extração de dna para a análise da amelogenina em amostras

Karina Silva Funabashi
EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA
EM AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM
PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DE SÃO PAULO
Dissertação
apresentada
à
Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do
título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Karina Silva Funabashi
EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA
EM AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM
PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DE SÃO PAULO
Dissertação
apresentada
à
Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Edna Sadayo Miazato Iwamura
São Paulo
2011
ii
Funabashi, Karina Silva
Univ
Extração de DNA para a análise da amelogenina em amostras
fixadas em formalina, incluídas em parafina e arquivadas por 1 e 5
anos no Departamento de Patologia da Universidade Federal de São
Paulo. / Karina Silva Funabashi. – São Paulo, 2011.
xviii, 99f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo.
Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Patologia.
Título em inglês: DNA extraction for amelogenin analysis in formalin
fixed, paraffin embedded samples stored for 1 and 5 years from Department
of Pathology of Federal University of São Paulo.
1. amelogenina 2. extração de DNA 3. parafina.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Maria Teresa Seixas Alves
Coordenadora do Curso de Pós-graduação:
Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara
iv
Karina Silva Funabashi
EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA EM
AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM
PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DE SÃO PAULO
Presidente da banca:
Prof.ª Dr.ª Edna Sadayo Miazato Iwamura
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Gilles Landman
Prof.ª Dr.ª Janete Maria Cerutti
Prof. Dr. Rogério Nogueira de Oliveira
Aprovada em: 23/02/2011.
v
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Mitur e Maria Luiza, que sempre iluminaram os meus
caminhos com muito amor e amizade, vibrando com minhas vitórias e
incentivando nos momentos difíceis.
Ao Prof. Dr. Antonio Sesso, Pesquisador Associado do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo pela Universidade de São Paulo, pela transmissão de
conhecimentos científicos, com grandes e valiosos ensinamentos.
A todos os docentes e funcionários que de alguma forma participaram deste
trabalho.
À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
UNIFESP/EPM.
vi
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À Profa. Dra. Edna Sadayo Miazato Iwamura, Professora Adjunta do
Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM, orientadora deste trabalho, pela
oportunidade, confiança a mim depositada e por todos os ensinamentos
científicos e intelectuais que colaboraram para minha formação.
vii
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por
fornecer os recursos financeiros para o desenvolvimento dessa pesquisa
através do processo de número 2008/11233-8.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pelo apoio financeiro.
viii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina –
UNIFESP/EPM, por ter me recebido como aluna do Programa de Pósgraduação em Patologia e possibilitando minha titulação;
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Patologia da
UNIFESP/EPM, pelos ensinamentos, apoio, críticas e exemplo como docentes
e pesquisadores;
À Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara, coordenadora do programa de Pós-graduação
em Patologia da UNIFESP/EPM, pela receptividade e auxílio;
À médica patologista do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, Dra.
Iria Visoná, que muito colaborou na realização deste trabalho, principalmente
na análise histológica das amostras;
Aos residentes do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, que muito
colaboraram na realização deste trabalho, principalmente na coleta e seleção
das amostras;
Aos funcionários do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, Daniel
Rosa Filho, Vera Cotrim, Angélica Maria da Silva, Arquimedes Leonardi,
José Sérgio Alves e Fátima de Seixas, pela simpatia, receptividade e apoio
ao meu trabalho;
Ao Joaquim Soares de Almeida, biólogo e técnico de laboratório do
Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, pela simpatia, disponibilidade e
por preparar com habilidade e atenção os cortes dos blocos de parafina para
este trabalho;
ix
Às secretárias do Programa de Pós-graduação em Patologia da UNIFESP/EPM
Virgínia Silva e Jeniffer Oliveira, pelo atendimento atencioso quando
precisava de auxílio;
Aos secretários Norberto Silva Lobo e Denise Pelegrini, pela simpatia e
auxílio;
Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Patologia da UNIFESP/EPM,
pela convivência e experiências trocadas para a formação profissional;
Ao Marcos Araújo Sobrinho, pelo companheirismo, auxílio e compreensão
durante todo este trabalho;
Aos amigos que acompanharam todo o projeto: Valéria Fernandes, Orlando
Piubelli, Alpio Stanchi, Suellen Albertão e Márcia Nascimento. Obrigada
pelo apoio, carinho e suporte.
Aos colegas Carla Godoy, Mirella Soler, Marcelo Silva e Denise Barcelos,
pela convivência, amizade, formação de espírito crítico e auxílio para o
desenvolvimento deste trabalho. Vocês foram de suma importância para o meu
crescimento profissional, intelectual e pessoal.
x
"O mistério gera curiosidade e a
curiosidade é a base do desejo
humano para compreender. "
(Neil Armstrong)
xi
SUMÁRIO
Dedicatória ........................................................................................
vi
Agradecimentos ...............................................................................
vii
Epígrafe .............................................................................................
xi
Lista de Figuras ................................................................................
xiii
Lista de Tabelas e Gráficos .............................................................
xv
Lista de Abreviaturas .......................................................................
xvi
Resumo .............................................................................................
xviii
1. INTRODUÇÃO ...............................................................................
01
2. OBJETIVOS ...................................................................................
20
3. MATERIAIS E MÉTODO ................................................................ 21
4. RESULTADOS ............................................................................... 30
5. DISCUSSÃO ..................................................................................
45
6. CONCLUSÃO ................................................................................
50
7. Anexos
8. Referências Bibliográficas
Abstract
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de temperatura durante reação de PCR .........................
03
Figura 2. Localização cromossômica do gene da amelogenina .............
14
Figura 3. Organograma da análise do processo de fixação e inclusão
em amostras de baço e cérebro ..............................................................
27
Figura 4. Fotomicrografia de amostra de baço normal recente
(coletada em 2009). 100x ........................................................................
30
Figura 5. Fotomicrografia de amostra de fígado normal recente
(coletada em 2009). 100x ........................................................................
30
Figura 6. Fotomicrografia de amostra de cérebro normal recente
(coletada em 2009). 100x. .......................................................................
31
Figura 7. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com fenolclorofórmio. ..............................................................................................
36
Figura 8. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com kit comercial. ....
36
Figura 9. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com Salting-Out. ......
37
Figura 10. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com fenol-clorofórmio. ....
37
Figura 11. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com kit comercial. ...........
38
Figura 12. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com Salting-Out. .............
38
Figura 13. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com fenol-clorofórmio. ..
39
Figura 14. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com kit comercial. .........
39
Figura 15. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em
amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com Salting-Out. ...........
40
xiii
Figura 16. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina
em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com fenolclorofórmio. ..............................................................................................
41
Figura 17. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina
em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com kit
comercial. .................................................................................................
41
Figura 18. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina
em amostras recentes (coletadas em 2009) de baço e cérebro fixados
em formalina tamponada e não-tamponada por 24h, seguido por
extração com kit. ......................................................................................
44
Figura 19. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina
em amostras recentes (coletadas em 2009) de baço e cérebro fixados
em formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias, processadas
pelos banhos de etanol e xilol e seguidas para extração com kit. ...........
44
xiv
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Tabela 1. Parâmetros de fixação a serem considerados para uma
boa preservação do tecido. ...................................................................
07
Tabela 2. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de
amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de
baço congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e
amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ...........................
32
Tabela 3. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de
amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de
fígado congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e
amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ...........................
32
Tabela 4. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de
amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de
cérebro congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e
amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ...........................
33
Tabela 5. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e
cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 24h.
42
Tabela 6. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e
cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias
e processadas nos banhos de xilol e etanol. ........................................
43
Gráfico 1. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de baço
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e
arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
34
Gráfico 2. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de fígado
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e
arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
34
Gráfico 3. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de cérebro
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e
arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
35
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
AmeloF
Sentido do primer da amelogenina 3´-5´ (forward)
AmeloR
Sentido do primer da amelogenina 5´-3´ (reverse)
AMELX
Gene da amelogenina localizado no cromossomo X
AMELY
Gene da amelogenina localizado no cromossomo Y
A-T
Ligação adenina – timina
B
Baço
BN
Baço em formalina não-tamponada
BT
Baço em formalina tamponada
C
Cérebro
CH2OH
Metilol
cm
Centímetro
CN
Cérebro em formalina não-tamponada
CT
Cérebro em formalina tamponada
C-T
Ligação citosina – timina
DMSO
Dimethyl sufoxide
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dNTPs
Desoxirribonucléicos fosfatados (adenina, timina, citosina e
guanina)
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
F
Fígado
FN
Fígado em formalina não-tamponada
FT
Fígado em formalina tamponada
G-A
Ligação guanina – adenina
xvi
h
Hora
HCl
Ácido clorídrico
ME
Microscopia eletrônica
mg
Miligramas
ml
Mililitros
NaCl
Cloreto de sódio
Neg
Controle negativo
Ng/µl/cm²
Nanogramas / microlitro / centímetro ao quadrado
O4Os
Tetróxido de ósmio
PCR
Reação em cadeia da polimerase
Pos
Controle positivo
SBME
Sociedade brasileira de microscopia eletrônica
SDS
Dodecil sulfato de sódio
TE
Solução de Tris-EDTA
µl
Microlitro
µm
Micrômetro
v/v
Volume por volume
Xg
Unidade de rotação
β
Beta
βF
Sentido do primer da β-actina 3´-5´ (forward)
βR
Sentido do primer da β-actina 5´-3´ (reverse)
xvii
RESUMO
Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações
retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos
genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras
congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil
obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na
fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA
extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através
de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina
(136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da
amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e
viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo
envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado
(n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo
que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e
outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os
mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de
autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a
remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit
comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA
extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR
(10ng/µl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As
amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à
extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas
as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA,
porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos
tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol
rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros
métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto
à amplificação do DNA obtido. Houve amplificação do gene da amelogenina em
todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers
menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado.
xviii
1. INTRODUÇÃO
O procedimento da biópsia é utilizado rotineiramente na medicina,
visando o diagnóstico das doenças, orientando o tratamento e o prognóstico
dos pacientes. Essas amostras são armazenadas em frascos contendo
soluções fixadoras, na maioria das vezes a formalina, para posterior inclusão
em parafina. Os blocos de parafina são cortados em micrótomos e os cortes
obtidos são aderidos às lâminas de vidro e corados para análise histológica.
Após a obtenção dos cortes, esses blocos ficam arquivados e representam
importante fonte de material biológico para pesquisa.
Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina representam a
maior fonte de materiais biológicos arquivados disponíveis para estudos
genéticos. São materiais essenciais para diagnósticos médicos e pesquisa
clínica. Com isso, espécimes biológicos arquivados puderam ser analisados
em diversas situações:
a) Diagnóstico: para detectar ou não a presença de três tipos de vírus
em crianças com síndrome da morte súbita (Alvarez-Lafuente et al 2008);
doenças neurológicas humanas (Ferrer et al 2007) e alguns espécimes
tumorais (Ananian et al 2010, Lassalle et al 2009 e Budimlija et al 2009).
b) Estudos retrospectivos: em museus de anatomia que armazenam
amostras raras de más-formações congênitas, doenças infecciosas (Santos et
al 2008, Dubeau et al 1986, Goelz et al 1985, Kallio et al 1989, Warford et al
1988) e expressão de um determinado gene em uma neoplasia rara (RibeiroSilva et al 2007);
c) Em casos de investigações forenses, análise de DNA pós-morte e
casos de erro médico, como troca de amostras. Em muitas situações este tipo
de material pode representar a última fonte disponível para análise genética, e
podem contribuir para obtenção de dados históricos e de aspecto legal (Duval
et al 2010, Doran et al 1986, Crisan et al 1990, Banaschak et al 2000).
De modo que, os tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina
são uma excelente fonte de DNA, porém sua extração continua sendo um
desafio.
O uso do DNA extraído de tecidos parafinados em procedimentos de
genética molecular é dependente de sua qualidade e quantidade. Diversos
2
autores afirmam que é essencial um método de extração de DNA adequado e
deve ser escolhido de acordo com características específicas de uma
investigação. (Santos et al 2009, Coura et al 2005, Farrugia et al 2010,
Grantzdorffer et al 2009, Okello et al 2010, Gilbert et al 2007, Rivero et al
2006).
De acordo com alguns autores, é difícil obter DNA genômico de boa
qualidade, uma vez que o processo de fixação, freqüentemente, resulta na
fragmentação do DNA, além das ligações cruzadas de proteína-proteína e
proteína-DNA que se formam. Além disso, o formaldeído dentro do tecido
gradualmente se modifica em ácido fórmico, hidrolisando o DNA (Gillio-Tos et
al 2007).
Existem diversos protocolos descritos para a extração de DNA de
tecidos frescos, sangue e cultura celular, mas extrações de DNA em tecidos
parafinados requerem protocolos especiais. Obter uma boa qualidade de
produtos de PCR de DNA extraído de tecidos parafinados é uma tarefa difícil,
pois, geralmente este material é escasso, degradado e contém substâncias
que inibem a reação de amplificação da amostra, como a formalina, ou que
inibem a enzima proteinase K utilizada no procedimento de extração, como
também o xilol (Coura et al 2005). A literatura tem mostrado que o tamanho
médio de fragmentos obtidos de DNA após a PCR é de 300-400pb em
biópsias congeladas, mas em tecidos parafinados o tamanho é bem menor
(Casale et al 2010).
O advento da tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),
técnica molecular específica, sensível, de rápida execução e de baixo custo,
permitiu a detecção de fragmentos específicos de DNA e com isso aumentou
o interesse, pelos pesquisadores no estudo de espécimes preservados e
armazenados em arquivos de hospitais e museus. (Arnheim et al 1990 e
Paabo et al 1989).
Ao contrário do DNA bem conservado oriundo de tecidos frescos
congelados, o DNA recuperado de amostras fixadas em formalina e incluídas
em parafina é altamente degradado. Portanto, numerosas tentativas são
realizadas para se descobrir um método ideal para uma recuperação e
amplificação eficiente de DNA nestes materiais. (Legrand et al 2002).
3
Nas décadas de 80 e 90, a utilização de técnicas moleculares para
extração de DNA em materiais arquivados em parafina era bastante limitada,
visto que alguns procedimentos requeriam a destruição dos blocos. Nesta
época, o processo de degradação do DNA através do contato com a formalina
era ainda desconhecida e somente eram amplificados fragmentos de DNA a
partir de amostras que continham DNA totalmente integro. (Shibata et al 1988
e Faloona et al 1987).
A técnica de PCR é realizada a partir de uma amostra de DNA e alguns
reagentes que propiciaram a amplificação de regiões específicas desta
amostra. Para isso, são necessários dois primers que flanqueiam a sequência
de DNA de interesse, dNTPs (que são os 4 nucleotídeos), a enzima DNA
polimerase, íons de magnésio e um tampão que equilibrará toda essa mistura.
A reação é realizada através de ciclagens em diferentes temperaturas
(conforme figura 1). Uma temperatura inicial é aplicada a fim de separar a
dupla hélice de DNA na seqüência. Em seguida, é utilizada uma temperatura
específica para que os primers sejam anelados na amostra, e finalmente a
temperatura é ajustada para aproximadamente 72ºC (fase de extensão), onde
a enzima adicionará a partir dos primers, os nucleotídeos correspondentes à
região a ser amplificada (Kubista et al 2006).
Desnaturação
Anelamento
Extensão
95°C -
1
3
72°C -
2
50°C -
tempo
Fig.1. O ciclo de temperatura da PCR: (1) a temperatura é elevada a
aproximadamente 95ºC para separar as duplas fitas de DNA, (2) a temperatura é
dimunuída para o anelamento dos primers, (3) a temperatura é ajustada para 72ºC
para a polimerase estender os primers. (Kubista et al 2006)
4
A fase de desnaturação deve ter temperatura suficiente para a
separação das fitas de DNA. A temperatura e duração da desnaturação
dependem do comprimento e às vezes da sequência de DNA a ser analisada,
além do equipamento e reagentes utilizados (Faloona et al 1987).
A temperatura de anelamento depende do conjunto de primers
utilizados e dos nucleotídeos nele contidos. Existem diversos programas
gratuitos disponíveis que estimam a temperatura de desnaturação ideal para
cada primer. Entretanto, estes programas não contam com o efeito
estabilizador da polimerase, que se liga ao primer anelado e estabiliza o
complexo. Na verdade, o mecanismo mais provável é de que a polimerase se
liga primeiramente ao primer e em seguida o complexo polimerase-primer se
liga à sequência de DNA alvo. A temperatura ótima para a polimerase é de
aproximadamente 72ºC, utilizada na maioria dos protocolos de PCR. (Kubista
et al 2006)
A investigação genética requer a extração de DNA de uma variedade
de tecidos com os mais variados tipos de preparações. Dentre estas, o
processamento de tecidos parafinados pode variar de acordo com as rotinas
de laboratórios clínicos, pois apesar de padronizado, pode ter variações no
tipo de fixador utilizado, tempo de fixação (especialmente em soluções de
formaldeído) e suplementos. Alguns autores relatam que a fixação de um
tecido em formalina por mais de uma semana pode danificar os ácidos
nucleicos, pois induz a um extensivo “crosslinking” nas proteínas do tecido,
resultando na fragmentação do DNA. (Bonin et al 2003).
A obtenção do DNA em condições ideais para amplificação é o fator
limitante desse tipo de amostra. O tipo de fixador utilizado, tempo de fixação,
condições de inclusão e condições de armazenagem podem resultar na
degradação do DNA (Ben-Ezra et al 1991).
Uma garantia fundamental para prevenir possíveis contaminações com
produtos de PCR é realizar a preparação das amostras em local isolado do
processo de análise. O seccionamento dos blocos de parafina requer esforços
consideráveis para prevenir contaminações entre as amostras. Deve ser
realizada uma rigorosa limpeza do micrótomo, das lâminas de corte e qualquer
outro equipamento utilizado nesse processo, pois qualquer resquício de tecido
pode contaminar a próxima amostra a ser seccionada. O uso de lâminas
5
descartáveis fornece maior proteção contra este tipo de problema, além da
troca freqüente de luvas descartáveis entre a limpeza dos equipamentos e as
secções dos blocos. (Greer et al 1994)
Uma vez que o micrótomo está limpo, várias secções (5-20µm) podem
ser obtidas de cada bloco e colocadas em um tubo para microcentrífuga de
1,5ml. A espessura do corte depende do tamanho da amostra. Para biópsias
pequenas (2-3mm), cortes de 10-20µm podem ser utilizados, enquanto que
tecidos maiores (5x5mm) podem ser cortados com 5µm. (Greer et al 1994)
Para a remoção da parafina, são necessárias diversas lavagens com
alcoóis. Alguns autores afirmam que a utilização de etanol a diversas
graduações (30-100%) podem remover completamente a formalina (Fang et al
2002, Rivero et al 2006, Gräntzdörffer et al 2009, Duval et al 2010). Outros
utilizam kits comerciais para desparafinização (Okello et al 2010).
Apesar de eficiente, esse método é laborioso, pois exige várias
lavagens com solventes que são tóxicos e centrifugações, o que aumenta o
risco de contaminação das amostras. Procedimentos usando sal têm sido
usados para extrair o DNA de sangue e amostras citológicas e provou ser
menos laborioso e tóxico do que o método do fenol-clorofórmio (Rivero et al
2006).
1.1 FIXAÇÃO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS
Tão cedo quanto 400a.c, Hipócrates discutiu os efeitos biológicos do
mercúrio e do álccol como fixadores. Entretanto, curiosamente sobre as
estruturas histológicas dos tecidos começaram apenas com a invenção do
microscópio. Centenas de anos mais tarde, a importância da qualidade do
espécime para uma validez exata foi realizado. Um estudo sistemático dos
fixadores deu início na última metade do século 19. Entretanto, deve ser
notado que o próprio fixador leva a um maior número de artefatos (Srinivasan
et al 2002).
A célula animal está em um estado de fluidez ou um semifluidez, e a
fixação envolve algumas modificações químicas dos constituintes e proteínas
dos tecidos, evento este necessário para prevenir sua perda durante o
processamento do tecido (Williams et al 1999).
6
Uma atenção maior foi focada em desenvolver fixadores que podem
preservar células e constituintes dos tecidos em um estado tão semelhante
quanto à célula original permitindo passar por procedimentos de preparação
sem mudança (Chaw et al 1980).
Diversos fixadores são discutidos na literatura a fim de solucionar os
problemas de preservação das amostras. O glutaraldeído é amplamente
utilizado na microscopia eletrônica, entretanto, a penetração lenta e a
necessidade de diversas trocas para manter os níveis de aldeído tornam-se
uma grande limitação para a biologia molecular (Srinivasan et al 2002).
O fixador Bouin é constituído de ácido pícrico, ácido acético glacial e
formalina, que apesar de preservar melhor os detalhes das células e
apresentar menor quantidade de artefatos, é cada vez menos utilizado.
Embora nestas amostras uma quantidade considerável de DNA pode ser
extraído, o rendimento obtido de ácidos nucléicos é menor do que em tecidos
fixados em formalina (Baloglu et al 2008). O uso de etanol e metanol como
fixadores preserva bem os ácidos nucléicos e provocam poucas mudanças
químicas nos tecidos. Por ter uma rápida penetração, pode contribuir para a
uniformidade do tecido fixado e mínima perda dos componentes da amostra.
(Giannella et al 1997 e Noguchi et al 1997)
Em diversas aplicações clínicas, o diagnóstico pode ser dificultado por
métodos de fixação que falham na conservação da estrutura dos ácidos
nucléicos e proteínas em tecidos e até mesmo em diagnosticar estágios
tumorais (Hsu et al 2007) e a capacidade limitada de extrair DNA, RNA ou
proteínas de alta qualidade de tecidos fixados. Diversos fatores de pré fixação,
intra fixação e pós fixação (conforme tabela 1) estão integralmente envolvidos
na manutenção do estado in vivo do tecido humano ex vivo (Srinivasan et al
2002).
7
Tab. 1. Parâmetros de fixação a serem considerados para uma boa preservação do
tecido. (Srinivasan et al 2002)
Grupo I: parâmetros de pré-fixação
1. Fatores constantes:
a. Natureza do anestésico
b. Duração da anestesia
c. Injúria anóxica in situ
2. Fatores variáveis:
a. Tempo de pré-fixação
Grupo II: parâmetros de intra-fixação
1. Propriedades dos fixadores:
a. Química e mecanismo de ação
b. Penetração no tecido
2. Condição da fixação:
a. Temperatura
b. Duração
c. pH
d. Osmolaridade
e. Concentração
f. Tamanho do espécime
g. Volume do fixador
Grupo III: parâmetros pós-fixação
1. Parâmetros de armazenamento
a. Duração
b. Temperatura
c. Condição (empacotado em vácuo)
2. Natureza do fator biológico a ser analisado
a. Proteínas
b. Enzimas
c. Lipídios
d. Ácidos nucleicos
e. Mucopolissacarídeos
f. Glicogênio
Como o nome sugere, a fixação é o processo pelo qual se obtém a
estabilização das estruturas celulares e intercelulares. As fixações por
métodos físicos incluem: a secagem ao ar, a criofixação, utilização de
substâncias crioprotetoras, a criofixação convencional, a criofixação por
congelamento ultra-rápido (“quick freezing”), etc. (Ben-Ezra et al 1991).
A fixação química é obtida pelo emprego de substâncias que, reagindo
com determinados sítios das biomacromoléculas, estabilizam as mesmas. As
moléculas das substâncias empregadas na fixação química podem ou não ser
adicionadas às macromoléculas tissulares (Greer et al 1991).
As proteínas, por exemplo, as intracelulares de membranas, citosólicas,
etc,
e
as
produzidas
pela
célula
para
exportação
para
atuarem
8
extracelularmente, pertencem a uma das duas seguintes categorias: Proteínas
fibrosas e proteínas globulares. Nas proteínas fibrosas, como o colágeno e
queratina, a cadeia polipeptídica, em sua estrutura secundária está disposta
em hélice e se enrola ao redor de um cilindro imaginários de cerca de 1nm de
diâmetro. As proteínas globulares solúveis têm cadeia polipeptídica enovelada
numa configuração esferoidal com os radicais hidrofóbicos na parte inferior da
estrutura terciária da proteína e os radicais hidrofóbicos expostos na
superfície. Segmentos variáveis, conforme o tipo de proteína globular desse
polipeptídio podem exibir estrutura em hélice. As proteínas integrais que
atravessam as membranas têm os radicais hidrofóbicos expostos para o
segmento hidrofóbico da bicamada de fosfolipídios. Essa interação permite o
ancoramento dessas proteínas à membrana (Casale et al 2010)
Para a microscopia eletrônica, os procedimentos de fixação têm sido
mais estudados e descritos devido às suas características de resolução. Os
fixadores químicos podem desnaturar as proteínas em graus variáveis,
conforme a estrutura molecular do agente fixador. A desnaturação, que se for
intensa e irreversível é indistinguível da coagulação, consiste numa
modificação da estrutura da cadeia polipeptídica que é revirada e passa a
exibir exteriormente radicais hidrofóbicos, o que determina a precipitação e
insolubilização de uma proteína previamente solúvel (Greer et al 1991 e
Srinivasan et al 2002).
Os fixadores que têm ação coagulante sobre as proteínas precipitam
permanentemente as mesmas, alteram bastante sua configuração (por isso
não são utilizadas em microscopia eletrônica) e, geralmente, não são
incorporados às proteínas, sendo por isso também referidos como não
aditivos. Sob a ação dos fixadores não coagulantes, como os aldeídos
fórmicos e glutaraldeído, a acroleína e o tetróxido de ósmio (O4Os), as
proteínas assumem o aspecto de gel transparente, isso porque ocorre uma
estabilização estrutural através de uma amarração que as moléculas fixadoras
fazem sobre as macromoléculas tissulares sem distorcer muito estas
últimas. A “amarração“ que esses fixadores propiciam deve-se ao fato que
suas moléculas ou parte das mesmas estabelecem ligações cruzadas entre
os componentes estruturais. Desse modo, esses fixadores são incorporados
aos tecidos, daí também serem nomeados de fixadores aditivos. (Sociedade
9
Brasileira de Microscopia Eletrônica - SBME 1989). A Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrônica editou um manual no qual seguem as recomendações
de procedimentos de fixação.
As soluções comerciais designadas formalina têm concentração de
formaldeído de 37 a 40%. A formalina apresenta de 11% a 16% de metanol
que extrai boa parte do material do citosol e das membranas da célula.
Tecidos fixados em solução aquosa de formalina a 10% (ou de formaldeído
3.7% - 4.0%) subseqüentemente em tetróxido de ósmio a 1% em tampão
fosfato 0,1 M pH 7.3 e processados para inclusão em resina epóxi exibem
péssima preservação das estruturas submiscroscópicas, principalmente
devido à ação deletéria do metanol contido na primeira solução fixadora.
Preservação estrutural razoável, para fins de diagnóstico histopatológico ao
ME, é obtida de fragmento de órgão diretamente fixado em formalina 10% em
tampão fosfato 0,1 M pH 7,2-7.4 e depois em O4Os. (Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrônica - SBME 1989).
A fixação depende do coeficiente de difusão do fixador e a taxa em que
reage com os componentes do tecido. O coeficiente de difusão em 1 hora é a
distância em milímetros que o fixador é difundido no tecido, e é inversamente
relacionada à raiz quadrada do tempo. No geral, quanto mais alto o coeficiente
de difusão, melhor o fixador. A formalina a 4% possui um coeficiente de
difusão de 0,78. Em contato com a água, a formalina rapidamente se torna
hidratada para formar metileno glicol. Quando o tecido está imerso na
formalina, ele é rapidamente penetrado pelo metileno glicol. A atual fixação
química covalente depende da fração da formalina formando ligações com os
componentes do tecido e a dissociação da formalina com o metileno glicol.
(Srinivasan et al 2002)
Para facilitar uma maior uniformidade de penetração do fixador no
tecido, é aconselhável utilizar pequenos fragmentos de amostras (5mm a 1cm)
e o volume do fixador deve ser 20 vezes maior que o volume do tecido.
(Srinivasan et al 2002 e Greer et al 1991)
10
1.2 FORMALINA
Ferdinard Blum foi creditado como a primeira pessoa a utilizar formalina
como fixador de tecidos em 1893 (Puchtler et al 1985). Desde esta data, a
formalina tamponada a 10% é o fixador universal mais amplamente utilizado,
pois preserva uma grande quantidade de tecidos e seus componentes. A
formalina é o fixador mais utilizado na prática histopatológica devido ao seu
fácil manuseio, menor toxicidade e um grande número de anticorpos podem
ser utilizados para imunohistoquímica. (Zsikla et al 2004). Entretanto, as
tentativas de extrair DNA utilizável de tecidos fixados em formalina são
variavelmente bem sucedidas. (Srinivasan et al 2002)
Na preparação dos fixadores, consideram-se, entre outros fatores, o pH
da solução, a sua tonicidade e ainda a presença de íons bivalentes e
açúcares. O pH parece ser um dos elementos mais importantes a ter em
conta, pois os resultados obtidos com fixadores não tamponados são muito
variáveis. Os tampões estabilizam as modificações de pH que acompanham a
morte celular à medida que o fixador penetra nos tecidos. Geralmente a
fixação faz-se a um pH fisiológico (7.2 - 7.5). No entanto, um pH baixo próprio
do tecido (como biópsias gástricas), não gera efeito negativo na qualidade do
DNA (Zsikla et al 2004).
A formalina a 10% tamponada é ainda a melhor opção nas diversas
circunstâncias. Além do baixo custo, o tecido é preservado durante longos
períodos sem sofrer deteriorização, além de ser compatível com a maioria das
colorações especiais. A formalina pura é uma solução concentrada (40%) do
gás formaldeído em água. Assim a solução de formalina a 10% representa a
solução de um gás a 4%. (Alves et al 2002)
A velocidade de penetração da formalina a 10% é de cerca de 1 mm/h,
mas este período pode ser abreviado com a utilização de forno de microondas
comercial, desde que sejam mantidas as temperaturas entre 63° e 65 °C, já
que a ebulição da formalina conduz a artefatos indesejáveis (Alves et al 2004).
Estudos das reações químicas entre formalina e ácidos nucléicos têm
demonstrado que diversas reações são semelhantes àquelas observadas em
interações com formalina e proteína. A formalina inicia a desnaturação do
DNA (ligações de hidrogênio são rompidas e ocorre o desempilhamento das
11
bases) nas regiões de adenina e timina (A-T) da dupla fita de DNA, criando
sítios para interação química (Zsikla et al 2004).
Existem 4 interações da formalina com DNA:
1. Reação adicional: a formalina é adicionada ao ácido nucléico, formando
um grupo de hidroximetil (metilol, -CH2OH).
2. Ataque eletrofílico do N-metilol em uma base amino, formando uma
ponte de metileno entre dois grupos aminos.
3. Tratamento com formalina pode gerar sítios apurínicos e apirimídicos
(sítios de AP) via hidrólise das ligações N-glicosílicas, levando a
resíduos de pirimidina e purina. Sítios de AP possuem um íon
carboxônio altamente instável que hidrolisa rapidamente.
4. Formalina pode causar hidrólise lenta das ligações fosfodiésteres,
levando a pequenas cadeias de polideoxiribose com pirimidinas intactas
(Srinivasan et al 2002).
Quando comparado ao DNA extraído de tecidos congelados, tecidos
fixados em formalina exibem alta freqüência de sequencia não reproduzível.
Como resultado, na reação de PCR, a polimerase falha em reconhecer a
citosina e incorpora uma adenina no lugar de uma guanina, criando uma
mutação artificial C-T ou G-A. Além disso, o DNA danificado é conhecido por
promover saltos durante amplificação, permitindo que a polimerase insira um
resíduo de adenina no final da molécula da amostra em questão (Srinivasan et
al 2002).
12
1.3 PARAFINA
A parafina é uma mistura de hidrocarbonetos sólidos derivados do
petróleo. A parafina é branca ou incolor, mais ou menos translúcida e inodora.
Existem vários tipos, cada um com um ponto de fusão diferente. As parafinas
mais moles têm um ponto de fusão de aproximadamente 45°C e são melhores
para tecidos moles como os tecidos conjuntivos dos fetos. As parafinas duras
derretem-se a cerca de 60°C e são as mais indicadas para tecidos duros,
como por exemplo, o tecido fibroso denso e o osso. Para utilização em
laboratório aconselha-se uma parafina cujo ponto de fusão ronde os 56°C, já
que não é prático num laboratório de patologia de rotina incluir algumas
amostras com parafinas moles e outras com parafinas duras (Alves et al
2002).
As parafinas utilizadas para impregnação e inclusão são variadas e são
escolhidas de acordo com a demanda de cada laboratório. Por terem
diferentes
pontos
de
derretimento
e
texturas,
podem
impactar nas
características de seccionamento dos blocos finais. A maioria dos laboratórios
utiliza a parafina sintética, que possui baixa temperatura de derretimento (5563ºC) e é composta por látex, DMSO (dimethyl sulfoxide) e “plastificantes” que
modificam a textura e maleabilidade. O uso de parafinas com alta temperatura
de derretimento resulta em uma inadequada desparafinização e redução da
quantidade de ácidos nucléicos recuperados (Hewitt et al 2008).
Os tecidos embebidos em parafina podem ficar armazenados por
longos períodos. Alguns pesquisadores afirmam que há uma redução na
quantidade de ácidos nucléicos recuperados em amostras antigas, na ordem
de 5%-50% por cada década armazenada. Não é claro se esta redução é em
função do tempo em que o tecido está parafinado, da qualidade do
processamento do tecido ou das mudanças dos reagentes e processos
utilizados durante a fixação. Apesar disso, muitos laboratórios trabalham com
materiais de 20 e 25 anos atrás (Cronin et al 2004 e Gillio-Tos et al 2007) e
até mesmo em espécimes de museus datadas do século 20, para estudo da
gripe espanhola (Taubenberger et al 1997).
13
1.4 AMELOGENINA
Nos estágios terminais do desenvolvimento dos dentes, as células
epiteliais presentes no esmalte interno são diferenciadas em ameloblastos,
que sintetizam e secretam proteínas específicas. Existem duas classes de
proteínas
que são constituintes do desenvolvimento do esmalte: a
amelogenina e a enamelina . A amelogenina contém altas concentrações de
prolina, glutamina, leucina e histidina (Sasaki et al 1995).
Os genes da amelogenina foram identificados nos cromossomos
sexuais tanto em camundongos quanto no homem por Lau et al 1989. Duas
cópias do gene da amelogenina foram detectadas no genoma humano através
da técnica de Southern Blot (Shimokawa et al 1989).
Fincham et al, em 1991, encontrou diferenças nos componentes da
amelogenina humana de acordo com o sexo do indivíduo. Foram extraídas
amostras de dentes de indivíduos e as proteínas foram analisadas por
eletroforese. Bandas específicas da amelogenina foram detectadas e o
dimorfismo sexual foi observado.
Após este estudo, em 1992, Salido et al relataram que os genes da
amelogenina são expressados tanto no cromossomo X, quanto no
cromossomo Y.
Trata-se de um gene homólogo, que está localizado no cromossomo
Xp22.1-Xp22.3 e Yp 11.2 (conforme figura 2). Ele pode ser utilizado na
determinação do sexo de amostras humanas desconhecidas através da
Reação de Cadeia da Polimerase (PCR). Utilizando primers específicos para o
íntron 1 do gene, a seqüência do gene para o íntron pode ser amplificada. O
gene do cromossomo X, AMELX, dá origem a um produto de amplificação de
212pb e o gene do cromossomo Y, AMELY, 218pb. Desta forma o AMELX
contém uma deleção de 6pb no íntron 1. Utilizando primers específicos para o
íntron 1 do gene, a seqüência do gene para o íntron pode ser amplificada.
Portanto, quando os fragmentos amplificados são colocados em gel de
agarose, as amostras do sexo masculino (XY) apresentarão duas bandas
(uma de 212pb e outra de 218pb), enquanto as do sexo feminino (XX)
apresentarão apenas uma banda (Sasaki et al 1995).
14
Fig. 2. Localização do gene da amelogenina nos cromossomos X (AMELX) e Y
(AMELY), destacados em vermelho. (Fonte: Nature Genetics Reviews)
A identificação do sexo é uma importante variável biológica que auxilia
na avaliação específica de um indivíduo e tem se tornado indispensável em
casos forenses, não apenas em casos de estupro, mas também em desastres
em massa e utilizado na maioria dos kits comerciais para PCR. Quando a
utilização de métodos convencionais de identificação sexual é impossível ou
dificultada (análise arqueológica), a análise de sequências específicas de DNA
para os cromossomos X e Y permitem uma solução rápida (Gibbon et al
2009).
Há diversas situações onde a identificação do sexo é crucial, como o
diagnóstico prenatal de hemofilia e a determinação do número de cópias de
cromossomos sexuais. Além disso, a caracterização sexual também é
utilizada em aplicações médicas, como em casos de síndrome de Klinefelter
(XXY). O princípio dos testes comercialmente disponíveis é baseado no fato
15
de que numerosos polimorfismos estão presentes nas duas cópias homólogas
do gene da amelogenina nos cromossomos X e Y (AMELX e AMELY)
(Tschentscher et al 2008 e Sullivan et al 1993).
A amelogenina é utilizada nos kits de identificação humana para
propósitos forenses (Applied Biosystems).
1.5 EXTRAÇÃO DE DNA
Com base nas características estruturais dos ácidos nucléicos, algumas
técnicas moleculares são utilizadas na manipulação do DNA dos organismos.
A hibridização é a técnica que se baseia na complementaridade entre as fitas
de DNA. Um fragmento de DNA marcado por uma substância radioativa é
usado como sonda para determinar a presença da fita complementar em uma
amostra específica. Essa técnica foi muito utilizada em testes de diagnóstico,
porém, atualmente em conseqüência de sua baixa sensibilidade e de
problemas advindos do uso de radioatividade, ela caiu em desuso (Oliveira et
al 2007).
A clivagem é outra técnica que pode facilitar a manipulação do DNA.
Para esse fim, existem as chamadas enzimas de restrição, que são capazes
de cortar o DNA em sítios específicos, definidos geralmente pela seqüência de
bases distribuídas ao longo da molécula, produzindo fragmentos de
comprimento menor. As enzimas de restrição são sintetizadas naturalmente
por muitas bactérias e centenas (com especificidade para diferentes sítios de
restrição) estão disponíveis comercialmente. Outros tipos de manipulação de
DNA incluem a amplificação (utilizando a técnica de PCR) e a eletroforese
(Oliveira et al 2007)
Para o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos, encontram-se
disponíveis várias técnicas alternativas as quais originam DNA ou RNA com
diferentes graus de pureza e de integridade física. Na maioria dos casos,
estas técnicas iniciam-se com o processo de liberação dos ácidos nucleicos, o
que envolve a lise das células a estudar, seguida de ataques enzimáticos e/ou
químicos para destruir os componentes proteicos da mistura. Já no que diz
respeito ao processo de purificação dos ácidos, várias alternativas se
16
encontram disponíveis (Rivero et al 2006, Baloglu et al 2008, Greer et al 1991,
Gräntzdörffer et al 2009 e Duval et al 2010).
O processo de purificação mais económico e simples é denominado de
Salting-Out e consiste na insolubilização dos longos filamentos de DNA por
ação da concentração salina da solução. Neste método, o DNA obtido é de
baixa pureza, sendo recolhido por suave enrolamento com uma vareta de
vidro após adição de um sal. O DNA assim preparado necessita depois de ser
submetido a um longo processo de ressolubilização, após o que se encontra
pronto para ser estudado. Note-se que apesar do baixo custo envolvido, este é
um processo muito ineficiente devido á baixa pureza do DNA obtido, ao
elevado teor de mão de obra necessário, e ao longo tempo de preparação que
envolve (Rivero et al 2006).
O processo tradicional de extração de DNA de elevada pureza e
integridade física é denominado de fenol-clorofórmio. Este processo deve o
seu nome ao fato de envolver o ataque químico de proteínas e outros
compostos celulares por ação do fenol dissolvido em clorofórmio. Esta mistura
contém ainda habitualmente d-hidroxiquinelona como corante (facultativo) e
álcool isoamílico como regulador da densidade. Neste processo, após a
libertação dos ácidos nucleicos, a solução aquosa é misturada com igual
volume de solução de fenol/clorofórmio, e após homogeneização suave, é
centrifugada. Como as soluções aquosas (contendo o DNA) e orgânicas
(contendo o fenol) são imiscíveis, após a centrifugação podemos facilmente
recolher a fase aquosa (no topo do tubo) e rejeitar a fase orgânica (no fundo
do tubo) e a interfase contendo um anel esbranquiçado de proteínas e
precipitados. A remoção da fase aquosa deve ser executada com muito
cuidado, para que a alta viscosidade não acarrete o arrastamento de interfase
proteica. O processo repete-se ciclicamente até não ser observável a
presença de interfase protéica (Barcelos et al 2008, Oliveira et al 2007).
No final, a precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol
absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico.
O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se
agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol
absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de
clorofórmio presentes na amostra. O etanol a 70% é utilizado para remover
17
resíduos de sais. Embora tanto o cloreto de sódio como o acetato de sódio e o
acetato de amônio sejam eficazes na precipitação do DNA, é mais difícil
remover o cloreto de sódio, em razão da sua menor solubilidade (Barcelos et
al 2008).
Este processo, apesar de permitir obter DNA de elevada pureza,
concentração e integridade fisica, tem como o Salting-Out a desvantagem de
ser exigente do ponto de vista da mão-de-obra e do tempo de execução,
envolvendo ainda a manipulação de compostos tóxicos como o fenol e o
clorofórmio (Oliveira et al 2007).
A solubilidade das proteínas depende, além de outros fatores, da
concentração de sal na solução. Em baixas concentrações, a presença de sais
estabiliza vários grupos de uma molécula de proteína, atraindo a mesma
dentro da solução e reforçando a solubilidade. Este método é comumente
conhecido como Salting-In. Entretanto, como a concentração de sal vai
aumentando, o ponto de solubilidade máximo da proteína é alcançado. O
aumento da concentração de sal implica na menor disponibilidade de água
para solubilizar as proteínas. Desta maneira, a proteína começa a precipitar
quando não há moléculas de água suficientes para interagir com as moléculas
de proteínas. Este fenômeno de precipitação na presença de excesso de sal é
conhecido como Salting-Out (Jakoby 1971).
Diversos tipos de sais têm sido empregados para a separação e
purificação de proteínas através do Salting-Out. O mais amplamente utilizado
é o sulfato de amônio, pois possui alta solubilidade e baixo custo (Jakoby
1971).
A grande revolução nos processos de purificação de ácidos nucleicos
foi a descoberta em meados dos anos 80 de que certas formulações de sílica
possuíam a capacidade de adsorver os ácidos nucleicos, de modo
dependente do pH e da concentração salina. A formulação da matriz de sílica
variou desde suspensões a colunas de centrifugação, colunas ou matrizes de
colunas de vácuo, sistemas de filtração e até partículas magnéticas revestidas
a sílica. Em todos os casos, o processo melhorou muito em termos de rapidez,
automatibilidade, reprodutibilidade, utilização de mão de obra, rendimento e
até custo (Oliveira et al 2007 e Okello et al 2010).
18
1.6 ELETROFORESE
A eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar,
identificar e para purificar fragmentos de DNA e de proteínas. Este método
consiste na separação de moléculas ionizadas (aminoácidos, peptídeos,
proteínas - incluindo lipoproteínas e glicoproteínas, nucleotídeos, ácidos
carboxílicos e outras substâncias de relevância biológica), de acordo com sua
carga elétrica e seu peso molecular. Moléculas com carga negativa migram
para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o
pólo negativo (cátodo) (Sambrok et al 2001).
Para haver migração, é preciso desequilibrar eletricamente duas
regiões extremas de um meio que contenha eletrólitos, no qual esteja
dissolvida ou dispersa uma substância com potencial para migrar. Para tanto,
é estabelecida a diferença de potencial entre dois eletrodos ligados aos
terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois
compartimentos, catódico e anódico; ambos os compartimentos contém, em
geral, uma solução-tampão. O meio físico de separação, igualmente
tamponado, se comunica através de suas extremidades com as soluçõestampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico. A corrente elétrica,
ao passar pelo meio, conduzida pelos pequenos íons presentes na solução,
dá ensejo ao deslocamento, por exemplo, de partículas protéicas carregadas
para determinado pólo (Oliveira et al 2007).
Pelo fato das proteínas serem substâncias anfóteras, ou seja, capazes
de adquirirem carga positiva ou negativa de acordo com o pH, é indispensável
manter constante o pH do meio durante a eletroforese, por meio do uso de
soluções-tampão (Oliveira et al 2007).
Os ácidos nucléicos, por possuírem carga total negativa (em
decorrência do grupamento fosfato), migram sempre em direção ao pólo
positivo (ânodo). O sistema tampão usado consiste em duas partes: o tampão
usado na preparação do gel e o tampão da cuba eletrolítica, na qual se
encontram os eletrodos (ânodo e cátodo). Nos tampões das cubas e do gel, a
corrente elétrica é conduzida por íons, e nos eletrodos, por elétrons. Na
presença de um sistema tampão adequado, a hidrólise da água, que se dá na
superfície dos eletrodos, permite a troca entre elétrons e íons. O sistema
19
tampão pode ser contínuo (o mesmo tampão é utilizado no gel e nos
eletrodos) ou descontínuo (quando diferentes composições ou concentrações
de tampão são utilizadas no gel e nos eletrodos) (Sambrok et al 2001).
O principal fator a ser considerado na escolha do tampão é a sua
capacidade de tamponamento. Os dois tampões mais usados na separação
eletroforética de moléculas de DNA são TAE (tampão tris-acetato-EDTA) e
TBE (tampão tris-boratoEDTA). Esses dois tampões possuem efeito
ligeiramente diferente na mobilidade do DNA. Apesar de o TAE ser mais
utilizado, ele é mais facilmente exaurido durante reações longas ou com alta
voltagem. O TBE tem melhor capacidade tamponante, mas deve ser evitado
para purificação de DNA de géis. (Sambrok et al 2001).
A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou
em diferentes meios de suporte, tais como papel-filtro, sílica-gel, membranas
de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida. O suporte
deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade
das moléculas e, em relação aos géis de agarose ou à poliacrilamida, a
porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas e este
geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os monômeros
(Oliveira et al 2007).
Diante da problemática exposta, é importante conhecer e analisar cada
etapa deste tipo de estudo, desde o armazenamento e processo de amostras
parafinadas até a análise molecular. Em nosso estudo, pretendeu-se avaliar a
qualidade do DNA por diferentes métodos de extração e analisar todo o
processo histológico em amostras parafinadas. Além disso, com o intuito de
avaliar a integridade do DNA, o gene da amelogenina foi utilizado na
diferenciação do sexo.
20
2. OBJETIVOS:
Avaliar a influência da fixação e do tempo de armazenamento na
integridade do DNA da amelogenina extraída de tecidos humanos incluídos
em parafina.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Em amostras normais de fígado, baço e cérebro fixadas em formalina e
incluídas em parafina, obtidas de cadáveres:
1. Comparar a concentração e a qualidade do DNA extraído de tecidos
normais coletados durante os procedimentos de necropsia, fixados em
formalina e incluídos em parafina;
2. Comparar as amostras de fígado, baço e cérebro fixadas em formalina,
incluídas em parafina e arquivadas por 1 e 5 anos;
3. Comparar 3 métodos de extração: fenol-clorofórmio, utilização de sais
(Salting-Out, modificado de Rivero ERC 2006) e kit comercial (QIAamp
Mini Kit QIAGEN®).
4. Avaliar a amplificação dos produtos de PCR utilizando o gene da
amelogenina (212-218pb) para identificação do sexo.
21
3. MATERIAIS E MÉTODO:
3.1 MATERIAL:
1º grupo (casos recentes):
Foram coletadas amostras de fígado, baço e cérebro normais de 13
indivíduos, de forma aleatória, sendo adultos do sexo masculino e sexo
feminino, submetidos aos procedimentos de necropsia, realizadas no
Departamento de Patologia. Os fragmentos de cerca de 1cm² foram fixados
em formalina tamponada e incluídos em parafina (n=10 de cada tipo de
tecido); fixados em formalina não-tamponada e incluídos em parafina (n=10 de
cada tipo de tecido) e congelados (casos controle, n=10 de cada tipo de
tecido).
2º grupo (casos arquivados):
Foram coletados blocos de parafina contendo fragmentos de fígado,
baço e cérebro normais de 15 indivíduos adultos, do sexo feminino e
masculino, obtidas de necropsias realizadas no Departamento de Patologia
da UNIFESP. As amostras foram fixadas em formalina não-tamponada,
incluídas em parafina e arquivadas no Departamento de Patologia, sendo
armazenadas por 1 ano (n=10 bloco de cada tecido) e armazenadas por 5
anos (n=10 blocos de cada tecido).
3º grupo:
Fragmentos de baço, fígado e cérebro normais de um único indivíduo
(adulto do sexo masculino) retirados no momento da necropsia. Analisamos a
qualidade do DNA extraído dentre diferentes etapas do processamento
22
histológico, a fim de avaliar os efeitos dos fixadores, dos banhos de etanol e
xilol e do processo de parafinização, em cada etapa, de forma isolada.
Critérios de inclusão:
1. Possuir o exame com os resultados anátomo-patológico de necropsias;
2. Aspecto histológico de normalidade;
3. Blocos arquivados por 1 e 5 anos em boas condições de preservação.
Critérios de exclusão:
1. Exame histológico com diagnóstico de neoplasia ou alterações de
normalidade (patologias relacionadas ao cérebro, fígado e baço);
2. Blocos de parafina em más condições de preservação (blocos
danificados, tecidos emblocados inadequadamente, blocos gastos, etc.)
3. Biópsias;
4. Hepatopatias;
5. Doenças infecciosas (viroses e septicemias no geral);
6. Etilistas;
7. Tabagistas;
8. Presença de autólise, artefatos ou pigmentos na análise histológica.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
EPM/UNIFESP – CEP 0063/09.
3.2. MÉTODO:
3.2.1. Microtomia
Dois cortes com aproximadamente 10µm de espessura foram obtidos
em micrótomo do tipo Minot (Leica, Modelo RM 2035) e armazenados em
tubos de 1,5 ml. As amostras escolhidas apresentaram a mesma área de
superfície (aproximadamente 1 cm2).
23
3.2.2. Extração de DNA
Foram cortados em micrótomo 2 secções de 10µm de espessura dos
blocos de parafina e coletados em tubos de 1,5 ml.
3.2.3. Métodos de Extração:
Fenol-clorofórmio
Um mililitro (1mL) de xilol pré-aquecido (60ºC) é adicionado em tubos
de 1,5ml, contendo os tecidos, que são mantidos a 60ºC por 30 minutos. O
sobrenadante é descartado, é adicionado 1mL de xilol e em seguida mantido a
60°C por 10 minutos. Em seguida, o tecido é lavado duas vezes com 1mL de
etanol
absoluto
(Merck).
Toda
troca
de
reagentes é
precedida
por
centrifugação em 16000xg por 4 min. Após, as amostras são colocadas em
470µl de solução que chamaremos de DP (Tris HCl 1mM pH 8.0, EDTA
0,5mM e Tween 20 0,5%) e 30µl de proteinase K (30mg/µl). A digestão em
proteinase K ocorre por 24h a 56ºC.
Após a digestão pela proteinase K, 0,5mL de fenol-clorofórmio-álcoolisoamílico (25:24:1 v/v) é adicionado. As amostras são centrifugadas a
16000xg por 2 minutos e em seguida o sobrenadante é transferido para outro
tubo. A seguir, 0,5mL de fenol-clorofórmio é adicionado no sobrenadante e os
tubos são centrifugados novamente a 16000g por 4 minutos. O sobrenadante
é transferido para um novo tubo. O DNA é precipitado com 1mL de etanol
absoluto e 40µl de acetato de sódio 3M pH 4.8 a -20ºC por 2 horas. A solução
é centrifugada a 16000xg por 15 minutos. Após a decantação do DNA, o
etanol é desprezado por inversão e os tubos são incubados à temperatura
ambiente até secarem completamente. O DNA então é dissolvido em 80µL de
solução TE (Tris-EDTA) e mantido à temperatura de 4ºC até a sua utilização
(Barcelos et al 2008).
24
Utilização de sais: Salting-out (modificado de Rivero EC, 2006)
Um mililitro (1ml) de xilol pré-aquecido (60ºC) é adicionado nos tubos de
1,5ml contendo os cortes e mantidos a 60ºC por 10min. Em seguida, os tubos
são centrifugados a 9300xg por 5 min. O sobrenadante é descartado, seguido
por uma nova lavagem com xilol. O pellet é lavado em séries no sentido
descrescente de etanol (etanol absoluto, etanol 95% e etanol 70%). Toda a
lavagem é precedida por homogeneização e centrifugação a 9300xg por 5min.
Em seguida, adiciona-se 470ul de tampão de digestão (1M NaCl, 1M Tris-HCl
pH 8.0, 0,5M EDTA pH 8.0 e 10% de SDS) e 30ul de proteinase K (30mg/ml).
A digestão em proteinase ocorre por 24h a 56ºC.
Após a digestão pela proteinase K, essa é inativada, incubando os
tubos a 95ºC por 10min. Em seguida são adicionados 200µL de acetato de
amônia. Os tubos são vortexados por 20 segundos na velocidade alta e em
seguida incubados a -20ºC por 5 minutos e centrifugados a 13000xg por 3
minutos. O sobrenadante é transferido para um novo tubo de 1,5ml e 600µL
de isopropanol é adicionado e centrifugado a 16000xg por 5 minutos. O pellet
de DNA é lavado com 200µl de etanol a 70% e centrifugado a 16000xg por 1
minuto. O sobrenadante é descartado. O DNA é dissolvido em 80µl de solução
de TE (Tris-EDTA) e mantido à temperatura de 4ºC até a análise.
Kit comercial (QIAamp DNA Mini Kit - QIAGEN®)
Os procedimentos de extração são realizados de acordo com as
instruções do manual do fabricante. Um mililitro (1mL) de xilol é adicionado no
tubo de 1,5ml (contendo os cortes do tecido parafinado) e vortexado
vigorosamente por 5 segundos. Em seguida o tubo é centrifugado em
velocidade máxima (16000xg) por 5 min, o sobrenadante é descartado e
adiciona-se 1mL de etanol absoluto (Merck). O tubo é vortexado gentilmente e
em seguida centrifugado a 16000xg por 5 min. Este processo é repetido por
mais uma vez. A seguir, o tubo é incubado aberto a 37°C por 10-15 min até o
etanol ter evaporado. O pellet é ressuspendido em 180µL de Buffer ATL e
20µL de proteinase K (30mg/ul), vortexado e incubado a 56°C por 2h. Após
digestão pela proteinase K, são adicionados 200µL de Buffer AL, vortexados
25
por 15 segundos e incubados a 70°C por 10 min. Em s eguida são adicionados
200µL de etanol absoluto (Merck), vortexado por 15 segundos e a mistura é
transferida para a coluna do kit, sem encostar na membrana. O tubo é então
centrifugado a 8000rpm por 1 min e a coluna é transferida para um novo tubo
coletor. São adicionados 500µL de Buffer AW1, o tubo é centrifugado a
8000rpm por 1 min e a coluna é transferida para um novo tubo coletor. Em
seguida são adicionados 500µL de Buffer AW2 e o tubo é centrifugado a
14000rpm por 3 min. A coluna é transferida para um tubo limpo de 1,5mL e
são adicionados 200µL de Buffer AE. O tubo é incubado em temperatura
ambiente por 1 min e em seguida centrifugado a 8000rpm por 1 min. A coluna
é descartada e o material é armazenado a -20°C até sua utilização.
3.3. Análise do processo de fixação e inclusão em fragmentos de baço,
fígado e cérebro.
Conforme figura 3, realizamos um experimento em paralelo onde foram
obtidos fragmentos de baço, fígado e cérebro normais de um indivíduo (adulto
do sexo masculino) retirados no momento da necropsia. Analisamos a
qualidade do DNA extraído dentre diferentes etapas do processamento
histológico, a fim de avaliar os efeitos dos fixadores, dos banhos de etanol e
xilol e do processo de parafinização, em cada etapa, de forma isolada.
Todas as amostras foram pesadas para 25mg ou cortadas em 10µm
numa área de 1cm² e utilizados 2 cortes por bloco.
Esses fragmentos foram divididos e processados da seguinte forma:
1. Congeladas em Tissue Tek ® a -20ºC;
2. Fixadas em formalina 10% tamponada;
3. Fixadas em formalina 10% não-tamponada.
Amostras congeladas:
Foram pesadas e padronizadas para 25mg de tecido. A extração de
DNA foi realizada conforme as recomendações do kit comercial QIAGEN
QIAamp Mini®. Essas amostras foram utilizadas como controle da análise.
26
Amostras somente fixadas:
Os fragmentos fixados tanto em formalina tamponada quanto nãotamponada (por 24h) foram novamente divididas: uma parte seguiu por mais 6
dias no fixador e outra parte seguiu para o processo de extração de DNA.
Amostras fixadas e processadas para inclusão, exceto na parafina:
Após 6 dias de fixação em formalina tamponada e não-tamponada, as
amostras foram submetidas aos banhos no aparelho Leica Jung Histokinnette
2000® em gradiente de etanol e xilol (3 banhos de etanol absoluto com 1h
cada e 3 banhos de xilol com 1h cada). Os fragmentos previamente pesados
(25mg) seguiram então para a extração de DNA no kit QIAGEN QIAamp
Mini®.
Amostras fixadas e processadas para a inclusão em parafina (processo
final):
Os fragmentos que foram processados até o final, ou seja, até a
inclusão em parafina, foram cortados e padronizados para 1cm².
Após os banhos de etanol e xilol, as amostras foram incluídas em
parafina de acordo com a rotina do departamento. Em seguida, foram obtidos
2 cortes de 10µm de cada bloco (fragmento com 1cm²) e seguiu-se a extração
de DNA com o kit QIAGEN QIAamp Mini®.
27
Caso 2010
Baço
Fígado
Fixação em formalina
tamponada
Cérebro
Congeladas
Fixação em formalina
não tamponada
Fixado
Fixado
24h
7 dias
Banhos
Etanol+Xilol
Extração de DNA – kit QIAGEN QIAamp DNA Mini®
Fig. 3. Organograma do experimento para análise do processo de fixação e inclusão
das amostras de fígado, baço e cérebro normais coletadas durante o procedimento
de necropsia.
3.4. Avaliação do DNA extraído
3.4.1. Pureza e rendimento do DNA
A pureza do DNA extraído foi avaliada por espectrofotometria, através
do aparelho Nanodrop (Thermo Scientific®), calculando a taxa A260/A280 para
as impurezas das proteínas. A concentração de DNA presente nas amostras
foi calculada em ng/µl/cm².
28
3.5. Amplificação através da técnica de PCR (reação em cadeia da
polimerase)
Foi utilizado o gene da amelogenina (218pb-X / 212pb-Y) de acordo
com as recomendações do fabricante (Promega®), a fim de avaliar a
integridade do DNA obtido em fragmentos maiores e para identificação do
sexo. Além disso, também foi utilizado o gene da β-actina (136pb) para avaliar
a viabilidade e integridade do DNA extraído.
Amelogenina - primers (iniciadores):
212/218pb:
AmeloF (5´-3´): ACCTCATCCTGGGCACCCTGG
AmeloR (5´-3´): AGGCTTGAGGCCAACCATCAG
Preparo para PCR:
Componentes
H2O
Primer Amelogenina F (300nM)
Primer Amelogenina R (300nM)
Master Mix (Qiagen®)
DNA (10ng/µL)
Total
Volume de amostra
8 µl
1,25 µl
1,25 µl
12 µl
2,5 µl
25 µl
Reação de PCR
40 ciclos
94°C 30´´, 60°C 1´, 72°C 30´´
Final Extension
72°C 7´
4°C ∞
29
β-actina 136pb - primers (iniciadores):
βF (5´-3´): AGC GGG AAA TCG TGC GTG
βR (5´-3´): GGT GAT GAC CTG GCC GTC
Preparo para PCR:
Componentes
H2O
Primer β-actina F (300nM)
Primer β-actina R (300nM)
Top Taq Master Mix (Qiagen®)
DNA (10ng/µl)
Total
Volume
6,5 µl
1,25 µl
1,25 µl
12 µl
2 µl
25 µl
Reação de PCR
96°C 5´
40 ciclos
96°C 2´, 60°C 2´,72°C 2´
Final Extension
72° 7´
4° C ∞
Como controle negativo foi utilizada água MilliQ e K562 (Promega®)
como controle positivo da amplificação.
3.6. Análise do DNA extraído
Para a visualização dos amplicons gerados pelos primers descritos, as
amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado
com Gel RedTM (Biotium®). Após, o gel de agarose foi fotografado sobre luz
ultra-violeta no equipamento Edas KODAK.
30
4. RESULTADOS:
As fotomicrografias a seguir apresentam a condição de normalidade
das amostras incluídas em parafina de um caso recente (coletado em 2009 –
N09-35):
Fig.4. Fotomicrografia de amostra de baço recente incluída em parafina. 100x.
Fig.5. Fotomicrografia de amostra de fígado recente incluída em parafina. 100x.
31
Fig.6. Fotomicrografia de amostra de cérebro recente incluída em parafina. 100x
As tabelas 2, 3 e 4 a seguir apresentam os resultados das
concentrações de DNA em ng/µl/cm² (média ± dp), obtidas das amostras de
baço, fígado e cérebro, respectivamente (n= 10). Cada uma das tabelas
apresenta os resultados obtidos pelos 3 métodos de extração: fenolclorofórmio, kit comercial (QIAGEN® QIAamp Mini) e Salting-Out. Após a
extração e quantificação, realizou-se a reação de PCR para o gene da βactina (136pb) e amelogenina (212-206pb) nos 3 métodos. O sucesso da
amplificação está expresso em porcentagem do total de amostras.
De acordo com os resultados obtidos, houve 100% de taxa de
amplificação nas amostras congeladas, utilizadas neste estudo como controle.
Houve maior taxa de amplificação pelo gene da β-actina em amostras
recentes parafinas, se comparada com as amostras arquivadas por 1 e 5
anos. Nos três tipos de tecido, todas as amostras selecionadas para reação de
PCR pelo gene da amelogenina foram amplificadas.
Foram estudados um total de 450 amostras e realizadas 615 reações
de PCR.
Em todas as amostras extraídas com fenol-clorofórmio, recuperou-se
uma maior quantidade de DNA em todos os tempos, se comparado com os
outros tipos de extração.
32
Tabela 2. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação
(expresso em porcentagem) para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de
baço congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de baço
armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 2. Análise de baço
Congeladas
Recentes
Parafinadas
1 ano
5 anos
Fenol
Kit
Salting-Out
523,5 ± 88,8
117,4 ± 50,7
80,5 ± 52,5
323,9 ± 135,6
21,2 ± 18,8
21,2 ± 20,1
1009,5 ± 526,6
14,9 ± 8,3
10,5 ± 6
312,5 ± 141,7
34,4 ± 19,7
19,2 ± 24,1
β-actina (+) Fenol
β-actina (+) Kit
β-actina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
100%
100%
100%
60%
50%
100%
50%
50%
100%
Amelogenina (+) Fenol
Amelogenina (+) Kit
Amelogenina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
100%
-
0%
0%
-
-
Tabela 3. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação
(expresso em porcentagem) para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de
fígado congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de fígado
armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 3. Análise de fígado
Congeladas
Recentes
Parafinadas
1 ano
5 anos
1522,7 ± 693,7
80,7 ± 61,8
70,5 ± 50,2
313,2 ± 152,4
27,5 ± 15,8
11,7 ± 7,1
1045,6 ± 572,4
14 ± 10,2
16,2 ± 11,8
274,4 ± 127,8
24,3 ± 21,8
7,6 ± 4,2
β-actina (+) Fenol
β-actina (+) Kit
β-actina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
90%
100%
100%
70%
60%
70%
40%
60%
100%
Amelogenina (+) Fenol
Amelogenina (+) Kit
Amelogenina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
100%
-
0%
0%
-
-
Fenol
Kit
Salting-Out
33
Tabela 4. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de amplificação
(expresso em porcentagem) para o gene da B-actina e amelogenina em amostras de
cérebro congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e amostras de
cérebro armazenadas por 1 ano e 5 anos (n= 10 cada).
Tabela 4. Análise de cérebro
Congeladas
Recentes
Parafinadas
1 ano
5 anos
Fenol
Kit
Salting-Out
524,8 ± 205,9
10,3 ± 3,9
148,6 ± 89,6
182,6 ± 125,7
11 ± 7
6,3 ± 3,1
335,2 ± 115,4
7,2 ± 4,3
6,5 ± 4,4
157 ± 69,3
14,5 ± 8,3
7,9 ± 6,3
β-actina (+) Fenol
β-actina (+) Kit
β-actina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
70%
100%
100%
70%
20%
80%
50%
40%
100%
Amelogenina (+) Fenol
Amelogenina (+) Kit
Amelogenina (+) Salting-Out
100%
100%
100%
100%
-
0%
0%
-
-
Os gráficos a seguir apresentam as comparações entre os métodos de
extração (kit comercial, fenol-clorofórmio e Salting-Out) em relação ao grau de
pureza do DNA extraído em amostras de fígado, baço e cérebro congeladas,
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), armazenadas por 1 ano e por 5
anos.
Nota-se que, em todas as amostras extraídas pelo método Salting-Out,
há um menor grau de pureza e heterogeneidade entre os tempos, se
comparado com os outros métodos. A extração pelo kit comercial rendeu
maior grau de pureza, porém na extração com fenol-clorofórmio, houve maior
homogeneidade entre os tempos.
34
DNA extraído de amostras de baço
Grau de pureza (A260/A280)
2,5
2
1 ano
5 anos
2009 parafinadas
1,5
1
Congeladas
0,5
0
Kit Comercial
Fenol
Salting-out
Gráfico 1. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de baço
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1
ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
DNA extraído de amostras de fígado
Grau de pureza (A260/A280)
3
2,5
2
1 ano
5 anos
2009 parafinadas
Congeladas
1,5
1
0,5
0
Kit Comercial
Fenol
Salting-out
Gráfico 2. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de fígado
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1
ano e 5 anos, nos diferentes méto dos de extração.
35
DNA extraído de amostras de cérebro
Grau de pureza A260/A280
3
2,5
1 ano
2
5 anos
1,5
2009 parafinadas
congeladas
1
0,5
0
Kit Comercial
Fenol
1
Salting-out
Gráfico 3. Grau de pureza (A260/A280) do DNA extraído de amostras de cérebro
coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e arquivadas por 1
ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração.
As figuras a seguir apresentam a amplificação dos produtos de PCR
das amostras, com os genes da β-actina e amelogenina em gel de agarose
1% corada com GelRed®. Cada número e letra identificados no gel
representam um indivíduo e seu respectivo órgão, ou seja, 12, 13, 20, etc
significa o código do indivíduo e as letras “B”, “C” e “F” significam “baço”,
“cérebro” e “fígado” respectivamente. As letras “T” e “N” significam “formalina
tamponada” e “formalina não-tamponada”, respectivamente. Em cada gel
foram utilizados um controle negativo (água MilliQ), um controle positivo
(K562® Promega) e um padrão de peso molecular (pGem® Promega).
Como pudemos observar, as fotografias dos géis mostram a maioria
das amostras amplificadas pelos genes estudados. De acordo com nossos
resultados, as amostras recentes apresentam uma intensidade de banda
maior quando comparada às amostras armazenadas por 1 e 5 anos.
A amplificação dos produtos de PCR pelo método Salting-Out
apresentou maior taxa de amplificação, porém há a presença de “fundo
manchado” em todos os géis realizados.
36
pGem 33BT 33BN 33CN 33CT 33FT 33FN 33BT 35BN Neg Pos pGem
136pb
pGem 35CT 35CN 35FT 35FN 34CT 34CN Neg Pos pGem
222
179
126
Fig. 7. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras
de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método fenolclorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT =
formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo K562 e pGem = padrão de peso molecular).
pGem 33CN 35BT 34CN 34CT 35FT 33BT 33FN 35CT Neg Pos pGem
136pb
pGem 35FN 35CN 33CT 35BT 33BN 33FT Neg
Pos pGem
222
222
179
179
126
126
Fig. 8. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras
136pb
de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método de kit
comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT =
formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo K562 e pGem = padrão de peso molecular).
37
pGem 33FT 33FN 33BT 33BN 35FT 35FN 35BT 35BN pGem
pGem 36BT 36BN 36FT
36FN 34CT 37BT 37BN Neg
Pos pGem
222
179
126
136pb
Fig. 9. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em amostras
de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método de Salting-out.
(B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT = formalina não
tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562 e pGem =
padrão de peso molecular).
pGem 18F 18B 18C 19F 19B 19C 24F 24B 24C 25F 25B 25C Neg Pos pGem
136 pb
222
179
126
Fig. 10. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de
fenol-clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água,
Pos = controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
38
18F 18B 18C 19F 19B 19C 24C 24F 24B 25F neg 25C pos pGem
136pb
222
179
126
Fig. 11. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de
kit comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos =
controle positivo - K562 e pGem = padrão de peso molecular).
pGem 17B 17F 19B 19F 19C 16B 18B 24C 24F 24B pGem
222
136pb
179
126
pGem 25F 25C 25B 26B 27C 13C 18C 20C neg pos pGem
Fig. 12. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 1 ano, extraídas pelo método de
Salting-Out (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos =
controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
39
pGem 2C
3C
4C
5C
6C
7B
9F
9B 10C
5C pGem
pGem 5F
11C
4F
12F
4B
13F neg neg pos pGem
222
179
136pb
126
Fig. 13. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método
de fenol-clorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo água, Pos = controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
pGem 2C
3C
4C
5C
6C 7B
9F
9B
10C 11C 12F 4B
7C
13F 14F 15F pos neg pGem
136pb
Fig. 14. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método
kit comercial (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos=
controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
40
pGem 1B
2B
2C
3F
3C
pGem 5B
5F
5C
6B
6F
4B
4F
4C
pGem
.
6C
neg pos pGem
222
179
136pb
126
Fig. 15. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina (136pb) em
amostras de fígado, baço e cérebro armazenadas por 5 anos, extraídas pelo método
Salting-Out (B = baço, F = fígado, C = cérebro, Neg = controle negativo - água, Pos =
controle positivo - K562 e pGem= padrão de peso molecular).
As figuras a seguir apresentam as amplificações dos produtos de PCR
do gene da amelogenina do DNA extraído pelo método de fenol-clorofórmio e
kit comercial.
Podemos observar que, nas amostras extraídas com fenol-clorofórmio,
não houve amplificação do gene da amelogenina. Por outro lado, nas amostras
extraídas com kit comercial, houve amplificação do gene e, portanto, a
identificação sexual do indivíduo.
41
pGem
XY
30CT 30CN 30BT 30BN 30FT 30FN neg pos
XY
pGem
212
218
222
179
126
Fig. 16. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em amostras
de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método fenolclorofórmio (B = baço, F = fígado, C = cérebro, T = formalina tamponada, NT =
formalina não tamponada, Neg = controle negativo - água, Pos = controle positivo K562, pGem = padrão de peso molecular e XY = padrão da amelogenina).
pGem 30BT 30BN
30FT 30FN
neg
pos
pGem
212pb
Fig. 17. Amplificação dos produtos de PCR pelo gene da amelogenina em amostras
de fígado, baço e cérebro recentes parafinadas, extraídas pelo método kit comercial
(B= baço, F = fígado, T = formalina tamponada, NT = formalina não tamponada, Neg
= controle negativo - água, Pos = controle positivo - K562, pGem = padrão de peso
molecular e XY = padrão da amelogenina).
42
Análise do processo de fixação e inclusão:
As tabelas a seguir apresentam a concentração do DNA extraído (ng/µl)
em amostras somente fixadas pela formalina (Tabela 5) e em amostras
processadas pelos banhos de xilol e etanol (Tabela 6).
Podemos observar que as amostras de baço apresentaram maior
rendimento de DNA extraído em relação às amostras de cérebro. Entretanto,
não houve diferença na quantidade de DNA entre as etapas.
Tab. 5. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e cérebro fixadas em
formalina tamponada e não-tamponada por 24h.
Tipo de
Amostra
baço tamponado I
Concentração
Inicial (ng/ul)
52,36
baço tamponado II
37,34
baço tamponado III
40,11
baço não tamponado I
50,73
baço não tamponado II
56,47
baço não tamponado III
45,45
cérebro tamponado I
4,64
cérebro tamponado II
4,01
cérebro tamponado III
5,99
cérebro não tamponado I
6
cérebro não tamponado II
7,04
cérebro não tamponado III
7,62
43
Tab. 6. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e cérebro fixadas em
formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias e processadas nos banhos de xilol e
etanol.
Tipo de
Amostra
baço tamponado I
Concentração
Inicial (ng/ul)
31,54
baço tamponado II
38,5
baço não tamponado I
28,85
baço não tamponado II
32,16
cérebro tamponado I
12,11
cérebro tamponado II
12,35
cérebro não tamponado I
14,14
cérebro não tamponado II
14,18
As figuras a seguir apresentam a amplificação dos produtos de PCR
pelo gene da amelogenina em amostras somente fixadas (Figura 18) e em
amostras processadas pelos banhos de etanol e xilol (Figura 19).
De acordo com os nossos resultados, houve identificação sexual do
indivíduo (sexo masculino, apresentando duas bandas) nas amostras de baço
que foram somente fixadas. Entretanto, nas amostras processadas pelos
banhos, houve amplificação do gene, porém não houve a diferenciação das
bandas (X e Y).
44
pGem BT
BT
BT
BN
BN
BN CT
CT
CT
CN
CN
CN Neg Pos pGem
216pb
212pb
222
179
126
Fig. 18. Amplificação dos produtos de PCR da amelogenina em amostras de baço (B)
e cérebro (C) fixadas em formalina tamponada (T) e não tamponada (N) e DNA
extraído após 24h de fixação (pGem = padrão de peso molecular, Neg = controle
negativo - água e Pos = controle positivo, K562).
pGem
BT
pGem
BT
L
BN
CT
BN
FT
FT
FN
CT
CN
CN
Neg
FN
Pos
Neg
L
Pos
pGem
pGem
216pb
212pb
Fig. 19. Amplificação dos produtos de PCR da amelogenina em amostras de baço (B)
e cérebro (C) fixadas em formalina tamponada (T) e não tamponada (N) por 7 dias e
processadas no banhos de xilol e etanol. (L) Ladder amelogenina (pGem = padrão de
peso molecular, Neg = controle negativo - água e Pos = controle positivo, K562).
45
5. DISCUSSÃO
Os dados obtidos neste estudo (tabela 2 e anexo 1) demonstram que as
amostras de baço apresentaram uma maior concentração de DNA extraído,
seguido pelas amostras de fígado e cérebro, respectivamente. Isso se deve ao
fato do baço e o fígado possuírem maior celularidade e tipo de arquitetura
celular diferenciado nestes tecidos (conforme figuras 4 e 5). O cérebro é
composto por células da glia, que apresentam estrutura alongada, ocupam
mais espaço no tecido e, apresentam menor quantidade de núcleos (conforme
figura 6). Assim como afirma Carturan et al (2008) , cada tipo de tecido rende
uma quantidade de DNA específica, mas esta quantidade também está
associada ao método de extração e fixação da amostra. Dos três métodos
testados, o fenol apresentou maior rendimento, seguido pelo kit e pelo Saltingout. Portanto, as amostras de cérebro extraídas pelo método Salting-out foi o
que apresentou os menores índices de DNA extraído.
A ação do tempo de armazenamento das amostras foi analisado pela
observação dos produtos de amplificação pela PCR do gene da β-actina
humana. Foi observado, em gel de agarose 1%, que as amostras armazenadas
por 1 ano e 5 anos apresentaram intensidade de banda menor (conforme
figuras 10-15) quando comparadas com as amostras congeladas e as recentes
parafinadas (conforme figuras 7-9), pelos três métodos de extração. Quanto ao
rendimento e ao grau de pureza do material obtido, não houve diferença
(conforme gráficos 1, 2 e 3) entre os tempos. Desta maneira, podemos obter
quantidade suficiente de DNA para determinada análise, porém a qualidade
pode estar comprometida se utilizarmos amostras parafinadas armazenadas
por mais de 1 ano.
Diversos protocolos de extração têm sido descritos (Greer et al 1991,
Gall et al 1993, Bonin et al 2003, Bonin et al 2005, O´Learly et al 1994, Sato et
al 2001, De Lamballerie et al 1994, Diaz-Cano et al 1997, Bielawski et al 2001,
Chan et al 2001, Andreassen et al 2004, Coombs et al 1999, Duval et al 2010)
a fim de obter DNA de qualidade a partir destas amostras arquivadas. As
variações dos protocolos podem focar em diferentes etapas do processamento,
como a desparafinização, tempo e quantidade da digestão com proteinase K,
purificação pós extração e amplificação pela PCR. O tempo de armazenamento
46
do bloco, a temperatura e a umidade do ambiente onde o bloco está
armazenado podem influenciar na qualidade do DNA. De acordo com vários
autores (Greer et al 1991, Bonin et al 2003, Baloglu et al 2008 ) a etapa mais
crítica para a integridade do DNA é a fixação em formalina. Entretanto, no
nosso estudo e no de Gillio-Tos et al (2007) o processo de inclusão em
parafina tem também uma importante ação na obtenção de DNA amplificável
(conforme demonstrado no estudo de avaliação da qualidade do DNA durante
processo histológico, pág 42-44).
O método convencional utilizado para a purificação do DNA é a técnica
do fenol-clorofórmio, que se baseia na diferença de solubilidade dos ácidos
nucléicos, proteínas e lipídios. A vantagem deste método é que uma maior
quantidade de DNA pode ser obtida, entretanto o procedimento é laborioso,
devido ao número de centrifugações necessárias, manuseio dos reagentes e
toxicidade dos mesmos. Já no método de extração com kit comercial, uma
menor quantidade de DNA é obtida, porém há uma melhor qualidade da
amostra em relação à amplificação. Essa diferença pode ser observada nas
figuras 7 e 8, onde há nitidamente uma amplificação da PCR no kit comercial
em relação à β-actina.
Esses resultados confirmam o estudo de Gilbert et al 2007, onde houve
um maior número de DNA amplificável pela PCR através do kit do que usando
a extração com fenol-clorofórmio. De acordo com o trabalho, supõe-se que os
reagentes do kit possuem propriedades que revertem a ligação entre proteínas
do tecido. Por outro lado, entende-se em nosso estudo e pelo principio da
extração pela sílica que ocorre uma retenção de um DNA com melhor potencial
de amplificação, mesmo em quantidades menores, liberando aqueles que
estejam com as ligações cruzadas.
O DNA extraído através do kit comercial mostrou melhores resultados na
amplificação dos produtos de PCR pelo gene da β-actina e amelogenina,
(figuras 8, 11, 14 e nas figuras 16 e 17 em relação à amelogenina), mesmo
havendo diferença quanto ao grau de pureza em relação aos outros métodos
de extração. Desta maneira, pode-se afirmar que, apesar de se obter menor
quantidade de DNA e purificação não tão eficiente quanto a extração com
fenol, neste método há uma melhor qualidade em relação à amplificação,
comparando-se aos outros tipos de extração.
47
Em amostras com o DNA extraído pelo método Salting-out, o grau de
pureza apresentou resultados muito variados (conforme gráficos 1, 2 e 3).
Surpreeendentemente, houve amplificação do gene da β-actina em 100%
(conforme figuras 9, 12 e 15), porém não houve definição exata de intensidade
de banda se comparado com o DNA extraído por fenol-clorofórmio e kit
comercial (conforme figuras 7, 8, 10, 11, 13 e 15). Esse resultado pode ser
justificado pelo processo de extração em si, em que não há etapas de
purificação da amostra e, portanto, fragmentos inespecíficos podem persistir
durante a reação de PCR. De acordo com Rivero et al 2006, utilizando tecido
de carcinoma oral e tecido inflamatório oral fixadas em formalina 10%
tamponada e os blocos armazenados por até 5 anos foi possível obter DNA de
boa qualidade neste tipo de extração, tanto quanto no método orgânico e de
sílica.
De acordo com os resultados apresentados, a extração de DNA pelo
fenol-clorofórmio apresentou maior quantidade de ácidos nucleicos e maior
grau de pureza. No entanto, trata-se de um método extremamente tóxico e
laborioso, e com custo similar de um kit comercial.
A extração de DNA pelo kit comercial apresentou uma menor quantidade
de ácidos nucleicos e grau de pureza, quando comparado ao método de fenol.
Apesar de ter o mesmo custo que a extração com fenol-clorofórmio, pudemos
obter melhor amplificação de produtos de PCR.
O método de Salting-Out apresentou quantidades de DNA variáveis e
graus de pureza heterogêneos e baixos, porém houve amplificação dos
produtos de PCR em todas as amostras. Trata-se de um método menos
laborioso e com baixo custo, se comparado aos outros métodos estudados.
O laboratório de anatomia patológica do Departamento de Patologia
recebe um grande número de biopsias e representa um importante centro de
diagnósticos, responsável por 33.000 exames anuais (www.unifesp.br/dpato).
Para os exames com finalidade diagnóstica, principalmente os de necropsia,
não há a urgência de um centro cirúrgico. Nossas amostras provenientes
dessas necropsias não apresentam um padrão de processamento histológico
em relação ao tempo de fixação, o que poderia justificar nossos resultados. Em
nosso estudo, a forma de processamento em parafina das amostras pode
interferir nos resultados.
48
Em relação à condição do fixador, não há diferenças quanto à qualidade
e quantidade de DNA em amostras recentes fixadas em formalina 10%
tamponada e não-tamponada (conforme figuras 7-9), mesmo com a diferença
de pH entre as soluções (formalina tamponada com pH 7.0 e formalina nãotamponada com pH 4.0).
Quanto à amplificação dos produtos de PCR, houve amplificação dos
produtos de PCR pelo gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas
(conforme figura 17). Entretanto, nas amostras extraídas com fenol-clorofórmio,
não houve amplificação (conforme figura 16). Os resultados obtidos sugerem
que há uma “amarração” do DNA e ligações cruzadas entre proteínas durante o
processo de fixação e inclusão em parafina, causando maior dificuldade no
processo de amplificação do DNA. Diversos estudos apontam esse mesmo tipo
de problema, onde a análise das amostras pela PCR é somente realizada em
sequências curtas de DNA, raramente excedendo 300pb (Liu et al 1993,
Pavelic et al 1996, Bonin et al 2005, Shi et al 2004, Rivero et al 2006, Ferrer et
al 2007, Baloglu et al 2008, Coombs et al 1999).
O processo de fixação em formalina e a inclusão em parafina pode
comprometer a qualidade do DNA, como mostra as figuras 18 e 19. Nas
amostras que foram apenas fixadas e em seguida submetidas à extração,
houve identificação sexual pelo gene da amelogenina nas amostras de baço,
enquanto que nos tecidos que foram submetidos aos banhos, a identificação
não pôde ser feita. Isso sugere que o processo de desidratação dos tecidos, ao
passar por consecutivos banhos de etanol e xilol também podem afetar a
qualidade do DNA, seja por hidrólise na estrutura dos ácidos nucléicos ou
ligações cruzadas entre proteínas e amarração das histonas.
O uso da biologia molecular no âmbito da patologia é cada vez mais
crescente, e novos métodos de otimização e padronização de amostras para
análise molecular tem sido estudadas. Sabe-se que a condição ideal de uma
amostra para diagnóstico molecular é o congelamento, porém nem todos os
laboratórios possuem fácil acessibilidade na coleta de material fresco de
biópsias e/ou autopsias. Por isso, ao analisar molecularmente amostras
parafinadas, que já fazem parte da rotina de patologia, é importante considerar
o tipo de tecido, a condição de fixação e inclusão em que a amostra foi
processada e estudar qual o melhor método de extração para este caso.
49
Desta maneira, a escolha do método de extração deve ser direcionada
pelo tipo de análise molecular. Recomenda-se a utilização de mais de um tipo
de extração para a obtenção de um bom rendimento e boa qualidade de DNA.
Uma possibilidade seria a utilização do fenol-clorofórmio com kit comercial. Por
outro lado, um equilíbrio entre custo e interesse do material em estudo deve
também ser considerado.
50
Considerando os objetivos propostos:
1. Os tecidos normais coletados durante os procedimentos de necropsia
apresentam
quantidades
de
DNA
suficientes
após
a
extração.
São
teoricamente viáveis para estudos moleculares. O baço e o fígado
apresentaram o maior rendimento em relação a extração de DNA comparado
ao cérebro. Os resultados obtidos estão de acordo com sua estrutura celular,
apesar da variabilidade entre indivíduos, as amostras e os cortes das amostras.
2.
Todos os tecidos coletados no processo de necropsia (baço, fígado e
cérebro FFEP) arquivados por 1 e 5 anos apresentam condições de extração
de DNA.
Além da fixação em formalina, o tempo de armazenamento dos
blocos de parafina influenciou na qualidade do DNA extraído. Por outro lado, o
processo de inclusão em parafina também é um fator a ser considerado quanto
à análise dos ácidos nucleicos.
3. A extração de DNA pelo método orgânico (fenol-clorofórmio) rendeu maior
quantidade de ácidos nucleicos e pureza em relação aos outros métodos
estudados. Porém, o método de sílica mostrou resultados consistentes quanto
à amplificação do DNA obtido. O método utilizando sais (Salting-out)
apresentou resultados positivos de extração e amplificação, embora com muito
variável (não consistentes).
4. Foi possível a identificação do sexo através da amplificação por PCR do
gene da amelogenina nas amostras fixadas em formalina e incluídas em
parafina, analisadas em gel de agarose.
51
6. CONCLUSÃO
Os tecidos normais coletados durante os procedimentos de necropsia
apresentam
quantidades
de
DNA
suficientes
após
a
extração.
São
teoricamente viáveis para estudos moleculares. Além da fixação em formalina,
o tempo de armazenamento dos blocos de parafina influenciou na qualidade do
DNA extraído. Por outro lado, o processo de inclusão em parafina também é
um fator a ser considerado quanto à análise dos ácidos nucleicos. O método
por kit comercial mostrou resultados consistentes e reprodutíveis quanto à
amplificação do DNA obtido. Desta maneira, a escolha do método de extração
deve ser direcionada pelo tipo de análise molecular.
Considerações finais:
Percebe-se a importância e a necessidade da elaboração de protocolos
adequados de fixação e processamento de amostras na área da Patologia,
para novos estudos que envolvam ferramentas da Biologia Molecular, como a
amplificação pela PCR e a análise pelo sequenciamento.
7. ANEXOS
Anexo 1. Concentração de DNA (ng/µl/cm²), grau de pureza (A260/A280), grau de contaminação orgânica (A260/A230) e grau de
impurezas (340 raw) em todas as amostras analisadas.
Identificação
da amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Tipo de
Extração
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
Tecido
utilizado
1
1
1
1
1
1
3
3
3
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
Tempo
do bloco
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
Caso
(indivíduo)
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
156,98
20,8
2,83
277,68
7,5
5,07
140,94
4,68
17,38
213,99
23,73
3,66
149,82
14,07
5,24
341,55
23,36
8,95
328,82
27,18
16,09
228,74
12,95
Leitura
A260/A280
1,72
2
1,56
1,79
2,22
1,28
1,66
15,57
1,38
1,75
1,77
1,3
1,66
2,02
1,69
1,79
1,84
1,38
1,8
1,87
1,51
1,76
1,99
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
2,03
0,83
2,23
2,04
0,25
0,76
1,84
0,24
0,58
1,94
0,66
0,54
1,76
0,63
0,78
2,05
0,76
0,52
2,1
0,99
1,04
1,82
0,56
Leitura
340 raw
0,005
0,004
-0,007
0,06
0,035
0,034
0,012
0,022
0,298
0,03
0,188
-0,01
0,036
0,004
0
0,016
0,062
0,972
0,038
-0,004
0,084
0,024
-0,013
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
Tipo de
Extração
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
1
2
2
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Tecido
utilizado
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
2
1
2
1
2
3
3
3
2
2
2
3
3
3
2
2
2
Tempo
do bloco
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
Caso
(indivíduo)
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
8
8
8
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
8,69
523,3
82,97
2,2
523,3
82,97
60,13
43,02
21,41
2,59
399,33
180,41
23,32
46,32
5,08
1,67
66,08
19,23
7,22
141,37
21,95
8,54
140,37
4,54
3,49
409,29
36,19
3,18
Leitura
A260/A280
2,03
1,86
1,96
0,79
1,86
1,96
1,65
1,7
2,48
0,77
1,79
1,78
1,69
1,7
1,47
1,06
1,65
1,8
1,31
1,72
2,13
1,19
1,67
3,61
0,77
1,85
1,86
0,94
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,85
1,93
1,51
0,32
1,93
1,51
0,69
1,63
0,77
0,35
2,02
2
0,54
1,19
0,72
-0,52
1,81
0,75
0,53
1,9
0,9
0,66
1,9
0,24
0,35
1,94
1,07
0,36
Leitura
340 raw
-0,001
0,24
0,025
-0,002
0,24
0,025
0,769
-0,006
0,031
0,017
0,086
0,048
0,007
-0,065
-0,03
-0,38
0,006
-0,01
0,016
0,008
-0,001
0,017
0,01
0
0,017
0,022
0,013
-0,189
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
Tipo de
Extração
1
1
2
2
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
3
3
1
2
1
2
Tecido
utilizado
1
2
1
2
1
2
3
3
3
2
2
2
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
Tempo
do bloco
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
Caso
(indivíduo)
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
10
10
10
10
10
11
11
11
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
308,43
361
21,49
10,73
10,08
31,53
247,9
10,93
10,49
143,88
33,73
2,74
204,69
30,02
1,85
244,74
6,39
2,48
112,6
23,53
407,83
24,29
12,46
1,69
293,08
23,76
512,27
37,28
Leitura
A260/A280
1,77
1,78
1,7
2,06
1,32
1,71
1,78
1,91
1,39
1,67
1,73
1,01
1,76
1,79
2,29
1,82
1,95
0,71
1,7
2,2
1,87
1,8
1,44
1,05
1,8
1,98
1,87
1,7
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
2,04
1,99
0,71
0,37
0,5
0,96
1,96
0,42
0,89
1,91
0,98
0,53
2
0,94
-4,02
2,06
0,3
0,55
1,71
0,91
1,97
0,83
0,66
-0,97
1,95
0,62
2,07
0,62
Leitura
340 raw
0,02
0,002
0,025
-0,014
0,057
1,843
0,039
0,016
-0,019
0,019
0,014
0,024
0,124
0,017
0,027
0,031
-0,001
0,007
0,628
0,009
0,017
-0,01
0,148
0,073
0,012
0,005
0,055
-0,002
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
Tipo de
Extração
1
2
3
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
Tecido
utilizado
3
3
1
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
2
2
2
1
1
1
2
2
Tempo
do bloco
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
5 anos
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
Caso
(indivíduo)
13
13
13
13
13
14
14
14
15
15
15
16
16
16
16
16
16
17
17
17
17
17
17
18
18
18
18
18
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
103,78
20,8
15,87
62,92
19,7
174,47
4,74
6,84
157,55
11,61
7,08
1258,64
19,16
3,47
1397,35
18,84
10,3
1705,32
5,15
12,25
1714,2
11,6
21,59
1634,91
4,58
26,89
1678,57
6,14
Leitura
A260/A280
1,75
2
1,46
1,77
1,59
1,73
3,38
1,34
1,69
1,77
1,32
1,59
1,67
1,09
1,54
1,82
1,61
1,61
1,68
1,36
1,63
1,23
1,34
1,55
1,42
1,55
1,54
1,56
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
1,82
0,83
0,65
1,63
1,82
1,9
0,17
0,73
1,77
0,44
0,57
1,96
0,61
1,42
1,96
0,73
0,76
1,98
0,24
0,39
2
0,38
0,45
1,97
0,21
0,79
1,95
0,23
Leitura
340 raw
-0,002
0,004
0,05
0,036
0,096
0,008
0,027
0,022
0,024
-0,03
0,052
0,541
0,026
-0,007
0,116
0,036
0,059
-0,07
0,012
0,065
-0,078
0,025
0,133
0,013
0,029
0,98
1,258
0,029
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
Tipo de
Extração
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
1
2
Tecido
utilizado
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
2
2
1
3
3
3
1
1
1
3
3
3
2
2
3
Tempo
do bloco
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
Caso
(indivíduo)
18
18
18
18
19
19
19
19
19
19
19
19
19
20
20
20
20
20
20
21
21
21
21
21
21
22
22
22
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
3,39
2370,58
5,31
3,12
1684,94
15,18
3,61
1173,35
9,78
15,93
3143,43
8,28
10,35
1507,19
13,28
15,18
239,22
5,57
2,94
295,3
34,03
13,56
68,85
10,69
1,34
24,54
407,98
4,9
Leitura
A260/A280
1,26
1,54
1,49
1,64
1,59
1,44
1,11
1,61
2,39
1,92
1,64
1,5
1,53
1,58
1,4
1,58
1,74
1,61
1,73
1,81
1,77
1,42
1,6
2,12
0,68
1,62
1,77
1,64
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,38
2,06
0,17
0,29
2,01
0,49
0,43
1,95
0,44
1,12
2,19
0,3
0,88
1,99
0,4
0,73
1,93
0,16
0,46
2,03
0,99
0,45
1,75
0,36
0,43
0,59
1,96
0,19
Leitura
340 raw
-0,01
0,011
0,033
0,112
1,488
0,102
0,096
0,027
0,001
0,075
-0,066
0,074
0,024
-0,022
0,035
0,087
0,096
0,04
0,022
0,06
0,01
0,273
0,028
0,008
-0,008
0,065
0,076
0,03
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
Tipo de
Extração
3
1
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
3
3
1
1
2
2
1
1
1
2
3
3
3
2
2
1
Tecido
utilizado
2
3
3
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
3
2
3
2
3
1
2
3
1
1
2
3
2
3
1
Tempo
do bloco
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
Caso
(indivíduo)
22
22
22
23
23
23
23
23
23
24
24
24
24
24
24
24
24
24
25
25
25
25
25
25
25
25
25
26
Tipo de
fixação
-
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
7,34
202,6
3,73
260,5
11,22
3,88
135,72
8,73
12,11
197,33
11,1
10,99
4,72
6,09
102,84
180,6
27,81
6,78
147,41
196,95
161,53
6,16
26,81
9,42
11,19
5,25
4,25
1490,39
Leitura
A260/A280
1,66
1,73
1,56
1,7
1,77
1,47
1,65
1,71
1,15
1,74
2,07
1,48
1,75
1,24
1,64
1,68
1,82
2,38
1,67
1,63
1,68
2,37
1,6
1,7
1,38
1,97
1,55
1,46
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,51
1,9
0,36
2,02
0,36
0,46
1,85
0,24
0,49
1,93
0,45
0,65
0,42
0,49
1,86
1,86
0,9
0,33
1,84
1,87
1,88
0,23
0,6
0,85
0,42
0,14
0,15
1,95
Leitura
340 raw
0,045
0,03
-0,124
0,052
0,013
0,006
-0,037
0,049
0,263
0,033
0,016
0,015
0,316
0,002
0,02
0,037
0,069
-0,004
0,03
0,051
0,012
0,051
0,366
0,055
0,075
0,091
0,114
0,011
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
Tipo de
Extração
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
1
2
3
2
3
1
1
2
3
2
Tecido
utilizado
1
1
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
3
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
Tempo
do bloco
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
1 ano
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
26
26
27
27
27
27
27
27
27
27
27
28
28
28
28
28
28
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
29
Tipo de
fixação
1
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
10,91
8,62
452,79
2,81
38,64
344,09
5,34
13,55
184,2
11,48
12,28
248,42
18,15
5,31
246,58
5,6
2,36
242,32
314,61
16,58
58,47
3,42
27,87
236,63
205,04
8,61
5,96
6,44
Leitura
A260/A280
1,71
1,49
1,82
3,69
1,46
1,75
1,82
1,64
1,68
1,88
1,55
1,75
1,68
1,49
1,77
1,99
1,67
1,82
1,85
1,86
1,88
1,68
1,8
1,78
1,79
1,58
2,62
1,9
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,37
0,79
1,97
0,13
0,72
1,92
0,15
0,65
1,87
0,46
0,86
1,92
0,52
0,52
1,87
0,23
0,33
2,05
2,05
0,68
1,62
0,19
1,44
1,88
1,94
0,33
0,61
0,31
Leitura
340 raw
0,003
0,028
0,08
-0,012
0,144
0,085
0,063
0,273
0,067
0,013
0,189
0,06
0,229
-0,006
0,071
0,008
-0,001
0,091
0,048
0,014
0,071
0,014
0,042
0,02
0,012
0,07
0,028
0,054
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
Tipo de
Extração
3
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
2
2
2
Tecido
utilizado
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
29
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
31
31
31
31
31
31
31
31
31
Tipo de
fixação
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
5,43
166,11
73,13
431,88
352,58
278,47
401,28
11,44
39,22
3,42
4,56
23,99
18,42
3,88
23,73
67,73
13,07
3,73
4,55
263,61
173,47
157,36
125,54
22,64
23,22
15,13
17,67
9,11
Leitura
A260/A280
2,55
1,74
1,74
1,85
1,86
1,81
1,85
1,76
1,91
1,66
3,49
1,83
1,75
2,49
1,44
1,82
1,78
2,19
1,72
1,85
1,83
1,85
1,81
1,79
1,7
1,45
1,87
2,37
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
1,28
1,82
1,82
2,04
2,12
1,89
2,05
0,37
1,05
0,15
0,2
0,73
0,58
6,74
0,51
1,48
1,08
0,72
0,7
2,14
2,15
2,17
2,11
1,61
1,7
0,45
0,55
0,39
Leitura
340 raw
-0,7
0,044
0,044
0,093
0,047
0,08
0,08
0,036
0,056
0,052
0,046
0,045
0,139
0,608
0,104
0,114
-0,001
0,004
-0,012
0,103
0,013
0,05
-0,011
-0,013
-0,009
0,094
0,056
0,04
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
Tipo de
Extração
2
2
2
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
Tecido
utilizado
2
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
31
31
31
31
31
31
31
31
31
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
Tipo de
fixação
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
16,57
5,24
7,67
7,46
21,02
18,29
38,91
7,5
3,16
300,15
263,23
2399,55
488,4
306,75
530,64
50,72
99,58
395,04
20
22,4
23,99
31,79
49,1
118,65
4,35
3,75
6,8
7,73
Leitura
A260/A280
1,84
1,51
1,66
1,67
1,49
1,77
1,85
1,63
0,85
1,73
1,7
1,82
1,82
1,77
1,77
1,65
1,56
1,86
1,89
1,76
2
1,83
1,84
1,9
1,6
1,78
2
1,33
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,54
0,19
0,25
0,84
0,55
1,26
1,58
0,68
-2,07
1,9
1,88
1,93
1,95
1,97
1,65
1,69
1,75
1,74
0,57
0,65
0,71
0,83
1,11
1,45
0,16
0,17
0,23
0,32
Leitura
340 raw
0,038
-0,027
0,034
-0,004
0,825
0,053
0,023
-0,004
-0,091
0,114
0,023
0,676
0,102
0,048
0,726
-0,011
0,01
0,033
0,009
0,023
0,021
0,012
0,065
0,053
0
0,003
0,043
-0,021
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
261
262
263
264
265
266
267
268
269
270
271
272
273
274
275
Tipo de
Extração
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
1
1
Tecido
utilizado
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
3
3
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
32
32
32
32
32
32
32
32
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
33
34
34
Tipo de
fixação
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
10,11
50,79
10,97
13,32
45,84
1,49
3,08
132,78
381,17
61,03
216,06
120,05
21,67
90,54
28,07
23,78
20,75
37,72
8,9
10,08
2,55
4,25
5,46
2,04
9,1
3,9
185,34
151,12
Leitura
A260/A280
1,25
1,49
1,73
1,45
1,18
2,2
2,07
1,43
1,86
1,68
1,81
1,7
1,61
1,63
1,72
1,72
1,75
1,8
1,46
1,46
2,13
1,58
2,33
1,63
1,4
3,91
1,72
1,64
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,31
0,55
1,24
0,44
0,38
-0,3
0,44
0,54
1,84
1,51
2,03
1,73
1,36
1,66
0,84
0,7
0,64
0,97
0,35
0,36
-0,42
0,26
0,79
0,41
0,34
0,8
1,85
1,74
Leitura
340 raw
0,045
0,635
0,133
0,003
0,971
0,014
0,003
3,803
0,022
-0,284
-0,033
-0,061
-0,078
-0,063
-0,01
0,007
-0,003
0,054
0,006
-0,01
0,099
0,008
-0,076
-0,057
0,276
0,189
-0,058
-0,029
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
276
277
278
279
280
281
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
Tipo de
Extração
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
Tecido
utilizado
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
3
3
3
1
1
2
2
3
3
3
1
1
2
2
3
3
3
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
34
34
34
34
34
34
34
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
Tipo de
fixação
3
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
3
1
2
1
2
1
2
3
1
2
1
2
1
2
3
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
421,49
9,08
17,77
5,65
9,57
12,72
154,13
74,91
237,85
127,26
166,33
56,58
60,32
841,93
10,27
11,94
10,15
25,87
6,95
12,37
8,52
6,45
3,9
10,97
10,12
8,97
2,28
190,9
Leitura
A260/A280
1,9
1,35
1,61
1,68
1,34
1,99
1,38
1,69
1,72
1,65
1,67
1,61
1,57
1,53
1,43
1,6
1,57
1,75
1,19
1,51
1,51
1,32
3,91
1,69
1,91
1,76
0,98
1,32
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
1,81
0,3
0,55
0,22
0,33
1,2
0,58
1,69
1,73
1,78
1,76
1,72
1,61
1,09
0,27
0,42
0,31
0,78
0,22
0,41
0,46
0,38
0,8
0,66
1,19
0,77
0,26
0,52
Leitura
340 raw
0,009
-0,06
0,026
0,009
-0,014
-0,032
6,509
-0,055
-0,045
-0,06
-0,061
-0,063
-0,073
0,986
0,347
0,019
0,021
0,005
-0,002
0,026
0,531
-0,052
0,189
-0,002
-0,044
4,35
-0,091
7,646
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
304
305
306
307
308
309
310
311
312
313
314
315
316
317
318
319
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
331
Tipo de
Extração
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
2
3
1
1
1
2
2
2
3
Tecido
utilizado
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
37
37
37
37
37
37
37
Tipo de
fixação
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
3
3
3
1
2
3
1
2
3
1
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
487,33
338,5
2138,7
8,15
51,45
171,18
16,62
16,53
48,46
389,93
350,14
447,26
3,99
15,7
183,18
12,69
7,39
42,93
699,6
14,65
320,53
536,59
388,71
1918,07
57,99
56,82
157,45
7,23
Leitura
A260/A280
1,89
1,8
1,64
3,42
1,92
1,76
1,67
1,43
1,34
1,87
1,81
1,66
2,33
1,84
1,79
1,71
1,31
1,36
1,6
1,45
1,34
1,91
1,82
1,73
2,03
1,9
1,76
1,96
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
1,9
1,97
1,24
0,21
1,06
1,23
0,66
0,5
0,6
1,91
1,87
1,44
0,09
0,38
1,4
1,05
0,47
0,46
1,62
0,21
0,47
1,94
1,85
1,4
1,15
1,24
1,17
-3,82
Leitura
340 raw
0,022
-0,018
3,965
-0,042
0,07
0,316
-0,06
0,174
6,401
0,031
0,005
1,751
-0,028
0,405
0,253
-0,045
0,127
0,851
0,607
0
46
0,018
0,006
2,388
0,021
0,054
0,1
0,514
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
350
351
352
353
354
355
356
357
358
359
Tipo de
Extração
3
3
1
1
1
2
2
2
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
Tecido
utilizado
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
38
38
38
38
38
38
38
38
Tipo de
fixação
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
8,37
99,32
298,55
507
452,04
50,86
70,4
58,38
154,28
255,62
462,77
23,65
22,85
15,26
9,96
1,46
56
0,61
1,96
185,99
358,63
239,2
380,79
522,46
383,07
395,11
330,78
409,26
Leitura
A260/A280
1,65
1,48
1,8
1,92
1,73
1,97
1,95
1,76
1,66
1,74
1,95
1,96
1,96
1,52
1,88
0,98
1,6
0,52
2,64
1,28
1,84
1,75
1,75
1,89
1,86
1,77
1,84
1,91
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
-10,22
0,46
1,95
1,96
1,46
1,13
1,44
0,8
1,66
1,84
1,3
0,71
0,66
0,33
-6,02
-0,24
0,58
-0,11
-0,41
0,41
1,91
1,81
1,33
1,92
1,87
1,32
1,84
1,84
Leitura
340 raw
-0,002
2,946
0,025
0,035
1,147
0,012
0,059
0,039
-0,021
0,024
0,512
0,041
0,159
0,799
0,048
0,01
1,1
-0,014
0,007
2,3
0,053
0,014
0,272
0,033
0,009
0,291
0,002
0,006
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
Tipo de
Extração
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tecido
utilizado
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
38
39
39
39
39
39
39
39
39
39
Tipo de
fixação
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
243,44
43,68
37,9
72,5
18,53
5,87
92,55
12,72
6,88
5,22
2,96
7,7
41,97
65,95
2,84
62,64
0,29
0,8
183,49
585,24
512,84
956,04
470,66
508,74
594,22
275,16
345,28
405,6
Leitura
A260/A280
1,49
1,97
1,89
1,81
1,81
2,68
1,8
1,7
1,44
1,44
1,59
1,31
1,29
1,72
1,45
1,36
-0,7
0,63
1,37
1,92
1,91
1,55
1,89
1,91
1,65
1,75
1,83
2,12
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,77
0,99
1
1,05
0,59
0,13
1,32
0,4
0,29
0,19
-0,68
2,06
0,41
1,75
-0,76
0,45
-0,04
-0,15
0,52
1,8
1,83
0,78
1,97
1,92
1,19
1,81
1,83
1,83
Leitura
340 raw
0,71
0,033
0,024
0,074
0,049
0,07
0,021
0,014
-0,134
0,181
-0,016
0,166
2,39
0,073
-0,026
2,628
-0,014
-0,015
5,757
0,216
0,097
5,222
0,062
0,034
1,084
0,077
0,004
0,007
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
388
389
390
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
411
412
413
414
415
Tipo de
Extração
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
3
3
1
2
3
1
Tecido
utilizado
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
40
40
40
40
40
40
41
41
41
42
Tipo de
fixação
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
3
3
3
3
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
16,59
43,66
152,41
29,54
10,03
156,92
1,06
2,86
7,9
13,86
8,83
73,16
2,48
3,46
113,14
0,18
0,17
190,04
449,92
372,39
29,68
21,69
6.95
38,97
448,12
16,2
52,32
464,47
Leitura
A260/A280
2,05
1,89
1,72
1,63
2,18
1,85
-0,005
5,22
1,43
1,49
1,7
1,53
1,05
1,58
1,59
0,18
1,24
1,34
1,91
1,84
1,83
2,09
1,49
1,64
1,91
1,55
1,39
1,94
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,29
0,86
0,83
1,2
0,2
1,97
-4,5
0,21
0,31
0,86
2
0,54
-0,72
-1,38
0,76
-0,03
-0,03
0,51
1,88
1,87
0,88
0,69
10,67
1,44
1,74
0,33
0.52
1,89
Leitura
340 raw
0,732
0,528
0,813
0,047
-0,016
0,089
-0,063
-0,001
-0,015
0,366
0,329
0,847
0,951
-0,027
6,544
-0,016
-0,012
8,013
0,029
0,026
0,034
0,01
-0,024
0,156
0,033
2,023
1,952
-0,017
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
416
417
418
419
420
421
422
423
424
425
426
427
428
429
430
431
432
433
434
435
436
437
438
439
440
441
442
443
Tipo de
Extração
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
Tecido
utilizado
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
2
2
2
1
1
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
42
42
43
43
43
43
43
43
43
43
43
44
44
44
45
45
45
45
45
45
46
46
46
46
46
46
47
47
Tipo de
fixação
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
13,58
1,7
1867,47
49,96
45,06
520,57
81,85
172,24
865,68
9,79
74,69
696,93
22,14
189,25
1866,41
48,71
70,2
659,8
195,81
131,73
1480,25
28,46
16,72
588,36
62
19,86
384,18
214,87
Leitura
A260/A280
1,97
0,95
1,66
1,83
1,4
1,61
1,77
1,46
1,65
1,84
1,59
1,42
1,52
1,38
1,59
1,77
1,45
1,59
1,9
1,54
1,74
1,96
1,42
1,61
1,97
1,42
1,95
1,89
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,43
0,33
1,05
1,07
0,5
1,33
1,19
0,63
1,71
0,33
0,72
0,92
0,53
0,49
1,07
0,54
0,61
0,88
1,78
0,66
1,78
0,59
0,53
1,4
0,18
0,43
1,78
1,67
Leitura
340 raw
0,045
-0,029
3,358
0,051
1,175
1,161
0,158
2,47
0,215
-0,024
0,917
5,177
0,156
4,871
3,015
0,045
1,029
3,843
0,029
2,812
0,013
0,031
0,834
0,099
0,015
0,426
0,027
0,192
Continuação - Anexo 1
Identificação
da amostra
444
445
446
447
448
449
450
Tipo de
Extração
3
1
2
3
1
2
3
Tecido
utilizado
1
2
2
2
2
2
2
Tempo
do bloco
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Caso
(indivíduo)
47
47
47
47
48
48
48
Tipo de
fixação
3
3
3
3
3
3
3
Concentração
de DNA (ng/µl/cm³)
5,78
696,67
295,62
3,98
484,62
288
6,95
Leitura
A260/A280
1,1
1,72
1,89
1,07
2,1
1,88
1,34
Tipo de extração: 1- fenol-clorofórmio; 2- kit comercial e 3- Salting-Out
Tecido utilizado: 1- baço; 2- fígado e 3- cérebro;
Tipo de fixação: 1- formalina tamponada; 2- formalina não-tamponada e 3- tecido congelado
Leitura
A260/A230
0,49
1,69
2
0,65
1,9
2,07
0,44
Leitura
340 raw
0,101
0,054
-0,015
0,02
0,034
0,042
0,765
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ABSTRACT
Formalin fixed and paraffin embedded tissues provide valuable retrospective
investigations for molecular studies, especially for genetic studies, when the
DNA is not available in fresh and/or frozen samples. However, according to
some authors, is difficult to obtain a DNA of good quality, since the fixation
process results in nucleic acids fragmentation. The aim of this study was to
evaluate the DNA extracted from paraffin embedded tissues, after 1 and 5 years
of storage, by 3 methods of extraction. For this, the gene of β-actin (136pb)
were used, to detect the viability and DNA fragmentation, and the gene of
amelogenin (X: 212pb e Y: 218pb) for sexual differentiation and viability in
primers with greater length. The study involved 12 recent autopsy cases, where
samples of liver (n=10), spleen (n=10) and brain (n=10) were collected in
duplicate, which one group followed to the process of fixation and inclusion and
the other group followed to freezing. Moreover, the same kind of tissues, normal
(n=10 each), from 13 autopsy cases archived for 1 year and 15 cases archived
for 5 years were used. After paraffin remove, the samples were submitted to
DNA extraction with commercial kit (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out and
phenol-chlorophorm. The DNA extracted was quantified in Nanodrop® and
adjusted for PCR (10ng/µl). The PCR products were visualized in agarose gel
1%. The samples of spleen and liver showed more yield in DNA extraction than
the brain samples, in all the times. All the samples archived showed good
extraction conditions, however should take in consideration the fixation and
embedded process, which could compromise the DNA quality. The extraction
by phenol-chloroform yielded more DNA quantity and purity than the other
methods. However, the commercial kit extraction showed better results in DNA
amplification. The primer of the gene of amelogenin was amplified in all utilized
samples, however recommends the utilization of smaller primers for a complete
analyze of the fragment studied.