Identificação de herpes vírus humano (Tipos 1-8)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Centro de Ciência da Saúde
Faculdade de Odontologia
Departamento de Odontopediatria e Ortodontia
RENATA ALVES OTERO
IDENTIFICAÇÂO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1-8)
NA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO
HIV
Rio de Janeiro
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Centro de Ciência da Saúde
Faculdade de Odontologia
Departamento de Odontopediatria e Ortodontia
RENATA ALVES OTERO
IDENTIFICAÇÂO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1-8)
NA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO
HIV
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Odontologia
(Odontopediatria),
Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção
do
título
de
Mestre
em
Odontologia
(Odontopediatria).
Orientadores:
Prof. Dra. Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro
Prof. Dra. Norma Suely de Oliveira Santos
Rio de Janeiro
2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Otero, Renata Alves
Identificação de Herpes Vírus Humano (Tipos 1-8) na cavidade oral de crianças
infectadas pelo HIV / Renata Alves Otero– Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Odontologia,
2011.02, 61 f.
Orientadores: Gloria Fernanda Barbosa Araújo Castro e Norma Suely de Oliveira
Santos
Dissertação (Mestrado) – UFRJ / Faculdade de Odontologia, 2011.
Referências Bibliográficas: 45-49
1. Herpes Vírus Humano. 2. Infecção pelo HIV. 3. Imunossupressão. – Tese. I.
Castro, Glória Fernanda Barbosa de Araújo. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Odontopediatria).
IV. Identificação de Herpes Vírus Humano (tipos 1-8) na cavidade oral de crianças infectadas
pelo HIV.
iii
F O L H A D E A P R O V AÇ Ã O
R E N AT A AL V E S O T E R O
“IDENTIFICAÇÂO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1-8) NA SALIVA DE
CRIANÇAS INFECTADAS PELO HIV”.
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Odontologia (Odontopediatria), Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do
Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Odontologia (Odontopediatria).
Rio de Janeiro, 01 de Fevereiro de 2011.
_________________________________________________________
Profa. Dra. Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro
DO - Profa. Adjunto do Depto de Odontopediatria e Ortodontia – FO/UFRJ
_________________________________________________________
Profa. Dra. Norma Suely de Oliveira Santos
DO - Profa. Associada do Depto de Microbiologia – CCS/UFRJ
_________________________________________________________
Prof. Rogério Gleiser
DO - Prof. Adjunto do Depto de Odontopediatria e Ortodontia - FO/UFRJ
_________________________________________________________
Profa. Dra. Maria Teresa Villela Romanos
DO - Profa Adjunto de Microbiologia - CCS/UFRJ
iv
DEDI CATÓRI A
AO
MEU PAI
LUIZ CARLOS,
QUE ME APOIOU DURANTE TODA A MINHA
TRAJETÓRIA ESCOLAR, SEM NUNCA MEDIR ESFORÇOS PARA ME DAR UMA
EDUCAÇÃO DE QUALIDADE, PERMITIDO QUE EU VIESSE A CAMINHAR
SOZINHA.
DEDICO
À CONQUISTA DESSE SONHO A VOCÊ, QUE SEMPRE
ACREDITOU EM MIM, INDEPENDENTE DO DESAFIO A SUPERAR.
AMO VOCÊ!
v
AGRADECIMENTOS
Á Deus por estar sempre comigo.
Aos meus pais Luiz Carlos e Regina Celi sem os quais minha vida não teria
sentido, pois nenhuma conquista seria possível sem o incentivo de vocês. Obrigada
por acreditarem em mim. Obrigada pelo amor incondicional. Obrigada por TUDO.
Amo Muito Vocês!!!
Aos meus avós Elza e Quilvio (in memorian) por toda a ternura que sempre
demonstraram nos mais simples gestos. Vocês são grandes exemplos para a minha
vida e dizer apenas obrigada não seria suficiente por tudo o que fizeram por mim.
Amo Vocês!
Aos meus irmãos Rodrigo e Rafael pela amizade de uma vida inteira. A
vocês, que fazem parte da minha história, que alegram a minha vida e se alegram
com minhas conquistas, um obrigada muito especial.
As minhas sobrinhas Gabriela, Martina e Julia pela alegria que me
proporcionam a cada gesto de carinho, pela responsabilidade de serem minhas fãs o
que me impulsiona a querer sempre mais. Obrigada por sempre torcerem por mim!
Tia “Tata” Ama Vocês!
Ao meu marido Bruno, meu grande amigo e incentivador nessa trajetória.
Obrigada por sempre acreditar em mim, por sonhar esse sonho junto comigo, pois
sem a sua ajuda, a realização desse sonho não seria possível. Amo Você
Eternamente!!!
A todos os meus tios e tias, em especial minha tia “Maleni”, querida por toda
a minha vida.
A prima Aninha por sempre cuidar com carinho do meu sorriso, pelo exemplo
de dedicação profissional, sendo o meu espelho no momento da escolha pela
odontologia. Muito Obrigada pelo incentivo! Primos e primas obrigada pelo carinho!
vi
Aos meus padrinhos André e Andréia, por estarem comigo nos momentos
mais importantes da minha vida. Vocês são grandes exemplos pra mim!
A minha grande amiga Brena por estar ao meu lado durante toda a minha
caminhada, da infância a vida adulta. Você faz parte das minhas melhores
recordações! Amigas de infância, amigas de profissão, amigas Sempre!!!
As minhas amigas Renata, Thaís, Luciana e Ana Catarina, que permitiram
que aos poucos eu fosse fazendo parte de suas vidas e me tornando suas grandes
amigas. Obrigada por estarem ao meu lado desde a adolescência e se tornarem
grandes exemplos pra mim.
Aos meus grandes amigos da graduação Mariana, Natália, Fernanda, Beth e
Vicente que estiveram comigo durante os anos mais gostosos da minha vida e até
hoje me acompanham, me incentivam e vibram com minhas conquistas.
Ao amigo Dennis Carvalho por me incentivar a dar um passo maior quando
ainda era aluna da especialização. Obrigada pelos ensinamentos de forma
descontraída no laboratório!!!
À Profª. Dr.ª Gloria Fernanda que me orientou nessa caminhada de forma
paciente e carinhosa, tornando-se uma orientadora-mãe. Obrigada por me incentivar
e acreditar em mim. Agradeço também pela disponibilidade de tempo, por todos os
ensinamentos e por me ajudar quando não era capaz, para que na próxima vez
pudesse fazer sozinha. Faço minhas as palavras da Raquel: “Você é a Melhor !!!
Ao Profa. Norma Suely apesar do pouco tempo de convívio pude aprender
muito com você. Obrigada por todos os ensinamentos e por acreditar em mim para
que esse trabalho pudesse ser realizado.
À Profª. Dr.ª Ivete Pomarico Ribeiro de Souza exemplo de profissional
competente, obrigada por todos os ensinamentos, pela disponibilidade e pelo
carinho demonstrado ao longo desses três anos. Obrigada pela oportunidade!
À amiga Flávia Nascimento por toda ajuda durante esses dois anos de
mestrado. Sem você, seria muito mais difícil. Obrigada por tudo!
vii
Aos amigos do LAVIREO, obrigada por me “apresentar” todo o laboratório,
pela paciência de me ensinar muitas coisas, por mais simples que pudessem ser e
pela disponibilidade de tempo na ajuda das análises das amostras. Muito Obrigada!
Aos queridos professores Rogério Gleiser, João Farinhas, Eduardo,
Marcelo Costa, Thomaz, Luciane Maia, Maristela Portela e Laura Primo,
obrigada por sempre me incentivar a crescer e a melhorar! Vocês são grandes
exemplos pra mim e têm um lugar muito especial no meu coração. Muito Obrigada!
As queridas amigas de turma Adílis, Camila e Ticiana, por fazerem
intensamente parte desses dois anos de mestrado. Obrigada por entrarem na minha
vida e compartilharem seus conhecimentos comigo. Aprendi muito com vocês!
Agradeço também pela amizade, carinho, preocupação e por me ajudarem quando
era preciso. Espero que nossa amizade seja eterna. Amo Vocês!
Aos amigos de mestrado Andréia, Daniela, Luciana e Yedda pela amizade e
carinho. Daqui a pouquinho são vocês!!!
Às doutorandas Ana Karla, Viviane Pierro, Patrícia, Lívia, Márcia, Valéria,
Viviane pelo carinho e incentivo.
Á doutoranda Carla Martins um obrigada muito especial, por acompanhar a
minha trajetória na odontopediatria desde a especialização, sempre me incentivando
e torcendo por mim.
Ás companheiras do projeto SIDA Cristiana e Raquel, obrigada pela
amizade, ajuda e incentivo, principalmente no momento das coletas. Sem vocês não
seria possível!
Aos amigos Tatiana e Rafael, pela amizade que começou lá atrás, ainda na
graduação e por estarem por perto quando ainda dava os primeiros passos no
mestrado. Obrigada meu M2!
Ao João por toda a tranqüilidade quando a nossa vontade é jogar o
computador pela janela. Obrigada pela ajuda constante!
viii
Às queridas Mary, Andréa, Gina e Kátia pelo companheirismo durante os
atendimentos na clínica e pelos vários momentos de alegrias proporcionados.
Obrigada pela amizade!
Às queridas Isabel, Bruna e Rose pela amizade, carinho e bons momentos
durante o nosso convívio.
Ao Robson, Zezé, Luiza, Ednaldo e Jorge pela amizade e momentos de
descontração.
À
Natália
e
Gabriela,
companheiras
do
projeto
SIDA/AIDS
em
Odontopediatria, por toda colaboração, paciência e dedicação. Muito obrigada!
À equipe do ambulatório pediátrico SIDA/AIDS – Instituo de Puericultura e
Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG), especialmente aos Dr. Ricardo Hugo e Dra.
Thalita, pelos ensinamentos e disponibilidade.
Aos pequeninos pacientes do IPPMG que fizeram parte deste trabalho e
seus responsáveis, pela colaboração. Que Deus abençoe vocês!
À Capes e CNPq, que possibilitaram o desenvolvimento desta pesquisa.
ix
“Todos os nossos sonhos podem tornar-se realidade
se tivermos a coragem de persegui-los”
Walt Disney
x
RESUMO
OTERO, Renata Alves. Identificação de Herpes Vírus Humano (Tipos 1-8) na
cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação
(Mestrado em Odontologia, área de concentração em Odontopediatria) – Faculdade
de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.
O objetivo deste estudo foi identificar a presença de herpes vírus humano
(Tipos 1-8) na cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV (HIV+) e controle
correlacionando com a presença de gengivite, imunossupressão (contagem de
células CD4) e uso de anti-retrovirais. O grupo de estudo consistiu de quarenta e oito
crianças infectadas pelo HIV, assim como no grupo controle, com idade variando de
6-12 anos. As amostras de saliva forma coletadas através da estimulação pela
mastigação de um tablete de goma base (Parafilm®) e armazenada em tubos
plásticos estéreis. Os fragmentos de DNA de HHV foram identificados e amplificados
pelo protocolo nested-PCR. Dentre as crianças HIV+ a média de idade foi de 9.58 ±
1.88, dos quais 48,9% eram meninos. O DNA de HHV detectado em 39 indivíduos
(81.3%). No grupo controle, a média de idade foi de 9.04 ± 1.36, dos quais 51.1%
eram meninos, sendo o DNA de HHV detectado em 45 indivíduos (93.8%). Não foi
identificada a presença de nenhum tipo viral em 9 pacientes do grupo HIV e 3 do
grupo controle, enquanto que a presença de apenas um tipo viral, foi verificada em
14 amostras do grupo HIV + e 16 amostras do grupo controle. Já a presença de 2 ou
mais tipos virais, foi detectada em 25 pacientes HIV+ e em 29 pacientes do grupo
controle, não havendo assim, diferença estatisticamente significante entre a
quantidade viral encontrada nos dois grupos (Teste Exato de Fisher; p>0.05). Em
relação à gengivite, 69.2% dos pacientes do grupo HIV, apresentaram a inflamação,
enquanto 30.8% dos pacientes não tinham gengivite (Teste Exato de Fisher;
p=0.22). Também não houve relação entre a presença do vírus e a presença de
xi
gengivite (Teste Exato de Fisher; p>0.05). Nenhuma associação significativa pode
ser observada em relação à imunossupressão e uso de HAART. Baseado nos
resultados desse estudo foi possível detectar uma elevada quantidade de DNA dos
vírus herpes tanto no grupo de pacientes infectados pelo HIV, como no grupo
controle, não havendo, portanto, diferença estaticamente significante entre os
grupos estudados e nem a relação da presença dos vírus com a infecção pelo HIV.
Palavras-chave: Infecção pelo HIV, manifestações orais, herpesviridae, reação em
cadeia de polimerase, crianças.
xii
Abstract
OTERO, Renata Alves. Identification of Human Herpes Virus (Types 1-8) in the
saliva of HIV-infected Children. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação (Mestrado em
Odontologia, área de concentração em Odontopediatria) – Faculdade de
Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.
The aim of this study was to identify the presence of human herpes virus (types 1-8)
in saliva of HIV-infected children (HIV +) and control correlated with the presence of
gum disease, immunosuppression (CD4 counts) and use of antiretroviral . The study
group consisted of forty-eight HIV-infected children, as well as in the control group,
aged 6-12 years. The saliva samples had been collected by chewing through the
stimulation of one tablet of gum base (Parafilm ®) and stored in sterile plastic tubes.
The DNA fragments were identified and HHV amplified by nested-PCR protocol.
Among HIV + children the mean age was 9:58 ± 1.88, of which 48.9% were boys.
The DNA of HHV detected in 39 patients (81.3%). In the control group, the mean age
was 04.09 ± 1.36, of which 51.1% were boys and the DNA of HHV detected in 45
individuals (93.8%).Was not identified by the presence of any virus in nine patients in
the HIV group and 3 in the control group, while the presence of only one viral type,
was found in 14 samples of the HIV + and 16 samples from the control group. The
presence of two or more viral types was detected in 25 HIV + patients and 29 control
patients, so there were no statistically significant difference between the amount virus
found in both groups (Fisher's exact test, p> 0.05). In relation to gingivitis, 69.2% of
patients in the HIV group showed inflammation, while 30.8% of patients had no
gingivitis (Fisher's exact test, p = 0.22). There was also no relationship between the
presence of the virus and the presence of gingivitis (Fisher's exact test, p> 0.05). No
significant association could be observed in immunosuppression and HAART. Based
on the results of this study could detect a high amount of DNA of herpes viruses both
xiii
in patients infected with HIV, as in the control group, there is therefore no statistically
significant difference between groups, nor the relationship between the presence of
viruses with HIV infection.
Key words: HIV-infection, oral manifestations, herpesviridae, Polymerase Chain
Reaction, child.
xiv
L I S T A D E Q U A D R O S , T AB E L A S E F I G U R AS
Table 1: Distribution of viral types in the groups HIV and control …….………… 38
Table 2: Presence and absence of HHV compared with sex and age………. 38
Figure 1: Oral Manifestations of HIV. A- Linear Gingival Erythema; B- Oral Ulcer; CAngular Cheilitis ............................................................................. 39
xv
L I S T A D E AB R E V I AT U R A S
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
CD4
Linfócitos CD4
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
HAART
Highly Active Antiretroviral Therapy
HIV
Human Immunodeficiency Vírus
HHV
Human Herpesvírus
HHV-1
Human Herpesvírus 1
HHV-2
Human Herpesvírus 2
HHV-3
Human Herpesvírus 3
HHV-4
Human Herpesvírus 4
HHV-5
Human Herpesvírus 5
HHV-6
Human Herpesvírus 6
HHV-7
Human Herpesvírus 7
HHV-8
Human Herpesvírus 8
IPPMG
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
Ml
mililitro
Min
Minuto
mM
miliMolar
n
number
PB
Pares de base
PCR
Polymerase Chain Reaction
pmol
Pico mol
RPM
Rotação por minuto
UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
UFRJ
Universidade Federal do Rio de Janeiro
µL
Microlitro
xvi
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17
2.
PROPOSIÇÃO ............................................................................................... 19
3.
DELINEAMENTO DA PESQUISA ................................................................. 20
4.
ARTIGO ......................................................................................................... 23
5.
DISCUSSÃO .................................................................................................. 40
6.
CONCLUSÕES .............................................................................................. 44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 45
ANEXOS....................................................................................................... 50
1.
INTRODUÇÃO
O controle da contaminação pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
continua sendo um desafio para a saúde pública global. Dados epidemiológicos
mostram que o número anual de novas infecções por HIV diminuiu globalmente, e a
prevalência do HIV entre jovens também diminuiu em muitos países (UNAIDS,
2008). Mundialmente, a cobertura de serviços de prevenção da transmissão vertical
do HIV (da mãe para o filho) aumentou de 10% em 2004 para 45% em 2008
(Organização Mundial da Saúde, Fundo das Nações Unidas para a Infância,
UNAIDS, 2008), e a redução de novas infecções por HIV entre crianças em 2008
sugere que estes esforços estejam salvando vidas.
O tratamento da infecção com terapia anti-retroviral múltipla (HAART) nos
estágios iniciais da infecção pelo HIV em crianças tem aumentado a expectativa de
vida (LAMBERT, 1996; DE MARTINO et al., 2000) e diminuído o aparecimento de
lesões bucais (CASTRO et al., 1999; RAMOZ-GOMES, 2002; SOARES et al., 2004).
Entretanto, manifestações associadas à infecção pelo HIV ainda estão presentes
nestas crianças, com freqüência variando de 20% a 80% (RAMOZ-GOMES, 2002;
CHIGURUPATI et al., 1996). Essas manifestações podem ser o primeiro sinal da
infecção pelo HIV e constituem importante fator prognóstico, pois seu aparecimento
pode indicar evolução da doença. (PONGSIRIWET et al., 2003; MELO et al., 2004;
NAIDOO & CHIKTE, 2004; SOARES et al., 2004; CASTRO et al., 2004; PINHEIRO
et al. 2009).
As manifestações bucais mais comumente encontradas são a candidíase
bucal, lesões herpéticas, gengivite, eritema linear gengival (ELG) e hipertrofia de
parótidas (CASTRO et al., 2004; PINHEIRO et al., 2009). Já as infecções virais mais
freqüentemente encontradas, são as causadas pelos vírus da família herpes,
18
principalmente pelos Herpes vírus simples (HHV-1), Varicella Zoster (HHV-3) e
Epstein-Barr (HHV-4), com prevalência de 24%, 21% e 56,43%, respectivamente
(KETCHEM et al., 1990; KATZ et al., 1993; MONIACI et al., 1993).
No que se refere às infecções herpéticas, foram identificados em humanos 8
tipos virais (CONTRERAS & SLOTS, 2000), onde após a infecção primária, esses
vírus entram em estado de latência, com potencial para reativação (KETCHEM et al.,
1990). Sua reativação em pacientes infectados pelo HIV pode resultar em infecção
severa pelo herpes vírus simples (HHV-1) (MILLER, 1996), disseminação de herpes
zoster (HHV-3) (GRIFFITHS, 1996), mononucleose infecciosa pelo vírus EpsteinBarr (HHV-4) (COHEN, 2000), pneumonia e rinite pelo citomegalovírus (HHV-5)
(DAL MONTE et al., 1996; MOCARSKI, 1996) e associação ao sarcoma de kaposi
pelo herpes vírus humano 8 (HHV-8) (CAVERT, 1997).
Alguns estudos sugerem que crianças infectadas pelo HIV possam estar mais
susceptíveis a infecções orais pelos Herpes Vírus Humanos (HHV1-8), podendo vir a
desenvolver manifestações como: herpes zoster (GRIFFITHS, 1996) e sarcoma de
kaposi (CAVERT, 1997). No entanto, não foram encontrados estudos que verifiquem
a co-infecção por herpes vírus na saliva de crianças infectadas pelo HIV.
Considerando a importância da infecção por esses vírus em crianças
infectadas pelo HIV, no que diz respeito à progressão e prognóstico da doença,
torna-se relevante identificar a presença dos herpes vírus nesses pacientes, sendo,
portanto, este o objetivo deste estudo.
19
2.
PROPOSIÇÃO
OBJETIVO GERAL
Identificar a presença do herpes vírus humano (Tipos 1-8) na saliva de
crianças infectadas pelo HIV.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Identificar e comparar a presença do herpes vírus (Tipos 1-8) na saliva de
crianças infectadas pelo HIV e comparar com crianças saudáveis (grupo controle).
2) Relacionar a presença dos herpes vírus com a presença de gengivite.
3) Relacionar a presença dos herpes vírus com a presença de imunossupressão e
uso de anti-retrovirais nas crianças infectadas pelo HIV.
3.
D E L I N E AM E N TO D A P E S Q U I S A
O presente estudo foi caracterizado como seccional do tipo caso-controle, ao
propor a identificação da presença do herpes vírus humano (Tipos 1-8) em crianças
infectadas pelo HIV, provenientes de uma COORT de crianças acompanhadas pelo
Instituto de Pediatria e Puericultura Martagão Gesteira (IPPMG), comparando a um
grupo controle, formado por crianças saudáveis, atendidas no Departamento de
Odontopediatria FO/UFRJ.
O estudo teve seu início somente após a aprovação pelo Comitê de Ética
local do IPPMG (Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira) da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, na cidade do Rio de Janeiro, Brasil (Anexo
1, pág. 51) e após a obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
devidamente explicado e assinado pelo responsável legal dos sujeitos da amostra
(Anexo 2, pág. 52).
A amostra foi constituída por dois grupos. Um grupo de estudo formado por
crianças com diagnóstico definitivo de HIV, pelos critérios CDC (1994) que fazem
acompanhamento no Serviço de AIDS Pediátrica do IPPMG e acompanhados pelo
Projeto SIDA/AIDS em Odontopediatria (Faculdade de Odontologia – UFRJ). E um
grupo de crianças clinicamente saudáveis atendidas na Clínica de Odontopediatria
da Faculdade de Odontologia-UFRJ.
O universo amostral para o grupo HIV foi composto de aproximadamente 208
pacientes infectados pelo HIV de 6 a 12 anos de idade, atendidos no Ambulatório
AIDS do IPPMG no período de Agosto de 2009 a Julho de 2010. Dentro desse
universo, foram selecionadas 40 crianças por conveniência para iniciarem o estudo.
21
Durante o processamento, foram perdidas 12 amostras por não identificação de DNA
humano, logo, se fez necessária a coleta de um maior número de espécimes para
que pudéssemos realizar a associação entre a presença dos vírus da família herpes
e a criança infectada pelo HIV. Sendo assim, foi realizada a seleção de mais 20
crianças, resultando em um n de 48 amostras. Para o grupo controle, foi selecionado
por conveniência o mesmo número de crianças sem nenhum comprometimento
sistêmico que faziam tratamento dentário na Clínica de Odontopediatria da
Faculdade de Odontologia/UFRJ.
Os dados sobre os exames extra e intraoral foram anotados nas fichas de
cada paciente (Anexo 3, pág. 55). Durante o exame intra oral, primeiro os pacientes
eram classificados visualmente em relação ao biofilme, aonde a ausência do biofilme
indicava o score 0, enquanto que a presença indicava o score 1 (AYNAMO & BAY,
1975). Depois, usando uma sonda periodontal estéril, a criança era examinada para
avaliação do índice gengival. Quando na ausência de sangramento da margem
gengival a sondagem, recebia score 0 e na presença, score 1 (AYNAMO & BAY,
1975). Já a extensão da gengivite, foi classificada segundo os Anais de Periodontia
de 1999, aonde pacientes com envolvimento de menos de 30% dos sítios sondados
possuíam uma gengivite localizada e pacientes com envolvimento de mais de 30%
dos sítios, apresentavam gengivite generalizada.
História médica (classificação clínica e imunológica da doença, tipo de
transmissão, tipo de parto, uso de medicamentos antiretrovirais) e os exames
laboratoriais (carga viral, percentual e contagem de CD4) mais recentes, colhidos até
03 meses antes ou após o exame bucal, foram obtidos dos prontuários médicos de
cada paciente do grupo HIV.
22
Para a coleta da saliva, o paciente não havia feito a ingestão de alimentos
pelo menos 1 hora antes da coleta. A criança foi instruída a mascar um tablete de
goma base por 1 minuto e dispensar a saliva inicial num recipiente plástico
descartável. Em seguida, a criança continuou mascando e dispensando a saliva em
recipientes plásticos estéreis e descartáveis, e, devidamente identificados, por mais
5 minutos. O material coletado foi mantido sob refrigeração em um isopor com gelo e
levado para o Laboratório de Viroses Respiratórias, Entéricas e Oculares (LAVIREO)
do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ em um prazo máximo de
2 horas. Em seguida as amostras foram acondicionadas para posterior análise
molecular por meio da PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) para a identificação
de DNA humano pela presença da proteína marcadora β-globina (AMMATUNA et
al., 2001). Essa identificação se faz necessária, para que sejam evitados resultados
falso-negativos, já que na ausência de DNA humano na amostra, não seria possível
a identificação de DNA viral. Das 60 amostras coletadas no grupo HIV, foi
identificada a presença da β-globina em 48 amostras. Já no grupo controle, foi
possível realizar a identificação da proteína em todas as amostras. Logo, foi feita a
nested-PCR para identificação e amplificação do DNA viral em 48 amostras do grupo
HIV e 48 amostras do grupo controle.
Para subsidiar a interpretação, entendimento e discussão dos resultados
obtidos, bem como apresentação dos mesmos e o detalhamento de toda a
metodologia empregada, foi elaborado um artigo científico intitulado: “Identification of
Human Herpes Virus (Types 1-8) in the saliva of HIV-infected children”
4.
ARTIGO
Identification of Human Herpes Virus (Types 1-8) in the saliva of
HIV-infected children
Renata Alves Otero1
Flávia Nóbrega Nunes do Nascimento2
Rodrigo da Silva de Lima3
Raquel Cirlene da Silva4
Ivete Pomarico Ribeiro de Souza 5
Norma Suely de Oliveira Santos 6
Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro7
1
Aluna de pós-graduação, Departamento de Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
2
Aluna de iniciação científica, Departamento de
Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro;
3
Aluno de iniciação científica, Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro;
4
Aluna de Pós- Graduação, Departamento de
Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, .
5
Professora Titular, Departamento de Odontopediatria e Ortodontia, Universidade Federal do Rio de
6
Janeiro. Professora adjunta, Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
7
Professora Adjunta, Departamento de
Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
24
ABSTRACT
Human herpesviruses are pathogens found in high prevalence among human
immune deficiency virus infected persons. This study aimed to identify the presence
of herpesvirus types 1-8 in saliva of children with HIV infection, comparing with
healthy patients. The sample was composed of 96 individuals from 6 to 12 years
shared into HIV Group and Control Group. Data collection from medical records
(Immunessupression and use of HAART), intraoral examination, visible plaque index,
gingival index, extent of gingivitis and collection of stimulated saliva was realized. For
identify the viral species nested-PCR technique was used. For the HIV group, the
mean age was 9.58 (± 1.88) and 51% were girls, while in control group 49% were
girls aged 9.04 (±1.36) years. Was not identified by the presence of any virus in nine
patients in the HIV group and 3 in the control group, while the presence of only one
viral type, was found in 14 samples of the HIV-positive and 16 samples from the
control group. The presence of two or more viral types was detected in 25 HIV +
patients and 29 control patients, so there were no statistically significant difference
between the amount found in two viral groups (Fisher Exact Test; p> 0.05). Types
HHV-1 (7.7% e 6.7%), HHV-2 (5.1% e 8.9%), HHV-5 (30.8% e 13.3%), HHV-6B
(76.9% e 62.2%) e HHV-7 (53.8% e 86.7%) were identified in HIV and control group
respectively, but HHV-6A was found only in the control patients (2.2%). No difference
was found between the groups. Considering only HIV group, the presence of HHV-5
was associated with male sex (75%) (Fisher Exact Test; p=0.02) but there were not
relationship between the presence and the type of viruses with the use of HAART
and immunosuppression (CD4<25%). The presence or absence of gingivitis, plaque
and gingivitis extension, showed no statistical difference (fisher Exact Test; p>0.05)
when compared to the presence of the herpes virus family, for the both groups. It was
25
concluded that the prevalence of children infected by the herpesvirius was elevated
in both groups, mainly in control group.
KEY WORDS
HIV-infection, oral manifestations, herpesviridae, Polymerase Chain Reaction, child.
26
INTRODUÇÃO
Almost 45 million people worldwide have been infected with the Human
Immunodeficiency Virus (HIV), and prior to highly active antiretroviral therapy
(HAART), more than 75% of all HIV-infected persons developed HHV-related
diseases (FICARRA, 1997). The association between CD4 cell count and the onset
of a variety of opportunistic infections, suggesting that reactivation of these
organisms is associated with a common set of deficits in host defense (GRIFFIN et
al., 2008). After the introduction of HAART some changes could be observed, such
as changes in the prevalence of some oral manifestations associated with HIV
infection and emergence of other lesions in group of individuals (PINHEIRO et al.,
2009). However, children and adults infected with HIV are prone to develop
opportunistic infections in the oral cavity such as candidiasis, herpes zoster,
gingivitis, gingival erythema linear (ELG) and parotid enlagement (CHIGURUPATI et
al., 1996).
Herpesviruses are transmitted from person to person during the period of
primary infection or reactivation, being highly prevalent in the general population
(MORGAN et al., 1979). All these agents are epitheliotropic and most of them are
present in latent form (WEINERT, 1996). The balance between latency and
reactivation involves the regulations of gene expression and reactivation may be
triggered by stress, hormonal changes, infections and immunosuppressive
medication (NAGATA et al., 2004). Salivary glands are reservoirs for herpesviruses,
that are generally transmitted by saliva (WEBSTER-CYRIAQUE et al., 2006) and the
Herpesviridae family members such as the Cytomegalovirus (CMV), the Epstein-Barr
Virus (EBV), and the Herpes Simplex Virus (HSV) can reactive to cause infection
27
when the immune system declines, like in patients with HIV infection (MACPHAIL et
al., 1995).
It is possible to suggest that HIV-infected individuals who were under HAART
may be more susceptible to oral infections by Human Herpes Virus (HHV 1-8) and
could develop as manifestations: herpes zoster (GRIFFITHS et al., 1997) and Kaposi
sarcoma (GREENSPAN, 1997). However, no previous study has co-infection with
herpes virus in saliva of HIV-infected children. Therefore, in order to identify the
presence of herpesviruses in saliva of HIV-infected children, and its correlation to HIV
infection and the oral manifestations, this study was developed.
METHODS
This is cross-sectional type control-case. The protocol was approved by the
Local Ethical Committee and the Informed Consent was obtained from all individuals
and/or their responses.
Subjects and data collection
The sample was composed for 2 groups, of both sexes, selected for
convenience, between August 2009 and July 2010.
The HIV Group (HIV-G), were formed by 48 individuals with definitive
diagnostics from HIV, between 6 and 12 years old, patients of the Institute Pediatrics
and Childcare Martagão Gesteira from Rio de Janeiro, Brazil, and the Healthy Group
(HG), consisted of 48 subjects with the same age, patients of Pediatric Dentistry
Clinic of a public university in Rio de Janeiro, which showed no clinical evidences of
systemic or chronic diseases.
28
Data from the patient's medical history such as: definitive diagnosis of HIV
infection, immunological classification, use of anti-retrovirals, and the latest laboratory
tests (viral load, percentage of CD4 and CD8, CD4/CD8 ratio and WBC) were
collected from their medical records.
During oral examination, first the patients were classified visually in the rate of
biofilm (absence of visible biofilm: score 0; presence of visible biofilme: score 1)
(AINAMO & BAY, 1975). Then, using a sterile periodontal probe, the children were
examined to assess the gingival index. When the absence of bleeding of gingival
margin to the survey, the score was 0, while in the presence was 1 (AINAMO & BAY,
1975). Since the extent of gingivitis, were classified according to the Annals of
Periodontology, 1999, where patients with involvement of less than 30% of sites
surveyed, had a localized gingivitis. When gingivitis assailed over 30% of sites
surveyed, the patient was classified having a generalized gingivitis.
All data were recorded on dental records. For all exams, dental elements were
discarded that showed exfoliation in an advanced stage as well as those who were in
the process of eruption.
For saliva collection, the patient should have eaten food at least 1 hour before
collection. The child was instructed to chew one tablet of gum base for 1 minute and
waive the initial saliva in a plastic container disposable. Then the child was still
chewing and ejecting saliva into sterile plastic containers and disposable, and,
properly identified for a further 5 minutes (TENEVUO, 1986). The material was kept
refrigerated in a ice cooler and taken to the Laboratório de Viroses Respiratórias,
Entéricas e Oculares (LAVIREO) - UFRJ in a maximum of 2 hours.
Laboratorial Analysis
29
Initially for the molecular analysis there were used 200µL of the clinical sample
for DNA extraction with the Wizard® Purification Kit (Promega, Madson, USA)
according to the manufacturer's instructions. The final pellet was suspended in 65µL
of rehydration solution of DNA, incubated at 65°C f or 1 hour and the tubes stored at 20°C until use. As positive controls of PCR amplifi cations were used clinical samples
previously tested belonging to the Laboratory of Respiratory, Enteric and Ocular
viruses, Institute of Microbiology Professor Paulo de Góes, UFRJ.
For detection and identification of herpes virus types in clinical specimens was
used to multiplex PCR with a pool of oligonucleotides (HHV-F1 / HHV-R1 and VZVF1 / VZV-R1) for a selected region of consensus DNA polymerase of the types:
Herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2), cytomegalovirus (CMV), Epstein
Barr virus (EBV) and Varicella-zoster virus (VZV) (TAFRESHI, 2005).
The resulting amplicons were 742bp for HSV-1 and HSV-2, 817bp for CMV,
748bp for EBV and 650bp fragment for VZV. For the nested-PCR, we used a second
pool of oligonucleotides (HHV-F2 / HHV-R2 and VZV-F2 / VZV-R2) also described
by14. With amplicons resulting from 493bp for HSV-1 and HSV-2, 565bp for CMV,
499bp for EBV and 356pb fragment for VZV (TAFRESHI, 2005). The amplifications
were realized in GeneAmp PCR System model 2400 (Applied Biosystems, Foster
City, CA), in eppendorfs tubes of 0,2 ml they had been mixed 5 µL of DNA and 20µL
of Master Mix with enzyme containing 15,25µL of distilled water, 0,5 µL of mixing
dideoxynucleotide triphosphate, 2,5 µL of buffer for enzyme 10x concentrate, 0,7 µL
of primer solution (HHV-F1/HHV-R1), 0,2 µL of other primer solution (VZV-F1/VZVR1) (20mM each), 0,75 µL MgCl2 solution (25mM) and 0,2 µL Taq polymerase.
After denaturation of the DNA template at 94°C/ 3 m in, the PCR cycling
conditions, included 35 cycles of denaturation at 94°C/ 45 s, annealing at 65°C/ 1min,
30
and extension at 72°C/ 1 min, following 1 cycle of final extension at 72°/ 7 min.
(TAFRESHI, 2005).
The PCR amplicons were revealed on 1,2% agarose gel, followed by ethidium
bromide staining (0.5 mg/ml), and visualization under UV light and photographed with
digital camera. Later, 5 µL of the amplified product in the PCR had been mixed with
20µL of the Master Mix as it was described previously, changing only in the primers
set (HHV-F2/HHV-R2 and VZV-F2/VZV-R2). For nested-PCR: after denaturation of
the template DNA at 94°C/ 3 min, the nested-PCR was performed for 35 cycles of
denaturation at 94°C/ 45s, annealing at 63°C/ 1 min , and extension at 72°C/ 1min,
following a final extension of 1 cycle at 72°C/ 7 m in. (TAFRESHI, 2005).
Aliquots of the amplicons (10 µl) were checked by electrophoresis on a 1,2%
agarose gel, similar have been described previously.
For the amplification of the other viral types had been used the protocols
described to HHV-6 by Wang et al. (1996), to HHV-7 by Oña et al. (2002) and to
HHV-8 by Jang et al. (2000) for PCR cycling conditions showed in the Figure 1. To
detect this viral types was conducted nested-PCR, resulting in amplicons of 195bp for
HHV-6A and 423bp for HHV-6B (WANG, 1996), 126bp for HHV-7 (OÑA et al., 2002)
and 160bp fragment for HHV-8 (JANG et al., 2000). All the PCR and nested-PCR
amplicons were revealed on 1.2% agarose gel.
To the purpose of differentiate the viral types found which had a similar
molecular weights and to confirm the positivity of some samples by PCR was
employed the sequencing using the amplified DNAs of positive samples. They were
purified witch the Wizard SV gel and PCR Clean-Up system kit (Promega), and the
sequences established using the PCR primers, the BigDye® Terminator Cycle
Sequencing Kit and the ABI PRISM® 3100 automated DNA sequencer (Applied
31
Biosystems, Foster City, CA, USA). The DNA sequences were analyzed making use
of the program SeqMan in the Lasegene software package (DNASTAR, Madison, WI,
USA).
Statistical analysis
The obtained data were stored and processed in the statistical program EpiInfo for statistical analysis. For the comparisons between the two groups (HIV and
Healthy), we used the χ2 tests and Fischer's exact for categorical variables (sex,
presence of oral manifestations, presence of herpes virus type, immunessupression
and use of HAART) and Mann-Whitney for comparison between ages, with
significance level of 5%. .
RESULTS
In HIV group, 23 subjects were male, while 25 in the control group, which
corresponds to 51% and 49%, respectively. The average age of the HIV group was
9.58±1.88 and in control group 9.04±1.36 (Mann-Whitney; p=0.07).
The presence of HHV in HIV group is 81.3%, whereas in control group is
93.8%. There was no statistically significant difference between the amount of herpes
virus types of family found in both groups (ϰ2; p>0.05). The distribution of each viral
type in the groups can be seen in Table 1 and being observed that the HHV-3, HHV4 and HHV-8, were not found in either group. No correlations with age and sex were
found between the two groups.
Changes assessed as plaque index, presence or absence of gingivitis, and
gingivitis extension, showed no statistical difference (Fisher Exact Test; p>0.05),
32
when compared to the presence of the herpes virus family, both the HIV group, as in
the control group.
Considering only the group of HIV patients, we observed a statistically
significant result (Fisher Exact Test; p=0.02) when comparing the presence of HHV-5
with sex, thereby highlighting that 75% (n=9) of subjects infected by HHV-5 were
men. When comparing the presence of viral types with the average age, subjects
with HHV-5 were younger (8.6±1.2) (Fisher Exact Test; p=0.05). A similar tendency
was found for children with HHV-6B (Fisher Exact Test; p=0.06) whereas subjects
with HHV-1 tend to be older (Fisher Exact Test; p=0.07) (Table 2).
Regarding the manifestations of HIV, only one patient had erythematous
candidiasis, angular cheilitis with a mouth ulcer and also just one. Three patients had
a history of herpes zoster and the same number also had pseudomembranous
candidiasis. The linear gingival erythema was identified only in five patients, while 10
children were in infarcted lymph nodes (Figure 1). There was no correlation between
the presence of viruses, the use of HAART and immunosuppression (CD4<25%).
DISCUSSION
Our study reported a prevalence of 81.3% of the herpes virus in HIV patients
in the group, while in the control group showed a prevalence of herpes virus of
93.8%. Our results differ from other studies that found an increased prevalence of
herpes group of HIV-positive patients compared to healthy control group
(MARDIROSSIAN et al., 2000; GRANDO et al., 2005, MILLER et al., 2006). For not
having data in the literature to support our findings, we believe that this difference
has occurred because the children of the group to be HIV + being followed up
33
regularly and making routine use of HAART, which would increase your immunity and
reduce the co- infection by the herpes virus family.
The main limitation of this study was the small sample size, a fact that
occurred during laboratory analysis. Before a sample can be processed for viral
identification, should be performed to identify a protein called β-globin, in order to
detect the existence of human DNA in the sample and avoid a false negative for the
herpes virus (AMMATUNA et al., 2001). In our study, 12 samples were lost due to
failure to identify the β-globin protein, a fact that can be explained by failures during
the saliva collection or during laboratory analysis.
Regarding the presence of each studied herpes viruses, types HHV-6 and
HHV-7 were the most prevalent, identified in 76.9% and 53.3% respectively in HIV +
and 62.2% and 86.7 % in the control group. As a result statistically significant (Fisher
Exact Test; p = 0.000), HHV-7 was most prevalent in the control group. This finding
may be explained by the fact that the vast majority of people being infected with
HHV-6 and HHV-7 during childhood (WYATT et al., 1991; YAMANISHI, 1992) and
persists as a latent infection for life (SADA et al., 1996). The frequent isolation of
HHV-6 and HHV-7 in saliva suggests that salivary glands are the main sites under
these viral types (FOX et al., 1990; HARNETT et al., 1990).
Considering the total sample and the groups separately, there was no sex
predilection for the presence of herpes virus, with the exception of HHV-5, which was
identified in 9 men (75%) and 3 women (25%), with significant results statistically
(Fisher Exact Test; p = 0.02). These data suggest that HHV-5 presents a
predominance of males, a fact that corroborates a study by Watanabe et al. (2007),
where men have more periodontal sites positive for HHV-4 and HHV-5 than women.
The author suggests that this is possible, usually the boys begin sexual life earlier
34
than girls, what would be favoring a greater prevalence of male patients associated
with viral types. Moreover, the size of the study population and ethnic differences
could also be causing this variation. As in our sample consists of children aged 6 to
12 years, we believe that the population size and ethnic differences may be the main
factors that would be interfering with our results.
In this study, when the relationship between the presence of viral types with
immunosuppression in patients with HIV, we found that there was no statistically
significant difference (Fisher Exact Test; p = 0.6). However, for type viral HHV-5,
75% of patients were not immunosuppressed, with a tendency to a statistically
significant result (Fisher Exact Test; p = 0.08). As for the viral type HHV-7, 42.9% of
the patients were immunosuppressed, featuring the same way, a tendency toward
significance of the results (ϰ2; p=0.09). While conducting an extensive review of the
literature,
there
are
no
published
data
that
could
justify
the
results.
35
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38
TABLES
Table 1- Distribution of viral types in the groups HIV and control.
Viral Types
(n)
Groups
(n)
HIV
(68)
Control
(81)
a
HHV-1
(6)
HHV-2
(6)
HHV-5
(18)
6.7% a
5.1% a 30.8% b
6.7% a 8.9% a 13.3% b
HHV-6A HHV-6B
(1)
(58)
HHV-7
(60)
0% a
76.9% c
53.8% d
2.2% a
62.2% c
86.7% d
p>0.05, Fisher Exact Test; bp=0.05, ϰ2; cp>0.05, ϰ2; dp<0.05, Fisher Exact Test
39
FIGURE
Figure 1- Oral Manifestations of HIV. A- Linear Gingival Erythema; B- Oral Ulcer;
C- Angular Cheilitis.
A
B
C
40
5.
DISCUSSÃO
Os herpesvirus humano (HHV) pertencem à família Herpesviridae, estando
subdivididos nas subfamílias Alphaherpesvirinae (HHV-1, HHV-2 e HHV-4),
Gammaherpesvirinae (HHV-3 e HHV-8) e Betaherpesvirinae (HHV-5, HHV-6 e HHV7). Seu genoma é composto por uma única molécula de DNA, variando em tamanho
de 120-250 Kbp. Recentemente, o trauma físico, estresse, imunossupressão,
disfunção imune e a radioterapia têm sido associados a reativação de infecções
latentes
pelos
herpesvírus,
podendo
causar
infecções
sintomáticas
ou
assintomáticas. Na cavidade oral 6 tipos são associados com a presença de lesões,
sendo eles: HHV-1, HHV-2, HHV-3, HHV-4, HHV-5, HHV-8 (CONTRERAS &
SLOTS, 2000).
A transmissão do HHV se dá pelo contato direto com a mucosa e pele
lesionadas (REGEZI et al., 1996), no entanto, há participação dos portadores
assintomáticos na disseminação, através principalmente de secreções sanguíneas e
orais (COHEN et al., 2000). A contaminação pela secreção oral acontece com maior
freqüência nos pacientes imunocomprometidos, como é o caso dos pacientes HIV
positivo. Isso ocorre pois as glândulas salivares apresentam-se como um
reservatório para os herpesvírus, em que a saliva possui uma grande quantidade do
DNA viral, gerando a sua transmissão pela troca de saliva contaminada (SALIMI,
2002). Um estudo realizado com 40 pacientes identificou a presença de HHV-4 em
13 amostras e HHV-5 em 30 amostras de saliva estimulada (IMBRONITO, 2008).
Por isso, em nosso estudo, optamos pela coleta de saliva para identificação dos
vírus da família herpes.
Porém, após a introdução do HAART, estudos tem relatado uma baixa
prevalência de herpesvírus humano na saliva de indivíduos infectados pelo HIV.
41
(DUKERS et al., 2000; DUUS et al., 2006; MILLER et al., 2006). Isso se dá pelo fato
do advento do HAART ter diminuído a incidência de doenças oportunistas e
melhorado a sobrevida dos pacientes HIV+ que recebiam a terapia (FONS et al.,
1994; ANTINORE et al., 2003) contudo ainda não é conhecido se o HAART alterou a
taxa de HHV pelo ressurgimento da latência ou se a capacidade dos HHVs para
produzir manifestações clínicas ainda não é bem conhecida (MILLER et al., 2006).
Em crianças, um estudo com 135 crianças HIV positivas de Zambia, relatou
uma prevalência desta infecção de 38%, porém, este trabalho não relacionou dados
como idade, imunossupressão e uso de HAART (BRAYFIELD et al., 2003). No
nosso estudo, houve uma alta prevalência de HHV nos dois grupos estudados,
porém, a prevalência de HHV no grupo de crianças não infectadas foi maior do que
no grupo de crianças HIV +, com 93,8% e 81,3% respectivamente, o que apresentou
um resultado com tendência a significancia estatística (Fisher Exact Test; p=0.06).
Destaca-se que dentre os pacientes infectados, a maioria (71%) estavam sob uso de
HAART e apresentava ausência de imunossupressão (53,8%).
A principal limitação do nosso estudo inclui o tamanho pequeno da amostra, a
qual occorreu devido as perdas pela ausência de DNA humano, verificadas durante
a análise laboratorial das amostras. Após as perdas, foram realizadas novas coletas
para que chegássemos a uma amostra de 48 pacientes para cada grupo, já que não
havia tempo hábil para mais coletas. Portanto, qualquer comparação com estes
resultados deve ser feito com cautela e deve ser avaliado de acordo com a
população estudada.
Em nosso estudo, observamos a alta frequência de HHV-6 e HHV-7 em
ambos os grupos, sendo o HHV-6 mais prevalênte no grupo HIV quando comparado
ao grupo controle, com frequências de 76,9% e 62,2%, respectivamente. Já o HHV-
42
7, foi identificado em 21 amostras (53,8%) do grupo HIV+ e em 39 amostras (86,7%)
do grupo controle, apresentando um resultado estatisticamente significante (Fisher
Exact Test; p=0.000). Esse achado pode ser explicado pelo fato de a grande maioria
das pessoas serem infectadas com HHV-6 e HHV-7 durante a infância (WYATT et
al., 1991; YAMANISHI, 1992) e persistir como infecção latente durante toda a vida
(SADA et al., 1996). O isolamento freqüente do HHV-6 e HHV-7 na saliva sugerem
que as glândulas salivares sejam os principais locais de abrigo desses tipos virais
(FOX et al., 1990; HARNETT ET al., 1990).
Considerando a amostra total e os grupos separadamente, não houve
predileção por sexo em relação à presença dos vírus, com exceção do HHV-5, no
qual nossos dados corroboram com o estudo de Watanabe e col. (2007), aonde os
homens apresentam mais sítios periodontais positivos para HHV-4 e HHV-5 do que
as mulheres. O autor sugere que isso seja possível, por geralmente os meninos
iniciarem vida sexual mais cedo que as meninas, o que estaria favorecendo a maior
prevalência de pacientes masculinos associados aos tipos virais. Além disso, o
tamanho da população de estudo e as diferenças étnicas, também poderiam estar
gerando essa variação. Em nosso estudo, para o HHV-5, 75% dos pacientes eram
do sexo masculino, enquanto que apenas 25% do sexo feminino, sendo esse
resultado significante estatisticamente (ϰ2; p=0.02). Porém, como nosso universo
amostral é composto por crianças de 6 a 12 anos, acreditamos que o tamanho da
população de estudo e as diferenças étnicas estejam relacionadas ao resultado por
nós encontrado.
No presente estudo, quando na relação da presença dos tipos virais com a
imunossupressão, no grupo de pacientes com HIV, verificamos que não houve
diferença estatísticamente significante (Fisher Exact Test; p=0.6). Apesar da
43
realização de uma extensa revisão da literatura, não foram encontrados dados
publicados que pudessem justificar os resultados apresentados.
Quando relacionamos a presença da gengivite com os tipos virais, verificamos
que dos 39 pacientes com gengivite, 27 (69,2%) também apresentavam algum tipo
de vírus herpes. Esses dados estão em conformidade com diversos estudos
realizados por Contreras et al. (1997; 1998; 1999a; 1999b; 2000) nos quais ocorre
uma relação positiva entre as doenças que atingem os tecidos de suporte, como
gengivite e periodontite, com a presença dos vírus da família herpes.
44
6.
CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:
1) Encontraram-se presentes na cavidade bucal das crianças infectadas pelo
HIV os tipos HHV-1, HHV-2, HHV-5, HHV-6B e HHV-7, sendo da mesma
forma, identificado nas crianças saudáveis, somando ainda o tipo HHV-6A.
Ao comparamos os dois grupos, foi possível observar a presença de
81.3% dos vírus da família herpes no grupo de pacientes HIV, enquanto
que 93.8% de vírus no grupo controle.
2) Não houve correlação estatística entre a presença dos vírus da família
herpes (Tipos 1-8) com a gengivite.
3) Não houve correlação estatística com a presença dos vírus da família
herpes (Tipos 1-8) com a presença de imunossupressão e o uso de antiretrovirais no grupo HIV+.
R E F E R Ê N C I AS B I B L I O G R Á F I C A S
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50
ANEXOS
51
ANEXO 1
52
ANEXO 2
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ODONTOPEDIATRIA E ORTODONTIA
DISCIPLINA DE ODONTOPEDIATRIA
Consentimento Livre e Esclarecido
IDENTIFICAÇÃO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1 – 8) NA SALIVA DE
CRIANÇAS INFECTADAS PELO HIV
- TERMO DE ESCLARECIMENTO:
Sabemos que pacientes em tratamento médico podem estar com o sistema
de defesa alterado, o que aumenta as chances dele apresentar vírus na boca que
possam causar alguma doença, como o Herpes, justificando assim a importância
dessa pesquisa. Logo, a Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (FO/UFRJ) possui o objetivo de estudar
a presença do vírus da herpes na boca de crianças infectadas pelo HIV que são
atendidas no Ambulatório AIDS no IPPMG (Instituto de Puericultura e Pediatria
Martagão Gesteira).
Para tanto, o procedimento utilizado começará com uma entrevista com você
para preenchimento de uma ficha com o nome, telefone, idade e sexo, entre outras
informações sobre a criança. As crianças serão beneficiadas ao receberem da
pesquisadora responsável uma escova de dente, pasta de dente e orientações
práticas sobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então a
escovação dental. Após a escovação, irei verificar se a gengiva está saudável ou
não, através de uma sondagem realizada com um instrumento arredondado que
contorna a margem da gengiva de forma suave, sem força, não causando assim
desconforto a criança. Para a coleta da saliva, a criança irá mascar um pequeno
tablete de goma e cuspir a saliva em um “copinho” descartável. O material será
analisado em um laboratório para saber se existe a presença ou a ausência de
algum vírus da herpes na boca. Os exames não trarão qualquer problema para a
saúde dos participantes. Esses procedimentos serão realizados no Ambulatório
AIDS do IPPMG e no Departamento de Odontopediatria FO/UFRJ, onde as crianças
são atendidas rotineiramente, realizando exame da boca, escovação e aplicação de
flúor com a escova. Os pacientes que durante o exame da boca, apresentarem
cáries ou outras necessidades dentárias, receberão tratamento odontológico
na Clínica de Odontopediatria da FO/UFRJ, sendo atendidos pela própria
pesquisadora, sem nenhum custo sobre o tratamento.
Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso à pesquisadora responsável
através do(s) telefone(s) (21) 2241-3739 e (21) 9242-7332. Informações também
poderão ser dadas pelo serviço da Clínica de Odontopediatria da Faculdade de
Odontologia, UFRJ no telefone (21) 2562-2101. Se você tiver alguma consideração
ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Éitica em
Pesquisa do IPPMG (2o andar).
Será entregue uma cópia do termo de consentimento livre e esclarecido a
cada participante da pesquisa. É garantida a liberdade de querer não participar
do projeto de pesquisa ou de retirar o consentimento a qualquer momento, no
53
caso da aceitação, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na
instituição.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as informações
obtidas de outros pacientes, não sendo divulgada a identificação de nenhum
paciente.
Os resultados dos exames serão de competência apenas dos pesquisadores
envolvidos no projeto e dos profissionais que possam vir a ter relacionamento de
atendimento e ou cuidados com a criança ou jovem e não será permitido acesso a
terceiros (seguidores, empregadores, superiores hierárquicos), garantindo
proteção contra qualquer tipo de discriminação e ou estigmatização.
Os resultados da pesquisa serão entregues individualmente a cada
participante tão logo a pesquisa seja concluída. Além disso, estes ficarão
disponíveis no Ambulatório AIDS do IPPMG (1o andar), na biblioteca do Centro de
Ciências da Saúde (CCS), e no Departamento de Odontopediatria da Faculdade de
Odontologia da UFRJ localizado na Cidade Universitária, Ilha do Fundão – Rio de
Janeiro, RJ.
Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo,
incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada
à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo
orçamento da pesquisa.
Eu, pesquisadora responsável, me comprometo a utilizar os dados e o
material coletado somente para esta pesquisa.
- TERMO DE CONSENTIMENTO:
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações sobre
o estudo acima citado que li ou que foram lidas para mim.
Eu
discuti
com
o
Dr.
____________________________________________________,
Sobre a minha decisão em permitir a participação de meu representado legal nesse
estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que
minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a
tratamento odontológico quando necessário. Concordo voluntariamente em
participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento,
antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer
benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento nesta instituição.
________________________________
Nome do Sujeito da Pesquisa
Data: ___/___/____
________________________________
Data: ___/___/____
Nome do Representante Legal
Assinatura do Representante Legal
_________________________________
Nome da Pesquisadora
Assinatura da Pesquisadora
Data: ___/___/____
54
- TERMO DE ASSENTIMENTO:
Nome da criança/adolescente ______________________________________________
Este formulário de assentimento informado é para crianças entre as idades de 6 a 12 anos que
comparecerão ao ambulatório AIDS do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
(IPPMG) e que estou convidando a participar da pesquisa intitulada: “Identificação de Herpes Vírus
Humano (Tipos 1-8) na Cavidade Bucal de Crianças Infectadas pelo HIV”.
Introdução
Meu nome é Renata Alves Otero, sou dentista de criança e meu trabalho é ver se as crianças
que fazem tratamento no ambulatório AIDS possuem muitos e/ou vários tipos de bichinhos na boca,
que nós chamamos de herpes. Eu vou informar você e convidá-lo a participar dessa pesquisa. Você
pode escolher se quer ou não. Discuti essa pesquisa com seus pais ou responsáveis e eles sabem
que também estamos pedindo o seu acordo. Se você vai participar na pesquisa, seus pais ou
responsáveis também terão que concordar. Mas se você não desejar fazer parte na pesquisa, não é
obrigado, até mesmo se seus pais concordarem. Antes de decidir se quer participar ou não da
pesquisa, você poderá falar com qualquer pessoa que você quiser para conversar sobre o assunto e
tomar a sua decisão. Você pode decidir se quer participar ou não depois de ter conversado sobre a
pesquisa e não é preciso decidir imediatamente. Pode haver algumas palavras que não entenda ou
coisas que você quer que eu explique mais detalhadamente porque você ficou mais interessado ou
preocupado. Por favor, peça a qualquer momento e eu explicarei.
Objetivos
Quero identificar a presença do herpes em diferentes regiões da boca e verificar se o
problema de saúde que você possui, está relacionado com uma maior ou menor quantidade desse
vírus na boca.
Escolha dos participantes
Estou fazendo esses exames em crianças entre 6 a 12 anos de idade que fazem tratamento
na DIP. Nesta pesquisa estou tentando identificar um maior número de herpes somente em crianças
que fazem tratamento na DIP.
Voluntariedade de Participação
Você não precisa participar desta pesquisa se não quiser. É você quem decide. Se decidir
não participar da pesquisa, é seu direito e nada mudará no seu tratamento de saúde. Mesmo assim,
este serviço de saúde estará disponível para você. Até mesmo se disser "sim" agora, poderá mudar
de idéia depois, sem nenhum problema.
Procedimentos
Se você decidir fazer parte da pesquisa, deverá fazer os seguintes procedimentos:
1) Você participará de uma entrevista para preenchermos uma ficha com seu nome, telefone, idade
e sexo, entre outras informações.
2) Depois, eu irei examinar visualmente a sua boca para verificar a presença de acúmulo de
“sujeira” (Biofilme bacteriano) visível a qual será removida do dente para coleta através da
passagem de um instrumento semelhante a uma pequena colher (Cureta Dentinária).
3) Em seguida, você receberá de mim uma escova de dente, pasta de dente e orientações práticas
sobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então a escovação dental.
4) Após a escovação, irei verificar se a gengiva está saudável ou não, através de uma sondagem
realizada com um instrumento arredondado que contorna a margem da gengiva de forma suave,
sem força, não causando nenhum desconforto a você.
5) Para a coleta da saliva, você irá mascar um pequeno tablete de goma e cuspir a saliva em um
“copinho” descartável.
6) Logo após, serão colocados 3 bolinhas de papel levemente na margem da sua gengiva e
removidas logo em seguida. Por fim, passarei um cotonete, sob a margem da gengiva sem te
causar nenhuma dor ou desconforto.
7) Todo o material será analisado em um laboratório para saber se existe a presença ou a ausência
de algum vírus do herpes na boca.
55
8) Você pode me pedir que eu explique a qualquer momento mais informações sobre o processo.
Riscos
Esses exames são considerados seguros. Já foram feitos em adultos e em outras crianças.
Não houve nada que nos preocupasse. Porém, se qualquer coisa incomum acontecer a você,
precisarei saber e você deverá se sentir à vontade de me chamar a qualquer momento para falar
sobre suas preocupações ou perguntas.
Desconfortos
Há algumas outras coisas que eu gostaria que você soubesse. Esses exames não lhe
causarão nenhuma dor ou desconforto. Também não será necessário que você perca o horário da
escola, porque você já estará aqui na DIP para realizar o seu exame com o seu médico.
Você entendeu que nessa pesquisa não há risco e nem desconforto? ____ sim____ não.
Benefícios
Você será beneficiado ao receber de mim uma escova de dente, pasta de dente e orientações
práticas sobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então a escovação dental.
Você também receberá tratamento dos dentes na Clínica de Odontopediatria FO/UFRJ se durante o
seu exame, eu verificar que você está com cáries ou outras necessidades dentárias, sendo atendido
por mim, sem ter que pagar nada pelo tratamento.
Confidencialidade
Não falarei para outras pessoas que você está nesta pesquisa e também não compartilharei
informação sobre você para qualquer um que não trabalha na pesquisa. Depois que a pesquisa
acabar, os resultados serão informados para você e para seus pais. As informações sobre você serão
coletadas na pesquisa e ninguém, exceto os investigadores poderão ter acesso a elas. Qualquer
informação sobre você terá um número ao invés de seu nome. Só os investigadores saberão qual é o
seu número e manteremos em sigilo. Ela não será compartilhada com quem quer que seja exceto,
alguém que tenha permissão de acesso à informação, tais como: patrocinadores de pesquisa, órgãos
governamentais, o seu médico, etc.
Divulgação dos resultados
Quando terminarmos a pesquisa, eu entregarei a você e a seus pais o resultado. Além disso,
o
estes ficarão disponíveis no Ambulatório AIDS do IPPMG (1 andar), na biblioteca do Centro de
Ciências da Saúde (CCS), e no Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da
UFRJ localizado na Cidade Universitária, Ilha do Fundão – Rio de Janeiro, RJ, através de um número
que apenas eu e você saberemos.
.
Direito de recusa ou retirada do assentimento informado
Você não tem que estar nesta pesquisa. Ninguém estará furioso ou desapontado com você
se você disser não, a escolha é sua. Você pode pensar nisto e falar depois se você quiser. Você pode
dizer "sim" agora e mudar de idéia depois e tudo continuará bem.
Contato
Você pode me perguntar agora ou depois ligar pra mim. Eu escrevi um número de telefone e
endereço onde você pode nos localizar ou, se você estiver por perto, você poderá vir e me ver. Se
você quiser falar com outra pessoa tal como o seu professor ou doutor ou tia, não tem problema.
Certificado do Assentimento
Eu entendi que a pesquisa é sobre um vírus que estão querendo identificar na minha boca,
chamado herpes. Eu entendi que serão feitos exames para verificar a quantidade e a presença ou
não desses vírus.
Assinatura da criança/adolescente:__________________________________________
Assinatura dos pais/responsáveis:__________________________________________
Ass. Pesquisador:________________________________________________________
Dia/mês/ano:____________________________________________________________
56
ANEXO 3
N°____________
IDENTIFICAÇ ÃO
Data do Exame: ________
Nome: ______________________________________________________
Prontuário (IPPMG): _____________
DN: ___ /___ /___ sexo:___ cor:___ naturalidade: ________________
Mãe: __________________________________________ HIV (+) (-)
Pai: ___________________________________________ HIV (+) (-)
End. ________________________________________________________
Telefone: _____________________
Responsável: _________________________________ Parentesco:_____
Profissão do Responsável: _________________________
1) EX AME ORAL
História prévia de manifestação oral:
( ) S ( ) N
Qual: ______________________________________________________
Tecidos Moles:
Extra Oral:
Linfonodos submandibulares: ( ) D ( ) E ( ) Não
Linfonodos cervicais: ( ) D ( ) E ( ) Não
Linfonodos submentonianos: ( ) S ( ) N
Hipertrofia de Parótidas: ( ) D ( ) E ( ) Não
Intra Oral:
Candidíase Pseudomembranosa: ( ) S ( ) N
local:___________________________
Candidíase Eritematosa: ( ) S ( ) N
local: ___________________________________
Eritema Linear Gengival: ( ) S ( ) N
local:___________________________________
Queilite angular: ( ) S ( ) N
Gengivite: ( ) S ( ) N
dentes: _________________________________
57
Retração gengival: ( ) S ( )N
dentes:________________________________________
Abscesso gengival: ( ) S ( )N
dentes:________________________________________
Fístula: ( ) S ( ) N
dentes: _______________________________________
Periodontite: ( ) S ( ) N
Estomatite herpética: ( ) S ( ) N
Herpes labial: ( ) S ( ) N
Leucoplasia Pilosa: ( ) S ( ) N
Sarcoma de Kapposi: ( ) S ( ) N
Úlcera aftosa: ( ) S ( ) N
Outros: _______________________________________
Exame dentário
CPOD / ceo e CPOS /ceos:
CPOD:___________
CPOS: __________
ceo: ____________
ceos: ___________
Nº. de lesões cavitadas ativas em dentina: _____________________
Dente dist vest mes ling oclus
1
2
3
4
5
16
17
18
Dente dist vest mes ling oclus
1
2
3
4
5
46
47
48
Dente dist vest
1
2
3
4
5
26
27
28
Dente dist vest
1
2
3
5
5
36
37
38
mes ling oclus
mes ling oclus
58
0 - sadia
1 - cárie ativa em esmalte, sem cavitação.
2 – cárie inativa em esmalte
3 - cavitação ativa em esmalte
4 - cavitação inativa em esmalte
5 - cavitação ativa em esmalte / dentina
6 - cavitação inativa em esmalte / dentina
7 - dente com possível comprometimento pulpar
8 - restaurado
9 - extraído
10 - exodontia indicada
2) EX AMES LABORATORI AIS
Data
CD4
CD8
T4/T8
Data
Ht/Hb
Leucócitos
Plaquetas
3) HIGIENE ORAL
Quantas vezes escova os dentes/dia?
( ) pelo menos 1 vez/dia
( ) 2 a 3x/dia
( ) + 3x/dia
Quem escova?
( ) o próprio paciente
( ) o responsável
( ) outro menor (irmãos)
Usa fio dental?
( )S
( )N
Freqüência: ____ vezes/dia
Uso de fluoreto:
( ) bochecho
( ) creme dental
Informações sobre a dieta:
( ) realiza as 3 refeições diárias
( ) costuma “beliscar”entre refeições
Consumo de sacarose entre as refeições:
( ) pelo menos 1 vez/dia
( ) 2 a 3x/dia
( ) + 3x/dia
59
Toma a medicação associada a alimentos?
( )S
( )N
Qual(s)?
( ) água
( ) alimentos açucarados ( ) alimentos s/ açúcar ( ) leite puro
( ) outros ___________________________________
4) CLASSIFICAÇÂO
A) ÍNDICE DE BIOFILME (AINAMO & BAY, 1975)
0 – Ausência de biofilme visível ( )
1 – Presença de biofilme visível ( )
B) ÍNDICE GENGIVAL (AINAMO & BAY, 1975)
0 – Ausência de sangramento da margem gengival a sondagem ( )
1 – Presença de sangramento da margem gengival a sondagem ( )
C) EXTENSÃO DA GENGIVITE (Annals of Peridontology, 1999)
Gengivite Localizada
Gengivite Generalizada
Acometimento de menos de 30% dos sítios sondados ( )
Acometimento de mais de 30% dos sítios sondado ( )
5) FICHA DE PROCEDIMENTOS
Data
Procedimento realizado
60