apresentação - CiB – Centro de Informação de Biotecnologia

Agrobiotecnologia: ponto de vista técnicocientífico
Como se produz uma planta transgénica?
Sofia Duque
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Introdução ao DNA:
DNA
DNA- Ácido desoxirribonucleico
(“deoxyribonucleic acid”)
Esta molécula armazena a informação
genética do organismo e regula o processo
metabólico da vida.
Encontra-se em todas as células dos
organismos vivos e em alguns vírus (vírus de
DNA).
Cromossoma
Estruturas constituídas por DNA e que
permitem a transmissão da informação
genética.
Cada espécie possui um numero
característico de cromossomas (ex: 46
nas células humanas não reprodutoras).
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Genes
Um gene é uma unidade hereditária
constituída por uma sequencia de DNA e que
ocupa
uma
posição
especifica
num
cromossoma.
Um gene contem a informação necessária
para a construção de uma proteína especifica.
É responsável por uma característica
geneticamente determinada (ex: resistência a
um herbicida, resistência a vírus).
Informação genética
A informação genética está contida na sequencia de
quatro moléculas (bases azotadas) que são: adenina (A),
citosina (C), guanina (G) e timina (T).
Estas unidades encontram-se ligadas a um açúcar C5
(desoxirribose) e a um ácido fosfórico, criando uma
estrutura denominada nucleótido.
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
RNA
RNA- Ácido ribonucleico
(“ribonucleic acid”)
Esta molécula copia a informação que
recebe do DNA e traduz essa informação de
modo a que sejam produzidas as proteínas
necessárias a vida.
Transcrição
DNA
Tradução
mRNA
Proteína
Característica
Tradução da informação genética
A informação genética contida no DNA é copiada
para o RNA, por emparelhamento das bases
azotadas (C::G) e (A::U).
Nota: No RNA a base timina (T) é substituída pelo
uracilo (U).
No RNA, estas unidades encontram-se ligadas a
um açúcar (ribose) e a um acido fosfórico. O
RNA e usualmente uma molécula linear.
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Proteínas
Proteínas são longos polímeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas.
Existem 20 aminoácidos diferentes e é a
ordem e tipo de aa ligados que caracterizam
uma proteína.
Os genes codificam para diferentes
proteínas, estas podem funcionar como
enzimas
(catalizadores
de
reacções
químicas), como unidades estruturais ou de
armazenamento na célula.
O código genético
O código genético; que é estabelecido pela
ligação sequencial das quatro moléculas
anteriormente referidas: adenina (A), citosina
(C), guanina (G) e timina (T); é posteriormente
transcrito para o RNAm (sob a forma de U, G, C
e A) e traduzido para ligar aminoácidos com
vista a formar proteínas.
Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico
O que é um OGM?
OGMs
Organismos geneticamente modificados são
organismos que são manipulados por
engenharia genética (EG).
A EG ou “tecnologia do DNA recombinante” é
o processo de transferência de genes
individuais, seleccionados, de um organismo
para outro, com o objectivo de reproduzir
características da espécie original.
Quais as vantagens?
Saúde: Produtos mais baratos e mais
seguros; fonte mais barata de vacinas;
aumento do valor nutricional em alimentos.
Agricultura: Resistência a pestes e doenças;
tolerância a factores ambientais; resistência a
herbicidas; aumento de produtividade; maior
tempo de armazenamento; alteração da cor e
do sabor.
Biotecnologia
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Exemplos:
Produção de fármacos
- 1982 - Primeiro fármaco (insulina)
produzido por engenharia genética
(EG) consistiu na clonagem de DNA
humano em bactérias.
(Inicialmente a insulina comercial era
derivada de suínos).
Alguns agentes biofarmacêuticos produzidos por
EG e aprovados para comercialização.
Nome
comercial
Substancia
Finalidade
Humulin
Insulina
humana
Tratamento da diabetes (Dezembro, 1990).
Laboratorio
Lilly Farma
Activase
alteplase
recombinante
Tratamento enfarte do miocárdio (Novembro, 1987)
e embolismo pulmonar agudo (Junho, 1990).
Genentech, Inc.
Adagen
adenosina
diaminase
Tratamento de bebés e crianças com
imunodeficiência severa (Março, 1990).
Enzon, Inc.
Engerix-B
-
Vacina recombinante contra hepatite B
(Setembro, 1989).
SmithKline Beecham
Humatrope
somatropina
Tratamento da deficiência na hormona de
crescimento em crianças (Março, 1987).
Eli Lilly & Co.
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Plantas geneticamente modificadas
Plantas geneticamente modificadas foram
patenteadas em 1985. No entanto, só na
década seguinte foram comercializadas as
primeiras plantas transgénicas (tomate
FlavrSavr, Calgene).
Fonte:USDA
Outros exemplos: Cultivares Bt resistentes a insectos
"Bt" de Bacillus thuringiensis.
Uma bactéria do solo cujos esporos contem
uma proteína cristalina (CRY).
No sistema digestivo do insecto esta proteína
degrada-se e liberta uma toxina, denominada
delta-endotoxina.
Esta toxina paralisa o sistema digestivo
provocando a morte do insecto.
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
O que são cultivares Bt?
Cultivares em que foi inserido, no
próprio DNA da planta, uma versão
modificada do gene Cry da bactéria.
A planta passa a produzir a toxina e
quando o insecto se alimenta da
planta, ingere a toxina e morre em
poucos dias.
Fonte:USDA
Fonte:CIB
Broca do milho (esquerda) e do algodão (direita), são duas
pestes controladas pelo milho e algodão Bt, respectivamente.
A utilização de variedades Bt
reduziu drasticamente o uso de
pesticidas químicos.
Fonte:CIB
Campo de milho Bt (Odemira, Portugal)-Out 05
Milho Bt (esquerda) e
convencional (direita)
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Como se produz uma planta transgénica?
Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante
Inserção estável, no genoma de uma planta, de uma sequência codificante e expressável.
Essa sequência tem que ser transferida e expressa na descendência.
1) Seleccionar genes responsáveis por características de interesse:
• É o processo mais limitativo desta tecnologia.
• Consiste no isolamento e caracterização de sequencias de DNA responsáveis por
características agronomicamente relevantes.
• Conhecer os genes responsáveis pelo aumento da produtividade, melhoria na
tolerância os stress, alteração de propriedades químicas, ou outros, que possam
afectar as características das plantas.
• Identificar um gene responsável por uma característica não e normalmente suficiente;
é necessário conhecer os mecanismos reguladores, que outros efeitos poderá ter na
planta e como interactua com outros genes.
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Que características se podem introduzir nas plantas com
recurso à Engenharia Genética ?
•Resistência a insectos, nematodes, fungos, bactérias e vírus.
•Resistência ao frio, à seca, à salinidade, a determinado
herbicida e a determinado metal pesado.
•Alteração do conteúdo nutricional em aminoácidos, vitaminas,
antioxidantes, fibras, ácidos gordos, hidratos de carbono,
micronutrientes.
•Alteração da cor, do sabor, da fragrância, e da textura
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
2) Clonagem de genes seleccionados
Após selecção de um gene de interesse é
necessário uma série de modificações antes da
efectiva inserção na planta.
• Isolar e clonar as sequências do DNA
• Escolher um promotor
• Possibilidade de alterar o gene clonado
(ex: no gene Bt, nucleótidos A-T foram substituídos por G-C,
aumentando a produção da proteína em plantas)
• Incluir uma sequência terminadora
• Adicionar um gene marcador ou de selecção
Gene de selecção
promotor
transgene
Acção da enzima de restrição EcoRI
ter
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
3) Métodos de transferência
Transformação mediada pelo Agrobacterium
As primeiras tentativas de transferência de
genes para plantas consistiram na utilização do
Agrobacterium
tumefaciens
utilizando
o
sistema natural de transferência de DNA que na
natureza produz a doença conhecida por
“crown gall”
Agrobacterium tumefaciens
É uma bactéria do solo (Gram-), capaz de colonizar
geneticamente as plantas devido a presença de um
plasmídeo, plasmídeo Ti (“tumor inducing”).
Uma região do plasmídeo Ti, T-DNA (“TransferredDNA”), é transferida e integrada no genoma da
planta durante o processo de infecção.
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Nota: A transformação é feita célula a célula
Célula de Agrobacterium tumefaciens.
Transformação de uma planta com
Agrobacterium tumefaciens.
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Plasmídeo Ti
T-DNA region
Auxin
Left
border
Cytokinin
Opine
Right border
12-24 kbp
vir
genes
ori
Opine
catabolism
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Como se constrói
um vector para
transformação
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
3
1
2
Transformação de uma planta com Agrobacterium tumefaciens.
1 - Co-cultura; 2 - Diferenciação em presença de agente selectivo; 3 - interacção entre a bactéria e
a célula vegetal. (adaptado de várias publicações)
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
4) Sistema de selecção dos tecidos transformados
• Após a inserção do transgene na célula vegetal os
tecidos são transferidos para um meio selectivo.
• Este meio contém um antibiótico ou herbicida,
dependendo do gene de selecção que foi
introduzido no plasmídeo.
• Apenas as plantas que expressam o gene de
selecção irão sobreviver, assumindo-se que essas
plantas também possuem o transgene de interesse.
• Nos passos subsequentes do processo apenas
serão utilizadas plantas que sobreviveram a
selecção.
Em meio selectivo sobrevivem apenas
as plantas que integraram o transgene.
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
5) Sistema de regeneração
A indução e diferenciação de embriões somáticos em Medicago truncatula
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Transformação da M. truncatula
• Ferimento dos explantes com lâmina
infectada numa suspensão de Agrobacterium
• Meio de indução de embriões
fitoreguladores : 2,4 –D e Zeatina)
(com
• 5 dias co-cultura, escuras
• Selecção tecidos transgénicos em 100mg/l
Canamicina
• Eliminação do Agrobacterium em 500 mg/l
Carbenicilina
• Diferenciação e maturação dos embriões
somáticos (meio sem fitoreguladores)
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Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico
Aclimatação e transferência para a estufa das plantas in vitro.
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Resultados
Um processo relativamente moroso…..
154 explants
64 embriões
somáticos
75 CanR agregados
embriogénicos
1 -2 meses
2-3 meses
33 potenciais linhas
transgénicas
40 linhas CanR
enraizaram em
50 mg/l Can
3-5 meses
Transferidas para a
estufa para obter
sementes
9-10 meses
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Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico
6) Análise dos Transformantes
Diferentes passos
numa reacção de
PCR
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
PCR (“Polymerase Chain Reaction”)
Extracção DNA
Amplificação exponencial dum gene por PCR
Transformantes
Usando “primers”
específicos para o
transgene
WTC+
1.5 Kbp
Verificação do produto de PCR em gel
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
6) Análise dos Transformantes
Análise da descendência (segregação de sementes)
Plantas
CanR T1
Semente
Semente
Plantas
T2
Homozigóticas
Kan 400 mg/l
Plantas T1
Plantas To
(Plantas auto-polinizadas)
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
No entanto, não basta analisar as plantas
transgénicas por métodos de Biologia Molecular
É preciso verificar se a expressão
destes genes resulta numa alteração
fenotípica de valor acrescentado
Ensaios de campo!
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
7) Avaliação e Melhoramento
Processo de avaliação exaustivo:
• Actividade do gene introduzido.
• Estabilidade do gene introduzido (transmissão e expressão na descendência).
• Inexistência de efeitos indesejáveis no crescimento, qualidade e produtividade.
Mesmo que uma planta “passe” nestes ensaios, provavelmente não será utilizada
directamente na agricultura, mas será cruzada com variedades agronomicamente
relevantes. (Apenas algumas variedade podem ser eficientemente transformadas e essas não são por
vezes as de maior interesse comercial !)
O próximo passo no processo são os ensaios em estufas e no campo com vista a testar o
efeito do transgene e a “performance” geral.
Nesta fase também se inclui a avaliação do impacto ambiental e segurança alimentar.
Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
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Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico
Fontes:
• Agbios
http://www.agbios.com
• AgBiotechNet
http://www.agbiotechnet.com
• Agroecology/ Sustainable Agriculture Program
http://www.aces.uiuc.edu/asap/
• Biotechnology & GMOs
http://gmoinfo.jrc.it/
• Centro de Informação de Biotecnologia - CIB
http://www.cib.biotecnologia.com.pt/
• Library of Crop Technology Lesson Modules
http://croptechnology.unl.edu
•Transgenic Crops: An Introduction and Resource Guide
http://cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/index.html
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