Jacqueline Marques de Oliveira

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
PROGRAMA MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS DE Neospora caninum
E REALIZAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
INDIRETA EM CÃES.
Jacqueline Marques de Oliveira
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL – BRASIL
AGOSTO DE 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
PROGRAMA MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS DE Neospora caninum E
REALIZAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
EM CÃES.
Jacqueline Marques de Oliveira
Orientadora: Profª. Drª. Maria de Fátima Cepa Matos
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, como requisito à obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal. Área
concentração: Saúde Animal.
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL – BRASIL
2004
Ficha catalográfica elaborada pela
Coordenadoria de Biblioteca Central/UFMS
Oliveira, Jacqueline Marques de
O48o
Obtenção de antígeno de Neospora caninum para a realização de um
teste sorológico com base em Reação de Imunofluorescência Indireta/
Jacqueline Marques de Oliveira. -- Campo Grande, MS, 2004.
40 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Maria de Fatima Cepa Matos.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde.
1. Parasitologia veterinária. 2. Cão – Parasito. I. Matos,
Maria de Fatima Cepa. II.Título.
CDD (21) –
636.089696
ii
“Porque um dia é preciso parar de
sonhar, tirar os planos das gavetas e, de algum modo, começar”.
Amyr Klink
iii
Ao Elton, meu incentivador, sempre...
e a Mariana, que ainda tão pequena, já
me doou muito.
Aos meus pais, cujo amor e dedicação
possibilitaram minha formação pessoal e
profissional.
iv
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profa. Dra. Maria de Fatima Cepa Matos, professora do Departamento
de Farmácia-Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pela orientação e
apoio constantes ao desenvolvimento de todas as etapas deste trabalho e em respeito por sua
dedicação à carreira acadêmica.
Ao pesquisador Dr. Renato Andreotti e Silva, da Embrapa Gado de Corte, pelos
ensinamentos e dedicação a mim dispensados.
Ao Prof. Dr. Fernando Paiva, professor do Departamento de Patologia da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul, pela disponibilidade e auxílio na coleta de material e
realização de exames.
À Profa. Dra. Maria da Graça Morais, coordenadora do Programa Mestrado em Saúde
Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pelo empenho, dedicação e
oportunidade que nos proporcionou.
À Profa. Dra. Joice Stein, professora do Departamento de Morfofisiologia da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul, por disponibilizar o Laboratório de Biofisiofarmacologia,
para a realização do cultivo celular.
À Profa. Dra. Elenir Rose Jardim Cury Pontes, professora de Bioestatística do
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Saúde Coletiva da Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, pelo auxílio com os dados estatísticos.
À Profa. Dra. Rosângela Locatelli Dittrich, professora do Departamento de Medicina
Veterinária da Universidade Federal do Paraná, pelo envio da cepa NC-1 de Neospora
caninum.
v
À médica veterinária Leandra Marla Oshiro, pelo companheirismo, esforços e dedicação
durante as etapas do cultivo celular.
A Marilete Otaño Ferencz, secretária do Programa Mestrado em Saúde Animal da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pela atenção, boa vontade e constante apoio.
Aos queridos amigos do Cento de Controle de Zoonoses-CCZ, pela coleta das amostras e
principalmente pela amizade a mim dispensada.
Aos amigos do Laboratório de Diagnóstico de Doenças Animais (LADDAN) da Agência
Estadual de Defesa Sanitária Animal e Vegetal (IAGRO), pelo incentivo e apoio durante o
desenvolvimento deste trabalho.
À Regina Rocha de Oliveira, auxiliar do Laboratório de Hematologia do Departamento de
Farmácia-Bioquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pelo auxílio com os
materiais utilizados, atenção e amizade.
Ao Márcio Saravi de Lima, auxiliar do Laboratório de Biofisiofarmacologia do
Departamento de Morfofisiologia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, que
sempre com boa vontade, deu seu apoio.
À Jacqueline Cavalcante Barros, técnica do laboratório de Biologia Molecular da Embrapa
Gado de Corte, pela cooperação e apoio durante o desenvolvimento deste trabalho.
A Embrapa Gado de Corte e a FUNDECT/MS, pelo suporte na realização deste trabalho e
financiamento do projeto.
As amigas queridas, Jane, Susiene, Júlia, Letícia, Camila e Cristina pelo apoio,
companheirismo e amizade.
Os meus sinceros agradecimentos a todos, pelo apoio, atenção e confiança, sem os quais seria
impossível a realização deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
“Página”
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 01
1.1 Neospora caninum ....................................................................................... 01
1.2 Biologia do Neospora caninum ................................................................... 02
1.2.1
Taquizoítas ................................................................................. 02
1.2.2
Cistos teciduais e bradizoítas ...................................................
1.2.3
Oocistos ..................................................................................... 03
1.3 Aspectos epidemiológicos da neosporose ..................................................
03
03
1.3.1 Transmissão de Neospora caninum .............................................. 05
1.4 Patogenia da neosporose ............................................................................. 07
08
1.4.1
Aspectos clínicos ......................................................................
1.4.2
Aspectos imunológicos .............................................................. 09
1.5 Diagnóstico da neosporose .........................................................................
11
1.5.1
Reação de imunofluorescência indireta ..................................... 13
1.5.2
ELISA – Enzime-linked immunosorbent assay.…........………. 14
1.5.3
Isolamento in vivo e in vitro ….……………………….……… 15
1.6 Importância econômica .……………………….……………………......... 17
1.7 Medidas de controle para neosporose ……….………………...................
18
1.8 Perspectivas ................................................................................................. 18
2. OBJETIVOS............................................................................................................
20
3. ANEXOS.................................................................................................................. 21
3.1 Artigo - Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em cães da
área urbana do município de Campo Grande, MS, Brasil. (2004).
3.2 Folder – Diagnóstico da neosporose em bovinos – RIFI.
4. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 34
vii
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC
American Type Culture Collection
CCL
Certified Cell Line
CCZ
Centro de Controle de Zoonoses
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s
DNA
ácido desoxirribonucléico
DS
distrito sanitário
ELISA
Enzime-linked immunosorbent assay
IFNγ
interferon gama
IL
interleucina
PBS
solução salina tamponada
PCR
reação de polimerização em cadeia
RIFI
reação de imunofluorescência indireta
rpm
rotações por minuto
SFB
soro fetal bovino
Th1
linfócito T helper 1
µm
micrometro
_______________________________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________________
1
1. INTRODUÇÃO
A neosporose é reconhecida como uma patogenia importante do trato reprodutor de
bovinos, causando abortos, nascimentos imaturos e mortalidade neonatal. Recentemente
recebeu considerável atenção, por causar grande impacto na indústria de laticínios, devido às
perdas econômicas relacionadas às falhas reprodutivas e diminuição na produtividade
(DUBEY, 2003). No Brasil o diagnóstico da neosporose não é realizado rotineiramente em
casos de aborto. Isto ocorre por falta de conhecimento do agente e da sua prevalência nos
rebanhos brasileiros, o custo elevado do diagnóstico e a difícil obtenção e manutenção da cepa
do protozoário (ANDREOTTI et al., 2003).
Estudos têm sido desenvolvidos para identificar e caracterizar os componentes
moleculares antigênicos específicos de N. caninum, com o objetivo de melhorar o diagnóstico
sorológico e aumentar os conhecimentos relacionados com a biologia celular e sua interação
com o hospedeiro (HEMPHILL et al., 1999). Assim, o cultivo in vitro do parasita em
linhagens celulares estabelecidas, é utilizado como uma importante ferramenta no
desenvolvimento de técnicas diagnósticas que possibilitem a detecção dessa infecção.
1.1. Neospora caninum
Neospora caninum é um protozoário do filo Apicomplexa, classe Sporozoea da
família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae, que pode infectar canídeos domésticos e
selvagens, ruminantes e eqüinos. Foi primeiramente descrito causando alterações
neuromusculares e morte em cães. Até 1988 foi confundido com Toxoplasma gondii, por
causa da similaridade morfológica e biológica entre eles, no entanto, N. caninum é
antigenicamente diferente de T. gondii (DUBEY et al., 1988). Cães domésticos foram
considerados os únicos hospedeiros definitivos do parasita, eliminando oocistos nas fezes
2
após a ingestão de cistos teciduais de N. caninum (LINDSAY et al., 1999), porém
recentemente, estudos realizados com coiotes (Canis latrans) demonstraram a presença de
oocistos de N. caninum nas fezes desta espécie, caracterizando-a também como hospedeiro
definitivo deste protozoário (GONDIM et al., 2004). Durante muito tempo N. caninum foi
considerado o único membro do gênero Neospora, porém MARSH et al. (1998), isolaram
uma nova espécie a partir do sistema nervoso central de um eqüino adulto, a qual passou a ser
denominada de Neospora hughesi.
1.2. Biologia de Neospora caninum
Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório, e muitos aspectos do ciclo
evolutivo desse protozoário ainda são desconhecidos, porém três estádios evolutivos podem
ser identificados. Os taquizoítas, que são formas de multiplicação rápida, produzem várias
centenas de novos parasitas em poucos dias, causando lesões e ruptura celular. Os bradizoítas,
formas de multiplicação lenta, são capazes de formar cistos intracelulares nos tecidos do
sistema nervoso central. Esta forma ocorre tanto no hospedeiro definitivo quanto no
intermediário, podendo persistir nestes por vários anos sem causar manifestações clínicas
significativas. Por fim, os oocistos que são eliminados nas fezes do hospedeiro definitivo
(DUBEY & LINDSAY, 1996).
1.2.1 Taquizoítas
Os taquizoítas podem ter formas ovóide, lunar ou globular e medir de 3 a 7 x 1 a 5
µm, dependendo do estádio de divisão. Eles dividem-se em dois zoítas por endodiogenia
(DUBEY & LINDSAY, 1996). Podem infectar diferentes tipos de células, incluindo células
neurais, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, monócitos, hepatócitos e células
epiteliais do túbulo renal. A penetração na célula hospedeira ocorre por meio de invasão ativa,
podendo começar após cinco minutos de contato com a célula. Os taquizoítas normalmente
localizam-se no citoplasma da célula, formando um vacúolo parasitário, podendo haver mais
que um vacúolo por célula (HEMPHILL & GOTTSTEIN, 1996). Sem uma resposta
imunológica efetiva do hospedeiro, os taquizoítas podem continuar a se multiplicar, causando
progressivamente destruição celular, levando o hospedeiro à morte. Com o início de uma
resposta imune do hospedeiro, os taquizoítas diferenciam-se em bradizoítas, estabelecendo-se
um cisto tecidual persistente (BUXTON et al., 2002).
3
1.2.2 Cistos teciduais e bradizoítas
Os cistos teciduais são freqüentemente ovais, com diâmetro de até 107 µm e foram
observados em tecidos neurais, como cérebro, medula espinhal, nervos e retina (DUBEY et
al., 1988). Também já foi descrita a ocorrência de um cisto tecidual na musculatura ocular de
um potro (LINDSAY et al., 1996). A maioria dos cistos teciduais apresenta parede variando
de 1 a 2 µm de espessura, podendo medir até 4 µm, o que provavelmente está relacionado
com o tempo de infecção. No interior desses cistos são encontrados os bradizoítas, que são
delgados, medindo 6 a 8 x 1 a 1,8 µm e apresentam as mesmas organelas encontradas nos
taquizoítas, exceto pela quantidade de roptrias (organelas que atuam provavelmente
facilitando a penetração do parasita na célula hospedeira) que é menor nos bradizoítas
(BJERKAS & DUBEY, 1991).
1.2.3 Oocistos
Oocistos não esporulados, quando eliminados nas fezes dos hospedeiros definitivos
não são infectivos, medem de 10 a 11 µm de diâmetro e são esféricos ou subesféricos,
contendo um esporonte central. Após três dias, esses oocistos esporulam e tornam-se
infectivos no ambiente (MCALLISTER et al., 1998). Passam a apresentar dois esporocistos,
que medem 8,4 x 6,1 µm, e cada esporocisto contém quatro esporozoitas, medindo 7-8 x 2-3
µm (LINDSAY et al., 1999).
1.3. Aspectos epidemiológicos da neosporose
Os estudos de prevalência de anticorpos anti-N. caninum indicam que a neosporose
apresenta uma ampla distribuição mundial, tendo sido relatada em grande parte do mundo,
incluindo Austrália, Nova Zelândia, Europa, Coréia, Japão, Tailândia e as Américas. Os cães
e bovinos são as principais espécies expostas ao parasita, afetando tanto bovinos de leite,
quanto de corte (ANDERSON et al., 2000).
No Brasil, RAGOZO et al. (2003), determinaram a ocorrência de anticorpos anti-N.
caninum em bovinos de corte em cinco Estados brasileiros e encontraram uma maior
freqüência em Mato Grosso do Sul com (29,9%) e uma menor no Rio de Janeiro de (6,7%).
Os demais Estados apresentaram os seguintes dados: Minas Gerais 11,1%, Paraná 26,7% e
Rio Grande do Sul 21,4%.
4
As infecções clínicas e subclínicas de N. caninum em cães são importantes
epidemiologicamente, porque o cão doméstico (Canis familiaris) é o principal hospedeiro
definitivo de N. caninum, podendo eliminar oocistos no meio ambiente, tornando-se um fator
de risco para a ocorrência de abortos associados a N. caninum em bovinos (PARE et al.,
1998). Estudos no Canadá, Japão e Holanda têm relatado uma relação positiva entre a
neosporose canina e bovina (WOUDA et al., 1999). No Brasil, há poucos estudos sobre a
soroprevalência de N. caninum em cães. DE SOUZA et al. (2002) encontraram anticorpos anti
N. caninum em 29 (21,6%) de 134 cães em fazendas de bovinos leiteiros no Estado do Paraná,
MEIRA SANTOS et al. (1999) encontraram um resultado de 18% no Estado da Bahia e
BELO et al. (1999) detectaram um índice de 35% em cães de rua e GENNARI et al. (2002)
encontraram um resultado de 10% em cães com domicílio e 25% em cães de rua, no Estado
de São Paulo. CÂNON-FRANCO et al. (2003), encontraram anticorpos anti N. caninum em
13 (8,3%) de 136 cães acima de seis meses de idade no Estado de Rondônia e SILVA et al.
(2001) encontraram uma ocorrência de 30% em 40 cães estudados na região urbana de Campo
Grande, MS.
Nos bovinos, os abortos podem ser epidêmicos ou endêmicos, tendo sido
considerado epidêmico quando mais que 10% das vacas abortam dentro de 6 a 8 semanas
(WOUDA et al., 1999). A parasitemia materna pode ser originária de uma infecção recente ou
por ativação de bradizoítas em animais cronicamente infectados. O aborto esporádico e
endêmico é quase sempre resultado de infecções crônicas. Estudos quantitativos nos Estados
Unidos, Nova Zelândia e Alemanha indicaram que 12% a 42% de fetos abortados em
rebanhos leiteiros estavam infectados com N. caninum. A prevalência sorológica irá depender
do país, região e tipo de teste sorológico utilizado (DUBEY, 2003).
Segundo LOCATELLI-DITTRICH (2002), a alta prevalência de anticorpos anti N.
caninum observada em rebanhos bovinos com histórico de aborto endêmico, o isolamento do
parasita de fetos bovinos e de bezerros com sinais neurológicos e a presença de infecção
congênita em bezerros clinicamente sadios, indicam que o diagnóstico de neosporose deveria
ser incluído em rebanhos com histórico de aborto e doenças neurológicas em bezerros.
Vacas soropositivas para N. caninum apresentam maior probabilidade de abortar que
vacas soronegativas. Vacas congenitamente infectadas tiveram 7,4% maior risco de abortar
em sua primeira prenhez, comparada a vacas soronegativas. É possível que qualquer causa de
imunossupressão provoque reativação do protozoário e posterior aborto. A freqüência de
casos de abortos em rebanhos leiteiros é maior que em rebanhos de carne, principalmente pelo
5
tipo de manejo intensivo do sistema. Em geral, conhece-se menos sobre as causas de aborto
em rebanhos de corte que de leite, uma vez que há dificuldade em encontrar fetos imaturos
expelidos no primeiro trimestre de gestação, sendo assim, não há uma avaliação precisa das
perdas causadas por N. caninum em rebanhos de corte. Por não haver sinais clínicos da
doença relatados em animais acima de dois meses de idade, não há evidencias diretas de N.
caninum associada à morbidade em animais adultos (DUBEY, 2003).
1.3.1 Transmissão de Neospora caninum
O parasita pode ser transmitido por via transplacentária (via vertical) em vários
hospedeiros, sendo esta via a principal forma de transmissão em bovinos. A maioria dos
bezerros que nascem de mães infectadas são portadores da infecção e, uma vez infectado, o
animal parece permanecer infectado por toda a vida (DUBEY, 2003). Não há transmissão de
animal para animal (ANDERSON et al., 1997). No entanto, sabe-se que a infecção pode se
estabelecer em bovinos, por meio da ingestão de oocistos esporulados (via horizontal) (DE
MAREZ et al., 1999). Uma vaca cronicamente infectada pode transmitir a infecção ao feto
por sucessivas gestações e pode apresentar um ou mais abortos durante a sua vida reprodutiva.
As vacas infectadas são 3 a 7 vezes mais susceptíveis ao aborto que vacas não infectadas
(DAVISON et al., 1999).
A transmissão transplacentária pode ocorrer durante consecutivas gestações e
fêmeas congenitamente infectadas podem mais tarde transmitir o parasita aos seus
descendentes. Assim, o parasita pode persistir por muitos anos em um rebanho infectado sem
o envolvimento de um hospedeiro definitivo. A transmissão transplacentária do parasita é
considerada a via dominante da infecção em bovinos, e estudos têm demonstrado que cerca de
78% a 95% dos bezerros nascidos de mães infectadas também se encontram infectados
(DAVISON et al., 1999).
Na infecção experimental com taquizoítas de N. caninum por via parenteral, em
bovinos de corte e leite, o feto torna-se infectado e desenvolve a doença quatro semanas após
a inoculação do parasita (BUXTON et al., 2002). É pouco provável que ocorra transmissão
venérea ou por meio da transferência de embriões, assim sendo, esta prática já é recomendada
como um método de controle para prevenir a transmissão vertical. Um estudo com
transferência de embriões demonstrou que a infecção por N. caninum não ocorreu em nenhum
dos bezerros nascidos de vacas soronegativas, que receberam embriões provenientes de
6
doadoras soropositivas. Enquanto bezerros provenientes de doadoras soronegativas e
transplantados
para
receptoras
soropositivas
foram
infectados
com
N.
caninum
(BAILLARGEON et al., 2001). LANDMANN et al. (2002) confirmaram esses achados e
demonstraram que não houve transmissão da infecção de N. caninum com a transferência de
embriões de vacas soropositivas para vacas receptoras soronegativas.
A transmissão lactogênica de N. caninum já foi demonstrada experimentalmente em
bezerros recém-nascidos, alimentados com taquizoítas adicionados ao colostro, mas não há
evidências de que isto ocorra naturalmente (DAVISON et al., 2001). Cães alimentados com
taquizoítas adicionados ao leite não eliminaram oocistos nas fezes (DIJKSTRA et al., 2001).
Carnívoros podem adquirir a infecção por meio da ingestão de tecidos infectados
(MACALLISTER et al., 1998). LOCATELLI-DITTRICH (2002) observou que cães
alimentados com tecidos de bezerros com neosporose eliminaram poucos oocistos não
esporulados de N. caninum nas fezes, e o período de eliminação foi de 16 dias. Anticorpos
anti N. caninum não foram detectados nesses cães, nos períodos de 11 e de 38 dias após a
infecção experimental.
A presença de cães em fazendas é um fator de risco para a ocorrência de aborto
associado a N. caninum em rebanhos bovinos (PARE et al., 1998). DIJKSTRA et al. (2001)
observaram que cães em fazendas com evidência de infecção por N. caninum pós-natal,
consumiam placenta e defecavam no pasto e nas silagens armazenadas, enquanto nas fazendas
sem evidência da infecção essa prática não ocorria freqüentemente. Concluiu–se que cães são
provavelmente infectados por fluidos fetais ou restos de placenta expelidos por bovinos já
infectados, podendo causar uma infecção pós-natal em bovinos não infectados, pela liberação
de oocistos. O acesso dos cães a placentas e descargas uterinas de bovinos e às áreas de pasto,
pode facilitar a disseminação da infecção na propriedade. Também é recomendado proteger a
alimentação e a água da contaminação pelas fezes dos cães.
No entanto, BERGERON et al. (2001), ao alimentar cães com fetos bovinos
naturalmente infectados, constataram que nenhum dos cães alimentados eliminou oocistos,
apresentou soroconversão ou teve sinais clínicos ou lesões compatíveis com a infecção por N.
caninum. O autor sugere que a infecção nos cães deste experimento pode não ter ocorrido
devido ao armazenamento dos fetos sob refrigeração e congelamento, resultando em uma
diminuição na infectividade, o baixo número de parasitas no feto ou uma quantidade tão
pequena de oocistos nas fezes que não foram identificados. O autor também sugere, que o cão
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pode ser apenas um hospedeiro acidental e que o hospedeiro definitivo possa ser outro
canídeo que não o cão doméstico.
Até o presente momento não há evidências de que N. caninum possa infectar
humanos (DUBEY, 2003). No entanto, dois macacos resus (Macaca mulata) foram infectados
com N. caninum com sucesso (BARR et al., 1994), o que torna a neosporose uma potencial
zoonose. GRAHAM et al. (1999) não encontraram títulos de anticorpos anti-N. caninum em
amostras sorológicas de 199 doadores e 48 agricultores ao Norte da Irlanda. PETERSEN et al.
(1999), não encontraram anticorpos anti N. caninum em 76 mulheres com histórico de
abortos, usando ELISA, imunoblot e reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Não
havendo assim, evidências de que a infecção por N. caninum seja uma zoonose (DUBEY,
2003). No entanto, mais estudos devem ser realizados sobre esse aspecto.
1.4. Patogenia da neosporose
Como outros parasitas Apicomplexa, N. caninum é um parasita intracelular
obrigatório, assim para a sua sobrevivência, proliferação e para completar seu ciclo de vida, o
parasita deve entrar em uma célula hospedeira viável. A invasão da célula hospedeira
compreende dois eventos distintos, adesão à superfície da célula hospedeira e o processo de
entrada nesta célula. O evento inicial no processo de adesão é mediado por um contato de
baixa afinidade, que subseqüentemente conduz à secreção de micronemas, como
conseqüência, segue-se uma ligação mais específica com a superfície da célula hospedeira,
ocorrendo assim à entrada na célula. Para que esse evento ocorra, é necessário que haja a
presença de receptores adequados na superfície da célula hospedeira, que forneçam o sinal
para a entrada do parasita no citoplasma dessa célula (HEMPHIL & GOTTSTEIN, 1996).
Constata-se, assim, que taquizoítas de N. caninum interagem com a célula
hospedeira por meio de mecanismos altamente conservados em todo o filo Apicomplexa. Mas
em contraste com outros gêneros desse filo, que exibem considerável especificidade pela
célula hospedeira, tanto N. caninum quanto T. gondii são capazes de invadir e se proliferar em
diferentes tipos de células de mamíferos, sugerindo assim, que eles possam reconhecer um ou
vários receptores na superfície da célula hospedeira, para a adesão inicial e subseqüente
invasão (NAGULESWARAN et al., 2002).
O parasita ao invadir as células uterinas, multiplica-se causando uma destruição
local nos tecidos do feto e da mãe e estes tecidos iniciam uma resposta inflamatória. A partir
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daí, as lesões se estendem para a região corio-alantóide entre os cotilédones. Ao mesmo
tempo em que essas lesões ocorrem, o parasita também entra na corrente sangüínea e invade
outros tecidos, com uma predileção pelo sistema nervoso central, onde se localiza
preferencialmente ao redor dos vasos sangüíneos. A destruição de células fetais, associada à
inflamação linfóide, também pode ocorrer em outros tecidos, como coração, músculo
esquelético, pulmão e fígado (BARR et al., 1994).
N. caninum é capaz de produzir lesões necróticas visíveis em poucos dias, causando
morte celular pela ativa multiplicação dos taquizoítas, podendo produzir doenças
neuromusculares graves em cães, bovinos e provavelmente em outras espécies, destruindo um
grande número de células neurais, incluindo nervos craniais e espinhais, afetando assim a
condutibilidade dessas células (CANTILE & ARISPICI, 2002).
1.4.1 Aspectos clínicos
Apesar do parasita infectar uma grande variedade de animais e poder causar danos a
várias espécies, cães e bovinos são as espécies mais significativamente afetadas. O aborto é o
único sinal clínico observado em vacas infectadas, e vacas de qualquer idade podem abortar a
partir do terceiro mês até o final da gestação. Os abortos induzidos por N. caninum ocorrem
principalmente no quinto e sexto meses de gestação. Em humanos não parece causar infecção
ou danos significativos (DUBEY, 2003).
A neosporose apresenta sintomatologia de infecção persistente, que pode reaparecer
na fêmea durante a prenhez, resultando em uma parasitemia materna e infecção do útero
grávido, de onde passa prontamente para a placenta e para o feto. Assim, pelo menos em
bovinos, a idade e conseqüentemente a maturidade imunológica do feto podem influenciar
significativamente o resultado dessa infecção (BUXTON et al., 2002). As conseqüências da
infecção por N. caninum, em uma fêmea durante a gestação, podem ser: abortos ou o
nascimento de bezerros debilitados e infectados ou mesmo clinicamente sadios. Assim, cerca
de 95% dos bezerros provenientes de mães soropositivas podem nascer clinicamente normais,
ainda que soropositivos, e somente uma pequena parte dos fetos sucumbe à infecção a ponto
de ser abortado. A ocorrência de aborto ou não, vai depender de fatores tais como, a idade do
feto, a magnitude da parasitemia da mãe e de características particulares da cepa de N.
caninum (INNES et al., 2002).
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Ao nascerem, bezerros infectados com N. caninum podem apresentar sinais
neurológicos, estar abaixo do peso, ser incapazes de levantar-se ou não apresentar sinais
clínicos (BARR et al., 1993). Membros posteriores ou anteriores podem estar flexionados ou
hiperextendidos. Ao exame neurológico freqüentemente observam-se ataxia, diminuição dos
reflexos patelares e ainda exoftalmia ou assimetria ocular. Ocasionalmente pode causar
defeitos congênitos como hidrocefalia e estreitamento da medula espinhal (DUBEY, 2003).
Cães de qualquer idade podem desenvolver clinicamente a neosporose, que pode ser
generalizada, com vários órgãos envolvidos, incluindo a pele, ou localizada. A maioria dos
casos graves da forma localizada ocorre em animais jovens ou filhotes congenitamente
infectados, que apresentam uma paresia dos membros posteriores, progredindo para paralisia.
Sinais neurológicos dependem do local parasitado no sistema nervoso central. Os membros
posteriores, que são normalmente mais afetados que os anteriores, apresentam freqüentemente
hiperextensão. Outras disfunções que podem ocorrer consistem na dificuldade em engolir,
paralisia das mandíbulas, flacidez e atrofia muscular e falha cardíaca (DUBEY, 2003).
Neosporose congênita e pós-natal têm sido induzidas experimentalmente em cães, porém os
sinais típicos da neosporose congênita, como observado nos casos naturais, não têm sido
reproduzidos (BUXTON et al., 2002).
Além das células do sistema nervoso, outras também podem ser infectadas, entre as
quais àquelas do endotélio vascular, dos miócitos e das células da derme. Os casos de
neosporose cutânea relatados estão relacionados a cães imunossuprimidos ou cães idosos
(DUBEY et al., 1988).
1.4.2 Aspectos imunológicos
A resposta imunológica produzida perante a infecção por N. caninum consiste na
produção de anticorpos específicos e em uma resposta imune mediada por células. Tanto em
animais naturalmente infectados, quanto em animais experimentalmente infectados com
taquizoítas ou oocistos, essa resposta está relacionada com a produção de interferon gama
(IFNγ) (ADRIANARIVO et al., 2001). Uma vez que N. caninum é um parasita intracelular
obrigatório, espera-se que a resposta imune mediada por células tenha maior importância
como resposta protetora. Infecções experimentais com N. caninum induziram uma resposta
imunológica típica T helper 1 (Th1), caracterizada por altos níveis de IFNγ e produção de
anticorpos do tipo IgG (WILLIAMS et al., 2000). Esse tipo de resposta está envolvido no
10
controle da multiplicação dos taquizoítas. Estudos in vitro têm demonstrado que IFNγ inibe o
crescimento de taquizoítas. Estudos em ratos sugerem que a supressão da resposta do IFNγ,
usando anticorpos monoclonais, aumenta a suscetibilidade desses animais à proliferação e
disseminação dos taquizoítas (INNES et al., 1995).
Pouco se sabe sobre a resposta imunológica nos animais cronicamente infectados.
Esses animais parecem desenvolver uma resposta sistêmica similar a Th1, evidenciando uma
resposta imunológica protetora contra o aborto. A resposta imunológica aparentemente é
ineficiente para proteger o feto, quando ocorre uma reativação da infecção (recrudescência)
(GUY et al., 2001). WILLIAMS et al. (2003) observaram que vacas cronicamente infectadas
foram menos suscetíveis ao aborto que vacas não infectadas, quando expostas ao parasita
(inoculação parenteral de taquizoítas), porém não houve evidência de uma resposta
imunológica que evitasse a transmissão vertical para o feto. Estudos adicionais demonstraram
que o risco de aborto associado a N. caninum foi mais alto na primeira gestação e diminuiu
com as gestações subseqüentes (THURMOND & HIETALA, 1997), sugerindo que os
bovinos podem adquirir um grau de proteção contra o aborto. No entanto, parece que o
desenvolvimento dessa resposta imunológica é insuficiente para prevenir completamente a
transmissão vertical do parasita (INNES et al., 2002).
Durante a gestação ocorre uma situação interessante para o sistema imune, uma vez
que a mãe carrega o feto, estranho ao sistema imune, sem causar rejeição. Citocinas como IL2, IL-12 e IFNγ, que são importantes para a produção de resposta do tipo Th1 e que limitam a
multiplicação de N. caninum, durante a gestação, são potencialmente prejudiciais, podendo
causar rejeição ou aborto do feto (ENTRICAN et al., 2002). Células trofoblásticas do feto
produzem IL-10, conhecida por inibir a produção de IFNγ e facilitar a multiplicação de N.
caninum durante a gestação, alterando o balanço existente entre hospedeiro e parasita e
favorecendo o último (INNES et al., 2002). Conseqüentemente, ocorre uma situação em que a
resposta imune perante a infecção pode influenciar no sucesso da gestação e na
imunomodulação que ocorre por causa da gestação, afetando a habilidade do animal em
combater a infecção. Assim, a gestação cria um desequilíbrio entre o hospedeiro e o parasita.
Sabe-se que a ocorrência de destruição celular e conseqüentemente da doença depende de um
balanço existente entre a capacidade do taquizoíta em penetrar e se multiplicar na célula
hospedeira e a habilidade do hospedeiro em inibir a multiplicação do parasita (BUXTON et
al., 2002).
11
A gestação em bovinos perdura por um período de aproximadamente 280 dias e o
sistema imune do feto desenvolve-se de maneira progressiva durante este período, assim o
bezerro é imunologicamente competente ao nascer. O feto é particularmente vulnerável
durante o primeiro trimestre da gestação, quando o timo, baço e linfonodos periféricos estão
em formação. Durante o terço médio da gestação, esses tecidos já começam a reconhecer e
responder aos microorganismos. Então, antes de 100 dias de gestação, o feto é incapaz de
reconhecer um patógeno como uma partícula estranha. Assim, se sobreviverem à infecção
nesse estágio, ao nascerem tornam-se imunotolerantes ao patógeno em questão. Dos 100 aos
150 dias de gestação, o feto inicia uma resposta imunológica e após os 150 dias de gestação,
ele torna-se progressivamente mais imunocompetente, sendo capaz de reconhecer e responder
à presença de vários patógenos (ENTRICAN, 2002).
Portanto, no primeiro trimestre o feto é bastante vulnerável a uma infecção por N.
caninum e é incapaz de sobreviver a ela. No terço médio da gestação, o feto é capaz de iniciar
uma resposta imune rudimentar, que pode não ser suficiente para salvá-lo, sendo este o
período em que a maioria dos abortos ocorre (GONZÁLES et al., 1999). Isto sugere que a
resposta imunológica celular da vaca prenhe para N. caninum é mais efetiva no início da
gestação do que no seu terço médio. No terceiro trimestre de gestação, o feto já é capaz de
defender-se contra o patógeno, podendo então sobreviver (INNES et al., 2002).
1.5. Diagnóstico da neosporose
Técnicas diagnósticas precisas para a detecção de animais infectados com N.
caninum são a chave para o entendimento dos aspectos epidemiológicos da neosporose. O
diagnóstico da neosporose pode ser realizado por detecção parasitológica pós-morte, por
histopatologia, imuno-histoquímica ou por detecção de anticorpos específicos para N.
caninum (HEMPHILL et al., 2000).
O exame sorológico de vacas que sofreram aborto é somente um indicativo da
exposição do animal perante o parasita, tornando-se necessário o exame histológico do feto
para se estabelecer um diagnóstico definitivo. O cérebro, coração, fígado, placenta, soro
sanguíneo e fluídos corporais são os melhores materiais a serem coletados para realização dos
testes diagnósticos. Nem sempre é possível a obtenção desses materiais, uma vez que muitos
já estão autolisados quando encontrados (DUBEY, 2003). Lesões de neosporose são
encontradas em vários órgãos, sendo o cérebro fetal o órgão mais consistentemente afetado.
12
Na histopatologia, a lesão mais característica é uma encefalite focal, caracterizada por necrose
e inflamação não supurativa. Hepatite é mais comumente encontrada em abortos epizoóticos
que em abortos esporádicos. As lesões também estão presentes na placenta, porém o parasita é
difícil de ser encontrado nesse tecido (BARR et al., 1991).
A detecção de anticorpos contra N. caninum em soro de fetos pode estabelecer uma
infecção por N. caninum, mas um resultado negativo não é muito esclarecedor, uma vez que a
síntese de anticorpos pelo feto é dependente do estágio de gestação, intensidade de exposição
e o tempo entre a infecção e o aborto. Quando os tecidos fetais não se encontram viáveis para
o diagnóstico, este pode ser feito por meio da sorologia materna (OTTER et al., 1997).
Vários testes sorológicos podem ser utilizados para detectar anticorpos de N.
caninum, incluindo diversos ELISAs (enzime-linked immunosorbent assay), RIFI, testes de
aglutinação e imunoblots. O desenvolvimento de testes de ELISA, visando distinguir
infecções recentes de infecções crônicas em bovinos, parece promissor para a distinção entre
abortos endêmicos e epidêmicos (INNES et al., 2002).
Um ponto de corte (cutoff) definitivo, que deveria ser considerado para diagnóstico
bovino ainda não foi estabelecido, por causa da incerteza do diagnóstico sorológico em
animais cronicamente infectados e da viabilidade do soro de animais não infectados. Nos
métodos sorológicos, valores de títulos e absorbância são dependentes da composição do
antígeno e secundariamente do anticorpo e de outros reagentes utilizados. Além do mais, os
pontos de corte podem ser arbitrariamente selecionados, a fim de se obterem a sensibilidade e
especificidade necessárias para uma determinada aplicação. A idade e a classe do animal
também podem afetar essa seleção. Títulos de anticorpos em geral são mais altos em animais
que abortaram por causa da neosporose do que naqueles com gestação normal, de qualquer
modo, a titulação em uma única vaca não pode determinar a etiologia dos abortos (DUBEY,
2003).
Toxoplasma gondii e Sarcocystis cruzi são dois protozoários que devem ser
considerados no diagnóstico diferencial de aborto por protozoários em bovinos. Reações de
imuno-histoquímica e detecção do DNA do parasita por PCR podem distingui-los. A infecção
por T. gondii em fetos bovinos é rara (CANADA et al., 2002). S. cruzi, cujo hospedeiro
definitivo é o canino, provoca sinais clínicos e doença severa em bovinos, caracterizada por
anemia, anorexia, caquexia, morte em bezerros e aborto em vacas prenhes (DUBEY, 1993),
forma esquizontes no endotélio vascular e raramente é encontrado em cérebro de fetos
abortados (< 0,1%), enquanto que N. caninum geralmente encontra-se localizado em tecido
13
extravascular. Não há esquizontes imaturos na infecção por N. caninum, em contraste com a
infecção por Sarcocystis cruzi. (CANADA et al., 2002). RUAS et al. 2001, encontraram uma
prevalência para Sarcocystis spp. de 100%, em 305 bovinos sadios abatidos em frigorífico da
região sul do Rio Grande do Sul.
O desenvolvimento de um teste sorológico requer o isolamento e a multiplicação do
organismo infeccioso em questão, para a produção do antígeno. Quando DUBEY et al. (1988)
isolaram pela primeira vez N. caninum de cães infectados, organismos produzidos por meio
do cultivo celular, foram utilizados como antígenos em um teste de RIFI. A partir de então,
foram desenvolvidos e aplicados diversos testes sorológicos para o diagnóstico desse parasita,
incluindo o teste de ELISA (“Enzime-linked immunosorbent assay”). O rápido aumento nos
conhecimentos sobre a biologia e epidemiologia de N. caninum não teria sido possível sem o
emprego desses métodos (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
A habilidade de um teste em distinguir entre indivíduos infectados e não infectados,
é definida como sensibilidade e especificidade do diagnóstico. A sensibilidade é definida
como a proporção de indivíduos infectados corretamente identificados pelo teste, enquanto
que a especificidade é a proporção de indivíduos não infectados corretamente identificados
(NOORDHUIZEN et al., 1997). Na infecção por N. caninum, animais podem hospedar uma
infecção latente sem mostrar sinais clínicos, e isto dificulta uma identificação definitiva do
indivíduo não infectado (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
1.5.1 Reação de imunofluorescência indireta
Os testes diagnósticos desenvolvidos são freqüentemente comparados com um
método estabelecido como referência, denominado de padrão ouro (NOORDHUIZEN et al.,
1997). Para N. caninum, o teste de RIFI é considerado como teste referência, com o qual
outros métodos são comparados (BJORKMAN & UGGLA, 1999). Assim, ele foi o primeiro
teste sorológico usado para detecção de anticorpos anti-N. caninum. O teste é baseado no
princípio da fixação de taquizoítas de N. caninum em lâminas de microscopia, que são
incubadas inicialmente com soros diluídos e em uma segunda etapa, com anticorpos ligados a
uma fluoresceína (conjugado). Esses anticorpos são direcionados contra as imunoglobulinas
da espécie animal sob investigação. A reação é avaliada pela observação da reação em
microscopia de fluorescência (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
14
Como os taquizoítas utilizados para antígeno nos testes de RIFI estão intactos, o
teste detecta principalmente anticorpos direcionados para antígenos presentes na superfície
celular do parasita. Nas espécies de Apicomplexas, os antígenos de superfície são
considerados mais específicos que os componentes intracelulares. Estudos epidemiológicos
em diversos hospedeiros têm demonstrado que testes de RIFI para N. caninum apresentam
uma baixa incidência de reação cruzada com outros coccídios. Isto é particularmente
importante em relação a T. gondii. Por essa razão, o teste de RIFI é usado freqüentemente
como teste de referência para detecção de anticorpos contra N. caninum (TREES et al., 1993).
GONDIM et al. (1999), ao analisarem sessenta e três amostras de soro bovino, positivas para
N. caninum, constataram que apenas três amostras foram positivas para Toxoplasma gondii,
quando utilizada a RIFI. HIGA et al. (2000) ao avaliarem a reação cruzada entre T. gondii e
N. caninum por meio da RIFI, em 203 amostras de soro canino, encontraram apenas 8
(4,84%) amostras positivas para os dois antígenos, demonstrando assim uma freqüência baixa
para reação cruzada entre esses parasitas.
O ponto de corte utilizado nos testes de RIFI difere entre os laboratórios, mas os
mais freqüentemente utilizados são 1:50 em cães e 1:160–1:640 para bovinos. Essa
divergência entre os laboratórios dificulta uma comparação direta dos resultados obtidos.
Taquizoítas de N. caninum isolados, tanto de bovinos quanto de cães, também são utilizados
como antígenos de testes da RIFI por diversos laboratórios. Não havendo indicação de que
diferenças antigênicas entre os isolados afetem a exatidão do teste. O teste de RIFI para N.
caninum tem sido utilizado para um grande número de espécies animais, incluindo cães,
raposas, gatos, bovinos, ovinos, caprinos, búfalos, eqüinos, roedores e primatas
(BJORKMAN & UGGLA, 1999).
1.5.2 ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
Os testes de ELISA são aplicados para a detecção de anticorpos direcionados a uma
variedade de agentes infecciosos, incluindo T. gondii e N. caninum. O princípio do teste
consiste em uma preparação de antígeno adsorvida a uma superfície de plástico. Após a
incubação com o soro diluído a ser analisado, uma enzima ligada a uma antiimunoglobulina
espécie-específica (conjugado) é aplicada. Ao final, um substrato é adicionado, e em presença
do conjugado, é transformado em um produto colorido. Após a ocorrência da reação enzima
substrato, uma solução de parada da reação é adicionada e a absorbância é medida por um
espectrofotômetro. Os testes tradicionais de ELISA para N. caninum e T. gondii utilizam uma
15
preparação bruta de taquizoítas com um grande número de antígenos, sendo a maioria
composta de antígenos de origem intracelular (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
O desenvolvimento de testes sorológicos específicos, sensíveis e de baixo custo para
N. caninum tem sido essencial para os avanços no conhecimento da epidemiologia desse
parasita. O desenvolvimento de técnicas sorológicas para detecção de anticorpos anti-N.
caninum, geralmente corresponde aos métodos utilizados para detecção de T. gondii. Hoje,
vários testes já são viáveis comercialmente. No entanto, um problema com os testes
sorológicos para N. caninum é que a maioria dos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico
para Neospora desenvolve seu próprio método e determina os pontos de corte a serem
utilizados para interpretação do resultado. Não sendo possível comparar títulos ou valores de
absorbância obtidos entre os diferentes laboratórios (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
1.5.3 Isolamento in vivo e in vitro
Neospora caninum foi primeiramente cultivado in vitro em monócitos e células
endoteliais de artéria cardiopulmonar de bovinos. Desde então, é cultivado em rim bovino,
fibroblasto humano, em cérebro de feto de rato, células Vero (células de rim de macaco verde
africano) e em várias outras linhagens celulares estabelecidas. Alguns isolados de N. caninum
multiplicam-se mais rapidamente que outros. Os organismos provenientes do cultivo celular
são infectivos para animais (DUBEY & LINDSAY, 1996).
A criopreservação de taquizoítas em nitrogênio líquido pode manter a infectividade
para o cultivo celular. Os métodos utilizados para preservar T. gondii são adequados para a
preservação de N. caninum. Taquizoítas do isolado NC-1 podem dividir-se em dois zoítas
com oito horas após a inoculação (DUBEY & LINDSAY, 1996).
Tentativas de isolamento de N. caninum viáveis, por métodos biológicos em ratos e
cultura de células, são bastante utilizadas, mas apenas uma pequena variabilidade antigênica é
encontrada entre os isolados de N. caninum, especialmente quando isolados de animais
saudáveis. Isolados de Neospora já foram obtidos de cães, por DUBEY et al. (1988), de fetos
bovinos abortados, por CONRAD et al. (1993), e de fetos bovinos experimentalmente
infectados por BARR et al. (1994).
Considerando a extensa distribuição de casos de neosporose bovina no mundo,
relativamente poucos casos de isolamento com sucesso são relatados. Isto ocorre porque o
16
isolamento de Neospora de fetos bovinos abortados é difícil, uma vez que os fetos estão
geralmente autolisados e o número de protozoários no cisto tecidual é relativamente pequeno
(CONRAD et al., 1993). YAMANE et al. (1997), isolaram Neospora no Japão, e obtiveram
maior sucesso usando tecidos frescos de bezerros congenitamente infectados que tecidos de
fetos abortados. A limitação desse método ocorreu por causa da baixa densidade de parasitas
encontrados nos tecidos. Porém, o desenvolvimento de métodos melhores para a concentração
do parasita nesses casos, pode aumentar as chances de se obterem os isolados.
Assim YAMANE et al. (1998), desenvolveram uma técnica para melhorar o
isolamento de Neospora em bovinos, na qual foram utilizados camundongos nude para
inoculação de tecidos de bezerros infectados, ao invés de se inocular diretamente em
monocamadas de células Vero. Após duas passagens de inoculação em camundongo, obtevese uma mistura de tecidos do cérebro, pulmão e fígado dos camundongos infectados, para
então ser inoculado em células Vero. O uso dessa técnica comparada à inoculação direta de
tecidos de bovinos infectados em monocamadas de células Vero mostrou-se mais vantajosa,
porque apresentou uma maior densidade de taquizoítas nos tecidos infectados de
camundongos nude do que em tecidos de bezerros congenitamente infectados. Diferenças na
densidade de taquizoítas entre bezerros e camundongos nude podem ser atribuídas à diferença
de susceptibilidade desses animais à infecção por N. caninum.
As técnicas mais comuns utilizadas para o isolamento de N. caninum eram a
inoculação
de
tecidos
infectados
em
cultura
de
células
ou
em
camundongos
imunossuprimidos ou imunodeficientes (DUBEY et al., 1998), porém camundongos de
laboratório imunocompetentes têm demonstrado resistência à infecção. Em contraste, gerbils
(Meriones unguiculatus) são susceptíveis a infecção com N. caninum sem que seja necessária
a imunossupressão (DUBEY & LINDSAY, 2000). GONDIM et al. (2001) utilizando gerbils
imunocompetentes para o isolamento de N. caninum, concluíram que o gerbil pode ser um
bom modelo para a produção de cistos teciduais, por causa do grande número de cistos que
foram produzidos e porque a infecção de gerbils com N. caninum não requer
imunossupressão, em contraste com os camundongos.
O cultivo in vitro de taquizoítas de N. caninum tem sido feito com sucesso em
diversos tipos de linhagem celular. Freqüentemente as mesmas técnicas utilizadas para o
cultivo e criopreservação previamente descritas para taquizoítas de T. gondii, podem ser
aplicadas a N. caninum (DUBEY et al., 1988). O cultivo in vitro tem proporcionado o
desenvolvimento de ferramentas diagnósticas para a detecção da infecção por N. caninum,
17
especialmente para diferenciar a neosporose de outras infecções semelhantes, como espécies
de Toxoplasma e Sarcocystis. Isto inclui métodos indiretos, como a detecção de anticorpos
sangüíneos, ou métodos diretos, como a imuno-histopatologia, a visualização histopatológica
do parasita e a detecção do DNA do parasita pela reação da polimerização em cadeia (PCR)
(HEMPHIL et al., 2000).
O cultivo celular também é usado em processos de estudos sobre a adesão e invasão
da célula hospedeira, e também na manipulação genética do parasita. Não somente o estádio
de taquizoítas como também o de bradizoítas do parasita, podem ser induzidos no
desenvolvimento in vitro (HEMPHILL et al., 1999).
Os soros comerciais utilizados no cultivo das cepas do protozoário podem interferir
nos resultados obtidos nos testes sorológicos. LOCATELLI-DITTRICH (2002) observou que
os taquizoítas de N. caninum obtidos dos cultivos com meio suplementado com soro fetal
bovino (SFB), apresentaram fluorescência à solução de PBS. Os anticorpos anti-N. caninum
foram detectados em todos os lotes comerciais de soro fetal, de bovinos e de eqüinos,
utilizados para suplementação do meio de cultivo. Os anticorpos anti-N. caninum, presentes
no soro comercial, ligaram-se aos taquizoítas durante o cultivo, sendo reconhecidos pelo
conjugado anti-espécie.
1.6. Importância econômica
Não existem dados precisos sobre as perdas econômicas causadas pela neosporose
em bovinos, mas estima-se que em todo o mundo as perdas alcançam milhões de dólares. De
um modo bem geral, as perdas econômicas causadas pela neosporose são calculadas de
acordo com uma estimativa quantitativa dos efeitos atribuídos diretamente à infecção, por
exemplo, o número de abortos ocorridos no rebanho, e ainda, os custos diretos e indiretos
desses efeitos, como o valor do feto abortado (TREES et al., 1999). Custos indiretos incluem
gastos feitos com ajuda profissional, diagnóstico, repetição do cio, aumento do intervalo entre
partos, infertilidade, aumento no descarte de vacas, por causa do baixo desempenho
reprodutivo e possíveis perdas na produção de leite, já que mesmo vacas que não abortam e
são infectadas, apresentam uma redução de 4% na sua produção durante a primeira lactação.
Na Califórnia, foi constatado que vacas soropositivas produzem aproximadamente 1kg/dia a
menos de leite em relação àquelas soronegativas (HERNANDEZ et al., 2001).
18
1.7. Medidas de controle para neosporose
As estratégias de controle da neosporose bovina devem levar em consideração a
estimativa da prevalência da infecção no rebanho, uma vez que algumas medidas a serem
adotadas são economicamente inviáveis em determinados rebanhos. A transmissão horizontal
requer medidas de controle que previnam a contaminação de bovinos por oocistos, reduzindose as possibilidades de contato dos bovinos com as fezes de cães infectados. Assim, é
importante realizar o manejo adequado de tecidos infectados por N. caninum, diminuir o
número de cães que tenham acesso ao rebanho, proteger locais de armazenamento de alimento
e água e remoção das fezes de cães de locais como os cochos e bebedouros (ANDREOTTI et
al., 2003).
LARSON et al. (2004) ao avaliarem um modelo de estratégias de controle para um
período estimado de cinco anos em um rebanho endemicamente infectado de gado de corte,
concluíram que medidas como o descarte de fêmeas que abortaram e a venda de fêmeas
soropositivas, seguida pela reposição de fêmeas soronegativas, não foram economicamente
viáveis. Enquanto que a realização do teste para N. caninum em animais que serão
introduzidos no rebanho, seguido da exclusão das fêmeas provenientes de mães soropositivas
como potenciais repositoras do rebanho, parece ser um uma estratégia de controle com melhor
retorno econômico.
1.8. Perspectivas
Uma vez que o diagnóstico sorológico é uma estratégia para o controle da
neosporose (LARSON et al., 2004), é necessário que ele se torne acessível ao setor produtivo.
A Embrapa Gado de Corte introduziu no Estado um teste por meio de ensaio
imunoenzimático (ELISA), porém, os testes são importados e de alto custo, impedindo a
realização dos mesmos de forma mais ampla.
O isolamento de N. caninum em cultivo celular e em camundongos é considerado
difícil, e o isolamento in vitro é o mais utilizado para a obtenção das cepas de N. caninum
(DUBEY et al., 1998). As desvantagens do isolamento in vitro referem-se aos custos e à
dificuldade para manter um laboratório de cultivo celular, com as linhagens disponíveis para o
cultivo de protozoários. No Brasil o cultivo celular é realizado em poucos laboratórios
(LOCATELLI-DITTRICH, 2002).
Desta forma, o Setor de Sanidade Animal da Embrapa Gado de Corte, em parceria
com o Programa Mestrado em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do
19
Sul, desenvolveu um projeto para a produção de antígenos e realização de um teste sorológico
com base em imunofluorescência indireta, para o diagnóstico de N. caninum em cães, neste
primeiro momento, e posteriormente para que os testes sejam realizados em bovinos.
A produção de antígenos para o diagnóstico sorológico no Estado de Mato Grosso do
Sul permitirá a redução significativa do custo do teste para oferecimento ao setor produtivo.
E, ainda, a obtenção de antígenos, a partir do cultivo in vitro de N. caninum em linhagens
celulares estabelecidas, permitirá a consolidação de uma tecnologia no Estado, abrindo
amplas perspectivas, que poderão resultar em formas de diagnóstico e controle mais
eficientes.
_____________________________________________________________________________
2. OBJETIVOS
_____________________________________________________________________________
20
2. OBJETIVOS
•
Obter antígenos de Neospora caninum a partir do cultivo in vitro;
•
Produção de lâminas para testes de imunofluorescência indireta;
•
Determinar a prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em soros de cães da
cidade de Campo Grande, MS.
21
Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em cães da área urbana
do município de Campo Grande, MS, Brasil.
Jacqueline Marques de Oliveira1, Maria de Fatima Cepa Matos1, Leandra Marla Oshiro2, Renato
Andreotti2
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul1 , Embrapa Gado de Corte2
RESUMO
Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, que pode infectar canídeos
domésticos e selvagens, ruminantes e eqüinos, tendo sido descrito em 1988 por DUBEY et al.
causando alterações neuromusculares e morte em cães. Para determinar a prevalência deste
parasita na população de cães da cidade de Campo Grande-MS, foram coletadas 245 amostras
de sangue, de animais provenientes dos quatro distritos sanitários da cidade. Os soros foram
submetidos à Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos antiN. caninum, utilizando-se a cepa NC-1. Foram detectadas 65 amostras reagentes
representando uma prevalência de 26,53%. As prevalências entre os diferentes distritos
sanitários foram similares, sendo Norte 30,61%, Sul 27,27%, Leste 24,32% e Oeste 23,94%.
Os títulos encontrados variaram de 1:50 a 1:400, sendo 1:50 (29,23%), 1:100 (47,69%), 1:200
(18,46%) e 1:400 (4,62%). Verificou-se associação estatisticamente significativa em relação à
variável idade (p< 0,05), sendo 31,38% para cães adultos e 10,52% para cães jovens. Entre os
cães machos e fêmeas não houve diferença estatística significativa. Os resultados encontrados
evidenciam a presença de N. caninum nos diferentes distritos sanitários de Campo GrandeMS, indicando que os cães desta região estão expostos à infecção por este parasita.
PALAVRAS-CHAVE
Neospora caninum, cães, imunofluorescência indireta, cultivo in vitro, prevalência.
22
ABSTRACT
Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan that can infect domestic and wild
canids, as well as ruminants and equines. It was described by Dubey et al. in 1988 as causing
neuromuscular alterations and death in dogs. In order to determine the prevalence of this
parasite in the population of dogs in Campo Grande, MS, Brazil, 245 blood samples were
collected from animals originating from the city’s four health districts. Sera were submitted to
the indirect fluorescence antibody test (IFAT) for detection of anti-N. caninum antibodies,
using the NC-1 strain. Sixty-five reactive samples were detected, accounting for a prevalence
of 26.53%. The prevalences were similar across all health districts: North, 30.61%; South,
27.27%; East, 24.32%; and West, 23.94%. Titers ranged from 1:50 to 1:400, as follows: 1:50
(29.23%), 1:100 (47.69%), 1:200 (18.46 %), and 1:400 (4.62%). The study revealed a
statistically significant association with age (p < 0.05), at 31.38% for adult dogs and 10.52%
for young ones. No statistical difference was found between male and female animals. The
results provided evidence for the presence of N. caninum in all health districts of Campo
Grande, MS, showing that dogs in these areas are exposed to infection with this parasite.
KEY WORDS:
Neospora caninum, dogs, indirect fluorescence antibody test, in vitro culture, prevalence.
INTRODUÇÃO
Neospora caninum é um protozoário do filo Apicomplexa, classe Sporozoea da
família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae, que pode infectar canídeos domésticos e
selvagens, ruminantes e eqüinos. Foi primeiramente descrito causando alterações
neuromusculares e morte em cães. Até 1988 foi confundido com Toxoplasma gondii, por
causa da similaridade morfológica e biológica entre eles, no entanto, N. caninum é
antigenicamente diferente de T. gondii (DUBEY et al., 1988). Cães domésticos foram
considerados os únicos hospedeiros definitivos do parasita, eliminando oocistos nas fezes
após a ingestão de cistos teciduais de N. caninum (LINDSAY et al., 1999), porém
recentemente, estudos realizados com coiotes (Canis latrans) demonstraram a presença de
oocistos de N. caninum nas fezes desta espécie, caracterizando-a também como hospedeiro
definitivo deste protozoário (GONDIM et al., 2004). Durante muito tempo N. caninum foi
considerado o único membro do gênero Neospora, porém MARSH et al. (1998), isolaram
uma nova espécie a partir do sistema nervoso central de um eqüino adulto, que passou a ser
denominada de Neospora hughesi.
Os estudos de prevalência de anticorpos anti-N. caninum, indicam que a neosporose
apresenta uma ampla distribuição mundial, tendo sido relatada em grande parte do mundo,
incluindo Austrália, Nova Zelândia, Europa, Coréia, Japão, Tailândia e as Américas. Os cães
e bovinos são as principais espécies expostas ao parasita, afetando tanto bovinos de leite
quanto de corte (ANDERSON et al., 2000).
As infecções clínicas e subclínicas de N. caninum em cães são importantes
epidemiologicamente, porque o cão doméstico (Canis familiaris) é o principal hospedeiro
definitivo de N. caninum, podendo eliminar oocistos no meio ambiente, tornando-se um fator
de risco para a ocorrência de abortos associados a N. caninum em bovinos (PARE et al.,
1998). Estudos no Canadá, Japão e Holanda têm relatado uma relação positiva entre a
neosporose canina e bovina (WOUDA et al., 1999). DIJKSTRA et al. (2001) observaram em
um estudo, que cães em fazendas com evidência de infecção por N. caninum pós-natal,
consumiam placenta e defecavam no pasto e nas silagens armazenadas, enquanto nas fazendas
sem evidência da infecção, essa prática não ocorria freqüentemente. Concluiu–se que cães
provavelmente são infectados por fluidos fetais ou restos de placenta expelidos por bovinos já
infectados, podendo causar uma infecção pós-natal em bovinos não infectados, pela liberação
de oocistos.
23
Recentemente N. caninum recebeu considerável atenção, por causar grande impacto
na industria de laticínios por causa das perdas econômicas relacionadas com as falhas
reprodutivas e diminuição na produtividade (DUBEY, 2003).
N. caninum é capaz de produzir lesões necróticas visíveis em poucos dias, causando
morte celular pela ativa multiplicação dos taquizoítas, podendo produzir doenças
neuromusculares graves em cães, bovinos e provavelmente em outras espécies, destruindo um
grande número de células neurais, incluindo nervos craniais e espinhais, afetando assim a
condutibilidade dessas células (CANTILE & ARISPICI, 2002).
Cães de qualquer idade podem desenvolver clinicamente a neosporose, que pode ser
generalizada – com vários órgãos envolvidos, incluindo a pele – ou localizada. A maioria dos
casos graves da forma localizada ocorre em animais jovens ou filhotes congenitamente
infectados, que apresentam uma paresia dos membros posteriores, progredindo para paralisia.
Sinais neurológicos dependem do local parasitado no sistema nervoso central. Os membros
posteriores, que são normalmente mais afetados que os anteriores, apresentam freqüentemente
hiperextensão. Outras disfunções que podem ocorrer consistem na dificuldade em engolir,
paralisia das mandíbulas, flacidez e atrofia muscular e falha cardíaca (DUBEY, 2003).
Neosporose congênita e pós-natal têm sido induzidas experimentalmente em cães, porém os
sinais típicos da neosporose congênita, como observados nos casos naturais, não têm sido
reproduzidos (BUXTON et al., 2002).
Além das células do sistema nervoso, outras também podem ser infectadas, entre as
quais àquelas do endotélio vascular, dos miócitos e das células da derme. Os casos de
neosporose cutânea relatados estão relacionados a cães imunossuprimidos ou cães idosos
(DUBEY et al., 1988).
Técnicas diagnósticas precisas para a detecção de animais infectados com N.
caninum são a chave para o entendimento dos aspectos epidemiológicos da neosporose. O
diagnóstico da neosporose pode ser realizado por detecção parasitológica pós-morte, através
da histopatologia, imunohistoquímica ou por detecção de anticorpos específicos para N.
caninum (HEMPHILL et al., 2000). Para N. caninum, o teste de reação de imunofluorescência
indireta (RIFI) é considerado como teste referência, com o qual outros métodos são
comparados (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
O desenvolvimento de um teste sorológico requer o isolamento e a multiplicação do
organismo infeccioso em questão, para a produção do antígeno. Quando DUBEY et al. (1988)
24
isolaram pela primeira vez N. caninum de cães infectados, organismos produzidos por meio
do cultivo celular, foram utilizados como antígenos em um teste de RIFI. A partir de então,
foram desenvolvidos e aplicados diversos testes sorológicos para o diagnóstico desse parasita,
incluindo o teste de ELISA (Enzime-linked immunosorbent assay). O rápido aumento nos
conhecimentos sobre a biologia e epidemiologia de N. caninum não teria sido possível sem o
emprego desses métodos (BJORKMAN & UGGLA, 1999).
O ponto de corte utilizado nos testes de RIFI difere entre os laboratórios, mas os
mais freqüentemente utilizados são 1:50 em cães e 1:160–1:640 para bovinos. Essa
divergência entre os laboratórios dificulta uma comparação direta dos resultados obtidos.
Taquizoítas de N. caninum isolados tanto de bovinos quanto de cães, também são utilizados
como antígenos de testes da RIFI por diversos laboratórios. Não havendo indicação de que
diferenças antigênicas entre os isolados afetem a exatidão do teste. O teste de RIFI para N.
caninum tem sido utilizado para um grande número de espécies animais (BJORKMAN &
UGGLA, 1999).
O objetivo deste trabalho foi determinar a prevalência de anticorpos anti-N. caninum
em soros de cães da área urbana da cidade de Campo Grande, MS e estabelecer a associação
entre os fatores sexo, idade e distrito sanitário, com a prevalência dos títulos reagentes
encontrados.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Na determinação do tamanho da amostra foi utilizada a fórmula proposta por
THRUSFIELD (1994), N= Z2. P(1-P)/E2, em que N = tamanho da amostra, Z = nível de
significância, P = prevalência estimada, E = margem de erro admitida. Admitindo um grau de
confiança de 95% e aceitando-se um erro máximo de 5%. Adotou-se um valor de 20% para a
prevalência esperada, valor correspondente à média encontrada nos estudos epidemiológicos
já realizados em outras localidades brasileiras (DE SOUZA et al., 2002, MEIRA SANTOS et
al., 1999, BELO et al., 1999, CÂNON-FRANCO et al., 2003, SILVA et al., 2001), obtendo-se
assim um total de 245 amostras. Foi realizada a estratificação da amostra para que cada
distrito sanitário fosse representado por um número de amostras proporcionais à população
canina total estimada, cujos dados foram fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses de
Campo Grande, MS.
25
Coleta das amostras
As amostras de sangue foram coletadas pelo Centro de Controle de Zoonoses de
Campo Grande, MS (CCZ), durante a campanha de vacinação anti-rábica, no período de
setembro a outubro de 2003 e gentilmente cedidas, para análise de anticorpos anti-N.
caninum. Todas as amostras coletadas foram provenientes de cães domiciliares da região
urbana de Campo Grande, MS e sem histórico clínico conhecido. Estas amostras foram
obtidas por punção da veia braquial ou jugular em tubos de vacutainer estéreis, sem
anticoagulante. Os tubos foram centrifugados a 2500 rpm por 10 minutos e os soros obtidos
foram estocados a –20ºC até o momento da análise.
Produção do antígeno
As técnicas de preparo do antígeno e da reação de imunofluorescência indireta
seguiram de um modo geral as recomendações descritas por LOCATELLI-DITTRICH
(2002).
Células e parasitas
Taquizoítas de N. caninum, cepa NC-1 (DUBEY et al., 1988), gentilmente cedidos
pela Drª Rosangela Locatelli-Dittrich, da Universidade Federal do Paraná – Curitiba, Brasil,
foram transferidos para duas linhagens de células estabelecidas adquiridas do Instituto
Adolpho Lutz (São Paulo, SP) e originalmente obtidas da American Type Culture Collection,
VERO (ATCC- CCL 81, de rim de macaco) e MDCK (ATCC- CCL 34, de rim de cachorro).
Todos os procedimentos foram executados de forma idêntica para as duas linhagens.
Manutenção dos protozoários
A continuidade da infecção, a partir das garrafas de 25 cm2 recebidas, foi mantida
por meio da transferência periódica dos parasitas para novas garrafas de cultivo contendo as
monocamadas de células Vero ou MDCK. As monocamadas de células foram utilizadas após
48 a 72 horas de incubação, conforme descrito a seguir.
As células Vero ou MDCK foram descongeladas e cultivadas em garrafas estéreis de
25 cm2 essencialmente como descrito (HEMPHILL & GOTTSTEIN, 1996); foi utilizado o
26
meio Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM – Sigma), suplementado com soro fetal bovino a
10% (SFB) e solução antibiótico/antimicótico, GIBCO (concentração final: 100 U/mL de
penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 0,25 µg/mL de anfotericina) e as células foram
mantidas a 37°C em estufa umidificada com 5% de CO2. Após o estabelecimento da
monocamada, que ocorria após 24 ou 48 h de incubação (Figura 1), o meio com SFB era
substituído por meio sem SFB, e as células mantidas durante um período adicional de 24 h
nessa condição, para que não houvesse interferência nos resultados do método da RIFI,
(LOCATELLI-DITTRICH, 2002). A partir da infecção até a produção do antígeno foi
utilizado meio sem soro. Foi utilizado microscópio invertido da ZEISS (Modelo Axiovert 25)
e aumento de 400 X para a observação do crescimento das células e dos parasitas.
Figura 1. Monocamada de células Vero não infectada. 400 X.
Preparação do Antígeno
Os taquizoítas foram retirados das garrafas de cultivo celular quando a monocamada
de células apresentava efeito citopático (Figura 2) em cerca de 80% de sua extensão, tendo
sido utilizado haste de borracha (“scraper”) estéril para a remoção de células infectadas e do
parasita. A suspensão obtida foi passada três vezes por agulha de 25 x 6, para o rompimento
das células e liberação do parasita, em seguida a suspensão foi centrifugada a 1.000 rpm
durante 10 minutos e o sedimento lavado três vezes em solução salina tamponada (PBS) pH
7,2. Os parasitas eram contados em câmara de Neubauer e o inóculo diluído em PBS, para
uma concentração de 1,0 x 106 taquizoítas/mL, e em seguida, depositados 30 µL (30.000
taquizoítas) da suspensão em cada orifício da lâmina de imunofluorescência. As lâminas
foram secas em temperatura ambiente, “overnight” e em seguida armazenadas a –20°C até o
momento da análise.
27
A
B
Figura 2. A - Monocamada de células Vero infectada com N. caninum cepa NC-1. B - Presença de
efeito citopático na monocamada. 400 X.
Uma parte das lâminas produzidas com taquizoítas obtidos do cultivo em células
Vero foi escolhida aleatóriamente para as análises do presente trabalho. As demais lâminas
com taquizoítas obtidos do cultivo em células Vero e aquelas obtidas do cultivo em células
MDCK foram produzidas para utilização em futuros testes sorológicos (Anexo 3.1).
Durante a transferência dos parasitas de uma garrafa para outra, foram retiradas
amostras das suspensões, para coloração e observação dos protozoários. A suspensão foi
centrifugada a 2.600 rpm, durante 10 minutos e do sedimento foram realizadas as distensões
em lâminas e coradas pelo método de May-Grünwald-Giemsa (Figura 3).
Figura 3. Taquizoítas da cepa NC-1 de Neospora caninum, obtidos
em cultivo celular. Coloração de May-Grünwald-Giemsa. 1.000 X.
Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
As amostras de soro foram testadas em uma diluição inicial de 1:50, sendo diluídas
em microplacas de fundo chato, onde eram previamente distribuídos 245 µL de PBS por poço
e adicionados a cada um deles 5 µL da amostra a ser testada. Após homogeneização, 10 µL da
amostra diluída foram transferidos para os poços da lâminas de imunofluorescência
28
previamente sensibilizadas e, em seguida as lâminas foram incubadas em câmara úmida por
30 minutos a 37ºC. Após esse procedimento, as lâminas foram lavadas três vezes em cubetas
de vidro, por imersão em PBS, sendo a primeira lavagem rápida e as duas seguintes com
duração de 10 minutos. As lâminas foram secas em estufa por 5 minutos e em seguida
adicionados 15 µL do conjugado comercial anti-IgG canina (VMRD). Foram novamente
incubadas por 30 minutos a 37ºC. Após repetição dos procedimentos de lavagem e secagem,
descritos anteriormente, as lâminas foram montadas com glicerina tamponada pH 8,5 e
cobertas com lamínulas. Para cada lâmina foram incluídos os soros controles negativo e
positivo (VMRD).
A observação da fluorescência dos taquizoítas foi realizada em microscópio com fonte de luz
ultravioleta (Figura 4), sendo consideradas reagentes as amostras que apresentaram uma
completa fluorescência periférica do parasita na diluição de 1:50 (PARE et al., 1998). As
amostras positivas foram testadas nas diluições de 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800. A
fluorescência dos taquizoítas observada em lâminas preparadas com antígenos provenientes
do cultivo em células MDCK foi idêntica àquela obtida em células Vero.
A
B
Figura 4. Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para Neospora caninum em soros de cães.
A – aumento de 400 X. B – aumento de 1.000 X.
Análise estatística
Para a análise dos resultados, os dados foram agrupados por distrito sanitário, sexo,
idade e analisados pelo teste de Qui-quadrado, com um grau de liberdade para as variáveis
sexo e idade, e 3 graus de liberdade para a variável distrito sanitário, por meio do programa de
análise estatística Epi Info 6.04b com nível de significância p < 0,05.
29
RESULTADOS
Foram detectadas 65 amostras reagentes, representando uma prevalência de 26,53%
(65/245). Os resultados da sorologia foram relacionados com distrito sanitário, sexo e idade.
Observa-se na Tabela 1 que foi detectada a presença de anticorpos anti-N. caninum
em todos os distritos sanitários pesquisados, sendo o de menor freqüência o distrito Oeste,
23,94% (17/71) e o de maior, o distrito Norte , 30,61% (15/49), porém não foi constatada
diferença estatisticamente significativa entre os distritos.
Tabela 1. Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em cães, por reação de imunofluorescência indireta,
no período de setembro a outubro de 2003, nos distritos sanitários (DS) de Campo Grande, MS.
Distrito sanitário
(DS)
Reagentes
Não-reagentes
Total
Soro reagentes/Total
DS (%)
Norte
15
34
49
30,61
Sul
24
64
88
27,27
Leste
09
28
37
24,32
Oeste
17
54
71
23,94
Total
65
180
245
χ2Calculado= 0,78
χ2 Tabelado= 7,81
Na Tabela 2 estão apresentados os resultados das variáveis sexo e idade analisados.
Apesar da proporção de machos soro reagentes 30,71% (43/140) ser maior que a de fêmeas
20,95% (22/105), não houve diferença estatisticamente significativa entre eles. Ao comparar a
prevalência em cães jovens 10,52% (6/57) com àquela de adultos 31,38% (59/188), verificouse significância estatística (p<0,05).
30
Tabela 2. Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em cães, por idade e sexo, no período de setembro a
outubro de 2003, nos distritos sanitários de Campo Grande, MS.
Variáveis
Reagentes
Não Reagentes
Total
N
%
N
%
N
%
Macho
43
30,71
97
69,29
140
100
χ 2= 2,93
Fêmea
22
20,95
83
79,05
105
100
p= 0,0868
Total
65
26,53
180
73,47
245
100
Jovens (< 1 ano)
6
10,52
51
89,48
57
100
χ2= 9,76
Adultos (> 1 ano)
59
31,38
129
68,62
188
100
p= 0,0018
Total
65
26,53
180
73,47
245
100
Sexo
Idade
Os títulos encontrados variaram de 1:50 a 1:400, sendo 1:50 (29,23%), 1:100
(47,69%), 1:200 (18,46%) e 1:400 (4,62%). Não foram encontradas amostras com títulos
iguais ou maiores que 1:800 (Tabela 3).
Tabela 3. Freqüência dos títulos encontrados nas 65 amostras reagentes para anticorpos anti-Neospora caninum
por reação de imunofluorescência indireta, no período de setembro a outubro de 2003, nos distritos sanitários de
Campo Grande, MS.
Título
Nº de amostras
Freqüência (%)
1/50
19
29,23
1/100
31
47,69
1/200
12
18,46
1/400
3
4,62
1/800
-
-
Total
65
100
31
DISCUSSÃO
Existem poucos estudos sobre a prevalência de N. caninum em cães no Brasil. DE
SOUZA et al. (2002) encontraram anticorpos anti-N. caninum em 29 (21,6%) de 134 cães em
fazendas de bovinos leiteiros no Estado do Paraná, MEIRA SANTOS et al. (1999),
encontraram um resultado de 18% em cães do Estado da Bahia, BELO et al. (1999)
detectaram um índice de 35% em cães de rua e GENNARI et al. (2002) encontraram um
resultado de 10 % em cães com domicilio e 25% em cães de rua, no Estado de São Paulo, e
CÂNON-FRANCO et al. (2003), encontraram anticorpos anti-N. caninum em 13 (8,3%) de
136 cães acima de seis meses de idade no Estado de Rondônia. A prevalência encontrada no
presente trabalho foi de 26,53% (65/245), similar àquela obtida em estudo preliminar de nosso
grupo, em 40 cães da região urbana de Campo Grande, MS (SILVA et al., 2001).
Com relação a variável sexo, não houve diferença estatisticamente significativa
neste trabalho, fato este também observado por VARANDAS et al. (2001) e DE SOUZA et
al. (2002) sugerindo que machos e fêmeas da espécie canina estão submetidos às mesmas
condições de risco. Dubey (2003), afirma que se existe alguma susceptibilidade da neosporose
canina por raça ou por sexo, ainda é desconhecida. Também não encontramos diferença
estatisticamente significativa entre os diferentes distritos sanitários estudados, indicando a
presença de anticorpos anti-N. caninum em todas as regiões da cidade. BASSO et al. (2001),
encontraram uma prevalência de 26,2% em cães de área urbana na Argentina e 48% em cães
provenientes de fazendas leiteiras, demonstrando uma prevalência maior em cães de área
rural.
A variável idade exerceu influência nos resultados obtidos e a prevalência
encontrada em animais adultos foi mais elevada que nos animais jovens, concordando com os
dados apresentados por DE SOUZA et al. (2002) e BASSO et al. (2001), que também
detectaram um aumento na soroprevalência com a idade. Estes achados sugerem uma
exposição pós-natal ao parasita. BARBER & TREES (1998), relatam que a taxa de
transmissão da neosporose por via vertical em cães é baixa, uma vez que 80% dos filhotes de
mães soropositivas não se encontram infectados ao nascimento, indicando que a infecção pósnatal deve ser significativa nesta espécie. No entanto, VARANDAS et al. (2001) não
encontraram diferença significativa quanto ao parâmetro idade, sugerindo que cães de
qualquer idade estão sujeitos ao mesmo risco de infecção. Assim, outros estudos devem ser
realizados a este respeito.
32
Pelas informações de que dispomos, o presente trabalho relata pela primeira vez em
Campo Grande, MS, a prevalência de anticorpos anti-N. caninum em amostra aleatória e
estratificada da população canina de nossa cidade.
Os resultados encontrados, utilizando a reação de imunofluorescência indireta com
antígenos produzidos em nosso laboratório, evidenciaram a presença de anticorpos anti-N.
caninum em todos os distritos sanitários de Campo Grande-MS, indicando que esses animais
estão expostos à infecção por esse parasita. Sugere-se que a neosporose seja incluída no
diagnóstico diferencial das doenças neurológicas em cães dessa região e que outros estudos
sejam desenvolvidos em cães da área rural de Campo Grande, visto que estudos
epidemiológicos realizados no Canadá, Japão e Holanda relataram uma relação positiva entre
a neosporose em cães e em bovinos (PARE et al., 1998, WOUDA et al., 1999), sugerindo
assim a importância do papel desses animais na epidemiologia do parasita.
A obtenção de antígenos, a partir do cultivo in vitro de Neospora caninum em
células VERO e MDCK, posta em prática pela primeira vez no Estado, abrirá amplas
perspectivas, que poderão resultar em formas de diagnóstico e controle mais eficientes da
neosporose.
AGRADECIMENTOS
Ao Centro de Controle de Zoonoses (CCZ), à Agência Estadual de Defesa Sanitária Animal e
Vegetal (IAGRO) e à Embrapa Gado de Corte, pelo suporte na realização deste trabalho. A
FUNDECT/MS pelo financiamento e ao CNPq pela bolsa (L. M. O.) do projeto.
_____________________________________________________________________________
4. REFERÊNCIAS
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34
4. REFERÊNCIAS
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