Caracterização Do Vírus Dengue Circulante (Leonir

Universidade Federal de Rondônia
Núcleo de Saúde
Mestrado em Biologia Experimental
Caracterização do vírus dengue circulante no Estado de
Rondônia
Leonir Santos de Souza
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental, da
Universidade Federal de Rondônia, como
requisito à obtenção do título de Mestre em
Biologia Experimental.
Porto Velho - RO
2005
1
Universidade Federal de Rondônia
NÚCLEO DE SAÚDE
Mestrado em Biologia Experimental
Caracterização do vírus dengue circulante no Estado de
Rondônia
”
Leonir Santos de Souza
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental, da
Universidade Federal de Rondônia, como
requisito à obtenção do título de Mestre em
Biologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva
Apoio: WHO/DR – Special Programme for Research and training in tropical
Disease, Financiadora Nacional de Projetos – FINEP e a Rede da Amazônia
Legal de Genoma – REALGENE.
Porto Velho – RO
2005
2
FICHA CATALOGRÁFICA
De Souza, Leonir Santos
Caracterização do Vírus Dengue no Estado de
Rondônia / Leonir Santos de Souza.
nº pág.61.
Dissertação (mestrado) – Fundação Universidade
Federal de Rondônia. Porto Velho, 2005.
Área de concentração: Virologia
Orientador: Profº Dr. Luiz Hildebrando Pereira da
Silva.
1. Dengue 2. Diagnóstico molecular 3.Rondônia
3
DEDICO
À minha mãe Maria e ao meu pai José, que apesar das limitações
sempre valorizaram o estudo e a construção do conhecimento investindo
suas energias e incentivos a todos os filhos.
Aos meus dois queridos filhos, Henrique e Lívia que enchem minha casa
de alegria e novidade.
4
AGRADECIMENTOS
Ao meu DEUS Jeová ‫הוהי‬, a quem recorro em oração em todos os
momentos da vida.
À Leonardo da Vinci Monteiro, meu marido e companheiro a treze anos,
pelo seu bom humor e paciência.
À Glauciane por disponibilizar seu tempo no laboratório e pela ajuda
inestimável.
Aos meus irmãos Leina, Leon, Moisés e José que são minha referência de
família.
À Denaia, que aceitou o desafio de cuidar da minha casa, dos meus filhos,
trazendo tranqüilidade e organização ao meu dia-a-dia.
À Maria Antônia, Lúcia Helena e Marisete que ficaram e cuidaram das
crianças nas horas que precisei.
Aos colegas da Unidade de Virologia: Belgrano, Eduardo, Jaylson, Kellen,
e Soraya.
Aos colegas de trabalho da Escola Estadual José Otino de Freitas.
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Professor Dr. Luís Hildebrando Pereira da Silva pela oportunidade e
por proporcionar melhores condições para realização dessa pesquisa.
Ao MSc. Weber Cheli Batista que abriu as portas do laboratório de Virologia
e dispensou do seu tempo e energia para cooperar com o meu trabalho.
À
MSc.
Deusilene
Souza
Vieira
que
ajudou
incondicionalmente,
acompanhando o meu trabalho de perto, dando sugestões e esclarecimentos.
6
RESUMO
O dengue é a virose de transmissão vetorial mais relevante em termos de
morbidade e mortalidade, apresentando quatro sorotipos distintos. O Estado de
Rondônia apresenta um número crescente de casos de dengue. Portanto, a
caracterização molecular e a subtipagem do vírus dengue além de deteminar o
sorotipo circulante na região e a origem do vírus, nos auxilia no estabelecimento de
uma correlação de virulência das amostras estudadas. Para identificar os sorotipos
da dengue circulante no Estado de Rondônia coletaram-se oitenta e quatro
amostras de soros de pacientes entre os meses de janeiro de 2004 a fevereiro de
2005. Isolou-se em células C6/36. Todas as amostras foram submetidas à extração
pelo método TRIzol®. Em seguida, realizou-se RT-PCR com os primers universais
FG1 e FG2 que identifica Flavivirus. Para caracterizar os sorotipos, os amplicons
foram submetidos a Hemi-Nested PCR utilizando os primers nden-1, nden-2,
nden-3 e nden-4. Das oitenta e quatro amostras, quarenta e quatro foram positivas
para Flavivirus e quarenta negativas, sendo todas as positivas sorotipadas como
dengue tipo 3. Cinco amostras das quarenta e quatro foram escolhidas
aleatoriamente, sendo seqüenciadas e comparadas com o DENV-3 circulante no
Brasil pelo programa Clustal W, também construiu-se uma árvore filogenética
através do método neighbouring joining, indicando que DENV-3 de Rondônia é a
mesma que circula em outras regiões do Brasil. Todas as amostras caracterizadas
como DENV-3 foram submetidas a RSS-PCR, para se saber a origem da cepa
circulante no Estado, quarenta e três é do tipo C de origem na América Central, Sri
Lanka ou Indonésia e uma do tipo B de origem nas Filipinas ou Indonésia.
7
ABSTRACT
Dengue is the most relevant virus of vectorial transmission when it comes to
morbidity and mortality, showing four different serotypes. The State of Rondônia
presents an increasing number of dengue cases. Thus, the molecular
characterization and the subtype of the virus, besides determining the serotype
which is surrounding the region and the virus origin, helps us to establish a kind of
correlation among the virulence of the samples. Eighty-four samples of patients’
serum were collected between January 2004 and February 2005, in order to identify
the surrounding dengue serotypes in the State of Rondônia. They were isolated in
C6/36 cells. All samples were submitted to extraction by TRIzol ® method.
Subsequently, RT-PCR was made with the universal primers FG1 and FG2, which
identify the Flavivirus. The amplicons were submitted to PCR Hemi-Nested, in
order to mark the serotypes, using nden-1, nden-2, nden-3 e nden-4 primers. From
the eighty-four samples, forty-four were positive to Flavivirus and forty negative,
though all positive samples were serotyped as dengue type 3. Five out, from the
forty-four samples were randomly chosen, sequenced and compared to DENV-3
surrounding in Brazil, by Clustal W program. A philogenetic tree was also built
through the neighbouring joining method, showing that the Rondônia DENV-3 is the
same one which circles other regions in Brazil. All the samples marked as DENV-3
were submitted to RSS-PCR, in order to identify the origin of the surrounding
family in the State. Forty-three are type C, from Central America, Sri-Lanka or
Indonesia and one is type B, from the Philippines or Indonesia.
8
LISTA DE FIGURAS
Figuras
nº Página
01– Mapa político do Estado Rondônia ...................................................
20
02– Esquema de um Vírion de Dengue ...................................................
23
03– Esquema da cadeia de leitura (ORF) e sua ordem de tradução .......
24
04– Mapa de Rondônia das áreas amostrais ..........................................
31
05– Gel de agarose mostrando os amplicons da RT-PCR .....................
39
06– Gel de agarose mostrando os amplicons da Hemi-Nested-PCR
para caracterização do DENV-3 .......................................................
40
07– Seqüência gênica do DENV3 do Estado de Rondônia ......................
41
08– Alinhamento das amostras de Rondônia ...........................................
41
09– Árvore filogenética.............................................................................
43
10– Gel de agarose mostrando o produto da RSS-PCR para subtipagem
do DENV3 .........................................................................................
44
9
LISTA DE TABELAS
Tabelas
nº Página
01– Seqüência dos primers e região de anelamento no genoma DENV .
35
02– Referencia do seqüenciameno gênico dos DENV3...........................
36
03– Seqüência dos primers e região de anelamento na RSS-PCR .........
37
04– Origem dos subtipos de DENV3 identificados na RSS-PCR .............
37
05– Resultados das amostras analisadas com primers FG1 e FG2 ........
39
06– Resultados das amostras analisadas através da Hemi-Nested-PCR
40
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
C – Proteína do capsídio.
cDNA – DNA complementar.
CEPEM – Centro em Pesquisa em Medicina Tropical.
CIVD – Coagulação intravascular disseminada.
DENV – Vírus Dengue.
DENV1 – Vírus Dengue tipo 1.
DENV2 – Vírus Dengue tipo 2.
DENV3 – Vírus Dengue tipo 3.
DENV4 – Vírus Dengue tipo 4.
DNA – Ácido Desoxirribonucléico.
DHF – Febre Hemorrágica do Dengue.
DSS – Síndrome do Choque da Dengue.
E – Proteína do envelope.
ELISA – Ensaio Imunoenzimático.
FC – Fixação do complemento.
IFI – Imunofluorescência indireta.
IH – Inibição da hemaglutinação.
LACEN – Laboratório Central de Rondônia.
LCR – Liquor céfalo raquidiano.
Min. – Minutos.
NS – Não estrutural.
NS1 – Proteína não estrutural 1.
NS2a – Proteína não estrutural 2a.
11
NS2b– Proteína não estrutural 2b.
NS3 – Proteína não estrutural 3.
NS4a – Proteína não estrutural 4a.
NS4b– Proteína não estrutural 4b.
NS5 – Proteína não estrutural 5.
OMS – Organização Mundial de Saúde.
ORF – Cadeia aberta de leitura.
PAHO – Organização da Saúde Pan Americana.
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase.
prM – Proteína pré de Membrana.
RNA – Ácido Ribonucléico.
RNC – Região não codificadora.
RSS – Restrição de Sítio específico.
RT – Transcriptase reversa.
SESAU – Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Rondônia.
SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde.
TN – Teste de Neutralização.
YFV – Vírus da Febre Amarela.
12
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ..................................................................................
14
1.1 - Considerações Gerais ............................................................
14
1.2 - Aspectos Históricos ................................................................
15
1.3 - Aspectos Epidemiológicos ......................................................
16
1.3.1 - DENV nas Américas .............................................................
17
1.3.2 - DENV no Brasil ....................................................................
18
1.3.3 - DENV em Rondônia .............................................................
19
1.4 - Patogenia da DENV ...............................................................
21
1.5 - Genoma Viral ..........................................................................
23
1.6 - Proteínas Virais .......................................................................
24
1.7 - Diagnóstico Laboratorial .........................................................
26
1.7.1 - Testes Sorológicos .................................................................
26
1.7.2 - Isolamento Viral ......................................................................
26
1.7.3 - Detecção do Genoma Viral.....................................................
27
1.7.4 - Seqüenciamento Viral............................................................
28
2 – JUSTIFICATIVA................................................................................
29
3 – OBJETIVOS ......................................................................................
30
4 – MATERIAIS E MÉTODOS ...............................................................
31
4.1 - Amostras Biológicas ...............................................................
31
4.2 - Isolamento Viral ......................................................................
32
4.3 - Extração do RNA ....................................................................
32
4.4 - RT-PCR ..................................................................................
33
4.4.1 - Confecção do cDNA .............................................................
33
13
4.4.2 - PCR e Hemi-nested-PCR.......................................................
33
4.5 - Purificação ..............................................................................
35
4.6 - Seqüenciamento do DENV .....................................................
35
4.7 - Subtipagem do DENV-3 .........................................................
36
5 – RESULTADOS..................................................................................
38
5.1 - Isolamento Viral em Cultura de Célula ..................................
38
5.2 - RT-PCR ..................................................................................
38
5.3 - Caracterização Molecular do DENV .......................................
38
5.4 - Análise de Seqüenciamento do DENV-3. ...............................
41
5.5 - Análise Filogenética ...............................................................
42
5.6 - Análise da Subtipagem do DENV-3 por RSS-PCR ................
44
6 – DISCUSSÃO ....................................................................................
45
7 – CONCLUSÃO ...................................................................................
51
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................
52
ANEXO A ..........................................................................................
59
ANEXO B .......................................................................................... 60
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
O dengue é a virose de transmissão vetorial mais relevante em termos de
morbidade e mortalidade, sendo transmitida pela fêmea do mosquito Aedes aegypti
(BANCROFT, 1906 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Esta virose se
apresenta
nos
grandes
centros
urbanos
de
várias
regiões
do
mundo,
principalmente em áreas tropicais e subtropicais, sob a forma de epidemias de
grande magnitude ou sob a forma hiperendêmica, nos lugares onde há um ou mais
sorotipos circulantes, como no caso do Brasil (TEIXEIRA et al., 1999).
O
vírus
do
dengue
(DENV)
classifica-se
em
quatro
sorotipos
antigenicamente distintos, denominados dengue sorotipo 1 (DENV-1), dengue
sorotipo 2 (DENV-2), dengue sorotipo 3 (DENV-3) e dengue sorotipo 4 (DENV-4)
(SCHERER, 1968 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Cada um desses
sorotipos possui diversos genótipos que diferenciam entre si por variações na
seqüência de nucleotídeos, em nível dos genes da glicoproteína E, e da junção
dessa glicoproteína com a proteína NS1(CALISHER et al., 1989).
A infecção por qualquer um dos quatro sorotipos pode produzir
manifestações que variam desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até
um quadro grave e algumas vezes fatal de febre hemorrágica do dengue (Dengue
hemorrhagic Fever – DHF) ou síndrome do choque do dengue (Dengue Shock
Sydrome – DSS). São fatores de risco para casos graves: a cepa do sorotipo
infectante, o estado imunológico e genético do paciente, a concomitância com
outras doenças prévias por outro sorotipo viral da doença (TAUIL, 2001).
15
No Brasil, as flaviviroses provocadas principalmente pelo dengue e febre
amarela apresentam quadro febril exantemático. Entretanto, a dengue manifesta-se
de forma variável quanto ao tipo e à intensidade dos sintomas, na maioria dos
casos se desenvolvendo benignamente.
1.2 Aspectos Históricos
O DENV e o vírus da febre amarela (“yellow fever virus” -YFV) foram os
primeiros microrganismos a serem denominados vírus e descritos como agentes
filtráveis e submicroscópicos em 1902 e 1907, respectivamente. Durante a primeira
década do século XX, o vírus dengue mostrou ser transmitido por artrópodes, mas
não foi isolado até 1943 (FIELDS et al., 2001). Somente depois, foi que se
alcançaram o conhecimento e a tecnologia necessários para o desenvolvimento de
pesquisas laboratoriais com estes agentes. As primeiras evidências do ciclo de
transmissão do dengue foram publicadas por Bancroft em 1906 (BANCROFT, 1906
apud FOCACCIA & VERONESI, 2002), que levantou a hipótese de o mosquito da
espécie Aedes aegypti ser o vetor da infecção, o que, depois, foi confirmado por
Siler e outros pesquisadores (SILER et al., 1926 apud FOCACCIA & VERONESI,
2002) e Simmons e associados (SIMMONS et al., 1931apud FIELDS, 2001). Com
isto, foi possível estabelecerem os elos epidemiológicos envolvidos na transmissão
da doença resumidos na cadeia: mosquito infectado, homem susceptível, homem
infectado, mosquito infectado (MARTINEZ, 1999).
O isolamento do DENV só ocorreu na década de 40, por Kimura em 1943 e
Hotta em 1944 tendo-se denominado Mochizuki a esta cepa (HOTTA S. & KIMURA
R., 1952 apud FIELDS, 2001). Sabin e Schlesinger em 1945, isolaram a cepa
Hawaii, sendo que, neste mesmo ano Sabin ao identificar outro vírus em Nova
16
Guiné, observou que as cepas tinham características antigênicas diferentes das
primeiras cepas isoladas (SABIN, 1952 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Em
1956, no curso da epidemia de DENV no Sudeste Asiático, novos isolados
apresentaram características antigênicas diferentes (Martinez, 1999).
Em 1968, havia milhares de isolamentos do DENV e uma grande confusão
com relação à classificação dos mesmos. Scherer sugeriu ao comitê da
Organização Mundial de Saúde (OMS) a classificação dos vírus do dengue em
quatro tipos distintos, agrupados com base no relacionamento antigênico, assim
denominou-se às primeiras cepas sorotipo 1, à Nova Guiné sorotipo 2 e aos
isolados do Sudeste Asiático como sorotipos 3 e 4 (SCHERER, 1968 apud
FOCACCIA & VERONESI, 2002).
1.3 Aspectos epidemiológicos
Nas Américas, Aedes aegypti é o único transmissor desse vírus com
importância epidemiológica. Esta espécie de mosquito é originária da África, onde
se adaptou ao ambiente doméstico criado pelo homem, tornando-se antropofílico
(DYE, 1999). Suas larvas são encontradas em depósitos artificiais de águas, tais
como caixas d’água, pneus velhos, garrafas, enfim tudo o que acumula água. Estas
características de adaptação permitiram que se tornassem abundantes nas cidades
e facilmente transportados para outras áreas por meios de transportes terrestres,
aéreos ou marítimos, o que aumentou sua competência vetorial, ou seja, sua
habilidade em se infectar, replicar e transmitir o vírus da dengue (ROSEN, 1988).
O Aedes albopictus é uma espécie oriunda das selvas asiáticas e até
recentemente restrita àquele continente, nos últimos anos disseminou-se pelas
Américas através dos transportes marítimos intercontinentais (RODHAIN et al.,
17
1999). Não é um mosquito peridomiciliar, prefere ocos de árvores para depositar
seus ovos e tem hábitos antropofílicos e zoofílicos diurnos, no entanto, sua
importância epidemiológica como transmissor da dengue se restringe apenas ao
continente asiático (METSELAAR et al., 1980).
A distribuição e a freqüência das infecções pelo DENV estão intrinsecamente
relacionadas com a plasticidade de adaptação do Aedes aegypti ao ambiente
habitado pelo homem, e distingue-se das outras doenças infecciosas e parasitárias,
porque a ocorrência dela não está relacionada com as más condições sociais e
econômicas das populações (BARRETO et al., 1994; TEIXEIRA et al., 2003).
Portanto, é complexa a inter-relação dos fatores envolvidos na dinâmica da
circulação dos quatro sorotipos do DENV, o que gera incertezas sobre os
determinantes das suas apresentações epidemiológicas.
1.3.1 DENV nas Américas
Os registros da circulação do DENV nas Américas, data do século XVIII, a
primeira descrição foi feita por Benjamin Rush, em 1780 nos EUA, embora se
suspeite que o vírus venha causando epidemias, há vários séculos (SILER et al.,
1926 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). A partir de 1826, epidemias de
dengue foram registradas em intervalos irregulares no Sudeste dos EUA e países
da Bacia do Caribe. Os sorotipos envolvidos nessas epidemias não eram
conhecidos até 1953, quando foram isoladas as primeiras amostras de DENV-2 em
Trinidad. Dez anos depois, foram isoladas as primeiras amostras de DENV-3 em
Porto Rico, sendo estes dois sorotipos responsáveis pelas epidemias ocorridas no
continente na década de 60 (GUBLER, 1987).
18
Desde a década de 70 até os dias atuais, os problemas com as epidemias
do DENV agravam-se, particularmente, nos países localizados entre as linhas dos
trópicos, tendo sido estimado um número maior que 10 milhões de infecções por
ano. Enquanto que, na década de 80, ocorre em Cuba o acontecimento mais
relevante na história do DENV, com a primeira epidemia de DHF/DSS descritas nas
Américas. O vírus DEN-2 é associado a esta epidemia, que foi precedida por outra
causada pelo vírus DEN–1, em 1977 (KOURI et al., 1986). Nesta mesma década, o
DENV-1 foi responsável por grandes epidemias em países da América do Sul,
como: Brasil, Bolívia, Paraguai, Equador e Peru (GUBLER, 1997).
Nos anos 90, o quadro epidemiológico das Américas agravou-se e
epidemias de dengue clássica foram freqüentemente observadas em vários centros
urbanos, muitas delas associadas à ocorrência de casos de DHF. Atualmente, os
quatros sorotipos estão circulando em quase todo o continente, com ocorrência
sistemática de casos de dengue hemorrágico (GUBLER, 1992 apud FOCACCIA &
VERONESI, 2002; PAHO, 2003).
1.3.2 DENV no Brasil
A primeira epidemia do vírus dengue com confirmação laboratorial
aconteceu em 1982, na cidade de Boa Vista, capital do Estado de Roraima, onde
foram isolados DENV-1 e DENV-4. Estes agentes estavam circulando em diversos
países do Caribe e no norte da América do Sul e sua introdução, possivelmente,
ocorreu por via terrestre, pela fronteira da Venezuela (OSANAI et al., 1986).
Na década de 80 a dengue tornou-se um problema de saúde pública
nacional quando houve a dispersão por diversos Estados do país do DENV-1
introduzido na cidade de Nova Iguaçu, Estado do Rio de Janeiro (SCHATZMAYR
19
et al., 1986). A situação da dengue foi agravada pela introdução do DENV-2 no
Estado do Rio de Janeiro no ano de 1990, que resultou no aparecimento das
formas mais graves da doença (NOGUEIRA et al.,1990). No período compreendido
entre 1986 e 1993, as epidemias atingiram mais os grandes centros urbanos,
porém, a ausência de uma política nacional eficaz de combate ao vetor resultou na
rápida dispersão do vírus pelo país e conseqüentemente na ocorrência de
epidemias em diversos Estados (Boletim Epidemiológico - Fundação Nacional de
Saúde, Ministério da Saúde, 1999).
O DENV-3 foi introduzido no Brasil em 1998, oriundo de casos importados
em São Paulo e se disseminou por todo país de forma rápida e desde então várias
epidemias vêm ocorrendo simultaneamente em todo o país. Dois anos depois, o
mesmo sorotipo viral causou epidemias no Estado do Rio de Janeiro com
confirmação laboratorial de 91 casos em três diferentes municípios (ROCCO et al.,
2001).
1.3.3 – DENV em Rondônia
O Estado de Rondônia, localizado totalmente na Amazônia Legal e na
Região Norte do Brasil, possui 238.512,80 km 2. Faz fronteira com Bolívia em uma
extensão de 1.342 km de linha divisória em sua totalidade delimitada por rios. Os
limites territoriais são: ao norte, nordeste e noroeste com o Estado do Amazonas;
ao leste e sudeste com o Mato Grosso; ao sul e sudoeste com a República da
Bolívia. Possui 32 municípios localizados na Amazônia Legal e 20 municípios
situados em faixa de fronteira. Tem uma população estimada em 1.130.847
habitantes (IBGE, 2004).
20
A Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde registrou
no Estado de Rondônia 5.762 casos suspeitos de dengue durante o ano de 2004,
com importante aumento no número de notificações a partir do mês de setembro,
relativo a semana epidemiológica 44. Em janeiro de 2005 foram notificados 2.605
casos e em fevereiro 1.345, demonstrando um declínio no número de casos
notificados a partir de fevereiro. (SVS, boletim de 14/02/2005)
Os municípios em situação de epidemia, e que registraram mais de 2.700
casos da doença em 2005, foram: Jaru, Cacoal, Ariquemes, Pimenta Bueno,
Vilhena, Ji-Paraná, Outro Preto D’Oeste e Rolim de Moura. Nestes municípios
estão concentrados 91,3% dos casos notificados. Em três deles, Cacoal, Jaru e
Ouro Preto D’Oeste, ocorreram 18 casos de dengue com manifestações
neurológicas. Todos são investigados pela SVS. (SVS, boletim de 18/02/2005)
FIGURA 1 – Mapa político do Estado de Rondônia, com ênfase na BR-364 e na fronteira
delimitada com o Rio Mamoré. (Fonte: SEDAM/2004)
21
1.4 Patogenia do DENV
O dengue clássico apresenta-se com febre alta, acompanhada de cefaléia,
dor retrocular, mialgias, artralgias afetando os punhos, dedos, tornozelos e
artelhos, embora as articulações maiores também possam ser atingidas, algumas
vezes apresenta anorexia, náuseas e vômito. Observa-se o aparecimento de
exantema, epistaxe e petéquias após o terceiro dia, sendo proeminente no tórax,
dorso, braços e pernas (KURANE et al., 1992; MONATH & HEINZ, 1996 apud
FIELDS, 2001).
Acredita-se que existam duas formas opostas de resposta imune ao dengue,
a primeira previne e propicia a recuperação nas infecções e a segunda relaciona-se
a imunopatologia do dengue hemorrágico (HALSTEAD, 1988).
A primeira forma de reposta esta relacionada com a infecção primária por
dengue que estimula a produção de anticorpos IgM, detectáveis a partir do quarto
dia, após o início dos sintomas, atingindo os níveis mais elevados por volta do
sétimo ou oitavo dia e declinando lentamente, passando a não serem detectáveis
após alguns meses. As IgG são observadas, em níveis baixos, a partir do quarto
dia após o início dos sintomas, elevam-se gradualmente atingindo altos valores em
duas semanas e mantêm-se detectáveis por vários anos, conferindo imunidade
contra o sorotipo infectante, provavelmente por toda vida. A segunda forma de
resposta imune aos vírus do dengue é paradoxal, pois prejudica os hospedeiros
previamente infectados, sendo responsável pela DHF/DSS (HALSTEAD, 2002;
KURANE et al., 1992; MONATH, 1986; MONATH et al., 1996).
O quadro clínico da DHF inicia-se de forma similar ao dengue clássico, com
febre alta, náuseas, vômitos, mialgias e artralgias. Os fenômenos hemorrágicos
surgem no segundo ou terceiro dia da doença, com petéquias na face, véu palatino,
22
axilas e extremidades. Podem ocorrer púrpuras e grandes equimoses na pele,
epistaxes, gengivorragias, metrorragias e hemorragias digestivas moderadas. A
esplenomegalia, hematêmese e dor abdominal indicam mau prognóstico, com
provável evolução para choque (Secretária Estadual de Saúde-RJ, 1988).
Os sintomas relacionados a DSS costumam surgir entre o terceiro e o sétimo
dia da doença, mantendo-se este estado crítico por 12 a 24 horas. Os pacientes
mostram-se agitados e em alguns casos referem dor abdominal, posteriormente,
tornam-se letárgicos, afebris e com sinais de insuficiência circulatória: pele fria
manchada e congestionada, cianose perioral, pulso rápido e sudorese fria. A
pressão arterial mostra-se convergente, baixa ou imensurável. Instala-se acidose
metabólica e coagulação intravascular disseminada (CIVD), com ausência de
tratamento, o óbito costuma ocorrer em quatro a seis horas (NOGUEIRA et al.,
1991; VASCONCELOS et al., 1994). A DHF/DSS tem como base fisiopatológica
uma resposta imune anômala envolvendo leucócitos, citocinas e imuno-complexos,
causando aumento da permeabilidade por má função vascular endotelial sem
destruição do endotélio, causando queda da pressão arterial e manifestações
hemorrágicas, associadas a trombocitopenia (HOBER et al., 1993).
Apesar da similaridade de certas manifestações sistêmicas e hemorrágicas,
observam-se peculiaridades clínicas que, seguramente, ocorrem por conta do
tropismo dos agentes etiológicos pelos diferentes órgãos do hospedeiro. Nas
formas graves de dengue o quadro choque é um componente clínico dominante.
Portanto, as febres hemorrágicas de origem viral exibem características diferentes
quanto a sua etiologia, epidemiologia e patogênese.
23
1.5 Genoma viral
O DENV pertence ao gênero Flavivirus; seu material genômico é composto
por uma fita única de RNA com polaridade positiva e o seu comportamento é de
RNAm; com aproximadamente 11Kb. Sua estrutura é esférica, medindo
aproximadamente 40-60 nm de diâmetro, o envelope tem a mesma composição da
membrana plasmática das células eucarióticas e possui projeções em sua
superfície conforme mostrado na figura 2.
40 - 50 nm
.
Envelope E (55 -60 KDa)
Membrana M (9 KDa)
Cápside C (14KDa)
RNA fita simples (+) – (11KDa)
Figura 2 – Esquema de um vírion de dengue. Vírus esférico, envelopado de capsídeo
icosaédrico constituído das proteínas estruturais E, M e C com RNA de polaridade
positiva. Fonte: RICE, 1996.
O genoma do vírion do dengue possui 10 genes contidos em uma cadeia
aberta de leitura (ORF – open reading frame) que codificam três proteínas
estruturais e sete não-estruturais. O genoma é precedido por uma região 5’ não
codificante (RNC5’) e sucedido por uma região 3’ não codificante (RNC3’) e não
possui cauda de poli-A. Os genes estão na seguinte ordem: 5’-C-preM-E-NS1NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’, conforme representado na figura 3 (Rice,
1996). A tradução da ORF resulta em uma poliproteína que é processada por
“signal-peptidase” da célula hospedeira em três proteínas estruturais (E, prM e C)
que têm papel importante na biologia do vírus uma vez que são responsáveis por
24
várias atividades biológicas, incluindo montagem dos vírions (maturação), fusão
celular, imunogenicidade, induzindo a produção de anticorpos neutralizantes e
anticorpos inibidores da hemaglutinação. As sete proteínas não estruturais (NS1NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5), são responsáveis pela replicação dos vírus e
processamento da poliproteína (RICE et al., 1985).
Cadeia Aberta de Leitura
5’
ESTRUTURAL
3’
NÃO ESTRUTURAL
Tradução
POLIPROTEÍNA
C prM
E
1
2A
2B
3
4A
4B
5
COOH
Figura 3 – Esquema mostrando a cadeia aberta de leitura (ORF) e sua tradução em uma
poliproteína com as 3 proteínas estruturais (C, prM e E) e 7 não estruturais (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Fonte: RICE, 1996.
1.6 Proteínas Virais
A proteína C, com peso molecular de 14 Kda forma juntamente com o RNA
viral o nucleocapsídio (KHROMYKH et.al., 1997). A glicoproteína pré M (prM) com
cerca de 140 aminoácidos e 18,1 a 19,1KDa, dá origem à proteína M de
aproximadamente 8,5 a 9KDa, é produzida durante o processo de maturação viral.
A proteína E é uma glicoproteína com cerca de 55 a 60KDa, constitui o principal
componente do envelope viral e representa o mais importante alvo do sistema
imune, estando diretamente relacionada com a imunogenicidade das cepas, além
25
de participar do processo de adesão e penetração do vírus junto à membrana da
célula hospedeira, estimula o sistema imune através da indução de anticorpos
neutralizantes, proliferação de monócitos e macrófagos (HENCHAL et al., 1990;
RICE, 1996).
A proteína não estrutural 1 (NS1), com peso molecular aproximado de 40
KDa, possui atividade na maturação viral, sendo responsável pela fixação do
complemento (MACKENZIE et al., 1996). Esta é inserida no lúmen do retículo
endoplasmático via um peptídio sinal que é clivada pela ação de signalases
celulares geradas na porção N terminal da proteína (CHAMBERS et al., 1990).
Estudos sugerem a participação da NS1 na fase precoce da replicação viral bem
como na virulência (PLETNEV et al., 1993). A proteína NS2 é dividida nas porções
NS2a e NS2b. A porção NS2a, com aproximadamente 24KDa, hidrofóbica, não tem
função totalmente conhecida (NESTOROWICZ et al.,1994). A porção NS2b com
aproximadamente 27KDa, é portadora de atividade proteolítica, forma um complexo
com a NS3, necessária para a função serino-protease da NS3 (JAN et al.,1995). A
NS3 é uma proteína citoplasmática relativamente grande com 70 KDa, funciona
como serino-protease envolvida na clivagem pós-translacional da poliproteína viral
(GORBALENYA et al.,1989). A NS4 é clivada em duas porções: NS4a e NS4b,
ambas com aproximadamente 27KDa. Estas duas porções juntamente com as
proteínas NS2a e NS2b associam-se à membrana da célula infectada durante o
processo de maturação viral (MONATH et al., 1996). A proteína não estrutural 5
(NS5) é uma provável RNA polimerase dependente de RNA de origem viral (RdRp),
com aproximadamente 104KDa, sendo a mais conservada e essencial para a
replicação viral (RICE et al.,1985; VICKY et al., 1999).
26
1.7 Diagnóstico Laboratorial
A confirmação diagnóstica da infecção causada pelo vírus dengue pode ser
feita somente em laboratório usando para isso: testes sorológicos, isolamento viral
ou detecção do genoma viral (KING et al.,1991; GUZMAN et al., 1996).
1.7.1 – Testes Sorológicos
Atualmente é usado o ensaio imunoenzimático (ELISA) para detectar a
presença de anticorpos anti-dengue no soro do paciente. O ELISA e suas
variantes, como por exemplo, o MAC-ELISA, discrimina anticorpos do tipo IgM e
IgG indicando uma primo-infecção ou não. Outros testes sorológicos menos
utilizados por sua complexidade técnica são: inibição da hemaglutinação (IH),
fixação do complemento (FC), teste de neutralização (TN) (CHUNGUE et al., 1989).
1.7.2 – Isolamento Viral
Diferente dos testes sorológicos o isolamento viral somente é realizado em
laboratórios estruturados para tal evento. Três métodos são rotineiramente
empregados:
inoculação
intracerebral
em
camundongos
recém-nascidos,
inoculação intratorácica em mosquitos do gênero Toxorhynchities sp e cultivo em
células de mosquito e/ou mamíferos.
A inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos apresenta uma
grande desvantagem como, elevado custo, demora para o isolamento e baixa
sensibilidade em relação ao DENV (GUBLER et al., 1988; HAMMON et al., 1960;
SABIN, 1952 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). O cultivo em células de
mamíferos apresenta as mesmas desvantagens que a inoculação intracerebral em
27
camundongos: elevado custo, demora para o isolamento e baixa sensibilidade
(GUBLER et al.,1988; VORDAM et al., 1997).
A inoculação intratorácica em vetores adultos é o método mais sensível para
o isolamento do vírus. As espécies de vetores mais utilizadas para o isolamento
viral: Toxorhynchities amboinensis e Toxorhynchities splendens (GUBLER et al.,
1988). As desvantagens desta técnica são o intenso trabalho e a necessidade de
insetário para a produção de um grande número de mosquitos para a inoculação
(KUBERSKI et al.,1977; GUBLER et al., 1988).
O cultivo em células de mosquito é uma das metodologias mais empregada
no isolamento do DENV. A linhagem mais utilizada é a C6/36 ou AP61, originárias
de larvas do Aedes albopictus. O uso destas linhagens celulares tem proporcionado
um resultado rápido, sensível e econômico para o isolamento do vírus
(FIGUEIREDO et al., 1992; GUBLER et al., 1988).
A detecção da presença do vírus é feita através de imunofluorescência
indireta (IFI) dos tecidos do mosquito, ou das células cultivadas “in vitro”.
1.7.3 Detecção do Genoma Viral
Nas décadas de 80 e 90, com o surgimento da técnica de Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) precedida da extração e da transcrição reversa (RTPCR), a identificação de vírus tornou-se mais rápida (CHOMCZYNSKI & SACCHI,
1987). Diversos primers foram desenvolvidos e metodologias complementares, tais
como a nested-RT-PCR foram incluídas na detecção do genoma do dengue
(DEUBEL et al., 1997; HENCHAL et al., 1991; LANCIOTTI et al., 1992; MORITA et
al., 1991; MULLIS et al., 1987; TANAKA et al., 1993).
28
Além de se detectar e sorotipar o genoma do dengue, pode-se fazer a
identificação do subtipo das cepas utilizando uma técnica relativamente simples e
rápida que utiliza o método do RSS-PCR para subtipagem, distinguindo-se a cepa
por restrição de sítio específico da proteína E do cDNA viral (HARRIS et al., 1999)
Através desta técnica que tipa os patógenos baseados em diferenças
genéticas, é possível revelar importantes informações na transmissão e diferenças
na manifestação da doença. A habilidade de se detectar genótipo particular em
comunidades, pode identificar fatores de riscos associados com a cepa (Harris et
al., 1999).
1.7.4 Seqüenciamento viral
Desde a década de 80, o genoma completo de vários Flavivirus vem sendo
seqüenciado, começando pelo YFV, seguido pelo 4 tipos de DENV (MASON et al.,
1987; RICE et al., 1985, HAHN et al., 1988; OSATOMI et al., 1990).
Através do seqüenciamento pode-se fazer o alinhamento dos nucleotídeos
usando o programa Clustal W e construir árvore filogenética com finalidade de
analisar e comparar os sorotipos seqüenciados. Atualmente o seqüenciamento do
genoma do DENV é utilizado não apenas para indicar a origem do vírus, mas
também, mutações que provavelmente podem causar diferença em sua patogenia
(AQUINO et al., 2005).
A detecção de diferenças no alinhamento genético do agente infeccioso
pode ajudar na identificação desses patógenos associados a diferentes
manifestações da doença (HARRIS et al., 1999).
29
2 – Justificativa
Justifica-se a identificação e caracterização molecular do DENV no Estado
de Rondônia para se determinar o sorotipo circulante na região, numa tentativa de
se estabelecer uma correlação de virulência das amostras, seu impacto sobre a
população e sua importância epidemiológica.
30
3 – Objetivos
Geral:
Identificar quais sorotipos do vírus da dengue circulantes no Estado de
Rondônia através de métodos moleculares.
Específico:
Testar diferentes primers para caracterização molecular do vírus da dengue.
Seqüênciar os vírus dengue isolados no estado.
Realizar o RSS-PCR para identificar a origem geográfica do vírus circulante
no estado.
Fazer análise interpretativa dos resultados da subtipagem por RSS-PCR.
Inferir dados filogenéticos sobre a origem e mutações de nucleotídeos dos
diversos vírus isolados em Rondônia.
31
4 – Materiais e Métodos
4.1 Amostras Biológicas
As amostras biológicas de sangue, foram coletadas com o Laboratório
Central de Rondônia (LACEN) e na Unidade de Virologia do Centro de Pesquisa
em Medicina Tropical de Rondônia – CEPEM, entre o período de Janeiro de 2004 a
Fevereiro de 2005. Também, nas Unidades Mistas de Saúde de Ariquemes, Jaru,
Ouro Preto D’Oeste, Cacoal, Colorado D’Oeste e Vilhena no período de Janeiro de
2005. Os municípios que tiveram o DENV isolado pela Unidade de Virologia estão
representados na figura 4 em vermelho.
Foi explicado verbalmente para o paciente o destino da amostra, sendo as
mesmas coletadas com sua anuência. Selecionou-se pacientes entre o 1º e o 5º dia
de sintomas clínicos da doença, onde foram coletadas 84 amostras para o
isolamento viral.
ÍNDICE
1 – Vale do Paraíso
2 – Nova União
3 – Teixeirópolis
4 – Urupá
5 – Mirante da Serra
6 – Ministro Andreaza
7 – Castanheiras
8 – Novo Horizonte
9 – Rolim de Moura
10 – São Felipe
11 – Primavera
12 – Nova Brasilândia
Figura 4 – Mapa de Rondônia mostrando em vermelho a localização das cidades onde
foram coletados os soros de pacientes com suspeitas de dengue. Fonte Secretaria do
Desenvolvimento Ambiental de Rondônia - SEDAM.
32
4.2 Isolamento Viral
Para isolamento viral utilizou-se o clone C6/36, proveniente do mosquito
Aedes albopictus (FIGUEIREDO, 1990). As células foram cultivadas em placa de
24 orifícios, estéreis (Corning, USA) com meio de cultura Leibowitz – L15 (Gibco
BRL, USA) suplementado com solução de 10% de triptose fosfato (Sigma, USA),
10% de soro fetal bovino (Gibco BRL, USA) e 1000U/ml de penicilina e 1mg/ml de
estreptomicina, e quando a monocamada estava confluente foi inoculada 200μl
das amostras de soros diluídas 1:100 em meio L-15 completo. Incubou-se a placa
em estufa a 28º C por sete dias verificando a presença do efeito citopático
diariamente, em microscópio invertido (Nikon, USA).
4.3 Extração do RNA
Para extração do RNA viral contido no sobrenadante de culturas celulares
infectadas ou direto do soro do paciente, utilizou-se o método TRIzol®, método este
baseado na utilização de solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanina.
Para este método, adaptou-se o protocolo original descrito por Chomczyrsk et al.
(1987). Portanto, 500μl da amostra de fluido celular foi homogeneizado com 750μl
do reagente TRIzol®. O homogeneizado foi incubado por 5 minutos à temperatura
ambiente (TA), sendo que após incubado foi adicionado 150μl de clorofórmio. A
solução foi centrifugada em 12.000 rpm, por 15 minutos, a 4ºC. A fase aquosa foi
separada e o RNA precipitado após centrifugado a 14.000 rpm, por 5 minutos, a
4ºC. O RNA foi retirado seco, suspenso em 50μl de água DEPC e estocado a –
70ºC.
33
4.4 – RT-PCR
4.4.1 Confecção do cDNA
Após a extração realizou-se a transcrição reversa para confecção da fita de
cDNA. Incubando-se 5μl do RNA extraído com 3μg de primer randômico pd(N)6
(GIBCO BRL,USA), 1μl de dNTPs 10mM (GIBCO BRL, USA). Aqueceu-se a
amostra por 5 min à 65ºC. Acrescentou-se logo após este tempo 4μl do tampão
(20mM Tris-HCL (pH 7,5), 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.01% (v/v) NP40, 50%(v/v) glicerol), 2μl DTT 0.1M,10U/μl inibidor de Rnase e 200U/μl
SuperScript (GIBCO BRL,USA) e completou-se o volume para 20μl. Incubou-se por
1 hora a 42º C. Por fim, incubou-se por 10min à 70º C para desnaturar a
transcriptase reversa.
4.4.2. PCR e Hemi-nested-PCR
Para identificação do Flavivirus utilizou-se os primers universais FG1 e FG2,
que amplificam um fragmento de 938 pb do gene NS5 que identifica os vírus
dengue, encefalite Saint Louis, Bussuquara, Cacipacoré, Iguape, Ilhéus, Rocio e
Febre Amarela (BRONZONI et al., 2005; SCARAMOZZINO et al., 2001). Para a
PCR misturou-se 3,0μl do cDNA, com 5U/μl de Taq DNA polimerase (GIBCO®
BRL, USA), 10μl do tampão 10x (Tris-HCL 200mM, KCL 500mM), 2mM de MgCl2,
0.2mM dNTPs 10mM, 0,5 pmol/μl dos primers. Completou-se o volume final para
50μl com água ultra-pura. As seqüências dos primers são mostradas conforme
tabela 1. Submeteu-se a amostra a um hot start a 94ºC por 5min. Seguiram-se 30
ciclos térmicos de 94ºC por 1min; 53ºC por 1min e 72ºC por 2min em termociclador
(Eppendorf, Alemanha). Submeteu-se 7μl dos produtos da PCR, os amplicons, a
corrida eletroforética em gel de agarose 2,0% (GIBCO® BRL, USA) diluídos em
34
TAE (0,04M de Tris base, 0,04M de ácido acético e 0,0001M EDTA), acrescido de
brometo de etídio 1μl/ml. Observou-se a presença de amplicons através de
transiluminador com luz ultravioleta. Determinou-se o tamanho dos amplicons
através da comparação da linha de migração com as bandas do marcador de peso
molecular de 100pb (Invitrogen – USA).
Realizou-se a Hemi-nested-PCR para a caracterização molecular dos 4
sorotipos do vírus dengue. Utilizou-se 2μl do amplicon, 1,0μl de Taq polimerase
(GIBCO® BRL, USA), 1,0μl do tampão 10x da enzima (Tris-HCL 200mM, KCL
500mM), 1,0μl de MgCl, 1,0μl dNTPs 10mM e 0,5pmol/μl dos primers FG1, nden1
gerando fragmento 472pb para DENV-1, nden2 gerando fragmento 316pb para
DENV-2, nden3 gerando fragmento de 659pb para DENV-3, nden4 gerando
fragmento de 222pb para DENV-4. As seqüências dos primers da Hemi-nestedPCR são mostradas na tabela 1. Ajustou-se o volume final para 30μl. Submeteu-se
a mistura a 25 ciclos térmicos de 94ºC por 1min, 53ºC por 1 min e 72ºC por 2 min,
seguido de uma extensão final de 72ºC por 10 minutos em termociclador
(Eppendorf, Alemanha). Submeteu-se 7μl dos amplicons a corrida eletroforética em
gel de agarose 2,5% (GIBCO® BRL, USA) diluído em TAE, acrescido de brometo
de etídio 1μl/ml. Observou-se a presença do amplicom conforme descrito
anteriormente.
35
Tabela 1 – Seqüência dos primers e região de anelamento no genoma do DENV
Primers
Seqüência
Região
Referência
FG1
5’TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT 3
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
FG2
5’GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA 3
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
Nden1-
5’ CGTTTTGCTCTTGTGTGCGC 3’
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
Nden2-
5’GAACCAGTTTGGTTDRTTTCATCGCTGCC 3
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
Nden3-
5’ TTCCTCGTCCTCAACAGCAGCTCTCGCACT 3
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
Nden4-
5’ GCAATCGCTGAAGCCTTCTCCC 3’
NS5
Bronzoni et.al.; 2005
4.5 Purificação
Após a confirmação, os amplicons foram seccionados do gel com lâmina de
bisturi estéril e purificado com Kit Perfectprep
Gel cleaniup Kit (Eppendorf, USA),
conforme instrução do fabricante.
4.6 Seqüenciamento do DENV
Os
amplicons
obtidos
da
Hemi-Nested-PCR
foram
diretamente
seqüenciados pelo método de interrupção da síntese da cadeia de nucleotídeo por
dideoxinucleotídios, sem prévia clonagem e utilizando os respectivos primers sense
e anti-sense. O DENV3 isolado das amostras analisadas foi seqüenciado na
Unidade de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, utilizando o seqüenciador Personal Seq 4X4
gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo. Para obtenção da
seqüência utilizou-se o kit Thermo Sequenase Cy5.5 dye terminator cycle
sequencing (Amersham-Pharmacia-Biotech, USA). Para a mistura, utilizou-se
aproximadamente 5µg de DNA purificado, 3,2 pmol do primer sense, 3,2 pmol do
36
primer anti-sense, 0,5 l de cada dideoxinucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e
ddTTP) contidos no kit, 1µl de DNA. Submeteu-se as amostras a 25 ciclos térmicos
de 96ºC por 10 seg, 50ºC por 5 seg e 60ºC por 4 min. Em seguida, precipitou-se os
amplicons com álcool isopropílico e depois foram submetidos ao seqüenciador
automático Personal Seq 4x4 (Amersham-Pharmacia-Biotech, USA).
Desenhou-se uma árvore filogenética usando o
programa Clustal W do
European Bioinformatics Institute, pelo método neighboring joining que determina a
diferenciação molecular do vírus pelo comprimento dos clados do fenograma. Os
números de acesso ao GenBank, assim como as referências bibliográficas se
encontram na tabela 2.
Tabela 2 - Referência usada para adquirir a seqüência gênica dos DENV3 através
do GenBank.
Acesso ao
GenBank
M93130
Referência Bibliográfica
Osatomi,K. & Sumiyoshi,H., 1990.
AF317645
Yuan,X., Geng,L., Li,X., Yu,M. Não-publicado
AY679147
Miagostovich,M.P., dos Santos,F.B. & Nogueira,R.M.R. Nãopublicado
AY099338
Peyrefitte,C.N., Couissinier-Paris,P., Mercier-Perennec,V., et. al.
2003.
4.7 Subtipagem do DENV-3 por Restrição Sítio Específica (RSS-PCR)
Para subtipagem do DENV3 utilizou-se a técnica de subtipagem do sorotipo
3 do DENV por restrição de sítio específico - RSS-PCR, que faz análise da
seqüência do gene E do DENV, a seqüência dos primers são mostradas na tabela
3 (HARRIS et.al.; 1999). A origem e o fragmento de cada subtipo de DENV-3 são
mostrada na tabela 4. Para a RSS-PCR utilizou-se 3,0 μl do cDNA, com 5U/μl de
37
Taq DNA polimerase (GIBCO BRL, USA), 5,0 μl do tampão 10x (Tris-HCL 200mM,
KCl 500mM) 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM dNTPs 10mM, 0,5 pmol/μl dos primers.
Completou-se o volume final para 50 ul com água ultra-pura. Submeteu-se a
amostra a 30 ciclos térmicos para amplificação nas seguintes temperaturas: 94ºC
por 30s, 55ºC por 1min, e 72ºC por 2 min e uma extensão final de 72ºC por 5 min.
Submeteu-se 7μl dos produtos das PCR a corrida eletroforética em gel de agarose
1,5% (GIBCO BRL,USA) diluídos em TAE (0,04 M de Tris base 0,04M de ácido
acético e 0,001M EDTA), acrescido de brometo de etídio 1μl/ml. Observou-se a
presença de amplicons através de transiluminador com luz ultravioleta. Determinouse o tamanho dos amplicons através da comparação da linha de migração com as
bandas do marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen – USA)
Tabela 3 - Seqüência dos primers e região de anelamento na RSS-PCR
Primer
Seqüência
Região
Referência
RSS5
5’ CCAACATAACAACTGACTC 3’
E
Harris, et.al.; 1999.
RSS6
5’ GGCAAGGGAAGC(C/T)TGGTA 3’
E
Harris, et.al.; 1999
RSS7
5’CTACATTTTAAGTGCCCCG 3’
E
Harris, et.al.; 1999
RSS8
5’ GACAGGCTCCTCCTTCTTG 3’
E
Harris, et.al.; 1999
Tabela 4 - Origem dos subtipos de DENV-3 identificados na RSS-PCR
Subtipo
Origem
Fragmento
A
Indonésia, Filipinas e Malásia.
527pb e/ou765pb
B
Filipinas e Tailândia
655pb e/ou893pb
C
El Salvador, Guatemala, Nicaragua, Trinidade e Sri Lanka
527pb
38
5.0 - RESULTADOS
5.1 Isolamento Viral em Cultura de Célula
Oitenta e quatro amostras de soro de pacientes com suspeita clínica de
dengue foram inoculadas em células C6/36 na tentativa de isolamento viral. A
visualização diária das placas permitiu a verificação da presença de efeito
citopático em 24% dos poços das placas utilizando o microscópio invertido (Nikon,
USA). Mesmo aqueles poços que não apresentaram efeito citopático foram
submetidos a RT-PCR, pois o DENV é um vírus que causa pouco efeito citopático
em relação às outras arboviroses.
5.2 RT-PCR
Após a extração do RNA viral pela técnica do TRIzol , as 84 amostras foram
submetidas à reação de transcrição reversa e posteriormente foram amplificadas
pela técnica de PCR. Primeiramente, utilizou-se o par de primers, FG1 e FG2,
universal para Flavivirus, gerando fragmento de 938pb. Obteve-se 44 amostras
positivas e 40 negativas para Flavivirus, conforme tabela 5 e figura 5.
5.3 Caracterização Molecular do DENV por Hemi-nested PCR
Os amplicons das 44 amostras positivas foram submetidas a Hemi-nested
PCR, resultando na caracterização do DENV-3, os resultados das amostras por
municípios são mostrados na tabela 6. Quarenta e quatro amostras geraram
fragmento de 659pb caracterizando DENV-3, conforme figura 6.
39
Tabela 5 - Resultado das amostras analisadas, por município na primeira PCR,
utilizando primers FG1 e FG2.
Municípios
Positivas
Negativas
Total
Ariquemes
-
03
03
Cacoal
-
04
04
Colorado D’Oeste
08
06
14
Jaru
02
04
06
Ouro Preto D’Oeste
12
07
19
Porto Velho
20
10
30
Vilhena
02
06
08
Total
44
40
84
M
1
2
3
4
5
6
7
938pb
500pb
Figura 5 - Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio mostrando os
amplicons da RT-PCR com primers universais para Flavivirus. Em M: Marcador
de peso molecular de 100pb. Linha 1 a 5: fragmento de 938pb das amostras de
soro. Linha 6: controle positivo, DENV-2 Ceará. Linha 7: controle negativo,
sobrenadante de células C6/36 não infectadas.
40
Tabela 6 – Resultado, por município, da caracterização das amostras através da
Hemi-Nested-PCR.
Municípios
DENV3
Colorado D”Oeste
08
Jaru
02
Ouro Preto D’Oeste
12
Porto Velho
20
Vilhena
02
Total
44
M
500pb
1
2
3
4
5
6
7
659pb
316pb
Figura 6 - Gel de agarose de 2,5%, corado com brometo de etídio, mostrando os
amplicons da Hemi-Nested-PCR para caracterização do DENV-3 (659pb). Linha
M: marcador de peso molecular de100pb. Linha 1 a 6: fragmento de 659pb das
amostras de soro caracterizados como DENV-3. Linha 7: controle positivo DENV2 Ceará, fragmento de 316pb.
41
5.4 Análise do Sequenciamento do DENV-3
O DENV3 isolado das amostras analisadas foi seqüenciado na Unidade de
Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo. Analisou-se através da pesquisa de similaridade a
seqüência do DENV3 de isolados de Colorado D’Oeste, Jaru, Ouro Preto D’Oeste,
Porto Velho e Vilhena com seqüências nucleotídicas de DENV-3 encontradas no
Genbank, utilizando o programa Clustal W disponível no site do European
Bioinformatics Institute. A seqüência parcial obtida com as amostras é mostrada na
figura 7. De acordo com os dados mostrados pelo programa, as amostras
analisadas apresentaram 98% de similaridade com o DENV-3 quando comparadas
entre as amostras isoladas no Estado de Rondônia, conforme mostrado na figura 8.
1
61
121
181
241
301
TCTTTTTGGGGAGTCTGCTTGGAATTTGTATTGCTCTGTCCAGGTATGGACCTCGTTGGT
GACGAAGATTCCACTTCCACATTTGAGTTCTTTGCCTTTCCAGTTTATAACACATCCCAT
GTCAGCTTGCACCACAGCTCCCAGATAGAGTGTAATGATTCCTATCGCAATGCATGAAAA
TGACATGGATGTGTTTTTTGAATTCAACCCTATCCAAGTCAAGAGAACTCCTATTCCGAT
TTTCATTACCCAAGAGACTCCACTGAATAGGGCTGTGTAAGCACTTCCGAAATATTTGGT
GCACCATTTTGCCTAATGAGTTCAGAACACCACCCACTGATCC 343
60
120
180
240
300
Figura 7 – Seqüência gênica parcial do DENV3 isolado no Estado de Rondônia.
DENVRO1
DENVRO2
DENVRO3
DENVRO4
DENVRO5
GGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAACGTTGGATATAGAGCTTCAGAAGA
GGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAACGTTGGATATAGAGCTTCAGAAGA
GGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAACGTTGGATATAGAGCTTCAGAAGA
GGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAACGTTGGATATAGAGCTTCAGAAGA
GGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAACGTTGGATATAGAGCTTCAGAAGA
************************************************************
180
180
180
180
180
DENVRO1
DENVRO2
DENVRO3
DENVRO4
DENVRO5
CCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATGCATTGAGGGGAAAATTACCAACA
CCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATGCATTGAGGGGAAAATTACCAACA
CCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATGCATTGAGGGGAAAATTACCAACA
CCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATGCATTGAGGGGAAAATTACCAACA
CCGAGGCCACCCAATTGGCGACCTTAAGGAAGCTATGCATTGAGGGGAAAATTACCAACA
*********************** ************************************
240
240
240
240
240
Figura 8 –Alinhamento parcial das amostras do Estado de Rondônia feito pelo
programa Clustal W.
42
5.5 Análise Filogenética
A árvore filogenética (fenograma) obtida pelo programa ClustalW do
European Bioinfomatics Institute, pelo método de neighbouring joining, mostra pelo
tamanho das linhas do clado a diferenciação molecular do vírus. Para elaboração
dessa árvore além dos DENV seqüenciados do Estado de Rondônia, foram
incluídos os DENV isolados no Brasil e DENV3 isolados de um caso de DHF/DSS
ocorrido em Porto Velho (Figura 9).
A árvore mostra dois clados partindo de um único ramo com o DENV3
isolado de um caso de DHF/DSS em Porto Velho juntamente com o DENV3, cepa
H87 (M93130) originário da Filipinas e a cepa 80-2 (AF317645) originária da China.
No clado maior é onde se inserem os DENV3 isolados no Estado de Rondônia
juntamente com os outros DENV3 isolados em outras regiões do Brasil (AY679147)
e na Martinica (AY099338), o que corrobora com os achados por outras instituições
nacionais de pesquisa.
43
Figura 9 – Árvore filogenética mostrando os ramos com dois clados diferenciando
as amostras isoladas no Estado de Rondônia.
44
5.6 Análise da Subtipagem do DENV-3 por RSS-PCR
O cDNA das quarenta e quatro amostras caracterizadas como DENV-3
foram submetidas a RSS-PCR. Sendo que, uma das amostras de Porto Velho-RO
gerou um fragmento de 655pb, subtipada como B e as demais amostras dos
Municípios de Colorado D’Oeste, Jaru, Ouro Preto D’Oeste, Porto Velho e Vilhena
geraram fragmentos 527pb, subtipadas como C conforme figura 10.
M
1
2
3
655pb
500pb
4
5
6
7
527pb
Figura 10 - Gel de agarose de 1,5% corado com bromento de etídio
mostrando o produto da RSS-PCR para subtipagem do DENV-3. Linha M:
marcador de peso molecular de 100pb. Linha 1: fragmento de 655pb da
amostra de PVH. Linha 2 a 6: fragmento de 527pb das demais amostras.
Linha 7 controle negativo DENV-2 Ceará.
45
6 - Discussão
O apoio laboratorial, tanto sorológico como o isolamento viral, é considerado
fundamental na vigilância ativa do dengue, em virtude da necessidade de
confirmação diagnóstica, particularmente logo aos primeiros casos suspeitos em
uma área indene, e também para a determinação da extensão geográfica da
circulação e identificação dos sorotipos presentes bem como a informação sobre a
possibilidade de ocorrência de formas graves de acordo com a origem dos
sorotipos circulantes (TEIXEIRA et al., 1999). Os avanços no campo da biologia
molecular tornaram possível estudar com maior facilidade o genoma dos Flavivirus,
em especial o DENV. Diversos primers foram desenhados para amplificação do
genoma do dengue. São amplificados os genes da proteína E, a intersecção entre
C/prM, NS1 e NS3 e NS5 (BRONZONI et al., 2005; FIGUEIREDO, 1998; HARRIS
et al., 1999; HENCHAL et al., 1991; LANCIOTTI et al., 1992; TANAKA, 1993). O
uso da RT-PCR com primers universais para Flavivirus colabora, inicialmente, para
um rápido diagnóstico da família viral facilitando o segmento com os primers para a
Hemi-nested-PCR que identifica o vírus isolado.
A padronização de diagnósticos moleculares rápidos na Unidade de
Virologia identifica e caracteriza molecularmente o DENV, pois este altera seu
potencial epidêmico e suas manifestações clínicas quando se move entre as
populações, o que faz com que as apresentações epidemiológicas das infecções se
expressem de modo muito variado. Assim as epidemias podem ser explosivas,
seguidas de circulação endêmica, outras epidemias se comportam diferentemente,
delineando picos epidêmicos consecutivos até estabelecer um período de baixa
endemicidade de maior ou menor duração (TEIXEIRA et.al., 1999).
46
A reemergência das infecções causadas pelos quatro sorotipos do vírus
dengue em diferentes regiões geográficas evidencia a força do processo dinâmico
e progressivo de adaptação das populações de mosquitos que servem como
transmissores do dengue, bem como, a velocidade de circulação e replicação viral.
Durante as últimas décadas houve significante aumento da transmissão do
vírus dengue em todo o mundo, resultado de uma expansão na distribuição
geográfica deste, com a transmissão contínua dos sorotipos virais e emergência da
DHF em áreas onde a doença não tem prevalência (CHAMBERS et al., 1997;
PINHEIRO et al., 1997).
O Estado de Rondônia, de acordo com SVS no ano de 2004 apresentou
5.762 casos suspeitos de dengue, o que evidencia que esta doença constitui uma
indiscutível problemática de saúde não apenas pelas respostas imuno-patológicas
dos diferentes sorotipos do vírus, mas também pela possibilidade de agravamento
do cenário atual considerando que não há como prever, sob firmes bases
científicas, futuras ocorrências de epidemias, inclusive das formas mais graves
desta enfermidade, pois os fatores que determinam a reemergência destas
infecções são difíceis de serem eliminados.
De acordo com a SVS nos primeiros meses de 2005 os municípios de Jaru,
Cacoal, Ariquemes, Pimenta Bueno, Vilhena, Ji-Paraná, Ouro Preto D’Oeste e
Rolim de Moura apresentavam situação de epidemia, registrando mais de 2.700
casos da doença. Nestes municípios concentraram-se 91,3% dos casos
notificados. Em três deles, Cacoal, Jaru e Ouro Preto do Oeste, ocorreram 18
casos de DENV3 com manifestações neurológicas (SVS 14/02/2005). Houve a
coleta dos soros dos pacientes em conjunto com o Laboratório Central de Rondônia
(LACEN), sendo que os resultados obtidos pela Unidade de Virologia corroboram
47
com os obtidos pela Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS). Quanto ao
aparecimento de sintomas de neurovirulência do DENV3, não foi possível coletar o
liquor céfalo raquidiano (LCR) para isolamento de vírus, pois os pacientes já se
encontravam após o período de convalescença. Foram coletadas apenas amostras
para o diagnóstico sorológico de DENV. Em estudos sobre neurovirulência do
DENV3 na Malásia, após os seqüenciamento de cepas neurovirulentas, isoladas
entre 1992 a 1994 e não-neurovirulentas, isoladas entre 1974 a 1981, não houve
mutações significativas nos aminoácidos componentes da Proteína E. Assim, a
neurovirulência pode estar associada a mutações em proteínas não-estruturais ou
nas regiões não-codificantes (FONG et al., 2004)
Os números apresentados podem não mostrar a totalidade dos indivíduos
infectados, pois ocorre a subnotificação dos casos de DENV, podendo ser citado
entre outros motivos, pelo menos três observados no atendimento feito na Unidade
de Virologia. O primeiro é pela freqüência de infecções inaparentes. Segundo, em
virtude de o quadro clínico ser confundido com muitas viroses febris. Terceiro
motivo, após a epidemia estabelecida os pacientes fazem o tratamento sintomático
em domicílio por não haver a existência de terapêutica específica.
No presente trabalho foram estudadas 84 amostras de soros de pacientes
com suspeita clínica de dengue que apresentavam quadro clinico de 1 a 5 dias de
sintomas, coletados no período de janeiro de 2004 a fevereiro de 2005, nas cidades
de Ariquemes, Cacoal, Colorado D’Oeste, Jarú, Ouro Preto D’Oeste, Porto Velho e
Vilhena no Estado de Rondônia. Inicialmente, os soros das amostras foram
submetidos ao isolamento viral em cultura de células C6/36, clone do Aedes
albopictus. Onde, observaram-se através de microscópio invertido algumas
48
alterações morfológicas nas células. Das oitenta e quatro amostras, 24% sofreram
alteração na sua morfologia, caracterizando o efeito citopático.
Após o isolamento viral e acompanhamento das amostras, seguiu-se à
extração do RNA viral e RT-PCR. O cDNA resultante da RT foi submetido à PCR,
utilizando primers FG1 e FG2 universal para Flavivirus, que amplificam fragmento
de 938pb do gene NS5 (BRONZONI et al., 2005). O PCR é seguida de uma Heminested-PCR com a finalidade de caracterizar as amostras DENV, utilizando primers
específicos para cada sorotipo do vírus (BRONZONI et al., 2005). Atualmente o uso
de primers universal para identificação de arbovírus constituiu-se a melhor opção
para identificação desses vírus, principalmente em uma região favorável a
propagação destes.
Visando tornar confiáveis os resultados, amostras obtidas no GenBank
associadas a cinco amostras seqüenciadas de Porto Velho foram analisadas
através da pesquisa de similaridade pelo programa Clustal W. O cladograma
confirma os resultados do seqüenciamento, com exceção da amostra coletada de
uma paciente com suspeita de DHF no Hospital “João Paulo II”. A amostra foi
coletada na segunda quinzena de dezembro de 2003 e a identificação e
caracterização molecular foi realizada em fevereiro de 2004. Essa amostra formou
um clado atípico, pois sua similaridade é com DENV3 isolados na Filipinas. O
resultado sugere a introdução de uma nova cepa no país, pois no Brasil as cepas
circulantes de DENV3 têm origem na América Central. Foram realizados os testes
de IgM e IgG confirmando a doença. O soro obtido da paciente foi por cinco vezes
repassado em células C6/36 de lotes diferentes e seqüenciados todas às vezes,
provando assim não se tratar de uma contaminação laboratorial.
49
Das quarenta e quatro amostras dos municípios de Colorado D’Oeste, Jaru,
Ouro Preto D’Oeste, Porto Velho e Vilhena caracterizadas como DENV-3, quarenta
e três amostras foram tipadas como tipo C, de origem na América Central,
circulante em El Salvador, Guatemala e Nicarágua (HARRIS et al.; 1999) e
portanto, compatível com o DENV3 circulante no Brasil. Em consonância com a
árvore filogenética obtida, a RSS-PCR identificou um paciente de DHF como sendo
do tipo B, com origem na Tailândia ou Filipinas sugerindo a entrada de uma nova
cepa oriunda de outro continente no país.
A tipagem de cepas é uma ferramenta fundamental para a análise
epidemiológica molecular, fornecendo informações importantes sobre a dispersão
dos vírus, sendo este tipo de informação de suma importância podendo ser usada
para alertar as autoridades de uma potencial epidemia, mobilizando a
implementação de recursos apropriados para a prevenção e controle desta
moléstia (MIAGOSTOVICH et al.; 2003). A RSS-PCR já foi utilizada para subtipar
amostras de epidemias causadas por DENV2 e DENV3 ocorridas na Nicarágua, El
Salvador e Brasil (BALMASEDA et al., 1999; SIMONE et al., 2004).
Sendo assim, a RSS-PCR mostrou ser uma importante metodologia utilizada
na detecção rápida da penetração de novas cepas virais em determinadas
comunidades, contribuindo para o monitoramento dos sorotipos do vírus circulantes
e na adoção de medidas preventivas contra à disseminação de novos sorotipos,
cooperando com futuros estudos relacionados à epidemiologia e a biologia
molecular, bem como, com o desenvolvimento de futuras estratégias de controle da
doença. No entanto, quando comparada com outras técnicas moleculares utilizadas
na Unidade de Virologia de Porto Velho, foi considerada de difícil reprodutibilidade,
sendo sua padronização dificultada pelo fato de que os reagentes usados não
50
foram os mesmos recomendados pela autora Harris et al. (1999) no artigo sobre
RSS-PCR.
Tendo em vista que, o Estado de Rondônia se encontra numa região que
favorece o fluxo de pessoas provenientes de outras regiões do país e de outros
países, acaba se tornando uma porta de entrada para a circulação de novos
sorotipos, o que sugere a necessidade da ampliação na vigilância no sentido de
isolar, sorotipar e subtipar novas amostras do DENV, para tentar estabelecer uma
correlação de virulência do sorotipo circulante no Estado com outras cepas já
estudadas.
51
7 - CONCLUSÕES
Diante dos resultados apresentados nesta pesquisa pode-se concluir que:

A RT-PCR seguida da Hemi-nested-PCR utilizando primers de arbovírus
mostrou-se eficiente para o diagnóstico molecular do DENV e seus
respectivos sorotipos.

Através dos estudos epidemi-moleculares no Estado de Rondônia
confirmou-se que o sorotipo circulante do vírus dengue é o DENV3.

A RSS-PCR pode colaborar com a detecção de novos subtipos de DENV3.
52
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