EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CD8, FOXP3, 7

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CD8, FOXP3,
NB EM DISPLASIAS EPITELIAIS E
7*)ȕ71)ĮH1)-N
CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS.
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de
Pós-Graduação em Patologia Oral da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos para obtenção do grau
de Doutor em Patologia Oral.
DOUTORANDA: Marta Rabello Piva
ORIENTADORA: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza
Natal/RN
2009
2
DEDICATÓRIAS
3
DEDICATÓRIAS
Dedico este trabalho em especial a meu pai, ³1HVWRU 3LYD´, meu ídolo, meu
guia, que apesar de não poder compartilhar com essa vitória, foi o seu desejo e o seu
reconhecimento que me incentivaram a chegar até aqui.
A Chiquinho, meu companheiro e incentivador. Sua compreensão, dedicação,
carinho e confiança, me fizeram buscar forças para alcançar esta conquista. Sou sua fã
nº1.
À minha mãe Bernadeth, que sempre foi meu anjo da guarda, e me confortou
com todo seu carinho e preocupação dedicados aos meus filhos durante a minha
ausência.
Aos nossos filhos, Francisco Roberto, Diogo, Breno, Luís Henrique, Moema
Tereza, João Victor e Paulo Henrique, por serem as pessoas maravilhosas que são.
Pela compreensão e apoio que tanto me gratificou e encorajou. Para estes dedico a
esperança em um mundo melhor.
Às minhas amigas inseparáveis, Tânia, Lívia, Aída e Rosa, que suportaram o
meu abandono nas quartas e sextas. Os caranguejos agradecem.
Ao Deus pela minha família, e por ter colocado no meu caminho pessoas
maravilhosas como Cris, Karuza (Pan), Líbia e a tal de Daniele, minhas amigas,
companheiras e filhas de coração, espero que a distância não nos separe; assim como
meus filhos patológicos que nunca me abandonaram, Thiago, Luana, Luciana e o trio
Paulo, Dani e Giovanna. Foi um projeto e tanto! Obrigada por vocês existirem. Não
podendo deixar de fora o meu amigo e colaborador, Cassiano, que nunca me deixou na
mão, quando precisei, agora papai, desejo o melhor desse mundo para você, Simone e o
mais novo mascote da patologia. Dra. Lélia! Vamos pensar em ampliar esse negócio e
colocar a nossa creche, assim a senhora em vez de reclamar da superpopulação, vai
curtir junto com agente.
4
AGRADECIMENTOS
5
AGRADECIMENTOS
Aos professores Lélia Batista de Souza e Leão Pereira Pinto, por viabilizarem
a realização de um sonho.
Ao CNPq e à CAPES, na pessoa do Prfº José Fernandes Lima, pelo apoio
financeiro indispensável para a execução deste curso.
Aos meus irmãos e sobrinhos, Nestor, Isabela, Augusto César, Isabelle e
Nestorzinho pelo apoio e dedicação sem os quais não teria conseguido realizar esta
tarefa. Gugu, meu amor por você é incondicional.
À minha orientadora, professora Lélia Batista de Souza por sempre estar ao
meu lado nos erros e nos acertos. Acho que decifrei o enigma!
Aos professores Antônio Costa, Hébel, Lélia Maria, Márcia Miguel e
Roseana, por tudo que nos ensinaram, pela compreensão e pela solidariedade durante
todo o curso.
À Dr.Ângelo, Líbia, Cris e Cassiano pela orientação, possibilitando um
conhecimento mais profundo sobre a aplicabilidade dos testes utilizados na análise
estatística deste trabalho.
Aos funcionários Gracinha, Idelzuite, Canindé, Sandra, Hévio e Lourdinha
sempre amigos dedicados e atenciosos, dispostos a colaborar com nossos trabalhos.
Aos colegas do mestrado e doutorado Manuel, Márcio, Rosilene, Simone,
Roberta, Érika, Andréa, Janaína, Claudine, Polliana, Cristina, Karuza, George,
Cassiano, Bruna Rafaela, Bruna Amaral, Alexandre, Valéria*, Pedro Paulo*,
Daniele*(meus irmãozinhos*), João Goulart, Marcelo, Deborah, Ruth, Betânia e
Domingos, o pessoal do Maranhão, Antônio Luiz, Fernanda e Carmem e os caçulas,
Felipe, Joabe, Cyntia, Taís, Maiara, Marianne e Emeline, pelo companheirismo e
6
solidariedade não só no nosso aprendizado como também nas comemorações e
despedidas, sempre um motivo para festejarmos e estarmos juntos.
A Cassiano, Cris, Éricka, Líbia, Márcia e Pedro Paulo, pela mãozinha nas
horas dos apertos. Não existem palavras que expressem, o quanto vocês foram e serão
importantes na minha vida.
Ao amigo indispensável nas farras. O que seriam dos congressos sem você,
Gustavo?
A todos aqueles que por ventura tenham escapado injustamente do meu
pensamento neste momento, meu perdão, mas para fazer justiça sem medo de errar, eu
teria que agradecer à Sociedade Médica Sergipana em nome de todos aqueles que me
socorreram nos momentos de dificuldade, em especial a Dr. Eduardo Góis e Dr.
Caetano Macieira.
MUITO OBRIGADA!
7
LISTA DE SIGLAS E
ABREVIATURAS
8
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ƒ
APC ± Célula apresentadora de antígeno
ƒ
CE ± Carcinoma epidermóide
ƒ
Célula NK ± 'RLQJOrV³1DWXUDONLOOHUFHOO´FpOXODPDWDGRUDQDWXUDO
ƒ
CEO ± Carcinoma epidermóide oral
ƒ
DEO ± Displasia Epitelial Oral
ƒ
Fas ± Membro da família do TNF expresso na superfície celular (CD95)
ƒ
Foxp3 ± Proteína de transcrição reponsávem pela função e diferenciação da
célula Treg
ƒ
GITR ± 'RLQJOrV³*OXFRFRUWLFRLG-,QGXFHG71)5HFHSWRU´
ƒ
IFN-J ± Interferon-J
ƒ
LB ± Linfócito B
ƒ
LPS ± Lipopolissacarídio (Endotoxina)
ƒ
LT ± Linfócito T
ƒ
LTC ± Linfócito T citotóxico
ƒ
MHC ± Complexo principal de histocompatibilidade
ƒ
NFk-B ± Fator de transcrição nuclear kappa B
ƒ
TCR ± 'RLQJOrV³7FHOOUHFHSWRU´UHFHSWRUGHFpOXODV7
ƒ
TGF-E ± 'R LQJOrV ³7UDQVIRUPLQJ JURZWK IDFWRU´ )DWRU GH FUHVFLPHQWR
transformante
ƒ
TNF-D ± 'RLQJOrV³7XPRU1HFURVLV)DFWRU´)DWRUGe necrose tumoral-D
ƒ
Treg ± Linfócito T regulador
9
LISTA DE
ILUSTRAÇÕES
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Ilustrações
pg
Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasias.
46
Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais.
47
Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO.
47
Quadro 04-Estadiamento do CEO.
48
Quadro 05- Gradação de Bryne.(1998).
48
Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários.
50
Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos.
51
Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos carcinomas epidermóides
55
de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo. Natal/RN
2009.
Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides
57
de acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.
Tabela 01- Gradação histológica das displasias baseada na OMS (2005) de
54
acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.
Tabela 02- Correlação entre Gradação histológica de malignidade dos CEO e a
56
intensidade do infiltrado inflamatório, nas lesões estudadas. Natal/RN 2009.
Tabela 03- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 58
71)ĮH1)-NB nas DEO e CEO. Natal/RN 2009.
Tabela 04- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 59
71)ĮH1)-NB) de acordo com o grau das DEO. Natal/RN 2009.
Tabela 05- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 60
71)ĮH1)-NB) de acordo com o estágio dos CEO. Natal/RN 2009.
Tabela 06- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 61
71)Į H 1)-NB) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nas
DEO. Natal/RN 2009.
Tabela 07- Expressão imuno-histoquímicDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 62
71)Į H 1)-NB) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nos
CEO. Natal/RN 2009.
Tabela 08- Distribuição dos casos de CEO de baixo e alto graus segundo os
parâmetros utilizados na gradação histológica de malignidade. Natal/RN 2009.
63
11
Tabela 09- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,
64
estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas
SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação ao tipo de lesão. Natal/RN
2009.
Tabela 10- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,
64
estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas
SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação à gradação histológica das
DEO. Natal/RN 2009.
Tabela 11- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,
65
estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas
SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação à gradação histológica de
malignidade dos CEO. Natal/RN 2009.
Tabela 12- Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância
66
estatística entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células
LPXQRSRVLWLYDV SDUD &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H NF-NB, segundo o tipo de
lesão. Natal/RN 2009.
Ggáfico 01- Comparação das GHM.
56
Figura 01- CEO, Invasão em massas (HE/200x).
67
Figura 02- CEO, Invasão em cordões (HE/100x).
67
Figura 03- CEO, Células maduras (HE/200x).
67
Figura 04- CEO, Células imaturas (HE/200x).
67
Figura 05- CEO, Presença de massas (HE/100x).
68
Figura 06- CEO, Ausência de massas (HE/100x).
68
Figura 07- CEO, Dismorfismo escasso (HE/200x).
68
Figura 08- CEO, Dismorfismo acentuado (HE/200x).
68
Figura 09-DEO, CD8 > 50% (SABC/200x).
69
Figura 10- DEO, CD8 > 50% (SABC/200x).
69
Figura 11- CEO, CD8 > 50% (SABC/200x).
69
Figura 12- CEO, CD8 < 5% (SABC/200x).
69
Figura 13- DEO, FOXP3 > 50% (SABC/200x).
70
Figura 14- DEO, FOXP3 > 50% (SABC/200x).
70
Figura 15- CEO, FOXP3 > 50% (SABC/100x).
70
Figura 16- CEO, FOXP3 5-50% (SABC/200x).
70
12
Figura 17- '(27*)ȕ&(! (SABC/200x).
71
Figura 18- '(27*)ȕ&(-50% (SABC/200x).
71
Figura 19- '(27*)ȕ&(6$%&00x).
71
Figura 20- '(27*)ȕ,,-50% (SABC/400x).
71
Figura 21- &(27*)ȕ&(!6$%&00x).
72
Figura 22- &(27*)ȕ&(-50% (SABC/200x).
72
Figura 23- &(27*)ȕ&(6$%&00x).
72
Figura 24- &(27*)ȕ,,-50% (SABC/200x).
72
Figura 25- '(271)Į&(!6$%&00x).
73
Figura 26- '(271)Į&(-50% (SABC/200x).
73
Figura 27- '(271)Į&(6$%&00x).
73
Figura 28- '(271)Į,,-50% (SABC/200x).
73
Figura 29- &(271)Į&(!6$%&00x).
74
Figura 30- &(271)Į&(-50% (SABC/200x).
74
Figura 31- &(271)Į&(6$%&00x).
74
Figura 32- &(271)Į,,!6$%&00x).
74
Figura 33- DEO, NF-NB > 50% (SABC/200x).
75
Figura 34- DEO, NF-NB < 5% (SABC/200x).
75
Figura 35- CEO, NF-NB > 50% (SABC/100x).
75
Figura 36- CEO, NF-NB 5-50% (SABC/400x).
75
13
RESUMO
14
RESUMO
A Displasia Epitelial Oral (DEO) é a lesão que precede ou co-existe com o Carcinoma
Epidermóide Oral (CEO), apresentando alterações moleculares e/ou histológicas
semelhantes. As divergências sobre o potencial de malignização das DEO e o papel da
inflamação nestes processos têm dificultado o diagnóstico precoce e a avaliação da
agressividade dos CEO. Sendo assim, tornou-se objetivo deste estudo avaliar o papel da
inflamação na carcinogênese oral e agressividade tumoral. Para isso foi realizado estudo
morfológico em 20 casos de DEO e 40 casos de CEO para detectar o potencial de
malignização das DEO e o Grau Histológico de Malignidade (GHM) dos CEO,
analisando as massas superficiais para avaliação do dismorfismo e o front invasivo para
avaliação do crescimento tumoral; e imuno-histoquímico, utilizando os anticorpos antiCD8, anti-FOXP3, anti-7*)ȕ DQWL-TNF-Į H DQWL-NF-NB, para comparar a expressão
dos mesmos com o tipo de lesão, grau histológico e intensidade do infiltrado
inflamatório. Os resultados foram estatisticamente significantes para os parâmetros,
maturidade celular (p=0,0001), presença de massas (p=0,038) e dismorfismo (p=0,037),
quando associados aos GHM. Ao comparar a expressão dos marcadores com o tipo de
lesão, encontrou-se uma expressão significativamente maior do CD8 (p=0,001) e do
NF-NB (p=0,002) nas DEO, assim como uma menor expressão GR 7*)ȕ HSLWHOLDO nas
DEO severas (p=0,011), não tendo expressão significativa entre os graus dos CEO. Ao
relacionar a expressão dos marcadores estudados com a intensidade do infiltrado
inflamatório, observou-se uma relaomRSRVLWLYDFRPR71)Į inflamatório (p=0,003), o
71)ĮHRNF-NB epiteliais (p=0,051 e p=0,004), nas DEO; com o CD8 (p=0,021) e o
71)Į (p=0,015) no conjuntivo dos CEO; e uma relação negativa FRP R 71)Į
(p=0,034) epitelial dos CEO. Não foi encontrada relação significativa da FOXP3 com
nenhuma das variáveis estudadas. Esses achados levaram a concluir que, o estudo do
front invasivo é tão importante quanto o estudo das massas superficiais para avaliação
da agressividade tumoral; a intensidade do infiltrado inflamatório não pode ser utilizado
como parâmetro para avaliação prognóstica do CEO no exame de rotina; mas os eventos
moleculares detectados neste estudo podem ser necessários para embasar a
determinação do potencial de malignidade nas DEO e da agressividade nos CEO.
PALAVRAS-CHAVE: Carcinoma epidermóide oral, Displasia epitelial oral, Gradação
histológica de malignidade, Infiltrado inflamatório, Imuno-histoquímica.
15
ABSTRACT
16
ABSTRACT
The Oral Epithelial Dysplasia (OED) is the lesion that precedes or co-exists with the
Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC), presenting molecular and/or histological
similar alterations. The divergences about the malignization potential of OEDs and the
role of inflammation in this process make hard the early diagnosis and evaluation of
OSCCs aggressiveness. Thus, it became the goal of this study to evaluate the role of
inflammation in oral carcinogenesis and tumoral aggressiveness. For this purpose a
morphological study was performed in 20 OED cases and 40 OSCC cases to detect the
malignization potential of OEDs and the histologic malignancy grading (HMG) of
OSCCs, analyzing superficial masses for dismorphism evaluation and the invasive front
for evaluation of tumoral growing; and immunohistochemical, using anti-CD8, antiFOXP3, anti-TGFȕ, anti-TNFĮ and anti-NF-NB antibodies, comparing their with the
types lesion, histological degree and intensity of the inflammatory infiltrate. The results
were statistically significant for the parameters: cell maturity (p=0,0001), masses
presence (p=0,038) and dismorphism (p=0,037), when associated to HMG. To compare
the expression of the markers with the types lesion, a significantly higher expression of
CD8 (p=0,001) and NF-NB (p=0,002) in the OED, and also a smaller expression of the
epithelial TGFȕ in the severe OEDs (p=0,011), without significant expression between
OSCC degrees. By relating the expression of the studied markers with the inflammatory
infiltrate intensity, a positive relation was observed with: inflammatory TNFĮ(p=0,003),
epithelial TNFĮ and NF-NB (p=0,051 and p=0,004), in OEDs; and with CD8 (p=0,021)
and TNFĮ (p=0,015) in conjunctive OSCCs; and a negative relation with epithelial
TNFĮ (p=0,034) in OSCCs. No significant relation was found between FOXP3 with any
of the studied variables. These findings lead to the conclusion that, the study of the
invasive front is as important as the study of superficial masses for the evaluation of
tumoral aggressiveness; the intensity of the inflammatory infiltrate has no use as a
parameter for prognostic evaluation of OSCC in routine exams, but, the molecular
events detected in this study may be necessary to give basis for determining the
malignant potential in OEDs and aggressiveness in OSCCs.
KEYWORDS: Oral Squamous Cell Carcinoma, Oral Epithelial Dysplasias, Histologic
Malignancy Grading, inflammatory infiltrate, immunohistochemical.
17
SUMÁRIO
18
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
21
2.1 Carcinoma Epidermóide (considerações gerais)
22
2.2 Parâmetros para Gradação Histológica de Malignidade
27
2.3 Papel da Inflamação na Carcinogênese
29
2.4 Evasão da Resposta Imunológica no CEO
35
3DSHOGR7*)ȕH71)Į1)-ദ%QR'HVHQYROYLPHQWRGR&(2
37
3 PROPOSIÇÃO
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
46
4-1 Caracterização do Estudo
47
4.2 População e Amostra
47
4.3 Implicações Éticas
47
4.4 Estudo Morfológico
48
4.5 Estudo Imuno-Histoquímico
51
4.6 Análise dos Resultados
53
5 RESULTADOS
55
5.1 Resultados Morfológicos
56
5.2 Resultados Imuno-Histoquímicos
60
5.3 Resultados Estatísticos
65
6 DISCUSSÃO
78
7 CONCLUSÃO
94
REFERÊNCIAS
ANEXOS
19
INTRODUÇÃO
20
1- INTRODUÇÃO
Os Carcinomas são as neoplasias malignas de maior incidência no ser humano
sendo que, o Carcinoma Epidermóide (CE) corresponde a cerca de 95% das neoplasias
malignas orais (ALBERTS, 2004; CHOI et al., 2006). A Displasia Epitelial, é o evento
histológico que antecede ou co-existente em muitos CE, o que assegura seu potencial
pré-maligno, estando ambos associados à fatores de risco como a radiação ultra-violeta
(uv), o fumo, o álcool, e infecção por alguns tipos virais, entre eles o HPV, e quando
associados à predisposição genética de cada indivíduo, podem aumentar o potencial
cancerígeno ou, quem sabe, dar início a um processo que está freqüentemente associado
à reação inflamatória.
Estudos têm demonstrado que a ação intermitente ou descontrolada de citocinas
que participam do processo inflamatório são capazes não só de transformar como de
induzir à progressão, invasão e metástase das células neoplásicas (AGGARWAL, 2006)
e de alguns tipos celulares que participam do controle da inflamação e defesa antitumoral (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Embora para alguns pesquisadores o infiltrado inflamatório funcione como
defesa do hospedeiro no Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) (BRYNE et al.,1989),
outros acreditam que ele possa atuar na transformação e progressão tumoral
(BALKWILL e MANTOVANI, 2001). Porém, novos estudos são necessários para que
se possa esclarecer seu verdadeiro papel no câncer.
Sabendo-se que as células inflamatórias, em maior ou menor quantidade, estão
presentes nas Displasias Epiteliais Orais (DEO) e nos Carcinomas Epidermóides Orais
(CEO), pretende-se estudar o papel das mesmas, na transformação e progressão tumoral,
através dos eventos moleculares que ocorrem na carcinogênese, utilizando a expressão
imuno-histoquímica de marcadores relacionados à ativação ou inibição do CD8,
principal responsável pela defesa anti-tumoral e do fator de transcrição NF-NB,
responsável pela produção de grande parte das citocinas pró-inflamatórias. Esses
eventos podem ajudar a esclarecer o potencial de malignização das DEO e a
agressividade dos CEO, bem como a utilização da intensidade do infiltrado inflamatório
como parâmetro de malignidade para a gradação histológica, ajudando na prevenção e
tratamento precoce do câncer.
21
REVISÃO DE
LITERATURA
22
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS:
Displasia epitelial e carcinoma epidermóide oral
O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) é caracterizado por alterações
morfológicas e funcionais das células, associadas à diferenciação e crescimento, que
definem o processo de progressão tumoral. Várias lesões, histologicamente distintas,
precedem o aparecimento do CEO, as quais apresentam eventos similares àqueles
observados na progressão, justificando seu potencial de malignidade (MITHANI, 2007).
A Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1978, classificou como lesão précancerosa aquela que apresente alterações morfológicas nas quais o desenvolvimento do
CEO seja mais provável que o tecido normal (Leucoplasia, Eritroplasia e Lesão do
Palato por Fumo Invertido) e, como condição pré-cancerosa, uma situação associada a
um aumento significativo do risco de câncer (Fibrose Submucosa, Ceratose Actínica,
Líquen Plano e Lupus Eritematoso Discóide). Esse mesmo grupo definiu a
³OHXFRSODVLD´ FRPR XPD SODFD EUDQFD Tue não pode ser classificada clinicamente ou
patologicamente como qualquer outra doença, permanecendo por quase 25 anos, quando
em 2005, a OMS redefiniu-a como uma placa branca de risco questionável, depois de
excluído o diagnóstico de doenças conhecidas ou desordens sem risco aumentado de
transformação maligna. Portanto, não devendo ser usado como descritor clínico de uma
lesão branca (WARNAKULASURIYA, JOHNSON e VAN DER WAAL, 2007). Para
Mithani (2007), a leucoplasia é uma lesão pré-maligna que pode apresentar similaridade
molecular e/ou histológica com o CEO, quando apresenta displasia epitelial.
É importante ressaltar que a Displasia Epitelial Oral (DEO) não dispõe de uma
aparência clínica específica, sendo encontrada com freqüência precedendo o
desenvolvimento ou co-existindo com o Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) (WHO,
1978; LUMERMAN, FREEDMAN e KERPEL, 1995; PINDBORG et al., 1997;
REIBEL, 2003).
23
As dificuldades quanto ao diagnóstico e gradação das displasias epiteliais são
grandes entre os patologistas. Por isso, a OMS em 2005, resolveu propor um método
binário,
diminuindo
de
três
para
duas,
as
possibilidades
diagnósticas
e
conseqüentemente as chances de desacordo entre os profissionais. Foi sugerido estudo
longitudinal para testar a significância do baixo e alto risco de displasia. O termo
desordens potencialmente malignas foi sugerido, sendo a biópsia, prática necessária
para confirmar a presença de displasia, embora outros autores como Kuffer e Lombardi
(2002), tenham sugerido o termo, neoplasia intra-epitelial escamosa (SIN), ou mesmo
como neoplasia intra-epitelial oral (OIN). Na boca, o epitélio das lesões precursoras é
geralmente atrófico, sem evidência de invasão, e a quantidade de queratina é irrelevante,
porém, para o diagnóstico de displasia, deve-se considerar em primeiro lugar, as
alterações arquiteturais e em seguida, as citológicas (WARNAKULASURIYA et al.,
2008).
A Displasia Epitelial Oral (DEO) é o evento que assegura, histologicamente, o
potencial pré-maligno, já que apenas 15% das lesões sem displasia evoluem para CEO
(SILVERMAN, GORSKY e LOZADA, 1984). Sendo assim, através da biologia
molecular, várias proteínas relacionadas à progressão tumoral têm se mostrado
significativamente alteradas em estudos comparativos entre lesões pré-malignas com
Displasias Epiteliais Orais e o CEO, mas não entre os graus histológicos de malignidade
(ABBAS et al., 2007).
Apesar da grande maioria das leucoplasias estarem associadas ao fumo, apenas
2,1% das lesões, em pacientes fumantes, tornaram-se malignas em comparação com
11,1% dos pacientes não-fumantes. As porções lateral e ventral da língua são as mais
afetadas, geralmente de forma não-homogênea, envolvendo mulheres idosas e nãofumantes (NAPIER e SPEIGHT, 2008).
Embora a cirurgia tenha efeito benéfico, não reduz o risco de recorrência e
posterior transformação. Já a cessação de atividade de risco reduz, teoricamente, o risco
de transformação maligna ou desenvolvimento de novas lesões (LODI e PORTER,
2008). Warnakulasuriya et al. (2008) não acreditam que as mutações ocorridas nas
displasias sejam as mesmas responsáveis pela transformação maligna, mas o acúmulo
dessas mutações pode levar à transformação.
24
Além disso, a interação entre as células tumorais e o estroma peritumoral pode
ser um passo importante na progressão, visto que o compartimento estromal de um
tumor abriga uma grande variedade de células entre elas: fibroblastos, células
endoteliais e inflamatórias que passam a trabalhar a favor da progressão, ao produzirem
fatores que estimulam angiogênese, crescimento e metástase (BISWAS et al., 1995;
HANAHAN e WEINBERG, 2000 ).
Esse papel coube, em grande parte, ao indutor extracelular de metaloproteinases
da matriz, EMMPRIN, designado CD147 no Sexto Seminário Internacional e
Conferência sobre antígenos de diferenciação de leucócitos humanos (KOCH et al.,
1999). Para Yan, Zucker e Toole (2005) experimentos comprovam que o EMMPRIN
induz várias propriedades associadas à malignidade incluindo, invasividade,
angiogênese e ancoragem independente de crescimento. Processo esse que pode ter
início na remodelação da Membrana Basal ou Matriz extracelular ao redor das lesões
pré-malignas.
O Câncer Oral é o 8º câncer mais comum do mundo e o 4º do Brasil (INCA,
2008). Entre 90-95% de todas as neoplasias malignas da boca são carcinomas
epidermóides, sendo também denominados, carcinomas espinocelulares ou carcinomas
de células escamosas. Isso talvez se deva ao fato da maior parte da proliferação celular
de um organismo humano ocorrer nos epitélios, e/ou então porque os tecidos epiteliais
são expostos com maior freqüência às mais variadas formas de agressões físicas e
químicas, o que susceptibilizar o desenvolvimento do câncer, caracterizado por
proliferação desordenada das células escamosas do epitélio, expressando variáveis graus
de similaridade com suas células de origem (MOORE et al., 2000; DANTAS et al.,
2003; ALBERTS et al., 2004; CHOI et al., 2006).
Para Choi et al. (2006) o CEO é uma das neoplasias mais difíceis de ser
controlada, tendo uma sobrevida de 5 anos em apenas 35-50% dos casos, atribuindo este
fato ao reconhecimento tardio das lesões bem como à falhas no tratamento. Segundo
Kademani et al. (2005), a metástase em linfonodos é um dos principais indicadores
25
prognósticos, podendo ser responsável por uma queda de 50% da chance de
sobrevivência.
Já está bem estabelecido que, o câncer oral tem etiologia multifatorial, na qual
estão envolvidos tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos, sendo provavelmente
necessária a ação de mais de um desses carcinógenos para produção da malignidade.
Esta requer desestabilização de vários sistemas de controle que coordenam o
comportamento celular (PANDE et al., 2002; RAMALHO et al., 2002; NAGPAL,
DAS, 2003; SCHLIEPHAKE, 2003).
De acordo com Boshoff e Weiss (2001) ocorre, na maioria dos casos, um
acúmulo seqüencial de mutações somáticas por muitos anos, antes da expansão clonal
de células transformadas e, as lesões que se tornam clinicamente evidentes são
aparentemente resistentes aos mecanismos de defesa da imunidade celular (KERREBIN
et al., 1999).
O tabagismo e o etilismo crônicos são os principais fatores de risco para o
câncer de boca (MOORE et al., 2000; REGEZI, SCIUBBA, 2000; CANTO, DEVESA,
2002; BETTENDORF, PIFFKÒ, BANKFALVI, 2004; TROMP et al., 2005; GHOSHAL
et al., 2006), pois, apenas 15 a 20% dos pacientes portadores de lesões malignas orais
não têm história pregressa destes hábitos (VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004).
Conforme citam Venturi, Pamplona e Cardoso (2004), o risco de
desenvolvimento de CEO na população geral aumenta em cerca de sete vezes com o
tabagismo, e em até quinze vezes quando este hábito está associado ao consumo crônico
de álcool. Todavia, Schmidt et al (2004) verificaram que 1/3 dos pacientes de sua
amostra acometida por CEO, nunca fumaram.
Para zur Hausen (2000), 15 a 20% da incidência de câncer na população mundial
pode ser ligada etiologicamente à infecções específicas, sendo que, nos últimos anos, as
atenções têm sido voltadas particularmente ao HPV (BOUDA et al., 2000), que segundo
Schiffman e Castle (2003), é necessária mas não suficiente para causar câncer cervical.
Alguns fatores de risco que promovem a progressão tumoral nesses casos têm sido
amplamente estudados, como o tabagismo e o uso de contraceptivos.
26
Liang et al. (2008), estudando o carcinoma de língua, encontrou a presença de
HPV em apenas um caso dos 51 avaliados, contrastando com estudo anterior onde havia
encontrado a presença viral em 51,5% dos casos, concluindo portanto, ser a localização,
o fator divergente, responsável pelo resultado encontrado, visto que no primeiro estudo,
a amostra era da base da língua e no mais recente, da região anterior da língua.
Outros fatores como a exposição crônica à radiação solar (NEVILLE et al.,
2004) e deficiência nutricional 2¶5(*$1HWDO; INCA, 2008), podem favorecer
o desenvolvimento do CEO, em pessoas de pele clara e dietas inadequadas que
funcionam como fonte de radicais livres, respectivamente.
A localização anatômica dos CEO depende fundamentalmente dos fatores de
risco. Em fumantes de cachimbo é mais comum o carcinoma de palato, em mascadores
de fumo, o da mucosa jugal, e em alcóolatras e fumantes de cigarro, os da língua,
assoalho da boca e gengiva inferior (KOWALSKI, 1991). Ghoshal et al. (2006),
encontraram uma maior incidência de CE na mucosa jugal de indianos com hábito de
mascar fumo e Magrini et al. (2000); Kerdpon, Sriplung (2001) e Costa et al. (2002)
relataram uma maior incidência em língua e lábio inferior, embora o CEO de lábio
inferior esteja relacionado àqueles pacientes de pele clara que se expõem
freqüentemente à radiação solar, ou utilizam o lábio como apoio para o cigarro, charuto
ou cachimbo, cabendo a este a fração de 25 a 30% dos casos de câncer bucal (REGEZI,
SCIUBBA, 2000; NEVILLE et al., 2004).
Segundo Costa et al. (2002) e Miranda (2002), a localização anatômica também
encontra-se relacionada ao comportamento biológico do CEO, visto que os tumores
localizados no lábio inferior apresentavam grau de malignidade mais baixo que os
localizados na língua, o que pode ser atribuído à maior probabilidade destes
desenvolverem metástases ocultas e conseqüentemente baixa taxa de sobrevivência em
função da infiltração muscular observada mesmo quando detectados nos estágios
iniciais (AMARAL et al., 2004).
27
Os homens, principalmente aqueles que se encontram entre a quinta e a oitava
década de vida, têm uma probabilidade duas vezes maior de desenvolver CEO, embora
essa diferença tenha diminuído nos últimos anos, aumentando entre as mulheres
(REGEZI, SCIUBBA, 2000) e pessoas mais jovens, com menos de 40 anos
(O`REAGAN et al., 2006).
Schantz e Yu (2002) relataram que o CEO tem uma incidência de 0.4 a 3.9% em
pacientes jovens, havendo nestes casos uma maior agressividade da neoplasia e um pior
prognóstico; Sasaki et al. (2005) afirmaram que o prognóstico em pacientes mais jovens
não difere daqueles que acometem pacientes mais velhos.
Estados de imunodeficiência, especialmente os relacionados à deficiência de
imunidade do tipo celular, como a AIDS, aumentam a suscetibilidade às infecções em
geral, sendo alta a prevalência de lesões provocadas por HPV nestes grupos, tanto por
reativação de uma infecção latente como por aquisição de uma nova infecção (VILLA,
2¶5(*AN et al., 2006).
Doenças inflamatórias crônicas, como as doenças auto-imunes, de etiologia
desconhecida, caracterizadas por infiltrado linfocitário sub-epitelial e destruição da
membrana basal e/ou ceratinócitos, onde os linfócitos T citolíticos (LTC),
possivelmente induzidos por Th1, levam os ceratinócitos à apoptose (SUGERMAN et
al., 2002), vêm sendo consideradas fatores de risco para transformação maligna ou
mesmo, lesões pré-malignas (PINDBORG et al., 1997; MIGNONA et al., 2004; ACAY
et al., 2006).
2.2 PARÂMETROS PARA GRADAÇÃO HISTOLÓGICA DE MALIGNIDADE
A grande variação no aspecto histológico do CEO, o qual teve Broders (1920)
como pioneiro na sua classificação, baseando-se no grau de diferenciação das células
tumorais e em seguida, com o prognóstico da mesma (BRODERS, 1941), levou ao
desenvolvimento de vários sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHM) a
fim de viabilizar a interpretação da agressividade do tumor (MARTINS NETO, 1999).
Para Kurokawa et al. (2005) o aspecto histológico pode refletir a relação
tumor/hospedeiro.
28
Vários parâmetros como: ceratinização de células individuais, formação de
pérolas córneas, presença de pontes intercelulares, número e aspecto das figuras de
mitose, grau de pleomorfismo celular e nuclear, e presença de células gigantes
multinucleadas (WAHI, 1971); estrutura neoplásica, ceratinização, pleomorfismo
nuclear, número de mitoses, modo e estágio de invasão, invasão vascular e infiltrado
inflamatório linfoplasmocitário (JACKOBSSON et al., 1973); grau de ceratinização,
pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão, infiltrado inflamatório e
invasão vascular (CRISSMAN et al., 1984) e grau de ceratinização, pleomorfismo
celular, número de mitoses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado
inflamatório linfoplasmocitário (ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1987) foram
utilizados e, em 1999, Martins Neto em uma revisão sobre SGHM do CEO considerou o
grau de ceratinização, a atividade mitótica e as atipias celulares e nucleares, os
parâmetros de maior relevância, por serem comuns à maioria dos sistemas propostos.
No sistema proposto por Bryne (1989) a autora sugeriu que as células presentes
na área do front de invasão tumoral exibem diferentes características moleculares
quando comparadas com as áreas superficiais do tumor, e que interações entre o tumor e
R KRVSHGHLUR QHVVD UHJLmR VmR ³FUXFLDLV SDUD GLVVHPLQDomR GD QHRSODVLD´ VHQGR HVWD
uma importante região para determinação do prognóstico.
Para Bryne (1998) e Kurokawa et al. (2005) a população celular das áreas mais
invasivas (mais profundas) exibem um perfil mais agressivo (população mais
heterogênea) do que a situada nas áreas centrais e superficiais do tumor, além de ser
nessa área que as células tumorais se encontram com maior índice de proliferação e
conseqüentemente menor grau de diferenciação. Portanto, Bryne (1998) propôs um
novo SGHM com avaliação apenas do front de invasão tumoral, baseando-se em quatro
parâmetros: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado
inflamatório, já que em 1992, Bryne et al. verificaram que a exclusão do parâmetro
³Q~PHUR GH PLWRVHV´ QmR DOWHURX D VLJQLILFkQFLD GR YDORU SURJQyVWLFR HPERUD
aumentasse a reprodutibilidade.
29
Kurokawa et al. (2005) avaliaram 124 pacientes com CE de língua onde 66,7%
tiveram sobrevida acima de 5 anos e concluíram que os casos com escore < 8 e aqueles
com escore > ou igual a 11, avaliados pela Gradação do Front Invasivo, tinham melhor
e pior prognóstico, respectivamente.
Segundo Costa, Araújo-Júnior e Ramos (2005), a gradação histológica das partes
mais profundas do tumor influencia diretamente na sobrevida do paciente, pelo fato das
células neoplásicas nesse local mostrarem-se indiferenciadas. Estes autores acharam um
infiltrado inflamatório predominantemente discreto, nos casos de CEO agressivos,
quando correlacionados com o desenvolvimento de metástase nos linfonodos cervicais
(TNM II/IV).
Silveira (2007) verificou que as células inflamatórias CD8 e CD25 positivas
tinham maior participação nas lesões menos agressivas (lábio inferior), assim como o
anti-]foi mais marcante nos casos sem metástase, independente da localização
anatômica. A autora afirmou ainda que o infiltrado inflamatório exerceu certa influência
na agressividade dos CE de língua e lábio inferior estudados e de certa forma pode estar
contribuindo para as controvérsias no tocante a utilização deste como critério
morfológico indicador de agressividade, visto que, a grande maioria (80%) da amostra,
apresentou infiltrado inflamatório variando de moderado a intenso.
2.3 PAPEL DA INFLAMAÇÃO NA CARCINOGÊNESE
A inflamação, freqüentemente presente no CEO (HOFFMANN, BIER e
WHITESIDE, 2004), é uma resposta protetora do organismo cujo objetivo é livrá-lo da
causa inicial da lesão. Essa resposta ocorre no tecido conjuntivo vascularizado, cuja
reação vascular leva ao acúmulo extra-vascular de líquido e leucócitos estando
estreitamente ligada ao processo de reparo, caracterizado pela capacidade do organismo
substituir células lesadas ou mortas após a inflamação. Logo, a proliferação celular pode
ser estimulada, sendo a mesma controlada por fatores químicos do micro-ambiente. A
população celular, no tecido adulto, é determinada pela velocidade de proliferação,
diferenciação e morte por apoptose. Porém, um excesso de fatores estimulantes, ou uma
30
deficiência de inibidores pode resultar em um crescimento descontrolado, ou seja, o
câncer (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
Uma variedade de agentes lesivos, ao mesmo tempo em que provoca danos
celulares dispara uma série de eventos que servem para conter a lesão. As respostas
vasculares e celulares são desencadeadas por estímulos inflamatórios, e a inflamação só
termina quando o estímulo lesivo é removido e os mediadores dissipados ou inibidos
(COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
Na grande maioria das vezes, a remoção do estímulo inflamatório fica sob
responsabilidade do sistema imunológico, que tem como função defender contra
microorganismos infecciosos, embora, atue também contra substâncias estranhas não
infecciosas. A imunidade natural ou inata fornece a primeira linha de defesa contra os
microorganismos, mas não reconhece diferenças discretas entre substâncias estranhas.
Uma outra forma de imunidade mais específica e com memória é desenvolvida em
resposta a infecções, conhecida como imunidade adaptativa ou adquirida (ABBAS e
LICHTMAN, 2005).
Muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de ativar o sistema
imunológico de forma específica (JANEWAY et al., 2007), já que ele não é efetivo
frente a muitos tipos de tumores (KACANI et al., 2003; ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Para isso, é necessário a identificação dos antígenos associados às células tumorais,
pois, tumores sediados na cavidade oral são freqüentemente circundados por infiltrado
inflamatório com células imunes (HOFFMANN, BIER e WHITESIDE, 2004).
Os mecanismos efetores da resposta imunológica têm início com a ligação de
um agente sinalizador a um receptor específico, na superfície celular que envia sinais ao
núcleo através de vias de transdução de sinais, onde fatores reguladores conhecidos
como fatores de transcrição promovem alterações específicas na regulação da expressão
gênica (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
O NF-NB é um fator de transcrição ativado em resposta aos sinais do receptor de
célula T (TCR) sendo essencial para a síntese de citocinas. Na célula T em repouso,
essa proteína encontra-se no citoplasma associada a proteínas inibidoras (INBs). Os
31
sinais do TCR induzem à fosforilação pelas INB cinases (IKK), que é seguida pela
inserção de múltiplas cópias de uma pequena proteína chamada ubiquitina, liberando
assim o NF-NB que entra no núcleo, onde contribui para a ativação transcricional de
vários genes de citocinas e receptores de citocinas. O NF-NB está envolvido na ativação
da célula T, contribuindo para a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e na resposta de
muitos tipos celulares às citocinas pró-inflamatórias tais como o fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1) e lipoproteínas bacterianas (LPS) (HAYDEN e
GHOSH, 2004; ABBAS e LICHTMAN, 2005).
A manutenção do NF-NB ativado durante a inflamação, predispõe à
transformação maligna, podendo ser utilizado para inibir a transformação tumoral, mas
para isso, é preciso interferir no seu papel fisiológico, tanto na imunidade e/ou
inflamação, como na homeostase (PACIFICO e LEONARDI, 2006).
Os tumores humanos podem ativar linfócitos CD4 ou CD8, dependendo da via
do processamento para desencadear a resposta imunológica, e o controle do tumor
depende tanto da magnitude da resposta imunológica inicial, como da capacidade de
sustentar essa resposta por um período prolongado (SABEL et al., 2005).
O principal mecanismo de defesa anti-tumoral é a morte das células neoplásicas
pelos linfócitos T CD8, também conhecidos como linfócitos T citotóxicos (LTC), as
quais podem reconhecer e matar células potencialmente malignas que expressem
peptídeos derivados de proteínas celulares mutantes ou proteínas virais oncogênicas
associadas ao MHC classe I (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
A função dos linfócitos T CD4 parece estar relacionada com a produção de TNF
pelos macrófagos e INFJpela população Th1, podendo ser responsável pelo aumento na
expressão do MHC-I pelas células neoplásicas, resultando na sensibilisação dos
linfócitos T CD8 e conseqüente lise das células neoplásicas pelo sistema
perforina/granzima (CHANG et al., 2005), ou através da ligação do Fas presente nas
células tumorais com o Fas-L (CD95) dos Linfócitos (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Ainda segundo Chang et al. (2005), a supressão dos linfócitos CD4 Th1 resulta em
progressão tumoral.
32
Segundo Janeway et al. (2007), a resposta imune do tipo celular, se dá através do
receptor de célula T (TCR) associado a moléculas transmembranas designadas CD3 e ]
(zeta), as quais traduzem a ligação extracelular com o antígeno em sinais ativadores
para o interior da célula, e a completa ativação requer um segundo sinal coestimulatório fornecido pela ligação do CD28, presente nos linfócitos, ao B7-1 ou B7-2
nas APC.
Quando os linfócitos se tornam células ativadas, passam a expressar receptores
para IL-2, podendo ser identificados pelo método da imuno-histoquímica, utilizando-se
o anticorpo anti-CD25 (WEISS, 1993). Porém, Sato et al (2005) lembram que o CD25
também se encontra expresso na superfície das células T regulatórias, as quais exibem
propriedades imunossupressoras. Segundo Hoffmann, Bier e Whiteside (2004) a IL-2 é
capaz de inibir o crescimento de CE de cabeça e pescoço.
A célula Treg, é um subtipo de linfócito T que tem o papel de induzir e manter a
tolerância imunológica, bem como a finalização da resposta imune. A deficiência ou
diminuição dessa célula pode conduzir a uma doença auto-imune (HORI, NAMURA e
SAKAGUSHI, 2003; MAGGI et al., 2005).
Bluestone e Abbas (2003) propuseram dois grupos de células Treg profissionais:
a célula Treg Natural, que se desenvolve no timo, tem elevada expressão constitutiva de
CD25 (CD4+CD25+) e destrói outras células T por contato, independente de citocinas,
tendo papel importante na tolerância contra antígenos próprios; A Treg Adaptável (Th3)
torna-se madura nos tecidos periféricos, sob estimulação antigênica e/ou coestimulação, exercendo função supressiva através de secreção de IL-10 e TGF-E.
Forkhead Fox P3 (Foxp3), uma proteína responsável pela regulação das funções
e desenvolvimento das células Treg, tem sido utilizada na detecção das mesmas
(SAKAGUCHIS, 2004; SATO et al., 2005; BOER et al., 2007), sendo considerada por
Hori, Namura e Sakagushi (2003), o melhor marcador para essas células. Boer et al.
(2007) afirmaram ainda que Foxp3 é quase que exclusiva das células que expressam
CD4 e CD25, que devem expressar também GITR (Glucocorticoid-Induced TNF
Receptor) e CTLA-4.
33
Boer et al. (2007) relataram que Foxp3 pode ser um fator de transcrição que
induz GITR, talvez por isso encontraram um grupo de células Foxp3 (+) e GITR (-), não
considerando este último, um bom marcador.
Wan e Flavell (2007) demonstraram que a diminuição da expressão de Foxp3
causa doença auto-imune dose dependente através da transformação das células Treg
em células efetoras, as quais instruiriam uma diferenciação Th2 nas células T
convencionais.
Vários
estudos
têm
ressaltado
o
envolvimento
da
célula
Treg
no
desenvolvimento e progressão do câncer (PETERSEN et al., 2006; FU et al., 2007;
KOBAYASHI et al., 2007), e como a expressão de CD4+CD25+ não quer dizer que
essas células sejam Treg, pelo fato de outras células T, recentemente ativadas, poderem
expressar CD25, a proteína Foxp3 pode ajudar a entender o papel de Treg na
carcinogênese (BOER et al., 2007).
A propriedade imuno-supressiva das células T CD4 foram associadas à baixa
sobrevivência de pacientes com câncer de ovário (CURIEL, 2004), embora Sato et al.
(2005) não acreditassem que apenas o infiltrado de células T CD4 fosse responsável
pela baixa sobrevivência e sim, que a influência da modulação de CD4 sobre os
benefícios de CD8 dependesse do número de células Treg na população CD4.
A inflamação crônica como fator de risco para o câncer já havia sido cogitada
por Virchow no início do século XIX e constatada por Weitzman e Gordon (1990) ao
associar várias doenças inflamatórias crônicas como doença de Bowel, gastrite atrófica,
colecistite crônica e esofagite de refluxo com o desenvolvimento do câncer. Contudo,
com a biologia molecular vieram os vários estudos que envolviam a relação do tumor
com o estroma peri-tumoral (BALKWILL e MANTOVANI, 2001; COUSSENS e
:(5% 2¶%<51( H '$/*/(,6H, 2001; YAN, ZUCKER E TOOLE, 2005),
ficando evidente a contribuição deste com o crescimento tumoral, invasão e metástase
(MIGNOGNA et al., 2004; AGGARWAL et al., 2006; VIGNESWARAN et al., 2006).
34
Para Balkwill e Mantovani (2001), ficou mais fácil sugerir a participação das
citocinas e células inflamatórias no desenvolvimento e progressão tumoral do que uma
resposta anti-tumoral do hospedeiro (NAKANO et al., 2001), como proposto em vários
outros estudos onde serviu de parâmetro para gradação histológica de malignidade
(JACKOBSSON et al., 1973; ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1986; BRYNE et
al., 1989).
Aumento na concentração de linfócitos CD4 e CD8 foram relacionados tanto
com a transformação como com a progressão do câncer oral e este, exercia influência
tanto na reação imune local quanto na sistêmica (GANNOT et al., 2002 e GANNOT,
BOCHNER e KEISARI, 2004).
A quantidade de linfócitos T CD8 esteve relacionada com o grau de
diferenciação no câncer de pulmão, sendo maior quando as células encontravam-se
indiferenciadas (MORI et al., 2000), e segundo Sheu et al. (1999), os CD4 estiveram
diminuídos em relação ao CD8 em tumores cervicais de crescimento rápido e produção
de metástase.
Na revisão de Chang et al. (2005), os autores citaram um estudo onde a relação
CD4/CD8 era menor nas displasias moderadas e severas do que nas displasias leves,
sendo a maioria dos CD8 considerados supressores, sugerindo um desequilíbrio
imunológico local, e um outro que considerou essa relação menor que 1 preditiva de
metástase em linfonodo. Sendo assim, esses autores sugeriram a possibilidade dessa
deficiência de linfócitos CD8 no CEO, ser devido a fatores inibitórios liberados pelas
células tumorais.
Daniel et al. (2003) encontraram concentrações elevadas de linfócitos CD4 na
transformação de lesões pré-cancerosas para o câncer de pele, sugerindo a possibilidade
destas estarem relacionadas com a progressão tumoral.
Sato et al. (2005) encontraram um prognóstico favorável nos tumores que
apresentavam uma alta taxa na relação CD8/Treg, ao estudar 117 canceres de ovário,
ressaltando a importância da localização intra-epitelial dos linfócitos e a detecção das
células Treg sendo feita através de dupla marcação CD25/FOXP3.
35
2.4 EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA NO CEO
O escape à ação do sistema imunológico resulta em progressão rápida do câncer,
sendo necessário o uso da imunoterapia para potencializar a resposta anti-tumoral do
hospedeiro e evitar a disseminação (SHEU et al., 1999).
Os cânceres surgem a partir da proliferação e disseminação descontrolada de
clones de células transformadas, os quais deveriam ser reconhecidos pelo sistema
imune, antes de se transformar em tumor. Embora já tenha sido comprovado que o
sistema imune reage contra muitos tumores, ou pelo menos atrasa a progressão, não se
sabe ainda, o aproveitamento dessas reações imunológicas para destruir tumores de
forma específica. Além disso, tem-se que contar com a capacidade das células tumorais
de evadir ou superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (COUSSENS e WERB,
2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005). A remodelação da matriz extracelular (MEC) e
membrana basal (MB) confinada ao microambiente pericelular das lesões Pré-Malignas,
podem ser o primeiro passo para a invasão (YAN, ZUCKER e TOOLE, 2005).
O fenômeno da angiogênese, caracterizado pelo desenvolvimento de novos
vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura existente, é observado
em uma série de eventos fisiológicos e patológicos sediados na cavidade oral, incluindo
a inflamação, reparo tecidual e metástase tumoral (RAVI et al., 1998; SEDIVY et al.,
2003).
0HPEURV GD IDPtOLD 7*)ȕ FRPR D %03-2 é capaz de estimular células
mesenquimais indeferenciadas a liberar o P1GF (Fator de Crescimento Placentário), que
é importante no recrutamento de células hematopoiéticas e endoteliais indiferenciadas
em condições patológicas, como isquemia, inflamação, cicatrização e câncer (RAIDA et
al., 2005).
Segundo Abbas e Lichtman (2005), a evasão da resposta imunológica pode
ocorrer: pela sub-regulação do MHC da classe I ou qualquer componente da maquinaria
de processamento de antígeno, o que leva à perda da expressão deste e,
conseqüentemente, ausência de reconhecimento pela célula T; pela falta de co-
36
estimuladores ou MHC de classe II para induzirem a diferenciação dos LTC; pela
imunossupressão provocada por citocinas tumorais (TGF-E), que inibe a proliferação e
funções efetoras de linfócitos e macrófagos, ou através do ligante de Fas (FasL) que
reconhece o receptor de morte celular nos leucócitos que tentam atacar o tumor, levando
à apoptose; pela capacidade de alguns antígenos tumorais induzirem a tolerância
imunológica pois, os antígenos tumorais são antígenos próprios encontrados pelo
sistema imune em desenvolvimento ou em forma tolerogênica por linfócitos maduros,
permitindo livremente o seu crescimento.
La Gruta et al. (2004) acrescentaram que alteração ou ausência na expressão de
proteínas formadoras do complexo TCR estão relacionadas ao escape da neoplasia às
defesas do hospedeiro, como sugerem Gruiji et al. (1999) no caso dos componentes das
proteínas CD3 e ] (zeta) responsáveis por deficiências no sistema imune de pacientes
portadores de vários tipos de câncer.
Segundo Kiessling et al. (1996) e Reichert et al. (2002), isso pode estar
relacionado à liberação de citocinas imunossupressoras pelas células neoplásicas que
induziriam a degradação de constituintes do TCR, já que o referido domínio pode ser
clivado pela atividade proteolítica das caspases induzida por Fas (GASTMAN et al.,
1999). Reichert et al. (2002) encontraram ainda, que o aumento na proporção das
células apoptóticas estava relacionada com a redução na expressão do domínio ]. Como
sugeriram La Gruta et al. (2004), a redução ou ausência da expressão de proteínas
formadoras do complexo TCR, como a proteína ] está diretamente relacionada à
irresponsividade dos LT frente a estimulação antigênica.
O Fas é um receptor da família do TNF, membro dos receptores com domínio de
morte que pode estar envolvido na apoptose de linfócitos em tumores humanos
(ALDERSON et al., 1995).
Outra proteína chamada CTLA-4 (CD152), homóloga à CD28, liga-se ao B7-1 e
B7-2, e é expressa nas células T ativadas, mas não nas células T naive. CTLA-4 inibe a
ativação da célula T, possivelmente bloqueando a fosforilação das cadeias ]associadas
ao receptor de célula T (TCR) ao recrutar a fosfatase para sinapse. APCs normais em
37
repouso, que podem apresentar antígeno próprio, mas expressam pouco B7, ligam-se ao
CTLA-4 e induzem tolerância nas células T auto-reativas (ABBAS e LICHTMAN,
2005).
A MMP-9 também está envolvida no mecanismo de escape (evasão) à vigilância
imunológica ao clivar o receptor de IL-2, suprimindo a proliferação de células T
(COUSSENS e WERB, 2001) ou, quando ativa TGF-E, um importante inibidor da
resposta por célula T contra tumor (YU e STAMENKOVIC, 2000; GORELIK e
FLAVELL, 2001).
Os mecanismos utilizados para escape às reações de defesa nas neoplasias
humanas são variados, o que pode ser complicado pela supressão da imunidade local e
sistêmica exercida por elas. Isso pode explicar a discrepância entre falhas e sucessos nas
imunoterapias (WHITESIDE, 2005) .
2.5 PAPEL DO TGFEE TNFD1F-N% NO DESENVOLVIMENTO DO CEO
O TGF-Eé uma proteína cuja principal função no sistema imune é inibir a
proliferação e ativação de linfócitos e outros leucócitos, comumente designados
EEeEcodificados por genes diferentes, entre os quais, o E1 é o mais
freqüentemente superregulado nas células tumorais,podendo ser expresso por linfócitos
reguladores e/ou células neoplásicas para inibir a resposta de LTC, promovendo a
progressão e invasão tumoral (DERYNCK e FENG, 1997; GASTMAN et al., 1999;
GORELIK e FLAVELL, 2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005).
No tecido epitelial normal, TGF-E regula o crescimento e a diferenciação
celular, porém, freqüentemente, funciona como supressor tumoral no início da
carcinogênese, depois, passa a funcionar como um promotor na progressão e metástase
(MASSAGUÉ, BLAIN e LO, 2000; MOUSTAKAS et al., 2002).
O papel supressor do TGF-E é melhor ilustrado através da mutação de genes que
codificam seus receptores. Sendo assim, regulação negativa ou dano na disposição dos
receptores na superfície dos linfócitos T citolíticos, permitem que as células tumorais
38
escapem aos efeitos inibitórios de TGF-EDERYNCK, AKHURST e BALMAIN,
2001).
Gorelik e Flavell (2001) desenvolveram ratos transgênicos sem receptor de
TGF-E tipo II (dnTGF-RII) nas células T CD4 e CD8 e testaram seu efeito anti-tumoral
em modelos de timoma e melanoma, os quais estão associados com a produção de TGFE, resultando em ratos resistentes ao crescimento tumoral, por uma potente resposta
tumor-específica por parte dos LTC. Porém, isso funciona quando o bloqueio de TGF-E
ocorre antes das células tumorais inibirem as células T, sugerindo a inibição da
diferenciação de LTC e/ou expansão clonal, ou ainda destruição dos LTC pelo grande
número de células tumorais. Contudo, ficou claro que o bloqueio de TGF-E favorece a
resposta imune anti-tumoral.
Glinka, Chang e Prud`homme (2006) observaram o papel inibitório de TGF-E,
ao utilizar uma proteína B7-1 mutante (B7-1wa) que se liga seletivamente ao CTLA-4,
associando-a à pré-proinsulina (PPins) e ao ácido glutâmico (GAD65) como vacina,
ambos utilizados contra diabetes auto-imune, com resultados favoráveis restritos,
induzindo
assim
o
aumento
de
células
T
regulatórias
(Treg)
que
expressavamCTLAFoxpe7GF-E, tendo um efeito protetor contra a doença. A
deleção de TGF-E abolia o efeito supressor exercido pela célula Treg.
Glick et al. (1994) demonstraram que a diminuição autócrina de TGF-E em
ceratinócitos levou lesões papilomatosas a se transformarem em carcinomas, assim
como no câncer cervical, porém, as células cancerígenas desenvolvem uma resistência
parcial ou total a essa inibição nas células transformadas (DONALISIO et al., 2008).
Trombospondina, proteína da matriz extracelular e a integrina DvE6 podem
mediar ativação do TGF-E em diferentes contextos, e as células tumorais estão bem
equipadas
para
isso
(SCHULTZ-CHERRY
e
MURPHY-ULLRICH,
1993;
&5$:)25'HWDO6HJXQGR<XH6WDPHQNRYLF003¶VHH[SUHVVDV
freqüentemente em células malignas, principalmente em áreas de invasão, também
podem ativar TGF-E e sugerem que essas proteínas podem resultar de um processo
39
fisiológico de remodelação que são aproveitadas e adaptadas pelas células tumorais para
promover crescimento e invasão tumoral.
Logullo et al. (2003) estudaram a expressão do TGF-E1 em 140 casos de
Carcinoma Epidermóide de cabeça e Pescoço, observando positividade em apenas 52
(37,1%) casos sendo que, 16 (11,4%) destes apresentaram reatividade em >60% das
células e 9/16 ocorreram na cavidade oral. Nas adjacências, aparentemente normais, foi
observado positividade em todos os casos estudados, sendo que em apenas 16 destes, tal
expressão estendeu-se até as camadas superficiais, estando os mesmos associados com
positividade tumoral. Os receptores de TGF-E I e II foram avaliados em 20 casos da
cavidade oral (17 positivos para TGF-E e 3 negativos). Forte e difusa positividade foi
observada para RII nos 17 casos positivo e 2/3 foram negativos enquanto, apenas 9/17
casos positivos para RI, sugerindo uma interrupção na trajetória do TGF-E.
Iamaroon, Pattamapun e Piboonniyom (2006) também sugeriram alteração no
caminho do TGF-E indicada pela redução ou ausência na expressão da molécula
sinalizadora de TGF-E (Smad4), observando expressão desta em apenas 60% dos 15
casos de CEO comparados aos 82% dos 11 tecidos normais utilizados como controle.
Vagenas et al. (2007) ao estudarem 110 casos de carcinoma gástricos,
encontraram 71% de positividade para o TGF-E, a qual não foi observada no tecido
normal, sendo considerada como um fator prognóstico independente.
$R HVWXGDU D DWLYLGDGH LQLELWyULD GR 7*)ȕ H ,/-4 em linhagens de células de
câncer cervical CasKi e SiHa, HPV-16 positivas, Donalisio et al. (2008) concluíram que
estas células são resistenWHV D DPEDV DV FLWRFLQDV HPERUD R 7*)ȕ WHQKD VLGR PDLV
eficiente que a IL-4 no controle da infecção por HPV-16, funcionando como supressor
tumoral.
Para Yeh et al. (2008), TGF-E tem papel essencial na progressão tumoral e
metástase, através da ativação GD,..ĮȕH1)-NB resultando na ativação da integrina
DvE e migração de células (JJ012) de condrossarcoma humano.
40
$V %03 VmR FLWRFLQDV GD VXSHUIDPtOLD 7*)ȕ TXH H[HUFHP P~OWLSODV
funções que influenciam na diferenciação de muitos tipos celulares, sendo seu efeito
limitado ao tempo de exposição e à concentração no desenvolvimento embrionário e na
vida adulta, em eventos da tomorigênese como apoptose, esteve relacionado ao tempo
de exposição, já no processo de migração não foi encontrada essa relação, em linhagens
de células do câncer de mama (MCF-7) (STEINERT et al., 2008).
Via de sinalização das BMPs tem mostrado inibir a tumorigênese de vários tipos
tumorais, incluindo cérebro, estômago e carcinoma de células basais da pele, mas
Katsuno et al. (2008) esWXGDQGRDDomRGR7*)ȕH%03-2 em uma linhagem celular
(MDA-231-D) de câncer de mama, observaram que o crescimento dessas células não
foram afetados, porém verificou uma indução da motilidade e invasividade dessas
células através da degradação do colágeno tipo I.
O TNFDé considerado um dos maiores mediadores da inflamação, que induz
outros mediadores e proteases na orquestra da resposta inflamatória (BALKWILL,
2002), estando envolvido em diversos passos da tumorigênese, incluindo transformação,
promoção, sobrevivência, proliferação, angiogênese e metástase (AGGARWAL et al.,
2006).
Para Aggarwal (2003), o TNFDquando expresso localmente por células do
sistema imune, tem um papel terapêutico, todavia quando desregulado e secretado na
circulação, pode mediar uma variedade de doenças, inclusive o câncer. Inicialmente
pensou-se que só os macrófagos produziam TNFD, mas segundo Digel et al. (1990) o
TNFD é produzido por uma grande variedade de células tumorais.
As células cancerígenas expressam uma forma ativada de NF-NB, induzida por
vários estímulos inflamatórios, que regula os produtos gênicos (AGGARWAL, 2004;
PACIFICO e LEONARDI, 2006; LUEDDE et al., 2007), sendo um importante elo entre
câncer e inflamação, o qual pode ser disparado pela superregulação de TNFD
(PIKARSKY et al., 2004).
41
NF-NB tem um importante papel anti-apoptótico, crítico para a sobrevivência
das células cancerosas, sendo cotado como um importante alvo para a terapia do câncer.
A ativação de NF-NB induzida por TNF, protege as células contra apoptose através da
supressão da ativação de JNK e indução de fatores de sobrevivência tais como XIAP e
survivin (WANG, CHEN e LIN, 2007; LUEDDE et al., 2007). Porém, a morte
persistente das células do fígado, induzida por TNF, provavelmente se deve à atividade
persistente de JNK mediada por TNFR2 (SCHWABE e BRENNER, 2006).
As citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1 dependem do complexo da kinase que
degrada INB para ativação do fator de transcrição NF-NB. Esse complexo (IKK) é
constituído por duas kinases, IKKD e IKKE e uma subunidade regulatória denominada
NEMO, associadas com ambas IKKs, o qual regula a atividade dessas subunidades IKK
por vias de sinalização distintas, onde a associação de NEMO com IKKD ou NEMO
com IKKE podem formar complexos funcionais para ativação de NF-NB em resposta à
IL-1, mas não ao TNF, que depende unicamente do complexo NEMO:IKKE para
transcrição (SOLT et al., 2007).
Wang, Chen e Lin (2007) demonstraram que a supressão simultânea da ativação
de IKKE e Akt, resulta no eficiente bloqueio do fator anti-apoptótico XIAP, obstruindo
a via de sobrevivência mediada por NF-NB, a qual pode deixar as células cancerosas
mais vulneráveis a citotoxidade induzida por TNF, melhorando dramaticamente a ação
anti-câncer do TNF.
Segundo Greten et al. (2004), a deleção de IKKE não diminui a inflamação, mas
reduz a incidência de câncer no intestino, assim como a supressão de TNFD ou indução
de INB resulta na falha da progressão tumoral no fígado (PIKARSKY et al., 2004). Já
Luedde et al. (2007) concluiram que NEMO é essencial para ativação do NF-NB que
regula a resposta celular à inflamação, funcionando como um supressor tumoral no
fígado de ratos, fornecendo um paradigma para o seu papel no câncer.
Deleção de NEMO bloqueia completamente a ativação de NF-kB deixando o
fígado mais sensível à toxidade do TNF induzida por lipoproteínas (LPS), causando
esteatohepatite e carcinoma hepatocelular espontâneos. Assim como Maeda et al. (2005)
42
não encontraram o PHVPRUHVXOWDGRFRPDGHOHomRGDVXEXQLGDGH,..ȕ$OpPGRPDLV
o estresse oxidativo pode induzir a apoptose e proliferação compensatória levando à
diminuição da capacidade regenerativa e aumento de células ovais progenitoras
(LUEDDE et al., 2007).
A sinaOL]DomR PHGLDGD SRU UHFHSWRU GH 71)Į 71)5 H )DV QHFHVViULD SDUD
ativação do domínio de morte (FADD) em ceratinócitos e hepatócitos, é requerida para
o desenvolvimento da inflamação e câncer de pele e fígado em ratos com inibição de
NF-NB. Invasão massiva de polimorfonucleares está frenqüentemente presente (LIND et
al., 2004; SCHWABE e BRENNER, 2006). Segundo Lind et al. (2004), a superUHJXODomRGH71)ĮHPFHUDWLQyFLWRVLQGHSHQGHGDLQIODPDomRQHVVHVUDWRV
Os macrófagos próximos ao tumor são os maiores produtores de TNF, tendo
papel na promoção, crescimento e invasão tumoral (MOORE et al, 1999; BALKWILL e
MANTOVANI, 2001), embora seu fator inibitório tenha efeito anti-apoptótico,
impedindo a transcrição de p53 (HUDSON et al., 1999).
Um dos membros da família TNF, conhecido como Fas (CD95), é expresso na
superfície de muitos tipos celulares, inclusive do câncer, e inicia uma cascata de
sinalização à morte apoptótica da célula no momento em que este se liga ao ligante Fas,
expresso nas células T ativadas (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Segundo Iwase et al.
(2003), embora as células do câncer expressem Fas na sua superfície, são relativamente
resistentes à apoptose mediada por Fas. Para Fujieda et al. (2000), não existe correlação
entre a expressão de Fas ou FasL e qualquer fator clinicopatológico. A expressão de Fas
não afetou a apoptose espontânea das células neoplásicas.
Muitas são as moléculas que sinalizam apoptose mediada por Fas, podendo este
ser modulado por fatores anti-apoptóticos, como c-FLIP, o qual forma um complexo
estável com Fas, FADD e Caspase 8 (ASHKENAZI e DIXIT, 1998; KRUEGER et al.,
2001), sendo o mesmo mais elevado em células cancerosas que em células normais
(RIPPO et al., 2004).
No estudo realizado por Stang et al. (2007) eles demonstraram que a apoptose
pode ser induzida pelo fator regulador de interferon-1 (IRF-1), independente da ligação
43
de Fas com o domínio de morte (FADD). Porém envolve clivagem das caspases-3, -7 e
-8, visto que o inibidor específico da caspase-8 (IETH) leva à expressão de c-FLIP em
células cancerosas com déficit de caspase-8 e segundo Scaffidi et al. (1999) ocorre o
bloqueio da clivagem da caspase-8 quando esta associa-se a c-FLIP.
Kondo et al. (2006) estudaram o papel da associação da Kinase (PI3-K) com Akt
no controle da sobrevivência da célula do CEO, utilizando o inibidor de PI3-K, o qual
suprimiu a fosforilação de Akt e acelerou apoptose mediada por Fas no CEO. Embora o
inibidor de PI3-K não tenha afetado a expressão de Fas nas célula do CEO, regulou
negativamente c-FLIP, proteína inibidora de morte programada por Fas, favorecendo a
suscetibilidade da apoptose mediada por Fas.
O glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR) é um membro da superfamília
de receptores TNF o qual é biologicamente multifuncional, participando da proliferação,
ativação, diferenciação e sobrevivência dos linfócitos T. Atua como potente coestimulador na ativação inicial dos linfócitos CD4, através da sinalização do NF-kB que
resulta na produção de IL-2. Porém, a co-estimulação do GITR mostra grande
habilidade na produção de IL-10 que contra-regula a resposta proliferativa à IL-2
(KANAMARU et al., 2004).
44
PROPOSIÇÃO
45
3- PROPOSIÇÃO
A proposta deste estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquímica do
NFN-B, TNFD TGF-E FOXP3 e CD8, em Displasias Epiteliais e Carcinomas
Epidermóides Orais, visando um maior conhecimento da participação da inflamação na
transformação e progressão tumoral, para auxiliar na avaliação dos parâmetros de
agressividade já conhecidos, bem como no estabelecimento de outros parâmetros que
possam elucidar o comportamento biológico da lesão.
46
MATERIAL E
MÉTODOS
47
4- MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente trabalho consta de um estudo observacional, transversal da expressão
imuno-histoquímica dos anticorpos estudados, nos casos de Displasias Epiteliais e
Carcinomas Epidermóides Orais selecionados.
4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA
4.2.1 População
Casos de Displasias Epiteliais Orais (DEO) e Carcinomas Epidermóides Orais
(CEO) pertencentes aos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Universidade
Federal de Sergipe em Aracaju-SE e do Laboratório de Anatomia Patológica da
Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, em Natal-RN, diagnosticados no período de 1996-2007.
4.2.2 Amostra
4.2.2.1 Critério de inclusão
Foram incluídos no estudo 20 casos de DEO e 40 casos de CEO de biópsias
excisionais, dos referidos serviços, cujos blocos de parafina continham material
suficiente para elaboração do estudo.
4.2.2.2 Critério de Exclusão
Foram excluídos aqueles casos cujos blocos de parafina continham material
insuficiente para a análise proposta, bem como os espécimes provenientes de pacientes
que haviam se submetido a tratamento prévio com quimio ou radioterapia.
4.3 IMPLICAÇÕES ÉTICAS
A realização da pesquisa teve início após aprovação do projeto pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), sob
parecer de no 233/2007.
48
4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO
Do material emblocado em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5Pde
espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina, os quais foram observados
em microscopia de luz, para confirmação diagnóstica e análise dos critérios para
classificação das DEO e gradação histológica dos casos de CEO.
4.4.1 DISPLASIAS EPITELIAIS
As displasias foram classificadas em Leve (L), Moderada (M) e Severa (S), a
depender do grau de envolvimento das camadas epiteliais, baseando-se nos critérios
sugeridos
pela
OMS
em
2005,
conforme
descritos
no
quadro
01
(WARNAKULASURIYA et al., 2008).
Quando as alterações celulares e arquiteturais se restringiam ao terço inferior do
epitélio as displasias foram classificadas como Leves; quando se estendiam até o terço
médio, como Moderadas; e nos casos em que tais alterações ultrapassavam o terço
médio e/ou as atipias citológicas estavam presentes em maior quantidade,
como
Severas.
Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasia.
ARQUITETURA
Perda de Estratificação
Perda de polaridade da camada basal
Hiperplasia da camada basal
Projeção em forma de gota
Aumento do nº de mitoses
Mitoses acima da basal
Disceratose (ceratinização prematura)
Pérolas córneas
-
CITOLOGIA
Anisocariose (tamanho)
Pleomorfismo nuclear (forma)
Anisocitose
Pleomorfismo celular
Variação na relação núcleo/citoplasma
Aumento do nº de núcleos
Mitoses atípicas
Aumento do número de nucléolos
Hipercromatismo
4.4.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE
Para análise da gradação histológica dos casos de CEO foi utilizado um método
desenvolvido para este estudo, baseado em parâmetros bem embasados na literatura,
como: pleomorfismo celular, número de mitoses e presença de ceratinização, analisados
dentro do dismorfismo celular, além de dissociação das células e organização das
49
massas (Quadro 02), além de maturidade celular e tipo de invasão, conforme Martins
Neto (1999).
Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais.
Favoráveis
Muitas pérolas córneas
CRITÉRIOS
Ceratina
Anisocitose/Anisocariose
Hipercromatismo
Mitoses
Dissociação das células
Arquitetura
Contrários
Poucas pérolas córneas e/ou
ceratinizações isoladas
Acentuada
Muito
Muitas, espalhadas
Soltas
Desorganizada
Leve
Pouco
Poucas, na periferia
Unidas
Organizada (lembrando
as camadas do epitélio)
Obs: Se 03 ou mais critérios representarem um prognóstico favorável, utiliza-VH ³´
]HURFDVRFRQWUiULR³´XP
)RUDPDWULEXtGRVRVYDORUHV³´RX³´ para cada um dos parâmetros avaliados
(Quadro 03), a fim de testar todas as combinações possíveis e ordená-las. Após análise
de cada caso, estes foram agrupados e classificados como Estágio I (baixo grau) e
Estágio II (alto grau), de acordo com o quadro 04, para viabilizar uma análise
comparativa dos mesmos com a expressão dos anticorpos estudados e com a intensidade
do infiltrado inflamatório.
Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO
ESCOR
E
0
1
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
MASSAS
FRONT INVASIVO
Presença Dismorfism Maturidade
Tipo
o
Ausente
Baixo
Maduras
Massas
(Predominant
Trabéculas
e)
Presente
Alto
Imaturas
Ninhos
(Predominant
Cordões
e)
Para o presente estudo considerou-se os seguintes aspectos:
Presença de massas entre o epitélio de revestimento ou superfície tecidual
ulcerada e o Front Invasivo, dá uma conotação de antiguidade à lesão. O Dismorfismo
das células epiteliais, sendo aqui caracterizado por um conjunto de alterações que
50
aproximam ou distanciam do normal, as massas e/ou células, da estrutura original do
epitélio
de
revestimento,
como
a
formação
anormal
de
ceratina,
anisocitose/anisocariose, hipercromatismo e nº de mitoses aumentado, associado à
dissociação das células e desarranjo arquitetural, denunciando a incapacidade de
diferenciação normal dessas células (Quadro 02). A maturidade, quando predominante
no front invasivo dá a impressão de freio no processo de invasão, justificando a
avaliação do tipo de invasão que revela uma menor ou maior rapidez no crescimento
e/ou invasão, a exemplo dos casos de invasão em trabéculas ou massas, com
predominância de células maduras, em relação àqueles que invadem como pequenos
ninhos ou cordões de células imaturas, como utilizado na própria classificação de Bryne
/RJR D ³SUHVHQoD GH PDVVDV´ H R ³WLSR GH LQYDVmR´ VmR RV IDWRUHV
GHWHUPLQDQWHV HQTXDQWR R ³GLVPRUILVPR´ H D ³PDWXULGDGH FHOXODU´ VmR DWHQXDQWHV RX
agravantes dos primeiros, respectivamente.
Quadro 04- Estadiamento do CEO
SITUAÇÕES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Tipo de
Invasão
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
Maturidade
0
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
1
Presença Dismorfismo ESTÁGIOS
de Massas
0
0
I
0
1
I
1
0
I
1
1
I
0
0
I
0
1
I
1
0
II
1
1
II
0
0
II
0
1
II
1
0
II
1
1
II
0
0
II
0
1
II
1
0
II
1
1
II
Todos os casos foram submetidos à classificação desenvolvida por Bryne (1998)
para o Front LQYDVLYR4XDGURFRPHVHPRSDUkPHWUR³5HVSRVWDLQIODPDWyULD´DVHU
avaliado e os resultados foram graduados, conforme escores obtidos após análise:
Estágio I (escores 4-8) e (escores 3-6), respectivamente e Estágio II (escores 9-16) e
(escores 7-12), respectivamente, adaptados para este estudo, conforme Miranda (2002).
51
A intensidade do infiltrado inflamatório foi avaliada tanto nas DEO como nos CEO, em
Leve (L), Moderado (M) e Intenso (I), adaptado de Bryne (1998).
Quadro 05- Gradação histológica de malignidade proposta por Bryne.(1998)
ESCORE
1
2
3
4
PARÂMETROS (Bryne)
Pleomorfismo
Tipo de invasão
nuclear
(maturidade)
altamente
pouco pleomorfismo
massas com
ceratinizado
nuclear (mais de
bordas bem
(mais de 50%
75% de células
delimitadas
das células)
maduras)
moderadament
moderado
cordões ou
e ceratinizado
pleomorfismo
trabéculas sólidas
(20 a 50% das nuclear (50 a 75% de
e massas
células)
células maduras)
infiltrativas
mínima
abundante
pequenos grupos
ceratinização
pleomorfismo
ou cordões de
(5 a 20% das
(25 a 50 % de
células
células)
células maduras)
infiltrativas
(N>15)
nenhuma
pleomorfismo
dissociação
ceratinização
nuclear extremo (0 a celular difusa /ou
(O a 5 % das
25% de células
células
células)
maduras)
individuais
(N<15)
Grau de
ceratinização
Resposta
inflamatória
Intenso
Moderado
Escasso
Ausente
4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Os espécimes HPEORFDGRV HP SDUDILQD IRUDP VXEPHWLGRV D FRUWHV GH ȝ de
espessura e estes, montados em lâminas histológicas previamente limpas e
desengorduradas,
preparadas
com
adesivo
à
base
de
organosilano
(3-
aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Aos cortes
histológicos foram aplicados anticorpos dirigidos contra as proteínas estudadas, cujas
especificações estão contidas no quadro 06. Como controles negativos foram omitidos
os anticorpos primários e para os positivos foram utilizadas secções de câncer de mama
e granuloma periapical previamente testados.
4.5.1 Método da Imuno-histoquímica
ƒ
Xilol 1 (30 minutos), estufa 59º - desparafinização
ƒ
Xilol 2 (20 minutos), temperatura ambiente - desparafinização
ƒ
Etanol absoluto I, II, III ± 5 minutos cada;
52
ƒ
Etanol 95º/ 5minutos;
ƒ
Etanol 80º/ 5 minutos;
ƒ
Etanol 95% + Hidróxido de amônio a 10%/ 10 minutos (retirada do pigmento
formólico);
ƒ
Lavagem das lâminas em água corrente, 10 minutos;
ƒ
Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada.
ƒ
Recuperação antigênica;
ƒ
Água corrente, 10 minutos;
ƒ
Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 VOL;
ƒ
Água corrente, 10 minutos;
ƒ
Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada;
ƒ
TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada;
ƒ
Incubação do anticorpo primário + BSA;
ƒ
Lavagem e imersão das lâminas em TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada;
ƒ
Tween 20, 2 trocas, 5 minutos cada;
ƒ
Incubação do anticorpo secundário + SABC ou Envision;
ƒ
Incubação do complexo avidina/biotina, diluído em TRIS gelado (A+B);
ƒ
Lavagem com TRIS;
ƒ
Incubação da diaminobenzidina;
ƒ
Revelação;
ƒ
Lavagem em água corrente, 10 minutos;
ƒ
Passagem em água destilada;
ƒ
Contracoloração com Hemtoxilina de Mayer, 10 minutos;
ƒ
Lavagem em água corrente, 10 minutos;
ƒ
Água destilada, duas trocas, 5 minutos;
ƒ
Desidratação, diafanização e montagem.
53
Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários.
ANTICORPO
CLONE
NFN
N-B*
NFN-B p65
(A)
DILUIÇÃO/
TEMPO DE
INCUBAÇÃO
1:100
3 horas
1:100
Overnigth
1:500
TGFE1 (V)
TGFE
E*
Overnigth
1:100
FOXP3(H190)
FOXP3*
Overnigth
1:200
C8/144B
CD8**
¶
* Santa Cruz Biotechnology, Inc. e ** DAKO
TNFD
D*
TNFD(2C8)
RECUPERAÇÃO
ANTIGÊNICA
MÉTODO
Citrato
EnvisionHRP**
Pepsina
EnvisionHRP**
EnvisionHRP**
EnvisionHRP**
SABC**
Pepsina
Tris-EDTA
PH-9,0
Tris-EDTA
PH-9,0
4.6 ANÁLISE DOS RESULTADOS
4.6.1 Análise Morfológica
Após a classificação dos casos de DEO e CEO, quanto ao grau histológico,
conforme a metodologia descrita foi realizada análise de associação entre: os graus
histológicos dos mesmos e a intensidade do infiltrado inflamatório; entre os estágios
resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo
e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998); e entre os estágios
resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo
e os parâmetros utilizados pela mesma.
4.6.2 Análise Imuno-histoquímica
Foram realizadas análises semi-quantitativas dos anticorpos anti-CD8, antiFOXP3, anti-7*)ȕ H DQWL-71)Į HP FpOXODV GR LQILOWUDGR LQIODPDWyULR ,, H SDUD RV
anticorpos anti-7*)ȕ DQWL-71)Į H DQWL-NF-NB em células epiteliais que tiveram
marcação expressiva. Todos os casos foram classificados como de baixa expressão,
quando apresentavam < de 5% das células marcadas, de expressão moderada quando a
marcação envolvia entre 5% e 50% das células e de alta expressividade quando >50%
das células se encontravam marcadas (Quadro 07), segundo critérios propostos por
Abbas (2007).
54
Os resultados foram analisados em relação ao tipo de lesão, grau histológico e
intensidade do infiltrado inflamatório. Foram consideradas positivas as reações que
apresentaram coloração marrom. As análises morfológicas e imuno-histoquímicas
foram feitas por um único observador, por três vezes consecutivas.
Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos.
EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS
CD8/FOXP3/7*)ȕ71)ĮNFN
N-B
SEMI-QUANTITATIVA
Baixa
< 5%
Moderada
5-50%
Alta
> 50%
Abbas (2007)
4.6.3 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico com o objetivo
de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 13.0 para
Windows.
Foi empregado o teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher (para valores
menores que 5%) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados entre
o grau histológico de malignidade dos CEO e os parâmetros utilizados nessa avaliação.
Para a verificação das hipóteses de igualdade de expressão dos anticorpos
XWLOL]DGRV&')2;37*)ȕ71)ĮH1)NB) com relação aos tipos de lesão e grau
histológico das displasias (DEO) e carcinomas (CEO), utilizou-se o teste não
paramétrico de Mann-Whitney, uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do
estabelecimento de escores.
A existência de correlação entre a expressão dos marcadores imunoKLVWRTXtPLFRV &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H 1)-NB) e a intensidade do infiltrado
inflamatório, segundo o tipo de lesão, foi investigada utilizando-se o coeficiente de
correlação de Spearman.
O nível de significância utilizado para todos os testes foi de 5%.
55
RESULTADOS
56
5- RESULTADOS
5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS
a) DISPLASIAS EPITELIAIS
Dos 20 casos de DEO estudados, 9 (45%) foram classificados como displasias
leves (L), 3 (15%) moderadas e 8 (40%) severas. Quanto à intensidade do infiltrado
inflamatório, 5 (25%) eram leves (L), 10 (50%) moderados (M) e 5 (25%) intensos (I)
(Tabela 01).
Tabela 01- Gradação histológica das displasias epiteliais baseada na OMS (2005) e sua
relação com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.
Infiltrado Inflamatório
DEO
L
M
I
GRAU
N
%
n
%
n
%
n
%
9
45
2
22,2
4
44,4
3
33,3
L
3
15
1
33,3
2
66,6
M
8
40
2
25
4
50
2
25
S
20
100
5
25
10
50
5
25
TOTAL
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
b) CARCINOMA EPIDERMÓIDE
No exame microscópico, os carcinomas exibiram uma gama muito grande de
variações no que diz respeito à sua invasão, maturidade e organização, independente da
localização anatômica e idade dos pacientes. Os CEO foram estadiados conforme a
metodologia proposta (Quadro 08).
'RVSDUkPHWURVDYDOLDGRV³7LSRGHLQYDVmR´REWHYHFDVRVFRPHVFRUH
³´HFRPHVFRUH³´³0DWXULGDGH´ FRPHVFRUH³´H
FRP HVFRH ³´ ³3UHVHQoD GH 0DVVDV´ FRP HVFRUH ³´ H FRP
HVFRUH ³´ H SRU ~OWLPR R FULWpULR ³'LVPRUILVPR´ FRQWDELOL]RX FDVRV FRP
HVFRUH³´HFRPHVFRUH³´(Figuras 01-08).
Dos 40 casos analisados, 17 (42,5%) se encontravam no Estágio I e 23 (57,5%)
no Estágio II. Quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, 11 (27,5%) foram leves
(L), 10 (25%) foram moderados (M) e 19 (47,5%) intensos (Tabela 02).
57
Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos casos de Carcinomas
Epidermóides de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo.
Natal/RN 2009.
CASOS
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Tipo de
invasão
0
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
ESCORES
Maturidade
Presença de
massas
0
1
0
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
1
Dismorfismo
ESTÁGIO
0
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
I
II
II
II
II
II
II
II
I
II
II
II
I
II
II
I
II
I
II
II
I
I
II
I
I
I
I
I
I
II
II
I
II
II
II
II
I
I
II
I
Tabela 02- Correlação entre a gradação histológica de malignidade dos CEO e a
intensidade do infiltrado inflamatório, nas lesões estudadas. Natal/RN 2009.
58
CEO
Estágios
I
II
TOTAL
L
N
17
23
40
%
42,5
57,5
100
N
2
9
11
Infiltrado Inflamatório
M
%
n
%
11,8
4
23,5
39,1
6
26,1
27,5
10
25
I
n
11
8
19
%
64,7
34,8
47,5
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
Do ponto de vista do infiltrado inflamatório, dos 11 casos com infiltrado
inflamatório leve 2 (18,2%) pertenciam às lesões de grau I e 9 (81,8%) às de grau II;
dos 10 casos com infiltrado inflamatório moderado 4 (40%) pertenciam às lesões de
grau I e 6 (60%) às de grau II; e dos 19 casos com infiltrado inflamatório intenso 11
(57,9%) pertenciam às lesões de grau I e 8 (42,1%) às de grau II.
Os 40 casos de CEO também foram avaliados pelo método de Bryne para o front
invasivo (1998) e em seguida classificados como Estágio I (para escores entre 3-6 e 48) e Estágio II (para escores entre 7-12 e 9-16), conforme metodologia proposta. Foi
observada uma divergência de 13,3% e 20% para os casos sem e com o parâmetro em
questão, respectivamente (Quadro 09) em relação aos resultados obtidos pelo método
desenvolvido para este estudo (Quadro 08), embora o número total de casos de alto e
baixo graus, tenham sido coincidentemente iguais (Gráfico 01).
Grau Histológico de Malignidade
Baixo
Pesquisa
Bryne
Alto
0
5
10
Gráfico 01- Comparação das GHM
15
20
25
59
Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides de
acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.
CASOS
GC
M
TI
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
3
4
3
2
3
2
4
4
3
3
3
3
4
4
3
1
4
3
4
2
4
3
2
1
3
3
3
4
4
3
4
3
4
4
4
3
3
3
3
2
1
2
3
4
3
2
4
4
1
2
1
1
1
4
4
1
4
1
4
1
1
2
3
1
2
1
1
1
1
3
3
1
4
4
3
3
1
3
3
1
1
4
4
2
2
4
1
4
1
2
1
3
2
3
3
1
4
1
4
2
1
2
2
1
2
1
1
1
1
1
2
1
4
4
1
2
1
2
2
2
ESCORES
RI
TOTAL
s/RI
1
2
2
1
1
1
1
2
3
1
2
1
1
4
2
1
4
1
3
3
3
4
2
1
1
2
2
4
1
4
1
2
3
4
2
1
3
1
4
1
5
10
10
8
8
8
9
12
5
7
5
7
7
11
10
3
12
5
12
5
6
7
7
3
7
5
5
6
6
7
9
5
12
12
8
8
5
8
8
5
c/RI
I
II
II
II
II
II
II
II
I
II
I
II
II
II
II
I
II
I
II
I
I
II
II
I
II
I
I
I
I
II
II
I
II
II
II
II
I
II
II
I
6
12
12
9
9
9
10
14
8
8
7
8
8
15
12
4
16
6
15
8
9
11
9
4
8
7
7
10
7
11
10
7
15
16
10
9
8
9
12
6
I
II
II
II
II
II
II
II
I
I
I
I
I
II
II
I
II
I
II
I
II
II
II
I
I
I
I
II
I
II
II
I
II
II
II
II
I
II
II
I
Grau de ceratinização (GC); Maturidade (M); Tipo de invasão (TI);Resposta
inflamatória (RI); sem Resposta inflamatória (s/RI) e com Resposta inflamatória (c/RI).
5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
60
As células imunomarcadas foram evidenciadas ao microscópio de luz como uma
pigmentação que variava de castanho claro a marrom. A positividade foi observada
tanto nas células epiteliais (CE) como no infiltrado inflamatório (II) presente nas lesões
de DEO e CEO estudadas.
Tabela 03- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGFE, TNFD
e NF-NB nas DEO e CEO. Natal/RN 2009.
ANTICORPOS
CD8
FOXP3
TGFE
E (II)
TGFE
E (CE)
TNFD
D (II)
TNFD
D (CE)
NF-N
NB
ESCORES*
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
<5%
5-50%
>50%
DEO (n=20)
n
4
4
12
11
5
4
4
5
11
4
8
8
3
10
7
6
7
7
6
14
%
20
20
60
55
25
20
20
25
55
20
40
40
15
50
35
30
35
35
30
70
CEO (n=40)
N
28
3
9
24
11
5
7
16
17
16
14
10
15
14
11
16
17
7
20
15
5
%
70
7,5
22,5
60
27,5
12,5
17,5
40
42,5
40
35
25
37,5
35
27,5
40
42,5
17,5
50
37,5
12,5
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
*De acordo com Abbas (2007)
Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.
A marcação do anti-CD8 e anti-FOXP3 foi observada nas células inflamatórias;
o anti-NF-NB, no núcleo tanto das células epiteliais como das células inflamatórias,
embora apenas as epiteliais tenham sido avaliadas, conforme metodologia; já o TGFE e
o TNFD foram evidenciados tanto no núcleo como no citoplasma das células epiteliais e
inflamatórias.
61
A positividade epitelial para TGFE e TNFD era difusa tanto nas DEO como nos
CEO (figuras 17-32).
Todos os casos de DEO e CEO investigados expressaram positividade para
todos os anticorpos. Com exceção do TGFE presente nas células inflamatórias, que
apresentou expressão <5% em 20% dos casos de DEO, superando os 15% dos CEO, os
demais marcadores apresentaram maior expressividade, embora discreta, nas DEO do
que nos CEO, embora uma grande diferença fosse notada, na expressão do CD8 e NFNB, que foram bem mais expressas nas DEO (Tabela 03).
Tabela 04- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3,
e NF-NB) de acordo com o grau das DEO. Natal/RN 2009.
DEO (n=20)
ANTICORPOS ESCORES*
L
M
N
%
N
%
2
22,2
<5%
1
11,1
1
33,3
CD8
5-50%
6
66,6
2
66,6
>50%
3
33,3
3
100
<5%
3
33,3
FOXP3
5-50%
3
33,3
>50%
2
22,2
<5%
4
44,4
1
33,3
5-50%
TGFE
E (II)
3
33,3
2
66,6
>50%
<5%
5
55,5
1
33,3
5-50%
TGFE
E (CE)
4
44,4
2
66,6
>50%
1
11,1
2
66,6
<5%
5
55,5
1
33,3
5-50%
TNFD
D (II)
3
33,3
>50%
2
22,2
1
33,3
<5%
5
55,5
1
33,3
5-50%
TNFD
D (CE)
2
22,2
1
33,3
>50%
2
22,2
1
33,3
<5%
5-50%
NF-N
NB
7
77,7
2
66,6
>50%
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
*De acordo com Abbas (2007)
Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.
TGFE, TNFD
S
N
2
2
4
5
2
1
2
6
4
2
2
4
4
3
1
4
3
5
%
25
25
50
62,5
25
12,5
25
75
50
25
25
50
50
37,5
12,5
50
37,5
62,5
62
As expressões imuno-histoquímicas das DEO e CEO foram agrupadas de acordo
com o estágio em que as lesões se encontravam, seguindo a metodologia utilizada
(Tabelas 04 e 05).
Foi observado que a expressão do CD8 >50% ocorreu em 100% dos casos de
DEO moderadas onde a FOXP3 teve expressividade <5%, elevando ao máximo a
UHODomR &'7UHJ RQGH R 7*)ȕ WDQWR QDV FpOXODV HSLWHOLDLV TXDQWR QR LQILOWUDGR
inflamatório dessas mesmas lesões, esteve expresso >5% em 100% dos casos ( 5-50%
em 33,3% e >50% em 66,6%) e em 75% das células inflamatórias dos casos de DEO
severas, embora tenha caído bastante nas células epiteliais (Tabela 04).
Tabela 05- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGFE, TNFD
e NF-NB de acordo com o estágio dos CEO. Natal/RN 2009.
CEO (n=40)
ANTICORPOS ESCORES*
I (n=17)
II (n=23)
N
%
N
%
11
64,7
17
73,9
<5%
CD8
1
5,9
2
8,7
5-50%
5
29,4
4
17,4
>50%
11
64,7
13
56,5
<5%
FOXP3
4
23,5
7
30,4
5-50%
2
11,7
3
13
>50%
5
29,4
2
8,7
<5%
9
39,1
7
41,2
5-50%
TGFE (II)
5
29,4
12
52,2
>50%
9
52,9
8
34,8
<5%
10
43,5
4
23,5
5-50%
TGFE (CE)
4
23,5
5
21,7
>50%
6
35,3
9
39,1
<5%
4
23,5
10
43,5
5-50%
TNFD (II)
7
41,2
4
17,4
>50%
8
47
8
34,8
<5%
7
41,2
10
43,5
5-50%
TNFD (CE)
2
11,7
5
21,7
>50%
9
52,9
11
47,8
<5%
7
41,2
8
34,8
5-50%
NF-NB
1
5,9
4
17,4
>50%
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
*De acordo com Abbas (2007)
Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.
63
O NF-NB encontrava-se altamente expresso em todos os graus das DEO, embora
R 71)Į Vy WLYHVVH XPD PDUFDomR H[SUHVVLYD QDV FpOXODV HSLWHOLDLV GDV '(2 VHYHUDV
marcando >50% das células em 50% dos casos das mesmas (Tabela 04).
Entre os estágios dos CEO, a variação mais significativa foi a da expressão do
TGFE no infiltrado inflamatório dos casos de alto grau, com 56,5% de positividade
>50%, em relação aos de baixo grau, com 29,4% de positividade >50% (Tabela 05).
Tabela 06- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGFE, TNFD
e NF-NB de acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório nas DEO. Natal/RN
2009.
Infiltrado Inflamatório nos DEO (n=20)
ANTICORPOS ESCORES*
L
M
I
N
%
N
%
N
%
2
40
1
10
1
20
<5%
2
40
2
20
CD8
5-50%
1
20
7
70
4
80
>50%
3
60
6
60
2
40
<5%
1
20
2
20
2
40
FOXP3
5-50%
1
20
2
20
1
20
>50%
4
40
<5%
2
40
1
10
2
40
5-50%
TGFE
E (II)
3
60
5
50
3
60
>50%
1
20
3
30
<5%
1
20
4
40
3
60
5-50%
TGFE
E (CE)
3
60
3
30
2
40
>50%
2
40
1
10
<5%
3
60
6
60
1
20
5-50%
TNFD
D (II)
3
30
4
80
>50%
3
60
2
20
1
20
<5%
2
40
4
40
1
20
5-50%
TNFD
D (CE)
4
40
3
60
>50%
4
80
2
20
<5%
5-50%
NF-N
NB
1
20
8
80
5
100
>50%
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
*De acordo com Abbas (2007)
Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.
Relacionando a expressão do CD8 e FOXP3 com a intensidade do infiltrado
inflamatório nas DEO e CEO, verificou-se que o CD8 tinha uma marcação bem mais
expressiva nas DEO com infiltrado inflamatório moderado (70%) e intenso (80%),
64
caindo abruptamente nos CEO para moderado (20%) e intenso (36,8%), e a FOXP3 que
tinha uma expressão baixa, porém constante (20%) entre os graus de DEO, teve uma
redução de aproximadamente 50% nos CEO, principalmente nos casos que
apresentavam infiltrado inflamatório moderado (10%) e intenso (10,5%) (Tabelas 06 e
07).
2 71)Į WDQWR QDV FpOXODV HSLWHOLDLV TXDQWR LQIODPDWyULDV Wiveram expressão
<50% nas DEO com infiltrado inflamatório leve, aumentando consideravelmente,
>50%, quando o infiltrado inflamatório era moderado (40%) ou intenso (60%) no
epitélio, e moderado (30%) ou intenso (80%) no conjuntivo (Tabela 06).
Tabela 07- Expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD8, FOXP3, TGFE, TNFD
e NF-NB de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nos CEO. Natal/RN
2009.
Infiltrado Inflamatório nos CEO (n=40)
ANTICORPOS ESCORES*
L
M
I
N
%
N
%
n
%
11
100
6
60
11
57,9
<5%
2
20
1
5,8
CD8
5-50%
2
20
7
36,8
>50%
7
63,6
6
60
11
57,9
<5%
2
18,2
3
30
6
31,6
FOXP3
5-50%
2
18,2
1
10
2
10,5
>50%
3
27,2
2
20
2
10,5
<5%
4
36,4
3
30
8
42,1
5-50%
TGFE
E (II)
4
36,4
5
50
9
47,4
>50%
4
36,4
3
30
9
47,4
<5%
3
27,2
5
50
6
31,6
5-50%
TGFE
E (CE)
4
36,4
2
20
4
21
>50%
9
81,8
3
30
9
47,4
<5%
1
9,1
5
50
6
31,6
5-50%
TNFD
D (II)
1
9,1
2
20
4
21
>50%
3
27,2
1
10
10
52,6
<5%
6
54,4
6
60
6
31,6
5-50%
TNFD
D (CE)
2
18,2
3
30
3
15,8
>50%
6
54,4
6
60
8
42,1
<5%
3
27,2
2
20
10
52,6
5-50%
NF-N
NB
2
18,2
2
20
1
5,8
>50%
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
*De acordo com Abbas (2007)
Legenda: CE-Células Epiteliais; II-Infiltrado Inflamatório.
65
1RV &(2 R 71)Į ! IRL SRXFR representativo nos casos com infiltrado
inflamatório leve, marcando 18,2% das células epiteliais e 9,1% das inflamatórias,
elevando discretamente para 30% das células epiteliais e 20% das inflamatórias, nos
casos com moderado infiltrado inflamatório e 16% das células epiteliais e 21% das
inflamatórias, nos casos com intenso infiltrado inflamatório (Tabela 07).
1RV FDVRV FRP LQWHQVR LQILOWUDGR LQIODPDWyULR WDQWR R 71)Į GDV FpOXODV
epiteliais, quanto o NFN-B, tiveram baixa expressividade, apresentando positividade
>50%, em 15,8% e 5,8% dos casos, respectivamente (Tabela 07).
5.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS
Os resultados obtidos foram submetidos a tratamento estatístico com o objetivo
de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 13.0 para
Windows.
Foi empregado o teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher (para valores
menores que 5) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados entre o
estágio em que os CEO se encontravam e os parâmetros utilizados na Gradação
Histológica de Malignidade (GHM), constatando-se que o estágio em que os CEO se
encontrava esteve significativamente associado à maturidade celular, à presença de
massas entre o front invasivo e a superfície da lesão, como também ao dismorfismo das
células e arranjo das massas (Tabela 08).
Tabela 08- Distribuição dos casos de CEO de baixo e alto graus segundo os parâmetros
utilizados na gradação histológica de malignidade. Natal/RN 2009.
GRAU HISTOLÓGICO DE MALIGNIDADE
Estágio I
Estágio II
Total
Parâmetros
n
%
N
%
N
%
P
Maturidade Celular
0,0001
Maduras
15
68,2
7
31,8
22
100
Imaturas
2
11,1
16
88,9
18
100
Presença de Massas
0,038
Ausente
9
69,2
4
30,8
13
100
Presente
8
29,6
19
70,4
27
100
Dismorfismo
0,037
Pouca
10
62,5
6
37,5
16
100
Muita
7
29,2
17
70,8
24
100
* teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher
66
3DUD DYDOLDU D H[SUHVVmR GRV DQWLFRUSRV &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H 1)NB
com relação aos tipos de lesão, utilizou-se o teste não paramétrico de Mann-Whitney,
uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do estabelecimento de escores.
Tabela 09- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos,
estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8,
)2;37*)ȕ71)ĮH1)NB em relação ao tipo de lesão. Natal/RN 2009.
Soma
Marcador
Grau
N Mediana Q25-Q75 Média
dos
dos
U
P
postos
postos
CD8
DEO
20
3
2-3
40,50
818,00
200,00 0,001
CEO
40
1
1-2
25,50 1020,00
FOXP3
DEO
20
1
1-2
31,98
639,50
370,50 0,600
CEO
40
1
1-2
29,76 1190,50
7*)ȕ,,
DEO
20
3
2-3
32,28
645,50
364,50 0,546
CEO
40
2
2-3
29,61 1184,50
7*)ȕ&() DEO
20
2
2-3
35,30
706,00
304,00 0,110
CEO
40
2
1-2,75 28,10 1124,00
71)Į,,
DEO
20
2
2-3
34,70
694,00
316,00 0,161
CEO
40
2
1-3
28,40 1136,00
71)Į&() DEO
20
2
1-3
34,25
685,00
325,00 0,208
CEO
40
2
1-2
28,62 1145,00
DEO
20
3
1-3
39,75
795,00
215,00 0,002
NF-N
NB
CEO
40
1,5
1-2
25,88 1035,00
* teste não paramétrico de Mann-Whitney
Tabela 10-Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística
U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8, FOXP3,
7*)ȕ71)ĮH1)NB em relação à gradação histológica das DEO. Natal/RN 2009.
Marcador
Grau
N Mediana Q25-Q75 Média
Soma
dos
dos
U
P
postos
postos
CD8
L-M
12
3
2-3
11,42
148,50 33,50
0,278
S
8
2
1-3
8,79
61,50
FOXP3
L-M
12
2
1-3
11,69
152,00 30,00
0,173
S
8
1
1-2
8,29
58,00
7*)ȕ,,
L-M
12
2
2-3
10,00
130,00 39,00
0,568
S
8
3
1-3
11,43
80,00
7*)ȕ&() L-M
12
3
2-3
12,81
166,50 15,50
0,011
S
8
1
1-2
6,21
43,50
71)Į,,
L-M
12
2
1,5-3
9,62
125,00 34,00
0,317
S
8
2
2-3
12,14
85,00
71)Į&() L-M
12
2
1,5-2,5
10,12
131,50 40,50
0,674
S
8
3
1-3
11,21
78,50
L-M
12
3
2-3
11,19
145,50
36,50
0,370
NF-N
NB
S
8
3
1-3
9,21
64,50
* teste não paramétrico de Mann-Whitney
67
Com a amostra agrupada de acordo com o tipo de lesão, observou-se de forma
geral uma expressão maior nas DEO, embora a diferença entre elas só tenha sido
significativa para a quantidade de células TCD8 e a quantidade de células positivas para
o NF-NB (Tabela 09).
A amostra foi então agrupada de acordo com a gradação histológica das DEO e
dos CEO observando-VH TXH D H[SUHVVmR GH &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H 1)NB,
UHYHORX GLIHUHQoD HVWDWLVWLFDPHQWH VLJQLILFDQWH DSHQDV SDUD D H[SUHVVmR GR 7*)ȕ QDV
células epiteliais das DEO (Tabela 10).
$ DYDOLDomR GD LPXQRPDUFDomR GRV DQWLFRUSRV &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H
NFNB nos CEO, não apresentou diferença estatisticamente significante (Tabela 11).
Tabela 11-Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística
U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas para CD8, FOXP3,
7*)ȕ 71)Į H 1)NB em relação à gradação histológica de malignidade dos CEO.
Natal/RN 2009.
Marcador
Grau
N Mediana Q25-Q75 Média Soma
dos
dos
U
P
postos postos
CD8
I
17
1
1-3
21,74 369,50 174,50 0,475
II
23
1
1-2
19,59 450,50
FOXP3
I
17
1
1-2
19,62 333,50 180,50 0,638
II
23
1
1-2
21,15 486,50
7*)ȕ,,
I
17
2
1-3
16,97 288,50 135,50 0,076
II
23
3
2-3
23,11 531,50
7*)ȕ&() I
17
1
1-2,5
18,38 312,50 159,50 0,293
II
23
2
1-3
22,07 507,50
71)Į,,
I
17
2
1-3
22,53 383,00 161,00 0,315
II
23
2
1-2
19,00 437,00
71)Į&() I
17
2
1-2
18,65 317,00 164,00 0,351
II
23
2
1-2
21,87 503,00
I
17
1
1-2
19,32 328,50 175,50 0,546
NF-N
NB
II
23
2
1-2
21,37 491,50
* teste não paramétrico de Mann-Whitney
A existência de correlação entre a imunomarcação SDUD &' )2;3 7*)ȕ
71)Į H 1)NB e a intensidade do infiltrado inflamatório segundo o tipo de lesão foi
investigada utilizando-se o coeficiente de correlação de Spearman.
68
Nas DEO, foi observada correlação positiva e estatisticamente significativa entre
a quantidade de células imunopositivas para o TNF-ĮWDQWRQRLQILOWUDGRLQIODPDWyULR
como nas células epiteliais, e a intensidade do infiltrado inflamatório. Além disso,
também constatou-se correlação positiva entre a intensidade do infiltrado inflamatório e
a quantidade de células imunopositivas para o NF-NB.
Nos CEO, a intensidade do infiltrado inflamatório mostrou correlação positiva
com a quantidade de linfócitos TCD8 e com a quantidade de células imunopositivas
SDUDR71)ĮQRLQILOWUDGRLQIODPDWyULR3RUVXDYH]FRQVWDWRX-se correlação negativa
entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células neoplásicas
imunopositivas para o TNF-Į7DEHOD
Tabela 12-Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística
entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células imunopositivas
SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮH1)NB, segundo o tipo de lesão. Natal/RN 2009.
INFILTRADO
TIPO DE LESÃO
DEO
CEO
MARCADORES
INFLAMATÓRIO
R
P
CD8
0,391
0,088
FOXP3
0,109
0,648
7*)ȕ,,
0,000
1,000
7*)ȕ&(
-0,026
0,912
71)Į,,
0,632
0,003
71)Į (CE)
0,442
0,051
NB
NF-N
0,617
0,004
CD8
0,365
0,021
FOXP3
0,018
0,911
TGFȕ (II)
0,189
0,243
TGFȕ (CE)
-0,142
0,383
TNFĮ (II)
0,383
0,015
TNFĮ (CE)
-0,337
0,034
NF-N
NB
0,046
0,776
* coeficiente de correlação de Spearman.
Figura 01 ± CEO, Invasão em massas (HE 200x)
Figura 02 ± CEO, Invasão em cordões (HE 100x)
02
01
Figura 03 ± CEO, Células maduras (HE 400x)
Figura 04 ± CEO, Células Imaturas (HE 200x)
04
01
03
69
Figura 05- CEO, Presença de massas (HE 100x)
Figura 06- CEO, Ausência de massas (HE 100x)
06
05
Figura 07- CEO, Dismorfismo escasso (HE 200x)
Figura 08- CEO, Dismorfismo acentuado (HE 200x)
08
07
70
Figura 09- DEO, CD8 > 50% (SABC 200x)
Figura 10- DEO, CD8 > 50% (SABC 200x)
10
09
Figura 11- CEO, CD8 > 50% (SABC 200x)
Figura 12- CEO, CD8 < 5% (SABC 200x)
12
10
11
71
Figura 13- DEO, FOXP3 > 50% (Envision-HRP 400x)
Figura 14- DEO, FOXP3 5-50% (Envision-HRP 200x)
16
14
Figura 15- CEO, FOXP3 > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 16- CEO, FOXP3 5-50% (Envision-HRP 400x)
15
13
72
Figura 17- DEO, TGFȕ (CE) > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 18- DEO, TGFȕ (CE) 5-50% (Envision-HRP 200x)
20
18
Figura 19- DEO, TGFȕ (CE) < 5% (Envision-HRP 100x)
Figura 20- DEO, TGFȕ (II) >50% (Envision-HRP 400x)
19
17
73
Figura 21- CEO, TGFȕ (CE) > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 22- CEO, TGFȕ (CE) 5-50% (Envision-HRP 200x)
22
21
Figura 23- CEO, TGFȕ (CE) < 5% (Envision-HRP 100x)
Figura 24- CEO, TGFȕ (II) 5-50% (Envision-HRP 200x)
24
23
74
Figura 25- DEO, TNFĮ (CE) > 50% (Envision-HRP 400x)
Figura 26- DEO, TNFĮ (CE) 5-50% (Envision-HRP 200x)
28
26
Figura 27- DEO, TNFĮ (CE) < 5% (Envision-HRP 200x)
Figura 28- DEO, TNFĮ (II) >50% (Envision-HRP 400x)
27
25
75
Figura 29- CEO, TNFĮ (CE) > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 30- CEO, TNFĮ (CE) 5-50% (Envision-HRP 200x)
30
29
Figura 31- CEO, TNFĮ (CE) < 5% (Envision-HRP 200x)
Figura 32- CEO, TNFĮ (II) >50% (Envision-HRP 400x)
32
31
76
Figura 33- DEO, NF-B > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 34- DEO, NF-B 5-50% (Envision-HRP 400x)
34
33
Figura 35- CEO, NF-B > 50% (Envision-HRP 200x)
Figura 36- CEO, NF-B 5-50% (Envision-HRP 400x)
36
35
77
78
DISCUSSÃO
79
6- DISCUSSÃO
Sendo a etiologia do CEO multifatorial, para que haja uma expansão clonal de
células transformadas e resistentes aos mecanismos de defesa do hospedeiro, é
necessária a atuação conjunta de fatores extrínsecos e intrínsecos, de forma variada,
porém seqüencial, por muitos anos (KERREBIN et al., 1999; BOSHOFF e WEISS,
2001; RAMALHO et al., 2002; NAGPAL e DAS, 2003). Sendo assim, para impedir a
atuação de fatores intervenientes (sexo, idade, localização anatômica, fatores de risco,
etc.), considerou-se a possibilidade de avaliar a agressividade tumoral através das
alterações morfológicas e de sua relação com o hospedeiro, via inflamação. Isso já havia
sido proposto anteriormente por Jackobsson et al. (1973), Crissman et al.( 1984),
Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e Bryne et al. (1989) sendo que, para isso é
necessário entender o papel da inflamação na carcinogênese, objetivo principal deste
estudo, não esquecendo no entanto das lesões que precedem o aparecimento do câncer.
Segundo Warnakulasuriya et al. (2007), durante um longo período (1978-2005)
a OMS classificou as lesões com potencial de transformação maligna em dois grupos, o
GH ³FRQGLo}HV SUp-FDQFHURVDV´ TXH LQFOXtD RV FDVRV GH )LEURVH 6XEPXFRVD &HUDWRVH
Actínica, Líquen Plano e Lupus Eritematoso DiscóideHRGH³OHV}HVSUp-FDQFHURVDV´
do qual faziam parte a Leucoplasia, a Eritroplasia e a Lesão do Palato por Fumo
Invertido. O primeiro grupo consistia em situações associadas a um aumento
significativo do risco de câncer, enquanto o segundo grupo incluía lesões com
alterações morfológicas onde o desenvolvimento de CEO era mais provável. Nesse
segundo caso, o potencial de malignidade era demonstrado através da presença de DEO
nos cortes histológicos.
Entretanto, sabe-se que mesmo condições consideradas anteriormente como
³FRQGLo}HV SUp-FDQFHURVDV´ SRGHP GHPRQVWUDU GLVSODVLD HSLWHOLDO HP FRUWHV
histológicos, o que exigiria uma reformulação na classificação destas lesões. Assim, a
OMS (2005) acabou agrupando todas as lesões anteriormente citadas em um único
gUXSRFRQKHFLGRFRPR³GHVRUGHQVSRWHQFLDOPHQWHPDOLJQDV´:$51$.8/$685,<$
et al.,2008).
80
Dessa forma, uma classificação mais adequada para estas lesões deveria ser
feita, apenas, após análise histológica dos tecidos submetidos à biópsia, uma vez que a
preseQoD GH GLVSODVLD HSLWHOLDO p QHFHVViULD SDUD VH FRQVLGHUDU XPD ³OHVmR
SRWHQFLDOPHQWH PDOLJQD´ $V GHPDLV VLWXDo}HV FRQWLQXDULDP FRPR ³FRQGLomR SUpPDOLJQD´ 5DWLILFDQGR HVWD LQIRUPDomR 0LWKDQL DILUPRX TXH D OHXFRSODVLD
considerada pela OMS uma lesão de risco questionável, apresenta similaridade
histológica e molecular com o CEO quando há presença de displasia epitelial. De
acordo com Reibel (2003), as alterações displásicas encontradas em alguns casos de
leucoplasia podem ainda pré-existir e/ou coexistir com o CEO, confirmando ainda mais
D GHILQLomR GD OHXFRSODVLD FRP GLVSODVLD FRPR XPD ³GHVRUGHP SRWHQFLDOPHQWH
PDOLJQD´
As alterações moleculares presentes nos quadros de displasia epitelial podem
preceder as alterações morfológicas, devendo fazer parte da análise de classificação
GHVWDV OHV}HV FRPR ³SRWHQFLDOPHQWH PDOLJQDV´ /RJR QmR HVWDULD FODUR VH DSHQDV R
estudo morfológico, com a detecção de DEO, seria suficiente para sugerir um potencial
pré-maligno às desordens orais. Isso também pode ser raciocinado quando se percebe
que nem todas as lesões com displasia epitelial se transformam em CEO, devendo
existir alterações moleculares responsáveis pelo processo de transformação celular.
Vários estudos têm relacionado tanto as DEO quanto os CEO a alguns fatores de
risco como o fumo, o álcool, a radiação ultravioleta, o HPV e outros, considerados
fatores extrínsecos. Porém, é necessária a presença de fatores intrínsecos, inerentes a
cada paciente, para justificar a transformação de uma pequena parcela dos casos. Esta
situação requer, portanto, desestabilização de vários sistemas de controle que
coordenam o comportamento celular (NAGPAL, DAS, 2003; SCHLIEPHAKE, 2003).
Napier e Speight (2008) citaram um estudo realizado na Dinamarca em que
apenas 2,1% das leucoplasias em pacientes fumantes evoluíram para um câncer, em
contraste com 11,1% das leucoplasias em não fumantes. Considerando ser a DEO o
evento que garante o potencial maligno da lesão, estes resultados reforçam a
necessidade de avaliar a presença desta e/ou os eventos moleculares que participam do
processo de transformação celular, para sugerir, assim, o potencial de transformação
maligna das lesões.
81
Assim, quando ocorre uma desestabilização de algum ou alguns sistemas de
controle do comportamento celular, agravada pela manutenção de um fator de risco,
poderá se expressar histologicamente como uma DEO ou um câncer propriamente dito.
Caso contrário, fará parte dos casos omissos, em que só maiores estudos ou o tempo,
poderiam confirmar o desfecho destas lesões.
Para Silverman, Gorsky e Lozada (1984), apenas 15% das lesões sem displasia
evoluem para CEO. Por isso, a maioria das lesões leucoplásicas nunca sofrerá
transformação maligna, como também, a presença da displasia não implica
necessariamente em transformação maligna, mas, pode ocorrer sem constatação prévia
GH XPD ³GHVRUGHP SRWHQFLDOPHQWH PDOLJQD´ GHYHQGR H[LVWLU XP IDWRU GH ULVFR
UHODFLRQDGR j PHVPD (VVH p R YHUGDGHLUR GHVDILR SDUD GLDJQRVWLFDU XPD ³OHVmR SUpFDQFHURVD´TXHFRPFHUWH]a, terá um desfecho final, caso não haja intervenção.
Embora existam muitas pessoas sem doença expostas a fatores de risco, é
impossível negar a relação destes com o CEO. No entanto, é necessário considerar a
importância de fatores inerentes ao hospedeiro no processo de transformação celular.
Dentro desta linha de raciocínio, pode-se lembrar a afirmativa de Schiffman e Castle
(2003) ao estudar a relação do HPV com o câncer cervical, de que a presença do vírus é
necessária, mas não suficiente para causar o câncer. Da mesma forma que o HPV, a
maioria dos fatores de risco para funcionar como irritante crônico deve estar ativado ou
atuante por um período prolongado.
Teoricamente, a eliminação de fatores de risco reduz a possibilidade de
surgimento de novas lesões ou de transformação maligna das já existentes (LODI,
PORTER, 2008), sendo, portanto, a maneira mais viável de prevenir o câncer de boca.
A manutenção dos fatores de risco e, por conseqüência, do estado de inflamação crônica
dos tecidos afetados resulta, dependendo do tempo e periodicidade do estímulo, em
descontrole do comportamento celular (NAPIER, SPEIGHT, 2008). Assim, o processo
inflamatório pode funcionar como um estímulo à proliferação e invasão tumorais.
Dentro deste mesmo raciocínio, a reagudização da inflamação durante uma biópsia
incisional, seguida de cicatrização, pode acelerar o processo.
82
A duração da interação entre o epitélio exposto a fatores de risco e o conjuntivo
justo-epitelial pode ser um passo importante na transformação e invasão tumorais, visto
que as células presentes no mesênquima, quando estimuladas, passam a produzir fatores
que estimulam a angiogênese, o crescimento e, conseqüentemente, metástase, como já
citava Biswas et al. (1995) e Hanahan e Weinberg, (2000).
Segundo Yan, Zucker e Toole (2005), experimentos comprovam que o
EMMPRIN induz várias propriedades associadas à malignidade incluindo invasividade,
angiogênese e ancoragem independente de crescimento. Esse processo pode ter início na
remodelação da membrana basal ou matriz extracelular nas proximidades das desordens
potencialmente malignas, favorecendo a tese de que, o processo de reparo, gerado pela
biópsia incisional, pode estimular a invasão de uma lesão pré-cancerosa ou o
crescimento de um CEO já instalado, visto que está intimamente relacionado à
angiogênese e produção de citocinas inflamatórias.
Nessas condições patológicas, o recrutamento de células hematopoiéticas e
endoteliais indiferenciadas pode ser efetuado pelo P1GF (Fator de Crescimento
Placentário), liberado por membros da família TGF-ȕ FRPR DV %03 5$,'$ HW DO
2005). Isso mostra a importância da precisão e rapidez no diagnóstico das mesmas,
alicerçando a necessidade de maiores conhecimentos sobre os eventos moleculares
envolvidos.
No presente estudo os casos de DEO e CEO foram avaliados morfologicamente
e classificados quanto ao grau histológico e intensidade do infiltrado inflamatório,
considerando o grau histológico nas DEO, como potencial de malignização, visto que
esta assegura, pelo menos em parte, o potencial pré-maligno das lesões e, nos CEO,
como determinante da agressividade tumoral, semelhante ao que foi proposto por
Broders em 1920.
Na gradação histológica de malignidade desenvolvida neste estudo para análise
dos casos de CEO, foram utilizados quatro parâmetros: tipo de invasão, maturidade
FHOXODUSUHVHQoDGHPDVVDVHQWUHRHSLWpOLRHR³IURQW´ invasivo e o dismorfismo, todos
estes já consagrados na literatura, embora sob ponto de vista diferente. Os resultados
83
desta nova forma de avaliação foram, então, comparados com a gradação histológica de
Bryne (1998).
Ao comparar o tipo de invasão das duas gradações, verificou-se uma
concordância quanto à apresentação dos casos, constatando que quando essa invasão se
dava em forma de massas ou trabéculas, o tumor era de baixa agressividade enquanto
que quando esta apresentação se dava em forma de cordões ou células isoladas, as
lesões eram altamente agressivas.
Outro aspecto analisado pela gradação histológica desenvolvida para este estudo
IRLDPDWXULGDGHFHOXODU1HVWHDSUHGRPLQkQFLDGHFpOXODVPDGXUDVRFRUUHXQR³IURQW´
invasivo em 15 casos (68,2%) de baixa agressividade (Estágio I) e 7 casos (31,8%) de
DOWDDJUHVVLYLGDGH(VWiJLR,,MiDVFpOXODVLPDWXUDVSUHGRPLQDUDPQR³IURQW´ invasivo
em 2 casos (11,1%) de baixa agressividade (Estágio I) e 16 casos (88,9%) de alta
agressividade (Estágio II), mostrando-se estatisticamente significante (p=0,0001).
Contudo, a imaturidade não pode ser utilizada para avaliação do pleomorfismo, como
sugerido pelo estudo de Bryne (1998), entre outros citados na revisão, visto que este se
manifesta no decorrer do processo de diferenciação, por onde muitas dessas células
ainda não passaram. No estudo de Bryne (1998) essa utilização fica ainda mais
incoereQWHGHVGHTXHDDYDOLDomRpIHLWDDSHQDVQR³front´LQYDVLYRRQGHDPDLRULDGDV
células é imatura.
6H R WLSR GH LQYDVmR DVVRFLDGR j PDWXULGDGH FHOXODU QR ³IURQW´ invasivo
GHPRQVWUDDUDSLGH]GR³FUHVFLPHQWRWXPRUDO´DSUHVHQoDGHPDVVDVWXPRUDLVHQWUH o
HSLWpOLRGHUHYHVWLPHQWRRXVXSHUItFLHXOFHUDGDHR³IURQW´ invasivo denota a existência
GHXP ³WHPSR´QHFHVViULR SDUDTXHHVVDVFpOXODVVRIUDP GLIHUHQFLDomRH GHPRQVWUHP
através do dismorfismo, se essa diferenciação foi bem sucedida ou não contando com o
seu produto final, a ceratina, para esta avaliação. Portanto, as massas superficiais podem
não ser o local onde estão ocorrendo, as principais reações, mas onde se pode observar o
resultado destas, ou seja, o efeito das citocinas inflamatórias no processo de
transformação celular, analisada através do dismorfismo celular e arquitetural. A
presença de massas e o dismorfismo acentuado das mesmas estiveram presentes na
maioria dos casos de CEO de alto grau, mostrando resultado estatisticamente
significante (p=0,038 e 0,037, respectivamente).
84
Ao comparar os resultados da gradação de Bryne com a gradação desenvolvida
para este estudo, observou-se diferença nos resultados FRP H VHP ³5HVSRVWD
LQIODPDWyULD´em 20% e 13,3% dos casos, respectivamente. A diferença ocasionada com
a inclusão do infiltrado inflamatório, avaliado por Bryne (1998) como resposta do
hospedeiro, ou seja, diminuindo a agressividade, atribuindo maiores escores àquelas
lesões com menos infiltrado inflamatório e vice-versa, foi irrelevante, embora mostre
que interfere na avaliação individual, assim como a ausência de avaliação do
pleomorfismo celular, visto que no lugar deste, foi avaliada a maturidade das células no
front de invasão.
Na essência, são avaliações diferentes, podendo ocasionar as distorções mais
variadas possíveis, a depender da amostra e por ser um resultado numérico pode ter
havido uma compensação, diminuindo a diferença entre os resultados, chegando a
igualar o resultado final entre os casos de alto e baixo grau de malignidade (Gráfico 01).
O método binário diminui as possíveis distorções causadas por divergências nas
avaliações.
Embora estudos como o de Costa, Araújo-Junior e Ramos (2005) também
tenham encontrado relação entre o infiltrado inflamatório leve e a agressividade tumoral
dada pela presença de metástase em linfonodos, esta pode não estar relacionada à
intensidade do infiltrado inflamatório e sim ao tempo de permanência da lesão na
cavidade oral. Além do mais, a maioria (72,5%) dos casos avaliados em nosso estudo
apresentou infiltrado inflamatório variando entre moderado e intenso, concordando com
Silveira (2007) ao comprovar que o infiltrado inflamatório exerceu grande influência na
classificação da agressividade tumoral proposta por Bryne (1998), embora não garanta
que a inflamação seja favorável ao hospedeiro.
Ainda comentando a possibilidade de relação entre o leve infiltrado inflamatório
e metástase nos linfonodos. Não seria um contra senso, tendo em vista que os CEO de
uma maneira geral apresentam infiltrado inflamatório entre moderado e alto e são
descobertos tardiamente, ou seja, na maioria das vezes muito grande e/ou com
metástase!
85
A detecção de metástases em linfonodos ou à distância, feita através do sistema
TNM, é utilizada na clínica para descrever a situação do tumor naquele momento. No
entanto, isto nem sempre reflete a agressividade das células tumorais, a qual está
relacionada à capacidade dessas células burlarem o sistema imunológico do hospedeiro,
num curto espaço de tempo, fazendo com que o mesmo trabalhe em parceria com as
células tumorais, proporcionando proliferação acelerada e migração destas.
A biologia molecular, através da imuno-histoquímica, apesar de não determinar
o tempo de desenvolvimento tumoral, contribui para presumi-lo, ao detectar o momento
que as mudanças funcionais acontecem. Mesmo porque, estas devem ocorrer antes das
alterações morfológicas observadas na microscopia utilizando o método de rotina,
corado pela hematoxilina e eosina, justificando a falta de correlação muitas vezes
encontrada entre os estudos morfológicos e imuno-histoquímicos.
Mesmo comprovando a importância da imuno-histoquímica como subsídio do
estudo morfológico para determinar a agressividade tumoral, isto não diminui a
importância da classificação TNM na conduta do tratamento, uma vez que o
conhecimento da agressividade em condições avançadas do tumor tem pouca
importância para a sobrevida do paciente, mas seria de grande valia nas fases iniciais da
doença, onde a análise morfológica pode não detectar a sua presença.
Portanto, é impossível não concordar com Bryne (1998) quanto à importância da
interação entre o infiltrado inflamatório, independente do seu papel, e as células
WXPRUDLVQR³IURQW´invasivo, embora as marcações observadas permitam discordar que
as FpOXODV SUHVHQWHV QD iUHD GR ³IURQW´ de invasão tumoral tenham características
moleculares diferentes, quando comparadas com as áreas superficiais do tumor. Não
necessariamente, já que essa diferença vai depender da velocidade de crescimento. Nos
casos em que a lesão se encontra em fase de franca proliferação, a maioria das células
do ³IURQW´ invasivo são células imaturas; já quando o crescimento é lento, são
semelhantes às massas superficiais, constituídas em sua maioria de células maduras,
onde algumas já produziram ceratina, e não tendo como descamar, como acontece
normalmente no epitélio de revestimento, vão se acumulando e dando volume às massas
superficiais, e muitas vezes, quando o crescimento é intenso e duradouro, sofrem
86
necrose. Logo, essa diferença pode estar relacionada à maturidade celular, só ocorrendo
nos casos mais agressivos.
Desta forma, as características moleculares, observadas através das marcações
imuno-histoquímicas, podem ser diferentes nas áreas proliferativas, o que seria esperado
até mesmo num epitélio normal, Nas lesões em que o crescimento é lento (sem cordões
QR³fURQW´ invasivo), fica difícil visualizar essa diferença no padrão de marcação entre
DVPDVVDVHR³IURQW´ invasivo, mesmo quando são bem atípicas, com massas altamente
dismórficas e contêm muitas células imaturas. Por isso, a análise do ³IURQW´ invasivo é
tão importante na avaliação desse potencial de crescimento, quanto a avaliação das
massas em relação à sua capacidade de diferenciação, ambas importantes na avaliação
comportamental do CEO.
Os resultados deste estudo mostram que o infiltrado inflamatório esteve presente
em todos os casos de DEO e CEO, sendo mais intenso nos casos de CEO (47,5%) que
nos de DEO (25%). Na maioria dos casos de CEO, ocorreu variação entre moderado e
intenso, mas foi dentre os casos com infiltrado inflamatório leve que se observou que
81,8% (9 casos) estavam no grupo de alto risco, mostrando que a ausência de reação
pode estar relacionada à agressividade tumoral, visto que o hospedeiro não tem reação
contra o tumor, embora o aumento desse infiltrado não demonstre essa proteção,
sugerindo um papel diferente para o infiltrado inflamatório nos CEO. Esses resultados
vêm corroborar com os achados de Silveira (2007), alertando quanto à possibilidade
desse infiltrado exercer outro papel ou mesmo de não exercer seu papel de defesa
DQWLWXPRUDO R TXH IRL GHQRPLQDGR QD LPXQRORJLD GH ³HYDVmR LPXQROyJLFD´ FRQIRUPH
citado por diversos autores (ABBAS e LICHTMAN, 2005; JANEWAY et al., 2007 ;
HOFFMANN, BIER e WHITESIDE ,2004) que afirmavam ser comum a presença de
infiltrado inflamatório em tumores da cavidade oral, diferentemente dos conceitos de
Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e Bryne (1989), os quais atribuiram ao infiltrado
inflamatório o papel de defesa anti-tumoral.
É notório que a falta de resposta do hospedeiro, seja pela ausência de reação
inflamatória e/ou por incompetência desta, pode estar relacionada com a agressividade,
mas, a intensidade da inflamação pura e simples não é parâmetro para avaliação
prognóstica, visto que o infiltrado inflamatório pode assumir funções variadas nos
87
estágios da carcinogênese, sendo necessário entender o que representa a sua presença e
como ele atua na transformação, progressão e invasão tumoral.
Segundo Abbas (2007), alterações moleculares significativas que ocorrem entre
as DEO e os CEO não ocorrem entre os graus histológicos dos CEO, concordando com
R SUHVHQWH HVWXGR TXH FRP H[FHomR GD )2;3 H GR 7*)ȕ H[SUHVVRV QR LQILOWUDGR
inflamatório, detectou uma tendência à maior expressão dos marcadores estudados, nas
DEO do que nos CEO, visto que diferenças estatisticamente significantes só foram
detectadas na expressão do CD8 (p=0,001) e do NF-NB (p=0,002). Entre os estágios dos
CEO nenhuma alteração significativa foi encontrada.
Estes resultados sugerem que a maior expressão do CD8 no infiltrado
inflamatório das DEO indica uma função inicialmente protetora na carcinogênese,
estando presente também nos CEO, corroborando os achados de Sabel et al. (2005), os
quais sugerem que o controle do tumor depende tanto da magnitude da resposta
imunológica inicial, como da capacidade de sustentar essa resposta por um período
prolongado. Outros tipos celulares presentes em grande quantidade em algumas lesões,
como os polimorfonucleares, podem favorecer a transformação (LIND et al., 2004;
SCHWABE, BRENNER, 2006), como também a progressão e invasão tumoral,
observadas com freqüência após biópsias incisionais.
A queda repentina da resposta imune pode levar a uma progressão rápida da
doença. Porém, aquele papel protetor do CD8 que se esperava encontrar nos estágios
iniciais dos CEO não foi observado, sendo evidenciado nas DEO, significando que,
após a transformação, o infiltrado inflamatório pode tentar deter o crescimento e atrasar
a progressão tumoral, a depender da variação na expressão dos fatores que promovem
ou detêm a lesão, mas dificilmente conseguirá destruí-la. Isso pôde ser observado neste
estudo ao relacionar a intensidade do infiltrado inflamatório com a expressão do CD8, o
qual se mostrou estatisticamente significativo. Daí a importância de se estudar a
imunoterapia como forma de fortalecer a defesa do hospedeiro
27*)ȕpXPDFLWRFLQDVHFUHWDGDSRUYiULRVWLSRVFHOXODUHVHPYiULDVVLWXDo}HV
inclusive por um subtipo de célula T reguladora ou célula Treg, com atividade
imunossupressora, a qual é ativada sob estimulação antigênica nos tecidos periféricos,
88
TXHDSURGX]SDUDHVWHILP³UHJXODUDUHVSRVWDLPXQH´%/8(6721(H$%%$6
HORI, NAMURA e SAKAGUSHI, 2003; MAGGI et al., 2005). Desta forma, essa
citocina pode ter grande participação na agressividade tumoral, visto a forte tendência a
aumentar sua expressão no infiltrado inflamatório dos casos de CEO de alto grau. Como
uma das principais funções desta citocina, é a de inibir a ativação do linfócito T
citolítico (CD8), responsável pela defesa anti-tumoral do hospedeiro, há uma
concordância com os achados de Gorelik e Flavell (2001), os quais concluíram que o
EORTXHLRGR7*)ȕQDVFpOXODV7&'H&'IDYRUHFHXDUHVSRVWDDQWL-tumoral.
Apesar de não ter sido detectada no infiltrado inflamatório uma expressão
HVWDWLVWLFDPHQWH VLJQLILFDQWH SDUD R 7*)ȕ QHP SDUD D )2;3 SURWHtQD XWLOL]DGD QD
detecção de células Treg (BOER et al., 2007), tanto entre os casos de DEO e de CEO,
como entre os graus histológicRV GRV PHVPRV R 7*)ȕ PRVWUD XPD WHQGrQFLD D
aumentar nas células inflamatórias das DEO severas, junto com uma forte tendência à
diminuição da FOXP3 e mostrando uma forte tendência a aumentar nos casos de CEO
de alto grau, sugerindo maior atividade das células Treg com diminuição do tempo de
vida da mesma ou ineficácia do marcador, visto que a defesa anti-tumoral exercida
pelos linfócitos T CD8 tende a diminuir tanto entre DEO e CEO como entre os graus
histológicos destas, sendo estatisticamente significante apenas no primeiro caso, quando
R7*)ȕWDPEpPWHQGHDFDLU7DOYH]HVWHVDFKDGRVHVWHMDPUHODFLRQDGRVFRPDPDLRU
intensidade do infiltrado inflamatório nos casos de CEO.
A FOXP3 só mostrou tendência significativa para diminuir entre os graus de
DEO, qXDQGRR7*)ȕGRLQILOWUDGRLQIODPDWyULRWHQGHDDXPHQWDUHR&'DGLPLQXLU
,VVRVXJHUHXPDIRQWHGLIHUHQWHSDUDR7*)ȕ(PERUDQRVFDVRVGH&(2R&'VRIUD
uma queda estatisticamente significativa em relação às DEO, a FOXP3 parece estável e
R 7*)ȕ LQIOamatório tende a diminuir, concordando com Chang et al.(2005) que
sugeriram a possibilidade dessa deficiência ser devida a fatores inibitórios liberados
pelas células tumorais.
(P YLUWXGH GHVVD WHQGrQFLD DR DXPHQWR GD H[SUHVVmR GR 7*)ȕ QR LQILOWUDGR
inflamatório dos casos de CEO de alto grau e a leve tendência ao aumento do NF-NB
nos mesmos, é possível concordar com Yeh et al. (2008) que sugeriram um importante
SDSHOGR7*)ȕQDSURJUHVVmRWXPRUDOHPHWiVWDVH
89
1R HSLWpOLR QRUPDO R 7*)ȕ UHJXOD R FUHVFLPHnto e a diferenciação celular,
funcionando como supressor tumoral no início da carcinogênese, regulando
negativamente a expressão de oncogenes como o do HPV-16 (DONALISIO et al.,
2008). O presente estudo apresentou uma diminuição significativa deste nas DEO
severas (p=0,011), concordando com os relatos de Glick et al. (1994), os quais
demonstraram ocorrer transformação carcinomatosa em ceratinócitos após diminuição
autócrina do TGF-ȕ
Para Donalisio et al. (2008), em câncer cervical, as células transformadas têm
resistência parcial ou total aos efeitos inibitórios do TGF-ȕ e SRVVtYHO TXH HVVH
resultado esteja relacionado com o grau de diferenciação celular, onde a quantidade de
7*)ȕ SURGX]LGD DSyV D WUDQVIRUPDomR SRVVD LQLELU PDLV RX PHQRV HVVD
³GHVGLIHUHQFLDomR´ OHYDQGR DR GHVHQYROYLPHQWR GH XP FkQFHU PHQRV RX PDLV
agressivo, respectivamente. Neste estudo, não houve diferença significativa na
H[SUHVVmRGR7*)ȕ
Contudo, é importante lembrar que, segundo Gorelik e Flavell (2001), para
favorecer a resposWD DQWLWXPRUDO &' D VLQDOL]DomR GR 7*)ȕ QDV FpOXODV 7 GHYH VHU
EORTXHDGDLPSHGLQGRDWUDQVIRUPDomRHFRQVHTHQWHPHQWHDGLPLQXLomRGR7*)ȕQDV
células epiteliais. A diminuição do CD8 ocorreu entre os graus das DEO, mostrando a
mesma tendência entre as DEO e CEO, mas não entre os graus dos CEO.
(PERUDQmRWHQKDVLGRHQFRQWUDGDUHODomRHVWDWLVWLFDPHQWHVLJQLILFDQWHGR7*)ȕ
com a intensidade do infiltrado inflamatório pôde-se observar que existe um aumento do
mesmo nas células inflamatórias e uma diminuição nas células epiteliais, tanto nas DEO
como nos CEO, concordando com os estudos citados anteriormente. Isso sugere que a
GLPLQXLomR GR 7*)ȕ QDV FpOXODV HSLWHOLDO FDUDFWHUL]D XPD SHUGD GH FRQWUROH GR
crescimento, podendo funcionar como uma marca biológica de transformação nos casos
de DEO.
A manutenção do estímulo inflamatório levando à super-expressão do NF-NB
nas DEO, sugere que a transcrição acelerada do NF-NB nesses casos favorece o
processo de transformação, caindo logo após a transformação, nos casos de CEO. Essa
90
conclusão é fortalecida pela tendência significativa para maior expressão da proteína
UHVSRQViYHO SRU VXD DWLYDomR R 71)Į +$<'(1 H *+26+ ABBAS e
LICHTMAN, 2005), tanto nas células epiteliais, como nas células inflamatórias das
DEO em relação aos CEO, embora não tenha sido observada essa tendência entre os
graus das DEO e dos CEO. Talvez a falta de relação entre a imunomarcação e os graus
histológicos seja pela dificuldade na gradação pelo exame de rotina, mostrando a
importância desses marcadores na evidenciação das alterações moleculares,
contribuindo assim para uma melhor avaliação do potencial de malignidade nas DEO e
da agressividade nos CEO.
Os achados deste estudo vêm a discordar da possibilidade de existir uma forma
ativada de NF-NB induzida por vários estímulos inflamatórios que regula os produtos
gênicos nos CEO, protegendo as células tumorais contra apoptose, conforme relatos de
Aggarwal (2004); Pacifico e Leonardi (2006), visto que este diminui significativamente
nos CEO em relação às DEO.
Quando a expressão destes marcadores foi associada à intensidade do infiltrado
inflamatório, evidenciou-se aumento significativo tanto do NF-N%FRPRGR71)ĮQDV
FpOXODVHSLWHOLDLVDVVLPFRPRGR71)ĮQDVFpOXODVGRLQILOWUDGRLQIODPDWyULRGDV'(2
confirmando a importância da inflamação no processo de transformação celular. Nos
CEO, o NF-N%SDUHFHWHUSHUGLGRDLQIOXrQFLDGR71)ĮLQIODPDWyULRo qual aumentou
VLJQLILFDWLYDPHQWH FRP D LQWHQVLGDGH GR LQILOWUDGR HQTXDQWR R 71)Į GDV FpOXODV
epiteliais diminuiu. Estes resultados indicam que talvez as células transformadas
independam dessa via de transcrição e/ou que apresentem alguma falha no receptor de
71)Į 71)5 $SHVDU GD UHJXODomR GR 71)Į DXWyFULQR QmR GHSHQGHU GR UHFHSWRU
(LIND et al., 2004), pode estar ocorrendo uma diminuição compensatória devido à
LQDFHVVLELOLGDGHGR71)ĮLQIODPDWyULR/RJRR71)ĮLQIODPDWyULRVLJQLILFDWLYDPHQWH
aumentado, passa a ter outras funções nos CEO, as quais podem estar relacionadas à
progressão e invasão tumoral.
$R FRQWUiULR GRV DFKDGRV GH /LQG HW DO TXH DWULEXLUDP DR 71)Į
LQIODPDWyULR DWUDYpV GR UHFHSWRU GH 71)Į 71)5 QDV FpOXODV HSLWHOLDLV R SDpel de
induzir a transformação independente da ativação do NF-NB, assim como os de Luedde
91
et al. (2007), que sugeriram a inibição do NF-NB como causa do câncer, o atual estudo
acredita que o aumento do NF-NB nas DEO e subseqüente diminuição nos CEO seja
mais comumente uma conseqüência da transformação e não a causa, embora a
SDUWLFLSDomRGR71)ĮLQIODPDWyULRVHMDLPSUHVFLQGtYHOQHVVHSURFHVVRWHQGRHPYLVWD
o aumento tanto do NFN-% FRPR GR 71)Į HVWDU UHODFLRQDGR FRP D LQWHQVLGDGH GR
infiltrado inflamatório, opinião esta em concordância com Lind et al. (2004)
$ GLPLQXLomR GR 7*)ȕ QDV FpOXODV em transformação pode estar relacionada à
H[SUHVVmR GR 71)Į R TXDO PRVWURX XPD FRUUHODomR SRVLWLYD FRP D LQWHQVLGDGH GR
infiltrado inflamatório nas DEO, tanto nas células epiteliais, mostrando a aceleração
transcricional das mesmas através da correlação positiva do NF-NB, quanto nas células
inflamatórias, indicando grande atividade na produção de citocinas, o que vem a
concordar com Aggarval et al. (2006), que sugereP R 71)Į FRPR XP GRV PDLRUHV
mediadores químicos da inflamação, estando envolvido em diversos passos da
tumorigênese, inclusive no processo de transformação. A manutenção do NF-NB
ativado, durante a inflamação, disparado pela super-regulação de TNFDé um
importante elo entre o câncer e a inflamação, concordando com a opinião de Pikarsky et
al. (2004).
Nos casos de CEO, onde era esperada uma correlação positiva da expressão do
71)ĮQDVFpOXODVHSLWHOLDLVFRPDLQWHQVLGDGHGRLQILOWUDGRLQIODPDWyULRIRLGHWectada
uma correlação negativa, estatisticamente significativa, sugerindo que as células
transformadas perdem esse elo com a inflamação. Isso leva a discordar mais uma vez da
possibilidade de existência de uma forma ativada do NF-NB nos CEO, sugerida por
Pacifico e Leonardi (2006), mesmo porque, embora o NF-NB continue diretamente
proporcional à intensidade do infiltrado, o aumento é insignificante.
1R HQWDQWR D FRUUHODomR VLJQLILFDWLYDPHQWH SRVLWLYD GR 71)Į QDV FpOXODV
inflamatórias com a intensidade deste infiltrado, mantendo o NF-NB ativado, predispõe
à transformação maligna nas DEO, estando este envolvido na ativação da célula T,
contribuindo para a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e na resposta de muitos tipos
celulares às citocinas pró-inflamatórLDV FRPR R 71)Į QDV FpOXODV HSLWHOLDLV
concordando com a opinião de Pacifico e Leonardi (2006).
92
Embora neste estudo a avaliação do NF-NB tenha sido feita só nas células
epiteliais, a super-expressão deste esteve visivelmente presente nas células inflamatórias
GRVFDVRVGH'(2H&(2RTXHHUDHVSHUDGRSHORDXPHQWRVLJQLILFDWLYRGR71)ĮQDV
células inflamatórias associado à intensidade deste infiltrado, observado no teste de
correlação de Spearman (Tabela 12).
A avaliação das alterações moleculares nas DEO é o maior trunfo para a
prevenção e tratamento precoce do CEO, tendo em vista que não existe nenhum
parâmetro que determine o momento que um tecido displásico, independente do grau
histológico, invade o tecido conjuntivo ou um CEO metastatiza. No entanto, a falta de
FRQWUROH GR FUHVFLPHQWR HSLWHOLDO FDUDFWHUL]DGD SHOD GLPLQXLomR GR 7*)ȕ H D
WUDQVFULomRDFHOHUDGDGDGDSHORDXPHQWRGHH[SUHVVmRGR71)ĮHGR1)-NB sugerem
XPSURFHVVRGHWUDQVIRUPDomRQDV'(2DVVLPFRPRRDXPHQWRGR71)ĮQRLQILOWUDGR
inflamatório dos CEO, a progressão tumoral. Tais eventos podem ser valiosos na
determinação de uma marca biológica que sirva de parâmetro para avaliação do
potencial de malignidade das DEO e agressividade dos CEO em estudos futuros.
O contexto desse estudo em geral vem a concordar não só com Weitzman e
Gordon (1990) ao associarem vários processos inflamatórios crônicos com o
desenvolvimento do câncer, mas também com Balkwill e Mantovani (2001) ao
sugerirem a participação das citocinas e células inflamatórias no desenvolvimento e
progressão tumoral, com Abbas e Lichtman (2005), ao afirmarem que as células
transformadas têm a capacidade de evadirem ou superarem os mecanismos de defesa do
hospedeiro e com Silveira (2007), ao sugerir um papel diferente, daquele
exclusivamente anti-tumoral, sugerido em outros estudos.
No entanto, a inflamação tanto inibe como promove a carcinogênese, sendo que
o aumento dos promotores leva à transformação e durante a transformação, as células
perdem o controle do crescimento e se tornam independentes dos estímulos de uma
célula normal, criando seus próprios mecanismos de sobrevivência e fazendo com que o
infiltrado inflamatório participe junto com elas da progressão e invasão tumoral, embora
as células de defesa sejam importantes, nesta fase, para atrasar o processo. Isso mostra
que a imunoterapia ainda pode ser de grande valia no combate ao câncer.
93
A exploração de outras proteínas, principalmente aquelas relacionadas com
remodelação tecidual, como o EMPRIM (YAN, ZUCKER E TOOLE, 2005) e/ou as
relacionadas com a migração das células tumorais através da indução da motilidade e
conseqüentemente a invasividade, como as BMP (KATSUNO et al., 2008 e STEINER
et al., 2008), é necessária para demonstrar o papel das mesmas durante a invasão e
progressão do CEO.
94
CONCLUSÕES
95
7- CONCLUSÕES
1- Os parâmetros utilizados na Gradação Histológica de Malignidade deste estudo
são condizentes com a agressividade tumoral.
2- O estudo do front invasivo para avaliação do crescimento tumoral é importante
assim como o estudo das massas superficiais para avaliação da diferenciação
celular.
3- A intensidade do infiltrado inflamatório não serve como parâmetro histológico
de malignidade devido à variação do seu papel nas fases da carcinogênese.
4- A permanência da inflamação por tempo prolongado pode favorecer a
transformação maligna, após a qual passa a atuar na progressão tumoral
favorecendo a metástase.
5- A reação anti-tumoral exercida pelos linfócitos T CD8 pode impedir a
transformação ou atrasar a progressão da lesão.
6- O NF-N%DWLYDGRSHOR71)ĮGXUDQWHDLQIODPDomRSUHGLVS}HjWUDQVIRUPDomR
funcionando como elo de união entre a inflamação e o câncer.
7- $ GLPLQXLomR GR 7*)ȕ p XP PDUFR ELROyJLFR QR SURFHVVR GH WUDQVIRUPDomR
Logo, os ceratinócitos transformados perdem, parcialmente ou totalmente, o
controle do crescimento exercido por ele.
8- A diminuição do 71)Į nas células transformadas pode significar a autonomia
das mesmas.
9- Os eventos moleculares detectados neste estudo podem ser valiosos na
determinação de marcas biológicas que sirvam de parâmetro para avaliação do
potencial de malignidade das DEO e agressividade dos CEO em estudos futuros.
96
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