Análise genética de comportamentos emocionais através

Roteiro de Estudos G1
Tópicos Especiais em Processos Psicológicos Básicos 2009.2
Professor: Vitor de Castro Gomes
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Análise genética de comportamentos
através de modelos animais
emocionais
Sumário
O objetivo deste capítulo é introduzir o leitor no universo das abordagens experimentais disponíveis para
o estudo genético da emocionalidade, sendo o foco no uso de modelos animais. Primeiramente, alguns
conceitos preliminares serão discutidos, e então será apresentada uma visão geral dos principais métodos
para medir e interpretar os chamados “comportamentos emocionais”. Finalmente nós apresentaremos
estratégias clássicas e modernas para determinar as bases genéticas para a variância em traços
relacionados a emocionalidade.
Introdução
Estudar os aspectos genéticos das emoções, tanto em humanos quanto em modelos animais, é uma tarefa
particularmente desafiadora, devido três principais razões: emoções são difíceis de definir; emoções são
difíceis de medir; e emoções são difíceis de serem analisadas geneticamente. Estes três tipos de
dificuldades, assim como alguns dos métodos experimentais desenvolvidos para superar tais dificuldades,
serão discutidos aqui. Sem a intenção de sermos exaustivos, nós iremos introduzir através deste capítulo
alguns achados relacionados à procura de genes que influenciam as diversas respostas emocionais em
roedores de laboratório.
Definições
A interpretação dos termos derivados da palavra emoção pode variar entre os autores, mas a maioria dos
pesquisadores concorda que emoções são experiências subjetivas, que aparecem sob circunstâncias nãoordinárias, e que envolvem mudanças fisiológicas e comportamentais. No campo da Psicobiologia
Experimental, o conceito de emocionalidade que tem sido extensivamente usado para animais de
laboratório foi fornecido por Hall:
O termo emocionalidade é definido como o estado de ser emocional. Este estado consiste de um grupo de reações orgânicas,
experienciais e expressivas e denota um aumento geral ou uma condição excitada do animal. Emocionalidade pode ser entendida
como um traço... O leitor é advertido a não interpretar emocionalidade como uma coisa ou faculdade. É meramente um conceito
conveniente para descrever um complexo de fatores... O termo emoção é conveniente usado para designar a experiência que resulta
de uma estimulação emocional.
Pelo caráter intrinsecamente subjetivo, emoção e emocionalidade não podem ser diretamente medidas.
Assim sendo, cientistas muitas vezes tentam inferir tais estados subjetivos através de suas manifestações
comportamentais. Em termos operacionais, a taxa de defecação no teste do campo aberto (ver abaixo) tem
sido há muito tempo usada como a medida de emocionalidade no rato. Devido ao fato da atividade
locomotora neste teste covariar negativamente com a taxa de defecação, um animal com alta taxa de
defecação e baixa locomoção no campo aberto é usualmente considerado altamente emocional. Todavia,
vários resultados experimentais mostram que tal correlação entre estas duas variáveis não é sempre
confirmada, e que indivíduos ou linhagens específicas podem apresentar, por exemplo, uma alta taxa de
defecação juntamente com uma alta taxa locomotora. Além disso, estudos farmacológicos não fornecem
suporte incondicional para o uso de medidas do campo aberto como índices satisfatórios de ansiedade, um
traço psicológico ou estado que sejam relacionados com emocionalidade.
Por esta razão, apesar do termo emocionalidade, assim como estresse, possa ser conveniente para se
descrever uma larga categoria de processos biológicos e psicológicos, diferenças inter-individuais ou
inter-linhagens devem ser definidas de uma maneira mais analítica. Estas diferenças não são somente
quantitativas (mais ou menos emocionais), mas suas expressões comportamentais e neuroendócrinas
podem variar em natureza (diferenças qualitativas). Por exemplo, animais altamente emocionais podem
demonstrar tanto respostas de congelamento ou comportamento de fuga, dependendo da circuitaria
existente entre o estado central emocional e as saídas comportamentais. Por esta razão, existe um maior
consenso entre os pesquisadores de que emocionalidade possui, de fato, diversas dimensões diferentes, ao
invés de ser um constructo linear e unitário.
Medidas
Um bom número de paradigmas tem sido usado para se medir comportamentos “emocionais” em animais
de laboratório. Basicamente, estes paradigmas experimentais consistem na exposição dos animais a
estímulos aversivos, ao mesmo tempo em que se observa e se analisa seus comportamentos. O estímulo
aversivo pode variar em natureza, podendo ser essencialmente físico (choques elétricos nas patas,
privação de comida, submersão na água etc) ou então predominantemente psicológico (ambientes novos,
áreas intensamente iluminadas, espaços abertos, exposição ao cheiro de predadores, altura, instabilidade
social). Outra variável importante é a habilidade do animal de evitar ou escapar de estímulos aversivos.
Muitas situações experimentais usam respostas incondicionadas a uma quantidade de novos ambientes, ou
paradigmas de aprendizagem.
Respostas de Estresse Incondicionadas, Exposição Forçada.
O Teste do Campo Aberto é altamente usado em pesquisas comportamentais. Tal aparato consiste de
uma larga arena, circular ou quadrática, com diâmetro geralmente de um metro para o teste com ratos, e
cercada por paredes para prevenir a fuga dos animais; o piso é usualmente marcado com linhas para
permitir uma quantificação da locomoção. A iluminação é variável, e freqüentemente intensa para
provocar uma aversividade. Medidas comportamentais incluem locomoção (periférica ou central),
“rearings” (encostar as patas nas paredes ou no espaço vazio), auto-limpeza, congelamento, assim como
defecação ou urinação (que são medidas de ativação do sistema nervoso autonômico). A associação de
baixa locomoção com uma alta taxa de defecação, como mencionado acima, tem sido a definição
operacional de emocionalidade no rato, mas esta medida unitária de emocionalidade tem sido criticada.
De fato, muitos estudos mostram que o constructo da emocionalidade, do jeito que vem sendo medida no
campo aberto, é composto por diversos fatores ou componentes independentes, sendo que os dois
principais fatores são a “descarga motora” ou “atividade” (incluindo locomoção e “rearing”) e “equilíbrio
autonômico” ou “reatividade emocional” (medidas através da contagem do número de bolos fecais). A
urinação, primariamente, poderia ser considerada como um índice de demarcação territorial. Locomoção
pode ser ainda dividida em central (longe das paredes) e periférica (quando os animais podem encostar-se
à parede), sendo o primeiro mais relacionado com medo e ansiedade e o último com atividade geral do
animal. Diferenças nas linhagens relacionadas a defecação e atividade locomotora são descritas em
camundongos e ratos (Figura 20.1)
Muitos outros “testes de novidade” são usados para caracterizar a reatividade emocional dos animais.
Alguns deles são menores, com um baixo nível de iluminação para reduzir a aversividade do ambiente, o
que favorece a atividade locomotora dos animais. Estes são conhecidos como “gaiolas de atividade”, e
usualmente possuem equipamentos para um registro automático do movimento dos animais. A atividade
motora geral pode ser ainda registrada através de vários outros recursos, como por exemplo, pulsos de
infravermelho, bobinas de indução etc.
De forma alternativa, o ambiente experimental pode ser ainda mais complexo para favorecer outros
aspectos do comportamento e permitir a análise de diferentes componentes de atividade em testes de
novidade, como por exemplo, a “atividade exploratória” (caixa-vazada, introdução de objetos no campo
aberto, paredes perfuradas etc), ou conflitos motivacionais (presença de comida, água, ou de coespecíficos). Um destes testes é o chamado “Teste de Interação Social”. Neste teste é possível observar
que o tempo despendido por pares de ratos machos interagindo socialmente varia de acordo com a
aversividade do aparato experimental. O teste da “Hiponeofagia” é um teste de conflito aonde ratos com
fome são expostos a bolotas de comida localizadas no centro de um ambiente novo e intensamente
iluminado. Espera-se que ratos altamente emocionais demonstrem uma maior latência para abordar a
comida, e, por conseguinte, que tenham um menor consumo desta mesma comida. Estes testes vêm sendo
especialmente desenvolvidos para o estudo do mecanismo de ação de diversos compostos ansiolíticos.
Juntamente com outros testes de reatividade, nós podemos citar o “Reflexo de Sobressalto Acústico” e as
“Vocalizações Ultra-sônicas de filhotes”. Este último teste, por exemplo, é feito nas duas primeiras
semanas de vida de filhotes, após o isolamento de suas respectivas mães, e o registro de suas vocalizações
através de um aparelho especializado. Mas é importante lembrar que esta lista de modelos ainda está
longe de estar completa.
Respostas de Estresse Incondicionadas, Testes de Escolha.
Tais testes consistem de dois (ou mais) compartimentos que diferem entre si nos seus níveis de
aversividade. O animal pode se movimentar livremente de um compartimento para outro(s). Por exemplo,
temos a caixa de transição claro-escuro (“Black-White Box”), que é composta por um compartimento
pequeno e escuro, juntamente com uma área larga e altamente iluminada, conectadas por uma pequena
passagem (ou porta) por onde o animal pode se movimentar livremente. Transições entre os
compartimentos e a locomoção geral são registradas. Drogas ansiolíticas, de uma forma geral, aumentam
essas duas medidas (transição e locomoção geral), e antidepressivos se mostram inativos. Muitas
variantes desse teste têm sido descritos como testes de emergência, com o animal sendo introduzido num
compartimento “seguro” (usualmente pequeno e escuro, onde o animal pode sair por um tempo para se
habituar) e o tempo para emergir para um compartimento mais aversivo (usualmente maior, altamente
iluminado e não-explorado previamente) é medido.
O Labirinto em Cruz Elevado foi desenvolvido a partir de estudos que mostram que ratos demonstram
mais medo quando expostos a espaços abertos e elevados do chão, do que quando expostos a espaços
fechados. Este é o teste mais popular nos dias de hoje para a classificação de drogas ansiolíticas em ratos.
Tal aparato consiste de quatro braços elevados 45 cm do chão, com 50 cm de comprimento e 10 cm de
largura. Tais braços estão arranjados numa disposição de “cruz”, com dois braços opostos fechados com
paredes altas e dois braços opostos abertos. Em sua intersecção, uma plataforma central permite acesso
para qualquer um dos quatro braços. Os ratos são colocados na plataforma central, e por 5 minutos, a
locomoção total ou exploração total é medida através do número total de entradas em todos os braços,
aonde a porcentagem de entradas nos braços abertos é inversamente proporcional ao medo, já que tal
porcentagem é aumentada após certos tratamentos com ansiolíticos (benzodiazepínicos, mas não
ansiolíticos com ação na serotonina) e reduzida por drogas ansiogênicas como cafeína, yohombina, e
anfetamina. De fato, ratos passam maior tempo nos braços fechados e demonstram mais sinais
fisiológicos e comportamentais de medo quando confinados nos braços abertos do que quando estão nos
braços fechados: locomoção reduzida, maior taxa de defecação e maior resposta de corticosterona no
plasma sanguíneo.
Experimentos de Condicionamento
Muitos destes experimentos são baseados na administração de um estímulo aversivo, mais
freqüentemente um choque elétrico nas patas. Nos paradigmas de esquiva ativa, animais experimentais
podem escapar ou evitar o estímulo incondicionado através de uma resposta adequada programada pelo
experimentador: por exemplo, pressionar uma barra ou então a troca de um lado da caixa por outro. A
aprendizagem da resposta pode ser dificultada pela administração prévia de choques inescapáveis. Este
paradigma, conhecido como desamparo aprendido, é usado como um modelo de depressão em estudos
farmacológicos ou patofisiológicos. Outro paradigma popular para estudos psicofarmacológicos é o
chamado teste do nado forçado, aonde o rato aprende numa primeira exposição que não existe
escapatória possível de um pequeno tanque com água e eventualmente exibe um “comportamento
depressivo” (maior tempo de flutuação na água) nos testes subseqüentes.
Interpretando
multivariada.
Emocionalidade
através
de
uma
abordagem
Entender o significado psicológico de um dado “comportamento emocional” não é simples. Muito
freqüentemente, diferentes indivíduos variam numa série de comportamentos de uma maneira
visivelmente inconsistente, ou seja, um animal (ou grupo de animais) pode parecer altamente medroso em
relação a um específico comportamento (por exemplo, defecação), mas não em outros tipos (por exemplo,
locomoção). Como um exemplo, observe o comportamento dos ratos “Brown Norway” na figura 20.1 e
20.1. Por este motivo, para aumentar a confiabilidade do estudo da reatividade emocional em animais de
laboratório, diferentes comportamentos podem ser medidos num teste somente (situações de testes
simples), ou uma bateria de diferentes testes pode ser aplicada para o mesmo grupo de animais (situações
de testes múltiplos). Em ambos os casos, resultados normalmente sugerem que diferentes reações
comportamentais e diferentes contextos experimentais podem estar associados a diferentes dimensões da
emocionalidade.
Situações de testes simples: a análise fatorial ou multivariada tem sido aplicada de forma bem sucedida
para distinguir diversas dimensões da reatividade emocional em animais experimentais em situações de
testes simples. O paradigma do labirinto em cruz elevado servirá de exemplo, pois provavelmente é o
teste mais bem documentado da literatura. Cruz e colaboradores mediram 13 variáveis comportamentais
no labirinto em cruz elevado de 30 ratos Wistar machos. Os primeiros e mais importantes dois fatores
representam variáveis de ansiedade e locomoção. Porcentagem de entradas nos braços abertos, tempo nos
braços abertos, e tempo nos braços fechados (negativamente relacionados) são as variáveis com os
maiores carregamentos no primeiro fator. Estas medidas mudaram numa direção através da administração
de drogas ansiolíticas e numa direção oposta após a administração de drogas ansiogênicas, sendo
consideradas assim medidas de ansiedade. O segundo fator reflete principalmente o número de entradas
nos braços fechados (locomoção). O número total de entradas nos braços abertos, que normalmente é
usado como o principal índice de locomoção no labirinto em cruz elevado, é uma medida ambígua, já que
esta variável carrega simultaneamente tanto no fator ansiedade quanto no fator locomoção. Esta
ambigüidade parece ser devido a uma maior “contaminação” de respostas emocionais em comparação
com o fator “número de entradas nos braços fechados”. Finalmente, tempo despendido no centro do
labirinto carregou como terceiro fator.
Situações de testes múltiplos: Este tipo de análise é mais poderosa para se investigar os dados obtidos dos
mesmos animais utilizados em situações experimentais diferentes. Por exemplo, Trullas e Skolnick
estudaram o comportamento de 16 linhagens “Inbred” (uma linhagem “Inbred” é obtida após 20
gerações de cruzamentos consangüíneos, ou seja, irmão-irmã; uma linhagem “Outbred, por sua vez, é
obtida evitando-se cruzamentos consangüíneos) de camundongos no campo aberto e no labirinto em cruz
elevado. As variáveis que saturaram no fator 1 (44,5% da variância total) foram todas relacionadas com o
tempo despendido ou com o número de cruzamentos (“Crosses”) entre os braços abertos do labirinto em
cruz elevado. Já que o tempo despendido nos braços abertos correlacionou-se tanto com o reflexo do
sobressalto acústico e a hiponeofagia num ambiente novo, o fator 1 foi interpretado como um reflexo do
nível de ansiedade do animal. Variáveis relacionadas com locomoção, ambas no campo aberto e no
labirinto em cruz elevado, carregaram no fator 2 (27,5% da variância total), o que nos parece ser uma
medida de atividade geral. Novamente, o terceiro fator (10,3% da variância total) foi definido
exclusivamente como o tempo gasto na plataforma central do labirinto em cruz elevado. Uma análise
similar foi conduzida em nosso laboratório em cima dos dados obtidos de 19 variáveis de 4 testes
comportamentais: campo aberto, labirinto em cruz elevado, caixa de transição claro-escuro e interação
social. Os sujeitos empregados foram machos e fêmeas de seis linhagens “inbred”. O primeiro fator
(36,6% da variância total) foi ainda definido por variáveis classicamente associadas com ansiedade
(locomoção na parte central do campo aberto, entradas e tempo gasto nos braços abertos do labirinto em
cruz elevado, comportamento na caixa de transição claro-escuro). O segundo fator (30,3% da variância
total) foi definido por medidas de locomoção (locomoção total e locomoção na parte externa do campo
aberto, locomoção nos braços fechados do labirinto em cruz elevado). De forma muito interessante, o
tempo de interação social num ambiente novo carregou como terceiro fator (18,3% da variância total),
junto com a taxa de defecação no campo aberto e na caixa de transição claro-escuro. Esta independência
entre comportamentos medidos em diferentes “testes de ansiedade”, como o labirinto em cruz elevado e a
interação social, já havia sido anteriormente descrita por File. Tais dados mostram que estas 3 medidas
comportamentais no campo aberto – locomoção na parte externa, locomoção na parte interna e defecação
– carregaram em diferentes fatores e foram independentes na maior parte do tempo.
A abordagem multifatorial nos traz um bom número de conclusões interessantes. Por exemplo, em muitos
desses experimentos, os dois principais eixos de variabilidade são relacionados, respectivamente, ao nível
de estimulação emocional e a quantidade de ativação locomotora do aparato. Isto nos lembra os dois
principais fatores extraídos por Eysenck após numerosos estudos descritivos sobre a personalidade
humana: estabilidade emocional vs instabilidade emocional(neuroticismo) e extraversão vs introversão.
Obviamente, esta abordagem ainda é uma super-simplificação da realidade, como mostrado, por exemplo,
pela independência dos resultados obtidos em diferentes “testes de ansiedade”. A complexidade salta aos
olhos no exato momento em que nós a encaramos.
Análise Genética
Uma grande variabilidade pode ser encontrada em comportamentos “emocionais” entre animais
individuais. Diferentes estratégias experimentais têm sido usadas nos últimos 50 anos para se analisar esta
variabilidade e identificar suas causas. No restante deste capítulo, estas estratégias serão apresentadas
aqui com alguns exemplos ilustrativos de resultados experimentais. Diferenças entre linhagens “inbred”
criadas no mesmo ambiente, experimentos de seleção e estudos de genética quantitativa vêm mostrando
que fatores genéticos possuem uma grande influência em diferenças inter-individuais, embora tais fatores
de fato possuam uma interação com outros fatores ambientais, especialmente durante o período neonatal e
pós-natal. Estudos de genética Molecular, por outro lado, estão agora florescendo e devem, em pouco
tempo, desembaraçar as bases moleculares destas diferenças nos vários aspectos da reatividade
emocional.
Experimentos de Seleção
Nós mostramos diversos exemplos de diferenças entre linhagens para comportamentos emocionais nas
figuras 20.1 e 20.2. Se estes traços são herdáveis, criações selecionadas deveriam ser efetivas em
modificar o valor de um determinado caráter de uma população. Muitos exemplos nos mostram que, de
fato, este é o caso para numerosos traços de reatividade, como medidos:
- No Campo Aberto: Maudsley Reativos (MR) e Maudsley Não-Reativos (MNRA) linhagens de ratos,
selecionados a partir de sua taxa de defecação; ratos Floripa H e L, seletivamente criados para alta ou
baixa taxa de locomoção na área aversiva central; linhagens de camundongos (selecionadas a partir de sua
atividade locomotora divergente) criadas de uma geração F3, resultado de um cruzamento entre as cepas
BALB/c e C57BL/6;
- No Labirinto em Cruz Elevado: linhagens de ratos com Alto Comportamento Ansioso (“High Anxiety
Behavior – HAB”) e Baixo Comportamento Ansioso (“Low Anxiety Behavior – LAB”);
- No teste de vocalização ultra-sônica (Ultra Sonic Vocalization): linhagens de ratos com Alta ou Baixa
Vocalização Ultra-sônica (“High and Low USV”), a partir de suas taxas contrastantes de vocalização
ultra-sônica em resposta a um isolamento materno aos 10 dias de idade;
- Em testes de Atividade: Naples com alta-excitabilidade (“Naples High-Excitability”) e Naples com
baixa excitabilidade (“Naples Low Excitability”); Linhagem de ratos Wistar Kyoto hiperativos, linhagens
de ratos Tsukuba com alta emocionalidade (“Tsukuba high-emotional – THE”) e Tsukuba com baixa
emocionalidade (“Tsukuba low-emotional – TLE);
- No teste da Esquiva Ativa: Ratos Romanos com alta ou baixa esquiva (“Roman high and low avoidance
– RHA/RLA”); Linhagens de ratos Siracuse com alta ou baixa esquiva (“Syracuse high and low
avoidance – SHA/SLA”); Koltushi alta ou baixa esquiva (“Koltushi high and low avoidance –
KHA/KLA”); linhagens de ratos com alta ou baixa esquiva (“High and Low Avoidance animals –
HAA/LAA”).
Estas linhagens têm sido extensivamente usadas para análises genéticas quantitativas, e agora começarão
a ser empregadas em estudos de genética molecular.
(Tradução livre do Capítulo 20 – “Genetic Analysis of Emotional Behaviors Using Animal Models”,
de André Ramos e Pierre Mormède, págs 291-299 – do livro Neurobehavioral Genetics, Methods and
Applications, Editora Taylor & Francis, 2007)