Vacina Hasumi - Universidade Federal do Ceará

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Avaliação Experimental da Atividade Antitumoral da
Vacina Peptídica Anticâncer (Vacina Hasumi®)
Marcio Roberto Pinho Pereira
FORTALEZA – CEARÁ
2003
1
Avaliação Experimental da Atividade Antitumoral da
Vacina Peptídica Anticâncer (Vacina Hasumi®)
MARCIO ROBERTO PINHO PEREIRA
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À COORDENAÇÃO DO PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E
FARMACOLOGIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ COMO PRÉ-REQUISITO
PARCIAL PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM FARMACOLOGIA
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Co-Orientadora: Prof. Dra. Cláudia do Ó Pessoa
Universidade Federal do Ceará
Faculdade de Medicina
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Programa de Pós-graduação em Farmacologia
2
Esta dissertação foi apresentada como parte dos requisitos necessários para obtenção de
grau de mestre em Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e se encontra à
disposição dos interessados no Biblioteca Central da Universidade e na Coordenação do Curso.
A transcrição de qualquer trecho desta dissertação será permitida desde que sela
feita de acordo com as normas de ética científica.
Marcio Roberto Pinho Pereira
Dissertação aprovada em 02 de Abril de 2003.
Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Dpto de Fisiologia e Farmacologia
Universidade Federal do Ceará
Orientador
Dra. Cláudia do Ó Pessoa
Dpto de Fisiologia e Farmacologia
Universidade Federal do Ceará
Co-Orientadora
Dra. Maria da Guia Silva Lima
Dpto de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará
Examinadora
3
“Deus não pode estar em todos os lugares ao
mesmo tempo. E exatamente por esse motivo,
Deus criou as mães”.
Ditado Judeu
À minha mãe: Maria Teresa.
Dedico...
4
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador, professor Dr Manoel Odorico de Moraes, por toda a confiança
depositada em mim na realização desse trabalho, por ter me recebido em seu laboratório de
braços abertos, pela inspiração como docente e pelas oportunidades que me foram dadas,
contribuindo assim para meu engrandecimento pessoal e profissional.
À professora Dra Cláudia do Ó Pessoa, pelo convite feito a mim para trabalhar no
Laboratório de Oncologia Experimental no projeto Hasumi, por compartilhar comigo todos os
momentos do mestrado, sejam bons ou ruins, e pela grande amizade conquistada.
À professora Dra Maria da Guia Silva Lima, pelos ensinamentos em Imunologia e por ter
aceitado participar desta banca examinadora.
À professora Letícia Lotufo pela amizade conquistada e pelo exemplo como profissional
por ser a bióloga mais completa que conheço.
Aos técnicos Silvana, Fátima e Evanir, por sempre estarem disponíveis no
desenvolvimento de todo o trabalho.
À “Equipe Hasumi”: Patrícia Macedo, Daniel Magalhães, Rafael “Mini” e Rafael “Max”,
pela ajuda no desenvolvimento da dissertação e pelo exemplo do grande trabalho em equipe.
Aos colegas Pós-Graduandos e de Iniciação Científica do Laboratório de Oncologia
Experimental, pela convivência harmoniosa e pelo exemplo de grande família que esse grupo
sempre mantém.
Às secretárias Silvia e Áurea da Coordenação de Pós-Graduação em Farmacologia, pela
amizade e carinho com que sou recebido sempre que recorro à coordenação.
Ao meu monitor de Farmacologia Irissandro, pelos ensinamentos em Farmacologia e pela
ajuda oferecida no concurso do Mestrado.
5
À Artemísia, e ao seu Bento, pelo fornecimento dos animais utilizados nesse trabalho.
À Raquel Montenegeo, pela ajuda dispensada em momentos difíceis e por ter me
chamado para fazer parte da grande família LOE.
À Marne Vasconcelos, pelos momentos de “Bora” e “CalaBoca!” que fez nossa
amizade se tornar muito especial.
Aos professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pelo amadurecimento
científico proporcionado e pela agradável convivência no Departamento.
À minha família que me ama e entende minhas imperfeições. À minha mãe por todo o
sacrifício que faz pelos filhos, minha eterna gratidão.
A todos que contribuíram de alguma forma para que esta dissertação fosse realizada, meu
muito obrigado!
6
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão de bolsa de estudos para realização desse trabalho.
Ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia pela estrutura física para a realização
desse trabalho
Ao Instituto Claude Bernard, pela compra de muitos materiais utilizados nessa
dissertação.
A Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC), no nome da Dra Maria Elisabete de
Moraes, por ceder o espaço físico para a realização de muitos experimentos.
À Shukokai do Brasil, pelo fornecimento da Vacina Hasumi.
À Universidade de Fortaleza (UNIFOR), no nome da Professora Fátima Veras e Fátima
Antunes, por me acolher em seu corpo docente mesmo ainda não tendo concluído o Mestrado,
mostrando dessa forma que acreditam e confiam no meu potencial.
7
SUMÁRIO
Pág.
Lista de Tabelas
xi
Lista de Figuras
xii
Lista de Abreviaturas
xv
Resumo
xvi
Summary
xvii
INTRODUÇÃO
1
1- A Vacinação
1
2- O Câncer
3
3- Imunologia Tumoral: um Alvo para Novas Abordagens Terapêuticas Contra
o Câncer
6
4- Vacinas Anticâncer
12
5- Vacina Hasumi: Informações Gerais
23
OBJETIVOS
26
MATERIAL E MÉTODOS
27
1- Vacina
27
2- Reagentes
27
3- Equipamentos
30
4- Materiais Diversos
30
5- Animais
31
6- Soluções
31
7- Cromatografia Líquida de Alta Pressão
34
8- Dosagem de Proteínas
34
9- Imunização dos Animais
34
10- Obtenção dos Antissoros
35
11- Sorologia
35
11.1- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
35
11.2- Anafilaxia Cutânea Pasiva (PCA)
36
12- Linhagem Celular
36
13- Viabilidade Celular
36
8
14- Congelamento das Células
37
15- Descongelamento das Células
37
16- Teste da Atividade Antitumoral
37
16.1- Via de administração da vacina Hasumi
37
16.2 Avaliação do hemograma de ratos inoculados com carcinossarcoma de
Walker 256
38
16.3- Avaliação da atividade antitumoral em carcinossarcoma de Walker 256 38
16.4- Avaliação da atividade antitumoral em melanoma B/16
39
17- Calculo da Curva de Crescimento
39
18- Análise Estatística
40
RESULTADOS
41
1- Teor de Proteína do Extrato Total
41
2- Cromatografia Líquida de Alta Pressão
41
3- Avaliação da Resposta Imunológica
41
3.1- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por ELISA,
em Camundongos Imunizados com a Vacina Hasumi.
41
3.2- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por ELISA,
em Camundongos Imunizados com a Ovalbumina (OVA).
44
3.3- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por PCA, em
Camundongos Imunizados com a Vacina Hasumi.
44
4- Avaliação da Inibição do Crescimento Tumoral e Sobrevida em Ratos
inoculados com o Carcinossarcoma de Walker 256 Imunizados com a Vacina
Hasumi.
44
5- Avaliação do Hemograma dos Ratos Inoculados com o Carcinossarcoma
de Walker 256 Imunizados com a Vacina Hasumi
49
6- Avaliação da Inibição do Crescimento Tumoral e Sobrevida em Ratos
que Sofreram Retirada Cirúrgica do Carcinossarcoma de Walker 256 Imunizados
com a Vacina Hasumi.
53
7- Avaliação da Inibição do Crescimento Tumoral e Sobrevida em Camundongos
Inoculados com Melanoma B/16 Imunizados com a Vacina Hasumi pela via
Subcutânea.
57
9
8- Avaliação da Inibição do Crescimento Tumoral e Sobrevida em Camundongos
Inoculados com Melanoma B/16 Imunizados com a Vacina Hasumi pela via
Intraperitoneal.
57
DISCUSSÃO
63
CONCLUSÕES
68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
10
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1: Impacto estimado do aumento da técnica de vacinação em uma população com
doenças prevenidas por vacinas.
Tabela 2: Tipos de vacinas anticâncer mais recentes.
3
15
Tabela 3: Peptídeos de membrana de células neoplásicas utilizados como alvos moleculares.
21
Tabela 4: Peptídeos contidos na vacina Hasumi e seu(s) respectivo(s) tumor(es) de
origem.
28
Tabela 5: Composição química do extrato alcoólico do baço bovino.
29
Tabela 6: Tempo de retenção e área calculada dos picos retidos da ampola contendo os
peptídeos da vacina Hasumi em Cromatografia Líquida de Alta Pressão.
43
11
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1: Esquema ilustrativo da transformação de uma célula normal em uma célula cancerosa.
4
Figura 2: Ativação do linfócito Th CD4+ levando às ações efetoras da resposta imune mediada
por células.
8
Figura 3: Ativação do linfócito T CD8+ e seu mecanismo de eliminação da célula cancerosa.
10
Figura 4: Aparente mecanismo apresentação dos antígenos em Células Dentríticas ativadas pelo
adjuvante da vacina Hasumi.
24
Figura 5: Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) da ampola contendo os peptídeos da
Vacina Hasumi. O gráfico mostra o tempo de retenção dos picos com as respectivas
percentagens de área do gráfico.
42
Figura 6: Cinética da síntese de anticorpos em camundongos imunizados com Ovalbumina
(OVA) e Vacina Hasumi. O dia “0” representa o soro pré-imune. As setas representam as
imunizações (100 μL de Vacina Hasumi) (n=10).
45
Figura 7: Síntese de anticorpos anti-peptídeos da vacina Hasumi IgG1 revelados em
camundongos pela técnica de PCA. A seta indica a reação positiva do antissoro 35 dias após a
primeira imunização diluído na proporção de 1:2.
46
12
Figura 8: Cinética da síntese de anticorpos IgG1 em camundongos "Swiss" imunizados com a
vacina Hasumi. O dia “0” representa o soro pré-imune. As setas indicam as imunizações com
100 μL de Vacina (n=10).
47
Figura 9: Cinética do crescimento do tumor de Walker 356 em ratos imunizados com 500 μL da
Vacina Hasumi em dias alternados. Não houve diferença estatística entre os grupos experimental
(vacinado) e o grupo controle (n=10).
48
Figura 10: Cinética da curva de crescimento do tumor de Walker 256 nos ratos 1 e 4 imunizados
com 500 μL da vacina Hasumi em dias alternados até o 60° após a inoculação do tumor. O
gráfico mostra duas cinéticas de crescimento tumoral diferentes, apesar dos animais receberem o
mesmo tratamento.
50
Figura 11: Sobrevida dos ratos inoculados com o tumor de Walker 256 que sofreram, ou não,
retirada cirúrgica do tumor imunizados com a vacina Hasumi. O tempo é definido como dias
após a inoculação do tumor.
Controle com cirurgia.
Controle sem cirurgia.
Vacinado sem cirurgia.
Vacinados com cirurgia.
51
Figura 12: Leucograma dos animais inoculados com o tumor de Walker 256 imunizados com a
vacina Hasumi. 10 dias após a inoculação do tumor os níveis de leucócitos em animais
imunizados estão diferentes do controle (* p ≤ 0,05) (n=10).
52
Figura 13: Hemograma dos animais inoculados com tumor de Walker 256 imunizados com a
vacina Hasumi. 10 dias após a inoculação do tumor os níveis de hemoglobina e hemácias em
animais imunizados estão diferentes do controle (* p ≤ 0,05) (n=10).
54
Figura 14: Cinética do volume do tumor de Walker 256 após a retirada cirúrgica do tumor em
ratos imunizados com 500 μL da Vacina Hasumi em dias alternados. Não houve diferença
estatística entre os grupos experimental (vacinado) e o grupo controle (n=10).
55
13
Figura 15: Volume do tumor de Walker 256 em ratos imunizados com a 500 μL de Vacina
Hasumi em dias alternados 8 dias após a cirurgia. Os animais 2, 3, 4 e 6 do grupo vacinado
obtiveram uma inibição do crescimento tumoral, enquanto os animais 1 e 5 não apresentaram a
mesma inibição.
56
Figura 16: Cinética do crescimento do tumor melanoma B/16 em camundongos imunizados com
diferentes doses da Vacina Hasumi por Via Subcutânea 7 em 7 dias. Houve diferença estatística
entre os volumes tumorais do grupo imunizado com 0,006 μg de peptídeos (* p ≤ 0,05) em
relação ao grupo controle 10 dias após a inoculação do tumor (n=10).
58
Figura 17: Sobrevida dos camundongos inoculados com melanoma B/16 vacinados pela via
subcutânea. O tempo é definido como dias após a inoculação do tumor.
Vacinado com 1 μL.
Vacinado com 10 μL.
Controle.
Vacinados com 100 μL.
59
Figura 18: Cinética do crescimento do tumor melanoma B/16 em camundongos imunizados com
diferentes doses da Vacina Hasumi por Via Intraperitoneal a cada 7 dias. Houve diferença
estatística entre os volumes tumorais de todos os animais vacinados com a Vacina Hasumi (* p ≤
0,05) em relação ao grupo controle 10 dias e 12 dias após a inoculação do tumor (n=10).
60
Figura 19: Sobrevida dos camundongos inoculados com melanoma B/16 Vacinados pela via
intraperitoneal. O tempo é definido como dias após a inoculação do tumor.
Vacinado com 1 μL.
Vacinado com 10 μL.
Controle.
Vacinados com 100 μL.
61
Figura 20: Ratos inoculados com o tumor de Walker 256 16 dias após a vacinação. O animal
imunizado com a vacina Hasumi apresenta um tumor de tamanho bem menor que o animal
controle.
62
14
LISTA DE ABREVIATURAS
AAT – Antígenos Associados aos Tumores
BCG – Bacilo Calmette-Guérin
CTL – Linfócito T Citotóxico
DMSO – Dimetilsulfóxido
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético
ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GM-CSF – Fator Estimulante de Colônia
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA – Antígeno Leucocitário Humano
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Pressão
IFN-γ - Interferon gama
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IL-1 – Interleucina 1
IL-2 – Interleucina 2
IL-4 – Interleucina 4
INCA – Instituto Nacional do Câncer
MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal
NK – Natural Killer
PBS – Solução Tampão Fosfato
PCA – Anafilaxia Cutânea Passiva
PGE2 – Prostaglandina 2
PGF2 – Prostaglandina F2
OMS – Organização Mundial de Saúde
OPD – OrthophenyleneDiamine
OVA – Ovalbumina do ovo de galinha
TNF – Fator de Necrose Tumoral
TxB2 – Tramboxano B2
15
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Avaliação Experimental da Atividade Antitumoral de uma Vacina Peptídica Anticâncer (Vacina Hasumi®)
Marcio Roberto Pinho Pereira
Orientador: Manoel Odorico de Moraes Filho
Resumo
A vacina Hasumi é formada de peptídeos localizados na membrana plasmática de células
tumorais e um extrato de baço bovino associado a substâncias imunoestimulantes. O objetivo do
presente trabalho foi avaliar o possível efeito anticâncer da vacina Hasumi, e seu possível mecanismo
de ação, em animais inoculados com tumores experimentais. Para a avaliação da atividade
antitumoral in vivo foram utilizados dois grupos de ratos Wistar fêmeas inoculados com 1,0 X 106
células do carcinossarcoma de Walker 256 via subcutânea na região da axila. Os animais dos grupos
controle e tratado foram imediatamente vacinados com 500 μL de vacina Hasumi (3 μg de peptídeos)
e 500 μL de salina, respectivamente, pela via subcutânea e receberam reforços dessas doses em dias
alternados até sua morte. Os parâmetros avaliados foram a sobrevida e o crescimento tumoral
durante o período de tratamento. Amostras de sangue foram coletadas dos animais controles e
tratados para a obtenção do hemograma. Outros dois grupos de ratos também foram inoculados com
1,0 X 106 células do carcinossarcoma de Walker 256 mas sofreram excisão cirúrgica do tumor 5 dias
após a sua inoculação. Após a cirurgia, receberam o mesmo tratamento dos outros dois grupos acima
citados. Em um outro experimento, quatro grupos de camundongos C57BL/6 foram inoculados com
1,0 X 106 células de melanoma B/16 mantido em cultura. Três grupos foram imediatamente
vacinados com 1 μL, 10 μL, 100 μL de vacina Hasumi (0,006 μg, 0,06 μg, e 0,6 μg de peptídeos)
diluídos em 200 μL de solução salina, e o quarto grupo recebeu 200 μL de salina pela via subcutânea.
Todos os camundongos receberam reforços dessas doses a cada 7 dias até a sua morte. Foram
avaliados o crescimento tumoral e a sobrevida do animal. Outros quatro grupos de camundongos
C57BL/6 também foram tratados da mesma forma que os grupos anteriores, a não ser pela vacinação
intraperitoneal. Para a avaliação da imunogenicidade da vacina Hasumi, cinco grupos de
camundongos Swiss foram imunizados pela via subcutânea com 200 μL (2,4 μg de peptídeos) de
vacina Hasumi para identificação de anticorpos anti-peptídeos. Como controle positivo, outro grupo
de camundongos foi imunizado com 100μg de Ovalbumina. Os ratos inoculados com carcinosarcoma
de Walker 256 vacinados tiveram seu tumor parcialmente inibido. O hemograma revelou a ausência
de aumento da quantidade de leucócitos 10 dias após a inoculação do tumor nos animais imunizados,
sugerindo uma atividade antiinflamatória da vacina. Os ratos que sofreram retirada cirúrgica do
tumor de Walker 256 e foram vacinados também sofreram inibição do crescimento do tumor, sendo
que um animal ficou completamente curado. Os camundongos inoculados com o melanoma e
vacinados pela via intraperitoneal tiveram seu cresimento tumoral inibido de forma
significativamente superior quando comparados aos animais vacinados pela via subcutânea em todas
as doses testadas. Foi constatado a presença de anticorpos IgG1 anti-peptídeos pelo método do PCA,
indicando uma resposta imune do tipo Th2 que é favorável à atividade antiinflamatória, mas não foi
possível detectar anticorpos anti-peptídeos pelo método de ELISA. Nossos resultados sugerem que a
vacina Hasumi, assim como a maioria das vacinas anticâncer em estudo, apresenta uma atividade
antitumoral in vivo com eficiência diferente para cada animal, favorecendo a indução de uma
resposta imune do tipo Th2.
16
FEDERAL UNIVERSITY OF CEARÁ
MEDICINE FACULTY
GRADUATION PROGRAM IN PHARMACOLOGY
Experimental Approach of the Antitumoral Activity of a Peptide Anticancer Vaccine (Hasumi Vaccine®)
Marcio Roberto Pinho Pereira
Advisor: Manoel Odorico de Moraes Filho
Summary
The Hasumi vaccine is based on peptides of plasmatic membrane of tumor cells and a
extract of bovine spleen associated with immunostimulants substances. The aim of the present
work was to evaluate the possible anticancer effect of the Hasumi vaccine and its mechanism of
action in animals inoculated with experimental tumors. For the evaluation of the in vivo
antitumoral activity, two groups of female Wistar rats were subcutaneously inoculated with 1.0
X 106 cells of the Walker 256 carcinossarcoma in the armpit area. The groups were
subcutaneously vaccinated immediately with 500 μL of Hasumi vaccine (250 μg of peptides) or
500 μL of saline, and then, they received boosters of these doses every other day until their
death. It was analyzed their survival function and the volume of tumor growth during the
treatment period. The blood of these animals was taken for cell count. Other two groups of rats
were also inoculated with 1.0 X 106 cells of the Walker 256 carcinossarcoma but they suffered
surgical excision of the tumor 5 days after inoculation. After surgery, they received the same
treatment of the above mentioned groups. In another set of experiments, four groups of mice
C57BL/6 were inoculated with 1.0 X 106 melanoma B/16 cells maintained in culture. Three
groups were subcutaneously vaccinated with 1 μL, 10 μL, 100 μL of Hasumi vaccine (0.006 g,
0.06 g, and 0.6 g of peptides) diluted in 200 μL of saline solution, and the fourth group received
only 200 μL of saline. The animals received reinforcements of those doses every 7 days until
their death. During the treatment, it was measured the volume of the tumor and the survival time
of the animals. Other four groups of mice C57BL/6 were also treated in the same way that the
previous groups, however the vaccination were performed by intraperitoneal injection. For the
evaluation of the immunogenicity of the Hasumi vaccine, five groups of Swiss mice were
immunized with 200 μL (100 μg of peptides) of Hasumi vaccine. Egg-albumine (100 μg) was
used as positive control. The results showed that inoculated animals treated with Hasumi vaccine
had their tumor partially inhibited. The total blood count revealed the Hasumi vaccine reverted
the leukocytes rising observed in control group, suggesting an anti-inflammatory activity of the
vaccine. The animals that suffered surgical retreat of the tumor plus vaccination also presented
an inhibition of the tumor growth, and an animal was completely cured. The Hasumi vaccine was
also active in mice inoculated with melanoma, and the vaccine seemed to be more efficient when
injected intraperitoneally. The presence of antibodies IgG1 was verified by the method of PCA,
indicating an immune answer of the Th2 type that is favorable to the anti-inflammatory activity,
but it was not possible to detect antipeptides antibodies using ELISA assay. Our results suggest
that Hasumi vaccine, as the most alike against cancer vaccines, shows an antitumor in vivo
activity with some efficiency, suiting an induction of an immune response of Th2 type.
17
INTRODUÇÃO
1- A VACINAÇÃO
A vacinação pode ser definida como a atividade de imunização que leva uma pessoa à
proteção contra uma determinada doença infecciosa (Ehreth, 2002). Não há dúvidas de que a
vacinação foi uma das maiores intervenções mundiais no campo da saúde pública no século
passado, protegendo milhões de pessoas da morte contra as mais diferentes doenças infecciosas,
causando, inclusive, um impacto global no quadro de crescimento populacional. Apesar desses
avanços, a cada ano nascem 130 milhões de crianças que não tem acesso à vacinação (Ehreth,
2002). Acredita-se que em 1990, 80 % das crianças com até 5 anos foram vacinadas pelo menos
uma vez, mas essa estimativa baixou para 70 % em 1999. De acordo com a Aliança Global para
Vacinação e Imunização (GAVI, 2001), uma em cada quatro crianças no mundo não está
vacinada contra doenças infecciosas que possuem uma vacina específica.
A vacinação em larga escala pode levar à erradicação de epidemias, como a poliomielite e
a varíola, e ao controle da proliferação de outras como tétano e o sarampo. Até o presente, sabese que a varíola contaminou 350 milhões de pessoas e provocou a morte de mais 40 milhões de
pessoas (Andrus, 2001). A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem feito grandes
investimentos para a erradicação completa e definitiva da doença como o Programa de
Intensificação da Erradicação da Varíola que recebeu mais de 300 milhões de dólares nos
últimos 11 anos. Esse investimento é reembolsado quando vidas humanas são salvas, evitando
custos adicionais com internação hospitalar e o tratamento da doença (WHO, 2001). Outro
grande feito da vacinação foi a erradicação do vírus da poliomielite no hemisfério oeste do
Globo. Dos três tipos existentes de poliovírus, apenas o tipo 2 foi detectado pela última vez em
1999 nessa região e parece já ter sido erradicado. Mais de 190 países estão livres da poliomielite
e apenas 20 países da região sudeste da Ásia ainda sofrem com a sua presença. Desde 1998, o
número de casos de poliomielite caiu para 1 % em termos globais de acordo com a OMS. No ano
2000, menos de 3.000 casos de poliomielite foram reportados em todo o mundo. Esse é um
resultado surpreendente, se lembrarmos dos 35.000 casos reportados em 1988 (CDCP, 2001).
18
Em termos econômicos, podemos notar uma clara racionalização nos programas de
vacinação nos países em desenvolvimento. Mesmo assim, o impacto é comprovado e o benefício
é imenso, pois são programas de alta eficiência preventiva e têm elevado valor econômico para
os programas de saúde pública (Swartz & Loevinsohn, 1999). O Banco Mundial considera que as
intervenções na área de saúde possuem um custo-benefício favorável se o custo dessa
intervenção mantiver um indivíduo completamente saudável durante o ano com um gasto menor
do que o Produto Interno Bruto anual de uma nação. A maioria das imunizações custa, por ano,
menos do que U$ 50,00 por pessoa. É bem mais barato, por exemplo, do que o tratamento da
hipertensão, estimado nos EUA entre U$ 4.340,00 e U$ 87.940,00 por pessoa por ano (TWB,
2001). Quando as doenças infecciosas não são controladas, elas podem gerar uma grande
despesa para a economia de uma comunidade ou de um país. Para cada dólar gasto com
vacinação, de U$ 3,94 a U$ 4,91 são poupados (White et al; 1985).
Apesar dos comprovados benefícios econômicos e sociais das vacinas, a queda da prática
intervencionista da vacinação está cada vez maior. Nos países industrializados, esse fato pode ser
explicado, em parte, pelos órgãos responsáveis e até mesmo pela população em geral
subestimarem tanto a gravidade das doenças infecciosas quanto os benefícios que a vacinação
pode trazer para a prática de prevenção tais como a economia nas despesas hospitalares e
internação de pacientes infectados (Breiman, 2001; Henderson, 2000). O processo de erradicação
das epidemias de varíola e poliomielite, consideradas na época um verdadeiro milagre, só foi
possível graças a um trabalho de prevenção com vacinação em larga escala. Nos países em
desenvolvimento a disparidade é ainda maior. Em alguns países na África, uma criança tem dez
vezes mais chance de morrer de uma doença infecciosa que possui vacina específica comparada
à de um país industrializado. Embora as vacinas salvem cerca de três milhões de crianças por
ano, outros três milhões morrem de doenças que possuem vacinas específicas (tabela 1). Seria
possível diminuir essa incidência de mortalidade para mais da metade se o uso das vacinas fosse
corretamente intensificado, ou se os órgãos financiadores estimulassem novas pesquisas para a
descoberta de vacinas que neutralizassem outras doenças infecciosas, como malária, dengue,
doença de chagas e alguns tipos de câncer (Breiman, 2001).
19
Tabela 1: Impacto estimado do aumento da técnica de vacinação em uma população com
doenças prevenidas por vacinas.
Doença
Número de mortes por ano
causadas por doenças
prevenidas por vacinas
Hepatite B
900.000
Sarampo
888.000
Tétano Neonatal
215.000
Tétano
195.000
Febre Amarela
30.000
Difteria
5.000
Poliomielite
Total
720
2.979.720
2- O CÂNCER
Uma célula normal pode sofrer alterações no DNA dos genes, ocorrendo assim
mutação genética. Essas mutações podem ocorrer ocasionalmente ou por indução, a partir de
agentes carcinogênicos (Figura 1). Os carcinógenos atuam alterando a estrutura genética (DNA)
das células. O surgimento do câncer depende da intensidade e duração da exposição das células
aos agentes causadores de câncer. Por exemplo, o risco de uma pessoa desenvolver câncer de
pulmão é diretamente proporcional ao número de cigarros fumados por dia e ao número de anos
que ela vem fumando (INCA-III, 2002).
20
Gênese do Câncer
Ondas de UV
Radiação
Fatores Ambientais, Alimentos
Fumo
Microorganismos
Agentes Químicos
Células Normais
Invasão e
Metástase
Câncer
Célula Neoplásica
Angiogênege
Figura 1: Esquema ilustrativo da transformação de uma célula normal em uma célula cancerosa.
Esses agentes induzem as células, com material genético alterado, a receber instruções
erradas para as suas atividades metabólicas e fisiológicas. As alterações podem ocorrer em genes
especiais, denominados protooncogenes, que, em princípio, são inativos em células normais.
Quando ativados, os protooncogenes transformam-se em oncogenes, responsáveis pela
transformação maligna, comumente chamada “malignização” (cancerização), das células
normais. Essas células transformadas são denominadas cancerosas (INCA-I, 2002).
21
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o
crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo
espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo. Dividindo-se rapidamente, essas células
tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo
de células cancerosas) ou neoplasias malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa
simplesmente uma massa localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se
assemelham ao seu tecido original, raramente constituindo um risco à vida. Atualmente, o câncer
é a segunda causa de morte por doença no Brasil e, em 1994, as neoplasias foram responsáveis
por 10,86% dos 887.594 óbitos registrados, sendo que 53,81% dos óbitos por neoplasia
ocorreram entre os homens e 46,05%, entre as mulheres. Atualmente, os seguintes recursos são
usados no tratamento do câncer: cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormonoterapia e
imunoterapia. Esses recursos podem ser usados ou de forma isolada ou combinada (INCA-II,
2002).
As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo,
estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos
hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. As causas internas são, na
maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à capacidade do organismo de
se defender das agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de várias formas,
aumentando a probabilidade de transformações malignas nas células normais. De todos os casos,
80% a 90% dos cânceres estão associados a fatores ambientais. Alguns deles são bem
conhecidos: o cigarro pode causar câncer de pulmão, a exposição excessiva ao sol pode causar
câncer de pele, e alguns vírus podem causar leucemia. Outros estão em estudo, tais como alguns
componentes dos alimentos que ingerimos, e muitos são ainda completamente desconhecidos. O
envelhecimento traz mudanças nas células que aumentam a sua suscetibilidade à transformação
maligna. Isso, somado ao fato de as células das pessoas idosas terem sido expostas por mais
tempo aos diferentes fatores de risco para câncer, explica em parte o porquê de o câncer ser mais
freqüente nesses indivíduos.
22
3-
IMUNOLOGIA
TUMORAL:
UM
ALVO
PARA
NOVAS
ABORDAGENS
TERAPÊUTICAS CONTRA O CÂNCER
Durante todos os estágios do desenvolvimento tumoral as células neoplásicas interagem,
em maior ou menor escala, com células de defesas do organismo, principalmente na circulação
sangüínea quando migram para colonizar em órgãos alvo. Há mais de cem anos, Wiliam Coley
observou que a regressão tumoral poderia ser induzida pela estimulação do sistema imune por
toxinas bacterianas (Weinstock, 1999). Por volta de 1960, surgiu a teoria da “vigilância
imunológica” do câncer, segundo a qual as células do sistema imune estariam continuamente
“patrulhando” o organismo e eliminando as células em processo de transformação maligna. Esse
conceito de vigilância imunológica foi proposto pela primeira vez por Paul Ehrlich em 1909,
tendo sido reformulado posteriormente por MacFarlane Burnet (1973). Tem sido observado na
prática, entretanto, que a reação imunológica do hospedeiro frente ao desenvolvimento das
neoplasias permite detectar tumores do tipo imunogênico e não imunogênico. Tumores
imunogênicos são aqueles cujas células expressam determinantes que podem ser reconhecidos
como estranhos pelo sistema imune e contra os quais pode ser montada uma resposta efetiva.
Esses determinantes são moléculas expressas na célula tumoral e são denominados antígenos
tumorais. Os tumores não imunogênicos, são aqueles em que o sistema imune não reconhece a
existência das células tumorais. A transformação maligna, por outro lado, pode ser acompanhada
por alterações fenotípicas, incluindo a perda de componentes antigênicos na superfície celular,
em um mecanismo conhecido como “escape tumoral” (Seliger et al., 2000).
A função do sistema imune no controle do desenvolvimento tumoral e progressão
metastática é feita principalmente pela imunidade celular, com os linfócitos T, células “Natural
Killer” (NK) e macrófagos. Uma observação histológica comum que sugere a imunogenicidade
de alguns tumores é a presença de infiltrados de células mononucleares compostos de linfócitos
T, células “Natural Killer” e macrófagos ao redor da massa tumoral. O prognóstico de certos
tipos de tumores, dessa maneira, encontra-se favoravelmente associado à identificação
histológica, no sítio tumoral, de um abundante infiltrado de células imunes (Cerundolo, 1999).
23
A imunidade tumoral mediada pelas células T tem início com a apresentação de
antígenos às células Tc CD8+ ou Th CD4+. Essa apresentação dá-se através de células
especializadas denominadas Células Apresentadoras de Antígenos, as quais devem encontrar-se
associadas a moléculas MHC (complexo principal de histocompatibilidade) de classe I e II. As
moléculas de MHC são glicoproteínas integrais de membrana. Para que assim sejam
apresentadas pelo MHC II, as moléculas antigênicas são fagocitadas ou endocitadas pela Célula
Apresentadoras de Antígenos e degradadas em pequenos peptídeos nos lisossomos. Os
fragmentos peptídicos são então seletivamente associados a moléculas classe II e o complexo
transportado para a superfície celular. Da mesma forma, ocorre com as Células Apresentadoras
de Antígenos que apresentam MHC I, com a diferença que os antígenos não são fagocitados, mas
sintetizados dentro das próprias células, como proteínas virais ou oncogênicas (Abbas et al.,
2000).
As células Th podem também ser ativadas por células tumorais. Melanomas humanos
freqüentemente expressam moléculas MHC II. As Células Apresentadoras de Antígenos
produzem ainda citocinas envolvidas na ativação dos linfócitos, principalmente a IL-1 que vai
ativar a célula Th estimulada por antígenos (Cavaillon, 1994). A IL-1 ativa ainda as células NK e
os macrófagos, induzindo neste último a produção de TNF. Após a estimulação pela IL-1, as
células Th tanto expressam receptores para IL-2, como começam a produzir a própria IL-2,
efetuando uma ação autócrina. A IL-2 é a principal citocina secretada pela célula Th, sendo um
importante fator estimulador de crescimento para linfócitos e macrófagos. As células Th ativadas
secretam outras citocinas, como o TNF, IFN-γ entre outros que, junto com a IL-2, vão atuar nas
populações celulares envolvidas na imunidade celular, como os linfócitos T citotóxicos (Tc),
macrófagos e células exterminadoras naturais (NK), além dos linfócitos B (Arenzana et al.,
1985; Anton et al., 1996; Drapier & Hibbs Jr, 1988; Green et al., 1992; Allavena et al., 1990).
Inicia-se assim, uma cascata de fenômenos humorais e celulares que resultará na imunidade
antitumoral (Figura 2). As citocinas liberadas pelas células Th podem ainda induzir inflamação e
necrose hemorrágica (Fitzpatrick, 2001). Em algumas circunstâncias, as células Th secretam
citocinas, como a linfotoxina, capazes de recrutar efetores não específicos diretamente para o
sítio de crescimento tumoral (Kreitman, 1999).
24
Ativação de
Fagócitos
Expansão
Clonal
Produção de
Anticorpos pelos
Linfócitos B
Inflamação
Citocinas
(IL-2)
Células de
Memória
Lise da
Célula
Infectada
Célula
Infectada
Figura 2: Ativação do linfócito Th CD4+ levando às ações efetoras da resposta imune mediada
por células.
25
Dentre as citocinas mais importantes que atuam sobre o tumor, podemos destacar o IFN
(Intereron). O subtipo IFN-α é utilizado como imunoterepia de segunda escolha no tratamento
do câncer de bexiga superficial em pacientes que não respondem ao tratamento com BCG.
Além disso, essa citocina pode ser utilizada com sucesso na prevenção de hepatocarcinoma em
pacientes que soropositivos para hepatite C (Santhanam, et al., 2002). Mais recentemente, o
IFN-α está sendo utilizado como imunoterapia de primeira escolha contra a leucemia mielóide
crônica devido o aumento da sobrevida observado nesses pacientes quando comparado à
quimioterapia convencional (Bacarani, et al., 2003). Mas a atuação dessa citocina não se
restringe apenas a esses tipos de tumores. Câncer de cabeça e pescoço, Sarcoma de Kaposi,
câncer de pulmão, câncer de ovário, de mama e metástases provenientes de diferentes tumore
sólidos são considerados potenciais alvos de imunoterapia com IFN-α (Wall, et al., 2003;
Santhanam, et al., 2002; Sternberg, 2003).
As células Tc CD8+, por sua vez, reconhecem os antígenos tumorais quando os mesmos
estão em associação com moléculas do MHC classe I (van Endert, 1999). A ligação do
complexo antígeno tumoral/molécula MHC I com os receptores nas células Tc dá início a uma
sinalização intracelular para o núcleo do linfócito, estimulando a expressão de suas funções
efetoras que, no caso, é destruir a célula tumoral alvo por meio de liberação de linfotoxinas
como: perforinas, cuja função é induzir lise da célula alvo por desrregulação osmótica,
granzimas que são proteínas ativadoras de caspases e apoptose celular, e finalmente a ativação
da molécula do Fas e Fas ligante, onde a união dessas moléculas induz sinais intracelulares para
ativação de caspases e apoptose celular (Abbas et al., 2000). A resposta das células Tc pode
consistir em proliferação, aumento da regulação de moléculas de superfície, ativação da
maquinaria lítica e/ou secreção de citocinas como IL-2, IFN-γ , GM-CSF e TNF-α (Klimp et
al., 2002). Para a célula Tc tornar-se completamente ativada, ela deve receber estímulos
adicionais, provenientes da ligação de citocinas aos seus receptores de superfície, citocinas
essas secretadas pelas células Th. Após uma ativação bem sucedida, a célula Tc divide-se em
vários clones, todos com especificidade antigênica idêntica. Estes clones vão estar aptos a
efetuar a função de vigilância imunológica, reconhecendo e destruindo de células
potencialmente malignas, as quais expressam peptídeos derivados de proteínas celulares
mutantes em associação a moléculas MHC I (Figura 3). É interessante notar que o TNF e IFN-γ
26
secretados pelas células Th podem aumentar a expressão da molécula do MHC I em células
alvo e, conseqüentemente, a lise das mesmas pelos linfócitos Tc (Sharon, 1998).
Apresentação do
Antígeno tumoral ao Linfócito
T CD8+ (CTL)
Ativação do Linfócito T
Liberação de
Substâncias
Citotóxicas
(Linfotoxinas)
Desligamento da CTL
Lise da Célula
Alvo
Figura 3: Ativação do linfócito T CD8+ e seu mecanismo de eliminação da célula cancerosa.
27
A interação entre as células Tc e as células tumorais, entretanto, depende ainda de uma
interação entre a integrina LFA-1, expressa nos linfócitos, e a molécula ICAM-1 (intercellular
adhesion molecule-1), expressa na célula alvo tumoral e cuja expressão é estimulada por TNF,
IL-1, IFN- ou IL-6. Essa ligação entre LFA-1 e ICAM-1 estabiliza o conjugado citolítico entre
linfócitos Tc e a célula tumoral. A perda da expressão de ICAM-1 parece permitir às células
tumorais circulantes evitar o estabelecimento de conjugados citolíticos estáveis, podendo
significar a evasão da destruição pelos linfócitos Tc (Jonjic et al., 1992; Webb et al., 1991;
Bernasconi et al., 1991).
A terceira linha de defesa na imunidade celular seriam os macrófagos associados a
tumores (TAM-"Tumor-Associated Macrophages") que representam o maior componente do
infiltrado de vários tumores humanos (Klimp et al., 2002). Em adição à apresentação de
antígenos, os macrófagos possuem, eles mesmos, uma capacidade citotóxica tumoral mas,
apenas quando ativados por citocinas secretadas por células Th (como IFN-γ) (Yagisawa et al.,
1999, Boehm et al., 1997). As propriedades tumoricidas dos macrófagos têm sido demonstradas
extensivamente in vitro. Os mecanismos de destruição celular incluem a liberação de TNF, IL-1,
radicais livres, proteases e óxido nítrico (Kroncke et al., 1995; Adams & Hamilton, 1992). As
citocinas liberadas pelos macrófagos, por sua vez, vão recrutar células imunes secundárias para o
sítio tumoral, de maneira a amplificar os efeitos tumoricidas não-específicos. Os macrófagos
podem, também, destruir células tumorais sensibilizadas por anticorpos, atuando como efetor não
específico da via de citotoxicidade celular antígeno-específica dependente de anticorpo (ADCC)
(Shaw et al., 1978; Kawase et al., 1985). Os TAM portanto, parecem ter uma função central nas
vias de ambas as imunidades antitumorais, a específica (através da ativação inicial de células
CD4+) e a não-específica (através de suas propriedades tumoricidas e de sua função de secreção
de citocinas).
Um outro tipo de resposta, que não a celular, é a resposta imune humoral. Embora a
imunidade celular seja a mais importante resposta antitumoral, os hospedeiros que portam um
tumor produzem anticorpos contra antígenos tumorais. O potencial de destruição das células
tumorais mediado por anticorpos tem sido largamente demonstrado in vitro e é atribuído à
opsonização, ativação do complemento, ou à citotoxicidade celular dependente de anticorpos,
28
tendo como efetores macrófagos ou células NK (Fan et al., 1991; Johnson et al., 1986). A função
real in vivo para esse mecanismo de destruição dependente de imunoglobulina permanece
desconhecida, não existindo evidências para uma função protetora contra o desenvolvimento e
progressão tumoral.
As Células Dendríticas também desempenham um importante papel na imunologia
tumoral. Essas células são consideradas as principais apresentadoras de antígeno para linfócitos
T. Uma Célula Dendrítica fenotipicamente imatura é capaz de fagocitar células apoptóticas e
necróticas (Por exemplo, células tumorais), micróbios e antígenos solúveis em geral. As Células
Denríticas também são capazes de ativar lifócitos B para sintetizar anticorpos contra antígenos
tumorais por um processo ainda não muito bem esclarecido (Dallal & Lotze, 2000). O infiltrado
tumoral recebe as Células Dendríticas circulantes do sangue ou células mononucleares que se
diferenciam em Células Dendríticas devido a ação de citocinas e a fagocitose de antígenos
associados ao tumor. Após a fagocitose, a célula amadurece e processa o antígeno, apresentandoo ao linfócito T promovendo sua ativação nos órgãos secundários (Alters et al., 1997).
Atualmente existem numerosas estratégias para manipular as Células Dendríticas contra células
tumorais. Pepitídeos tumorais, células neoplásicas lisadas ou apoptóticas e RNA mensageiro
pulsados associam-se ao MHC no interior de Célula Dendrítica otimizando sua ação para ativar
linfócitos T antitumorais (Ashley et al., 1997).
4- VACINAS ANTICÂNCER
A idéia de inibir o crescimento de um tumor estimulando o sistema imune não é recente.
Na verdade, a mais de um século, os pesquisadores acreditam que é possível criar uma vacina
conta o câncer, seja ela específica ou não. Por essa razão, o termo “vacina anticâncer” tem sido
utilizado de forma indiscriminada para designar qualquer imunofármaco capaz de estimular o
sistema imune para combater células neoplásicas (Moingeon, 2001). A primeira tentativa de
estimular a resposta imune para combater o câncer foi usando um extrato de bactérias (Coley,
1893), sendo depois substituído por BCG, este último sendo extensivamente utilizado até hoje
29
como terapia imunoadjuvante contra o câncer (Morales et al., 1976; Lipton et al., 1991; Zorn et
al., 1997). Citocinas estimulatórias também foram usados contra muitos tipos de câncer, mas
apesar de alguns resultados positivos, em particular no melanoma e câncer renal, já foi
comprovado que a sua utilização no tratamento é limitada pela sua forte toxicidade sistêmica
(Marincola et al., 1995). A transferência passiva de células citotóxicas (linfócitos infiltrados,
células NK) foi subseqüentemente testada em humanos com algum progresso (Rosenberg et al.,
1988). Entretanto, esse processo rapidamente também demonstrou algumas limitações, como a
ineficiência da maioria dos linfócitos não terem a capacidade de se dirigirem especificamente
para tumor, provavelmente pela ausência de algumas moléculas de adesão nas células tumorais,
o que dificultaria a infiltração dos linfócitos. Nos últimos anos, novas observações no campo da
biologia molecular e da própria imunologia tumoral, tem aumentado o interesse em desenvolver
a imunoterapia anticâncer. Uma outra alternativa para a imunoterapia anticâncer foi a utilização
de anticorpos monoclonais direcionados para antígenos tumorais. Esse método obteve bons
resultados clínicos e hoje podem ser encontrados na clínica alguns exemplos bem sucedidos
dessa terapia como o anticorpo 17-1A para o tratamento câncer coloretal metastático, o antiCD20 para linfoma de células B e o mais conhecido, o anti-Her 2 para o câncer de mama
metastático (Scott & Welt; 1997). Atualmente, um grande número de vacinas anticâncer está
sendo testado em animais e em seres humano visando o aperfeiçoamento das vacinas contra o
câncer.
Em teoria, as vacinas anticâncer deveriam ser terapias ausentes de efeitos indesejados
capazes de induzir uma resposta específica tanto contra o tumor primário, como contra a
metástase. Adiciona-se a esse raciocínio, que uma poderosa imunização deve ser estabelecida
pela memória imunológica, impedindo a recorrência do tumor. A natureza da resposta imune que
se estabelece após a imunização com esses antígenos de superfície ainda não está claro, mas já é
consenso de que uma boa vacina anticâncer deve induzir uma ampla resposta imune. Isso
dificulta a especificidade do processo, o que pode acarretar em efeitos colaterais ainda não
controláveis. Por essa razão, vacinas que utilizam anticorpos específicos, seja por imunização
ativa ou passiva, contra os antígenos de superfície podem ser extremamente úteis como uma
terapia de maior especificidade, e ainda induzem um processo efetor de ADCC. Em uma outra
análise, a indução de uma forte resposta imune celular parece também exercer um papel
30
relevante. Linfócitos T citotóxicos ativados apresentam uma forte atividade lítica contra células
tumorais se forem bem redirecionados, e parece ser o método mais eficaz para uma resposta
terapêutica (Yee et al., 1997).
Mas a descoberta de maior impacto na terapia anticâncer foi os Antígenos Associados ao
Tumor (AAT), uma coleção de peptídeos ou glicopeptídeos de superfície de membrana que
podem ser usados para fins de imunização ativa (Van der Eynde & Brichard, 1995; Rosemberg,
1997; Gilboa, 1999; Offringa et al., 2000). As últimas pesquisas vêem apontando o
reconhecimento das AAT como as candidatas de maior importância e eficácia para uma
imunização eficiente e duradoura contra o câncer. Alguns AAT já estão bem caracterizados,
como o P1A, gp100, Mart1, TRP1, TRP2, p53, entre outros. A tabela 2 especifica os diferentes
tipos de AAT e os tumores onde foram encontrados.
Os Antígenos Associados ao Tumor podem ser encontrados em células neoplásicas e em
células normais do organismo. Em experimentos com animais, esses peptídeos são utilizados
para imunização de forma pura, ou com adjuvantes, ou até mesmo apresentado pelo DNA
recombinate de plasmídio ou de vírus. Este último existe um interesse especial, pois pode
infectar uma célula apresentadora de antígeno e induzi-la a apresentar este antígeno em
associação com o MHC de classe I e gerar uma forte resposta citotóxica via linfócito T (Restifo,
1996). Outra grande barreira que pode ser ultrapassada com a imunização dos AAT é a quebra da
tolerância imunológica induzida pelas células tumorais. Os linfócitos que percorrem a periferia
sofrem um processo de tolerância contra esses antígenos, ou seja, eles se encontram anérgicos.
Esse é um dos maiores problemas a ser enfrentado pelos imunologistas do câncer quando
utilizam os AAT como componentes de vacinas.
Alguns experimentos em animais permitiram demonstrar que essas vacinas podem até
derrubar a barreira da tolerância, mas podem induzir também sinais inaceitáveis de
autoimunizade (Naftzger et al., 1996). Contudo, ainda existe muita polêmica em relação aos
modelos animais usados para esses experimentos. Isso porque os animais e as linhagens tumorais
utilizados nesses experimentos não reproduzem o desenvolvimento tumoral em seres humanos.
31
Tabela 2: Tipos de vacinas anticâncer mais recentes.
Tipos de Vacinas
Células Alogênicas
Proteínas de Choque
Térmico
Gangliosídios
Peptídeos
DNA
Vantagens
Desvantagens
- Apresenta antígenos
relevantes apenas ao
paciente.
- Apresenta numerosos
antígenos.
- Requer produção de
vacina individual.
- Requer uso de
adjuvantes.
- Apresenta antígenos
relevantes apenas ao
paciente.
- Apresenta numerosos
antígenos.
- Requer produção de
vacina individual.
- Imunogenicidade ainda
contestada.
- Componentes bem
caracterizados.
- Imunogenicidade e
segurança comprovada.
- Difícil de preparar.
- Requer uso de
adjuvantes.
- Simples de preparar
- Segurança bem
estabelecida.
- Requer uso de
adjuvantes.
- Apresenta apenas
epitopos simples.
- Apresentação restrita ao
HLA.
- Simples de preparar.
- Apresenta numerosos
antígenos.
- Presença de seqüências
imunoestimulatórias no
próprio vetor.
- Resultados clínicos
contestáveis.
32
Uma conseqüência desse fato é a provável ausência de resultados positivos em
testes pré-clínicos com vacinas direcionadas para a terapia em seres humanos. Para atender
a necessidade de possibilitar a terapêutica das diferentes linhagens tumorais, vários tipos de
vacina foram desenvolvidas (Wolchok & Livingston, 2001).
Vacinas de células alogênicas: Existem dois tipos de vacinas produzidas com células
neoplásicas: as alogênicas e as autólogas. As vacinas de células alogênicas têm a vantagem
de conter um potencial antigênico muito maior, além da simplicidade para o seu preparo.
Entretanto, apesar da alta antigenicidade, esse tipo de vacina apresenta uma baixa
imunogenicidade, o que dificulta um potente estímulo imunológico contra o tumor.
As células alogênicas vem sendo estudadas por muitos grupos de pesquisadores.
Existem evidências bem documentadas de que esse tipo de vacina pode induzir uma
resposta imune humoral contra muitos antígenos, principalmente de melanoma, incluindo
gangliosídios e antígenos de diferenciação do melanoma (Hsueh, 1998; Takahashi et al.,
1999). Os comerciais CancerVax e Melacina são os dois principais exemplos de vacinas de
células autólogas que existem no mercado com uma eficácia garantida. Estudos de fase III
desenvolvidos no Instituto do Câncer John Wayne nos EUA indicam que essas vacinas são
de maior interesse na prevenção contra a recorrência do tumor após o tratamento inicial.
Uma das imunoterapias que são derivadas das vacinas de células alogênicas é o uso de
antígenos oriundos de linhagens de células tumorais, que são subseqüentemente mantidos
em cultura para manutenção. As imunizações recorrentes desses antígenos mostraram uma
alta indução da ativação de células T contra antígenos do tumor. Todavia, é necessário um
estudo randomisado para saber o real benefício clínico dessa técnica (Reynolds et al.,
1998).
33
Vacinas de células autólogas: Vacinas de células autólogas possuem a grande vantagem
de conter apenas os antígenos relevantes para o paciente portador do tumor. Com essa
filosofia, cada paciente terá uma vacina específica para o tratamento do próprio câncer. A
maioria das vacinas é preparada associada a um hapteno: o dinitrofluorobenzeno. Uma de
suas maiores desvantagens é o tempo necessário para criar uma vacina específica para cada
paciente e, além disso, a baixa imunogenicidade dos antígenos expressos no tumor. Uma
intrigante descoberta sobre as vacinas de células autólogas é a sua habilidade de induzir
inflamação nos locais metastáticos distantes da área de imunização (Berd et al., 1991).
Ainda existem muitas críticas em relação a esse tipo de vacina, principalmente quanto ao
seu potencial em aumentar a sobrevida de pacientes com recorrência do tumor. Isso indica
uma maior necessidade de estudos clínicos randomizados.
A introdução de genes que codificam citocinas ou quimiocinas nas células autólogas
tem sido explorada com a intenção de aumentar a potência da resposta imune.
Experimentos de Dranof e colaboradores (1993) sugerem que o fator estimulador de
colônias de granulócito/macrófago (GM-CSF) tem a habilidade de aumentar a atividade
antitumoral em modelo de melanoma B16 em camundongos. Nesse sentido, pesquisas
clínicas em fase inicial com vacinas de células autólogas que expressam o gene codificador
do GM-CSF tem mostrado que a vacina pode induzir uma resposta inflamatória localizada,
bem como na região de lesão metástica distante do tumor primário. (Soiffer et al., 1998;
Ellem et al., 1997; Dranoff et al., 1997). Apesar das respostas clínicas apontarem para o
sucesso dessa terapia, a interpretação dos resultados estatísticos fica comprometida pelo
baixo número de pacientes onde a vacina foi testada. Mais experimentos são necessários
para esclarecer o verdadeiro impacto que essas vacinas podem exercer na terapêutica.
Vacinas Gangliosídicas: As vacinas preparadas com antígenos caracterizados e
purificados possuem várias vantagens em relação aos outros preparados. Os antígenos
possuem alta imunogenicidade e induzem especificidade na resposta imune. Podemos,
inclusive, escolher o tipo de resposta imune desejado baseado na natureza do antígeno ou
34
do adjuvante em questão. Vários modelos pré-clínicos e testes clínicos suportam o fato
dessas vacinas, quando usados como tratamento adjuvante, induzirem a formação de
anticorpos que por ADCC eliminam células tumorais de micrometástases (Wolchok &
Livingston, 2001). Os alvos para as vacinas que induzem anticorpos devem ser as
moléculas de membrana das células tumorais, onde o complexo antígeno-anticorpo se liga a
um receptor Fc nas células fagocitárias, facilitando os mecanismos efetores de opsonização.
Por esse motivo, um dos alvos moleculares mais utilizados na imunoteraêutica anticâncer
são os gangliosídios, antígenos expressos na superfície dos tumores, especialmente os de
melanoma.
Gangliosídios são estruturas ácidas de glicolipídios que possuem em sua estrutura
uma cadeia de ceramida hidrofóbica e uma porção glicosídica constituída de açúcares
neutro e siálico. São extremamente abundantes na superfície de células do melanoma e, por
conseguinte, são umas das maiores fontes de vacinas contra esse tipo de tumor. Os
antígenos mais conhecidos são o GM3 e o GD3. Mas ainda podemos citar o GD2, GM2
(este o mais imunogênico gangliosídeo e alvo de várias pesquisas), e o O-acetil GD3
expressos em grande abundância (Zhang et al., 1997). Testes iniciais com vacinas de
gangliosídios mostraram uma forte relação entre a presença de anticorpos anti-GM2 em
soro de pacientes imunizados e sobrevida aumentada desses pacientes. 122 pacientes
apresentando estágio III de melanoma sofreram uma cirurgia para a retirada do tumor, mas
o risco de recorrência era ainda muito grande. Então, foi realizado um estudo randomizado
onde uma parte dos pacientes foi imunizada com GM2 associado ao BCG, e outra parte foi
imunizada apenas com BCG. O resultado foi uma resposta anti-GM2 humoral com
presença de IgM específica em 85 % dos pacientes tratados, com uma pequena margem de
sobrevida significante para os pacientes tratados com GM2/BCG (Livingston et al., 1994).
Esse experimento foi a primeira evidência de que os anticorpos anti-gangliosídios poderiam
trazer benefícios clínicos para pacientes com melanoma. As novas formulações para
vacinas contendo GM2, chamadas de GMK, apresentam um conjugado (“keyhole limpet
haemocyanin”), e uma associação com o adjuvante QS21. Com essa formulação,
aproximadamente 100% dos pacientes apresentam anticorpos anti-GM2. Além desses
resultados, a vacina GMK tem sido testada em estudos de fase III randomisado e os
35
resultados indicam um pequeno aumento de 15 % na sobrevida dos pacientes que são
vacinados com o gangliosídio (Helling et al., 1995; Chapman et al., 2000).
O GM2 constitui apenas uma pequena minoria de um grande grupo de gangliosídios
presente na superfície de células do melanoma, entretanto é uma das moléculas mais
importantes para o tumor. Por esse motivo, menos de 20% das células do melanoma podem
ser lisadas pelo sistema complemento e anticorpos monoclonais contra o GM2.
Conseqüentemente, anticorpos adicionais têm que ser induzidos contra outros gangliosídios
da superfície das células neoplásicas para se chegar a um resultado clínico favorável.
Ragupathi e colaboradores (2000) demonstraram que anticorpos anti-GD2 e GD3 pode ser
induzido na maioria dos pacientes após sua imunização associado quando conjugado ao
“keyhole limpet haemocyanin”. Outra maneira seria o uso de anticorpos monoclonais antiidiotípicos que mimetizem os gangliosídios. Essa prática pode ser útil para quebrar a
tolerância e induzir células T a se ativarem e induzir a síntese da classe G de anticorpos
(Sen et al., 1997; Cheung et al., 1993; Saleh et al., 1993; McCaffery et al., 1996; Yao et
al., 1999; Foon et al., 2000).
Vacinas de peptídeos: Os avanços nos últimos 15 anos na Biologia Molecular e na
Imunologia nos permitiram conhecer com mais detalhes os mecanismos efetores das células
T. Em especial, os peptídeos de superfície da membrana plasmática tem sido intensamente
estudados e identificados por serem pequenas proteínas endógenas que se ligam ao MHC
de classe I para apresentação ao linfócito T CD8+ e, portanto, terem um alto potencial
antigênico. Um dos primeiros peptídeos caracterizado foi o derivado da tirosinase, uma
enzima envolvida da biosíntese de melanina. Outros antígenos que mostraram mediar o
reconhecimento das células neoplásica pelas células T são: gp100, proteína-2 relacionada a
tirosinase (TRP-2), Melan-A/MART-1, Her2 neu, Muc, Syalyl Tn, KSA, MAGE, BAGE,
GAGE, entre muitos outros, todos candidatos em potencial a serem usados como vacinas
anticâncer (Moingeon, 2000). A tabela 3 mostra os principais peptídeos caracterizados e o
seu tumor de origem.
36
Já existem vários testes clínicos sendo realizados com estes antígenos. Alguns deles,
como o gp100 são usados na uma forma alterada quimicamente para intensificar a ligação
do peptídeo à molécula de MHC de classe I e dessa forma intensificar a resposta imune
contra o agressor. Os efeitos da estimulação da resposta imune celular aos peptídeos podem
ser constatados quando, por exemplo, isolamos células T periféricas de pacientes com
câncer e estimulamos estas mesmas células T in vitro pelo menos durante 7 dias na
presença do peptídeo antes de serem inseridas no paciente a fim de destruir o tumor. Essa
técnica de estimulação ex vivo de células T vem sendo utilizado com sucesso como
tratamento adjuvante de muitos tumores. Por alguma razão desconhecida, a estimulação in
vivo dessas mesmas células T não produz o mesmo efeito para combater o tumor
quanto a estimulação in vitro (Lee et al., 1999). Na maioria dos experimentos, os peptídeos
são administrados com o adjuvante incompleto de Freund (Jager et al., 1996; Rosenberg et
al., 1998; Marchand et al., 1999). Os adjuvantes são necessários pelo fato dos peptídeos
terem baixo poder imunogênico, e para quebrar a barreira da tolerância imunológica
imposta pelo próprio tumor. Muitos dos adjuvantes usados em associação com peptídeos
são extremamente tóxicos para seres humanos. Outros adjuvantes, como os sais de
alumínio, adjuvante incompleto de Freund, QS-21 ou GM-CSF, são de interessante
particular, pois podem induzir o recrutamento de células dendríticas ao local de
imunização. Acredita-se que cada peptídeo pode induzir uma resposta diferente quando
associada com um determinado adjuvante. Com esse intuito, Schaed e colaboradores (2000)
verificaram que a resposta imune foi mais intensa quando antígenos de melanoma, como a
tirosinase e gp100, são associados ao GM-CSF ou ao QS-21 e menos intensa quando usado
o adjuvante incompleto de Freund. Nesse experimento, o GM-CSF e o QS-21 estimularam
de forma muito mais agressiva linfócitos T CD8+ (resposta imune citotóxica) contra os
peptídeos de membrana, iniciando uma resposta antitumoral. Os estudos continuam visando
descobrir a melhor combinação de adjuvantes para cada peptídeo.
37
Tabela 3: Peptídeos de membrana de células neoplásicas utilizados como alvos
moleculares.
Peptídeo
MAGE 1, MAGE 3
Tumor de Origem
Melanoma, Pulmão, Cabeça e Pescoço, Bexiga
gp100 / gp100 modificado
Melanoma
Mart 1
Melanoma
Mart 1, tirusinase, gp100
Melanoma
Her2 neu
Mama, Adenocarcinoma de cólon
Ras Mutado
Melanoma, Câncer de Pâncreas
MUC1 (lipopeptídeo)
Câncer de Mama
Gastrina
Câncer de estômago, Pâncreas
38
Vacinas baseadas em proteínas de choque térmico: Nos últimos anos, proteínas que sofriam
um processo de choque térmico (HSPs) começaram a serem utilizadas como estimulantes do
sistema imune com fins de atividade antitumoral. HSPs são moléculas tumorais intracelulares
que são reconhecidas por terem a função de carreadores de peptídeos com alto potencial
imunogênico (Srivastava et al., 1994; Blachere & Srivastava, 1995; Heike et al., 1996;
Srivastava, 1997; Janetzki et al., 1998). A purificação de HSPs de células tumorais tem gerado
uma vasta lista de moléculas aptas a induzir uma imunidade antitumoral. Sabe-se que os HSPs
são realmente importante para a indução da resposta imune, embora o mecanismo exato da
apresentação do peptídeo-HSP ainda seja tópico de investigação. Uma hipótese seria a ligação
específica de HSPs a superfície das células apresentadoras de antígenos, sendo então fagocitado
e, uma vez no interior da célula, estimularia a síntese da molécula de MHC de classe I
(Castellino et al., 2000). Outro possível mecanismo da estimulação da apresentação do MHC de
classe I envolve uma rota citoplasmática na qual o HSPs é associado ao TAP e proteasomas do
citosol (Arnold-Schild et al., 1999). Alguns estudos clínicos de fase I com preparados de HSPs
autólogos já estão em andamento para combater alguns tumores. Em um destes estudos, HSPs
(particularmente o HSP96) foi purificado de tumores do próprio paciente e injetado por via
intradérmica. Os resultados mostraram que a técnica é segura e realmente possui uma ação
antitumoral, ainda que seja pequena (Wolchok & Livingston, 2001).
Vacinas de DNA: A imunização com o DNA de plasmídio que codificam antígenos de células
tumorais é a mais recente e promissora estratégia desenvolvida para induzir a ativação de células
T e a produção de anticorpos específicos. Nessa técnica, o plasmídio contendo a seqüência
gênica que codificará o antígeno tumoral é administrado na pele ou no músculo do paciente onde
será processado por células apresentadoras de antígeno profissionais, como as células
dendríticas. A maneira exata como o antígeno é introduzido nestas células ainda é foco de
investigação (Porgador et al, 1998; Casares et al., 1997; Akbari et al., 1999). Uma das hipóteses
mais aceita é a introdução do gene em células que não são boas apresentadoras de antígenos,
como keratinócitos ou miócitos. Estas células farão a transcrição e tradução dos genes que
codificam as proteínas tumorais nas quais serão secretadas para o exterior da célula. Em seguida,
as células dendríticas fagocitam e processam a proteína tumoral, e a apresentam para as células T
em locais apropriados, como nos nódulos linfáticos de drenagem. Embora as células dendríticas
39
sejam apenas minoria entre outras existentes na região da pele ou do músculo, a grande
habilidade dessas células de apresentarem antígenos permite o sucesso da metodologia.
A imunização por DNA oferece várias vantagens. Uma delas é o fato de permitir
múltiplos epitopos em potencial, pois não é necessária uma restrição do antígeno ao MHC, como
é necessário nas imunizações clássicas. Outra, é o plasmídio, utilizado nas imunizações, conter
seqüências CpG imunoestimulatórias não-metiladas na qual pode agir como um potente
adjuvante imunológico (Klinman et al., 1996; Sato et al., 1996). Além disso, a molécula de DNA
em si é fácil de ser purificado em grandes quantidades para qualquer prática.
5- VACINA HASUMI: INFORMAÇÕES GERAIS
A Vacina Hasumi foi desenvolvida em 1935 pelo médico Kiichiro Hasumi, sendo o seu
uso clínico iniciado no Japão em 1948, para tratamento do câncer. Trata-se de um imunoterápico
que associa um adjuvante obtido de extratos celulares do baço bovino e antígenos tumorais
obtidos de extratos da membrana de células neoplásicas de cada tipo histopatológico de câncer.
A vacina Hasumi vêm sendo usada a mais de 50 anos, no Japão e em outros países, em mais de
100.000 pacientes com câncer. Além disso, tem sido também indicada para o tratamento de
40
Vacina Hasumi
Adjuvante
Antígenos Tumorais
MHC I e II
Célula de Langerhans
Célula Dendrítica
Figura 4: Aparente mecanismo apresentação dos antígenos em Células Dentríticas ativadas pelo
adjuvante da vacina Hasumi.
41
doenças inflamatórias, sem que tenha sido observado, em ambos os casos, efeitos colaterais
relevantes. A Vacina Hasumi é constituida por dois componentes baseados em adjuvantes e
antígenos. O adjuvante é retirado de células de baço de bezerros e o antígeno, de diversas formas
de tumor. Trata-se de um material fisiologicamente ativo, contendo ácidos graxos não-saturados
e outras substâncias que, aparentemente, estimulam a maturação das células dendríticas (Figura
4). O antígeno é preparado isoladamente, a partir de um extrato de membranas de células de
tumores bem definidos patologicamente. Após a homogeneização do tecido neoplásico, utiliza-se
uma solução de colagenase e EDTA para fazer a suspensão das células. Em seguida a extração
osmótica e a sonicação, os componentes da parede celular são fracionados com o uso de
centrífuga com gradiente de densidade. Então, após o processo de solubilização, utiliza-se a
cromatografia de coluna de lectina para recolher os polissacarídeos e as glicoproteínas. A Vacina
Hasumi é um líquido incolor estéril, acondicionado em ampolas de vidro, no volume de 0,5 mL,
separadamente, antígeno tumoral e extrato de baço bovino (Shukokai do Brasil, 1999).
A Vacina Hasumi já existia muito antes da implantação dos modernos regulamentos de
registro de fármacos e somente era usada sob prescrição médica. Como o seu uso era
condicionado ao acompanhamento médico e não havia efeitos adversos significantes, ela
continuou a ser utilizada sem restrições. Recentemente, a Shukokai Incorporated, responsável
pela fabricação da vacina, em função da grande procura do seu produto, encorajou-se para
preencher todas as exigências requeridas para o seu registro em diversos países. No Brasil, o
nosso trabalho pretende contribuir com um estudo pré-clínico da vacina Hasumi para um
possível registro de patente e utilização terapêutica desse imunofármaco no país.
42
OBJETIVOS GERAIS:
Estudo farmacológico da atividade antitumoral pré-clínico da vacina anticâncer Hasumi.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1- Quantificar as proteínas existentes nas ampolas da Vacina Hasumi.
2- Demonstrar a capacidade da vacina Hasumi de inibir o crescimento tumoral in vivo do
carcinossarcoma de Walker 256 em ratos “Wistar” que foram submetidos, ou não, à retirada
cirúrgica do tumor, bem como de influenciar alguma alteração no hemograma dos animais.
3- Demonstrar a capacidade da vacina Hasumi de inibir o crescimento tumoral in vivo e do
melanoma B16 em camundongos C57BL/6.
4- Estudar a eficiência da vacina Hasumi em aumentar a sobrevida de animais experimentais
com Walker 256 e melanoma B16, bem como o possível mecanismo de ação da vacina.
5- Contribuir para uma maior compreensão dos mecanismos de ativação do sistema imune contra
o melanoma B16 por diferentes vias de imunização.
43
MATERIAL E MÉTODOS
1- VACINA:
A vacina Hasumi foi cedida pela Shukokai do Brasil – Ltd (São Paulo, SP, Brasil). A
composição dos peptídeos e do adjuvante contidos nas ampolas da vacina Hasumi está exposta
nas tabelas 4 e 5.
2- REAGENTES:
Álcool 70% - MERCK
Azul de Trypan 0,4% - MERK
Azul de Evans - MERK
Solução Fisiológica – MADREVITA
Soro Fetal Bovino – CULTILAB
Tripsina – DIFCO
Imunoglobulinas Policlonais de Cabra Anti–Camundongos Conjugados a Peroxidase –
SEROTEC
Leite Desnatado – NESTLÉ
Solução Reveladora da Peroxidade – SIGMA
Penicilina/Gentamicina - CULTILAB
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Tabela 4: Peptídeos contidos na vacina Hasumi e seu(s) respectivo(s) tumor(es) de origem.
Peptídeo
Tumor de origem
Gp100
Melanoma
MART-1/MelanA
Melanoma
TRP-1 (gp75)
Melanoma
Tyrosinase
Melanoma
b-catenin
Melanoma
MUM-1
Melanoma
CDK4
Melanoma
GnTV
Melanoma
p15
Melanoma
MAGE-1
Melanoma
MAGE-3
Melanoma
BAGE
GAGE-1,2
RAGE
Mucin
HER-2/neu
CEA
HLA-A2
bcr-abl
KIAA0205’
Melanoma, Bexiga
Melanoma, Sarcoma, Bexiga
Sarcoma
Mama, Ovário e Pâncreas
Mama, Ovário
Cólon, Pulmão, Mama
Rim
Carcinoma de Mama
Bexiga
45
Tabela 5: Composição química do extrato alcoólico do baço bovino.
Substância
Tipo de detecção
D. Glicose
Glicoseoxidase
Glicose Neutra
Oreinol Sulfúrico
Lipidios Totais
Fosfovanisilina
Proteína Total
Biuro
Fofolipídio
Enzima
Colesterol
Enzima
Triglicerídio
Enzima
Ácidos Graxoluire Enzima
Glicoproteína
Enzima
Ácido Graxoperóxido TBA
Vitamina A
HPLC
concentração
ND*
0,12mg
0,25mg
0,002mg
0,105mg
0,07mg
0,011mg
0,08 mEq
ND
0,01p mol
0,075U.L.
GRUPO PROSTAGLANDINA
TXB 2
11 Dehidro TXB 2
6-ceto pgf 1
PGF 2
PGE
PGE 2
ND
ND
ND
ND
ND
ND
18.28 pg
100 pg
1807 pg
394.7 pg
1240 pg
1.2 pg
FUNÇÃO ÁCIDO GRAXO
Ácido mirístico
Ácido Palmílico
Palmitoleico
Esteático
Oleico
Linileico
Araquidico
Linoleico
Elcosenóico
Eicosadienosóico
Elcosatrienóico
Beoinico
Araquidônico
Euricico
Elcosapentaenoico
Lignocerico
Neivonico
Docosapentaenico
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
1.25 µg
25.28 µg
0.9 µg
15.2 µg
18.05 µg
8.8 µg
Tr**
Tr
0.25 µg
0.3 µg
1.95 µg
0.15 µg
7.15 µg
ND*
ND*
ND*
ND*
0.35 µg
* Não descrito pela indústria. ** Traços.
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3- EQUIPAMENTOS:
Agitador magnético – ADVANCED
Autoclave (modelo ASV – 302) – CORPORATION
Balança analítica – METTLER
Câmara de Neubauer – CLAY ADAMS
Capela de fluxo laminar vertical – VECO
Centrífuga refrigerada – EPPENDORF
Citocentrífuga – SHANDON
Cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) – SHUMADZ
Destilador / Deionizador – TECNAL
Espectrofotômetro – BACKMAM
Estufa incubadora de CO2 – NUARE
Freezer -20°C – PROSDÓCIMO
Freezer -70°C – REVCO
Microscópio Óptico de inversão – LEITZ
Microscópio Óptico Olympus CH-2 – Olympus
4- MATERIAIS DIVERSOS
Agulhas hipodérmicas
Seringas de 1, 3, 5, 10, 20 cc – BD
Espátula
Eppendorf
Luvas cirúrgicas látex – LEMGRUDER S.A.
Material cirúrgico: pinça, bisturi, tesoura – EDLO
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Paquímetro
Placas de Petri – PYREX
Provetas 25, 50 e 100 mL – PYREX
Pipetas graduadas de 1,0; 5,0; 10;0 – BRAND
Pipetas graduadas de 20, 200, 1000 μL e ponteiras
Tubos de centrífuga – FALCON
Placas de ELISA – Cultilab
5- ANIMAIS
Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (25 a 30 g), provindos do Biotério
Central da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo, camundongos
Swiss fêmeas (25 a 30 g) e ratos albinos Wistar fêmeas (120 a 140 g), provindos do Biotério
Central da Universidade Federal do Ceará (UFC), mantidos em colônia fechada no
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da (UFC).
6- SOLUÇÕES
Solução de Ringer com lactato de Sódio: Química Farmacêutica Gaspar Viana, 6g NaCl; 0,30g
KCl; 0,2g CaCl2H2O; 3,1g lactato de sódio.
Soro Fetal Bovino (FCS): o soro estéril da cultilab foi estocado a -20°C em garrafas de 100mL.
Antes do uso foi descongelado e estocado a 4°C. Foi usado no RPMI numa concentração final de
10% (v/v).
Bicarbonato de sódio: uma solução de 7,5% (p/v) foi preparada dissolvendo 7,5 g de
bicarbonato de sódio em 100 mL de água destilada e deionizada, sendo em seguida filtrada em
filtro millipore e estocada a 4°C. Na preparação do meio, foi utilizada uma concentração final de
10 % (v/v).
48
Azul de Tripan: o pó “tripan blue” foi obtido da Serale Diagnostics e preparado a 1% (p/v) em
solução PBS, o qual foi filtrado através de filtro de papel para remover partículas insolúveis.
Meio RPMI: o meio foi obtido da Cultilab, sendo diluído em água destilada, deionizada e
esterelizada. A solução foi filtrada com ajuda do filtro Millipore com diâmetro de 0,22 μm.
Posteriormente, foi completado com 10% de soro fetal, 1% de glutamina, 1% de antibióticos, 1%
de bicarbonato (0,75%) e 25 mM de HEPES.
Água: a água de torneira contém grande quantidade de íons, muito dos quais são tóxicos para as
células, e pode ainda conter endotoxinas produzidas pelo crescimento de bactérias gram
negativas. Por esse motivo, as soluções foram preparadas com água tridestilada, ou de
preferência, bidestilada e deionizada (desmineralizada).
Solução de Glutamina: 3g de glutamina foram lentamente dissolvidos em 100mL de água
bidestilada e deonizada. Posteriormente a solução foi esterelizada por filtração com membrana
Millipore (0,22μm).
Soluções para dosagem de proteína:
Solução A – diluiu-se em 100mL de água bidestilada, 4g de hidróxido de sódio e 20g de
carbonato de sódio (Na2CO3).
Solução 2 – diluiu-se em 100mL de água bidestilada, 2g de tartarato de sódio
(KNaCuH.4H2O).
Solução 3 – diluiu-se em 100mL de água bidestilada, 1g de sulfato de cobre pentaidratado
(CuSO4.5H2O).
49
Solução C – para cada 100mL de solução A, adicionou-se 1mL da solução 2 e 1mL da
solução 3.
Para cada 5mL de Folin Ciocalteau adicionou-se 22,5mL de água bidestilada.
Tripsina: solução de tripsina 0,23% foi usada para desprender as culturas celulares do frasco
antes da repicagem. Diluiu-se 2,5g em 100mL de diluente de tripsina (1:250 Difco) e 1g Dglicose anidra, agitou-se por 1h ou 2h a frio para ser obtida uma solução mais límpida possível.
Esterelizou-se por filtração e subdividiu-se em frascos de 100 e 200mL. Fez-se a prova de
esterilidade e conservou-se a 4°C.
Diluente da tripsina:
NaCl
8g
KCl
0,4g
Na2PO4.7H2O
0,06g
Vermelho Fenol
0,02g
EDTA
1g
Colocou-se 50mL de água tridestilada num frasco, e com agitação contínua foram
adicionados os componentes, um a um, na ordem indicada. Esperou-se que cada um se
dissolvesse antes de juntar o seguinte. Completou-se o volume para 100mL, com água
tridestilada. Em seguida a solução foi filtrada sob pressão e aliquotada em volumes de 25mL. O
pH foi acertado para 7,8 a 8,0 com Na2HCO3 a 10%.
50
7- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PRESSÃO:
1mL da ampola contendo os peptídeos da vacina Hasumi foi submetida a uma
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Primeiramente foi realizado um “scan” entre 200
e 800nm em um espectofotômetro para estabelecer o melhor comprimento de onda. Em seguida
foi usado o gradiente 70/30 de metanol/água em fase móvel, com um comprimento de onda de
210nm, num fluxo de 1mL/min por injeção automática, uma temperatura de 35° C e a pressão da
bomba de 105 kgf.
8- DOSAGEM DE PROTEÍNAS
A determinação de proteínas na vacina Hasumi foi realizada segundo Eagle e Foley
(1958). A concentração de proteínas foi estimada com relação a uma curva padrão obtida com
albumina sérica bovina.
9- IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS
Grupo de 10 camundongos “Swiss” (fêmeas provenientes do Biotério Central da
Universidade federal do Ceará) com 25 a 30g foram imunizados pela via subcutânea com 100 μL
(0,6 μg de peptídeos) de vacina Hasumi, respectivamente, sendo aplicado um reforço da mesma
dose 21 dias após a primeira imunização. A coleta de sangue para obtenção do antissoro foi
realizada em três momentos: 24 horas antes da imunização (soro pré-imune), 7, 14, 21 dias após
a primeira imunização para avaliação da resposta primária, e 28, 35 e 42 dias após a primeira
imunização para avaliação da resposta secundária.
Em um outro experimento, 2 grupos de 10 camundongos “Swiss” (fêmeas provenientes
do Biotério Central da Universidade federal do Ceará) com 25 a 30g foram imunizados pela via
subcutânea com 100 μg de ovalbumina, respectivamente, sendo aplicado um reforço da mesma
dose 21 dias após a primeira imunização. A coleta de sangue foi realizada da mesma forma do
grupo anteriormente citado.
51
10- OBTENÇÃO DOS ANTISSOROS
As amostras de sangue foram coletadas com pipetas Pasteur por punção no plexo retroorbital dos camundongos. O sangue foi deixado em repouso durante duas horas à temperatura
ambiente para a retração do coágulo após o que o soro foi recolhido e centrifugado a 3.000 g por
5 minutos para que as hemácias fossem separadas e desprezadas. Em seguida, o antissoro obtido
foi armazenado a 20°C. Este procedimento foi adotado para todos os experimentos.
11- SOROLOGIA:
11.1- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Os antissoros foram submetidos ao teste de ELISA indireto (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay). Para esse ensaio, as placas foram sensibilizadas com 100 μL (1,2 μg) de
peptídeos, ou 10 μg de ovalbumina diluída em 100 μL de solução salina em cada poço. As placas
foram incubadas “overnight” (18 horas) a uma temperatura de 4°C. Em seguida, as placas foram
lavadas com solução salina 0,9% contendo Tween-20 (0,05%) e bloqueadas por 2h a uma
temperatura de 37°C em solução de bloqueio (solução salina contendo 5% de Molico). Após a
lavagem das placas, foram adicionados 100 μL dos antissoros (obtidos dos camundongos
imunizados) diluídos em 1:10, 1:100 e 1:1.000 em solução de bloqueio nos devidos poços e as
placas foram incubadas “overnight” (18 horas) a uma temperatura de 4°C. As placas foram
novamente lavadas e em cada uma adicionado o conjugado imunoglobulinas policlonais antimouse ligadas à peroxidase, em uma diluição de 1:1.000 em solução de bloqueio a uma
temperatura de 37°C. A seguir, as placas foram lavadas com solução salina 0,9% contendo
Tween-20. A reação foi desenvolvida pela a adição de orthophenylenediamine (OPD) após a
placa ter sido incubada por 20 minutos a temperatura de 37°C. A intensidade da reação foi
avaliada espectofotometricamente em um comprimento de onda de 490 nm com um micro
ELISA espectofotômetro BECKMAN.
52
11.2- Anafilaxia Cutânea Pasiva (PCA)
Os anticorpos IgG1 presentes em respostas de camundongos imunizados foram
quantificados através da técnica de PCA como descrito por Ovary (1958) e modificado por Mota
& Wong, adaptado para o uso do camundongo. O título de PCA foi definido como o logarítimo
na base dois do inverso da diluição máxima do antissoro (Dmax) capaz de provocar uma reação
cutânea positiva.
Título de PCA = log 2 1/Dmax
A região da pele dorsal dos camundongos swiss foi depilada sob leve anestesia com éter e
em cada animal 4 pontos foram marcados nos quais 50 μL das diluições seriadas dos antissoros
foram injetados em cada ponto, por via intradérmica. Após um período de duas horas, as reações
foram desencadeadas da seguinte maneira: foi injetado nos camundongos por via endovenosa, no
plexo retro-orbital, 250 μL de azul de Evans a 0,5 % em solução salina contendo 125 μL (1,5 μg)
de peptídeos.
12- LINHAGEM CELULAR
A linhagem celular congelada usada para os estudos in vivo foi o melanona B/16 mantido
em meio RPMI 1640 e suplementadas com 10% de soro fetal bovino. A passagem das células foi
realizada 3 vezes por semana, na fase de crescimento rápido. A cultura foi mantida a 37°C em
5% de CO2. A viabilidade das células excedeu 95% quando determinadas pelo azul de trypan
(McAteer & Davis, 1994) (A linhagem do melanoma B/16 tem como característica a aderência
das células, e por esse motivo as células deveriam ser lavadas com solução de tripsina para a
possível passagem in vivo)
13- VIABILIDADE CELULAR
Para determinar a viabilidade, uma alíquota da suspensão de células foi diluída 1:10 a
uma solução azul de tripan a 1% (p/v), depois de 2 a 3 min, as células foram examinadas na
53
câmara de Newbauer. As células coradas em azul escuro foram consideradas não viáveis. A
viabilidade foi expressa pelo número de células não coradas multiplicadas por 105 céls./mL.
14- CONGELAMENTO DAS CÉLULAS
Após tripsinização, as células foram resuspensas em meio a 10% de soro, e centrifugadas
durante 5 min, a 1.000 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi removido, e o precipitado foi
resuspendido em meio a 5 ou 10% de DMSO. A suspensão de células foi colocada em uma
ampola, sendo levada à geladeira por 30 min, posteriormente para o freezer a -70°C durante 24 h,
e em seguida armazenada a -180°C (nitrogênio).
15- DESCONGELAMENTO DAS CÉLULAS
As células foram descongeladas rapidamente em banho-maria a 37°C. O conteúdo foi
retirado da ampola e colocado gota a gota num tubo de centrífuga contendo meio RPMI a 10%.
Posteriormente o precipitado foi re-suspendido em meio de cultura recém preparado. Com o
auxílio de uma pipeta, foi agitado lentamente. A suspensão de células foi transferida para um ou
mais frascos de cultura, sendo posteriormente incubada em estufa a 5% de CO2 a 37°C.
16- TESTE DA ATIVIDADE ANTITUMORAL
16.1- Via de administração da vacina Hasumi
As vias utilizadas para a administração da vacina foram a subcutânea, por ser uma via
clássica de desencadeamento da resposta imunológica, e a intraperitoneal por se tratar de uma via
com indução de resposta imune a nível sistêmico. Os ratos foram inoculados com 500μL da
associação de duas ampolas, uma com os peptídeos e outra com adjuvante, que formam a Vacina
Hasumi. O tratamento foi de 2 em 2 dias até a morte dos animais para a avaliação da sobrevida.
Em camundongos, o tratamento era de 7 em 7 dias também para a avaliação da sobrevida. Nesse
54
caso, após a associação do conteúdo das ampolas, eram diluídas em solução salina 0,9% num
volume final de 200 μL para se obter várias doses diferentes.
16.2- Avaliação do hemograma de ratos inoculados com carcinossarcoma de Walker 256
Os animais que foram submetidos a retirada de sangue tiveram seu hemograma avaliado.
A sangria foi realizada pelo plexo retro-orbital com o auxílio de um capilar. O sangue dos
animais foram retirados antes de receber as células tumorais e 10 dias após a inoculação das
células. O sangue foi imediatamente armazenado em tubos vacutainer (Becton Dickinson and
Company, Franklin Lakes, NJ, USA) para evitar a coagulação e analisados em um contador
ajustado para células de ratos.
16.3 - Avaliação da atividade antitumoral em carcinossarcoma de Walker 256
Nesse primeiro estudo foi utilizado o carcinossarcoma de Walker 256 com 8 a 10 dias de
implante. O rato doador ou de manutenção foi sacrificado com éter etílico e feita na região do
tumor assepsia com álcool iodado. Em seguida foram realizadas a incisão com remoção da
epiderme do animal e posterior retirada do tumor através de pinça e tesoura. O tumor foi
colocado em placa de Petri contendo solução de Ringer lactato com gentamicina. Após a retirada
de vasos e partes necrosadas, foram selecionados fragmentos tumorais de aproximadamente 2 a
3mm de diâmetro, sendo estes transferidos para outra placa de petri contendo a mesma solução.
Os fragmentos tumorais foram triturados com tesoura, peneirados e a solução restante foi
submetida ao teste de viabilidade celular para contagem das células viáveis. O rato receptor foi
anestesiado com éter etílico tendo sido feita a sua assepsia com álcool iodado no local da
inoculação. Dois grupos de 7-9 ratos foram inoculados com 1,0 X 106 células por via subcutânea
na região axilar de acordo com a metodologia de Stock et al. (1955) modificado por Moraes
Filho (1982), sendo o primeiro grupo imediatamente vacinado com 500 μL (3 μg de peptídeos)
da vacina Hasumi, e o segundo grupo vacinado com solução salina 0,9%. Reforços da mesma
dose foram administrados em dias alternados até a morte dos animais. Nesse experimento foram
avaliados a sobrevida e o volume do tumor durante o período de tratamento. Os animais desses
55
dois grupos foram submetidos a retirada de sangue para a avaliação do hemograma como
explicado anteriormente.
No segundo estudo, dois grupos de animais também foram inoculados com 1,0 X 106
células por via subcutânea na região axilar. Cinco dias após a inoculação das células, os animais
sofreram a retirada cirúrgica do tumor palpável. Imediatamente após a cirurgia, o grupo
experimental foi imunizado com 500 μL (3μg de peptídeos) da Vacina Hasumi e o grupo
controle com 500 μL de solução salina 0,9%. Nesse experimento também foram avaliados a
sobrevida e o volume do tumor durante o período de tratamento.
16.4- Avaliação da atividade antitumoral em melanoma B/16
O melanoma B/16, mantido em cultura, foi tripsinizado e realizado o teste de viabilidade
celular para contagem das células viáveis. 4 grupos de 6-7 camundongos C57BL/6, fêmeas,
pesando de 25 a 30g, foram inoculados por via subcutânea na região axilar 1,0 X 106 células em
500 μL de salina, sendo o animal imediatamente imunizado com 1, 10 e 100 μL de vacina (0,006
μg, 0,06 μg e 0,6 μg de peptídeos) diluída em um volume final de 200 μL respectivamente para
cada grupo. O controle foi vacinado com 200 μL de solução salina 0,9%. Os animais receberam
reforços da mesma dose a cada 7 dias até a sua morte. Nesse experimento foram avaliados a
sobrevida, a variação do peso e o volume do tumor durante o período de tratamento.
Em outra série de experimentos, 4 grupos de 6-7 animais foram tratados da mesma forma
que o grupo anterior, com a diferença que os animais foram imunizados por via intraperitoneal.
Também foram avaliados a sobrevida e o volume do tumor durante o período de tratamento.
17- CÁLCULO DA CURVA DE CRESCIMENTO
A curva de crescimento tumoral foi mensurada no decorrer do tratamento. O volume
tumoral foi calculado a cada 2 dias segundo a fórmula de Steel (1987):
V(cm3) = D.d2/2
56
Onde:
D = diâmetro maior do tumor
d = diâmetro menor do tumor
18- ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Para a avaliação da sobrevida, foi utilizado o teste não paramétrico Kaplan-Meyer. Para
ou outros foram utilizados o teste t-student e a análise de variância (ANOVA). Considerou-se
que havia diferença entre os grupos tratados e o controle quando o p-valor foi menor ou igual a
0,05, existindo diferença significativa a 5%, e menor ou igual a 0,01, com significância a 1%
(Armitage & Berry, 1985).
57
RESULTADOS
1- TEOR DE PROTEÍNA DO EXTRATO TOTAL
O teor de proteínas na ampola contendo os peptídeos da Vacina Hasumi de acordo com o
método de Eagle e Foley (1958), foi de 12 μg de proteína por 1mL de solução.
2- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PRESSÃO
O cromatograma da ampola contendo os peptídeos da vacina Hasumi revelou a presença
de seis picos em um gradiente de concentração 70/30 (metanol/água), indicando uma
propriedade apolar dos peptídeos. Os diferentes tempos de retenção estão especificados na figura
5. O maior pico foi obtido com um tempo de 2,4 minutos após o início da cromatografia, sendo
este também o pico de maior percentagem de área retida (52,3473 %), seguido dos picos de 2,7;
2,9; 3,1; 3,6; e 4 minutos (Tabela 6).
3- AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA
3.1- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por ELISA, em
Camundongos Imunizados com a Vacina Hasumi.
A figura 6 mostra a ausência da detecção da síntese de anticorpos anti-peptídeos nos
camundongos imunizados com a vacina Hasumi. Não foram detectados anticorpos específicos
em nenhum dos sete dias de sangria.
58
0.00
1
2
0.02
Volts
0.02
0.04
4 .0 0 0 6 5 2 6 9
Retention Time
Area
2 .4 3 1 5 2 3 4 7 3
Volts
0.04
3 .6 5 3 3 0 3 9 1
Detector A
KREBS
KREBS (00)
2 .7 9 9 8 3 5 6 7
2 .9 4 6 1 0 8 2 2
3 .1 0 8 2 6 6 6 7 0
CURVA PADRÃO PARA DCTN
0.00
3
4
5
6
Minutes
Figura 5: Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) da ampola contendo os peptídeos da
Vacina Hasumi. O gráfico mostra o tempo de retenção dos picos com as respectivas
percentagens de área do gráfico.
59
Tabela 6: Tempo de retenção e área calculada dos picos retidos da ampola contendo os
peptídeos da vacina Hasumi em Cromatografia Líquida de Alta Pressão.
N° de Picos
Tempo de Retenção em Minutos
% da Área Retida
Pico n° 1
2,431
523,473
Pico n° 2
2,799
83,567
Pico n° 3
2,946
10,822
Pico n° 4
3,108
266,670
Pico n° 5
3,653
30,391
Pico n° 6
4,000
65,269
60
3.2- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por ELISA, em
Camundongos Imunizados com a Ovalbumina (OVA).
É sabido que ovalbumina habitualmente induz resposta imune em camundongos quando
imunizados pela via subcutânea. Por essa razão, foi feito um grupo controle-positivo onde os
animais foram imunizados com 100 μg de OVA, com reforços no 21° e 35° dias. Como era de
esperar, foi observado uma curva clássica da síntese de anticorpos anti-OVA, começando com
uma resposta primária de baixa intensidade e uma resposta secundária e terciária de maior
eficiência (Figura 6).
3.3- Determinação da Síntese de Anticorpos Específicos, Avaliada por PCA, em
Camundongos Imunizados com a Vacina Hasumi.
Como podemos observar na figura 7, os camundongos imunizados com a Vacina Hasumi
induziram uma fraca síntese de IgG1 no 21° dia, com um leve aumento nos dias 28 e 35. No 21°
dia foi obtido um título de 0,25, enquanto os positivos do 28° e 35° dias foram obtidos títulos
0,89 e 0,91 respectivamente (Figura 8).
4- AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL E SOBREVIDA EM
RATOS
INOCULADOS
COM
O
CARCINOSSARCOMA
DE
WALKER
256
IMUNIZADOS COM A VACINA HASUMI.
A figura 9 mostra a curva de crescimento tumoral nos animais inoculados com 1,0 x 106
células do tumor de Walker 256. Os resultados mostram a evolução do tumor frente à ação da
vacina Hasumi. Os valores foram obtidos pela avaliação da cinética de crescimento do tumor a
cada dois dias até que todos os animais tenham falecido.
61
600
500
ELISA
400
OVA
300
HV
200
100
0
0
7
14
21
28
35
42
Dias após a imunização
Figura 6: Cinética da síntese de anticorpos em camundongos imunizados com Ovalbumina
(OVA) e Vacina Hasumi. O dia “0” representa o soro pré-imune. As setas representam as
imunizações (100 μL de Vacina Hasumi) (n=10).
62
Figura 7: Síntese de anticorpos anti-peptídeos da vacina Hasumi IgG1 revelados em
camundongos pela técnica de PCA. A seta indica a reação positiva do antissoro 35 dias após a
primeira imunização diluído na proporção de 1:2.
63
2
1,8
1,6
1,4
Título
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
7
14
21
28
35
Dias após a imunização
Figura 8: Cinética da síntese de anticorpos IgG1 em camundongos "Swiss" imunizados com a
vacina Hasumi. O dia “0” representa o soro pré-imune. As setas indicam as imunizações com
100 μL de Vacina (n=10).
64
(Volume do tumor (em cm3)
14
12
10
8
CNTL
Hasumi
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
Dias após a inoculação do tumor
Figura 9: Cinética do crescimento do tumor de Walker 356 em ratos imunizados com 500 μL da
Vacina Hasumi em dias alternados. Não houve diferença estatística entre os grupos experimental
(vacinado) e o grupo controle (n=10).
Controle
De acordo com a figura, apesar de não haver diferença significativa no volume tumoral
dos animais imunizados frente ao controle, podemos observar uma tendência para que o tumor
65
imunizado não chegasse à mesma média de crescimento do tumor controle. No décimo segundo
dia, os animais do controle tiveram uma média de 9,87 cm3 de volume tumoral, enquanto o
grupo vacinado teve uma média de 5,89 cm3 de volume. O alto valor do desvio padrão foi obtido
devido às diferentes respostas no crescimento tumoral de cada animal. A figura 10 apresenta a
cinética do crescimento tumoral de dois animais do grupo imunizado com a vacina Hasumi. O
gráfico mostra cinéticas completamente diferentes. Enquanto um dos animais obteve a cura total
do tumor 50 dias após a primeira vacinação, o outro animal morreu 62 dias também após a
primeira vacinação. A sobrevida dos animais controle e vacinados foram diferentes a nível
estatístico. O grupo controle apresentou uma sobrevida média de 15,5 dias, enquanto o grupo
vacinado obteve uma sobrevida média de 41,2 dias (p ≤ 0,05) com 2 animais apresentando cura
total do tumor (Figura 11).
5- AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA DOS RATOS INOCULADOS COM O
CARCINOSSARCOMA DE WALKER 256 IMUNIZADOS COM A VACINA HASUMI
Os animais do grupo discutido anteriormente sofreram sangria para a avaliação do
hemograma completo. Foram analisados hemácias, hemoglobinas, leucócitos totais, neutrófilos,
linfócitos, eosinófilos, monócitos e plaquetas.
A figura 12 revela que todos os leucócitos totais, assim como os seus subtipos tiveram um
aumento no número total de células analisadas 10 dias depois da inoculação do tumor, o que já
era esperado, pois o tumor de Walker 256 induz forte reação inflamatória e quadro anêmico
(Benítez-Verguizas et al., 1999). Já no grupo vacinado, esse aumento não foi observado.
66
50
3
Volume do tumor (em cm )
45
40
35
30
Rato 1
25
Rato 4
20
15
10
5
60
56
52
48
44
40
36
32
28
24
20
16
12
8
4
0
0
Dias após a primeira vacinação
Figura 10: Cinética da curva de crescimento do tumor de Walker 256 nos ratos 1 e 4 imunizados
com 500 μL da vacina Hasumi em dias alternados até o 60° após a inoculação do tumor. O
gráfico mostra duas cinéticas de crescimento tumoral diferentes, apesar dos animais receberem o
mesmo tratamento.
67
Figura 11: Sobrevida dos ratos inoculados com o tumor de Walker 256 que sofreram, ou não,
retirada cirúrgica do tumor imunizados com a vacina Hasumi. O tempo é definido como dias
após a inoculação do tumor.
Controle com cirurgia.
Controle sem cirurgia.
Vacinado sem cirurgia.
Vacinados com cirurgia.
68
30.000
Células em mm
3
25.000
20.000
Leucócitos
Neutrófilos
Linfócitos
15.000
Monócitos
*
10.000
*
5.000
*
*
0
Dia 0 Controle
Dia 0 Hasumi
Dia 10 Controle Dia 10 Hasumi
Figura 12: Leucograma dos animais inoculados com o tumor de Walker 256 imunizados com a
vacina Hasumi. 10 dias após a inoculação do tumor os níveis de leucócitos em animais
imunizados estão diferentes do controle (* p ≤ 0,05) (n=10).
69
Com relação aos glóbulos vermelhos, observou-se exatamente o contrário (Figura 13).
Outra característica do tumor de Walker 256 é a apresentação de um quadro anêmico, com
diminuição dos níveis de hemoglobina (Vido et al., 2000), confirmado pelo hemograma dos
animais. O tumor induziu queda nos níveis de hemácias e na própria hemoglobina, 10 dias
depois da inoculação do tumor, enquanto os animais vacinados continuaram com seus níveis não
alterados.
6- AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL E SOBREVIDA EM
RATOS QUE SOFRERAM RETIRADA CIRÚRGICA DO CARCINOSSARCOMA DE
WALKER 256 IMUNIZADOS COM A VACINA HASUMI.
Dos ratos que sofreram retirada cirúrgica do tumor de Walker 256, apenas três foram
excluídos por não apresentaram uma reincidência pós-cirúrgica, sendo dois animais do grupo
controle e um animal do grupo vacinado. A cinética da curva de crescimento do tumor nos
grupos controle e vacinado foi semelhante ao grupo que não sofreu cirurgia (Figuras 14 e 9),
inclusive quando analisamos valor dos desvios. Mas quando observamos os animais de forma
individual, fica claro que a maioria dos ratos imunizados apresentou uma inibição no
crescimento tumoral quando comparados ao controle (Figura 15). No oitavo dia após o início da
vacinação, o grupo controle teve uma média de 12,03 cm3 de volume tumoral, enquanto o grupo
vacinado teve uma média de 5,57 cm3 de volume.
Quanto à sobrevida, os animais vacinados tiveram uma média de 26 dias, apresentando
um rato com cura total do tumor. O grupo controle obteve a média de 21 dias (Figura 11).
70
16
*
Número de Células em mm
3
14
12
Hemoglobina
10
Hemacias
*
8
6
4
2
0
Dia 0 Controle
Dia 0 Hasumi
Dia 10 Controle
Dia 10 Hasumi
Figura 13: Hemograma dos animais inoculados com tumor de Walker 256 imunizados com a
vacina Hasumi. 10 dias após a inoculação do tumor os níveis de hemoglobina e hemácias em
animais imunizados estão diferentes do controle (* p ≤ 0,05) (n=10).
71
16
3
Volume do tumor (cm )
14
12
10
Controle
8
Hasumi
6
4
2
0
0
2
4
6
8
Dias após a cirurgia
Figura 14: Cinética do volume do tumor de Walker 256 após a retirada cirúrgica do tumor em
ratos imunizados com 500 μL da Vacina Hasumi em dias alternados. Não houve diferença
estatística entre os grupos experimental (vacinado) e o grupo controle (n=10).
72
18
3
Volume do tumor (em cm )
16
14
Controle
Hasumi
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
Ratos
Figura 15: Volume do tumor de Walker 256 em ratos imunizados com a 500 μL de Vacina
Hasumi em dias alternados 8 dias após a cirurgia. Os animais 2, 3, 4 e 6 do grupo vacinado
obtiveram uma inibição do crescimento tumoral, enquanto os animais 1 e 5 não apresentaram a
mesma inibição.
73
7- AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL E SOBREVIDA EM
CAMUNDONGOS INOCULADOS COM MELANOMA B/16 IMUNIZADOS COM A
VACINA HASUMI PELA VIA SUBCUTÂNEA.
A cinética da curva de crescimento do melanoma em camundongos foi extremamente
agressivo. O tumor iniciou seu crescimento no oitavo dia, mas já no 12° dia os animais
começaram a morrer. Apenas as doses de 1 μL (0,006 μg) apresentou uma diferença significante
(p ≤ 0,05) na inibição do volume tumoral 10 e 12 dias após a primeira vacinação (Figura 16) .
Apesar de não haver diferença significativa nas outras doses, observa-se uma tendência para
inibir o crescimento do tumor. A sobrevida dos animais do grupo controle foi de 18,83 dias
(figura 17), enquanto a dos grupos vacinados com 1 μL, 10 μLe 100 μL (0,006 μg, 0,06 μg e 0,6
μg de peptídeos) foram respectivamente 21,71 dias, 23,83 dias e 22,14 dias após a primeira
vacinação. Todas as doses apresentaram diferença estatística na sobrevida dos animais em
relação ao controle (p ≤ 0,05).
8- AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL E SOBREVIDA EM
CAMUNDONGOS INOCULADOS COM MELANOMA B/16 IMUNIZADOS COM A
VACINA HASUMI PELA VIA INTRAPERITONEAL.
A figura 18 mostra a cinética da curva de crescimento tumoral do melanoma nos animais
imunizados com a vacina Hasumi em diferentes doses. Como no experimento anterior, o tumor
iniciou seu crescimento no oitavo dia, mas já no 12° dia os animais começaram a morrer.
Entretanto, todas as doses testadas inibiram o crescimento do tumor de forma significativa nos
dias 10 e 12 após a primeira vacinação (p ≤ 0,05). Quanto à sobrevida (figura 19), os animais do
grupo controle tiveram uma média de 17,8 dias, enquanto os grupos vacinados tiveram uma
média de 17,8 dias, 19 dias (p ≤ 0,05), e 19,5 dias respectivamente para as doses de 1 μL (0,006
μg), 10 μL (0,06 μg) e 100 μL (0,6 μg).
74
0,5
3
Volume do tumor (em cm )
0,6
0,4
Controle
Hasumi 0,006 mg
0,3
Hasumi 0,06 mg
Hasumi 0,6 mg
0,2
0,1
*
0
8
10
12
Dias após a inoculação do tumor
Figura 16: Cinética do crescimento do tumor melanoma B/16 em camundongos imunizados com
diferentes doses da Vacina Hasumi por Via Subcutânea 7 em 7 dias. Houve diferença estatística
entre os volumes tumorais do grupo imunizado com 0,006 μg de peptídeos (* p ≤ 0,05) em
relação ao grupo controle 10 dias após a inoculação do tumor (n=10).
75
Figura 17: Sobrevida dos camundongos inoculados com melanoma B/16 vacinados pela via
subcutânea. O tempo é definido como dias após a inoculação do tumor.
Vacinado com 1 μL.
Vacinado com 10 μL.
Controle.
Vacinados com 100 μL.
76
4
Controle
3
Volume do tumor (em cm )
3,5
H asumi 0,006 mg
3
Hasumi 0,06mg
Hasumi 0,6 mg
2,5
2
1,5
*
**
1
0,5
*
*
*
0
6
8
10
12
Dias após a inoculação do tumor
Figura 18: Cinética do crescimento do tumor melanoma B/16 em camundongos imunizados com
diferentes doses da Vacina Hasumi por Via Intraperitoneal a cada 7 dias. Houve diferença
estatística entre os volumes tumorais de todos os animais vacinados com a Vacina Hasumi (* p ≤
0,05) em relação ao grupo controle 10 dias e 12 dias após a inoculação do tumor (n=10).
77
Figura 19: Sobrevida dos camundongos inoculados com melanoma B/16 Vacinados pela via
intraperitoneal. O tempo é definido como dias após a inoculação do tumor.
Vacinado com 1 μL.
Vacinado com 10 μL.
Controle.
Vacinados com 100 μL.
78
Controle:
Hasumi:
Figura 20: Ratos inoculados com o tumor de Walker 256 após 16 dias de vacinação. O animal
imunizado com a vacina Hasumi apresenta um tumor de tamanho bem menor que o animal
controle.
79
DISCUSSÃO
A indústria farmacêutica vem procurando novas formas de combate ao Câncer desde o
início do século XX. Com a declaração da “guerra contra o Câncer” em 1971 (Lillehei et al.,
1999), acreditava-se que os avanços nas terapias anticâncer seriam maiores, mas as pesquisas
nesse campo estão cheias de resultados decepcionantes. A cirurgia e a quimioterapia promovem
um benefício em apenas um número limitado de tipos de tumores. A grande ausência de
benefícios associada a essas terapias convencionais encorajou os pesquisadores a procurarem
novas formas de combater a doença. Uma delas foi a utilização de vacinas. As vacinas têm efeito
profilático e são utilizadas em indivíduos saudáveis para impedir a instalação de uma patologia
(infecção) quaisquer. Mesmo assim, grandes esforços vêm sendo feitos para encontrar vacinas
que curem os indivíduos já portadores de patologias, como as vacinas para o HIV, a tuberculose,
úlceras gástricas e até mesmo a doença de Alzheimer. Com a exceção da vacina anti-HIV,
nenhuma ganhou tanto destaque quanto as vacinas anti-câncer (Sela et al., 2002).
A idéia de usar o sistema imune para erradicar tumores não é nova. Há mais de 100 anos,
William Coley (1893) reportou pela primeira vez que toxinas de bactérias poderiam estimular
inespecificamente o sistema imune para combater tumores sólidos. Desde então, muito se tem
descoberto sobre o complexo sistema imunológico, mas nenhuma época foi tão reveladora para a
imunologia do Câncer como a década de 90. Nessa década foi descoberta uma infinidade de
antígenos de membrana que poderiam ser usadas para estimular o sistema imune especificamente
contra o câncer (Jaffee & Pardoll, 1996). A tabela 6 mostra vários antígenos, certificados pela
cromatografia líquida de alta pressão (Fig 5), na vacina Hasumi. Essa variedade de antígenos
tumorais pode atribuir à vacina uma característica inespecífica, ou seja, que pode ser utilizada
com a mesma eficácia para todos os tumores. Mas, na realidade espera-se que ela seja mais
eficiente contra os tumores de origem dos antígenos tumorais.
As vacinas de peptídeos geralmente necessitam de adjuvantes, pois o baixo peso
molecular está associado à baixa imunogenicidade, exatamente por ser uma molécula menor, e
assim, possui um número menor de epitopos (Pereira, 2000). O adjuvante da vacina Hasumi
possui, entre outros componentes, Vitamina A e prastaglandinas (TXB 2, PGE, PGF 2, PGE 2),
80
cuja função é estimular de forma mais abrangente o sistema imune (Calder, 2001; Lu et al.,
2000). Mas, mesmo com o uso do adjuvante, não foi possível detectar uma resposta imune
humoral anti-Hasumi (Figura 6) no método de ELISA. Por outro lado, o método de PCA
detectou a presença de anticorpos IgG1 anti-Hasumi em baixos títulos (Figuras 7 e 8), o que seria
razoável já que se espera uma baixa imunogenicidade dos peptídeos. No caso do ELISA, usamos
um controle positivo para descartarmos a possibilidade de uma falha na metodologia. Na figura 6
podemos notar que houve uma clássica cinética da síntese de anticorpos anti-OVA, com uma
resposta primária tênue e uma resposta secundária com maior intensidade (Florindo et al., 2002).
É possível que o preparado da ampola contenha substâncias que impeçam a correta fixação dos
peptídeos nas placa de ELISA, já que muito dos componentes da Vacina não foram divulgados
por tratar-se de um produto patenteado.
Um dos maiores desafios dos imunologistas do câncer não é a falta de compreensão do
funcionamento do sistema imunológico, mas sim de como funciona o mecanismo de escape dos
tumores a um ataque do sistema imune. Muitas são as teorias para explicar o baixo desempenho
das células de defesa do organismo contra uma eventual formação tumoral. A baixa
imunogenicidade dos antígenos das células neoplásicas, ou até mesmo uma eficiente produção de
citocinas supressoras sintetizadas pelo próprio tumor, pode ser a resposta para tal fenômeno
(Anton et al., 1996; Moingeon, 2000). As figuras 9 e 14 revelam que a vacina Hasumi tende a
inibir o crescimento tumoral em ratos inoculados com o tumor de Walker 256, sem o tratamento
e com o tratamento cirúrgico. Não foi possível obter uma diferença estatística significante em
nenhum dos casos, pois a Vacina Hasumi induzia uma resposta diferente para cada animal.
Alguns animais vacinados sofreram redução completa após alguns dias, enquanto outros não
tiveram o mesmo resultado e acabaram morrendo, tornando a curva de sobrevida bastante
singular (figuras 10 e 15). Existem várias explicações para este tipo de fenômeno. Sabe-se que as
vacinas de peptídeos acabam tendo uma restrição no seu uso por serem moléculas MHC restritas,
ou seja, apenas aqueles animais que possuem tal seqüência de genes de MHC com capacidade
para ligar-se aos peptídeos e apresentá-las de forma eficiente aos linfócitos T (Wolchok &
Livingston, 2001). Outra possibilidade é a diferença da resposta de um tumor tratado por um
quimioterápico e um imunofármaco. O quimioterápico atinge seu alvo específico na própria
81
célula tumoral, enquanto o imunofármaco precisa induzir uma resposta imune eficiente para, esta
sim, atacar o tumor (Moingeon, 2000). Além disso, a resposta imune, por mais que tenha suas
definições e respostas clássicas a um antígeno, ela é realmente diferente de um animal para
outro. Ainda uma outra explicação é a certeza de que os peptídeos, por se tratarem de
aloantígenos, dependem da via de administração do antígeno e da interação perfeita entre o
receptor do linfócito T e a molécula de MHC, esta altamente polimórfica em indivíduos
alogênicos (Gérard et al., 2001). De qualquer forma, já é consenso entre os imunocancerologistas que a imunoterapia, logo após o tratamento cirúrgico, favorece resultados
positivos em maior grau (Berd et al., 1997; Kirkwood et al., 1996.).
As figuras 12 e 13 mostram o resultado do hemograma realizado em ratos inoculados
com o tumor de Walker 256 vacinados, ou não, com a vacina Hasumi. Pelos níveis de leucócitos
e, mais especificamente, neutrófilos e linfócitos apresentados, os gráficos revelam que,
possivelmente, a vacina tenha exercido um efeito antiinflamatório nos animais tratados. O tumor
de Walker parece induzir uma proliferação de células inflamatórias, não só local (figura 20)
como sistêmica (Fitzpatrick, 2001). Uma outra característica provocada pelo tumor é o quadro de
anemia nos animais. A vacinação parece ter inibido esse quadro, justificado pela não diminuição
dos níveis de hemoglobina nos animais imunizados (Gagic et al., 1997; Vido et al., 2000). A
atividade antiinflamatória da vacina Hasumi pode estar diretamente relacionada com a síntese de
anticorpos IgG1 anti-Hasumi (figura 4) e a presença de prostaglandinas E 2 na composição do
adjuvante. Uma sub-população de linfócitos chamada Th2 libera interleucina 4 (IL-4) e induz a
síntese de anticorpos IgG1 pelos linfócitos B. A IL-4 é conhecida por sua propriedade
antiinflamatória (Balkwill & Mantovani, 2001), o que pode explicar os resultados encontrados no
hemograma. Além disso, a prostaglandina E 2 inibe a fabricação de citocinas inflamatórias como
INF-γ e IL-2, pelos linfócitos T (Harris et al., 2002) permitindo as citocinas antiinflamatórias
terem uma atividade mais potente. Apesar da polêmica sobre o papel da PGE 2 no sistema
imunológico (Bloom, et al., 1999), pois se sabe que essa prostaglandina é extremamente
sintetizada no processo inflamatório, a grande maioria dos trabalhos reporta essa prostaglandina
como indutora primária da resposta Th2 (Harris et al., 2002).
82
A análise das figuras 16 e 18 revela os níveis de inibição do melanoma e conduz à mesma
discussão obtida no tumor de Walker. Os camundongos imunizados por via subcutânea com a
vacina Hasumi, nas 3 doses testadas (0,006 μg, 0,06 μg e 0,6 μg de peptídeos) não conseguiram
obter diferença estatística, com exceção da dose de 0,006 μg no dia 10 após a vacinação. O
gráfico também nos leva a pensar sobre a possibilidade da vacina conseguir induzir uma resposta
eficiente nos primeiros dias contra o tumor, e com doses baixas, mas depois não obter o mesmo
efeito, provavelmente porque o mecanismo de escape das células neoplásicas seja eficiente o
bastante para enganar o sitema imunológico (Restifo, 2000). A eficiência da dose baixa (0,006
μg) em relação às outras pode ser explicado pela possibilidade das doses maiores induzirem um
processo de tolerância imunológica (Czerkinsky et al., 1999). Por outro lado, a figura 18
apresenta uma inibição eficiente do melanoma quando os camundongos são vacinados pela via
intraperitoneal. Esse resultado foi, de certa forma, surpreendente, considerando que o protocolo
original de vacinação da vacina Hasumi é pela via subcutânea. Como já foi dito, existe uma
estreita relação entre a via de administração do antígeno e o tipo de resposta efetora. Por
exemplo, algumas proteínas administradas pela via parenteral induzem formação de anticorpos
específicos. Quando as mesmas são administradas pela via oral, observa-se uma supressão da
síntese de anticorpos específicos (Melo et al., 1996). Acredita-se que o local da via de
administração induz o contato do antígeno com diferentes células do sistema imune. Estas
células, dependendo da sua maturidade, podem induzir a síntese de diferentes citocinas e
influenciariam a resposta imunológica, seja para o estímulo, seja para a supressão (Czerkinsky et
al., 1999). Seguindo esse raciocínio, podemos concluir que a resposta imune induzida pela
vacina Hasumi nos camundongos quando imunizados pela via intraperitoneal, nas 3 doses
testadas, foi mais eficiente que a imunização subcutânea para combater o crescimento do tumor.
Além disso, não observamos os altos valores de desvio padrão nessa via de imunização quando
comparados a via subcutânea. A imunização intraperitoneal estimula linfócitos T CD4+ e CD8+
circulantes, ainda nativos da recente maturação do timo (Madrenas & Germain, 1996). Essas
células ainda não entraram em contato com o tumor e não sofreram o processo de anergia clonal
induzida pela célula neoplásica. Essa característica torna a via mais adequada para o tipo de
resposta que se quer obter. Apesar do aumento significativo da sobrevida, infelizmente, não foi
observado cura de camundongos em nenhum dos dois grupos (figuras 17 e 19). Mesmo que a
vacina Hasumi seja constituída de aloantígenos, era esperada uma resposta antitumoral mais
83
eficiente da Vacina contra o melanoma, já que a maioria dos peptídeos é de origem desse mesmo
tipo de tumor. A alta virulência do melanoma e seus conhecidos mecanismos de escape ao ataque
do sistema imunológico (Restifo, 2000) ainda são fatores a serem resolvidos pelas vacinas
imunoestimulantes.
84
CONCLUSÕES
1- Os peptídeos da Vacina induziram síntese de anticorpos IgG1 específicos, indicando uma
propriedade antiinflamatória confirmada pelo hemograma, já que este subtipo de
anticorpo representa a ativação de linfócitos Th do tipo 2.
2- A Vacina Hasumi inibiu o crescimento tumoral de forma não linear em ratos inoculados
com Carcinossarcoma de Walker 256 que sofreram , ou não, retirada cirúrgica do tumor.
Esse resultado é considerado normal quando se trabalha com antígenos autólogos em
animais não-isogênicos.
3- A Vacina Hasumi parece ter prolongado o período de latência do crescimento do
melanoma, não sendo capaz de manter essa inibição por muitos dias, possivelmente por
causa da exacerbada agrecividade do tumor, ou da dose utilizada nesse trabalho, e dos
mecanismos de escape que o melanoma exerce no sistema imunológico.
4- O mecanismo de ação da vacina Hasumi parece ser pela via de estimulação da resposta
Th2, já que observamos a síntese de anticorpos IgG1 anti-peptídeos da vacina.
85
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