado conforme a seguinte equação:
J = Kp. A. Cd
onde: J = é o fluxo de permeação através da membrana (inclinação da porção linear dos
dados);
A = área em cm2;
Cd = Concentração da droga no compartimento doador.
3.3.6 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos
Os perfis de liberação obtidos, foram modelados utilizando o programa Scientist®
(MicroMath Scientific Software, Inc.), sem a utilização de peso, conforme cinética de primeira
ordem monoexponencial ou biexponencial utilizando, respectivamente as equações abaixo
(FELIPPI, 2008):
49
C = C0 . e-k.t
C = A . e-α.t + B . e-β.t
onde: A = quantidade de fármaco degradado na velocidade α;
B = quantidade de fármaco degradado na velocidade β;
α, β e k = constantes de degradação;
C0 = concentração de fármaco no tempo zero.
Todos os perfis de liberação foram testados para os dois modelos e o modelo mais
adequado foi escolhido baseando-se no valor de Critério de Seleção de Modelo (MSC),
coeficiente de correlação e inspeção visual dos gráficos modelados.
O tempo de meia vida é o tempo necessário para que 50% do fármaco seja liberado ou
dissolvido e é calculado pela fórmula:
onde: k = constante observada para o modelo cinético selecionado através do programa
Scientist® (MicroMath Scientific Software, Inc.).
3.3.7 Avaliação da estabilidade das suspensões frente a exposição à radiação UVA
A fotodegradação do adapaleno incorporado nas NC foi realizada mediante a
exposição das formulações à radiação UVA. As formulações foram colocadas em frascos de
vidro âmbar, a uma distância de 35 cm da fonte luminosa.
Foram preparadas suspensões com NC-BR-Miglyol®, NC-AD-Miglyol®, NC-BRMelaleuca e NC-AD-Melaleuca. Foram adicionados em cada frasco de vidro fechado, 20 mL
de cada formulação as quais foram submetidas à radiação UVA durante 3 meses. Os tempos
de coleta foram 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias. As amostras coletadas nos diferentes períodos
foram diluídas em uma mistura constituída de ACN, THF e metanol (2,5:5,0:2,5), visando à
quantificação do adapaleno em CLAE de acordo com o método previamente descrito e
50
validado (item 3.3.3.4). As amostras, em triplicata, foram submetidas à irradiação.
3.3.8 Análise estatística dos resultados
A metodologia estatística dos dados incluiu análise descritiva de variáveis como a
média, desvio padrão (DP), desvio padrão relativo (DPR), estudos de correlação, regressão
linear simples e análise de variância (ANOVA), considerando um nível de significância de
p≤0,05.
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 TESTE DE INCHAMENTO DO POLÍMERO
Com o objetivo de verificar se o polímero poli (ε-caprolactona) selecionado para
composição da parede polimérica das nanocápsulas seria dissolvido pelos componentes do
núcleo oleoso ou pelo fármaco, foi realizado o teste de inchamento do polímero.
Guterres e colaboradores (2000) propuseram uma metodologia para a determinação de
inchamento do polímero pelos componentes do núcleo oleoso, avaliando assim a
adequabilidade das matérias-primas (polímeros e óleos) para a formulação das NC. Filmes de
poli (ε-caprolactona) e poli (ácido láctico) foram utilizados como polímero frente aos óleos
constituídos por benzoato de benzila ou por Miglyol 810®. Após 48 horas foi observada a
total dissolução dos polímeros em contato com benzoato de benzila, entretanto, para o
Miglyol 810®, as massas dos polímeros permaneceram constantes por 13 dias, indicando que
a integridade dos polímeros foi mantida. Com esses resultados, pôde-se concluir que o
benzoato de benzila dissolve os polímeros, formando dispersões coloidais micelares, não
sendo indicado para a formação destas nanocápsulas.
Os resultados referentes às variações de massa do polímero, ao longo do tempo de
contato com a mistura de adapaleno e óleo de melaleuca encontram-se representados na
figura 7.
1,6
1,4
M assa (gram as)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
14
21
28
35
42
Tempo (dias)
Figura 7: Massa de poli (ε-caprolactona) após imersão na mistura de adapaleno e óleo de melaleuca
(0,3 mg/mL) por 42 dias (n=3)
52
No presente estudo, verificou-se que a massa do filme de poli (ε-caprolactona) em óleo
de melaleuca e adapaleno variou nos primeiros 6 dias de estudo, ocorrendo um aumento de
peso. Já a partir da quarta pesagem as massas dos filmes de PCL permaneceram constantes,
indicando que o óleo de melaleuca utilizado nas nanocápsulas não dissolve o polímero, o que
possibilita em hipótese, a formação de uma parede polimérica em torno do núcleo oleoso das
nanocápsulas.
4.2 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES
As formulações obtidas apresentaram aspecto macroscopicamente homogêneo, com
coloração leitosa branca. Somente a suspensão com o fármaco nanodisperso apresentou-se
opaca (figura 8).
Figura 8: Suspensão A (nanodispersão), suspensão B (NC-AD-Miglyol®)
e suspensão C (NC-AD-Melaleuca).
4.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES CONTENDO NC DE
ADAPALENO
A determinação de parâmetros físico-químicos das suspensões contendo NC é
importante para a proposição de modelos de suas organizações em nível molecular. Tal
caracterização é tecnicamente difícil de ser realizada devido ao tamanho reduzido das
partículas (MAGENHEIN e BENITA, 1991). As características físico-químicas foram
avaliadas através de combinações de diversas técnicas de análise como a determinação de pH,
distribuição do tamanho médio das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta e
53
análises de espalhamento múltiplo de luz. As amostras foram avaliadas durante 90 dias, sendo
as mesmas armazenadas em temperatura ambiente (TA), geladeira (GE), estufa (ES) e luz
UV.
O conjunto de informações obtidas pela caracterização desses sistemas pode conduzir
à elaboração de modelos que descrevam a organização das nanopartículas em nível molecular,
dependendo da composição das formulações (KIP, 2004).
4.3.1 Determinação do pH
Segundo Guterres e colaboradores (1995), o monitoramento do valor do pH é uma
ferramenta importante para avaliar a estabilidade das suspensões, visto que uma diminuição
deste valor pode indicar degradação do polímero ou de algum outro componente, ou mesmo
representar a difusão do fármaco para o meio aquoso.
Os valores médios de pH para a suspensão contendo Miglyol® e óleo de melaleuca
como núcleo oleoso encontram-se descritos nas tabelas 2 e 3.
Tabela 2: Valores referentes ao pH das suspensões contendo NC-AD-Miglyol® durante 90
dias.
Miglyol®
TA
GE
ES
UV
Média ± DP
Média ± DP
Média ± DP
Média ± DP
Inicial
5,7 ± 0,02
5,7 ± 0,02
5,7 ± 0,02
5,7 ± 0,02
7 dias
5,7 ± 0,07
5,9 ± 0,07
4,7 ± 0,06
5,3 ± 0,17
15 dias
5,7 ± 0,05
5,9 ± 0,04
4,6 ± 0,22
4,2 ± 0,70
30 dias
5,4 ± 0,07
5,5 ± 0,07
3,9 ± 0,42
3,4 ± 0,21
60 dias
5,2 ± 0,09
5,6 ± 0,11
3,4 ± 0,20
3,1 ± 0,13
90 dias
4,9 ± 0,11
5,5 ± 0,04
3,0 ± 0,11
2,7 ± 0,12
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
Através da figura 9, observa-se que tanto em ES como em UV, as amostras tiveram
nitidamente seu pH alterado, variando de 5,7 a 2,8.
54
Estabilidade Miglyol (pH)
7
6
5
TA
GE
ES
UV
pH
4
3
2
1
0
Inicial
7 dias
15 dias
30 dias
Tempo (dias)
60 dias
90 dias
Figura 9: Estabilidade das NC-AD-Miglyol® em relação ao pH.
Quando a suspensão foi colocada em GE, durante os 90 dias de experimento, o pH não
apresentou mudança significativa nos seus valores (p>0,05), sendo esta a melhor temperatura
para conservação do produto (- 4 °C).
Tabela 3: Valores referentes ao pH das suspensões contendo NC-AD-Melaleuca durante 90
dias.
Melaleuca
TA
GE
ES
UV
Média ± DP
Média ± DP
Média ± DP
Média ± DP
Inicial
5,5 ± 0,69
5,5 ± 0,69
5,5 ± 0,69
5,5 ± 0,69
7 dias
5,4 ± 0,80
5,6 ± 0,76
4,5 ± 0,94
5,0 ± 0,51
15 dias
6,1 ± 0,08
5,7 ± 0,79
4,6 ± 0,67
4,6 ± 0,15
30 dias
5,5 ± 0,04
5,2 ± 0,67
3,7 ± 0,35
3,7 ± 0,11
60 dias
5,5 ± 0,15
5,1 ± 0,23
3,4 ± 0,12
3,3 ± 0,07
90 dias
5,5 ± 0,03
5,2 ± 0,32
3,2 ± 0,17
2,9 ± 0,01
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
Na tabela 3, observa-se o mesmo comportamento para as suspensões com óleo de
melaleuca como núcleo oleoso, variando o pH de 5,5 a 2,9 para as temperaturas em ES e UV.
Para a suspensão com óleo de melaleuca, quando armazenada em temperatura
ambiente, verifica-se menor variação nos valores de pH durante os 90 dias de experimento,
como pode ser observado na figura 10.
55
Estabilidade Melaleuca (pH)
7
6
5
TA
GE
ES
UV
pH
4
3
2
1
0
Inicial
7 dias
15 dias
30 dias
60 dias
90 dias
Tempo (dias)
Figura 10: Estabilidade das NC-AD-Melaleuca em relação ao pH.
Foi observado diferença significativa (p<0,05) entre NC-AD-Melaleuca e NC-ADMiglyol® somente para as análises dos dias 15, 60 e 90 em TA.
Com relação a estudos de estabilidade acelerada, quando as suspensões foram
colocadas em ES e luz UV, ocorreu uma grande variação nos valores de pH tanto para a
formulação com Miglyol® como para a formulação com óleo de melaleuca. Essa redução
(tabelas 2 e 3) pode ser explicada pela hipótese de relaxamento das cadeias poliméricas da
PCL ocasionando uma exposição de um maior número de grupos carboxílicos terminais e à
hidrólise do poliéster em pH ácido (SCHAFFAZICK et al., 2002).
Em estudos realizados por diversos autores com suspensão de NC, observa-se um pH
variando entre 4,6 e 6,0 (RAFFIN et al., 2003; FERRONY et al., 2008; BOCHI, 2010).
Assim sendo, apesar dos ativos serem quimicamente diferentes, os valores encontrados no
presente estudo, tanto em TA como em GE, encontram-se de acordo com os relatos da
literatura para as duas formulações analisadas.
Considera-se, desta forma, que os valores de pH levemente ácidos, principalmente das
amostras armazenadas em TA e GE, apresentados pelas duas suspensões durante todo o
período de estudo, encontram-se coerentes para este tipo de sistema e na faixa de pH
adequada para formulações de uso tópico (ALVES et al, 2007).
56
4.3.2 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão
A determinação do tamanho médio das partículas e do índice de polidispersão permite
analisar a distribuição do diâmetro das partículas em suspensão e avaliar a sua
homogeneidade. Para todas as formulações, no presente estudo, os índices de polidispersão
foram inferiores a 0,3, indicando uma adequada homogeneidade desses sistemas
(SCHAFFAZICK et al., 2003; FRIEDRICH et al., 2008; OURIQUE et al., 2008).
Segundo estudos realizados por Silva e colaboradores (2006), quando trabalha-se com
partículas em tamanho nanométrico, indiferentemente do método utilizado para obtenção,
todas as formulações apresentam-se monodispersas (índice de polidispersão < 0,2) e com
diâmetros inferiores a 300 nm.
Analisando o perfil da curva de distribuição de tamanho das partículas, consegue-se
acompanhar o comportamento físico das partículas em suspensão, evidenciando possíveis
fenômenos de instabilidade (BOCHI, 2010). Através da figura 11, pode-se observar que tanto
a NC-AD-Miglyol® como a NC-AD-Melaleuca permaneceram estáveis durante os 90 dias de
análise.
Suspensão NC-AD-Melaleuca
Suspensão NC-AD-Miglyol®
Figura 11: Comparação do tamanho de partícula no final do experimento (90 dias)
das suspensões NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca
57
Com relação ao tamanho das partículas (tabela 4), a suspensão de nanocápsulas com
óleo de melaleuca (154 a 198 nm), obteve valores inferiores aos encontrados para as
nanocápsulas com Miglyol® (225 a 297 nm). Estudos têm referido que no caso das
nanocápsulas, um dos fatores que podem influenciar o diâmetro das partículas, segundo Yu e
colaboradores (1993), é a natureza do núcleo oleoso das nanocápsulas. Os resultados são
atribuídos às diferenças de viscosidade (YU et al., 1993), hidrofobicidade (LOSA et al., 1993)
ou tensão interfacial (MOSQUEIRA et al., 2000) das substâncias empregadas.
58
Tabela 4: Valores referentes ao diâmetro médio e índice de polidispersão das partículas contendo NC-AD-Miglyol e NC-AD-Melaleuca durante 90
dias.
NC-AD-Miglyol
NC-AD-Melaleuca
TA
GE
ES
UV
TA
GE
ES
UV
Inicial
279,6 ± 0,08
279,6 ± 0,08
279,6 ± 0,08
279,6 ± 0,08
174,3 ± 0,03
174,3 ± 0,03
174,3 ± 0,03
174,3 ± 0,03
7 dias
297,9 ± 0,07
271,9 ± 0,04
253,2 ± 0,08
228,8 ± 0,02
170,7 ± 0,02
173,8 ± 0,02
172,1 ± 0,0
169,0 ± 0,0
15 dias
257,1 ± 0,02
270,7 ± 0,08
259,4 ± 0,07
270,8 ± 0,08
172,3 ± 0,02
171,0 ± 0,02
175,9 ± 0,03
178,1 ± 0,03
30 dias
257,9 ± 0,04
257,9 ± 0,06
225,3 ± 0,02
268,3 ± 0,02
171,6 ± 0,02
169,9 ± 0,01
177,7 ± 0,02
175,5 ± 0,02
60 dias
249,0 ± 0,03
258,6 ± 0,06
248,7 ± 0,03
256,9 ± 0,01
166,0 ± 0,01
169,0 ± 0,03
169,8 ± 0,05
168,6 ± 0,01
90 dias
247,2 ± 0,06
272,6 ± 0,07
259,4 ± 0,02
248,6 ± 0,01
154,1 ± 0,01
165,2 ± 0,0
194,0 ± 0,04
198,5 ± 0,01
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
59
Com exceção da análise dos 60 dias em UV, a partir da primeira leitura, já houve
diferença significativa entre as duas formulações para todas as temperaturas analisadas,
mantendo-se assim até o final do experimento, conforme descrito na tabela 4.
Estudos contendo NC poliméricas realizados por Raffin e colaboradores (2003),
Friedrich e colaboradores (2008), Marchiori (2008) e Ferrony (2008) utilizando o mesmo
polímero PCL, também descrevem uma redução no tamanho das partículas durante o período
do experimento.
Os estudos de variação do tamanho de partícula em função do tempo é um dos
parâmetros que deve ser estudado em suspensões coloidais, pois qualquer mudança pode ser
indício de agregação das partículas e, consequentemente, sedimentação do sistema
(GUTERRES et al., 1995; CALVO et al., 1996).
Considera-se, desta forma, que apesar da diferença significativa no tamanho das
partículas entre as formulações estudadas, o diâmetro médio tanto para a suspensão NC-ADMiglyol® como para a NC-AD-Melaleuca encontram-se adequados.
4.3.3 Determinação do potencial zeta
Segundo Schaffazick e colaboradores (2003), os polímeros, fosfolipídios e poloxamers
constituintes das nanopartículas são os principais componentes das formulações capazes de
influenciar o potencial zeta.
No presente trabalho, os valores de potencial zeta obtidos em todas as formulações
foram negativos e encontram-se descritos na tabela 5.
60
Tabela 5: Valores referentes ao potencial zeta inicial e final das suspensões contendo NC-ADMiglyol® e NC-AD-Melaleuca.
NC-AD-Miglyol
®
NC-AD-Melaleuca
TA
GE
ES
UV
TA
GE
ES
UV
Inicial
-19±1,3
-19±1,3
-19±1,3
-19±1,3a
-18±0,8
-18±0,8
-18±0,8b
-18±0,8c
90 dias
-16±1,1
-16±1,0
-23±1,2
-32±1,4a
-16±0,6
-16±0,5
-25±0,7b
-25±0,8c
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
a, b, c
Houve diferença significativa (p<0,05) entre os tempos iniciais e finais para as temperaturas analisadas.
De acordo com a literatura, esses resultados encontram-se adequados para manter o
sistema estável, ou seja, com menor probabilidade de agregação das partículas e,
consequentemente, precipitação das nanoestruturas (PAESE, 2008).
Houve diferença significativa entre o valor inicial e final para a formulação NC-ADMiglyol® somente quando submetido à irradiação UV. Já para a suspensão NC-ADMelaleuca, a diferença significativa no valor de potencial zeta inicial e final foi observado
para as amostras armazenadas em ES e UV.
Müller e colaboradores (2000) descrevem a presença de cargas negativas para as
suspensões preparadas com PCL, justificando-se esse potencial pelos grupamentos ésteres
presentes no polímero. Schaffazick e colaboradores (2003) referem a carga negativa desses
sistemas sendo decorrente da presença de poli (ε-caprolactona) e dos tensoativos Span 60® e
Tween 80®.
Losa e colaboradores (1993) consideram que a natureza do óleo é o principal fator que
determina o potencial de superfície da partícula. Porém, no presente estudo, os valores de
potencial zeta não mudaram significativamente em função da natureza do núcleo oleoso
corroborando com estudos de Mosquera e colaboradores (2000) que avaliaram a influência da
natureza da fase oleosa utilizando Miglyol 810®, Miglyol 812®, Miglyol 829®, Miglyol 840®,
oleato de etila, óleo de soja, óleo mineral e dodecano. Os valores de potencial zeta não
mudaram de forma significativa em função do óleo utilizado, sugerindo que o óleo não está
61
localizado na interface, mas completamente encapsulado pelo polímero.
4.3.4 Análises de espalhamento múltiplo de luz
Segundo Mengual e colaboradores (1999) e Lemarchand e colaboradores (2003), a
maior vantagem na utilização do Turbiscan Lab® é a detecção dos fenômenos de instabilidade
em emulsões, suspensões ou espumas não diluídas, muito antes que esses fenômenos possam
ser detectados por observação visual do analista, especialmente no caso de sistemas opacos e
concentrados.
Paese (2008) relata que a identificação dos fenômenos de instabilidade que uma
amostra apresenta possibilita prever o comportamento da mesma frente a testes de
estabilidade convencionais (bancada e estufa), bem como determinar mudanças eficazes na
sua constituição quali-quantitativa para torná-la estável.
A figura 18 apresenta os gráficos referentes à variação de backscattering das
suspensões contendo NC de adapaleno. A parte esquerda do gráfico refere-se à base da cubeta
de análise e a direita ao topo. Os fenômenos de instabilidade, como cremagem, floculação,
sedimentação e coalescência são demonstrados na base, no topo ou no centro da cubeta,
observa-se o aumento ou a diminuição na variação de backscattering. As leituras foram
realizadas durante 1 hora e 30 minutos com análises de 5 em 5 minutos.
62
a)
b)
Figura 12: Variação do backscattering das suspensões NC-AD-Miglyol® (a)
e NC-AD-Melaleuca (b).
Através dos gráficos pode-se observar um aumento na variação do backscattering na
base das cubetas e uma diminuição do backscattering no topo, próximo ao menisco, indicando
fenômeno de migração de partículas do topo para a base das cubetas, sugerindo possível
fenômeno de sedimentação como descrito por Mengual e colaboradores (1999).
A suspensão contendo NC-AD-Miglyol® apresentou valor de backscattering superior
a 5% na base da cubeta, indicando uma tendência maior à desestabilização. Enquanto que a
formulação contendo NC-AD-Melaleuca teve seu sinal de backscattering inferior a 5% na
base, sendo esse resultado desprezado, indicando dessa forma não haver fenômenos
significativos de instabilidade. Isto também pode ser relacionado com o tamanho das
63
partículas em suspensão, pois partículas maiores (NC-AD-Miglyol®) tendem a sedimentar
mais rapidamente.
Diante desses resultados, onde os possíveis fenômenos de instabilidade são detectados
muito antes do que possam ser perceptíveis por observação visual, notou-se uma estabilidade
maior da suspensão com óleo de melaleuca a longo prazo, visto que, este estudo representa a
estabilidade em tempo real das suspensões contendo nanocápsulas.
Fenômenos detectados através da variação do diâmetro das partículas, como
floculação e coalescência, não foram observados nas análises por espalhamento múltiplo de
luz, condizendo com os resultados obtidos através das metodologias usuais para determinação
da estabilidade nestes sistemas.
4.4 DOSEAMENTO DO ADAPALENO
4.4.1 Construção da curva analítica para doseamento
A curva analítica tem como objetivo demonstrar que os resultados obtidos
experimentalmente são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra,
dentro de um intervalo específico (BRASIL, 2003).
A equação da reta foi obtida através de estudos de regressão linear, entre a
concentração de adapaleno e sua respectiva área, obtendo-se um coeficiente de correlação de
0,994, mostrando-se desta forma linear (anexo). A curva analítica do adapaleno apresentou
regressão linear significativa (p<0,05) não havendo desvio significativo de linearidade
(p>0,05). Os valores de DPR obtidos neste experimento foram todos inferiores ao limite
máximo aceitável de 5% (BRASIL, 2003).
De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a curva analítica pode ser
utilizada para a interpolação de valores experimentais, pois a ANVISA recomenda um
coeficiente de correlação igual ou maior que 0,99.
64
4.4.2 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais
Os testes realizados para o doseamento do ativo foram feitos com as suspensões
contendo NC de adapaleno com Miglyol® e óleo de melaleuca e com a nanodispersão. Para
isso, as formulações foram manipuladas em triplicata e submetidas à estabilidade acelerada de
3 meses em temperatura ambiente (- 25 0C), geladeira (-4 0C) e estufa (40 0C).
De acordo com os resultados da Tabela 6 e Figuras 13, 14 e 15, referente ao teor de
adapaleno nas diferentes suspensões, pode-se observar que, durante o período do experimento
(90 dias), houve uma diminuição do teor do ativo para todas as formulações.
65
Tabela 6: Teor de adapaleno na nanodispersão e nas suspensões contendo NC-AD- Miglyol e NC-AD-Melaleuca no período de 90 dias.
Nanodispersão
NC-AD-Miglyol
NC-AD-Melaleuca
TA
GE
ES
TA
GE
ES
TA
GE
ES
Inicial
102,8 ± 1,9*
102,8 ±
1,9*
102,8 ±
1,9*
105,5 ±
8,2*
105,5 ± 8,2*
105,5 ±
8,2*
105,3 ±
1,3*
105,3 ±
1,3*
105,3 ±
1,3*
7 dias
101,7 ± 1,3*
100,8 ± 4,0
100,3 ± 9,6
95,6 ± 1,1*
92,8 ± 9,7
88,2 ± 9,5
101,4 ±
2,5*
100,6 ± 2,4
99 ± 1,8
15 dias
97,8 ± 6,3
98,3 ± 4,5
94,8 ± 5,1*
93,4 ± 4,6
91,5 ± 1,1
83,7 ± 5,1*
99,5 ± 1,5
100 ± 1,2
96,1 ± 1,0*
30 dias
95,3 ± 1,4
95,2 ± 2,3
89,2 ± 1,1
89,4 ± 1,2
86,4 ± 1,4
82,3 ± 1,4
98,4 ± 1,3
95,1 ± 1,6
92,9 ± 1,7
60 dias
82,3 ± 1,6
85,3 ± 1,0
80 ± 6,1
82,7 ± 1,7
83,8 ± 1,6
77,5 ± 1,6
90,6 ± 8,3
88,3 ± 1,3
86,6 ± 7,9
90 dias
75,4 ± 9,0
82,1 ± 9,1
74,9 ± 1,4
81,5 ± 1,7
81,6 ± 1,1
74,6 ± 1,7
87,1 ± 6,3
85,1 ± 1,3
84,4 ± 1,0
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
*
Houve diferença significativa (p˂0,05) no teor de adapaleno entre as formulações estudadas para os respectivos tempos e temperaturas descritas.
66
A figura 13 descreve os resultados referentes ao teor de adapaleno na ND e nas
Concentração de Adapaleno (%)
suspensões contendo NC com Miglyol® e óleo de melaleuca em TA (24 °C).
120
110
100
90
80
70
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
Limite aceitável superior
Limite aceitável inferior
NC-AD-Miglyol
NC-AD-Melaleuca
Nanodispersão
Figura 13: Concentração de adapaleno em TA durante 90 dias de experimento para
Nanodispersão (
), NC-AD-Miglyol® (
) e NC-AD-Melaleuca (
).
O teor final de adapaleno em TA para a ND e NC-AD-Miglyol® foi de 75,4% e
81,5%, respectivamente. A temperatura ambiente apresentou os melhores resultados para a
suspensão NC-AD-Melaleuca, apresentando um teor final (90 dias) de 87,1%, permanecendo
mais estável nessa temperatura. Porém, segundo o Guia de Estabilidade da ANVISA
(BRASIL, 2004), estes valores encontram-se abaixo dos limites inferiores aceitáveis para o
teor do ativo, sendo estes entre 90 e 110%.
A figura 14 descreve os resultados referentes ao teor de adapaleno na ND e nas
Concentração de Adapaleno (%)
suspensões contendo NC com Miglyol® e óleo de melaleuca em GE (-4 °C).
120
110
100
90
80
70
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
Limite aceitável superior
Limite aceitável inferior
NC-AD-Miglyol
NC-AD-Melaleuca
Nanodispersão
Figura 14: Concentração de adapaleno em GE durante 90 dias de experimento para
Nanodispersão (
), NC-AD-Miglyol® (
) e NC-AD-Melaleuca (
).
67
Observa-se através da figura 14, que a temperatura de -4 °C foi a temperatura onde as
nanodispersões e a suspensão NC-AD-Miglyol® permaneceram mais estáveis, apresentando
um teor final de 82,1% e 81,6%, respectivamente.
A figura 15 descreve os resultados referentes ao teor de adapaleno na ND e nas
Concentração de Adapaleno (%)
suspensões contendo NC com Miglyol® e óleo de melaleuca em estufa (40 °C).
120
110
100
90
80
70
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
Limite aceitável superior
Limite aceitável inferior
NC-AD-Miglyol
NC-AD-Melaleuca
Nanodispersão
Figura 15: Concentração de adapaleno em ES durante 90 dias de experimento para
Nanodispersão (
), NC-AD-Miglyol® (
) e NC-AD-Melaleuca (
).
Os teores mais baixos para todas as formulações estudadas foram observadas quando
as amostras ficaram armazenadas em ES. Os teores finais observados para a ND, NC-ADMiglyol® e NC-AD-Melaleuca foram 74,9%, 74,6% e 84,4%, respectivamente.
Ainda nesse contexto, a ND apresentou um teor abaixo de 90% a partir dos 60 dias
(em GE), a NC-AD-Miglyol® teve esse teor abaixo do limite inferior aceitável a partir dos 30
dias (em GE) enquanto a suspensão NC-AD-Melaleuca teve seu teor abaixo deste limite,
somente a partir dos 90 dias (em TA). De acordo com estes resultados, supõe-se que as NC
contendo óleo de melaleuca como núcleo oleoso, proteja o adapaleno da degradação por um
período maior de tempo.
4.4.3 Taxa de associação
Também denominada de eficiência de encapsulação, a taxa de associação é um
parâmetro indispensável na caracterização físico-química das suspensões, visto que através
dela é possível determinar quanto de fármaco foi encapsulado pelo polímero, sendo este um
dos pontos principais quando se trabalha com fármacos nanoestruturados (SCHAFFAZICK et
68
al., 2003; BOCHI, 2010).
No presente estudo os valores máximos obtidos de encapsulação para a suspensão
contendo NC-AD-Miglyol® foi 84,1% e para a suspensão NC-AD-Melaleuca foi de 95,4%,
sendo esses valores considerados eficazes para encapsulação de ativos.
A taxa de associação está relacionada principalmente com a solubilidade do fármaco
no óleo (FRESTA et al., 1995; FELIPPI, 2008), ou seja, com a lipofilicidade do ativo em
estudo. O adapaleno possui um valor de Log P alto (Log P = 8,6), logo, apresenta maior
afinidade pela fase orgânica. Estudos com objetivo de determinar a taxa de associação são
realizados pois indicam a capacidade de encapsulação do ativo pelo sistema. Por apresentar
uma maior solubilidade do adapaleno em óleo de melaleuca observou-se um valor superior de
fármaco encapsulado para este óleo quando comparado ao Miglyol®.
De acordo com dados relatados na literatura, dependendo do fármaco utilizado,
diferentes taxas de associação são obtidas. Em estudos realizados por Khoee e Yaghoobian
(2009) com a penicilina-G, observou-se uma taxa de encapsulação de 76% do ativo. Moraes e
colaboradores (2009) em outro estudo com a benzocaína, obtiveram uma eficiência máxima
de encapsulação menor ainda, de 72% do ativo. Já a taxa de associação determinada por
Fonseca e colaboradores (2008) em trabalho realizado com NC de diclofenaco foi 97%.
As características físico-químicas do fármaco (GUTERRES et al., 1995; CALVO et
al., 1996;), o pH do meio (BRASSEUR et al., 1991; GOVENDER et al., 1999;
FERNÁNDEZ-URRUSUNO et al., 1999; WEISS, 2001), as características da superfície das
partículas ou a natureza do polímero (VILA et al., 2002), a quantidade de fármaco adicionada
à formulação (BRASSEUR et al., 1991), a ordem de adição do fármaco na formulação, a
natureza do óleo utilizado (LOSA et al., 1993) e o tipo de tensoativo adsorvido à superfície
polimérica (MARCHAL-HEUSSLER et al., 1990; FONTANA et al., 1998) são alguns dos
fatores que podem influenciar a quantidade de ativo associado aos sistemas nanoestruturados.
4.5 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE DEGRADAÇÃO
Através do ajuste de curvas dos perfis cinéticos, o perfil de degradação do adapaleno,
para as formulações em estudo (nanodispersão, NC-AD-Miglyol® e NC-AD-melaleuca) foi
avaliado baseado no cálculo onde o tempo em que 90% da concentração original do fármaco
foi degradado (t90). A determinação foi considerada seguindo cinética de ordem zero.
69
Conforme os cálculos de t90, observou-se uma nítida vantagem da forma
nanoencapsulada com óleo de melaleuca, sendo o tempo para que a degradação de 90% do
adapaleno ocorresse em 175 dias, superior às demais formulações. Para a suspensão com
Miglyol®, esse mesmo tempo de degradação foi estipulado em 128 dias e para a
nanodispersão, foi de 52 dias, havendo diferença estatística significativa (p≤0,05) para a
determinação do prazo de validade entre as três formulações estudadas.
Através desses dados, observa-se que a suspensão contendo NC-AD-Melaleuca
aumentou a estabilidade do adapaleno em 26,8% com relação à suspensão contendo NC-ADMiglyol® e em 70,2% com relação à nanodispersão, demonstrando, dessa forma, uma boa
estabilidade da suspensão coloidal com óleo de melaleuca.
De acordo com as características físico-químicas apresentadas pelas três formulações
em estudo, pode-se concluir que as NC juntamente com o óleo de melaleuca estão evitando a
degradação do fármaco por um período superior de tempo, podendo-se sugerir que esta
combinação esteja desempenhando um papel de proteção para o adapaleno maior do que para
a suspensão NC-AD-Miglyol® ou para a nanodispersão.
4.6 ESTUDOS DE LIBERAÇÃO IN VITRO
4.6.1 Construção da curva analítica para realização dos estudos de liberação
A equação da reta foi obtida através de estudos de regressão linear, entre a
concentração de adapaleno e sua respectiva área, obtendo-se um coeficiente de correlação de
0,9995 (figura 16).
800
700
600
Área
500
400
300
y = 187,16x - 17,873
R² = 0,9995
200
100
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Concentração (μg/mL)
Figura 16: Curva de calibração do adapaleno obtida por CLAE
70
Através da análise de variância (ANOVA), os valores obtidos foram tratados
estatisticamente e a curva analítica do adapaleno apresentou regressão linear significativa
(p<0,05) não havendo desvio significativo de linearidade (p>0,05).
4.6.2 Análises dos resultados de liberação
Diversos artigos, assim como guias do FDA, preconizam o uso de células de difusão
como a célula de Franz, equipada com membrana sintética de acetato de celulose para
determinar a liberação in vitro de formulações tópicas, como em cremes, géis, loções e
sistemas transdérmicos (DOUCET et al., 1998; SHAH et al., 1998; CLEMENT et al., 2000).
As membranas sintéticas são amplamente empregadas em estudos de liberação in vitro
e são recomendadas pelo FDA (U.S FDA/CDER, 1997) por atenderem à diversas exigências,
como não reagir com a formulação ou o meio receptor, serem permeáveis ao fármaco e não
serem determinantes da taxa de liberação (SHAH et al., 1998).
Segundo Clement e colaboradores (2000), a célula de difusão tipo Franz é um dos
métodos mais utilizados para realizar estudos de difusão e permeação de substâncias através
da pele.
No presente estudo, foram utilizadas células de difusão tipo Franz, mantidas a 37° C
em banho termostatizado, com agitação constante do meio receptor. A solução receptora de
tampão fosfato pH 6,4 seguiu metodologia descrita por Jain e Ahmed (2007). O volume e a
área difusional do compartimento receptor corresponderam a 6,0 mL e a 3,14 cm2
respectivamente. A manutenção das condições de sink, nas células de fluxo, foi respeitado
para garantir a obtenção de resultados efetivos. Essa condição sink é fundamental para a
realização de análises matemáticas da liberação, uma vez que as equações de difusão tornamse de difícil resolução em condições de acúmulo do ativo no meio de dissolução
(WASHINGTON, 1990; COLOMÉ, 2006). No presente estudo, utilizou-se concentração bem
abaixo dos 10% de saturação máxima da solução receptora, que foi de 1,2 mg.
A taxa de liberação de um fármaco a partir de determinada formulação depende
diretamente das características físico-químicas do veículo e do fármaco (SANTOYO et al,
1996). A composição do veículo em formulações tópicas influencia a liberação do ativo,
alterando a permeabilidade do estrato córneo ou aumentando a atividade termodinâmica do
ativo (MOSER et al., 2001).
71
As leituras foram realizadas através de CLAE e os resultados obtidos (em área) foram
plotados frente a uma curva analítica correspondendo a concentrações de 0,5, 1, 2, 3 e
4 µg/mL.
A tabela 7 descreve os resultados referentes ao fluxo, concentração total liberada de
adapaleno, coeficiente de regressão e coeficiente de permeabilidade (Kp) nas diferentes
formulações testadas: nanocápsulas de adapaleno com Miglyol® (NC-AD-Miglyol®),
nanocápsulas de adapaleno com óleo de melaleuca (NC-AD-Melaleuca) e nanodispersão
(ND).
Tabela 7: Valores referentes ao fluxo e à concentração total liberada de adapaleno para a
forma nanoencapsulada e para a forma nanodispersa (n = 5).
Formulação
NC-ADMiglyol
®
NC-ADMelaleuca
ND
*
Fluxo
(µg/cm2/h)
Concentração
em 6h
(µg/cm2)*
Concentração
total (µg/cm2)**
Coeficiente de
regressão (r2)
Kp
(cm2/h)
2,74
14,70 ± 5,51
20,93 ± 5,9
0,99
1,8x10-2
1,50
8,54 ± 2,88
13,58 ± 4,9
0,98
1,0x10-2
2,62
14,52 ± 1,74
17,63 ± 2,2
0,96
1,7x10-2
Concentração liberada em 6 horas.
Concentração total liberada até atingir o nível linear platô (46 horas).
**
Na tabela 7 pode-se observar os resultados de coeficiente de permeabilidade (Kp) para
as três formulações estudadas. Observa-se uma quantidade maior de fármaco difundida pela
membrana em função do tempo para a suspensão NC-AD-Miglyol® (Kp = 1,8x10-2), enquanto
para a suspensão NC-AD-Melaleuca o valor de Kp foi 1,0x10-2.
De acordo com os estudos realizados, observou-se que a membrana artificial de
acetato de celulose foi adequada para a realização dos estudos de liberação in vitro. Isto pode
ser justificado analisando-se os valores de regressão linear para as formulações, o qual
apresentou-se em torno de 0,98 (tabela 7).
Pode-se verificar ainda, que o fluxo determinado através da quantidade de fármaco
detectado na solução receptora em função da área e do tempo foi de 2,74 µg/cm2/h para o
72
adapaleno nanoencapsulado com Miglyol®. Para o adapaleno com óleo de melaleuca, o fluxo
foi de 1,50 µg/cm2/h (tabela 7). Já para a nanodispersão, foi de 2,62 µg/cm2/h. Houve
diferença significativa entre as três formulações estudadas, porém não foi observada essa
diferença entre a suspensão NC-AD-Miglyol® e a ND.
Com relação à concentração total liberada em 6 horas (tabela 7), observa-se que o
adapaleno nanoencapsulado com Miglyol® apresentou uma liberação maior do veículo
(14,70µg/cm2) quando comparado com a nanodispersão (14,52 µg/cm2) e com o adapaleno
nanoencapsulado com óleo de melaleuca (8,54µg/cm2). Houve diferença significativa
(p<0,05) entre as formas nanodispersa e a nanoencapsulada com óleo de melaleuca. Esses
resultados sugerem que o adapaleno quando encapsulado com óleo de melaleuca apresenta
uma liberação mais lenta.
Pode-se observar através destes dados, que houve diferença significativa (p<0,05) para
os valores de fluxo entre a formulação nanodispersa e a suspensão contendo NC-ADMelaleuca. Entre as demais formulações, não foi observado diferença significativa para os
valores de fluxo.
As formulações foram analisadas até atingirem um platô que correspondeu ao fim do
experimento. Esse platô foi observado para as três formulações a partir da décima leitura, ou
seja, após 10 horas de experimento.
Liberação Adapaleno
Concentração (µg/cm 2)
25
20
15
NC-AD-Miglyol
10
NC-AD-Melaleuca
5
Nanodispersão
0
0
10
20
30
40
50
Tempo (horas)
Figura 17: Perfil de liberação da Nanodispersão (
e NC-AD-Melaleuca (
), NC-AD-Miglyol® ( )
) até atingirem o platô (46 horas).
Com relação à concentração total liberada durante as 46 horas de experimento
73
(tabela 7), observa-se que o adapaleno nanoencapsulado com óleo de melaleuca continuou
apresentando uma liberação menor do veículo (13,58 µg/cm2) quando comparado com a
nanodispersão (17,63 µg/cm2) e com o adapaleno nanoencapsulado com Miglyol® (20,93
µg/cm2). Esses resultados reafirmam que, baseado no comportamento dessa formulação
contendo óleo de melaleuca como núcleo oleoso, pode-se prever possivelmente um
comportamento de liberação prolongada ou modificada para este tipo de preparação. Com
relação à análise estatística, foi observado uma diferença significativa entre as três
formulações estudadas, porém essa diferença entre a suspensão NC-AD-Miglyol® e a forma
nanodispersa não foi significativa.
Ferranti e colaboradores (1999) realizaram estudos de liberação in vitro com NC de
primidona, um anticonvulsivante. Neste experimento, o perfil de liberação foi avaliado em
meio gástrico (pH 1,25) e intestinal (pH 7,4), sendo comparado os perfis de liberação entre o
fármaco livre e o nanoencapsulado. Os autores verificaram, que após 8 horas de experimento,
100% da primidona na forma livre foi difundida, enquanto que o mesmo fármaco na forma
nanoencapsulada liberou 76% em meio básico e 83% em meio ácido.
Com os resultados obtidos no presente estudo, pode-se observar que cada formulação
apresenta um mecanismo de liberação conforme as interações físico-químicas apresentadas no
sistema e/ou com a membrana sintética.
4.7 AJUSTE DE CURVAS DOS PERFIS CINÉTICOS
Diferentes comportamentos cinéticos são esperados para um fármaco dissolvido no
núcleo oleoso da nanocápsula ou simplesmente retido ou adsorvido em sua parede polimérica
(SOARES, 2003). As informações obtidas através da caracterização físico-química dos
sistemas nanoparticulados podem levar a proposição de modelos, que descrevam a
organização molecular destes sistemas, bem como a elucidação do mecanismo de associação
dos fármacos a estas nanocápsulas (SCHAFFAZICK et al., 2003).
A partir dos resultados obtidos na liberação in vitro, foi realizado um estudo
comparativo entre a ND, NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca baseados no ajuste de curvas
dos perfis cinéticos segundo os modelos monoexponencial (fornece uma constante cinética
para o processo) e biexponencial (constituído de duas constantes cinéticas).
Seguindo metodologia adaptada de Cruz (2005), o ajuste de curvas foi realizado para
74
os pontos experimentais até a décima hora de experimento para todas as formulações. A ND e
a
formulação
NC-AD-Miglyol®
foram
adequadamente
descritas
pelo
modelo
monoexponencial, enquanto a formulação NC-AD-Melaleuca obteve um melhor ajuste
gráfico para o modelo biexponencial. Para a escolha do modelo matemático adequado aos
pontos experimentais foram observados os melhores ajustes gráficos, os maiores coeficientes
de correlação e os valores de critério de seleção do modelo (MSC). Os perfis de liberação
foram construídos plotando-se a concentração de adapaleno liberada em função do tempo.
Através do programa Micromath Scientist®, foram obtidos as constantes apresentadas
nas tabelas 8 e 9. O ajuste de curvas forneceu a constante cinética do processo K = 0,196 h-1 e
um coeficiente de correlação R = 0,98 para a ND enquanto para a formulação NC-ADMiglyol® os valores obtidos foram K = 0,082 h-1 e R = 0,99.
Tabela 8: Modelagem cinética dos perfis de liberação da nanodispersão e da suspensão
contendo NC-AD-Miglyol® assumindo cinética monoexponencial.
Formulação
T½ (horas)
K (h-1)
MSC
R
Nanodispersão
3,53
0,196
2,98
0,98
NC-AD-Miglyol®
8,43
0,082
3,55
0,99
O ajuste dos pontos experimentais ao modelo monoexponencial calculado é
apresentado na figura 18.
a)
b)
Figura 18: Modelagem monoexponencial da nanodispersão (a) e da NC-AD-Miglyol® (b).
75
Tabela 9: Modelagem cinética monoexponencial e biexponencial do perfil de liberação da
suspensão contendo NC-AD-Melaleuca.
Monoexponencial
t½ (horas)
K (h-1)
MSC
R
NC-AD-Melaleuca
11,53
0,06
4,89
0,99
Biexponencial
NC-ADMelaleuca
A
(%)
7,0
α
(h-1)
0,17
T½, α
(horas)
4,07
B
(%)
93,0
β
(h-1)
0,003
t½, β
(horas)
230,6
MSC
R
8,51
0,99
Baseado nestes valores é possível observar que quando à nanodispersão não foi
adicionado polímero, o tempo de meia vida foi muito inferior às outras que possuíam essa
barreira polimérica. Desse modo, pode-se concluir que o revestimento do polímero nas NC
exerceu função importante no processo de liberação. Cruz (2005) realizou estudos avaliando
os perfis cinéticos de hidrólise do éster etílico de indometacina associado à nanocápsulas,
nanoesferas e nanoemulsão. A fase de liberação rápida apresentou tempos de meia-vida de
5,9; 4,4 e 2,7 minutos para nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão e a fase de liberação
sustentada apresentou tempos de meia-vida de 288; 87, e 147 minutos, respectivamente.
Comparando os resultados, observa-se que as NC apresentaram os maiores tempos de meiavida para o éster etílico de indometacina associado aos nanocarreadores.
O modelo biexponencial para a suspensão contendo NC-AD-Melaleuca apresentou
valores de α = 0,17 h-1, β = 0,003 h-1, MSC = 8,51 e R = 0,99, sendo esses, superiores aos
obtidos pelo modelo monoexponencial. Pela comparação desses valores e da análise gráfica
dos ajustes, o modelo escolhido para descrever matematicamente a liberação da NC-ADMelaleuca foi o biexponencial. A análise gráfica dos ajustes para os modelos
monoexponencial e biexponencial encontram-se demonstrados na figura 19.
76
a)
b)
Figura 19: Modelagem monoexponencial (a) e biexponencial (b) da NC-AD-Melaleuca.
Em uma modelagem biexponencial de perfil de liberação, o primeiro termo da
equação representa a fase de liberação rápida do fármaco, também chamada de burst. Durante
essa fase, o adapaleno que foi liberado encontrava-se localizado mais externamente nas
nanocápsulas. O segundo termo da equação corresponde à fase sustentada, que representa a
fase de liberação lenta e descreve a liberação do adapaleno que se encontra dissolvido no
núcleo oleoso.
De acordo com estudos de solubilidade realizados, o adapaleno apresentou uma
solubilidade de 0,36 mg/mL no Miglyol® e 1,59 mg/mL no óleo de melaleuca. Observa-se,
portanto, que o adapaleno é 4 vezes mais solúvel no óleo de melaleuca quando comparado ao
Miglyol.
Baseado nos dados obtidos pelo programa Micromath Scientist® pode-se concluir que
as formulações apresentaram ajustes de curvas diferentes. O adapaleno na formulação NCAD-Miglyol® encontra-se, em grande parte, localizado mais externamente nas NC,
reafirmando os estudos da liberação in vitro, onde essa formulação promove uma liberação
inicial mais rápida, assumindo uma modelagem matemática monoexponencial. Em
contrapartida, na formulação NC-AD-Melaleuca, o fármaco encontra-se, em maior parte,
dissolvido no núcleo oleoso da NC, ocorrendo uma liberação inicial rápida de apenas 7%,
correspondendo ao adapaleno que estava adsorvido na parede polimérica. A parte
correspondente ao fármaco encapsulado no núcleo oleoso foi de 93%. Desta forma, observase que a solubilidade do fármaco no óleo foi um parâmetro fundamental para obtenção de uma
formulação com liberação sustentada.
Corroborando desta forma com estudos realizados por Cruz (2005), que através dos
77
parâmetros A (quantidade de fármaco degradado na velocidade α) e B (quantidade de fármaco
degradado na velocidade β), pôde-se concluir que 5 a 15% de éster etílico de indometacina
estava adsorvido na superfície polimérica e que a maior parte do éster, de 85 a 95%,
permaneceu retido no núcleo oleoso das NC.
4.8 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES FRENTE À EXPOSIÇÃO À
RADIAÇÃO UVA
A estabilidade das suspensões contendo NC de adapaleno com Miglyol® e óleo de
melaleuca como núcleo oleoso foram avaliados frente à luz UVA durante 90 dias.
A figura 20 representa os perfis de fotodegradação em função do tempo e as
concentrações em porcentagens encontram-se na tabela 10.
Exposição frente à luz UVA
120
Concentração (%)
100
80
60
40
NC Miglyol
20
NC Melaleuca
0
0
7
15
30
60
90
Tempo (dias)
Figura 20: Teor de adapaleno em NC-AD-Miglyol® e NC-AD-Melaleuca em função
do tempo sob exposição à luz UVA.
Na figura 20 pode ser observado uma diminuição da concentração de adapaleno em
função do tempo para ambas as suspensões. Porém, na tabela 10, é possível observar que as
NC contendo óleo de melaleuca aumentaram o efeito fotoestabilizador em relação às NC
contendo Miglyol®.
78
Tabela 10: Percentuais equivalentes às concentrações de adapaleno em UV em função do
tempo após irradiação UVA.
0
NC-AD-Miglyol®
Teor ± DP
105,5 ± 8,2
NC-AD-Melaleuca
Teor ± DP
105,3 ± 1,3
7
92,4 ± 1,4
96,7 ± 1,0
15
92,3 ± 1,2
92,7 ± 3,8
30
76,4 ± 5,8
92,0 ± 8,3
60
62,5 ± 3,1
84,4 ±1,7
90
59,6 ± 5,1
80,7 ± 1,3
Dias
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão.
Nos primeiros 15 dias de experimento, o conteúdo do ativo se manteve acima de 90%
para ambas as suspensões. A avaliação das formulações no trigésimo dia de experimento
apresentou um perfil de fotodegradação significativo, tendo a formulação com Miglyol® uma
queda bastante expressiva no seu teor (76,4%) com relação ao seu teor inicial (105,5%).
A suspensão com óleo de melaleuca manteve o teor de adapaleno da fotodegradação
por um período maior, sendo observado um decaimento abaixo de 90% somente na leitura dos
60 dias.
O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho demonstra que a suspensão contendo
nanocápsulas de adapaleno com óleo de melaleuca são sistemas promissores para a
incorporação em formas farmacêuticas semissólidas, porém, apesar da viabilidade tecnológica
desta formulação, estudos mais aprofundados quanto a estabilidade após incorporação em gel,
estudos de permeação e biometria cutânea tornam-se necessários.
79
5 CONCLUSÕES
Considerando os objetivos propostos neste trabalho e analisando-se os resultados
obtidos, é possível obter algumas conclusões em relação ao estudo realizado:
A nanoencapsulação do adapaleno a partir da técnica de deposição do polímero préformado mostrou-se viável mediante o emprego de PCL como polímero, óleo de melaleuca e
Miglyol® como núcleo oleoso.
As suspensões contendo NC de adapaleno apresentaram pH ácido, diâmetro de
partícula inferior a 300 nm, índice de polidispersão menor que 0,3 e potencial zeta entre
-19 mV e -22 mV.
A taxa de associação da formulação NC-AD-Melaleuca foi superior à NC-ADMiglyol®, com 95,4% e 84,1%, respectivamente.
A formulação NC-AD-Melaleuca apresentou teor abaixo de 90% em TA após 90 dias
de análise, a nanodispersão após 60 dias de experimento, enquanto a NC-AD-Miglyol® teve
seu teor abaixo de 90% nos primeiros 30 dias de análise. Pode-se concluir, dessa forma, que
as nanocápsulas com óleo de melaleuca estariam exercendo um efeito estabilizante maior.
A incorporação do fármaco na forma nanoencapsulada modificou os parâmetros de
liberação com relação ao fluxo e à concentração total de adapaleno liberada. A suspensão
contendo NC-AD-Melaleuca apresentou concentração total e fluxo de liberação menor que a
nanodispersão e a suspensão com Miglyol®, sugerindo desta forma, uma liberação mais
controlada do ativo.
O perfil de degradação estimado para a suspensão contendo óleo de melaleuca como
núcleo oleoso foi de 175 dias, enquanto para a suspensão NC-AD-Miglyol® foi 128 dias e
para a nanodispersão foi 52 dias.
O ajuste de curvas da nanodispersão e da formulação NC-AD-Miglyol® mostrou um
perfil cinético ao modelo monoexponencial enquanto para a formulação NC-AD-Melaleuca o
modelo selecionado foi biexponencial.
80
O tempo de meia vida da NC-AD-Melaleuca apresentou uma fase de liberação rápida
de 4,07 horas e uma fase de liberação sustentada de 230,6 horas. Enquanto a nanodispersão
apresentou uma meia vida de 3,53 horas e a NC-AD-Miglyol® de 8,43 horas.
O adapaleno na NC-AD-Miglyol® apresentou-se localizado mais externamente na
nanocápsula, enquanto a NC-AD-Melaleuca apresentou 93% do ativo encapsulado no núcleo
oleoso da nanocápsula.
Quando expostos à radiação UVA, as suspensões contendo NC de adapaleno tiveram
uma queda do teor do ativo em função do tempo, porém, a suspensão com óleo de melaleuca
produziu um efeito fotoestabilizador maior, protegendo o ativo da degradação.
Conforme análises de espalhamento múltiplo de luz, as suspensões apresentaram
possíveis fenômenos de sedimentação a longo prazo, porém a formulação com Miglyol®
apresentou uma tendência maior a desestabilização que a formulação com óleo de melaleuca.
A validação da metodologia apresentou resultados satisfatórios para todos os
parâmetros analisados, demonstrando que o método de doseamento do adapaleno pela técnica
de cromatografia líquida de alta eficiência é válido e pode ser reprodutível.
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ANEXOS
97
ANEXO 1 - Validação da metodologia analítica para doseamento do adapaleno em
suspensões de nanocápsulas
Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e
interpretáveis sobre a amostra, ele deve passar por um processo de avaliação denominada
validação (RIBANI et al., 2004).
Segundo a ANVISA (2003) a validação deve garantir, através de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados.
A validação analítica seguiu critérios estabelecidos pelo Guia para Validação de
Métodos Analíticos e Bioanalíticos da ANVISA e os parâmetros avaliados foram linearidade,
precisão intermediária, repetibilidade, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação.
A quantificação do adapaleno nas suspensões de nanocápsulas foi adaptado de Jee e
colaboradores (2006) e realizado utilizando CLAE e as condições cromatográficas usadas
estão descritas na tabela 11.
Tabela 11: Condições cromatográficas usadas na quantificação do adapaleno em suspensões
contendo NC.
Característica
Coluna
Descrição
Coluna cromatográfica – Lichropher® 100 RP – 18,250
mm, 4,0 mm, 5 µm - Merck®
Pré-coluna
Mesmo material da coluna Lichropher®- Merck®
Fluxo
1,0 mL/min
Volume de injeção
20 µL
Detecção
254 λ
Fase móvel
Equipamento
Metanol:água:ácido fosfórico (95:5, v/v), pH 3,0. A fase
móvel foi filtrada em membranas de polivinilideno (0,45
µm Millipore®).
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência – CLAE –
Cromatógrafo líquido YL – Clarity, modelo YL9100
CLAE System, equipado com bomba modelo YL9110,
detector com comprimento de onda variável UV/VIS
modelo 9160
98
1 Especificidade
A especificidade avalia o grau de interferência de espécies como outro ingrediente
ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de
propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A especificidade garante que
o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se esta não for assegurada, a
linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas (RIBANI et al., 2004),.
A especificidade do método analítico para avaliação do adapaleno em suspensão foi
feita doseando-se o ativo em ACN e THF, sendo posteriormente, filtrado em membrana de
0,45 µm. Os cromatogramas resultantes encontram-se na figura 21.
Figura 21: Cromatograma da suspensão branca (a) e da suspensão contendo NC de adapaleno (b).
Desta forma, foi possível verificar que o método analítico foi específico para este tipo
de análise e encontram-se em concordância com as especificações oficiais.
2 Linearidade
Segundo o ICH (1996), a linearidade corresponde à capacidade do método em
fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro
de uma determinada faixa de aplicação.
99
Na tabela 12 estão descritas as médias das áreas correspondentes a concentração de
adapaleno, referentes a cada uma das diluições de matéria-prima. Foram preparadas três
curvas de calibração, em três dias diferentes e com leituras em triplicata, nas cinco
concentrações descritas na tabela abaixo.
Tabela 12: Média das áreas referente às diferentes concentrações de adapaleno para
elaboração da curva de calibração por CLAE.
Concentração (µg/mL)
Áreas
Média ± DP
DPR (%)
10 µg/mL
593144,7
600639,3
605943,7
59990 ± 64306
1,07
15 µg/mL
966268,3
956096
1024568
98231 ± 36947
3,07
20 µg/mL
1324030
1400982
1430559
13851 ± 54992
3,97
25 µg/mL
1707713
1775444
1784540
17558 ± 41977
2,39
30 µg/mL
1973942
1982864
2073146
20099 ± 54881
2,73
Valores representam a média de três formulações ± desvio padrão.
A equação da reta foi obtida através de estudos de regressão linear, entre a
concentração de adapaleno e sua respectiva área, obtendo-se um coeficiente de correlação de
0,994, mostrando-se desta forma linear (figura 22).
Figura 22: Curva de calibração do adapaleno obtida por CLAE
Segundo a ANVISA (2003) e o ICH (1996), a partir dos dados obtidos, conclui-se que
a curva analítica pode ser utilizada para a interpolação de valores experimentais, pois
apresenta um coeficiente de correlação maior que 0,99.
100
3 Precisão intermediária e Repetibilidade
Segundo Ribani e colaboradores (2004) a precisão intermediária (precisão
intercorrida) é reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um
único laboratório e, como tal, mais aconselhável de ser adotada. Tem como objetivo verificar
se no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados, porém em dias diferentes.
Já a repetibilidade, também chamada de precisão intracorrida, é a concordância entre
os resultados, dentro de um curto período de tempo sob as mesmas condições de medição:
mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo instrumento e mesmo local (BRASIL, 2003).
A precisão foi avaliada através da repetibilidade por doseamento do adapaleno na
concentração de trabalho correspondente a 20 µg/mL em um único dia (n = 6) e através da
precisão intermediária com determinações de três concentrações de trabalho (10 µg/mL,
20 µg/mL e 30 µg/mL), com analistas diferentes e em dias diferentes. Os resultados obtidos
encontram-se descritos na tabela 13 e 14.
Tabela 13: Valores experimentais obtidos para o ensaio de repetibilidade para a quantificação
do adapaleno em CLAE (n = 6).
Repetições
Teor (%)
Média ± DP
DPR (%)
N1
98,4
1325029 ± 8250,8
0,6
N2
106,9
1445801 ± 5110,1
0,3
N3
103,8
1401482 ± 3366,6
0,2
N4
98,3
1323548 ± 6597,3
4,9
N5
103,8
1401895 ± 7017,9
0,5
N6
98,2
132200 ± 4012,6
3,0
101
Tabela 14: Valores experimentais para o ensaio de precisão intermediária obtidos por
analistas diferentes para a quantificação do adapaleno em CLAE (n = 3).
Dia
1º
dia
Concentração de
Trabalho
(µg/mL)
10 µg/mL
20 µg/mL
30 µg/mL
10 µg/mL
20 µg/mL
30 µg/mL
2º
dia
Analista 1
Teor da amostra
(µg/mL)
(%)
9,8
98,4
19,8
99,4
29,6
98,8
10,6
20,1
31,1
106,4
100,6
103,8
Analista 2
Teor da amostra
(µg/mL)
(%)
9,5
95,5
21,1
105,8
27,7
92,4
10,0
19,8
29,1
100,3
99,1
97,1
Média
do dia
±DP (%)
DPR
do dia
(%)
98,4
±4,4
4,5
101,2
±3,3
3,2
Tanto para os estudos de precisão intermediária como para repetibilidade, os valores
de DPR (%) foram inferiores a 5%, como preconiza a RE nº. 899. Estes resultados
demonstram que o método possui precisão e repetibilidade adequadas para a quantificação do
adapaleno em CLAE.
4 Exatidão
Corresponde à proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo, em relação
a um valor de referência, aceito como verdadeiro (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004).
A exatidão foi determinada através do teste de recuperação, adicionando-se uma
quantidade conhecida de fármaco à solução amostra resultando nas concentrações 10, 15, 20,
25 e 30 µg/mL. Os limites preconizados pelo ICH (1996) são de 98% a 102%.
Os resultados percentuais obtidos de adapaleno recuperados a partir das soluções
amostra encontram-se dispostos na tabela 15.
102
Tabela 15: Valores experimentais obtidos para o teste de exatidão do adapaleno.
Concentração Teórica (µg/mL)
Concentração Recuperada (µg/mL)
Recuperação (%)
Miglyol®
Melaleuca
Miglyol®
Melaleuca
10 µg/mL
9,8
9,9
98,0
99,1
15 µg/mL
14,9
15,2
99,5
101,4
20 µg/mL
20,1
20,1
100,9
100,7
25 µg/mL
25,2
25,4
100,9
101,9
30 µg/mL
30,3
30,4
101,2
101,4
Os valores descritos na tabela 15 foram satisfatórios, pois todas as percentagens de
recuperação, tanto para a suspensão com Miglyol® como para a suspensão com óleo de
melaleuca ficaram dentro do limite estabelecido pelo ICH. Com isso, pode-se dizer que o
método possui uma boa exatidão e uma recuperação adequada.
5 Limite de Detecção e Limite de quantificação
Limite de detecção é a menor concentração da substância analisada que pode ser
detectada, mas não necessariamente quantificada.
Limite de quantificação representa a menor concentração da substância em análise que
pode ser medida utilizando um procedimento experimental.
Foram calculados através da relação entre desvio padrão da curva de calibração e sua
inclinação, usando o fator multiplicador sugerido pela norma ICH (1996):
LD =
DP
×3
IC
LQ =
DP
× 10
IC
onde: LD = limite de detecção;
LQ = limite de quantificação;
DP = desvio padrão da reta de calibração;
IC = inclinação da curva de calibração.
Os valores obtidos foram 0,11 µg/mL para o limite de detecção e 0,37 µg/mL para o
de quantificação, isto indica uma boa sensibilidade do método.
103
ANEXO 2 - Análise de variância dos valores obtidos da curva analítica do adapaleno
Os valores obtidos foram tratados estatisticamente, através da análise de variância
(ANOVA) e encontram-se descritos nas tabelas 16 e 17.
Tabela 16: Análise de variância (ANOVA) dos valores correspondente as áreas obtidas na
determinação da curva analítica do adapaleno para validação.
Fonte de Variação
Entre amostras
gl
4
Soma dos
Quadrado
Quadrados
Médio
3898040595,33
9745101487,83
317,61323*
4,53
*
5,99
F.calculado
Regressão linear
1
3874485125,63
3874485125,63
1262,7757
Desvio de linearidade
3
2355546929,69
7851823309,89
2,55907**
Resíduo
6
1840937459,44
3068229099,07
Total
14
3,91645E+12
F.tabelado
4,76
* Significativo (p < 0,05);
** Não significativo (p > 0,05).
Tabela 17: Análise de variância (ANOVA) correspondente as áreas obtidas na determinação
da curva analítica do adapaleno para estudos de liberação.
Fonte de Variação
gl
Soma dos
Quadrado
Quadrados
Médio
F.calculado
F.tabelado
Entre amostras
4
862127,98
215531,99
611,37870*
4,53
Regressão linear
1
861686,28
861686,28
2444,2619*
5,99
Desvio de linearidade
3
441,69
147,23
0,41764**
4,76
Resíduo
6
2115,20
352,53
Total
14
864243,18
* Significativo (p < 0,05);
** Não significativo (p > 0,05).