Avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante dos óleos

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM - FFOE
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Andréa Bessa Teixeira
Avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante
dos óleos essenciais das folhas dos quimiotipos I, II e III de
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown
Fortaleza
2009
2
ANDRÉA BESSA TEIXEIRA
Avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante
dos óleos essenciais das folhas dos quimiotipos I, II e III de
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown
Dissertação apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do
Ceará para a obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Nádia Accioly Pinto
Nogueira
Co-Orientadora: Profa. Dra. Luzia Kalyne
Almeida Moreira Leal
Fortaleza
2009
3
ANDRÉA BESSA TEIXEIRA
Avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante dos óleos essenciais
das folhas dos quimiotipos I, II e III de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Ceará, para a obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Aprovada em ____/____/____
Banca Examinadora:
___________________________________________________________
Profa. Dra. Nádia Accioly Pinto Nogueira (orientadora)
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (UFC)
___________________________________________________________
Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro
Departamento de Biologia (UFC)
___________________________________________________________
Profa. Dra. Maria Goretti Rodrigues de Queiroz
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (UFC)
4
DEDICATÓRIA
A Deus, meus pais e irmãs
até o último instante.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, minha fonte inesgotável de fé e força maior, que proporcionou estes momentos de
felicidade, amor e ciência a minha pequena sabedoria.
Aos meus pais, Francisco José Tavares Teixeira e Maria Aparecida Bessa Teixeira, e irmãs,
Luciana Bessa Teixeira e Janaína Bessa Teixeira, pelo amor incondicional, que sempre me
fortaleceu para realização de todos os sonhos. Vocês são os maiores exemplos de conduta que
seguirei até o fim dos meus dias e primordiais em todas as minhas vitórias e assim, em tudo
que tenho e sou. Eu amo muito vocês.
As Tias Joseni Bessa e Tereza Bessa, que com seu tão imenso amor e dedicação me fazem
sentir como uma filha. Obrigada por sempre torcerem pelo meu sucesso.
À minha orientadora Profa. Dra. Nádia Accioly Pinto Nogueira, pelo imprescindível e valioso
apoio, pelos ensinamentos, tanto profissionais como pessoais, pela confiança, dedicação e
paciência, principalmente nos momentos mais delicados da minha vida. Minha sincera
gratidão e profundo reconhecimento.
À Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal, a quem coube a co-orientação desta
dissertação, desejo manifestar os meus agradecimentos pela pronta disponibilidade, sempre
que precisei de ajuda, e pelo encorajamento que naturalmente me foi transmitido.
À Dânya Bandeira Lima, minha excelente estagiária, pela ajuda, força, incentivo e total
dedicação. Trabalhamos, aprendemos, rimos, conversamos, choramos enfim, tantos
momentos que serviram para o nosso crescimento. Continue sempre assim. Você será um
exemplo de profissional.
À minha amiga Cecília Câmara por todo apoio, carinho, atenção, ajuda, conselho e pela
grande amizade que se conserva e fortalece a cada dia que passa. É muito bom saber que
existem pessoas como você, que se preocupam com minha felicidade. Você é mesmo uma
pessoa especial e que eu adoro muito!
6
À minha amiga Maria Mirele, que apesar de um pouco distante, sei que posso contar sempre
com você e que o seu pensamento de energia me deu forças para mais essa conquista. Nas
amizades verdadeiras o tempo nunca passa e as distâncias nunca existem. Eu te agradeço de
todo coração e também te adoro muito!
Às minhas amigas Suzana Bezerra e Maria Cristina que juntas trilhamos o mesmo caminho de
luta e vitória. A companhia de vocês foi um diferencial que me motivou, principalmente nesta
fase final. Obrigada pela paciência, pelas horas agradáveis de estudo e debate, pelos ótimos
momentos de desabafo e lógico, pelos grandes eventos de descontração. Continuaremos em
frente.
À família “de Souza Cavalcante” a qual me deram a oportunidade de conhecer, fazer parte e
proporcionar momentos felizes. Vocês me ajudaram muito. Não deixaram de me apoiar, de
torcer por mim e de me incentivar a seguir em frente com ânimo, mesmo em momentos
difíceis. Guardarei para sempre vocês no meu coração.
As minhas amigas do “Clube da Luluzinha”, Sarah Rachel, Danielle Oliveira e Lyanna
Ferreira, pelas tão boas risadas, brincadeiras, pelos planos e confidencias, pela partilha,
crescimento enfim, pelos vários momentos alegres. Adoro fazer parte deste “Clube”.
A toda família do LabMicro (Lívia, Mirlayne, Elieyde, Cássia, Larissa, Eric, Felipe) que
sempre esteve disposta a colaborar e pelos momentos de alegria e amizade. Sentirei saudades.
Aos meus queridos funcionários de trabalho em Canindé, especialmente a Mayra Cavalcante,
que tanto ajudou quando precisei me ausentar. Obrigada amiga, pela sua dedicação, força,
torcida e pela paciência e disponibilidade em me auxiliar nos resultados.
Aos parceiros de trabalho, Eduardo Ribeiro, Jean Guilherme, Mailson e Anderson Souza, pela
fundamental colaboração e empenho na realização da atividade antioxidante.
A Profa. Dra. Maria Goretti de Vasconcelos Silva que gentilmente colaborou na realização da
cromatografia dos óleos essenciais e na análise dos resultados.
7
A secretária Raimundinha pelo valioso auxílio, paciência e amizade.
Aos meus amigos do mestrado pela agradável parceria concedida durante este período.
Aos membros da banca: Profa. Dra. Goretti Rodrigues e Prof. Dr. Thalles Barbosa por terem
assumido a difícil tarefa de avaliar e contribuírem na importante fase de conclusão do meu
trabalho.
Enfim, a todos que contribuíram de alguma forma para a execução deste trabalho,
impulsionando minha vida profissional para caminhos cada vez maiores, O MEU MUITO
OBRIGADO!
8
“Para realizar grandes conquistas, devemos
não apenas agir, mas também sonhar; não
apenas planejar, mas também acreditar. Nas
grandes batalhas da vida, o primeiro passo
para a vitória é o desejo de vencer!”
Mahatma Gandhi
9
RESUMO
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS
ÓLEOS ESSENCIAIS DAS FOLHAS DOS QUIMIOTIPOS I, II E III DE Lippia alba
(Mill.) N. E. Brown. Aluna: Andréa Bessa Teixeira. Orientadora: Profa. Dra. Nádia
Accioly Pinto Nogueira. Co-Orientadora: Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal.
Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação Em Ciências Farmacêuticas.
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas e Departamento de Farmácia.
Universidade Federal do Ceará.
A espécie Lippia alba (erva-cidreira) é muito usada na medicina popular. A composição de
seu óleo essencial apresenta variações quantitativas e qualitativas, levando à classificação de
diferentes quimiotipos. Um rico potencial farmacológico está relacionado à ampla variação na
composição química desses óleos, o que desperta o interesse de pesquisadores em estabelecer
explicações científicas para tais atividades. O objetivo do trabalho foi avaliar as atividades
antimicrobiana e antioxidante dos óleos essenciais dos quimiotipo I, II e III, de folhas, de L.
alba, bem como investigar suas possíveis relações com a composição química de seus óleos
essenciais. A caracterização química dos constituintes dos óleos essenciais foi realizada
utilizando a CG-MS, determinando-se a porcentagem dos constituintes presentes nas
amostras. O potencial antimicrobiano dos óleos foi determinado pelo método de difusão em
ágar, e as CIM e CLM pelos métodos da microdiluição em caldo de cultura e do
plaqueamento em ágar, respectivamente. A atividade antioxidante foi avaliada pela dosagem
de TBARS e pela determinação da atividade de remoção de radicais livres pelo DPPH. Os
óleos essenciais das folhas de L. alba foram reconhecidos pela presença de seus constituintes
majoritários em quimiotipo I (citral-mirceno); quimiotipo II (citral-limoneno) e quimiotipo III
(carvona-limoneno). Os três óleos essenciais apresentaram atividade sobre S. aureus, mesmo
as multirresistentes, e C. albicans. Para as bactérias Gram-negativas, os três quimiotipos
apresentaram ação sobre o A. lwoffi; os quimiotipos II e III inibiram o crescimento do A.
baumannii; e apenas o quimiotipo II foi que teve ação sobre E. coli ATCC 10536. As mais
baixas CIM e CLM obtidas para os óleos essenciais dos quimiotipos I, II e III, foram de 0,312
e 0,625mg/mL, 0,312 e 0,312mg/mL e 0,625 e 0,625mg/mL, respectivamente. A técnica de
difusão em ágar serviu como uma etapa preliminar na determinação do potencial
antimicrobiano e a determinação da CIM por diluição em caldo acompanhada de leitura das
densidades óticas das culturas, mostrou valores de absorbâncias semelhantes ao grupo
controle positivo até uma determinada concentração e então aumentaram, indicando um maior
crescimento microbiano. Os três quimiotipos do OELA reduziram a peroxidação lipídica
induzida no hipocampo e cérebro de ratos, contudo não apresentaram atividade seqüestradora
de radicais livres mensuradas através do teste do DPPH. Assim, os resultados sugerem que os
óleos essenciais dos quimiotipo I, II e III de L. alba, possuem excelente atividade
antimicrobiana, principalmente sobre S.aureus e C. albicans; que o método de difusão é um
excelente método de triagem; que o método da diluição, por inspeção visual e leitura de
absorbância, permite determinar alem da CIM, a CLM e avaliar a cinética de inibição de
crescimento microbiano; o potencial antioxidante mostrado pelo OELA no hipocampo e
córtex de rato, torna esses produtos uma ferramenta farmacológica em potencial no tratamento
de doenças neurodegenerativas, contudo, para isso estudos adicionais são necessários; e que
as diferenças na composição do óleo é um fator que deve ser considerado importante nos
estudos farmacológicos.
Palavras-chave: Lippia, óleo essencial, atividade antimicrobiana, atividade antioxidante.
10
ABSTRACT
EVALUATION OF ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF
ESSENTIAL OILS OF LEAVES OF CHEMOTYPE I, II AND III OF Lippia alba
(Mill.) N. E. Brown. Author: Andréa Bessa Teixeira. Advisor: Prof. Dr. Nádia Accioly
Pinto Nogueira. Co-Advisor: Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal. Dissertation. PostGraduate in Pharmaceutical Sciences. Department of Clinical and Toxicological
Analysis and Department of Pharmacy. Federal University of Ceará.
The species Lippia alba (erva cidreira) is widely used in folk medicine. The composition of
essential oil varies quantitative and qualitative, leading to the classification of different
chemotypes. A rich pharmacological potential is related to the wide variation in chemical
composition of these oils, which arouses the interest of researchers in establishing scientific
explanations for such activities. The objective of this study was to evaluate the antimicrobial
and antioxidant activities of essential oils of chemotype I, II and III, leaves of L. alba, and to
investigate their possible relationships with the chemical composition of their essential oils.
The chemical characterization of constituents of essential oils was performed using GC-MS
by determining the percentage of constituents present in the samples. The antimicrobial
activity of oils was determined by agar diffusion, and MIC and CLM methods by
microdilution broth culture and plated on agar, respectively. The antioxidant activity was
assessed by measurement of TBARS and by determining the activity of removal of free
radicals by DPPH. Essential oils from leaves of L. alba were recognized by the presence of its
major constituents in chemotype I (citral-myrcene), chemotype II (citral-limonene) and
chemotype III (carvone-limonene). The three essential oils showed activity against S. aureus,
even resistant, and C. albicans. For Gram-negative bacteria, the three chemotypes present
action on the A. lwoffi; the chemotypes II and III inhibited the growth of A. baumannii, and
only the chemotype II was that acted on E. coli ATCC 10536. The lowest MIC obtained for
CLM and essential oils of chemotypes I, II and III were 0,312 and 0,625mg/mL, 0,312 and
0,312mg/mL and 0,625 and 0,625mg/mL, respectively. The diffusion technique in agar served
as a preliminary step in determining the antimicrobial activity and MIC determination by
broth dilution accompanied by reading of optical densities of cultures showed absorbance
values similar to the positive control group by a certain concentration and then increased
indicating a higher microbial growth. Three chemotypes of OELA reduced lipid peroxidation
induced in the hippocampus and brain of rats, but showed no scavenging activity of free
radicals measured by the DPPH test. Thus, the results suggest that essential oils of chemotype
I, II and III of L. alba, have excellent antimicrobial activity, especially on S. aureus and C.
albicans, whereas the diffusion method is an excellent screening method, the dilution method,
by visual inspection and reading of absorbance, in addition to determine the MIC, the CLM
and evaluate the kinetics of inhibition of microbial growth, the antioxidant potential shown
OELA by the hippocampus and cortex of rats makes these products a potential
pharmacological tool in the treatment of neurodegenerative diseases, however, for that
additional studies are needed, and that differences in the composition of the oil is a factor to
be considered important in studies pharmacological.
Key-words: Lippia, essential oil, activity antimicrobial, antioxidant activity.
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC
American Type Culture Collection
BHI
Brain Heart Infusion
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CLM
Concentração Letal Mínima
CLSI
Clinical and a Laboratory Standards Institute
CG-MS
Cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas
DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EPM
Erro Padrão Médio
HI
Halo de inibição
MDA
Malonildialdeído
OELA
Óleo essencial de Lippia alba N.E.Brown
TBARS
Substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
ANOVA Análise de Variação
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Fluxograma da técnica de difusão em poço.
55
Figura 02: Fluxograma da técnica de microdiluição em caldo para a determinação da
CIM.
61
Figura 03: Fluxograma da técnica de Pour-Plate para a determinação da CLM.
63
Figura 04: Fluxograma da dosagem das substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico.
65
Figura 05: Fluxograma da dosagem das substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico
(continuação).
66
Figura 06: Fluxograma do ensaio do radical livre DPPH
68
Figura 07: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br.,
quimiotipo I, realizado através da cromatografia gasosa com detecção por
espectrometria de massas (CG-MS) (ADAMS, 2001).
73
Figura 08: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br.,
quimiotipo II, realizado através da cromatografia gasosa com detecção por
espectrometria de massas (CG-MS) (ADAMS, 2001).
74
Figura 09: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br.,
quimiotipo III, realizado através da cromatografia gasosa com detecção por
espectrometria de massas (CG-MS) (ADAMS, 2001).
75
Figura 10: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus ATCC 6538P
determinados pelo método de difusão em ágar.
Figura 11: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre C. albicans ATCC
82
13
10231 determinados pelo método de difusão em ágar.
82
Figura 12: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre E. coli ATCC 10536
determinados pelo método de difusão em ágar.
83
Figura 13: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre A. lwoffi determinados
pelo método de difusão em ágar.
85
Figura 14: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre A. baumannii
determinados pelo método de difusão em ágar.
85
Figura 15: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus 1 determinados
pelo método de difusão em ágar.
86
Figura 16: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus 2 determinados
pelo método de difusão em ágar.
86
Figura 17: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo I, sobre S. aureus ATCC 6538P.
91
Figura 18: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo I, sobre C. albicans ATCC 10231.
91
Figura 19: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo I, sobre de S. aureus 1.
92
Figura 20: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo I, sobre S. aureus 2.
92
14
Figura 21: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo I, sobre A. lwoffi.
93
Figura 22: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre S. aureus.
94
Figura 23: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre C. albicans.
94
Figura 24: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre de E. coli.
95
Figura 25: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre de A. lwoffi.
95
Figura 26: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre A. baumannii.
96
Figura 27: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre S. aureus 1.
96
Figura 28: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre S. aureus 2.
97
Figura 29: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre S. aureus.
98
Figura 30: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre C. albicans.
98
Figura 31: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre S. aureus 1.
99
15
Figura 32: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre S. aureus 2.
99
Figura 33: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre de A. lwoffi.
100
Figura 34: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das
folhas de L. alba, quimiotipo III, sobre de A. baumannii.
100
Figura 35: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba,
quimiotipo I, II e III determinado através da dosagem de substâncias reativas do
ácido tiobarbitúrico (TBARS) (AGAR et al., 1999).
102
Figura 36: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba,
quimiotipo I, determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC
et al., 1999).
103
Figura 37: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba,
quimiotipo II, determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC
et al., 1999).
104
Figura 38: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba,
quimiotipo III, determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC
et al., 1999).
104
16
LISTA DE FOTOS
Foto 01: Espécie Lippia alba N.E. Brown cultivada no Horto de Plantas Medicinais
Prof. Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará: a: L. alba
quimiotipo I; b: L. alba quimiotipo II e c: L. alba quimiotipo III
49
Foto 02: Semeadura das suspensões bacterianas na superfície de ágar Mueller-Hinton.
56
Foto 03: Confecções de poços de 5mm de diâmetro interno no ágar com auxílio de
um perfurador.
56
Foto 04: Remoção do ágar com auxílio de uma pinça para a formação dos poços.
57
Foto 05: Aplicação de volumes de 25µL dos óleos essenciais de folhas de L. alba em
diferentes concentrações.
57
Foto 06: Leitura das placas e interpretação dos resultados.
58
Foto 07: Ensaio de difusão em ágar do óleo essencial das folhas de L. alba, quimiotipo II,
sobre a cepa de S. aureus.
78
Foto 08: Ensaio de difusão em ágar do óleo essencial das folhas de L. alba, quimiotipo II,
sobre a cepa de P.aeruginosa.
78
Foto 09: Ensaio de microdiluição em caldo mostrando a CIM detectado a “olho nu”
(ausência de turvação visível).
88
17
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Perfil de resistência aos antibióticos das cepas de origem hospitalar obtidas
de diferentes sítios anatômicos.
52
Tabela 02: Rendimento médio dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E.
Brown, quimiotipos I, II e III, extraído pela técnica de destilação com arraste de vapor
71
d’água.
Tabela 03: Porcentagens dos componentes químicos dos óleos essenciais das folhas de
Lippia alba N. E. Br., quimiotipos I, II e III realizado através da cromatografia gasosa
com detecção por espectrometria de massas (CG-MS).
76
Tabela 04: Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de folhas da Lippia alba N.E.
Brow, quimiotipos I, II e III, sobre cepas microbianas originárias da ATCC,
determinado pela técnica de difusão em ágar (CLSI 2003).
79
Tabela 05: Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de folhas da Lippia alba
N.E. Brow, quimiotipos I, II e III, sobre cepas microbianas multirresistentes de origem
hospitalar, determinado pela técnica de difusão em ágar (CLSI 2003).
80
Tabela 06: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Letal Mínima
(CLM) dos óleos essenciais de folhas de Lippia alba N.E. Brown, quimiotipos I, II e III
da sobre cepas microbianas originárias da ATCC e cepas microbianas multirresistentes
de origem hospitalar, determinado pela técnica da microdiluição em caldo de cultura
(CLSI, 2003) e de plaqueamento em meio sólido (BARON et al., 1994).
89
Tabela 07: Atividade antioxidante pelo método de DPPH expresso em percentagem de
inibição dos óleos essenciais das folhas de L. alba, quimiotipo I, II e III.
105
18
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
22
1.2 Óleos essenciais
24
1.3 Antimicrobianos e resistência bacteriana
26
1.4 Antimicrobianos de origem vegetal
29
1.5 Espécies Reativas de Oxigênio e Estresse Oxidativo
32
1.6 Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas
34
1.7 A Família Verbanaceae e o gênero Lippia
36
1.8 A espécie Lippia alba (Mill) N. E. Brown e seus quimiotipos
38
1.9 Aplicações e propriedades biológicas da Lippia alba
41
1.10
Plantas
medicinais:
a
importância
e
necessidade
de
estudos
multidisciplinares
44
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
47
2.2 Objetivos Específicos
47
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material botânico
49
3.2 Óleo essencial
50
3.2.1 Extração do óleo essencial de folhas de L. alba
50
3.2.2. Análise do óleo essencial
50
3.2.3 Preparação das diluições seriadas dos óleos essenciais de folhas de L. alba
50
3.3 Cepas Microbianas
51
3.3.1 Cepas microbianas ATCC
51
3.3.2 Cepas microbianas multirresistentes isoladas de espécimes clínicos
51
3.3.3 Manutenção das cepas microbianas
51
3.4 Determinação do Potencial Antimicrobiano dos Óleos Essenciais de Folhas
da L. alba
53
3.4.1 Determinação da atividade antimicrobiana
53
3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima – CIM
59
3.4.2.1 Confirmação do tamanho do inoculo microbiano.
62
3.4.3 Determinação da concentração letal mínima – CLM
62
19
3.5 Avaliação da atividade antioxidante, in vitro, dos óleos essenciais de folhas
da L. alba
64
3.5.1 Avaliação do efeito dos óleos essências das folhas de L. alba, quimiotipos
I, II e III, sobre a peroxidação lipídica induzida pelo choque térmico em
cérebro de ratos: dosagem de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
64
3.5.2 Ensaio do radical livre DPPH
67
3.6 Análise Estatística
69
3.7 Comitê de Ética
69
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação do rendimento médio e caracterização química dos constituintes
dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E.Brown, quimiotipos I, II e III. 71
4.1.1 Rendimento médio dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimitipos I, II e III.
71
4.1.2 Composição química dos constituintes dos óleos essenciais das folhas de
Lippia alba, quimitipos I, II e III.
72
4.2 Avaliação do potencial antimicrobiano, determinação da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos
essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
77
4.2.1 Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimitipos I, II e III determinado pelo método de difusão em ágar (CLSI,
2003).
77
4.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Letal Mínima
(CLM) dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III
determinadas pelos métodos de microdiluição em caldo de cultura (CLSI,
2003) e plaqueamento em meio sólido (BARON et al., 1994).
87
4.3 Avaliação da atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de
Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
101
4.3.1 Atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimiotipos I, II e III determinado através da dosagem de substâncias reativas
do ácido tiobarbitúrico (TBARS) (AGAR et al., 1999).
101
4.3.2 Atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimiotipos I, II e III determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE
GAULEJAC et al., 1999).
103
20
5 DISCUSSÃO
5.1 Avaliação do rendimento médio e caracterização química dos constituintes
dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E.Brown, quimiotipos I, II e III. 107
5.2 Avaliação do potencial antimicrobiano, determinação da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos
essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
110
5.3 Avaliação da atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de
Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
121
6 CONCLUSÃO
124
7 REFERÊNCIAS
127
21
INTRODUÇÃO
22
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
“A busca de novos medicamentos em plantas é hoje a
esperança mais concreta para pacientes que possuem doenças graves.
A alternativa mais rápida e barata são as plantas que produzem
substâncias químicas que podem ser usadas como medicamentos.
Partindo de vegetais, as chances de acertos são de uma para cinco
mil tentativas” (FERESIN et al, 2001).
A utilização da fitoterapia não é nova, se tem demonstrado “factos” que indicam
que desde o ano de 2100 A.C. a civilização mesopotâmica utilizava as plantas medicinais.
Hoje em dia, não existe dúvida sobre a importância das plantas e apesar do desenvolvimento
alcançado pela síntese química, estas constituem um arsenal de substâncias biologicamente
ativas. As plantas medicinais têm um papel importante no cuidado da saúde das pessoas no
mundo. A sociedade humana, em todas as épocas, tem acumulado um vasto arsenal e
conhecimento tradicional sobre o uso das plantas para fins medicinais.
O homem moderno pode ser compreendido e diferenciado das demais épocas por
seu elevado consumo de medicamentos e conseqüentemente, a procura do mercado mundial
por produtos de origem natural, em substituição aos sintéticos, aumenta consideravelmente.
O uso de produtos naturais como matéria-prima para a síntese de substâncias
bioativas, especialmente fármacos, tem sido amplamente relatada ao longo dos tempos
(SIMÕES, 2004). Essa importância dos produtos naturais nas formulações de medicamentos
pode ser vista quando se considera que, mesmo nos países industrializados, 45% dos produtos
farmacêuticos provêm de produtos naturais e essa proporção é ainda maior nos países
subdesenvolvidos (HOLTEZ et al, 2002).
Nos últimos anos, inúmeras pesquisas científicas vêm sendo desenvolvidas nos
laboratórios de universidades e indústrias, em busca de explicações para usos populares de
plantas, assim como na esperança de encontrar novos compostos com potenciais biológicos
que possam ser utilizados na produção de novos medicamentos (BOTELHO et al, 2007;
BARBOSA-FILHO et al, 2006; CAVALCANTI, 2006; ANDREGHTTI-FROHNER et al,
2005; DUARTE, et al, 2005; PEREIRA, et al, 2004). A indústria farmacêutica tem buscado
23
incessantemente a descoberta de novas formulações à base de extratos, óleos ou mesmo
produtos sintéticos.
O Brasil é um país com grande diversidade em sua flora, por isso constitui um
grande campo de estudo e pesquisa, facilitando assim a descoberta de princípios ativos
vegetais. Muitas espécies de vegetais são extensamente utilizadas na medicina popular, com
diferentes finalidades terapêuticas, levando-as a serem alvos constantes e crescentes de
inúmeros estudos, para o conhecimento de suas propriedades químicas e farmacológicas, bem
como para a comprovação de sua segurança e do seu uso popular (BARBOSA-FILHO et al,
2006; ROCHA et al, 2005).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, 80% da humanidade não têm acesso
ao atendimento primário de saúde, por estarem muitos distantes dos centros de saúde ou por
não possuírem recursos para adquirir os medicamentos prescritos. Para essa população, as
terapias alternativas são as principais formas de tratamento, e as plantas medicinais os
principais medicamentos (AKERELE, 1993).
Em muitas comunidades e grupos étnicos, o conhecimento sobre plantas
medicinais simboliza geralmente o único recurso terapêutico. Nos dias atuais, nas regiões
mais pobres do País e até mesmo nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são
comercializadas em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais.
MARTINS et al (1995) relatam um aumento acentuado do uso de plantas
medicinais pela população mundial e a tendência é de contínuo crescimento. Segundo estudos
de SOUSA et al (1991) e MATOS (1998) o principal uso de plantas medicinais é no
tratamento das doenças respiratórias, seguido das inflamações em geral e das diversas formas
de doenças intestinais. Quanto a efetividades terapêuticas dessas plantas documentadas por
esses autores, muitas já possuem informações farmacológicas que podem justificar o seu uso
popular. Assim, esse tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em
estudos para terapia natural envolvendo componentes de plantas na área farmacêutica e as
pesquisas com esses produtos naturais assumem papel importante para a saúde humana.
No entanto, embora a Organização Mundial de Saúde reconheça que as plantas
medicinais deveriam ser as melhores fontes para a obtenção de uma variedade de drogas, para
a utilização de uma planta com finalidade terapêutica, em nível de saúde pública, é
fundamental o estabelecimento da segurança, eficácia e garantia de qualidade das preparações
(RATES, 2001).
24
1.2 Óleos essenciais
Desde muitos séculos atrás, os óleos essenciais são relatados e explorados.
Embora ainda hoje não se tenha documentado completamente o início exato, sabe-se que as
referências históricas de obtenção e utilização desses óleos estão ligadas, originalmente, aos
países orientais, com destaque para o Egito, Japão, China e Índia. Acredita-se que os
primeiros usos dos óleos essenciais tenham sido através de bálsamos, ervas aromáticas e
resinas que eram usadas para embalsamar cadáveres em cerimônias religiosas a milhares de
anos atrás (SILVA-SANTOS, 2002; LAVABRE, 1992; BRAGA, 1971).
Aqui no Brasil, sua produção teve início em 1927, tendo como base o puro e
simples extrativismo de essências nativas, como o pau-rosa (Aniba rosaeodora). Sua
exploração foi tamanha que atualmente o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) colocou essa planta na lista de espécies em perigo
de extinção. No entanto, como atividade verdadeiramente organizada, a produção de óleos
essenciais no Brasil só foi consolidada basicamente na sua venda voltada ao mercado externo,
com a obtenção dos óleos de menta, laranja, canela, eucalipto, capim-limão e outros. Isto
ocorreu durante a Segunda Guerra Mundial, devido à grande demanda imposta pelas
indústrias do ocidente, que se viram privadas de suas tradicionais fontes de suprimento, em
virtude da desorganização do transporte e do comércio (BRAGA, 1971).
O mercado internacional de óleos essenciais corresponde atualmente a US$ 1,8
bilhões, sendo que a participação do Brasil neste momento é estimada em apenas 1%,
principalmente em resposta à exportação de óleos de laranja, limão, eucalipto, pau-rosa, lima
e alecrim-pimenta. As comunidades científicas estão cada vez mais organizadas e diversos
novos óleos podem vir a contribuir para o quadro de exportação (SILVA-SANTOS, 2002).
As denominações óleos essenciais ou óleos etéreos derivam de algumas de suas
características físico-químicas, como por exemplo, a de serem geralmente líquidos de
aparência oleosa à temperatura ambiente, advindo daí, a designação de óleo; por serem
solúveis em solventes orgânicos apolares, como éter, sendo por isso, chamado de óleos
etéreos (SIMÕES, 2004). No entanto, a principal característica é a sua natureza volátil, por
evaporarem rapidamente quando expostos ao ar à temperatura ambiente e diferenciando,
assim, dos óleos graxos ou fixos, que são misturas de substâncias lipídicas (LAVABRE,
1992). Outra importante característica é o aroma agradável e intenso da maioria dos óleos
voláteis, por isso, são chamados, também, de essências (SIMÕES, 2004).
25
Os óleos essenciais apresentam composições complexas, algumas vezes, de
centenas de diferentes compostos químicos, com ação sinérgica ou complementar entre si. De
forma geral, são misturas complexas contidas em diversos órgãos vegetais e constituídas
principalmente de terpenos, sesquiterpenos, ésteres, alcoois, fenóis, aldeídos, óxidos,
peróxidos, cetonas e ácidos orgânicos. Em sua composição também são encontrados
antibióticos, vitaminas, hormônios e anti-sépticos (SIANI et al, 2000). Nessa mistura, tais
compostos apresentam-se em diferentes concentrações, normalmente, um deles é o composto
majoritário, existindo outros em menores teores e alguns em baixíssimas quantidades (traços).
Os estudos relatam que a constituição química do óleo essencial nem sempre é
constante, podendo variar significativamente, de acordo com o processamento de colheita e
pós-colheita (parte da planta coletada, hora da coleta, época do ano), do material genético da
planta (variedade do vegetal), bem como das condições de cultura e desenvolvimento do
vegetal (tipo de solo e clima) (SIMÕES, 2004; LAVABRE, 1992), tendo como conseqüência,
influencia diretamente no potencial farmacológico dessas plantas (MATOS, 2001).
A ampla variação química do óleo essencial permite a separação das espécies em
quimiotipos (QT) ou raças químicas. A ocorrência de quimiotipos é freqüente em plantas ricas
em óleos voláteis e é um termo aplicado a plantas da mesma espécie, com a mesma aparência
externa (botanicamente idênticas), mas que diferem, às vezes consideravelmente, na
composição química dos óleos essenciais (SIMÕES, 2004; CASTRO, 2001). Por exemplo,
para Chrysanthemum vulgare (L.) Berhn, popularmente conhecida como catinga-de-mulata,
apenas na Hungria, foram caracterizados 26 quimiotipos, com diferenças significativas na
composição de seus óleos (TEUSCHER, 1990).
Atualmente é grande o número de plantas conhecidas para a produção de óleos
essenciais, representando, assim, uma importância econômica crescente. Os diversos efeitos
de compostos extraídos de óleos essenciais de plantas levam sua aplicação em várias áreas
comerciais. Tradicionalmente são empregados como matérias-primas nas indústrias
farmacêuticas, de alimentos, de cosméticos, perfumes e de higiene pessoal, bem como na
aromatização de alimentos e bebidas (SILVA-SANTOS, 2002). Embora a utilização maior
ocorra nas áreas de alimentos (condimentos e aromatizantes de alimentos e bebidas) e
cosméticos (perfumes e produtos de higiene), também em farmácias as drogas vegetais ricas
em óleos voláteis são empregadas in natura para a preparação de infusões e/ou sob a forma de
preparações galênicas simples (SIMÕES, 2004).
26
Muitos estudos têm comprovado as propriedades farmacológicas de compostos
extraídos de óleos essenciais de plantas. Pode ser citada como propriedades farmacológicas
relativamente bem estabelecidas a ação carminativa do óleo de funcho, erva-doce, camomila,
menta; a ação sobre o Sistema Nervoso Central, como estimulante (óleos voláteis contendo
cânfora), depressor (melissa, capim-limão) ou mesmo provocando convulsões em doses
elevadas (sálvia, canela); a ação anestésica local do óleo do cravo-da-índia pelo seu alto teor
em eugenol e a ação antiinflamatória do óleo de camomila, que contém azulenos (SIMÕES,
2004).
1.3 Antimicrobianos e resistência bacteriana
As primeiras descrições sobre o uso de antimicrobianos datam de 3.000 anos
atrás, quando médicos chineses usavam bolores para tratar edemas inflamatórios e feridas
infeccionadas, e os sumérios recomendavam um emplasto com uma mistura de vinho, cerveja,
zimbro e ameixas (TAVARES, 2001).
No início do século XX, surgiram os primeiro quimioterápicos de ação sistêmica.
Os esforços do cientista alemão Paulo Ehrlich, considerado pai da quimioterapia, que
descobriu o salvarsan (sal do arsênico) usado no tratamento da sífilis e da febre recorrente,
revolucionaram a terapêutica das infecções e provocaram o desenvolvimento da pesquisa,
objetivando a obtenção de novas substâncias medicamentosa sintetizadas em laboratórios
(TORTORA, 2003).
Outro marco importante na história dos antimicrobianos foi a descoberta por
Alexander Fleming em 1928 da penicilina, o primeiro antibiótico de utilidade clínica. Fleming
estudando culturas de Staphylococcus aureus observou que uma das culturas tinha sido
contaminada por bolores e em volta dessas colônias não havia mais crescimento bacteriano.
Então Fleming e seu colega, Dr. Pryce, descobriram que a substância responsável pela
inibição do crescimento do S.aureus era produzida pelo fungo Penicillium nonatum, a qual foi
denominada de penicilina (KONEMAN et al, 2001).
Várias substâncias de origem vegetal, animal e mineral foram utilizadas na
Antiguidade e na Idade Média para o tratamento das conhecidas “pestes”, que eram diversas
epidemias de origem microbiana. Esses produtos, usados de forma empírica, sabe-se hoje que
apresentam propriedades terapêuticas antiinfecciosas devido a determinadas substâncias
presentes em sua composição (TAVARES, 2001).
27
O advento dos antibióticos e dos quimioterápicos permitiu o controle e cura das
doenças infecciosas, mudando a evolução natural dessas doenças de forma marcante. No
entanto, o uso indiscriminado de antimicrobianos, provocou a partir da década de 70, um
processo de aceleração do aparecimento de cepas bacterianas resistentes aos antimicrobianos,
principalmente nos ambientes hospitalares (LINARES-RODRIGUES et al, 2005;
WAGENLEHNER et al, 2005).
O termo “resistência” se refere aqueles microrganismos que tem a capacidade de
crescer in vitro em presença das concentrações que esta droga atinge no sangue. A resistência
pode ser de dois tipos: natural ou intrínseca e adquirida (TORTORA, 2003; KONEMAN et al,
2001; TAVARES, 2001;).
A resistência natural ou intrínseca faz parte das características biológicas
primitivas dos microrganismos e é observada regularmente em uma determinada espécie
bacteriana em relação a diferentes antimicrobianos. Resulta de genes cromossômicos que
codificam a existência, na célula, de estruturas ou mecanismos que impedem o antibiótico de
agir em seu receptor ou que codificam a falta do sitio de ação da droga ou que determinam a
existência de receptores inadequados para a ligação com uma substancia especifica
(TORTORA, 2003; KONEMAN et al, 2001; TAVARES, 2001).
A resistência adquirida a uma determinado antimicrobiano é aquela que surge
em uma bactéria primitivamente sensível a este mesmo antimicrobiano. Essa resistência
acontece devido a mutações que ocorrem no microrganismo durante seu processo reprodutivo
e resulta de erros de cópia na seqüência de bases que formam o DNA ou por meio de
transferências do material genético, em que consiste na importação de genes causadores da
resistência,
pelos
mecanismos
de
transdução,
transformação
e
conjugação,
que,
freqüentemente, envolve genes situados em plasmídios e transposons (TORTORA, 2003;
KONEMAN et al, 2001; TAVARES, 2001).
Os diferentes mecanismos de resistência podem tornar a cepa microbiana capaz de
resistir parcial ou totalmente à ação, não apenas de um antibiótico, mas de vários,
pertencentes a uma mesma classe e às vezes a classes diferentes (OTAIZA, 2002).
A resistência das diversas espécies de microrganismos aos antimicrobianos é
extremamente variável entre os países, regiões e origem hospitalar ou comunitária das
estirpes. Algumas espécies apresentam resistência amplamente difundida em todo o mundo,
como é o caso do Staphylococcus aureus (CARSON et al, 1995).
28
Os estafilococos vêm mostrando crescente resistência a beta-lactâmicos betalactamase-resistentes, como é o caso dos S. aureus resistente a meticilina - MRSA (Methicilin
Resistant Staphylococcus aureus) ou a oxacilina (Oxacilin Resistant Staphylococcus aureus) –
ORSA, principalmente em hospitais de grande porte, com serviços de emergência abertos ao
público e centros de referencias para pacientes infectados. É reconhecido como um dos mais
importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais em todo o mundo e o surgimento
e disseminação de cepas cada vez mais virulentas e multirresistentes é um fator preocupante
(TAVARES, 2001).
Um exemplo, dessa preocupação, é que em 2002 já foram confirmados nos
Estados Unidos da América (EUA) tanto em laboratório como em clínica, linhagens mutantes
com sensibilidade reduzida à vancomicina (FRIDKIN, 2002), como também, nesse mesmo
ano, descreve o primeiro caso documentado de infecção causada por S. aureus com resistência
completa a vancomicina (VRSA) (Vancomicina MIC > 32mcg/mL) (SIEVERT et al, 2002).
Além do S. aureus, dentre os microrganismos que sofrem grandes modificações
na sensibilidade aos antimicrobianos com o correr dos anos, destacam-se as enterobactérias,
como a Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, a Pseudomona aeruginosa, o Acinetobacter
baumannii, os fungos e as leveduras do gênero Candida, especialmente a Candida albicans
(KONEMAN et al, 2001, TAVARES, 2001 CHARTONE-SOUZA et al, 1998). Esses
patógenos representam cada vez mais um desafio emergente ao tratamento das infecções
causadas por eles.
Em um estudo feito por MENEZES e colaboradores em 2004, determinando o
perfil de resistência de A.baumannii a antimicrobianos nas unidades de terapia intensiva e
semi-intensiva do Hospital Geral de Fortaleza, verificaram que 62 (14%) das 437 amostras
analisadas foram positivas para essa bactéria, sendo o maior número de isolados do aspirado
traqueal e sangue. Quanto ao perfil de resistência observaram que as cepas isoladas de
cateteres foram resistentes a quase todos os antimicrobianos, com exceção das quinolonas e
imipenen (MENEZES et al, 2004).
Atualmente, o problema de resistência tornou-se mais grave devido às
dificuldades para a descoberta e o lançamento de novos antimicrobianos no mercado, pois são
necessários muitos anos e um custo altíssimo para que um antimicrobiano esteja á disposição
no mercado, o que leva a esses produtos estarem cada vez mais escassos e mais caros.
BAQUERO e BLÁZQUEZ (1997) relatam o perigo do retorno a uma era préantibiótico, particularmente considerando que nenhuma nova classe de antibiótico foi
29
descoberta nos últimos anos, apesar das intensas pesquisas das indústrias farmacêuticas e
CHARTONE-SOUZA (1998) confirma que uma das alternativas usadas pelas indústrias
farmacêuticas tem sido a modificação química da estrutura dos antimicrobianos já existentes,
na tentativa de torná-los mais eficientes ou de recuperar a atividade prejudicada pelos
mecanismos bacterianos de resistência.
Dessa forma, esses dados antecipam os gravíssimos problemas que poderão trazer
essas cepas microbianas resistentes, caso não surjam novos antimicrobianos ou terapias
alternativas para combatê-las.
1.4 Antimicrobianos de origem vegetal
“O problema da resistência microbiana é crescente e a
perspectiva futura do uso de drogas antimicrobianas, é incerta”.
(NASCIMENTO et al, 2000).
Como descrito anteriormente, um dos maiores problemas de saúde pública
enfrentados nas últimas décadas consiste no agravamento da resistência a antimicrobianos em
populações bacterianas e fúngicas, principalmente em cepas de origem hospitalar e que o
Brasil é um rico ambiente para estudos com produtos naturais, os quais constituem uma
importante fonte de novos compostos para serem utilizados na terapêutica. Nestes dois
aspectos, a busca por novas substâncias antimicrobianas a partir de fontes naturais vem
ganhando importância e está cada vez mais intensificada.
Acredita-se que as plantas medicinais sejam as melhores fontes de obtenção
dessas novas drogas e muitos estudos têm sido conduzidos, em diferentes partes do mundo
para comprovar sua eficiência. Muitas plantas são usadas por sua atividade antimicrobiana, a
qual se deve a compostos sintetizados em seu metabolismo secundário (NASCIMENTO et al,
2000).
A atividade antimicrobiana de plantas medicinais tem sido pesquisada em diversas
espécies e relatada em muitos países como no Cuba, Índia, México e Malásia que possuem
uma flora diversificada e uma rica tradição na sua utilização (DUARTE et al, 2005, STASI et
al, 2002, NASCIMENTO et al, 2000).
No Brasil, essa realidade não é diferente. É especialmente um país com uma rica
biodiversidade e conhecimentos tradicionais abundantes, com cultura comum do uso de
30
plantas medicinais, o que resulta no interesse da realização de importantes pesquisas sobre
atividade antimicrobiana de vegetais e o uso de componentes de plantas nessa área tem
aumentado gradualmente.
O uso de extratos vegetais e fitoquímicos com conhecida atividade antimicrobiana
assume importante significado nos tratamentos terapêuticos. Muitas espécies vegetais são
reconhecidas por suas substâncias ativas que apresentam atividade antimicrobiana contra um
grande número de microrganismos, incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos
(NASCIMENTO et al, 2000).
Em estudo realizado por SOUZA et al em 2004, foi avaliada a atividade biológica
de 49 plantas em farmácias comunitárias caseiras no Rio Grande do Sul. De dezoito espécies
analisadas quanto a sua atividade antimicrobiana, onze (Chaptalia mutans, Cordia
monosperma, Echinodorus grandiflorus, Eugenia uniflora, Leonurus sibiricus, Luehea
divaricata, Malva sylvestris, Ocotea odorifera, Parapiptadenia rigida, Pluchea sagittalis,
Psidium cattleyanum e Senna neglecta) inibiram no mínimo um dos microrganismos testados.
Em outra pesquisa, foi analisada a atividade antimicrobiana do extrato de 120
espécies de plantas de 28 diferentes famílias botânicas. Oitenta e um desses extratos, obtidos
de 58 plantas, mostraram-se ativos contra S. aureus, enquanto cinco extratos, de quatro
plantas, inibiram o crescimento de Pseudomonas aeruginosa (SANTOS-FILHO et al, 1990).
BASTOS em 2007, estudando o uso de preparações caseiras de plantas medicinais
utilizadas no tratamento de doenças infecciosas, verificou que das quarenta e cinco amostras
analisadas, 25 (55,6%) apresentaram atividade inibitória sobre o crescimento de pelo menos
um dos microrganismos testados. Duas dessas amostras (romã e cebolinha + pepaconha +
cumaru + beterraba + alho + mel de abelha) foram capazes de inibir todas as cepas testadas;
as amostras de alfavaca + eucalipto e cebolinha branca + eucalipto + aroeira + pepaconha
foram ativas contra Pseudomonas aeruginosa, microrganismo bastante conhecido por sua
múltipla resistência a drogas.
De um modo geral, um dos produtos vegetais que mais se destaca e que se
apresenta como potencial fonte de compostos antimicrobianos são os óleos essenciais. Já se
tem estabelecido cientificamente que 60% dos óleos essenciais possuem propriedades
antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (DAFERERA et al, 2003). Neste
contexto, vários estudos vêm sendo conduzidos para avaliar e comprovar cientificamente o
uso empírico para tal atividade, bem como para o desenvolvimento de novos fármacos.
31
Em 2004, FARAGO e colaboradores analisaram a atividade antibacteriana de
óleos essenciais de Ocimum selloi Benth, conhecida popularmente como alfavaca,
pertencentes às variedades estragol e eugenol. Os resultados in vitro demonstraram que tanto
a variedade estragol como a eugenol inibiram o crescimento das cepas de S.aureus ATCC
25923 e de E.coli ATCC 25922, mas que nenhuma teve ação contra P.aeruginosa ATCC
27853.
PEREIRA e colaboradores (2004) analisaram a atividade antibacteriana de óleos
essenciais de Ocimum gratissimum L., Cybopogum citratus (DC) Stapf. e Salvia officinalis L.
sobre 100 cepas de bactérias isoladas de indivíduos da comunidade com diagnóstico de
infecção urinária. Os resultados mostraram ser a ação inibitória do óleo essencial de Salvia
officinalis L., superior as apresentadas pelos óleos essenciais extraídos das outras ervas, tendo
eficácia de 100% sobre espécies dos gêneros Klebsiella e Enterobacter, 96% sobre
Escherichia coli, 83% sobre Proteus mirabilis e 75% sobre Morganella morganii. Foi
verificado que os óleos essenciais das outras duas espécies, embora menos potentes que o óleo
essencial de Salvia officinalis L., foram capazes de inibir o crescimento de 16% das cepas
estudadas.
LIMA et al, 2006, avaliaram a atividade antifúngica de óleos essenciais sobre
espécies de Candida (C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea
e C. tropicalis) e observaram que todos os óleos essenciais extraídos de Cinnamomum
zeylanicum Blume, Citrus limon Risso, Eucalyptus citriodora HK, Eugenia uniflora L.,
Peumus boldus Benth e Rosmarinus officinallis L. foram capazes de inibir o crescimento de
pelo menos uma das cepas fúngicas testadas e que os óleos essenciais de C. zeylanicum e P.
boldus inibiram o crescimento da maioria das cepas.
Muitos óleos essenciais extraídos apresentam atividade antimicrobiana contra um
grande número de bactérias, incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos,
podendo inibir tanto bactérias Gram-positivas quanto bactérias Gram-negativas e ainda
leveduras e fungos filamentosos (CARSON et al, 1995). Segundo DAFERERA et al (2003) o
uso de óleos essenciais, como agentes antimicrobianos, oferece um baixo risco de
desenvolvimento de resistência microbiana, pois sendo misturas de diferentes compostos, sua
atividade microbiana pode estar relacionada a diferentes mecanismos de ação, o que dificulta
a adaptação dos microrganismos.
32
Nesse sentido, os óleos essenciais assumem um importante papel no combate ao
desenvolvimento de resistência microbiana, levando a oportunidade de serem encontrados
compostos com propriedades antimicrobianas, muitas vezes superiores aos fármacos atuais.
1.5 Espécies Reativas de Oxigênio e Estresse Oxidativo
O oxigênio é um composto essencial para os seres vivos. As moléculas de
oxigênio diatômico na atmosfera terrestre são as maiores promotoras de reações nas células
vivas. Exceto aqueles organismos que são especialmente adaptados para viver em condições
anaeróbias, todos os animais e plantas requerem oxigênio para uma eficiente produção de
energia (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
Cerca de 2% a 5 % do oxigênio consumido, dá origem a intermediários altamente
reativos, denominados Espécies Reativas de Oxigênios (EROs). Estas espécies incluem o
oxigênio singlete (1O2), o radical ânion superóxido (O2--), o peróxido de hidrogênio (H2O2),
radical hidroxila (OH •) entre outros (SALVADOR & HENRIQUES, 2004).
O Radical Livre é qualquer átomo, molécula ou íon que possui um ou mais elétron
livre na sua orbita externa, o que caracteriza uma grande instabilidade elétrica e capacidade
reativa, podendo reagir com qualquer composto que esteja próximo, a fim de captar um
elétron desse composto para sua estabilização. A maioria desses radicais livres é derivada do
metabolismo do O2 pelo organismo, pois em condições normais é inevitável a produção das
EROs durante o processo de respiração celular que ocorre nas mitocôndrias das células, a fim
de gerar ATP. A mitocôndria, que consome mais de 90% de oxigênio, é a principal fonte de
espécies reativas de oxigênio e de radicais livres (LEE et al, 2002).
Além da respiração celular, as EROs também podem ser geradas pela ativação dos
leucócitos, como parte da resposta imune, usadas contra bactérias e fungos invasores do
organismo, produzindo ação lesiva a estes microrganismos, ou pela oxidação exógena,
causada pela poluição, fumo, solventes orgânicos, pesticidas e radiações, por exemplo
(HALLIWELL, 2001; NISSEN et al, 2001).
Em concentrações fisiológicas as EROs tem funções biológicas definidas, atuando
como mensageiros secundários de sinalização em mecanismos celulares. Entretanto,
concentrações supra-fisiológicas devem ser evitadas pelo organismo, considerando que sua
reatividade traz conseqüências celulares deletérias, causando oxidação de lipídios e proteínas,
33
alterações no DNA e a modificação nas bases e na modulação da expressão gênica (SIES,
1991).
Para se defender da toxidade das EROs, as nossas células saudáveis apresentam
mecanismos específico, que constituem o potencial biológico antioxidante. A condição
fisiológica da célula exige equilíbrio entre os sistemas pró-oxidante e antioxidante. O
desequilíbrio do estado estacionário em favor do sistema pró-oxidante promove injurias
celulares, sendo a condição denominada de estresse oxidativo (SALVADOR &
HENRIQUES, 2004).
O estresse oxidativo pode ser definido como o acumulo intracelular de níveis
tóxicos de espécies reativas de oxigênio por meio de saturação do sistema antioxidante,
causando danos moleculares às estruturas celulares, com conseqüente alteração funcional e
prejuízo das funções vitais (DROGE, 2002).
Da ação das EROs sobre ácidos nucléicos, decorrem modificações estruturais da
molécula do DNA, implicando alterações tais como mutações mutagênicas; sobre
carboidratos (principalmente em glicosaminoglicanos) são capazes de provocar quebra nas
cadeias dos carboidratos resultando em alterações no metabolismo energético celular e em
perda do reconhecimento do contato celular, podendo levar a divisões celulares não limitadas
pelo contato de células vizinhas; em proteínas causam fenômeno conhecido com peroxidação
protéica, responsável por quebra de cadeias polipeptídicas, perda ou alteração de atividade
enzimática, levando em alterações funcionais e estruturais nas células; sobre lipídeos resulta
em peroxidação lipídica, que é principalmente responsáveis por alterações da permeabilidade
da membrana celular. Desta forma, o resultado do estresse oxidativo é, com freqüência, a
morte celular (AUDDY et al, 2003, DROGE, 2002).
Dessa forma, o sistema de defesa antioxidante, mesmo presente em baixas
concentrações em relação ao substrato oxidante, é necessário e capaz de inibir ou retardar as
taxas de oxidação. Esse sistema antioxidante pode ser não enzimático ou enzimático e não se
tornam radicais livres pela doação de elétrons, pois eles são estáveis em ambas as formas
(SIES, 1991).
Os antioxidantes enzimáticos são compostos pelas seguintes enzimas: superóxidodismutase (SOD), catalase e glutationa-peroxidase (GSH-Px). A catalase, que é uma enzima
bastante abundante encontrada no sangue, medula óssea, rim e fígado, tem a função de reduzir
o H2O2 em H2O e O2 (HALLIWELL, 2001). A enzima superóxido-dismutase acelera a
dismutação do íon superóxido O2- em peróxido de hidrogênio (H2O2) na presença do próton
34
H+. E o sistema glutationa, atua no combate da redução do peróxido de hidrogênio (H2O2),
convertendo a glutationa reduzida (GSH) em oxidada (GSSG). Essa reação é catalisada pela
enzima glutationa-peroxidase (GSH-Px). A recuperação da glutationa reduzida é feita pela
enzima glutationa-redutase (GSH-Rd) (DROGE, 2002).
Quanto ao sistema de defesa antioxidante não-enzimáticos, os principais são o βcaroteno (vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), glutationa,
ácido úrico, bilirrubina, zinco, cobre e os bioflavonóides, derivados de plantas
(HALLIWELL, 2001).
O estresse oxidativo tem sido implicado como mediadores de várias patologias
tais como doenças cardiovasculares, câncer, artrite reumatóide, a distrofia muscular,
desordens neurológicas e processos de envelhecimento (NORDBERG & ARNÉR, 2001). Os
radicais livres correlacionados com essas doenças atuam, não como agentes etiológicos e sim
como fatores que participam diretamente dos mecanismos fisiopatológicos, os quais
determinam a continuidade e as complicações de diversos estados patológicos (ROVER
JUNIOR et al., 2001).
1.6 Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas
O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na
patogênese de algumas condições que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), contribuindo
para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas tais como epilepsia, esclerose
múltipla, demências e doenças de Alzheimer e de Parkinson (SALVADOR & HENRIQUES,
2004) que estão entre as doenças neurodegenerativas mais comuns.
Com a tendência de aumento do tempo de vida médio da população, a prevalência
dessas doenças também tem aumentado. As causas das desordens neurodegenerativas não
estão totalmente esclarecidas, e, com exceção da doença de Parkinson, não existem
tratamentos que alterem significativamente a progressão dessas patologias. As chances de
apresentar Alzheimer aumentam significativamente após os 60 anos, com uma prevalência de
47% em pacientes com mais de 85 anos (EVANS et al, 1989). Dessa forma, além da idade as
disfunções mitocondriais e o estresse oxidativo possuem um papel importante na morte
neuronal característica dessas doenças (ESPOSITO et al, 2002).
De fato, isso se torna facilmente compreensível, visto que o Sistema Nervoso
Central é altamente sensível ao estresse oxidativo. O cérebro é altamente dependente de
35
energia para seu funcionamento normal e a mitocôndria é a estrutura intracelular responsável
pela produção dessa energia. Para a produção eficiente de energia na forma de ATP, a
mitocôndria possui uma alta demanda por oxigênio, já que utiliza uma grande quantidade de
O2 em uma massa de tecido relativamente pequena, o que torna esse tecido altamente
susceptível à ação das espécies reativas (HALLIWELL, 2001; HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2000).
Outros fatores também contribuem para essa susceptibilidade como o alto
conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, os quais servem de
substratos para a peroxidação lipídica; os altos níveis de ferro presentes no cérebro, os quais
favorecem a lipoperoxidação; o baixo potencial antioxidante, sendo os níveis de catalase
particularmente baixos em muitas regiões cerebrais; e a presença de neurotransmissores autooxidáveis, entre outros fatores (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
Entre as evidencias que mostram o envolvimento de espécies reativas em doenças
neurodegenerativas estão o aumento dos parâmetros do estresse oxidativo no cérebro,
incluindo níveis aumentado de ácido malonildialdeído (MDA), 4-hidroxinonenal (HME) e a
oxidação protéica de grupos carbonil e 3-nitrotirosina, assim como concentrações reduzidas
de antioxidantes não enzimáticas GSH e ascorbato, e das enzimas antioxidantes catalase e
glutationa peroxidase (GSH-PX) (JENNER & OLANOW, 1996; PERRY et al, 1982).
Na doença de Alzheimer, a mais comum dentre as doenças neurodegenerativas, é
possível que o estresse oxidativo tenha um papel chave na morte neuronal. Estudos clínicos
mostraram níveis elevados de peroxidação lipídica e das enzimas catalase, SOD e GSH-Px em
várias regiões do cérebro de pacientes com Alzheimer. Por outro lado, as concentrações
intracelulares de glutationa (GSH), apresentaram-se diminuída. Níveis altos de nitrotirosina,
um aminoácido oxidado, têm sido encontrados em neurônios de pacientes com Alzheimer
(SALVADOR & HENRIQUES, 2004).
Na doença de Parkinson, foram observadas evidências do aumento do estresse
oxidativo em autópsias da substância nigra do cérebro, indicando que esse tem papel
importante na degeneração de neurônios (PARASKEVAS et al, 2003). Levantou-se a
possibilidade de que um estresse oxidativo induzido pela dopamina possa ser à base da
vulnerabilidade dos neurônios dopaminérgicos na Doença de Parkinson. Na degradação da
dopamina, ocorre a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), que na presença de Fe2+,
abundante nos gânglios da base, pode gerar radicais livres hidroxil (OH-). Caso, os
mecanismos protetores fossem inadequados, esses radicais livres poderiam levar a
36
degeneração de neurônios dopaminérgicos (GOODMAN & GILMAN, 1996). Já RIOBO e
colaboradores (2002) propõem um papel direto de óxido nítrico, e de seu produto,
peroxinitrito, na fisiopatologia da Doença de Parkinson.
Assim, devemos salientar que as EROs podem ser causa ou conseqüência de
doenças humanas associadas ao estresse oxidativo. Por isso, antioxidantes sintéticos e naturais
tem sido recomendados para o alívio dos sinais e sintomas destas doenças e, mesmo, para
bloquear sua evolução. No entanto, muito deve ser investigado acerca do benefício desses
antioxidantes exógenos, para garantir a dose, a via de administração e qual o antioxidante
ideal para cada doença.
Neste contexto, a biodiversidade brasileira, em particular a flora do Nordeste, tem
sido amplamente investigada quanto ao seu potencial terapêutico nas doenças neurológicas.
De fato, os produtos naturais parecem ser uma fonte promissora de substancias com atividade
antioxidante e pesquisas realizadas nos últimos anos evidenciam que o enriquecimento dos
sistemas orgânicos com antioxidantes naturais
1.7 A família Verbenaceae e o gênero Lippia
As Verbenaceae constituem uma família de plantas presentes em praticamente
todos os ecossistemas terrestres, sendo uma das cinco mais importantes entre as
eudicotiledôneas dos campos rupestres (CASTRO, 2001; LORENZI & MATOS, 2002).
A família Verbenaceae, subfamília Verbenoideae, apresenta aproximadamente 36
gêneros e 1.305 espécies. Os gêneros mais representativos são: Verbena (200 spp.), Lippia
(150), Citharexylum (70), Stachytarpheta (70), Glandularia (60) e Duranta (30)
(TRONCOSO, 1974).
O gênero Lippia, o segundo maior da família, foi primeiramente descrito em 1.753
por Linnaeu (BRANDÃO, 2003) e reúne um grande número de espécies. Para TRONCOSO
(1974) e SALIMENA (2000), o número de espécies estimado é de 160, estando a maior parte
no Brasil, no México, no Paraguai e na Argentina, com poucas espécies endêmicas na África.
O Brasil apresenta a maior diversidade em espécies do gênero Lippia, 111 espécies. Sendo os
principais centros de diversidade específica do gênero Lippia localizados na Cadeia do
Espinhaço, em Minas Gerais e na Chapada Diamantina, na Bahia (SALIMENA, 2000).
Além de se destacar pela grande diversidade botânica e ampla distribuição este
gênero vem recebendo importante atenção por apresentar espécies que podem ser utilizadas
37
para os mais diversos fins. Tradicionalmente, usadas no tratamento de infecções
gastrintestinais, respiratórias e cutâneas.
Em geral, as espécies do gênero Lippia apresentam na composição química de
seus tecidos, alguns compostos em comuns, encontrados em várias espécies diferentes, com
atividades farmacológicas antimalárica, antiviral e citostática. Em muitos casos, as partes
usadas são as folhas e as flores, as quais são comumente preparadas em infusão ou decocção,
mas também utilizadas oralmente ou através de emplastos e lavagens para ferimentos
(LORENZI & MATOS, 2002; PASCUAL et al, 2001).
Alguns constituintes químicos presentes em L. alba (Mill.) N. E. Br. tem ação
sedativa, antiespasmódica e estomáquica (GOMES et al, 1993). O extrato aquoso de L.
sidoides é dotado de acentuado efeito antisséptico, antiinflamatório e cicatrizante (PASCUAL
et al, 2001).
FERNANDES-FILHO et al (1998) realizaram a preparação e a análise clínica de
um anti-séptico bucal à base de óleo essencial de L. sidoides Cham (alecrim-pimenta). O
estudo que foi conduzido em 20 voluntários demonstrou que o anti-séptico bucal à base de
óleo essencial de L. sidoides reduziu em 6% a placa bacteriana nos indivíduos que fizeram seu
uso exclusivo por 7 dias, não sendo permitido durante este período realizar a escovação ou
qualquer outro tipo de higienização bucal.
O óleo essencial de L. sidoides é rico em timol e carvacrol, apresentando atividade
bactericida e fungicida. Em virtude destas propriedades, esse vegetal é cultivado em horto de
plantas medicinais e faz parte do elenco de plantas selecionadas pelo Governo do Estado o
Ceará como fitoterápico. Na Faculdade de Farmácia – UFC foi desenvolvido um anti-séptico
bucal à base de óleo essencial de L. sidoides (alecrim-pimenta) elaborado pelo setor de
Farmacotécnica com o objetivo de validar seu uso em programas alternativos na prevenção de
cárie dental (BOTELHO, 2005).
MALLIE & BASTIDE (1995) mostram que o óleo essencial de L. multiflora
Moldenk preparado por hidrodestilação das folhas e caules, apresentou atividade in vitro
sobre a cultura de Plasmodium falciparum, sendo dessa forma eficaz contra malária. Esse óleo
essencial inibiu o crescimento principalmente no passo trofozoíta - esquizonte, indicando um
potencial efeito sobre a primeira divisão nuclear do parasito. Também foi mostrado o efeito de
L. multiflora no tratamento da hipertensão (NOAMESI, 1977) e sua eficácia no combate à
sarna (OLADIMEJI et al, 2000).
38
A L. dulcis Trevir é principalmente usada no tratamento da tosse e bronquite
(COMPADRE et al, 1986). Além de suas propriedades medicinais, suas folhas são também
utilizadas na preparação de alimentos e apresenta como componente principal a
hernandulcina, que é um constituinte sesquiterpeno do óleo essencial extraído de flores e
folhas e que tem como característica de ser bem mais doce que a sacarose (KANEDA et al,
1992; COMPADRE et al, 1986)
L. citriodora e L. graveolens são utilizadas em preparações alimentar e também
como estimulador de apetite (PASCUAL, 2001; MORTON, 1981). CAVALCANTI em 2006
mostrou que o óleo essencial da L. gracillis Shauer apresentou atividade tuberculostática
sobre treze cepas de Mycobacterium tuberculosis, inclusive àquelas que resistentes à
isoniazida.
Em várias regiões, algumas espécies do gênero Lippia também têm sido utilizadas
como condimento culinário e na produção de aromatizantes, cosméticos e perfumes.
Apesar de muitas espécies apresentarem atividades biológicas comprovadas,
várias outras ainda não foram estudadas, sendo provavelmente bastante promissoras para o
isolamento de novas substâncias químicas com diferentes potenciais farmacológicos.
1.8 A espécie Lippia alba (Mill) N. E. Brown e seus quimiotipos
L. alba (Mill.) N. E. Brown, umas das principais espécies do gênero Lippia, é um
arbusto com até dois metros de altura, bastante rústico e vigoroso, perene, muito ramificado e
de morfologia variável (BRAGA et al, 2005; MATOS et al, 2001). São plantas que apresenta
ramos finos, esbranquiçados, arqueados e quebradiços. Folhas opostas, elípticas, de largura
variável, com bordos serreados e ápice agudo. Flores reunidas em inflorescências
capituliformes de eixo curto (MATOS, 1998). Podem ser encontradas em solos arenosos e nas
margens dos rios, açudes, lagos e lagoas, em regiões com clima tropical e temperado, porém
preferencialmente em regiões de clima tropical (BRAGA et al, 2005).
Muito usada como planta medicinal é popularmente conhecida como ervacidreira de arbusto, erva-cidreira do campo, alecrim do campo, chá-do-tabuleiro, cidreira
brava, erva cidreira brasileira, cidró, cidrão, falsa melissa, salsa limão entre outros
(MATOS, 1996; MARTINS et al, 1995; BRAGA, 1976). É comumente confundida com a
verdadeira erva cidreira ou melissa, Melissa officinalis (JULIÃO et al, 2003), devido à
39
presença de substância como o citral e o citronelal, os quais conferem o odor cítrico
característico da planta (PASCUAL et al, 2001).
Na comunidade científica, as diversas sinonímias que são conferidas a Lippia
alba (Mill.) N. E. Brown também causam confusão e segundo a revisão de PASCUAL et al
(2001), ela pode receber o nome de L. germinata, L. microphylla Griseb, L. germinata H. B.
K., L. globiflora Kuntze, L. lantanoides Coult, Lantana alba Mill e Phyla germinata H. B. K.
A L. alba possui um rico potencial farmacológico que está relacionado à ampla
variação na composição química de seu óleo essencial. Essa variação leva a classificação
desta espécie em quimiotipos, que são denominados de acordo com o componente químico
majoritário presente em seus óleos essenciais (JULIÃO et al, 2003; MATOS, 1996; BRAGA,
1976).
Além da variação química em seus óleos essenciais, os exemplares de diferentes
quimiotipos de L. alba também apresentam variações morfológicas, principalmente devido à
sua grande plasticidade fenotípica (CORREA, 1992), ou seja, o ambiente em que a planta se
encontra pode determinar seu hábito de crescimento, constituição fitoquímica, forma e
coloração das folhas (TAVARES et al, 2003). Esta variação morfológica, muitas vezes, leva a
problemas e complexidades na taxonomia do gênero, gerando dificuldades na correta
identificação da espécie.
Estudos da composição química do óleo essencial da L. alba em diferentes regiões
vem apresentando variações quantitativa e qualitativa dos constituintes, o que realmente
comprova a existência de muitos quimiotipos nesta espécie (CASTRO et al, 2001). No
entanto, as pesquisas relatam que os principais constituintes da composição química do óleo
dessa planta, são os monoterpenóides (borneol, cânfora, 1,8-cineol, citronelol, geranial,
linalol, mirceno, neral, piperetona, sabineno, 2-undecanona) e os sesquiterpenóides (amuuroleno, b-cariofileno, b-cubebeno, b-elemeno, gcadieno, alo-aromadendreno, óxido de
cariofileno) (PASCUAL et al, 2001).
Na Argentina, por exemplo, são conhecidos cinco quimiotipos de L. alba:
citral/linalol, d-limoneno/lippiona, d-piperitona, citral e piperitona/limoneno+1,8 cineol,
encontrados em diversas regiões com diferentes características climáticas, tipos de solos e
variado grau de umidade (PINO & ORTEGA, 1996)
Análise da composição química do óleo essencial de L. alba originada de Cuba,
revelou a presença de quarenta e dois componentes e os principais constituintes encontrados
40
foram: limoneno (6,5%), carvona (28,95%), piperitenona (6,35%) e b-guaieno (11,53%)
(PINO & ORTEGA, 1996).
No Nordeste do Brasil, foi verificada a ocorrência de quimiotipos que diferenciam
seus óleos essenciais principalmente em relação à predominância de monoterpenos tais como
citral (55,1%), mirceno (10,5%) e limoneno (1,5%) (JULIÃO et al, 2003; MATOS, 1996).
No estado do Pará, o estudo dos óleos essenciais das partes aéreas da L. alba
coletadas em três municípios, permitiram a divisão desta espécie em três grupos segundo os
seus componentes: grupo A, caracterizado por alto teor de 1,8 cineol (34,9%) e carvona
(31,8%); grupo B, com 32,1% de limoneno e 31,8% de carvona e o grupo C, caracterizado
com grandes quantidades de geranial (22,5%) e germacreno-D (25,4%) (ZOGHBI et al,
1998).
Um estudo fitoquímico feito por MENDES (2001) classificou os exemplares de L.
alba em oito formas, de acordo com os diferentes locais de coleta: formas 1 e 4 – Mato
Grosso do Sul, forma 2 – Rio Grande do Sul, formas 3, 5 e 6 – Acre, forma 7 – Paraná e
forma 8 – Goiás. A análise dos componentes principais dos óleos essenciais permitiu o
agrupamento das formas em quatro grupos distintos: nas formas de 1 e 7 foram encontrados o
linalol e 1,8 cineol; na forma 2, a cânfora, o óxido de cariofileno, o B-mirceno, o
transcariofileno, o linalol, o cafeno, e o p-cimeno; nas formas 4, 6 e 8, o citral; e nas formas 3
e 5, o D-limoneno, germacreno-D e a carvona.
No Ceará, foi verificado a ocorrência de três quimiotipos de cidreiras, que
apresentam diferenças quanto à composição química de seus óleos essenciais e de seus
componentes majoritários em relação aos teores de citral, carvona, mirceno e limoneno. Os
quimiotipos receberam as designações de acordo com os constituintes majoritários
encontrados: o quimiotipo I, com teores elevados de mirceno e citral, mais raro no Ceará; o
quimiotipo II, com teores elevados de limoneno e citral e o quimiotipo III, com limoneno e
carvona e ausência de citral (MATOS et al, 2001). Diferentes do quimiotipo I, os quimiotipos
II e III são morfologicamente semelhantes.
Assim, a variabilidade na constituição química dos óleos essenciais deverá ser
considerada em futuros estudos, para que se possa determinar que influência essa
variabilidade exerce sobre as diferentes atividades farmacológicas, com o objetivo de
potencializar determinada atividade e conseqüentemente aumentar a eficácia de um
fitoterápico preparado a partir desta espécie vegetal.
41
1.9 Aplicações e propriedades biológicas da Lippia alba
A Organização Mundial de Saúde estima que grande parte da população mundial
continue a depender de plantas medicinais para os cuidados primários da saúde, sobretudo nas
regiões mais desfavoráveis. De fato, o consumo de produtos caseiros à base de plantas já é
uma realidade assimilada não só pela indústria farmacêutica, mas também pelo poder público
(LORENZI & MATOS, 2002; STASI et al, 2002; AKERELE, 1993). Tanto assim, que
prefeituras de vários capitais, inclusive de Fortaleza, além de inúmeras cidades do interior, já
distribuem gratuitamente estes medicamentos à população, nos postos de saúde (MATOS,
1998).
Segundo MING (1992), uma espécie muito promissora para as indústrias
farmacêutica, de aromas e perfumaria, é a Lippia alba. De acordo com a lista de espécies
elaboradas e publicadas pela Central de Medicamentos (CEME) para o Programa de
Pesquisas em Plantas Medicinais (PPPM) do Ministério da Saúde, a L. alba é dita como uma
das espécies medicinais mais utilizadas pela população brasileira (SANTOS & INNECCO,
2004) e foi incluída em projetos como “Farmácias Vivas”, da Universidade Federal do Ceará
(MATOS, 1998), que visa oferecer sem fins lucrativos, assistência farmacêutica fitoterápica
às comunidades carentes.
Preparados a base de L. alba (erva-cidreira) são utilizados na medicina popular
para o tratamento de diversos males. No Brasil, existem vários estudos que avaliam o uso de
plantas medicinais para fins terapêuticos, os quais comprovam ser a espécie L. alba bastante
mencionada pela população.
Na cidade de Fortaleza, em um estudo realizado sobre o uso de preparações
caseiras de plantas medicinais, BASTOS (2007) mostrou que das 32 espécies utilizadas pelos
entrevistados, uma das plantas mais citadas para fins medicinais é a espécie Lippia alba (ervacidreira) (7,7%). De acordo com esse estudo, suas folhas são usadas na forma de chá para dor
de barriga, calmante, gripe, febre, dor e diarréia.
De acordo com OLIVEIRA & ARAÚJO (2007), a erva-cidreira (Lippia alba N. E.
Brow) foi a segunda (14,6%) espécie de planta mais utilizada pelos idosos na prevenção ou
controle da elevação da pressão arterial.
Um levantamento sobre as plantas medicinais cultivadas e usadas pelos idosos na
Estratégia Saúde da Família Santo Antônio do Município de Pedras de Fogo – Paraíba (PB)
indicou as 10 plantas medicinais mais usadas. A erva-cidreira foi a terceira planta mais citada
42
dentre os nove (45%) dos 20 entrevistados que usavam plantas para fins terapêuticos. Eram
usadas as folhas frescas, após decocção, para dor de barriga, dor, gases, hipertensão, ou como
calmante (SILVA et al, 2008)
Quanto ao órgão da planta utilizada e o modo de preparo como fonte terapêutica
dessa espécie, destacam-se as folhas e as raízes sob a forma de infusão, decocção, maceração,
compressas, banhos ou extratos alcoólicos (JULIÃO et al, 2003).
Popularmente, suas folhas são empregadas como infusão ou decocção no
tratamento de doenças gástricas, diarréia, febre, asma, tosse e tranqüilizantes ou calmantes
(TAVARES et al, 2005; JULIÃO et al, 2003 MATOS, 1996). Também podem ser usadas na
forma de compressas para combater hemorróidas, macerada para uso local contra dor de
dentes, e em forma de banhos, como febrífuga (CORREA, 1992).
Seu uso também é relatado em casos de resfriado (STASI et al, 2002), no combate
a hipertensão (GAZOLA et al, 2004; STASI et al, 2002), como sedativo (STASI et al, 2002),
analgésico (VALE et al, 2002), em distúrbios hepáticos, gripe, bronquite, sífilis (BRAGA et
al, 2005), no tratamento de dores de cabeça (DUARTE et al, 2005) e para malária
(VIGNERON et al, 2005). Algumas pesquisas confirmam o potencial farmacológico da
espécie Lippia alba, o que podem explicar, pelo menos em parte, alguns de seus usos
terapêuticos na medicina popular, o que também leva ao interesse de estudos, visando o
isolamento de compostos responsáveis por tais atividades.
CORRE (1992) comprovou a atividade analgésica, espasmolítica, antibacteriana e
peitoral a partir de suas folhas, sem que nenhum efeito tóxico tenha sido verificado em
animais tratados com extratos das plantas. Misturas de óleos essenciais obtidas das folhas e
flores, com cremes biológicos, comprovaram ser excelente para o tratamento de peles
envelhecidas e secas, contribuindo para a coesão da célula da pele e promovendo a formação
de uma barreira que regula a perda de umidade transepidérmica (ELDER et al, 1997).
PASCUAL et al, 2001 demonstraram a atividade antiulcerogênica em ratos
tratados por via oral com infusão das folhas de L. alba. A infusão foi efetiva na prevenção da
ulceração induzida por indometacina e, na dose testada, não causou lesão gástrica, nem
modificou o pH gástrico e a acidez total.
VALE (1999) realizou um estudo comparativo entre os óleos essenciais dos três
quimiotipos de L. alba e conclui que seus óleos essenciais apresentaram atividade analgésica,
ansiolítica, depressor central, relaxante muscular e diminuidoras da temperatura retal. Dentre
os componentes químicos dos óleos essenciais, o citral, mirceno e limoneno parecem atuar de
43
maneira sinérgica, sendo responsáveis pelos principais efeitos desses óleos. Já em 2002, esses
mesmos autores estudando as substâncias citral, mirceno e limoneno isoladamente,
demonstraram seu efeito sedativo e miorrelaxante, porém essas substâncias não apresentaram
ação ansiolítica, indicando que esta atividade deve ser de responsabilidade de outros
componentes do óleo essencial da planta.
Quanto a atividade antioxidante in vitro, o óleo essencial obtido por
hidrodestilação exibiu um efeito similar à vitamina E e ao 2-(ter-butil)-4-methoxifenol
(BHA), pelo método da oxidação do ácido linoléico em compostos carbonílicos
(STASHENKO et al, 2004).
Em relação à atividade antimicrobiana, o óleo essencial extraído de toda a planta
foi testado em bactérias de interesse clínico por ALEA (1997). O óleo essencial apresentou
atividade principalmente sobre bactérias Gram-positivas com Concentração Inibitória Mínima
(CIM) variando entre 0,3 e 0,63 mg/mL. De todas as bactérias testadas apenas a Pseudomona
aeruginosa mostrou-se resistente às diferentes concentrações testadas, enquanto a espécie
Gram-positiva Staphylococcus aureus teve seu crescimento inibido pela a menor dose do
agente antibacteriano testada.
Um screening de 68 plantas foi realizado para verificação de atividade
antimicrobiana sobre três bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyogenes e Streptococcus pneumoniae) que causam infecções respiratórias. Dessas 68 plantas,
usadas na Guatemala no tratamento de doenças respiratórias, destacaram-se as espécies Lippia
alba e Lippia dulcis pela elevada atividade antibacteriana. A L. alba inibiu principalmente o
crescimento do S. aureus e S. pneumoniae e moderadamente o S. pyogenes (CACERES,
1991).
Quanto sua ação antifúngica de L. alba, utilizando-se o método de microdiluição
em caldo, o óleo essencial e o extrato hidroalcóolico obtido por maceração inibiram
moderadamente o crescimento da Candida albicans e da C. krusei, quando nas CIM de 0,6
µg/mL e 125 µg/mL, respectivamente. No entanto, somente o extrato hidroalcóolico
apresentou atividade inibitória sobre C. parapsiolisis (100 µg/mL) (HOLTEZ et al, 2002).
Em relação ao seu efeito antiviral, a fração butanólica e acetato de etila,
provenientes da extração líquido-líquido do macerado etanólico da L.alba, apresentou ação
contra o vírus Herpes simples tipo 1 resistente ao aciclovir e contra o vírus da pólio tipo 2,
respectivamente. O screening fitoquímico realizado com o macerado etanólico detectou a
presença de compostos fenólicos e flavonóides (ANDREGHETTI-FROHNER et al, 2005)
44
Ensaios da atividade citotóxica da espécie L.alba também foram alvos de
pesquisas. COSTA e colaboradores (2004) avaliaram o efeito citotóxico de extratos brutos e
concluíram que o extrato etanólico da folha mostrou maior citotoxidade frente às células HEp2 e o extrato clorofórmio das raízes teve um efeito maior para as células NCl-H292. Essas
células foram obtidas de carcinoma epidermóide de laringe e mucoepidermóide de pulmão de
humano, respectivamente.
O uso adequado da espécie Lippia alba sugere ser muito promissor e seu
extensivo uso empírico vem despertando o interesse de pesquisadores em estabelecer
explicações científicas para tais atividades farmacológicas, o que tem resultado na
confirmação dessas atividades, bem como na detecção de outras propriedades importantes.
1.10 Plantas medicinais: a importância e necessidade de estudos multidisciplinares
É sabido que o Brasil, pais de maior biodiversidade do planeta, possui uma
imensa flora medicinal nativa ainda desconhecida ou pouco estudada. Também se sabe que
apesar de nossas condições privilegiadas de biodiversidade, utilizamos, e muito, as plantas
medicinais exóticas (LORENZI & MATOS, 2002). Isso torna mais do que necessário que se
invista em pesquisas em nossa flora nativa, pois o Brasil é um enorme potencial nesse campo.
É fundamental que a comunidade médica bem como outros profissionais da área
da saúde ligados às universidades atente para esse potencial, para que possamos lançar mão
dele. É um momento de voltarmos nossos esforços para construir um conhecimento médico
baseado em nossos valores e adequado às nossas necessidades, em vez de ficarmos atrelados a
um modelo científico exclusivamente internacional. Para tanto devemos valorizar, estudar,
validar e utilizar terapeuticamente nossas espécies, antes que outros o façam.
No Brasil, as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca ou
nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas, propagadas por usuários ou
comerciantes. Muitas vezes, entretanto, as supostas propriedades farmacológicas anunciadas
não possuem validade científica, por não terem sido investigadas, ou por não terem tido suas
ações farmacológicas comprovadas em testes científicos pré-clínicos ou clínicos (SOUZA et
al, 2004).
Comparada com as dos medicamentos usados nos tratamentos convencionais, a
toxicidade de plantas medicinais e fitoterápicos pode parecer trivial. É comum ouvir de
pessoas referirem o uso de preparados a base de plantas por meio de expressões como: “se é
45
natural, é bom; se não fizer bem, mal não fará”. Isto, entretanto, não é verdade. A toxicidade
de plantas medicinais é um problema sério de saúde pública e as pesquisas realizadas para a
avaliação do uso seguro de plantas medicinais ainda são incipientes.
De maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse e a
necessidade de pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por
exemplo, investigações da medicina tradicional e popular (etnobotânica); isolamento,
purificação e caracterização dos princípios ativos (química e orgânica: fitoquímica);
investigação farmacológica de extratos e dos constituintes químicos isolados (farmacologia),
estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química
medicinal e farmacologia), bem como a preparação de formulações para a produção de
fitoterápicos (RATES, 2001). A integração dessas áreas na pesquisa de plantas medicinais
conduz a um caminho promissor e eficaz para a descoberta de novos medicamentos.
Estudos farmacológicos realizados com espécies do gênero Lippia fornecem
claras evidencias de seus potenciais farmacológicos, incentivando a realização de pesquisas
que esclareçam novos aspectos, o que justifica o interesse pelo potencial valor medicinal da
Lippia alba. As excelentes características agronômicas da L. alba reforçam sua aplicabilidade
como produtora de óleos essenciais, tornando-a uma espécie de grande potencial industrial. É
um vegetal com rápido desenvolvimento, que floresce o ano todo, com inflorescências que
geram inúmeros frutos, de elevada rusticidade, sendo capaz de se desenvolver em condições
de solo pouco fértil e com escassez de água, além de apresentar facilidade de propagação
vegetativa por estaquia. A constatação do fácil enraizamento da L.alba sugere a possibilidade
de seu cultivo em larga escala, para produção de óleo essencial (BIASI & COSTA, 2003).
Assim, o óleo essencial de L. alba, produzidos principalmente em suas folhas,
apresenta composição química variada, a qual é influenciada pelo genótipo da planta e fatores
ambientais. Também não podemos esquecer que na produção comercial de óleos essenciais,
fatores como o rendimento do óleo e sua composição química, são características essenciais,
mas bastante variáveis, dificultando a obtenção de produtos com atividades farmacológicas
definidas, o que representa um grande desafio às tentativas de produção de insumos
farmacêuticos de alta qualidade. Para que o óleo essencial de L. alba possa representar um
insumo valioso a indústria farmacêutica e a outras atividades, é necessário ter um amplo
conhecimento e traçar um perfil químico, farmacológico e toxicológico
46
OBJETIVOS
47
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar as atividades antimicrobiana e antioxidante dos óleos essenciais das folhas
de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, quimiotipo I, II e III, bem como investigar possível
relação entre essas atividades biológicas e composição química dos óleos essenciais
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro sobre cepas de bactérias e levedura
provenientes da ATCC;
• Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro sobre cepas de bactérias
multirresistentes isoladas de espécimes clínicos;
• Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Letal
Mínima (CLM) in vitro sobre cepas de bactérias multirresistentes isoladas de
espécimes clínicos;
• Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Letal
Mínima (CLM) in vitro sobre cepas de bactérias e levedura provenientes da
ATCC;
• Avaliar o efeito do OELA I, II e III sobre a peroxidação lipídica induzida pelo
choque térmico em homogenato de cérebro (córtex e hipocampo) de rato;
• Avaliar a atividade antioxidante através do teste do DPPH;
• Estabelecer relações entre composição química e potencial biológico dos óleos
essenciais das folhas de L. alba, quimiotipo I, II e III.
48
MATERIAIS E MÉTODOS
49
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material Botânico
As amostras de folhas da espécie Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, quimiotipos I, II
e III, foram coletadas do Horto de Plantas Medicinais Prof. Francisco José de Abreu Matos da
Universidade Federal do Ceará (Foto 01: a, b, c). Exsicatas da espécie encontram-se
depositadas no Herbário Prisco Bezerra, Departamento de Biologia-UFC, sob os números
24151 (L. alba quimiotipo I), 24150 (L. alba quimiotipo II) e 24149 (L. alba quimiotipo III).
a
b
c
Foto 01: Espécie Lippia alba N.E. Brown cultivada no Horto de Plantas Medicinais Prof.
Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará: a: L. alba quimiotipo I; b:
L. alba quimiotipo II e c: L. alba quimiotipo III. Fonte própria.
50
3.2 Óleo Essencial
3.2.1 Extração do óleo essencial de folhas de L. alba
Os óleos essenciais dos três quimiotipos de L. alba foram extraídos nos
Laboratórios de Farmacognosia e de Produtos Naturais- LPN/UFC sob a Coordenação dos
Profs. Luzia Kalyne A. M. Leal e F. J. A. Matos (in memorian). Os óleos essenciais foram
obtidos das folhas frescas da planta com auxílio de um sistema de extração por arraste de
vapor em parelho convencional de vidro, com capacidade para 1 Kg de planta, e o tempo
médio de extração foi de 1 hora (CRAVEIRO, 1976). Os óleos essenciais obtidos foram
separados da água residual por tratamento com sulfato de sódio (Na2SO4) anidro.
3.2.2. Análise do óleo essencial
Os OELA foram analisados num sistema CG/EM QP 5000/QP5050A da
SHIMADZU, sob as seguintes condições: coluna capilar DB-5-dimetilpolisiloxano (30 m x
0,25 mm x 0,30 mm), fluxo de 1mL/min. de Hélio como gás de arraste, e gradiente de
temperatura, de 10ºC/min (40-180ºC) e de 40ºC/min (180-300ºC), com a temperatura do
injetor de 250ºC (ADAMS, 2001). As análises foram realizadas pela Profa. Maria Goretti de
Vasconcelos Silva – LPN/UFC.
3.2.3 Preparação das diluições seriadas dos óleos essenciais de folhas de L. alba
Para a determinação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar,
determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método de microdiluição em
caldo e da Concentração Letal Mínima (CLM) pelo método de PourPlate (técnica do
plaqueamento), de acordo com as normas da Clinical and a Laboratory Standards Institute
(CLSI, 2003), foram preparadas diluições seriadas binárias dos óleos essenciais de folhas de
L. alba a partir de uma concentração inicial de 200mg/mL diluídas em solução de Tween 80 a
1%.
51
3.3 Cepas Microbianas
3.3.1 Cepas microbianas ATCC
Foram utilizadas cinco cepas microbianas provenientes da “American Type
Culture Collection” (ATCC) doadas pelo Laboratório de Materiais de Referência da Fiocruz:
Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027, Salmonella cholerae-suis ATCC 10708 e Candida albicans ATCC
10231.
3.3.2 Cepas microbianas multirresistentes isoladas de espécimes clínicos
As cepas microbianas multirresistentes foram obtidas do Laboratório de
Microbiologia do Hospital Universitário Walter Cantídio (Tabela 01). Essas cepas isoladas de
espécimes clínicos de ambiente hospitalar foram fornecidas já identificadas através da
coloração e provas bioquímicas e com o perfil de sensibilidade in vitro aos antibióticos
conhecido.
3.3.3 Manutenção das cepas microbianas
Todas as cepas foram estocadas no LabMicro em ágar estoque sob refrigeração,
de forma a conservarem inalterados todas as suas características bioquímicas e perfil de
sensibilidade a antimicrobianos. Periodicamente foram realizados repiques para meios de
cultura esterilizados e a pureza de cada cultura confirmada por microscopia, provas
bioquímicas e antibiogramas.
52
Tabela 01: Perfil de resistência aos antibióticos das cepas de origem hospitalar obtidas de diferentes sítios anatômicos.
Microrganismo
Acinetobacter lwoffi
Acinetobacter baumannii
Origem da amostra
Sensibilidade
Resistência
Líquido
AMI, ATM, CPM, CAZ, GEN,
cefalorraquidiano (LCR)
POL, TAC, TOB.
Aspirado traqueal
AMI, ATM, CPM, CAZ, GEN,
CIP, NOR, PIT
% de
Resistência
72,72
POLI, TAC, TOB
78,57
VAN
88,89
VAN, OXA
77,78
IPM, MPM
87,50
AMP, CIP, GEN, NIT, NOR, TAC,
AMI, CFL, CFZ, CPM, CFO,
41,18
SUT
CRO, CRX, IPM, MPM, PIT
IPM, MPM, CIP, LEV, GAT, PIT
Staphylococcus aureus (1)
Urina
CLI, ERI, LNZ, NIT, NOR, OXA,
PEN, SUT
Staphylococcus aureus (2)
Secreção cística
CLI, ERI, LNZ, NIT, NOR, PEN,
SUT
Klebsiella pneumoniae
Aspirado traqueal
AMI, AMP, CFL, CFZ, CPM,
CFO, CRO, CRX, CIP, NIT, NOR,
PIT, TAC, SUT
Escherichia coli
Urina
AMI: amicacina; AMP: ampicilina; ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; CFL: cefalotina; CFO: cefoxitina; CFZ: cefazolina; CIP: ciprofloxacino; CLI:
clindamicina ; CPM: cefepime; CRO: ceftriaxona; CRX: cefuroxima sódica; ERI: eritromicina; GAT: gatifloxacino; GEN: gentamicina; IPM: imipenem;
LEV: levofloxacina; LNZ: linezolida; MPM: meropenem; NIT: nitrofurantoína; NOR: norfloxacino; OXA: oxacilina; PEN: penicilina; PIT: piperacilina;
POLI: polimixina; SUT: sulfametoxazol/Trimetoprim; TAC: ticarcilina; TOB: tobramicina; VAN: vancomicina.
53
3.4 Determinação do Potencial Antimicrobiano dos Óleos Essenciais de Folhas da L. alba
O potencial antimicrobiano do óleo essencial dos três quimiotipos da Lippia alba
foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada - LabMicro do
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (DACT) da Faculdade de Farmácia,
Odontologia e Enfermagem (FFOE) da Universidade Federal do Ceará.
3.4.1 Determinação da atividade antimicrobiana
A determinação da atividade antimicrobiana das amostras foi realizada segundo o
método de difusão em ágar (Norma M2-A8, Vol. 23 Nº 1 do Clinical and a Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2003), que padroniza os testes de sensibilidade a antimicrobianos
por disco-difusão, modificado. Essa técnica foi adaptada, pois ao invés de utilizar discos de
papel impregnados com as amostras, foram confeccionados poços para aplicação das
diferentes concentrações binárias dos óleos essenciais.
Culturas microbianas puras mantidas em ágar estoque sob refrigeração, foram
repicadas para caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a 35ºC até atingirem
fase exponencial de crescimento (4-6h). Após esse período, as culturas tiveram sua densidade
celular ajustada em solução salina 0,85% estéril, de modo a se obter uma turbidez comparável
à da solução padrão de McFarland 0,5, o que resulta em uma suspensão microbiana contendo
aproximadamente 1 x 108 UFC/mL. Para a realização correta dessa etapa, foi utilizado um
cartão de fundo branco com linhas contrastantes pretas ao fundo.
Com o auxílio de swabs estéreis, essas suspensões foram semeadas na superfície
do ágar Mueller-Hinton (para cepas bacterianas) (Foto 02) ou ágar Sabouraud-dextrose (para
cepas de leveduras). De acordo com a metodologia e para evitar resultados incorretos, a
camada de ágar na placa de Petri deverá ter de 3 a 4 mm de espessura e ser semeada em três
direções, para que seja obtido um crescimento confluente e homogêneo. Após 5 minutos,
foram feitos poços de 5mm de diâmetro interno no ágar, utilizando-se para isso um perfurador
estéril (Fotos 03 e 04). Nesses poços foram aplicados volumes de 25 µl das diferentes
concentrações dos óleos essenciais (Foto 05). Antibióticos comerciais foram usados como
controles positivos (inibição do crescimento microbiano na superfície do ágar) e solução
aquosa de Tween 80 a 1% (diluente dos óleos essenciais) como controle negativo (não
inibição do crescimento microbiano na superfície do ágar). Após 16-18h de incubação a 35ºC,
54
cada placa foi analisada para verificar se foi satisfatoriamente semeada e se os halos de
inibição (HI) foram uniformemente circulares. Caso contrário, o teste seria repetido. Os halos
de inibição de crescimento foram medidos em milímetros com auxílio de um paquímetro
(Foto 06). Os diâmetros dos halos de inibição total foram mensurados, incluindo o diâmetro
do poço. Esses ensaios foram feitos em duplicata. Os valores dos halos de inibição foram as
médias das medidas dos dois resultados e nos forneceu informação sobre o potencial inibitório
dos óleos essenciais de L. alba sobre as cepas testadas (Figura 01).
55
Suspensão/
Escala 0,5 McFarland
≈
Cepas em ágar
estoque sob
refrigeração
Caldo BHI 35 C 4-6h
Incubação a 35 C/18h
Leitura dos halos de inibição
Figura 01: Fluxograma da técnica de difusão em poço.
Solução salina
~108UFC/mL
Cepas microbianas ATCC
Cepas multirresistentes
56
Foto 02: Semeadura das suspensões bacterianas na superfície de ágar Mueller-Hinton.
Foto 03: Confecções de poços de 5mm de diâmetro interno no ágar com auxílio de um
perfurador.
57
Foto 04: Remoção do ágar com auxílio de uma pinça para a formação dos poços.
Foto 05: Aplicação de volumes de 25µL dos óleos essenciais de folhas de L. alba em
diferentes concentrações.
58
Foto 06: Leitura das placas e interpretação dos resultados.
59
3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima – CIM
As amostras de óleos essenciais que apresentaram potencial antimicrobiano sobre
as cepas testadas pelo método de difusão em meio sólido, como descritas anteriormente no
item 3.4.1 foram submetidas à determinação da CIM pelo método de microdiluição em caldo.
Foram utilizadas microplacas esterilizadas com 96 poços de fundo redondo estéreis próprias
para microdiluição.
A determinação da CIM foi realizada através da técnica de microdiluição em
placas de acordo com a Norma M7-A6, Vol. 23 Nº 2, CLSI, 2003. Esse método envolve o uso
de pequenos volumes de reagentes e a avaliação de grande número de bactérias, fornecendo
informações quantitativas indisponíveis quando utilizado o método de difusão em ágar.
Culturas microbianas puras mantidas em ágar estoque sob refrigeração, foram
repicadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a 35ºC até atingirem
fase exponencial de crescimento (4-6h). Após esse período, as culturas tiveram sua densidade
celular ajustada em meio BHI estéril, de modo a se obter uma turbidez equivalente à da
solução padrão de McFarland 0,5, o que resulta em uma suspensão microbiana contendo
aproximadamente 1 x 108 UFC/mL. Para a realização correta dessa etapa, foi utilizado um
cartão de fundo branco com linhas contrastantes pretas ao fundo.
Essa suspensão foi diluída 100 vezes, em meio BHI estéril, o que corresponde
aproximadamente a uma suspensão contendo 106 UFC/mL, da qual foi retirada 80µL e
adicionada em cada poço da placa.
Em cada poço da placa, tinha 100 µL de caldo BHI + 20 µL de óleo essencial ou
antimicrobiano + 80 µL de suspensão de microorganismo. As amostras de óleos essenciais
foram avaliadas em diversas diluições binárias, como descritas no item 3.2.3.
Para os controles positivos (inibição do crescimento microbiano) foi utilizado o
meio de cultura, o agente antimicrobiano e o inoculo do microorganismo. Já para o controle
negativo (não inibição do crescimento microbiano) foi usado meio de cultura, o diluente
(solução aquosa de Tween 80 a 1%) estéril e o inoculo do microorganismo.
As placas foram incubadas a 35ºC por 24 horas com no máximo quatro placas em
cada pilha, a fim de manter a mesma temperatura de incubação para todas as culturas. Após
esse período foi realizada a leitura. A inibição do crescimento microbiano foi determinada
através da mensuração da absorbância a 490nm em leitor de Elisa Bio-Tek (Figura 02).
60
A Concentração Inibitória Mínima foi considerada a menor concentração de óleo
essencial capaz de inibir completamente o crescimento microbiano, mediante inspeção a olho
nu (ausência de turvação visível).
61
Suspensão/
Escala 0,5 McFarland
≈
Cepas em ágar
estoque sob
refrigeração
Caldo BHI 35 C
4-6h
~108UFC/mL
Caldo BHI
Diluição
100 x
+
~106UFC/mL
CIM: a menor concentração capaz de inibir o
crescimento microbiano a olho nu (ausência
de turvação visível)
Incubação a 35 C/24h
LEITURA
Leitor de Elisa: 490nm
Meio BHI/Saboraund
Figura 02: Fluxograma da técnica de microdiluição em caldo para a determinação da CIM.
62
3.4.2.1 Confirmação do tamanho do inoculo microbiano.
Após o preparo e incubação das placas, as suspensões microbianas utilizadas para
determinação da CIM, como descrito anteriormente, foram semeadas na superfície do ágar
Plate-Count com o objetivo de determinar o número de UFC/mL que realmente continha no
inoculo utilizado. Para isso, foi adicionado, assepticamente, 120µL da suspensão (~106
UFC/mL) a 12mL de meio BHI estéril, de forma a se obter uma suspensão de
aproximadamente de 1x104UFC/mL. Desta suspensão, foram retirados, assepticamente,
120µL, os quais foram adicionados a 12mL de meio BHI estéril, o que corresponde a
aproximadamente 100 UFC/mL. Por último, inoculos de 1,0 mL dessa suspensão foram
semeados na superfície de ágar Plate-Count, que foi incubado a 35° por 24 horas. Após esse
período, as colônias crescidas na superfície do ágar foram contadas e o valor obtido
multiplicado pelo valor da diluição, para confirmar se as suspensões microbianas usadas
continham realmente o número de UFC/mL desejado, ou seja, aproximadamente 106
UFC/mL. Esse experimento foi realizado em triplicata e resultado foi a média dos valores
obtidos.
3.4.3 Determinação da concentração letal mínima – CLM
A Concentração Letal Mínima (CLM), em contraste com a CIM, é a menor
concentração de uma droga, expressa em mg/mL, que produz a morte de 99,9% das células
microbianas avaliadas. A determinação da CLM foi realizada pelo método de Pour-Plate
(BARON et al, 1994). Essa técnica consiste na semeadura de inoculos microbianos na
superfície de ágar Plate-Count.
De forma asséptica, foram semeados inóculos obtidos dos poços das placas de
microdiluição usadas para determinação da CIM (item 3.4.2), que não apresentarem turvação
visível na superfície de ágar Plate-Count. O inóculo foi espalhado em toda a superfície do
meio com o auxílio da alça de Drigauski. Após incubação a 35°C durante 24h, foi feita a
contagem das colônias crescidas na superfície do ágar (Figura 03). A concentração de óleo
essencial que determina um crescimento microbiano na superfície do ágar ≤ 0,1% do inóculo
adicionado, mensurado como descrito no item 3.4.2.1, foi considerada a CLM, ou seja, a
menor concentração do óleo essencial capaz de matar a cepa microbiana testada.
63
Placa de Elisa 96 poços
ágar Plate-Count
alça de Drigauski
Incubação a 35 /24h
LEITURA
CLM: menor concentração capaz de matar 99,9%
das cepas microbianas testadas
Figura 03: Fluxograma da técnica de Pour-Plate para a determinação da CLM.
64
3.5 Avaliação da atividade antioxidante, in vitro, dos óleos essenciais de folhas da L. alba
Os ensaios para a avaliação da atividade antioxidante foram realizados no
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará. A atividade antioxidante foi avaliada por dois métodos in vitro - pela
dosagem de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e pelo ensaio do radical
livre DPPH.
3.5.1 Avaliação do efeito dos óleos essências das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III,
sobre a peroxidação lipídica induzida pelo choque térmico em cérebro de ratos: dosagem de
substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Ratos Wistar (150-200g) foram decapitados e removidos o córtex e hipocampo,
que foram homogeneizados em 50 nM (pH 7,4) de tampão fosfato a 20% (AUDDY et al,
2003). Alíquotas do homogenato após a adição dos OELA (50 e 100 µg/mL) ou veículo
(Tween 80 1%) foram mantidas a -20°C durante 24 horas. Decorrido esse período o
homogenato foi exposto à temperatura de 37°C, adicionado 100 µL de ácido perclórico 35 %
e centrifugado a 5.000 rpm por 10 min a 4°C. Ao sobrenadante foi adicionado 50µL de ácido
tiobarbitúrico 1,2% e mantido em banho maria durante 30 min a 95°-100°C.
Após
resfriamento com auxílio de um banho de gelo, foi realizada a dosagem de substâncias
reativas do ácido tiobarbitúrico (marcadores de peroxidação lipídica) através da análise
espectrofotométrica (535nm) (AGAR et al, 1999).
65
Remoção do córtex e
hipocampo
homogeneização
ratos macho
peso ~ 180-200g
Adição de água e
tampão fosfato
Homogeneizador
elétrico
Incubação
-20 C/24h
Após 24 horas
banho-maria +/- 37 C
1h
sobrenadante
Adição da
droga teste
Adição de ácido
tiobarbitúrico 1,2%
5.000 rpm /
10 min/4 C
sobrenadante
Adição de ácido
5.000 rpm /
perclórico 35%
10 min/4 C
banho-maria +/- 95 C
30min
Figura 04: Fluxograma da dosagem das substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico.
66
após 30’
LEITURA
temperatura
ambiente
placa de elisa
96 poços
Os dados serão calculados a partir de uma curva
padrão de malonildialdeído (MDA).
leitor de elisa: 535nm
Figura 05: Fluxograma da dosagem das substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (continuação).
67
3.5.2 Ensaio do radical livre DPPH
Este método baseia-se na capacidade de remoção do radical livre DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl) do meio de reação pela ação dos antioxidantes presentes na
amostra. Uma alíquota (0.1 mL) dos óleos essenciais das folhas de L. alba, quimiotipo I, II e
III, nas concentrações 1, 10, 50, 100 e 150µg/mL, foram misturadas com 3,9 mL de solução
de DPPH (1:1 de metanol: etanol). Como controle positivo foi usado a vitamina E (αtocopherol) 50 µg/mL. Após 30 minutos de incubação em temperatura ambiente, o grau de
descoloração do radical DPPH foi medido através da leitura da absorbância em um
espectrofotômetro (Beckman Instruments Inc.) no comprimento de onda de 517 nm (Figura
06). A porcentagem de inibição do radical DPPH foi calculada de acordo com a seguinte
equação:
% de inibição de DPPH = [(A1 – A2/A1] X 100
Onde A1 é a absorbância do controle e A2 é a absorbância da amostra testada (óleo
essencial de L.alba, quimiotipo I, II e III). Todos os testes foram realizados em triplicata e os
gráficos construídos a partir das médias desses valores (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC et
al, 1999).
68
3,9mL de solução de DPPH
+
0,1mL da droga teste
0,1mL α-tocopherol
LEITURA
Incubação em
temperatura ambiente
30min
% INIBIÇÃO = [(Ao – Ac/ Ao] X 100
$ Ao é a absorbância do controle
$ Ac é a absorbância da droga testada
Figura 06: Fluxograma do ensaio do radical livre DPPH
Leitor de Elisa: 517nm
69
3.6 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad Prism 5.0
(USA). Os resultados foram expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM). Para a
verificação das diferenças estatísticas entre os grupos foi realizada análise de variância
(Anova) e teste de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes
quando p<0,05.
3.7 Comitê de Ética
O projeto de pesquisa “Estudo das atividades antimicrobiana e antioxidante do
óleo essencial de L. alba (Mill.) N. E. Brown” foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
com Animais (CEPA) da Universidade Federal do Ceará, sob o número de protocolo 46/09.
70
RESULTADOS
71
4. RESULTADOS
Os resultados do presente estudo foram divididos em três partes: 1) Avaliação do
rendimento médio e caracterização química dos constituintes dos óleos essenciais das folhas
de Lippia alba N.E.Brown (OELa), quimiotipos I, II e III; 2) Avaliação do potencial
antimicrobiano, determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração
Letal Mínima (CLM) dos OELa; 3) Avaliação da atividade antioxidante do OELa.
4.1 Avaliação do rendimento médio e caracterização química dos constituintes dos óleos
essenciais das folhas de Lippia alba N.E.Brown, quimiotipos I, II e III.
4.1.1 Rendimento médio dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
A quantidade de óleo essencial de folhas, extraída pela técnica de destilação com
arraste de vapor d’água (MATOS, 1996) e medido em mL/g de peso da planta fresca, variou
de acordo com os quimiotipos I, II e III de Lippia alba (Tabela 02). O menor rendimento foi
observado no quimiotipo I (0,08%), seguido dos quimiotipos III (0,25%) e II (0,40%).
Tabela 02: Rendimento médio dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E. Brown,
quimiotipos I, II e III extraído pela técnica de destilação com arraste de vapor d’água.
Quimiotipos
Rendimento médio (mL/g de peso fresco)
I
0,08%
II
0,40%
III
0,25%
72
4.1.2 Composição química dos constituintes dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimiotipos I, II e III.
Os resultados das análises de composição química dos óleos essenciais das folhas
de L. alba estão apresentados na Tabela 03 e nas Figuras 07, 08 e 09. Para a L. alba,
quimiotipo I, foram identificados 18 componentes, dos quais o geranial (31,69%), neral
(21,61%) e mirceno (12,15%), apresentam-se como os constituintes majoritários. Já no óleo
essencial do quimiotipo II, foram identificados 10 componentes, sendo a geranial (46,31%) e
neral (32,67%) os componentes majoritários. E para o quimiotipo III, foram encontrados 12
componentes, com teores elevados de carvona (64,5%) e limoneno (16,67%) e ausência de
citral (mistura de geranial e neral).
73
Figura 07: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br., quimiotipo I,
realizado através da cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas (CGMS) (ADAMS, 2001).
Geranial
500
450
14
16
18
20
22
24
Tempo de Retenção (min)
26
28
30
Oxido de cariofileno
δ-Cadineno
Elemol
α-Cubebeno
β-Elemeno
Nerol
Citronelol
50
Linalol
100
β-Ocimeno
γ-Terpineno
150
ρ-Cimeno
200
α-Humuleno
Allo-aromadendreno
Germacreno D
250
β-Cariofileno
300
Mirceno
Milivolts
350
Neral
400
32
74
Figura 08: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br., quimiotipo
II, realizado através da cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas
(CG-MS) (ADAMS, 2001).
900
800
Geranial
700
Neral
500
Elemol
E-Nerolidol
Germacreno D
100
trans Geraniol
200
β-Citronelol
300
γ-Terpineno
400
ρ-Cimeno
Limoneno
Milivolts
600
0
14
16
18
20
22
24
Tempo de Retenção (min)
26
28
30
32
75
Figura 09: Cromatograma do óleo essencial das folhas de Lippia alba N. E. Br., quimiotipo
III, realizado através da cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas
(CG-MS) (ADAMS, 2001).
Carvona
2000
1800
1600
12
14
16
18
20
22
24
Tempo de Retenção (min)
26
28
Elemol
200
Germacreno D
400
Timol
600
Sabineno
800
Linalol
1000
Β-Mirceno
ρ-Cimeno
Milivolts
1200
Limoneno
γ-Terpineno
trans Hidrato de sabineno
cis Hidrato de sabineno
1400
30
32
76
Tabela 03: Porcentagens dos componentes químicos dos óleos essenciais das folhas de Lippia
alba N. E. Br., quimiotipos I, II e III realizado através da cromatografia gasosa com detecção
por espectrometria de massas (CG-MS) (ADAMS, 2001).
Componentes químicos
Mirceno
ρ-Cimeno
β-Ocimeno
γ-Terpineno
Linalol
Citronelol
Neral
Nerol
Geranial
α-Cubebeno
β-Elemeno
β-Cariofileno
α-Humuleno
Allo-aromadendreno
Germacreno D
δ-Cadineno
Elemol
Oxido de cariofileno
Limoneno
β-Citronelol
trans Geraniol
E-Nerolidol
Sabineno
β-Mirceno
trans Hidratato de sabineno
cis Hidratato de sabineno
Carvona
Timol
I
12,15
2,71
0,50
1,96
1,01
1,19
21,61
0,89
31,69
5,26
1,06
7,25
0,74
0,45
3,85
0,95
1,90
2,98
-
Quimiotipo
II
%
1,40
1,19
32,67
46,31
5,67
3,22
4,35
0,91
0,81
0,66
-
III
0,64
2,38
1,38
5,92
1,57
16,67
3,54
0,55
1,40
0,68
64,25
1,04
77
4.2 Avaliação do potencial antimicrobiano, determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e da Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos essenciais das folhas
de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
4.2.1 Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I,
II e III determinado pelo método de difusão em ágar (CLSI, 2003).
Os resultados mostram que houve diferença de potencial antimicrobiano entre os
óleos essenciais de L. alba, quimiotipos I, II e III, determinados pelo método de difusão em
ágar. Os resultados foram baseados na presença ou ausência do halo de inibição de
crescimento microbiano (Foto 07 e 08).
Para as cepas microbianas ATCC, os três quimiotipos de L. alba apresentaram
potencial inibitório sobre S. aureus e C. albicans, enquanto apenas o quimiotipo II inibiu o
crescimento da cepa E. coli (Tabela 04). Nenhum dos três quimiotipos inibiu o crescimento de
P. aeruginosa e S. choleraesuis.
Já para as cepas microbianas multirresistentes de origem hospitalar (Tabela 05),
os três quimiotipos foram capazes de inibir o crescimento de A. lwoffi, S. aureus 1 e S. aureus
2 e apenas os quimiotipos II e III, apresentaram atividade contra o A. baumannii. As cepas
bacterianas K. pneumoniae e E. coli não foram inibidas por nenhum dos óleos essenciais de L.
alba utilizados, pelo método de difusão em ágar.
78
S. aureus
200mg/mL
100mg/mL
C+
25mg/mL
C-
50mg/mL
Foto 07: Ensaio de difusão em ágar do óleo essencial das folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre a cepa
de S. aureus. C+: controle positivo. C-: controle negativo. Em todas as concentrações testadas houve
inibição de crescimento bacteriano.
P. aeruginosa
200mg/mL
1,56mg/mL
3,12mg/mL
100mg/mL
C+
50mg/mL
C6,25mg/mL
25mg/mL
12,5mg/mL
Foto 08: Ensaio de difusão em ágar do óleo essencial das folhas de L. alba, quimiotipo II, sobre a cepa
de P.aeruginosa. C+: controle positivo. C-: controle negativo. Em todas as concentrações testadas não
houve inibição de crescimento bacteriano.
79
Tabela 04: Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de folhas da Lippia alba N.E. Brow, quimiotipos I, II e III, sobre cepas microbianas
originárias da ATCC, determinado pela técnica de difusão em ágar (CLSI 2003).
S. aureus
ATCC 6538P
Quimiotipos
I
II
III
Controle
Controle
Concentração
(mg/mL)
200
100
50
25
12,5
6,25
3,12
1,56
200
100
50
25
12,5
6,25
3,12
1,56
200
100
50
25
12,5
6,25
3,12
1,56
Positivo
Negativo
21±1,00
15,5±1,50
11±1,00
8,5±0,50
7,0±0,50
29±1,00
20,5±0,50
13,5±0,50
10,5±0,50
8,5±0,50
7±0,00
7±0,00
7±0,00
21±0,50
-
E. coli
ATCC 10536
Cepas Microbianas
P. aeruginosa
Salmonella
ATCC 9027
ATCC 10708
Diâmetro dos halos de inibição de crescimento (mm*)
11,5±0,50
8±1,00
7±0,00
7±0,00
7±0,00
22±0,50
25±1,00
22±0,50
-
C. albicans
ATCC 10231
35±1,00
27±2,00
18±2,00
10±1,00
7±0,00
43±2,00
34±1,00
20,5±0,50
14±0,00
9,5±0,50
7±0,00
8,5±0,50
7±0,00
16±0,50
-
(*) - Média ± EPM dos halos de inibição de crescimento (mm) de dois ensaios; Volume de óleo essencial aplicado em cada poço: 25µl
(-) - Sem atividade; (+) - Controles positivos: Amicacina 1,2mg/mL e Cetoconazol 2,0mg/mL; Controle negativo: Tween 80 1%; Diâmetro do poço: 5mm
80
Tabela 05: Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de folhas da Lippia alba N.E. Brow, quimiotipos I, II e III, sobre cepas microbianas
multirresistentes de origem hospitalar, determinado pela técnica de difusão em ágar (CLSI 2003).
A.lwoffi
Cepas microbianas
S. aureus 1
S. aureus 2
K. pneumoniae
E. coli
Concentração
(mg/mL)
Diâmetro dos halos de inibição de crescimento (mm*)
200
9,5±0,50
16±1,00
22±1,00
I
100
8,5±0,50
14±0,00
18,5±0,50
50
7±0,00
11,5±0,50
12±2,00
25
7±0,00
8,5±0,50
8,5±0,50
12,5
7±0,00
7±0,00
6,25
3,12
1,56
200
14±0,00
9,5±0,50
22,5±0,50
27,5±0,50
II
100
12,5±0,50
8±0,00
17±0,00
25,5±0,50
50
10±0,00
7±0,00
13±1,00
15,5±0,50
25
8,5±0,50
7±0,00
10,5±0,50
9±0,00
12,5
7±0,00
7,5±0,50
6,25
3,12
1,56
200
9±0,00
8,5±0,50
17,5±0,50
9,5±0,50
III
100
8±0,50
7±0,00
13,5±0,50
7,5±0,50
50
7±0,00
8±0,00
25
12,5
6,25
3,12
1,56
Positivo
21±0,50
12±0,50
22±1,50
24±0,50
20±1,00
17±1,00
Controle
Negativo
Controle
(*) - Média± EPM dos halos de inibição de crescimento (mm) de dois ensaios; (-) - Sem atividade; (+) - Controles positivos: Vancomicina 1,2mg/mL, Ciprofloxacina
0,2mg/mL, Polimixina B 1200UI/mL, Meropenen 0,4mg/mL e Amicacina 1,2mg/mL; Diâmetro do poço: 5mm; Controle negativo: Tween 80 1%; Volume de óleo essencial
aplicado em cada poço: 25µl
Quimiotipos
A. baumannii
81
Considerando os halos de inibição de crescimento microbiano produzido pelos
óleos essenciais das folhas de L. alba sobre as cepas microbianas provenientes da American
Type Culture Collection (ATCC), os resultados indicam que a C. albicans foi o
microrganismo que apresentou os maiores halos de inibição, variando entre 7 a 43mm (Figura
11), seguida do S. aureus (7 a 29mm) (Figura 10) e da E. coli (7 a 11,5mm) (Figura 12).
Comparando os valores dos halos determinados pela ação dos diferentes óleos
essenciais dos três quimiotipos de L. alba, sobre essas cepas, o quimiotipo II foi o mais ativo,
pois diferente do quimiotipo I e III, que apresentaram atividade antimicrobiana apenas para S.
aureus (Figura 10) e C. albicans (Figura 11), o quimiotipo II inibiu também o crescimento da
E. coli, até na concentração de 12,5mg/mL (Figura 12). Além disso, o quimiotipo II
determinou os maiores halos de inibição de crescimento para as cepas de S. aureus e C.
albicans.
Entre os três óleos essenciais de L. alba utilizados, aquele obtido de folhas do
quimiotipo II foi o que apresentou a menor concentração capaz de determinar a formação de
halo de inibição (≥ 7mm) para as cepas de S. aureus e C. albicans, 6,25mg/mL, seguido do
quimiotipo I, 12,5mg/mL e do quimiotipo III, 100mg/mL (Tabela 04).
As Figuras 10, 11 e 12 comparam os resultados das médias dos halos de inibição
de crescimento microbiano, obtidos pelo método de difusão em ágar, para diferentes
concentrações dos óleos essenciais de folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III, sobre as cepas
provenientes da ATCC.
82
H a lo d e in ib içã o d e c res cim en t o
m icro b i a n o ( m m )
40
30
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
20
10
5
2
56
1,
12
3,
25
6,
,5
12
25
50
0
10
20
0
0
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 10: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus ATCC 6538P determinados pelo método de
difusão em ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de
crescimento são representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de
incubação.
Halo de inibição de crescimento
microbiano (mm)
50
40
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
30
20
10
1,
56
2
3,
12
5
6,
25
12
,5
25
50
10
0
20
0
0
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 11: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre C. albicans ATCC 10231 determinados pelo método de
difusão em ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição são
representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de incubação.
15
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimotipo III
10
5
2
5
12
56
1,
,5
25
3,
6,
12
25
0
50
20
0
0
10
H a lo d e in ib içã o d e cres cim en t o
m icro b ian o ( m m )
83
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 12: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre E. coli ATCC 10536 determinados pelo método de
difusão em ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de
crescimento são representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de
incubação.
84
Em relação aos halos de inibição de crescimento microbiano produzido pelo óleo
essencial das folhas de L. alba sobre as cepas microbianas multirresistentes de origem
hospitalar, os dados obtidos indicam que a S. aureus 2 foi o microrganismo que apresentou o
maior halo de inibição, variando entre 7 a 27,5mm (Figura 16), seguida do S. aureus 1 (7 a
22,5mm) (Figura 15), do A. lwoffi (7 a 14mm) (Figura 13) e do A. baumannii (7 a 9,5) (Figura
14). As cepas K. pneumoniae e E. coli não foram inibidas por nenhum dos óleos essenciais
testados.
Considerando os resultados obtidos para os diferentes óleos essenciais de folhas
dos três quimiotipos de L.alba sobre essas cepas, os quimiotipos II e III apresentaram o
mesmo espectro de atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento das cepas A. lwoffi, A.
baumannii, S. aureus 1 e S. aureus 2, embora o quimiotipo II apresentou maiores halos de
inibição do que o quimiotipo III (Tabela 05). Apenas o quimiotipo I não apresentou atividade
antimicrobiana contra o A. baumannii (Figura 14). Assim como foi observado para as
atividades dos óleos essenciais sobre as cepas ATCC, o óleo essencial do quimiotipo II foi o
que apresentou o maior potencial antimicrobiano, seguido dos quimiotipos I e II (Tabela 05).
Em relação as mais baixas concentrações de óleo essencial capazes de determinar
a formação de halos de inibição (≥ 7mm) para essas cepas, os quimiotipos I e II mostraram
resultados semelhantes, com concentrações de 25 e 12,5mg/mL, enquanto que para o óleo
essencial do quimiotipo III as menores concentrações foram de 100 e 50mg/mL (Tabela 05),
dependendo do microrganismo testado.
As Figuras 13, 14, 15 e 16 comparam os resultados das médias dos halos de
inibição de crescimento microbiano, obtidos pelo método de difusão em ágar, para diferentes
concentrações dos óleos essenciais de folhas de L. alba, quimiotipo I, II e III, sobre as cepas
multirresistentes de origem hospitalar.
15
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
10
5
,5
6 ,2
5
3 ,1
25
1 ,5
62
12
25
50
10
20
0
0
0
H a lo d e in ib içã o d e cres cim en to
m icro b ian o ( m m )
85
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
15
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
10
5
2
56
1,
5
12
3,
25
6,
,5
12
25
50
10
20
0
0
0
H a lo d e in ib içã o d e cres cim en t o
m icrob ian o ( m m )
Figura 13: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre A. lwoffi determinados pelo método de difusão em ágar.
Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de crescimento são
representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de incubação.
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 14: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre A. baumannii determinados pelo método de difusão em
ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de crescimento são
representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de incubação.
25
20
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
15
10
5
56
2
5
1,
12
3,
25
6,
,5
12
25
50
10
20
0
0
0
H a lo d e in ib içã o d e cres cim en t o
m icrob iano ( m m )
86
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
30
Quimiotipo I
Quimiotipo II
Quimiotipo III
20
10
2
56
1,
5
12
3,
25
6,
,5
12
25
50
10
20
0
0
0
H a lo d e in ib içã o d e cres cim en t o
m icrob ian o ( m m )
Figura 15: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus 1 determinados pelo método de difusão em
ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de crescimento são
representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de incubação.
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 16: Diâmetro dos halos de inibição de crescimento microbiano pelos óleos essenciais das
folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III sobre S. aureus 2 determinados pelo método de difusão em
ágar. Os valores representam média ± EPM de dois ensaios. Os halos de inibição de crescimento são
representados em milímetros, incluindo o 5mm de diâmetro do poço, após 18h de incubação.
87
4.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos
essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III determinadas pelos métodos de
microdiluição em caldo de cultura (CLSI, 2003) e plaqueamento em meio sólido (BARON et
al., 1994).
Na Tabela 06 estão os resultados da CIM e CLM dos óleos essenciais das folhas
de L. alba, quimiotipos I, II e III. De acordo com os dados obtidos, pode-se observar que
houve diferença no comportamento entre os três óleos essenciais. Os resultados da CIM foram
detectados a “olho nu” (ausência de turvação visível) (Foto 09) e através de leituras ópticas,
por meio da mensuração da absorbância a 490nm em leitor de Elisa Bio-Tek.
Nas concentrações estudadas, o efeito inibitório mais significativo, foi verificado
nos quimiotipos I e II, já que apresentaram os menores valores para CIM e CLM, variando
entre 0,312 a 20 mg/mL, respectivamente, para os diferentes microrganismos testados. Já o
quimiotipo III, apresentou CIM e CLM maiores, variando entre 0,625 a 20 mg/mL.
Considerando separadamente o efeito inibitório dos quimiotipos sobre cada
microrganismo testado, observa-se que na maioria dos casos a CIM foi próxima da CLM,
indicando uma ação antibacteriana e/ou antifúngica considerável dos óleos essenciais de L.
alba. Na maioria das vezes, principalmente para os quimiotipos II e III, a CIM era a mesma
da CLM, o que torna ainda melhor o seu efeito antimicrobiano.
88
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Foto 09: Ensaio de microdiluição em caldo mostrando a CIM detectado a “olho nu” (ausência
de turvação visível). Poços A, B e C colunas 1 até 8: ausência de crescimento microbiano;
colunas 9 até 12: crescimento bacteriano; CIM: coluna 8. Poços D, E e F colunas 1 até 6:
ausência de crescimento microbiano; colunas 7 até 12: crescimento microbiano. CIM: coluna
6.
89
Tabela 06: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E.
Brown, quimiotipos I, II e III sobre cepas microbianas originárias da ATCC e cepas microbianas multirresistentes de origem hospitalar,
determinada pela técnica da microdiluição em caldo de cultura (CLSI, 2003) e de plaqueamento em meio sólido (BARON et al., 1994).
Quimiotipos
CIM* (mg/mL)
CLM** (mg/mL)
I
II
III
I
II
III
S. aureus ATCC 6538
0,312
0,312
1,25
0,625
0,625
2,5
E. coli ATCC 10536
> 20
0,625
> 20
> 20
0,625
> 20
Salmonella ATCC 10708
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
P. aeruginosa ATCC 9027
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
C. albicans ATCC10231
0,312
0,312
0,625
0,625
0,312
2,5
A. lwoffi
0,625
0,625
1,25
0,625
0,625
1,25
>20
2,5
1,25
>20
2,5
1,25
S.aureus 1
0,625
0,312
0,625
0,625
0,625
0,625
S.aureus 2
0,312
0,625
>20
0,625
1,25
>20
K. pneumoniae
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
E. coli
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
> 20
Cepas Microbianas
A. baumannii
*Menor concentração de óleo essencial capaz de inibir completamente o crescimento microbiano visível ao olho nu.
** Menor concentração de óleo essencial que determinou um crescimento microbiano na superfície do ágar ≤ 0,1% de inoculo adicionado
Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL, Ciprofloxacina 0,2mg/mL, Polimixina B 1200UI/mL, Meropenen 0,4mg/mL, Amicacina 1,2mg/mL e
Cetoconazol 2,0mg/mL.
Controle negativo: Tween 80 1%
Volume aplicado em cada poço de óleo essencial: 20µL
90
Em relação aos resultados da cinética de inibição do crescimento microbiano,
através da análise espectrofotométrica, observa-se que numa determinada concentração do
óleo essencial, a absorbância vai aumentando, o que indica um aumento no crescimento
microbiano. As Figuras 17 a 34 mostram os resultados significativos comparados com o
correspondente grupo controle. Também estão mencionadas a Concentração Inibitória
Mínima através da determinação a “olho nu” e a Concentração Letal Mínima para cada cepa
microbiana.
91
p<0.05
1.500
Absorbâncias
*
*
*
*
*
*
1.000
CIM *
CLM
0.500
*
5
2,
5
1,
25
0,
62
5
0,
31
2
0,
15
6
0,
07
8
0,
03
9
0,
01
9
0,
00
9
(+
)
()
M
+
I
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 17: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo I, sobre S. aureus ATCC 6538P. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as
leituras de Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ±
EPM de dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Amicacina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio +
Inóculo.
0.500
p<0.05
Absorbâncias
0.400
*
*
*
0.300
*
*
0.200
CIM
*
*
CLM
0.100
*
(+
)
()
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
5
0,
31
2
0,
15
6
0,
07
8
0,
03
9
0,
01
9
0,
00
9
10
20
0.000
Concentração do ól eo essenci al (mg/mL)
Figura 18: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo I, sobre C. albicans ATCC 10231. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas
as leituras de Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média
± EPM de dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Cetoconazol 2,0mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
92
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
*
*
*
*
*
*
CLM
0.500
CIM
*
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 19: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo I, sobre de S. aureus 1. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras
de Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Ciprofloxacino 0,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
0.500
CIM
*
*
*
*
*
*
CLM
*
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 20: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo I, sobre S. aureus 2. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
93
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
*
*
*
*
*
CLM
*
0.500
CIM
*
*
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 21: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo I, sobre A. loffi. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Ciprofloxacino 0,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
94
1.500
p<0.05
*
Absorbâncias
*
*
1.000
0.500
*
*
*
*
CIM
*
CLM
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 22: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre S. aureus. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Amicacina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio +
Inóculo.
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
*
*
*
*
CLM
0.500
CIM
*
*
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 23: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre C. albicans. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Cetoconazol 2,0mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
95
p<0.05
2.000
Absorbâncias
1.500
*
*
*
*
1.000
*
CLM
*
*
*
0.500
CIM
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 24: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre de E. coli. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Amicacina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio +
Inóculo.
2.000
p<0.05
Absorbâncias
1.500
*
1.000
*
CLM
*
*
*
*
*
0.500
CIM
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 25: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre de A. lwoffi. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Ciprofloxacino 0,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
96
1.500
p<0.05
Absorbâncias
*
*
1.000
*
*
*
CLM
*
*
0.500
CIM
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 26: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre A. baumannii. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras
de Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Polimixina B 1200UI/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
*
*
*
*
*
CIM *
0.500
*
CLM
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração de óleo essencial (mg/mL)
Figura 27: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre S. aureus 1. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
97
Absorbâncias
1.500
p<0.05
*
1.000
*
*
*
*
*
*
*
CIM
0.500
*
CLM
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
10
20
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 28: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo II, sobre S. aureus 2. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
98
Absorbâncias
1.500
p<0.05
1.000
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CIM
0.500
CLM
*
(M )
+
I
(+
)
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 29: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre S. aureus. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Amicacina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio +
Inóculo.
Absorbâncias
1.500
p<0.05
1.000
*
*
*
*
*
*
*
*
0.500
CLM CIM
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
20
10
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 30: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre C. albicans. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Cetoconazol 2,0mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
99
p<0.05
Absorbâncias
1.500
1.000
*
*
*
*
*
*
*
0.500
CLM CIM
*
(M )
+
I
20
10
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 31: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre S. aureus 1. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
1.500
p<0.05
Absorbâncias
*
1.000
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0.500
*
*
(M )
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
(+
)
20
10
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 32: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre S. aureus 2. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Vancomicina 1,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) - Meio
+ Inóculo.
100
2.000
p<0.05
*
*
Absorbâncias
1.500
*
1.000
*
CLM
*
*
*
0.500
CIM
*
*
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 33: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre de A. lwoffi. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as leituras de
Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ± EPM de
dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Ciprofloxacino 0,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
2.000
p<0.05
Absorbâncias
1.500
*
1.000
*
CLM
*
0.500
CIM
*
* *
*
*
*
*
(+
)
(-)
M
+
I
5
2,
5
1,
25
0,
62
0, 5
31
0, 2
15
0, 6
07
0, 8
03
0, 9
01
0, 9
00
9
10
20
0.000
Concentração do óleo essencial (mg/mL)
Figura 34: Cinética da inibição do crescimento microbiano do óleo essencial das folhas de L. alba,
quimiotipo III, sobre de A. baumannii. Após incubação a 35ºC, por 24 horas, foram realizadas as
leituras de Absorbância a 490nm, em leitora de ELISA (Bio-Tek). Os valores representam a média ±
EPM de dois ensaios. * p < 0.05 comparado com o correspondente grupo controle.
(+) - Controle positivo: Ciprofloxacino 0,2mg/mL; (-) - Controle negativo: Tween 80 1%; (M+I) Meio + Inóculo.
101
4.3 Avaliação da atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimiotipos I, II e III.
4.3.1 Atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e
III determinado através da dosagem de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)
(AGAR et al., 1999).
Na figura 35 pode ser observado o efeito dos óleos essenciais das folhas de L.
alba, quimiotipos I, II e III, sobre a formação de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
(TBARS); parâmetro empregado para mensurar a peroxidação lipídica induzida pela variação
abrupta de temperatura em homogenato de cérebro de ratos. Nos homogenatos de hipocampo
e córtex incubados apenas com veículo (controle) o choque térmico causou um aumento
significativo de concentração de TBARS em relação ao grupo normal, ou seja, não submetido
ao choque térmico. Na presença dos óleos essenciais (50 e 100µg/mL), os resultados mostram
que o quimiotipo II foi o que apresentou o melhor resultado, tanto na concentração 50µg/mL e
100µg/mL. Este quimiotipo reduziu significativamente a concentração de TBARS quando
comparada ao grupo controle. Já o quimiotipo III, apenas na concentração 100µg/mL é que
mostrou resultado significativo de redução de TBARS. Quanto ao quimiotipo I, este
apresentou efeito antioxidante apenas na concentração de 50µg/mL.
102
1.5
TBARS (abs.)
a
1.0
b
b
0.5
b
b
no
r
m
co al
nt
ro
le
Q
I5
0
Q
I1
00
Q
II
5
Q 0
II
10
Q 0
II
I
Q 50
II
I1
00
0.0
Figura 35: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III
determinado através da dosagem de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) (AGAR et
al., 1999). O nível de TBARS, expresso pela concentração de MDA, um dos produtos da peroxidação
lipídica foi determinado após o estresse oxidativo. O grupo normal não passou pelo estresse oxidativo.
Os valores representam a média ± EPM de dois ensaios. Controle: veículo Tween 80 1%. a vs
normal; b vs controle (p < 0.05 – ANOVA e teste de Tukey)
103
4.3.2 Atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e
III determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC et al., 1999).
Nas Figuras 36, 37 e 38, mostra os resultados da avaliação do potencial
antioxidante dos óleos essenciais das folhas de L. alba, quimiotipos I, II e III (1-150µg/mL) e
da vitamina E (droga padrão), determinado pelo teste DPPH. Ao contrário da vitamina E,
nenhum dos óleos testados apresentou atividade seqüestradora de radicais livres. Na Tabela
07 estão apresentados os valores em porcentagem de inibição que foram obtidos a partir dos
resultados das absorbâncias. As porcentagens de inibição dos óleos essenciais das folhas de L.
alba, quimiotipos I, II e III, foram muito baixas em relação ao grupo controle (88,7% de
Absorbância
inibição).
4
p<0.05
3
*
*
*
*
*
*
2
1
*
0
(-)
1
10
50
100
150
(+)
Concentrações (µg/mL)
Figura 36: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba, quimiotipo I,
determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC et al., 1999). Os óleos
essenciais foram adicionados à solução de DPPH e em 30min foi realizada a leitura
espectrofotométrica (517nm). Os valores representam a média ± EPM de dois ensaios. * p < 0.05
comparado com o correspondente grupo controle.
(+) – Controle positivo: vitamina E (50µg/mL); (-) – Controle negativo: Tween 80 1%.
Absorbância
104
4
p<0.05
3
*
*
*
*
*
*
2
1
*
0
(-)
1
10
50
100
150
(+)
Concentrações (µg/mL)
Figura 37: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba, quimiotipo II,
determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC et al., 1999). Os óleos
essenciais foram adicionados à solução de DPPH e em 30min foi realizada a leitura
espectrofotométrica (517nm). Os valores representam a média ± EPM de dois ensaios. * p < 0.05
comparado com o correspondente grupo controle. (+) – Controle positivo: vitamina E (50µg/mL); (-)
– Controle negativo: Tween 80 1%.
Absorbância
4
3
p<0.05
*
*
*
*
*
*
2
1
*
0
(-)
1
10
50
100
150
(+)
Concentrações (µg/mL)
Figura 38: Atividade antioxidante do óleo essencial das folhas de Lippia alba, quimiotipo III,
determinado pelo método de DPPH (SAINT-CRICQ DE GAULEJAC et al., 1999). Os óleos
essenciais foram adicionados à solução de DPPH e em 30min foi realizada a leitura
espectrofotométrica (517nm). Os valores representam a média ± EPM de dois ensaios. * p < 0.05
comparado com o correspondente grupo controle.
(+) – Controle positivo: vitamina E (50µg/mL); (-) – Controle negativo: Tween 80 1%.
105
Tabela 07: Atividade antioxidante pelo método de DPPH expresso em percentagem de
inibição dos óleos essenciais das folhas de L. alba, quimiotipo I, II e III (SAINT-CRICQ DE
GAULEJAC et al., 1999).
Quimiotipo
Controle positivo*
Concentração (µg/mL)
1
10
50
100
150
50
% de Inibição do oxidante
I
0,6
1,67
1,9
2,0
2,6
88,7
II
2,1
0,25
1,34
1,36
1,69
88,7
III
0,7
0,7
0,9
1,0
1,3
88,7
*Controle positivo: vitamina E (50µg/mL).
106
DISCUSSÃO
107
5 DISCUSSÃO
Apesar de possuir a maior diversidade do mundo, o Brasil conhece muito pouco
acerca da flora nativa e, em especial, das propriedades medicinais que essas plantas possam
apresentar. Neste caso, é imprescindível a importância de pesquisas multidisciplinares com
essas plantas medicinais, envolvendo estudos etnobotânico, químico e a farmacológico,
conduzindo a um caminho promissor e eficaz para a descoberta de novos medicamentos
(SIMOES et al., 2004).
A espécie Lippia alba apresenta uma série de estudos pré-clínicos evidenciando
várias atividades relacionadas ao seu uso popular. No entanto, apesar do futuro promissor,
essa espécie necessita de um maior número de estudos para poder gerar um fitomedicamento
ou fitoterápico com eficácia, segurança e qualidade.
5.1 Avaliação do rendimento médio e caracterização química dos constituintes dos óleos
essenciais das folhas de Lippia alba N.E.Brown, quimiotipo I, II e III.
Alguns trabalhos comprovam a existência da variabilidade na composição
química do óleo essencial da espécie L. alba, chamados de quimiotipos, o que deve ser levado
como um fator importante para se determinar que influência esta variabilidade exerce sobre as
diferentes atividades farmacológicas. Esses quimiotipos são separados de acordo com as
variações quantitativas e qualitativas da composição de seus óleos essenciais (JULIÃO et al,
2003; CASTRO et al, 2001; MATOS, 1996; GOMES et al, 1993).
No presente trabalho, a quantidade de óleo essencial de folhas, extraída pela
técnica de destilação com arraste de vapor d’água (MATOS, 1996) e medido em mL/g de
peso da planta fresca, variou de acordo com os quimiotipos I, II e III de Lippia alba. Como
mostrado na Tabela 02 o menor rendimento foi observado no quimiotipo I (0,08%), seguido
dos quimiotipos III (0,25%) e II (0,40%).
Alguns trabalhos mostram que a quantidade de óleo essencial varia de acordo com
a época do ano na qual foi extraído. TAVARES et al (2005), analisando o óleo essencial de
folhas de três quimiotipos de L. alba, cultivadas em condições semelhantes, a fim de verificar
se as diferenças na composição do óleo essencial devem-se a fatores ambientais ou a variação
genética, observou que o menor rendimento do óleo essencial foi na época em que as plantas
encontravam-se em floração. Na época da floração, de agosto a novembro, o rendimento foi
108
de 0,15%, 0,40% e 0,40%, respectivamente para os quimiotipos I, II e III. Já durante o
crescimento vegetativo, dezembro a março, o rendimento foi de 0,30% para o quimiotipo I,
0,50% para o quimiotipo II e 0,60% para o quimiotipo III. Da mesma forma, ATTI et al
(2002) concluíram que para a espécie L. alba, a maior produção de óleo essencial ocorre na
fase de crescimento (dezembro a março).
Embora no nosso trabalho não tenha sido feito um estudo comparativo entre
épocas do ano, pois as plantas foram cultivadas no Horto de Plantas Medicinais Prof.
Francisco José de Abreu Matos do Laboratório de Plantas Medicinais da UFC, em condições
semelhantes, e coletadas, para a extração de óleo essencial, no período de agosto a dezembro,
sempre no mesmo horário (entre 8:00 às 9:00h), observa-se que quando comparada com
outros estudos, o rendimento dos óleos essenciais de L. alba, pode ser considerado baixo,
principalmente para o quimiotipo I (0,08%), seguido do quimiotipo III (0,25%) e do II
(0,40%). De acordo com TAVARES et al (2005) e ATTI et al (2002) isso pode ser explicado,
pela época do ano na qual foram coletadas as plantas e extraído os óleos essenciais.
Já em relação à composição do óleo essencial analisado por cromatografia gasosa
com detecção por espectrometria de massa (CG-MS), foi confirmado que realmente existem
diferenças nos constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas de L. alba. Para o
quimiotipo I, os componentes majoritários foram o geranial, neral e o mirceno, o que
correspondem, respectivamente, a 31,69%, 21,61% e 12,15% do total de teor do óleo
essencial (Figura 07). Já para o quimiotipo II, os principais componentes foram o geranial
(46,31%) e neral (32,67%) (Figura 08) e para o quimiotipo III com teores elevados de carvona
(64,5%) e limoneno (16,67%) e ausência de citral (Figura 09).
Outros constituintes também foram encontrado nos óleos essenciais das folhas de
L. alba, quimiotipo I, II e III, porém em menores porcentagens (Tabela 03). Verifica que
alguns compostos foram produzidos exclusivamente no quimiotipo I como o Mirceno, βOcimeno, Citronelol, Nerol, α-Cubebeno, β-Elemeno, β-Cariofileno, α-Humuleno, Alloaromadendreno, δ-Cadineno e Oxido de cariofileno; no quimiotipo II como o β-Citronelol,
trans Geraniol e E-Nerolidol; e no quimiotipo III como o Sabineno, β-Mirceno, trans e cis
Hidratato de sabineno, Carvona e Timol.
TAVARES et al (2005), analisando a composição dos óleos essenciais de L. alba,
observou que para o quimiotipo I foram identificados 29 componentes, dos quais o geranial e
o neral foram os constituintes majoritários. Já o quimiotipo II, dos 26 componentes
109
identificados, os principais foram o limoneno, a carvona e o germacreno D, e para o
quimiotipo III, o linalol foi o majoritário dos 42 constituintes identificados.
Esses autores, concluíram que a diversidade na composição do óleo essencial dos
quimiotipos da L. alba não se deve a fatores ambientais, já que as plantas analisadas
cultivadas lado a lado, em um mesmo canteiro, por mais de um ano, mantiveram a
composição original. Observaram também que não ocorreu variação qualitativa dos
componentes majoritários nos dois períodos de vida da espécie L. alba, no crescimento
vegetativo e no período da floração. Por outro lado, a análise quantitativa desses elementos,
mostrou que a porcentagem de citral, carvona e linalol sofreu uma ligeira diminuição durante
a época de floração ao passo que houve aumento na porcentagem do limoneno.
NOGUEIRA et al (2007), relacionando a caracterização química e atividade
biológica do óleo essencial de L. alba cultivada no Paraná, considerando as diferentes
estações do ano (primavera, verão, outono e inverno), observaram que os melhores
rendimentos de óleo essencial foram das folhas coletadas na primavera (novembro) e verão
(fevereiro), apresentando teores de 0,54% e 0,38%, respectivamente, e que também, nessa
época, foi maior a produção do constituinte químico majoritário, o composto transdihidrocarvona. Dos 15 compostos identificados, o trans-dihidrocarvona, não foi produzido
nas outras épocas do ano (inverno e outono).
SILVA et al (2006) relatam que quanto à caracterização química do óleo essencial
da L. alba cultivada em Ilhéus-Ba, considerando as diferentes estações do ano, durante a
primavera (outubro), outono (abril) e verão (janeiro) foram obtidos rendimentos similares de
óleos essenciais, variando de 0,19% a 0,17%, sendo observado o menor rendimento no
inverno (julho), 0,12%. Neste estudo, foram identificados 24 compostos, sendo o componente
majoritário o citral, que variou de 70 a 79%.
Esses dois autores, SILVA (2006) e NOGUEIRA (2007), concluíram que tanto a
constituição química como as porcentagens relativas das diferentes amostras do óleo essencial
foram alteradas nas diferentes estações do ano (primavera, outono, verão e inverno).
Em 2001, LORENZO analisando a composição do óleo essencial da L. alba,
identificaram 27 componentes e referiram o linalol como o constituinte majoritário (55%).
RAO et al (2000) identificaram 50 componentes e os principais constituintes foram o geranial
(15,57%), seguido por uma mistura de mirteno e mirtenal (9,89%), neral (9,44%), e geraniol
(7,36%). ZOGHBI et al (1998), estudando os óleos essenciais dessa mesma espécie,
propuseram a divisão em três grupos segundo seus componentes: grupo A, caracterizado por
110
1,8 cineol (34,9%), limoneno (18,4%), carvona (31,8%) e sabineno (8,2%); grupo B,
caracterizado por limoneno (32,1%), carvona (31,8%) e mirceno (11%); e grupo C,
caracterizado por neral (13,7%), geranial (22,5%), germacreno-D (25,4%) e α-cariofileno
(10,2%).
Aqui no Ceará, alguns estudos mostram a variação na composição dos óleos
essenciais das folhas de L. alba. VALE (1999), fez estudos comparativos dos óleos essenciais
de três quimiotipos de L. alba, os quais foram definidos segundo a predominância de
monoterpenos em seus óleos essenciais: tipo I – com citral e mirceno; tipo II – com citral e
limoneno e tipo III – com carvona e limoneno. Já MATTOS (1996) caracterizou em grupos a
espécie L. alba de acordo com os teores elevados dos óleos essenciais em: tipo I, com teores
elevados de mirceno e citral; tipo II com teores elevados de limoneno e citral; tipo III com
limoneno e carvona e ausência de citral.
A classificação proposta por estes dois autores VALE (1999) e MATTOS (1996),
está semelhante aos dados encontrados no presente estudo, no qual os óleos essenciais das
folhas de L. alba podem ser classificados quanto aos seus componente majoritários em
quimiotipo I – com geranial, neral e mirceno (Figura 07); quimiotipo II – com geranial e
neral (Figura 08); e quimiotipo III – com carvona e limoneno e ausência de citral (mistura
de geranial e neral) (Figura 09).
Assim, os dados obtidos neste trabalho juntamente com os encontrados na
literatura, reforçam a idéia de que as plantas de diferentes regiões podem apresentar variações
na composição química dos óleos essenciais, mesmo sendo de plantas da mesma espécie,
como no caso da L. alba; que a variação nos componentes dos óleos essenciais de L. alba leva
a separação em quimiotipos; que essa variação é um fator importante em estudos de
atividades biológicas do óleo essencial da L. alba N. E. Brwon; e que no geral, os
constituintes carvona, mirceno, neral, geranial, limoneno, germacreno estão presentes no óleo
essencial das folhas de L. alba. Apesar de não ter sido feito neste trabalho, também vale
ressaltar que fatores ambientais, genético e de técnicas de cultivo devem ser fatores que
influenciam e que refletem na composição química do óleo essencial da L. alba.
5.2 Avaliação do potencial antimicrobiano, determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e da Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos essenciais das folhas
de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.
111
É consenso a necessidade de introdução de novos compostos bioativos no arsenal
terapêutico com efeito antimicrobiano, devido principalmente ao aparecimento de cepas
microbianas resistentes, decorrente, sobretudo, do uso indiscriminado de antimicrobianos.
Óleos essenciais e extratos de plantas há muito tempo tem sido usado em diversas
aplicações na medicina popular, entre elas, podemos citar o uso de anti-sépticos tópicos. Tal
realidade serve de base para várias investigações científicas com a finalidade de confirmar a
atividade antimicrobiana desses óleos essenciais (FERESIN et al, 2001).
Alguns estudos realizados com as espécies do gênero Lippia fornecem
importantes evidencias de seus potenciais efeitos farmacológicos, incentivando a realização
de pesquisas que esclareçam novos aspectos. Alguns estudos confirmam o potencial
farmacológico dos óleos essenciais da Lippia alba: atividade analgésica (VIANA et al, 1998);
atividade antiinflamatória (SLOWING BARRILAS, 1992; DO VALE et al, 2002); atividade
anticonvulsivante (VIANA et al, 2000); atividade antiviral (ABAD et al, 1997); e atividade
calmante (VALE et al, 2002). No entanto, embora muitas pesquisas anteriores demonstrem
diversas atividades biológicas, trabalhos que relacionem a composição dos diferentes
quimiotipos da espécie L. alba com suas atividades biológicas ainda são muito escassos ou
quase inexistentes.
Atualmente existem diversas técnicas usadas em pesquisas para definir se uma
determinada substância possui atividade antimicrobiana. No entanto um dos grandes
problemas encontrado nestas pesquisas é justamente a falta de uniformidade nos critérios
selecionados para estudar tal atividade (TORTORA et al, 2000). RIOS et al, na tentativa de
solucionar a falta de uniformidade nos critérios de seleção para o estudo da atividade
antimicrobiana, propuseram os métodos de difusão em ágar e de diluição em caldo de cultura
como métodos padrões para o estudo de extratos de plantas e de óleos essenciais, bem como
de seus compostos. Na realidade, para se obter resultados mais confiáveis, a realização de
pesquisas que utilizam mais de um método para se avaliar a atividade antimicrobiana, é uma
excelente alternativa.
Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos com possíveis
atividades biológicas. Sua atividade antimicrobiana pode ser determinada pela atividade de
seus constituintes individuais, que podem interagir resultando em efeitos sinérgicos
vantajosos (ABOUL et al, 1996; PATTNAIK et al, 1995), mas também em efeitos
antagonistas desvantajosos, enfraquecendo a ação do óleo quando comparada com seus
constituintes (CARSON et al, 1995).
112
A maioria dos óleos essenciais é constituído de derivados fenilpropanoídes ou de
terpenos, sendo os compostos terpênicos predominantes (SIMÕES et al, 2002) e um dos
principais responsáveis pela atividade antimicrobiana dos óleos.
Comparando a composição dos óleos essenciais de folhas dos três quimiotipos de
L. alba (Tabela 03) podemos observar relevantes diferenças quantitativa e qualitativa entre
eles. Os constituintes majoritários dos quimiotipos I, II e III, aos quais podemos atribuir o
potencial antimicrobiano de cada óleo foram: citral-mirceno (53,30-12,15%), citral-limoneno
(78,98-4,35%) e carvona-limoneno (64,25-16,67%) respectivamente. Foram observadas
também variações quantitativas e qualitativas para os constituintes minoritários presentes nos
três óleos essenciais.
Como mostrado nas Tabelas 04 e 05, os óleos essenciais dos três quimiotipos de
L. alba apresentam um amplo espectro de ação antimicrobiana, sendo capazes de inibir o
crescimento de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas e C. albicans, o que pode
ser atribuído a alta concentração de terpenos em sua composição. Estudos anteriores têm
demonstrado a ampla atividade antimicrobiana dos terpenos, por um mecanismo de ação não
totalmente elucidado, que parece estar associado ao seu caráter lipofílico, determinando um
acúmulo em membranas e perda de energia pelas células (CONNER, 1993; SIKKEMA et al,
1995). Acredita-se que esse acúmulo ative e/ou inative compostos, rompendo e/ou
desestruturando as membranas, agindo sobre compostos lipofílicos e causando a perda de
enzimas e nutrientes presentes na membrana celular (COWAN, 1999; DORMAN E DEANS,
2000; WILKENS, 2002).
As diferenças nos potenciais antimicrobianos constatados para os óleos essenciais
dos três quimiotipos (Tabelas 04 e 05) podem estar associadas às suas diferentes composições
químicas (Tabela 03), especialmente em relação aos constituintes majoritários presentes em
cada um dos óleos. O óleo essencial do quimiotipo III, o único entre os três óleos estudados a
não apresentar citral (uma mistura de neral e geranial) em sua composição, constituintes
majoritários dos óleos dos quimiotipos I e II, também demonstrou a menor atividade
antimicrobiana sobre todas as cepas testadas.
O menor potencial antimicrobiano constatado para o óleo essencial de folhas do
quimiotipo III, sobre todas as cepas testadas, pode estar relacionado à sua composição e
especialmente à ausência de citral (neral e geranial). Os constituintes majoritários desse óleo
essencial são carvona (64,25%) e limoneno (16,67%). Embora CARVALHO & FONSECA
(2006) considerem a carvona um importante agente antimicrobiano, estudos realizados por
113
SCHUCK et al (2001) demonstraram uma reduzida atividade antimicrobiana para limoneno
sobre S. aureus ATCC 6358, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 10231 quando
comparado ao citral. ONAWUNMI et al (1984) fizeram constatações semelhantes, ao
verificarem que a atividade antibacteriana do óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.)
Stapf é devida, principalmente, à presença de citral, seu componente majoritário e que outros
componentes como limoneno e a heptanona não demonstraram atividade frente aos
microrganismos ensaiados.
Essas diferenças ressaltam o efeito da estrutura do terpeno sobre sua atividade
antimicrobiana, mas devemos também considerar a influencia da possível ação sinérgica dos
vários componente do óleo essencial, mesmo que em baixas concentrações, e da presença de
substâncias inibidoras da atividade antimicrobiana.
O elevado potencial antimicrobiano do citral, relatados nos trabalhos de
ONAWUNMI et al (1944) e SCHUCK et al (2001), também foi constatado em nosso estudo,
em que os óleos essenciais de folhas dos quimiotipos I e II de L. alba, ricos em citral (53,30 e
78,98%, respectivamente), determinaram grande inibição no crescimento de bactérias Grampositivas e de C. albicans. O óleo essencial de folhas do quimiotipo II, com teor de citral
25,68% superior ao encontrado no quimiotipo I, apresentou os mais elevados potenciais
antimicrobianos e o maior espectro de ação, sendo capaz de inibir o crescimento de bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas, provenientes da ATCC e de origem hospitalar, e de C.
albicans, em um total de 63,63% das cepas microbianas testadas.
A maior atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de L. alba sobre a cepa
Gram-positiva S. aureus e a levedura C. albicans, do que sobre bactérias Gram-negativas,
estão de acordo com os resultados de ALEA et al (1997), ao testarem seu potencial inibitório
sobre B. subitilis e E. faecalis e RAO et al (2000) que comprovaram sua ação antifúngica.
Em nosso estudo foi testado um total de sete cepas de bactérias Gram-negativas,
das quais, menos da metade (42,86%), tiveram seu crescimento inibido quando expostas aos
óleos essenciais de L. alba. As maiores atividades antimicrobiana sobre bactérias Gramnegativas foram observadas para os óleos essenciais do quimiotipo II, com CIM e CLM de
0,625 mg/mL para E. coli e A. lwoffi e do quimiotipo I para A. lwoffi (Tabela 06).
O mecanismo de ação de alguns óleos essenciais, como exemplo, o óleo de
Melaleuca alternifolia, usado contra E. coli, causa a desnaturação de proteínas de membrana,
o que resulta no rompimento de sua membrana externa e subsequente perda de potássio,
inibição da respiração e lise celular (COX et al, 1998).
114
A ação de óleos essenciais sobre bactérias Gram-positivas e fungos parece ocorrer
através do mesmo mecanismo. Os compostos do óleo destroem a parede celular e a membrana
citoplasmática dos microrganismos resultando assim na liberação e coagulação dos compostos
do citoplasma (MANN et al, 2000)
Nossos resultados, em concordância com os de muitos pesquisadores, constatam a
menor suscetibilidade das bactérias Gram-negativas, aos óleos essenciais testados, o que pode
ser atribuído à presença de uma camada externa de natureza lipopolissacarídeo. As drogas que
conseguem penetrar facilmente em bactérias Gram-negativas, utilizam as porinas, devendo ser
relativamente pequenas e preferencialmente hidrofílicas. Compostos terpênicos, constituintes
majoritários dos óleos essenciais de L. alba, são especialmente grandes e incapazes de
penetrar prontamente em bactérias Gram-negativas (TORTORA et al., 2000; KONEMAN et
al., 2001; TAVARES, 2001).
A atividade antimicrobiana dos óleos de L. alba mostrou-se do tipo dosedependente, para todas as cepas testadas. Os maiores halos de inibição foram determinados
pela ação do óleo essencial do quimiotipo II sobre C. albicans (43 mm), que também
apresentou a menor concentração capaz de determinar a formação de halo de inibição de
crescimento pelo método de difusão em ágar (6,25mg/mL). Quando testados pelo método da
microdiluição em microplacas, a CIM desse óleo sobre C. albicans foi de 3,12mg/mL, o que
pode ser atribuído à baixa capacidade de difusão dos óleos essenciais em meio sólido.
Resultados semelhantes foram obtidos para a maioria das cepas testadas. Esses achados
reforçam a importância de que compostos com potencial antimicrobiano, determinado
previamente pelo método de difusão em ágar, devem ser testados pelos métodos da diluição
em caldo de cultura, o qual fornece resultados mais precisos e possibilitam a determinação da
CLM.
Alguns fatores podem interferir nos resultados obtidos pelo método de difusão em
ágar como a densidade do crescimento microbiano e a solubilidade da substância testada
(LAMBERT et al, 2001; HOOD et al, 2003). Além disso, uma importante desvantagem desta
técnica é que não possibilita determinar se uma droga é bactericida ou se é simplesmente
bacteriostática (TORTORA et al, 2000), como no caso dos métodos de diluição.
Embora a técnica de difusão em ágar apresente limitações e nem sempre forneça
resultados compatíveis com as técnicas da diluição, nossos resultados indicam ser essa técnica
de grande utilidade, quando realizada em uma etapa preliminar e em associação com outras,
115
na determinação do potencial antimicrobiano, para a seleção de drogas com possível eficácia,
pois permite obter informações gerais sobre esse efeito.
O método da diluição em caldo de cultura pode ser realizado em tubos de ensaio
ou em placas de microdiluição e a CIM é determinada pela inspeção visual do crescimento
microbiano após 24h de incubação. A CIM pode também ser obtida através da determinação
da densidade ótica em leitor de ELISA, que alem de fornecer a CIM, possibilita entender a
cinética de inibição do crescimento microbiano.
Os métodos de diluição em caldo de cultura para determinação da CIM
possibilitam a obtenção da CLM, o que é de grande importância clínica, pois torna possível
evitar ou diminuir o uso excessivo ou errôneo de um determinado antibiótico, minimizando a
ocorrência de reações adversas (NASCIMENTO et al, 2000) e a seleção de cepas microbianas
resistentes.
Nesse trabalho foram determinadas as CIM e CLM, pelos métodos da
microdiluição e do plaqueamento em meio sólido, respectivamente, para todas as cepas
testadas pela técnica de difusão em ágar, mesmo para aquelas que se mostraram resistentes.
As mais baixas CIM e CLM obtidas para os óleos essenciais dos quimiotipos I, II
e III, foram de 0,312 e 0,625mg/mL, 0,312 e 0,312mg/mL e 0,625 e 0,625mg/mL,
respectivamente. Para as bactérias Gram-negativas que não apresentaram qualquer
suscetibilidade aos óleos testados quando submetidas ao ensaio de difusão, também não foi
possível encontrar as CIM e CLM, assim, consideramos essas concentrações superiores a
20mg/mL.
Segundo TAVARES (2001), no tratamento de infecção bacteriana ou fúngica
deve-se utilizar preferencialmente droga com ação letal sobre o agente etiológico, droga
bactericida ou fungicida, respectivamente, pois a droga por si só é capaz de provocar a morte
do germe, não havendo grande dependência das defesas orgânicas, principalmente em
pacientes com deficiências em sua imunidade, incluindo os recém-nascidos, paciente idoso,
gestante, pacientes com doença que alteram a imunidade ou que estão em uso de drogas
imunossupressoras. Essa situação foi constatada para cinco das 11 (45,45%) cepas testadas: o
óleo do quimiotipo I sobre A. lwoffi e S. aureus 1, do quimiotipo II sobre E. coli ATCCC
10536, C. albicans ATCC 10231 e A. lwoffi e A. baumannii e, do quimiotipo III sobre A.
lwoffi, A. baumannii e S. aureus 1. As cepas A. lwoffi, S. aureus 1 e A. baumannii são de
origem hospitalar e apresentam perfil de multirresistência.
116
A excelente atividade antimicrobiana constatada para os óleos essenciais dos três
quimiotipos de L. alba sobre cepas bacteriana Gram-positivas e Gram-negativas e C. albicans,
inclusive sobre cepas multirresistentes de origem hospitalar, alem de reforçar a grande
importância dos estudos das atividades biológicas de L. alba, especialmente da determinação
do potencial antimicrobiano de seus óleos essenciais e explicar seu uso popular, sugere serem
esses óleos possíveis candidatos ao desenvolvimento de fármacos úteis no tratamento de
doenças infecciosas.
Para determinação do potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de L. alba
sobre cepas microbianas com perfil de multirresistência (Tabela 01), foram utilizadas seis
cepas pertencentes a quatro gêneros bacterianos: três Gram-negativos (Acinetobacter,
Klebisiella e Escherichia) e um Gram-positivo (Staphylococcus). Todas as cepas foram
isoladas de espécimes clínicos (líquidos corporais) de origem hospitalar e submetidas aos
testes de sensibilidade a antimicrobianos. Com exceção da espécie E. coli, resistente a 41,18%
dos antibióticos testados, as demais cepas foram resistentes mais de 72% dos antibióticos.
Duas dessas cepas (33,33%), E. coli e K. pneumoniae, foram resistentes aos três óleos
essenciais, nas concentrações testadas; A lwoffi e S. aureus 1 foram sensíveis aos três óleos; A.
baumannii foi sensível aos óleos dos quimiotipos II e III; e S. aureus 2 aos quimiotipos I e II.
Sendo o quimiotipo II o de maior atividade sobre a maioria dessas cepas, apresentando
geralmente as menores CIM e CLM, quando comparadas às determinadas pelos quimiotipos I
e III.
As cepas de S. aureus, especialmente aquelas de origem hospitalar, são
conhecidas por sua grande resistência a antibióticos (CARSON et al, 1995). As duas cepas de
S. aureus testadas no nosso trabalho, S. aureus 1 e S. aureus 2 apresentam um forte perfil de
resistência, sendo sensíveis apenas a Vancomicina e Oxacilina/vancomicina, respectivamente,
mas foram sensíveis aos óleos essenciais de L. alba, em CIM e CLM tão baixas quanto
0,312mg/mL e 0,625mg/mL, respectivamente (Tabela 06). Esses resultados sugerem que a
ação dos óleos essenciais de L. alba ocorram por mecanismos diferentes daqueles exercidos
pela maioria dos antimicrobianos e destacam a importância desses óleos para o
desenvolvimento de drogas antimicrobianas, para a resolução de infecções causadas por S.
aureus meticilina resistentes.
A determinação da CLM foi realizada através de plaqueamento em meio sólido de
alíquotas obtidas das culturas, nos poços das placas de microdiluição, que não apresentaram
turvação visível. Após incubação de por 24horas a 35ºC, foi realizada a contagem de colônias
117
crescidas no meio sólido e calculado o número de UFC/mL. A CLM foi considerada aquela
concentração do óleo essencial que determinava um crescimento em meio sólido < 0,1% do
inóculo inicial.
Quatro cepas (36,36%) apresentaram CIM superiores as CLM apenas em uma
diluição e para a levedura C. albicans ATCC 10231 (9,09% do total) a CIM do óleo essencial
do quimiotipo III foi 2 vezes maior que a CLM. É importante observar que esse óleo essencial
foi também o que apresentou as maiores CIM e CLM, exceto para a cepa multirresistente S.
aureus 1.
Segundo TAVARES (2001) é esperado que a CLM seja igual ou somente maior
em uma ou duas diluições que a CIM, pois distância muito grande entre esses dois valores
(CLM e CIM) podem indicar a ocorrência de tolerância do microrganismo à droga em
questão. De acordo com as constatações desse autor, nossos resultados mostram que nenhuma
das cepas microbianas testadas foi tolerante à ação dos óleos essenciais da L. alba.
Embora
na
clínica
exista
a
preferência
pela
utilização
por
drogas
bactericida/fungicida, as drogas bacteriostáticas/fungistáticas, também exercem um papel
importante nos casos de drogas tóxicas, evitando o uso de concentrações bactericidas. Dessa
forma, seria usada uma concentração menor, suficiente para alcançar a CIM. A droga atuaria
somente inibindo o crescimento do microrganismo, não havendo sua destruição, e a resolução
do processo infeccioso dependeria da resistência orgânica, representada pela fagocitose e
imunidade (TAVARES, 2001).
De acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, a determinação da CIM pelos
testes de diluição em caldo de cultura é realizada através de inspeção visual. No entanto,
podemos utilizar a leitura de densidade ótica das culturas para conhecer a cinética de inibição
do crescimento microbiano e comprovar os valores obtidos para CIM. No presente trabalho
pode ser observar, que a CIM detectada por inspeção a “olho nu”, na maioria das vezes, foi
semelhante à CIM obtida através da determinação da densidade ótica, em leitora de ELISA.
As leituras de densidade realizadas em um comprimento de onda de 490 mm, em
leitora de ELISA (Bio-Tek) foram utilizadas para avaliar a cinética de inibição de crescimento
microbiano. Analisando os gráficos da cinética de inibição do crescimento das cepas
microbianas sob a ação dos óleos essenciais de L. alba, observamos que os valores das
absorbâncias permanecem semelhantes ao do grupo controle positivo (inibição do
crescimento microbiano pela ação de antimicrobianos comerciais e de comprovada eficácia)
118
até uma determinada concentração e então aumentam, indicando um maior crescimento
microbiano (Figuras 17, 20, 21, 22, 24, 27, 28, 29, 30, 33 e 34).
As metodologias descritas para determinação da CIM, realizadas em tubos ou em
microplacas, preconizam como CIM a menor concentração capaz de inibir o crescimento
microbiano em 24h de incubação, observada por inspeção visual, o que é fortemente
influenciada pela acuidade visual do observador. Por outro lado, as leituras de absorbância são
capazes de fornecer valores precisos que podem ser relacionados com a população microbiana
na cultura.
Observando os gráficos de cinética de inibição do crescimento das cepas
microbianas testadas, podemos contatar que para alguns ensaios, os valores de CIM,
determinados através de observação visual, são superiores, em uma ou quatro vezes, às
menores concentrações da droga que determinam um crescimento microbiano que não difere
significativamente (p<0,05) daquele determinado pela ação do controle positivo. Isso foi
evidente quando testamos o óleo do quimiotipo I sobre C. albicans (0,156mg/mL) e S. aureus
1 (0,312mg/mL), para o óleo do quimiotipo II sobre A. lwoffi (0,312mg/mL) e A. baumannii
(0,312mg/mL) e para o óleo do quimiotipo III sobre S. aureus 1 (0,312mg/mL). Esses
resultados denotam uma excelente atividade antimicrobiana para os óleos essenciais de L.
alba, se considerarmos que mesmo em concentrações menores que suas CIM ainda são
capazes de inibir o crescimento microbiano de algumas das cepas testadas para níveis que não
diferem significativamente daqueles determinados pelos controles positivos usados.
Na figura 32 podemos observar a cinética de inibição do crescimento de S. aureus
2, determinada pela ação do óleo essencial do quimiotipo III. Pelo método da difusão foi
possível observar um discreto halo de inibição de crescimento, até na concentração de
100mg/mL de óleo, e pelo método da diluição não foi possível determinar visualmente a CIM,
quando testado nas concentrações binárias de 20 a 0,009 mg/mL. No entanto, a cinética de
inibição mostra que a inibição de crescimento nas concentrações de 20, 10 e 2,5 mg/mL não
diferem significativamente daquela determinada pela ação da vancomicina, usada como
controle positivo.
Esses resultados sugerem que as determinações de CIM por diluição em caldo de
cultura sejam acompanhadas de leitura das densidades óticas das culturas, após incubação,
evitando assim, a utilização de CIM, algumas vezes superiores a concentrações com
eficiências comparáveis as dos controles. É importante também ressaltar que o fato de uma
droga não ser capaz de inibir visivelmente o crescimento microbiano, não significa que sua
119
atividade seja inferior a do controle do experimento, como foi o caso da ação do óleo
essencial do quimiotipo III sobre S. aureus 2, pois a turvação da cultura microbiana é
determinada pela presença de células vivas e de células mortas.
A realizarmos as leituras de densidade ótica das culturas a 490mm podemos
observar que os valores obtidos para as maiores concentrações foram, muitas vezes,
superiores àqueles obtidos para a CIM, chegando até a ser significativamente diferentes
quando comparados com o grupo controle, o que poderia levar a um entendimento errôneo
dos resultados. No entanto, quando feito o plaqueamento desta concentração, foi verificado
que não houve nenhum crescimento microbiano e que a diferença nos resultados pode ser
atribuída à turvação devido à alta concentração do óleo essencial presente no poço. Dessa
forma, apesar dos métodos automatizados oferecerem rapidez, reduzirem a possibilidade de
erros técnicos e permitirem a realização de grande número de testes simultâneos, facilitando o
trabalho laboratorial, nem sempre expressam a real sensibilidade dos microrganismos
identificados, podendo falhar na demonstração da resistência às drogas (TAVARES, 2001).
O controle negativo usado para todos os testes foi Tween 80 1%, o qual não
determinou qualquer inibição sobre crescimento das cepas testadas, para nenhum dos métodos
realizados.
Os resultados obtidos em nosso trabalho fornecem explicações cientificas que
ajudam a explicar a utilização dessa planta pela população no combate de doenças infecciosas
como gripe, bronquite (BRAGA et al, 2005), tosse e resfriados (STASI et al, 2002), dor de
barriga (SILVA et al., 2008) e diarréia (JULIÃO, 2003).
Alguns estudos têm demonstrado o efeito antimicrobiano de extratos brutos, óleos
essenciais e néctar das flores da espécie da L. alba, principalmente sobre S. aurues e algumas
espécies de Candida, mas são escassos ou inexistentes estudos que realizem comparação entre
composição química dos óleos essenciais dos três quimiotipos e seus potenciais
antimicrobianos, que determinem os valores de CIM e CLM e principalmente que avaliem a
cinética de inibição de crescimento microbiano.
Estudo feito por CÁCERES et al, 1991, destaca que entre as 68 plantas utilizadas
na Guatemala no tratamento de doenças respiratórias, a espécie L. alba apresentou grande
atividade antibacteriana, principalmente contra o S. aureus. BASTOS (2007) mostrou que a
espécie Lippia alba (erva-cidreira), também foi uma das espécies mais citadas para fins
medicinais e que suas folhas são usadas principalmente no combate da gripe. A atividade
antimicrobiana de L. alba, principalmente para bactérias Gram-positivas, também foi
120
constatada para os extratos etanólicos das folhas e soluções extrativas hidroalcoólicas a 80%
sobre S. aureus (SOARES, 2001).
Atividade antibacteriana contra S. aureus e E. coli do mel produzido a partir das
flores de L. alba foi mostrado por CAMARGO em 2001. O estudo foi realizado através da
técnica de diluição da amostra de mel em meio de cultura líquido em concentrações variando
de 5% a 80% (v/v). Os resultados mostraram que as CIM e CLM para S. aureus foi de 60% e
45%, respectivamente. Para E. coli verificou-se que o valor da CIM foi de 35% e de 60% para
a ação bactericida.
A ação antifúngica dos extratos etanólicos e dos óleos essenciais das folhas de L.
alba sobre C. albicans foi avaliada por DUARTE et al, 2005, que mostraram uma moderada
CIM com valor de 0,6mg/mL para os óleos essenciais e fraca CIM com valor maior de
2,0mg/mL para os extratos etanólicos das folhas. Também visando avaliar atividade
antifúngica do óleo essencial das folhas de L. alba, RAO et al (2000), detectaram vapores de
óleos com forte atividade antifúngica contra patógenos da cana de açúcar. OLIVEIRA (2000)
testou óleos essenciais e exsudatos de L. alba sobre fungos isolados de frutas e verificaram a
ocorrência de atividade antifúngica através do aumento do tempo de vida útil dessas frutas.
Um screening de plantas usadas na medicina popular brasileira para tratamento
de doenças infecciosas realizado por HOLETZ et al., 2002, mostrou que o extrato
hidroalcoolico das folhas de L. alba apresentou uma concentração inibitória mínima
moderada de 125µg/mL para a Candida krusei. Já para os outros microrganismos, S. aureus,
Bacillus subtilis, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans, C. parapsiolis e C. tropicalis, a CIM foi
maior do que 1000µg/mL, considerado pelo autor, como inatividade dos extratos.
NUNES et al (2008), avaliando a atividade antimicrobiana de L. alba quimiotipo
linalol e limoneno, verificaram que o quimiotipo linalol apresentou efeito inibitório sobre B.
megaterium, B. subtilis, B. cereus, Shiguella, E. coli, Salmonella sp, Acinetobacter sp e que o
quimiotipo limoneno inibiu o crescimento de Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes,
C. guillermondii. Neste estudo, o autor constatou que a inibição do crescimento microbiano é
dependente da composição do óleo essencial da planta analisada.
Nossos resultados mostram que os óleos essenciais das folhas de L. alba,
quimiotipo I, II e III, contem substâncias com propriedades antimicrobianas. Semelhantes a
estudos anteriores (CÁCERES et al, 1991; ALEA et al, 1997; SOARES, 2001; CAMARGO
2001; DUARTE et al, 2005; HOLETZ et al, 2002; NUNES et al, 2008), a atividade
antimicrobiana foi principalmente sobre S. aureus, mesmo os multirresistentes e C. albicans.
121
Já em relação às bactérias Gram-negativas, os três quimiotipos apresentaram ação sobre o A.
lwoffi, os quimiotipos II e III inibiram o crescimento do A. baumannii, e apenas o quimiotipo
II teve ação sobre E. coli ATCC.
5.3 Avaliação da atividade antioxidante dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba,
quimiotipos I, II e III.
Têm sido cada vez mais crescente as recomendações para o consumo de alimentos
ricos em moléculas antioxidantes, como carotenóides e polifenóis, isso devido aos benefícios
destes produtos relacionados desde a prevenção ao tratamento de doenças neurodegenerativas,
por exemplo. Assim, as pesquisas de novos produtos antioxidantes naturais são crescentes e
têm levado a identificação do potencial antioxidante tanto de produtos derivados quanto de
moléculas isoladas de plantas, incluindo Camellia sinensis (chá-verde), e moléculas como
amburosídio A, epigalocatequina e curcumina isolados de Amburana ceraensis, Camellia
sinensis e Curcuma longa, respectivamente (LEAL et al., 2006).
O estresse oxidativo ocorre quando a produção de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio tais como o radical superóxido, peróxido de hidrogênio, nitrito, peroxinitrito e
outros supera o mecanismo antioxidante natural celular. Produtos do estresse oxidativo
comprometem vários componentes celulares incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios.
A membrana celular é uma das estruturas celulares mais afetadas em decorrência da
peroxidação lipídica, que acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas
celulares (DROGE, 2002). Consequentemente há perda da seletividade na troca iônica e
liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação
de produtos citotóxicos, como o malonildialdeído, culminando na morte celular. Existem
evidências de que as espécies reativas do metabolismo do oxigênio e do nitrogênio estão
envolvidas na fisiopatologia de inúmeras doenças neurodegenerativas tais como epilepsia,
esclerose múltipla, demências e doenças de Alzheimer e de Parkinson (SALVADOR &
HENRIQUES, 2004) que estão entre as doenças neurodegenerativas com maior prevalência.
Estudos anteriores demonstraram alguns efeitos no sistema nervoso central do
óleo e extrato hidroalcoólico das folhas de Lippia alba (VALE, 1999; ZÉTOLA et al., 2002;
HENNEBELLE et al., 2008). Assim, o potencial antioxidante dos OELA-quimiotipos I, II e
III foi investigado pela mensuração do seu efeito sobre a peroxidação lipídica induzida pelo
choque térmico em córtex e hipotálamo de ratos. Os OELA-quimiotipo II e III reduziram
122
significativamente a concentração de TBARS, medida indireta do malonildialdeído, tanto no
córtex quanto no hipotálamo, enquanto o OELA - quimiotipo I também interferiu na
peroxidação lipídica, porém apresentou um efeito dual concentração-dependente no córtex.
Por outro lado, nenhum dos quimiotipos do OELA apresentaram atividade seqüestradora de
radicais livres avaliada através do teste do DPPH.
STASHENKO et al (2004) observaram o efeito antioxidante dos óleos essenciais
de L. alba obtido por hidrodestilação. O método utilizado foi da oxidação do ácido linoléico
em compostos carbonílicos, e o efeito antioxidante do óleo essencial que foi comparável aos
efeitos da vitamina E e do 2-(terc-butil)-4-methoxifenol (BHA), ambos usados como aditivos
naturais e sintéticos. Além disso, o extrato hidroalcoólico e flavonóides obtidos de L. alba
também possuem efeitos antioxidantes determinados através do teste do DPPH
(HENEBELLE et al., 2008; STASHENKO et al., 2004). Dessa forma, a ausência da atividade
antioxidante do OELA investigada através do teste do DPPH no presente estudo, que avalia a
ação seqüestradora de radicais livres, pode está relacionada as características desse modelo
experimental que requer uma estabilidade química do radical formado na reação para que se
comprove seu potencial antioxidante.
O córtex e o hipocampo são áreas cerebrais relacionadas ao comportamento e a
memória, portanto tem um papel importante na fisiopatologia de várias desordens
neurológicas e de doenças neurodegenerativas como Alzheimer’s (GUYTON & HALL,
2002). Portanto, o efeito antioxidante dos quimiotipos dos OELA, em particular a inibição da
peroxidação lipídica nas referidas áreas cerebrais, tornam esse produtos derivados de L. alba
uma ferramenta farmacológica em potencial no tratamento de desordens no sistema nervoso
central que envolvem particularmente as funções cognitivas. No entanto, são necessários
estudos adicionais, para determinar os mecanismos de ação antioxidante dos OELA.
123
CONCLUSÃO
124
6 CONCLUSÃO
•
A determinação da composição química dos quimiotipos de L. alba é de extrema
importância nos estudos de atividades biológicas, pois possibilita estabelecer uma
comparação entre composição química e atividade biológica;
•
Os óleos essenciais das folhas de L. alba, principalmente o quimiotipo II, apresentam
elevada atividade antimicrobiana e amplo espectro de ação, sendo eficazes sobre
bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas e C. albicans, sugerindo serem
promissores candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de
doenças infecciosas;
•
As bactérias Gram-positivas e a levedura C. albicans são mais sensíveis à ação inibitória
determinada pelos óleos essenciais de L. alba, que as bactérias Gram-negativas;
•
As diferenças, quantitativas e qualitativas, nas composições químicas dos óleos essenciais
de folhas dos quimiotipos I, II e III de L. alba, influenciam fortemente em seus potenciais
antimicrobianos;
•
A presença de elevados teores de citral nos óleos essenciais dos quimiotipos I e II de L.
alba pode explicar a maior atividade antimicrobiana desses óleos quando comparados ao
óleo essencial do quimiotipo III;
•
O método de difusão em meio sólido é um excelente método de triagem, por ser de fácil
realização e fornecer resultados que orientam a realização dos métodos de diluição em
caldo de cultura, no entanto não é suficiente para o conhecimento do potencial
antimicrobiano dos óleos essenciais;
•
A determinação da CIM pelo método da diluição em caldo de cultura em microplacas,
por inspeção visual e leitura de absorbância, permite determinar alem da CIM, a CLM e
avaliar a cinética de inibição de crescimento microbiano;
125
•
O conhecimento da cinética de inibição de crescimento possibilita a utilização de
concentrações da droga, inferiores à CIM ou à CLM, mas que ainda apresentem um efeito
semelhante à de antibióticos de uso comercial;
•
Para a maioria das cepas testadas, os valores de CIM e CLM dos óleos essenciais da
folhas de L. alba, principalmente o quimiotipo II, são iguais, o que evita a ocorrência do
fenômeno de tolerância pelos microrganismos expostos a eles;
•
Os óleos essenciais das folhas de L. alba quimiotipo I, II e III apresentaram efeito
antioxidante que parece não está relacionado a uma ação seqüestradora de radicais livres,
mas sim a um bloqueio da peroxidação lipídica;
•
O presente estudo mostrou que o óleo essencial L. alba possui um potencial
farmacológico que poderá ser aproveitado no desenvolvimento de um fitoterápico,
contudo estudos adicionais são necessários no sentido de comprovar a segurança, a
eficácia e qualidade do produto.
126
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127
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