Dissertação Mestrado pdf

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA
PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.
ÉRICA DE OLIVEIRA MELLO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO – 2010
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA
PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.
ÉRICA DE OLIVEIRA MELLO
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências
Universidade
e
Biotecnologia,
Estadual
do
da
Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para a obtenção do título
de
Mestre
em
Biociências
Biotecnologia
ORIENTADORA: PROF ª VALDIRENE MOREIRA GOMES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO – 2010
e
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA
PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências
Universidade
e
Biotecnologia,
Estadual
do
da
Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para a obtenção do título
de
Mestre
em
Biociências
Biotecnologia
Aprovada em 22 de fevereiro de 2010.
Comissão examinadora:
Profª Michelle Frazão Muzitano (Drª em Química – UFRJ)
Profª Claudete Santa Catarina (Drª em Biotecnologia – UENF)
Profª Maura da Cunha (Drª em Ciências – UENF)
Profª Valdirene Moreira Gomes (Drª em Ciências – UENF)
Orientadora
e
DEDICO...
A minha mãe Nádia, ao meu pai José Aurélio e aos
meus irmãos Rômulo, Milla e Thaís por todo o
incentivo
e
apoio,
por
acreditarem
em
mim,
investirem nos meus sonhos e por compreenderem,
há tanto tempo, a minha ausência. Essa vitória é
nossa!!!! Muito obrigada por tudo!!!!
AGRADECIMENTOS
À prof ª Valdirene Moreira Gomes não só pela orientação e pelo aprendizado, mas
também pela experiência de vida passada a mim durante todo esse tempo. Obrigada
por toda força, paciência e pela confiança depositada em mim para que hoje eu
pudesse enfim alcançar mais essa vitória!!
Ao prof ° André de Oliveira Carvalho por ter aceitado revisar essa dissertação, por
todos os ensinamentos desde a minha graduação, por todas as dicas, pela paciência
e sabedoria, pelo companheirismo. Grande parte do que sou hoje devo a você!!
À prof ª Rosana Rodrigues por ter me cedido as sementes de feijão comum para que
eu pudesse dar continuidade ao desenvolvimento deste trabalho.
Ao prof ° Wilmar Dias da Silva e à técnica Claudia Letícia que com toda a
experiência e sabedoria colaboraram na produção do anticorpo.
À prof ª Maura Da Cunha e a Germana pela colaboração e pela ajuda durante os
experimentos de microscopia.
Aos meus companheiros de bancada: Izabella (agora Drª, né?) pela colaboração nos
ensaios antifúngicos, Gabriela, Umberto, Nádia, Júlia, Marcielle e Layrana por toda a
ajuda prestada durante todo esse tempo e em especial aos meus amigos
Mariângela, Suzanna, Luana e Gabriel que além de toda a ajuda prestada, sempre
me proporcionaram momentos de descontração, fazendo meu dia-a-dia muito
melhor!!!
À Suzanna por toda ajuda, ensinamentos passados e colaboração com os ensaios
de inibição do crescimento e inibição da acidificação. Valeu Su!!
Ao Luis pela dedicação e manutenção do nosso laboratório.
A todos os alunos, professores e funcionários do LFBM.
A amiga de república Géssika pela amizade, pelas risadas até altas horas da noite e
também por aguentar meu mau humor no dia-a-dia (rsrsrs). Não posso deixar de
agradecer também as ex integrantes da eterna República Blush: Xxxxúúú, Priscilla,
Paty (tenso), Lidy (dinda) e também as meninas do Caju, valeu pela força e amizade
de sempre!!!!!
Aos meus cunhados Fábio, Carla e Reginaldo por todo o incentivo! E a minha
sobrinha Anita, por ser a minha alegria de viver e principal fonte para recarregar
minhas energias! Titia te ama muito!!!!
À minha família campista e em especial ao meu namorado e anjo da guarda
Raphael Santiago. Obrigada por toda a paciência, dedicação, cuidado, amizade,
pelas palavras de conforto nos momentos mais difíceis e por toda atenção e carinho
a mim dedicados! Te amo!!
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS................................................................................................
I
ÍNDICE .....................................................................................................................
III
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................
VII
ABREVIATURAS......................................................................................................
IX
RESUMO..................................................................................................................
XI
ABSTRACT..............................................................................................................
XII
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................
1
1.1. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS.................................................................
1
1.2. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE PLANTAS..........................................
2
1.3. DEFENSINAS.................................................................................................
3
1.3.1. ASPECTOS ESTRUTURAIS...................................................................
4
1.3.2. ATIVIDADES DESCRITAS IN VITRO PARA AS DEFENSINAS DE
PLANTAS .................................................................................................................
1.3.3.
ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA
DAS
DEFENSINAS
5
DE
PLANTAS..................................................................................................................
6
1.3.4. MECANISMO DE AÇÃO DAS DEFENSINAS DE PLANTAS.................
9
1.4. LEVEDURAS..................................................................................................
11
1.5. FUNGOS FILAMENTOSOS...........................................................................
15
1.6. FEIJÃO COMUM Phaseolus vulgaris .............................................................
12
2. OBJETIVOS..........................................................................................................
14
2.1. OBJETIVO GERAL..........................................................................................
14
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................
14
3. MATERIAIS ........................................................................................................
15
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO.................................................................................
15
3.1.1. SEMENTES.............................................................................................
15
3.1. 2. MICRORGANISMOS.............................................................................. 15
3.1.3. COELHOS...............................................................................................
15
3.2. REAGENTES E OUTROS MATERIAIS..........................................................
15
3.3. INSTRUMENTAL............................................................................................. 17
4. MÉTODOS............................................................................................................
18
4.1. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA DEFENSINA PvD1 DE Phaseolus
vulgaris......................................................................................................................
18
4.1.1. EXTRAÇÃO PROTÉICA DAS SEMENTES..............................................
18
4.1.2. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DEAE-SEPHAROSE...............
20
4.1.3. CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA EM COLUNA C2C18 EM
HPLC.........................................................................................................................
4.2. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ..........................................................
4.3.ELETROFORESE
EM
GEL
DE
TRICINA
NA
PRESENÇA
20
21
DE
SDS...........................................................................................................................
21
4.3.1. CORAMENTO E DESCORAMENTO DO GEL ........................................
21
4.4. PRODUÇÃO DE ANTICORPO E WESTERN BLOTTING............................... 21
4.4.1. OBTENÇÃO DO SORO PRÉ-IMUNE E IMUNIZAÇÃO............................
21
4.4. 2. PURIFICAÇÃO DE IgG DO SORO..........................................................
22
4.4.3.ELETROTRANSFERÊNCIA
DE
PROTEÍNAS
PARA
WESTERN
BLOTTING................................................................................................................
23
4.4.4. IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS ....................................................
23
4.5. ENSAIO DE INIBIÇÃO DA GERMINAÇÃO DOS ESPOROS FÚNGICOS EM
MEIO LÍQUIDO.......................................................................................................... 24
4.5.1. OBTENÇÃO DE ESPOROS DE FUNGOS FILAMENTOSOS.................. 24
4.5.2. ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DOS ESPOROS
FÚNGICOS...............................................................................................................
24
4.6. AVALIAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA PvD1 SOBRE FUNGOS..........
24
4.6.1. EFEITOS DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A PERMEABILIZAÇÃO DE
MEMBRANA DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS................................ 24
4.6.2. ANÁLISE DO EFEITO DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A INIBIÇÃO DA
ACIDIFICAÇÃO DO MEIO INDUZIDO POR GLICOSE POR CÉLULAS DE
LEVEDURAS............................................................................................................
25
4.6.2.1. MANUTENÇÃO E PREPARO DAS CÉLULAS...................................
25
4.6.2.2. ENSAIO DE ACIDIFICAÇÃO.............................................................
25
4.6.3. EFEITOS DA DEFENSINA ISOLADA PvD1 SOBRE A INDUÇÃO DA A
PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS) EM))
CÉLULAS DE C. albicans.......................................................................................... 26
5. RESULTADOS.....................................................................................................
27
5.1. PURIFICAÇÃO DA DEFENSINA....................................................................
27
5.2. ELETROFORESE EM GEL DE TRICINA NA PRESENÇA DE SDS..............
29
5.3. WESTERN BLOTTING.................................................................................... 30
5.4. ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE ESPOROS FÚNGICOS
EM MEIO LÍQUIDO...................................................................................................
31
5.5. EFEITOS DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A PERMEABILIZAÇÃO DE
MEMBRANA DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS................................ 32
5.6. ENSAIO DE ACIDIFICAÇÃO DO MEIO INDUZIDO POR GLICOSE EM
CÉLULAS DE LEVEDURAS.....................................................................................
41
5.7. EFEITOS DA DEFENSINA ISOLADA PvD1 SOBRE A INDUÇÃO DA
PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS) EM
CÉLULAS DE C. albicans.........................................................................................
45
6. DISCUSSÃO.........................................................................................................
47
7. CONCLUSÕES.....................................................................................................
53
8. BIBLIOGRAFIA....................................................................................................
54
LISTA DE ESQUEMAS, FIGURAS E TABELAS
FIGURA 1. Comparação entre estruturas elucidadas de diferentes defensinas de
plantas.......................................................................................................................
5
TABELA 1. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras,
oomicetos e bactérias................................................................................................
9
ESQUEMA 1. Fracionamento com sulfato de amônio do homogeneizado obtido a
partir da extração da farinha das sementes de feijão comum..................................
19
FIGURA 2. Cromatograma da F/0-70 de sementes de feijão comum obtido após
cromatografia em coluna DEAE–Sepharose............................................................
27
FIGURA 3. Cromatograma obtido após cromatografia de fase reversa em coluna
C2/C18 em HPLC do pico D1 obtido após cromatografia em DEAE-Sepharose.....
FIGURA 4. Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS da
F/0-70 e dos picos obtidos após cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e
28
cromatografia em coluna de fase reversa C2C18..................................................
29
FIGURA 5. Western Blotting do anticorpo produzido em coelhos contra a
defensina PvD1 isolada de sementes de P. vulgaris................................................
30
FIGURA 6. Curva de crescimento mostrando a alteração do crescimento dos
fungos filamentosos (A) F. oxysporum, (B) F. solani e (C) F. laterithium na
ausência (controle) e na presença da defensina isolada PvD1, obtida após
cromatografia em coluna de DEAE-Sepharose........................................................
31
TABELA 2. Atividade antifúngica da defensina PvD1 para fungos filamentosos....
32
TABELA 3. Atividade antifúngica da defensina PvD1 para leveduras..................... 32
FIGURA 7. Microscopia dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum (A-D),
Fusarium solani (E-H), Fusarium laterithium (I-L) tratados com Sytox Green..........
35
FIGURA 8. Microscopia das células das leveduras C. parapsilosis (A-D), P.
membranifaciens (E-H), C. tropicalis (I-L) tratadas com Sytox Green......................
38
FIGURA 9. Microscopia das células das leveduras C. albicans (A-D), K.
marxiannus (E-H) e S. cerevisiae (I-L) tratadas com Sytox Green...........................
41
FIGURA 10. Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura S.
cerevisiae, na presença da defensina PvD1 de sementes de feijão comum obtida
após cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, nas várias concentrações
testadas. (A) 1 h de pré-incubação; (B) 2 h de pré-incubação; (C) 4 h de préincubação..................................................................................................................
43
FIGURA 11. Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura C.
albicans, na presença da defensina PvD1 isolada de sementes de feijão comum
obtida
após
cromatografia
em
coluna
DEAE-Sepharose,
nas
várias
concentrações testadas. (A) 1 h de pré-incubação; (B) 2 h de pré-incubação e (C)
4 h de pré-incubação................................................................................................
45
FIGURA 12. Microscopia das células da levedura C. albicans tratadas com o
corante 2’,7’ diclorofluoresceína diacetato.............................................................
46
ABREVIATURAS
ACN – Acetonitrila
AMP – Peptídeo antimicrobiano
BSA – Albumina bovina sérica
D1 – Pico não retido na cromatografia em coluna DEAE- Sepharose
D2 – Pico retido na cromatografia em coluna DEAE- Sepharose
Da – Dalton
DAD – Detector de arranjo de diodo
DAB – Diaminobenzidina
DAPI – 4,6 diamidino 2 fenilindol
DEAE – Dietilaminoetil
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA – Ensaio imunosorvente ligado à enzima
FITC – Isotiocianato fluoresceína
F/0-70 – Fração 0-70 obtida após fracionamento com sulfato de amônio 0-70%
H1 – Pico obtido em coluna de fase reversa
HPLC – Cromatografia líquida de alto desempenho
IC50 – Concentração de proteína necessária para de obter 50% de inibição do
crescimento da levedura
IgG – Imunoglobulina G
kDa – Quilodaltons
M – Marcador de massa molecular
nm – Nanômetro
PvD1 – Defensina 1 de Phaseolus vulgaris
TEMED – N, N, N’ ,N’ -tetrametiletilenodiamina
TFA – Ácido trifluoroacético
Tris – Tris-hidroximetil-aminometano
SDS – Dodecil sulfato de sódio
VrD1 – Defensina 1 de Vigna radiata
PhD1 e PhD2 – Defensinas 1 e 2 de Petunia hybrida,
PsD1 – Defensina de Pisum sativum
Rs-AFP2 – Defensina 2 de Raphanus sativus
NaD1 – Defensina 1 de Nicotiana alata
alfAFP – Defensina de Medicago sativa
Hs-AFP1 – Defensina 1 de Heuchera sanguinea
ROS – Espécies reativas de oxigênio
Bisacrilamida – N,N’-metileno bisacrilamida
PBS – Tampão fosfato salino
RESUMO
Nos últimos anos muitos trabalhos vêm demonstrando a função de algumas
proteínas e peptídeos com atividade antimicrobiana isolados de diferentes espécies
de plantas contra um vasto número de microrganismos, os quais vêm sendo
utilizados como modelo no estudo dos diferentes processos celulares relacionados à
ação destes peptídeos antimicrobianos. Em 2008, nosso grupo isolou e caracterizou
uma defensina de sementes de Phaseolus vulgaris (L.), denominada PvD1. O
objetivo deste trabalho estudar o mecanismo de ação e atividade antifúngica desta
defensina contra diferentes espécies de fungos filamentosos e leveduras.
Inicialmente, proteínas foram extraídas da farinha da semente em tampão fosfato pH
5,4 na proporção de 1:5 por duas horas sob constante agitação a 4 °C. O
sobrenadante obtido foi submetido a precipitação com sulfato de amônio (0-70%).
Este precipitado foi ressuspenso em água destilada e aquecido a 80 °C por 15 min.
A solução resultante foi centrifugada e o sobrenadante dialisado contra água
destilada e liofilizado. Uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAESepharose foi empregada inicialmente para a purificação da PvD1 a qual resultou
em dois diferentes picos denominados D1 e D2. O pico D1 contendo a PvD1, foi
submetido a uma cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em HPLC
confirmando sua pureza. Então, a fração D1 foi utilizada para a produção do
anticorpo contra PvD1 e também foram feitos testes antifúngicos com os fungos
filamentosos Fusarium oxysporum, F. solani e F. laterithium e foi possível observar
que a inibição foi mais acentuada na presença de 100 µg.mL-1 da PvD1. Foi
mostrado também que PvD1 é capaz de causar permeabilização de membrana tanto
nos fungos filamentosos testados quanto nas células das leveduras Candida
parapsilosis, Pichia membranifaciens,
marxiannus
C. tropicalis, C. albicans, Kluyveromyces
e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 também foi capaz de inibir a
acidificação do meio, estimulada por glicose por células das leveduras S. cerevisiae
e C. albicans bem como induzir também a produção de espécies reativas de
oxigênio em células de C. albicans.
ABSTRACT
In the last years studies have demonstrated the function of some proteins and
peptides with antimicrobial activity isolated from different plant species against an
extensive number of microorganisms, which have been used as a model in the study
of different cellular processes connected with the action of these antimicrobial
peptides. In 2008, our group isolated and characterized an defensin from Phaseolus
vulgaris seeds (L.), named PvD1. The aim of this study was to study the mechanism
of the action and the antifungal activity of the defensins against different species of
filamentous fungi and yeasts. Initially, the proteins from seed flour were extracted in
phosphate buffer pH 5.4 in the ratio 1:5, for two hours under constant agitation at 4
°C. The supernatant obtained was submitted to precipitation with ammonium sulfate
(0-70%). This precipitate was resuspended in distilled water and heated at 80 °C for
15 min. The resulting solution was centrifuged and the supernatant dialyzed against
distilled water and freeze dried. An ion exchange chromatography on a column of
DEAE-Sepharose was initially employed for the purification of the PvD1 which
resulting in two different peaks named D1 and D2. The peak D1 containing the PvD1,
was submitted to a C2C18 HPLC reverse phase column to assure its purity. Then,
D1 fraction used for production of the antibody against the defensin PvD1 and also
for antifungal tests were made with the filamentous fungi Fusarium oxysporum, F.
solani e F. laterithium and was possible to observe that the inhibition was more
accentuated in the presence of 100 µg.mL-1 of the PvD1. It was also shown that the
defensin PvD1 is capable of causing membrane permeabilization in filamentous fungi
and in yeast cells Candida parapsilosis, Pichia membranifaciens, C. tropicalis, C.
albicans, Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 was also
able to inhibit the acidification of the medium, stimulated with glucose by yeast cells
of S. cerevisiae e C. albicans, as well as to induce too production the reactive oxygen
species in the cells of C. albicans.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Peptídeos antimicrobianos
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são moléculas de baixa massa molecular
com uma vasta atividade inibitória contra vírus, bactérias e fungos (Izadpanah e
Gallo, 2005). Estes peptídeos pertencem a um grupo diverso e abundante de
moléculas que são produzidas por diversas células tanto em plantas quanto em
animais e, que são agrupados de acordo com a sua atividade antimicrobiana
intrínseca (Gallo et al., 2002; Brodgen, 2005).
Grande parte desses AMPs consistem em aproximadamente 50 resíduos de
aminoácidos, são anfipáticos e carregam uma carga líquida positiva em pH
fisiológico (Van’t Hof et al., 2001). Os AMPs foram agrupados em cinco classes
baseando-se em suas estruturas tridimensionais e sequências. O primeiro grupo é
constituído por AMPs que adotam conformação de α-hélice em ambientes
hidrofóbicos tais como a cecropina e a magainina. O segundo grupo encerra
peptídeos que tem estrutura secundária formada por folhas β como exemplificado
pela taquiplesina, tanatina e polifemusina. O terceiro grupo é rico no aminoácido
cisteína o qual está ligado entre si formando pontes dissulfeto e são representados
por vários peptídeos de plantas como as defensinas, tioninas, proteínas
transportadoras de lipídeos e quinotinas. O quarto grupo engloba peptídeos ricos em
aminoácidos regulares como a histidina (histatinas) e triptofano (indolicidinas). A
última classe é representada pelos peptídeos ricos em aminoácidos raros tais como
gramicidinas (Broekaert et al., 1997; Reddy et al., 2004).
Os AMPs são componentes importantes do sistema de defesa das plantas,
animais e humanos (Hancock e Scott, 2000; Thevissen et al., 2003a). Evidências
indicam
que
eles
atuam
na
permeabilização
da
membrana
celular
dos
microrganismos (Huang et al., 2000). Devido à capacidade que os AMPs possuem
de interagir com determinadas membranas celulares e, dessa forma, conferir uma
eficiente atividade antimicrobiana contra determinados agentes patogênicos, tem-se
observado nos últimos anos um grande interesse biológico em estudar esse grupo
de proteínas (Gallo et al., 2002).
A seleção de um número cada vez maior de microrganismos resistentes a
antibióticos e a outros agentes antimicrobianos tem despertado a atenção de muitos
pesquisadores na tentativa de se desenvolver novos agentes terapêuticos (Gallo et
al., 2002). O potencial terapêutico dos AMPs é valorizado graças à capacidade
destes compostos de matar rapidamente um grande número de microrganismos
incluindo bactérias, vírus e fungos que são multiresistentes a drogas.
1.2. Peptídeos antimicrobianos de plantas
As plantas, por serem organismos sésseis, estão constantemente expostas a
uma grande variedade de organismos potencialmente patogênicos, como vírus,
bactérias, micoplasmas, fungos, protozoários e nematódeos, e podem ainda ser
afetadas por diversos animais herbívoros e por condições ambientais adversas.
Sendo assim, sua sobrevivência nessas condições exige uma rápida resposta de
defesa (Castro e Fontes, 2005). Evolutivamente, todas as plantas desenvolveram
eficientes sistemas de defesa com a capacidade de reconhecer patógenos invasores
e agressores herbívoros e acionar o sistema de defesa (Castro e Fontes, 2005).
As defesas empregadas pela planta para sua proteção contra herbívoros e
patógenos são de múltipla ordem e de diversos tipos e, embora as plantas possam
sofrer danos de maior ou menor extensão, a enorme maioria sobrevive (Nürnberger
e Lipka, 2005).
Diversos mecanismos estão envolvidos na defesa de plantas contra seus
agressores seja pelo acúmulo de componentes fenólicos, de alcalóides, de
aminoácidos não protéicos, de glicosídeos ou de proteínas e peptídeos com
atividade antimicrobianas e inseticidas (Wittstock e Gershenzon, 2002; Castro e
Fontes, 2005).
Várias classes de proteínas de plantas têm sido implicadas nos mecanismos
de defesa de plantas contra patógenos e insetos, sejam estas induzidas ou
constitutivas. Dependendo de sua função durante a resposta de defesa, proteínas
envolvidas nesses processos podem atuar fortalecendo ou reparando a parede
celular ou modificando as propriedades da matriz extracelular. A grande maioria,
porém, atua diretamente sobre o patógeno ou herbívoro agressor (Shewry e Lucas,
1997; Carline e Grossi-de-Sá, 2002).
Muitos AMPs têm sido isolados de plantas, especialmente de sementes, local
em que podemos encontrá-los em nível elevado se comparado a outros órgãos da
planta (Broekaert et al., 1997; Wang et al., 2001; Sels et al., 2008). Nos últimos anos
nosso grupo, por exemplo, vem isolando e caracterizando diferentes proteínas e
AMPs presentes em sementes, os quais estão envolvidos nos mecanismos de
defesa de plantas. Até o momento Foram purificadas e caracterizadas uma
defensina e uma proteína transportadora de lipídeos (LTP) de sementes de feijãode-corda (Vigna. unguiculata) (Carvalho et al., 2001; Carvalho et al., 2004), uma
albumina 2S de sementes de maracujá amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa)
(Agizzio et al., 2003), uma LTP exsudada de sementes de feijão-de-corda (Diz et al.,
2003), um peptídeo com alta homologia à LTP isolado de sementes de pimenta
(Capsicumm annuum) (Diz et al., 2006) e um inibidor de proteinase isolado também
de sementes de pimenta (Ribeiro et al., 2007).
A expressão dos AMPs em plantas transgênicas pode ter aplicações na
proteção das plantas contra doenças (Kanzaki et al., 2002) e alguns AMPs estão
sendo desenvolvidos como novos antibióticos potenciais com aplicações médicas
(Hancock e Scott, 2000). No momento existe um forte interesse em se identificar os
processos celulares que determinam a susceptibilidade dos microrganismos aos
AMPs, devido à sua função no sistema de defesa natural e sua potencial aplicação
(Stephens et al., 2005).
Nos últimos anos, os pesquisadores vêm aumentando o interesse no estudo
das proteínas e dos peptídeos presentes em sementes de plantas, devido ao seu
forte papel antimicrobiano, dentre eles podemos citar: as tioninas, as heveínas, as
knotinas, as LTPs e as defensinas (Broekaert et al., 1997; Carvalho e Gomes, 2007,
Carvalho e Gomes, 2009).
1.3. Defensinas
As defensinas de plantas são peptídeos pequenos (45-54 resíduos de
aminoácidos), que apresentam peso molecular entre 5 e 8 kDa, altamente básicos,
ricos em cisteínas (oito resíduos) e que possuem atividade antifúngica e/ou
antimicrobiana em concentrações micromolares (Thevissen et al., 2003a; Carvalho e
Gomes, 2009). Estes peptídeos foram primeiramente isolados a partir de sementes
de trigo e cevada em 1990 (Colilla et al., 1990). Estes são ativos contra várias
classes de fungos fitopatogênicos e patógenos humanos, como por exemplo,
Candida albicans (Thevissen et al., 2003a).
Inicialmente, estas defensinas foram consideradas como um novo subgrupo
das tioninas, sendo então chamadas γ-tioninas (Terras et al., 1995) por
apresentarem a mesma massa molecular, mas sua conformação estrutural disposta
em três folhas β antiparalelas e uma α-hélice estabilizada por quatro pontes
dissulfeto, as diferenciavam das tioninas estruturalmente (Broekaert et al., 1997;
Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002); Thevissen et al., 2003a; Thevissen et al.,
2004.
Alguns anos depois, devido a sua similaridade estrutural com defensinas de
insetos e mamíferos, γ-tinionas foram renomeadas como defensinas de plantas
(Terras et al., 1995).
1.3.1. Aspectos estruturais
Estudos da estrutura tridimensional de defensinas encontradas em diferentes
espécies de plantas revelaram que estas moléculas são bastante semelhantes entre
si (Almeida et al., 2002). De um modo geral, a estrutura das defensinas de plantas é
composta por três folhas β e uma α-hélice, sendo estes elementos da estrutura
secundária, conectados através de três alças. A estrutura das defensinas de plantas
é estabilizada por quatro pontes dissulfeto (Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002;
Carvalho e Gomes, 2009) (Figura 1A). Duas dessas pontes são formadas entre as
Cys21 da α-hélice e Cys45 da última folha β e entre a Cys25 da α-hélice e Cys47 da
última folha β formando um arranjo estrutural denominado de domínio αβ
estabilizado por cisteínas, característico de peptídeos com atividade antimicrobiana
(Cornet et al., 1995; Fant et al., 1998; Thomma et al., 2002).
Embora exista uma grande similaridade entre as estruturas das defensinas de
plantas, recentemente foram descritas algumas defensinas que possuem estruturas
diferenciadas. A defensina 1 de feijão (Vigna radiata),VrD1 (Liu et al., 2006),
apresenta em sua estrutura uma hélice extra denominada hélice 310 (Figura 1B).
Além desta, as defensinas isoladas de flores de Petunia hybrida, PhD1 e PhD2,
apresentam em sua estrutura 5 pontes dissulfeto (Janssen et al., 2003; Lay et al.,
2003a; Lay et al., 2003b) (Figura 1C). Mesmo com estas diferenças estruturais,
estas defensinas continuam apresentando o domínio αβ estabilizado por Cys. A
Figura 1 mostra os três tipos de estrutura descritos para as defensinas de plantas.
A
C
B
α1
β2
β3
β1
Figura 1. Comparação entre estruturas elucidadas de diferentes defensinas de plantas. A Estrutura da defensina PsD1 de ervilha (Pisum sativum) (Almeida et al., 2002); B - Estrutura
da defensina VrD1 de feijão (Vigna radiata) (Liu et al., 2006); C - Estrutura da defensina
PhD1 de Petunia hybrida (Janssen et al., 2003). (N) Região N-terminal; (C) região Cterminal; (α1) α-hélice; (β1) folha β 1; (β2) folha β 2; (β3) folha β 3; (310) α-hélice 310.
1.3.2. Atividades descritas in vitro para as defensinas de planta
As defensinas de planta apresentam diversas funções biológicas que incluem
atividade antifúngica (Broekaert et al., 1997; García-Olmedo et al., 1998; Carvalho et
al., 2001; Thomma et al., 2002; Thevissen et al., 2003b; Games et al., 2008), inibição
de amilases do intestino de insetos (Bloch e Richardson, 1991; Liu et al., 2006;
Pelegrini et al., 2008;) e tripsina bovina (Wijaya et al., 2000), inibição de síntese de
proteínas (Colilla et al., 1990; Chen et al., 2002; Wong et al., 2006), atividade
antibacteriana (Moreno et al., 1994; Osborn et al., 1995;) e bloqueio de canais de
sódio (Kushmerick et al., 1998; Spelbrink et al., 2004).
Na literatura, foi visto que defensinas encontradas em plantas desempenham
um papel importante na proteção dos tecidos de plantas jovens durante os primeiros
estágios de emergência (Terras et al., 1995). A expressão das defensinas nos vários
tecidos das diferentes espécies de plantas, como nabo (Brassica campestris) (Park
et al., 2002), ervilha (P. sativum) (Almeida et al., 2002), fumo de jardim (Nicotiana
alata) (Lay et al., 2003a), rabanete (Raphanus sativus) (Terras et al., 1995), tomate
(Lycopersicon esculentum) (Brandstadter et al., 1996) e Arabidopsis thaliana
(Penninckx et al., 1996; Thomma et al., 2002) tem sido estudada e, observa-se que
não estão presentes somente nas sementes mas também nas camadas celulares
periféricas das frutas e dos órgãos florais. Esta localização periférica está
relacionada com a função de proteção dos órgãos contra os ataques microbianos
(Thevissen et al., 2003a).
Estudos de imunomarcação revelaram que defensinas estavam localizadas
na parede celular, nos espaços extracelulares do cotilédone e no tegumento deste
órgão. Essa localização seria adequada a um componente do sistema de defesa que
estaria presente nas regiões onde ocorrem os primeiros contatos entre fungos e a
semente e com a velocidade necessária para que esta proteína fosse exsudada. Isto
sugere que estes peptídeos possam contribuir para o controle de doenças fúngicas
do solo (Terras et al., 1995). Algumas defensinas são sistemicamente induzidas sob
infecção fúngica ou ferimentos de tecidos vegetativos em diferentes espécies de
plantas, como por exemplo, ervilha (P. sativum), batata (Solanum tuberosum),
rabanete (R. sativum), Arabidopsis thaliana entre outras (Thevissen et al., 2003a).
Confirmando definitivamente a participação das defensinas na defesa de
plantas, Terras et al. (1995) introduziram o gene que codifica a defensina de R.
sativum, Rs-AFP2, em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum). Por comparação do
número e da área das lesões causadas pelo fungo Alternaria longipes, verificou-se
que nas plantas transformadas, as áreas de lesão foram de sete a oito vezes
menores que nas plantas controles. Este estudo, além de confirmar a participação
das defensinas na defesa de plantas, forneceu indícios do possível potencial
biotecnológico destas moléculas.
1.3.3. Atividade antimicrobiana das defensinas de planta
A atividade antimicrobiana das defensinas de planta é principalmente
observada contra fungos. Diversas espécies de fungos têm o crescimento inibido e
entre eles estão vários patógenos de plantas (Tabela 1) (Terras et al., 1992; Terras
et al., 1993; Osborn et al., 1995). A concentração inibitória varia muito e é
dependente do fungo testado; por exemplo, Fusarium culmorum é inibido pela
defensina de castanheiro-da-Índia (Aesculus hippocastanum), Ah-AMP1, com 12
µg.mL-1 (IC50) e por RS AFP2 com 1,5 µg.mL-1 (IC50) (Tabela 1). A atividade inibitória
contra bactérias é bem menos pronunciada e é observada de um modo geral apenas
contra bactérias Gram-positivas (Carvalho e Gomes, 2009). No entanto, alguns
autores têm demonstrado a atividade das defensinas de plantas sobre bactérias
Gram- negativas, sendo descrito por Terras et al. (1993). Mais recentemente, Franco
et al. (2006) isolaram a partir de sementes de feijão (V. unguiculata) a Cp-tionina II,
uma defensina (γ-tionina) que possui atividade contra bactérias Gram-positivas e
negativas.
Estudos também foram realizados mostrando a atividade antimicrobiana de
uma defensina isolada de fumo de jardim (N. alata), denominada NaD1, sobre o
crescimento de fungos filamentosos como Fusarium oxysporum, Thielaviopsis
basicola, Verticillium dahliae, Leptosphaeria maculans e Aspergillus nidulans. Na
concentração de 1 µM de NaD1, foi observada a inibição de 50% do crescimento
dos fungos F. oxysporum e L. maculans e 65% dos fungos V. dahliae, T. basicola e
A. nidulans. Já na concentração de 5 µM de NaD1, o crescimento de todos os
fungos filamentosos testados, apresentou mais do que 90% de inibição (Van der
Weerden et al., 2008). Foi demonstrado também que defensina isolada de sementes
de alfafa (Medicago sativa), denominada alfAFP, possui uma forte atividade contra o
patógeno fúngico de grande importância agronômica V. dahliae. Esta defensina,
alfAFP, foi capaz de inibir o crescimento de esporos pré-germinados em 50% numa
concentração de 5 µg.mL-1 e 100% para 15 µg.mL-1. Além deste fungo, esta também
foi capaz de inibir outros patógenos fúngicos como Alternaria solani e F. culmorum
(Gao et al., 2000).
Em 2001, Carvalho et al. relataram a presença de uma defensina em
sementes de feijão-de-corda que, atuando em sinergismo com uma LTP, inibia o
crescimento de fitopatógenos fúngicos de importância econômica.
Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa mostrou que uma defensina
isolada de sementes de Phaseolus vulgaris, inibiu fortemente o crescimento das
leveduras C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, Pichia membranifaciens,
Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 também apresentou
uma atividade inibitória contra o crescimento de fungos fitopatogênicos como
Fusarium solani, F. laterithium e F. oxysporum.
25*
0,5*
*
12
0,5*
6*
>*1
*
0,5
6*
-
20*
6*
*
10
*
6
20*
>*1*
*
2
2*
-
Ct 1 Dm1 Dm2
12*
3*
*
5
1,5*
2*
>*1*
*
1
4*
-
10*
3*
*
3
1*
2*
>*1*
*
1
2*
-
DEFENSINAS
µg.mL-1 (IC50)
Hs1 Rs1 Rs2 Br1
6*
1*
*
1
25*
1*
15*
*
0,5
12*
-
8#
#
5
#
15
30#
#
0,3
#
5
3+
#
sa
10*
3*
*
1,5
*
12
1,5*
30*
*
1,5
12*
#
2
2#
#
0,4
1,5#
25+
#
sa
1,5#
#
1,2
#
3
1,8#
#
0,25
#
0,8
#
sa
100*
sa#
#
sa
sa#
15*
sa#
#
sa
sa#
150*
sa#
#
sa
sa#
-
>*2#
>*2#
#
>*2
>*2#
sa
sa#
-
#
>*2#
>*2#
#
>*2
>*2#
sa
sa#
-
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
-
#
>*2
-
sa#
#
sa
sa #
#
sa
sa#
-
sa#
-
-
MICRORGANISMOS
Fungos
Botrytis cinerea
Cladosporium sphaerospermum
Fusarium culmorum
Leptosphaeria maculans
Penicillium digitatum
Trichoderma viride
Septoria tritici
Verticilium albo-atrum
Alternaria brassicola
Fusarium oxysporum lycorpesici
Pericularia oryzae
Verticilium dahlae
Phythophtora infestans
Saccharomyces cerevisiae
Bactérias Gram +
Bacilus megaterium
Sarcina lutea
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Microcous luteus
Streptococcus faaecalis
Bactérias Gram Agrobacterium tumefaciens
Alcalignes eutrophus
Azospirillum brasilenses
Escherichia coli
Erwinia carotovora
Pseudomonas solanacearum
Proteus vulgaris
Ah1
sa#
#
Br2 At1
>*1# 3,9#
#
#
38
3
#
#
75
10
#
#
42
3
#
#
3
0,25
#
#
15
1,5
#
#
sa
sa
#
Bn1
2#
#
2,8
#
0,6
1,3#
#
0,35
#
1,2
#
sa
Bn2
2#
#
2,1
#
1,2
1,5#
#
0,25
#
1
#
sa
#
-
52
sa#
-
sa
sa#
-
sa #
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
sa#
#
sa
-
-
-
-
Tabela 1. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras, oomicetos e
bactérias. Os valores são mostrados em concentrações expressas em µg.mL-1 necessárias
para se obter 50% da inibição do crescimento do fungo (IC50). (-), atividade não determinada;
sa, atividade inibitória acima de 500 µg.mL-1; >*1, atividade acima de 100 µg.mL-1; >*2,
atividade acima de 200 µg.mL-1; Ah, Aesculus hippocastanum; At, Arabidopsis thaliana; Bn,
Brassica napus; Br, Brassica rapa; Ct, Clitorea ternatea; Dm, Dahlia merckii; Hs, Heuchera
sanguinea; Rs, Raphanus sativus; +, dados obtidos de Terras et al. (1992); #, de Terras et al.
(1993); *, de Osborn et al. (1995). Fonte: Adaptado de Carvalho, 2005.
1.3.4. Mecanismos de ação das defensinas de plantas
Diferentes estudos têm sido feitos no sentido de se desvendar o mecanismo de
ação das defensinas de plantas, porém este ainda não foi totalmente elucidado. Em
relação ao seu modo de ação, foi mostrado que a defensina 1 de D. merckii, DmAMP1, e Rs-AFP2 induzem uma variedade de rápidas respostas na membrana fúngica
como alterações na permeabilização da membrana plasmática resultando na entrada
de Ca+2 e no efluxo de K+ e mudanças no potencial de membrana. Estes resultados
sugerem a interação das defensinas de plantas com a membrana fúngica (Thevissen
et al., 1996; Thevissen et al., 1999; Thevissen et al., 2003b). A membrana plasmática
dos fungos apresenta fosfoglicerolipídeos principalmente no seu lado interno e esteróis
e esfingolipídeos no lado externo. Tem sido mostrado que os esfingolipídeos e os
esteróis são enriquecidos em domínios específicos, os chamados “rafts lipídicos”. A
interação de Dm-AMP1 com estes “rafts” resultam na ação dessa defensina, ligada a
estes componentes de membrana (Schneiter et al., 1999).
Thevissen et al. (2004) estudando mais especificamente os sítios de ligação
das defensinas de plantas Dm-AMP1 e Rs-AFP2 na membrana de fungos,
identificaram e caracterizaram certos grupos de esfingolipídeos. Eles descobriram
que a sensibilidade antifúngica a Dm-AMP1 está relacionada ao nível de
manosildiinositolfosforilceramida na membrana da levedura, mostrando o papel do
complexo de esfingolipídeos/defensina na atividade antifúngica de Dm-AMP1
(Thevissen et al., 2004). Assim, sugere-se que as defensinas de plantas têm, além
de um receptor, um sítio específico de interação com a membrana.
Estudos semelhantes também foram realizados utilizando a defensina RsAFP2. Em 2003a, Thevissen et al. mostraram que Rs-AFP2 interage com
glicosilceramidas presentes na membrana fúngica e que esta defensina não é capaz
de se ligar às glicosilceramidas presentes nas células de humanos e soja. Segundo
estes autores, isto acontece devido ao fato da ceramida encontrada nestas células
serem estruturalmente diferentes. Os dados acima relatados nos dão indícios de que
as defensinas de plantas podem atuar sobre microrganismos também de uma
maneira específica. Além da estrutura dos lipídeos que constituem a membrana, a
composição lipídica da mesma parece determinar a susceptibilidade e/ou resistência
às defensinas de plantas. Ferket et al. (2003) demonstraram que mutantes do fungo
Neurospora crassa com maiores quantidades de esteril-glicosil (ergosterol-β-Dglicopiranosideo) em sua membrana eram resistente às defensinas Rs-AFP2, Dm-
AMP1 e Hs-AFP1 (defensina de H. sanguinea). Adicionalmente, Thevissen et al.
(2007) mostraram que as defensinas Hs-AFP1 e Rs-AFP2 eram capazes de inibir o
crescimento de Candida albicans e C. krusei, mas não de C. glabrata e atribuem
estes dados ao fato de que C. glabrata não sintetiza glicosilceramidas (possível
receptor para Rs-AFP2). Da mesma forma, Medeiros et al. (2009) mostraram que
cepas de C. albicans mutantes (∆GCS1), que também eram incapazes de sintetizar
glicosilceramidas, eram mais resistentes à Psd1.
Recentemente, Aerts et al. (2007) demonstraram que Rs-AFP2 induz a
produção endógena de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C.
albicans e que tanto esta produção de ROS quanto a atividade antifúngica
desaparece na presença do antioxidante ácido ascórbico, o que sugere uma ligação
causal entre a atividade antifúngica de Rs-AFP2 e a produção de ROS por ela
mediada. Estes autores sugerem ainda que, a permeabilização da membrana é
consequência de uma sinalização intracelular gerada pela ligação de Rs-AFP2 com
as glicosilceramidas da membrana e não simplesmente a ação direta deste peptídeo
na membrana através de sua interação com este esfingolipídeo.
Até agora, não está claro se as defensinas de plantas acima citadas são
internalizadas
pelas
células
fúngicas
através
de
sua
interação
com
os
esfingolipídeos de membrana, ou se elas se mantêm do lado de fora da célula e
modulam processos que levam a morte celular, como por exemplo, produção de
ROS e apoptose, via interação com os esfingolipídeos de membrana. Porém
recentes estudos têm investigado um novo mecanismo de ação intracelular das
defensinas, usando Psd1. Um sistema duplo híbrido foi usado para identificar
interações proteína-proteína entre Psd1 e as proteínas fúngicas. Proteínas alvo
foram analisadas dentro do cDNA do fungo N. crassa. Um clone apresentou
sequência similar à da ciclina F, que é uma proteína que está envolvida no ciclo
celular. Análises por microscopia de fluorescência de Psd1 conjugado com
Isotiocianato fluoresceína (FITC) e do coramento do fungo com 4,6 diamidino 2
fenilindol (DAPI) mostraram a colocalização, in vivo, do peptídeo de planta Psd1 no
núcleo. Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação da defensina de planta
Psd1, pode envolver também alvos nucleares (Lobo et al., 2007).
1.4. Leveduras
As
leveduras
são
fungos
que
se
diferenciam
por
apresentarem
predominantemente sob a forma unicelular, se reproduzem comumente por
brotamento e não possuem hifas ascogênicas e ascocarpos. Algumas podem ser
encontradas no solo, água, esgoto e até no trato digestivo de mamíferos
(Alexopoulos et al., 1996). Sua parede é composta predominantemente por
polissacarídeos, mas especificamente
mananos,
β-1,3
e
β-1,6-glucanos e
quantidades menores de quitina, sendo esta encontrada principalmente nas
cicatrizes do broto (Baladrón et al., 2002). Dentre os eucariotos, as leveduras foram
os primeiros organismos a terem seu mapa genético completamente seqüenciado
(Goffeau et al., 1996).
Diversas espécies de leveduras, como por exemplo, as pertencentes ao
gênero Candida, podem causar severas infecções sistêmicas em pacientes
imunocomprometidos, incluindo aqueles que são submetidos à quimioterapia no
tratamento de câncer, em pessoas diabéticas e em crianças prematuras (Isola et al.,
2009). Além disso, podem também provocar infecções localizadas ou disseminadas
como candidíase, meningite, infecções no sangue, entre outras (Alexopoulos et al.,
1996). Algumas leveduras são consideradas patógenos facultativos como, por
exemplo, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata (Kwon-Chung e Bennett, 1992).
Quanto à forma destas leveduras podemos destacar as várias espécies
patogênicas dimórficas existentes. Estas possuem uma capacidade reversível de
transição entre as formas leveduriforme e filamentosa, uma importante característica
que está diretamente relacionada à virulência destas leveduras durante o processo
de invasão do hospedeiro (Gow et al., 2002).
1.5. Fungos filamentosos
Os
fungos
filamentosos
são
organismos
eucarióticos,
heterotróficos
possuindo uma parede celular predominantemente constituída de quitina e glucanos,
os quais encontram-se embebidos numa matriz de polissacarídeos e glicoproteínas.
São organismos multinucleares possuindo como elemento constituinte básico a hifa,
que pode ser septada ou não septada e é a partir da hifa que serão formados os
esporos, para que haja a propagação das espécies (Alexopoulos et al., 1996).
Alguns fungos filamentosos podem ser saprofíticos obtendo sua nutrição por
absorção de nutrientes de organismos mortos, atuando como importantes
decompositores, além do grupo dos fitopatogênicos que são redutores de enzimas
que atacam polímeros das paredes de plantas (Agrios, 2005).
Os fungos filamentosos são importantes agentes fitopatogênicos, podendo ser
os principais causadores de doenças de plantas, agindo como parasitas obrigatórios
ou facultativos (Gurgel et al., 2005)
Na tentativa de colonizar as plantas, os fungos desenvolveram diferentes
mecanismos para invadir o tecido, aperfeiçoar o crescimento e se propagar. Alguns
microrganismos oportunistas precisam de alguma abertura natural ou ferimento para
que ocorra o processo de infecção e colonização de plantas, no entanto os fungos
patogênicos possuem mecanismos e estruturas capazes de romper as células da
planta e assim penetram as suas estruturas externas como, por exemplo, a cutícula
(Agrios, 2005).
1.6. Feijão Comum (Phaseolus vulgaris)
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) foi originalmente cultivado no Novo
Mundo, mas é agora cultivado extensivamente em todas as maiores áreas
continentais (Graham et al., 1997). É um componente principal na dieta, e
consequentemente, a fonte de proteína de mais de 300 milhões de pessoas na
América Latina e África Ocidental e do Sul (Kaschuk et al., 2005).
O feijão comum é membro da família Leguminosae, tribo Phaseoleae,
subfamília Papilionoideae (Debouck et al., 1991; Graham et al., 1997). Existem cerca
de 55 espécies conhecidas do gênero Phaseolus, porém as quatro espécies mais
cultivadas são: P. vulgaris L., P. coccineus L., P. lunatus L. e P. polyanthus. O feijão
comum (P. vulgaris L.) é o mais importante, por ser a espécie cultivada mais antiga e
mais utilizada nos cinco continentes (Aidar et al., 2003).
Este é um dos principais componentes da dieta alimentar brasileira,
constituindo uma das mais importantes fontes de proteína. Além do seu conteúdo
protéico, o elevado teor de ferro e fibra alimentar, com seus reconhecidos efeitos
hipocolesterolêmico e hipoglicêmico, aliado às vitaminas, especialmente do
complexo B, e aos carboidratos, tornam o seu consumo altamente vantajoso como
alimento funcional (Aidar et al., 2003). É também rico em vitaminas, carboidratos e
minerais. O consumo das sementes secas tem reduzido o risco de diabetes,
obesidade (Geil et al., 1994), doenças do coração e câncer de cólon (Anderson et
al., 1984).
O feijoeiro comum é hospedeiro de inúmeras doenças causadas por vírus,
bactérias, fungos e nematóides. Entre as principais doenças fúngicas, encontram-se
a antracnose, a mancha-angular, a ferrugem, o oídio e a mancha-de-alternária, além
de outra recentemente identificada nessa cultura e denominada de sarna. Todas são
determinadas como doenças da parte aérea do feijoeiro comum (Sartorato et al.,
2006). Já entre as doenças do solo, encontram-se o mofo-branco, a mela, a
podridão-radicular-de-rizoctonia, podridão-radicular-seca, a murcha-de-fusário e a
podridão-cinzenta-do-caule (Graham, 1997; Sartorato et al., 2006). De um modo
geral, essas doenças podem ser disseminadas à longa distância pelas sementes
infectadas e por correntes aéreas. À curta distância, essas doenças são
disseminadas pelas sementes infectadas, vento, chuvas, insetos, animais, partículas
de solo aderidas aos implementos agrícolas, água de irrigação e pelo movimento do
homem (Sartorato et al., 2006).
Ainda não se conhecem os mecanismos de resistência de plantas a várias
doenças fúngicas. O esclarecimento desses mecanismos é uma etapa fundamental
para o desenvolvimento de métodos de controle adequados, bem como para a
compreensão da interação entre patógeno e hospedeiro
2. OBJETIVOS
2.1 – Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo geral estudar o mecanismo de ação e a
atividade antifúngica da defensina PvD1 isolada a partir de sementes de feijão
comum (Phaseolus vulgaris – cultivar Pérola).
2.2 – Objetivos específicos
1- Isolar em grande quantidade a defensina PvD1 de sementes de feijão
comum;
2- Estabelecer uma metodologia para a produção de anticorpos policlonais
contra a defensina isolada;
3- Estudar o efeito da defensina isolada PvD1 sobre a inibição do crescimento de
fungos filamentosos em meio líquido;
4- Analisar o efeito da defensina PvD1 isolada de sementes de feijão comum sobre
a permeabilização de membranas de fungos filamentosos e leveduras;
5- Analisar o efeito da defensina PvD1 sobre a inibição da acidificação do meio
estimulado por glicose, em células de leveduras;
6- Analisar o efeito da defensina isolada PvD1 sobre a indução da produção
endógena de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C.
albicans.
3. MATERIAIS
3.1 - Material biológico
3.1.1 - Sementes
Sementes de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) cultivar Pérola foram cedidas
pela Profa. Rosana Rodrigues do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal,
do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, da Universidade Estadual do
Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.
3.1.2 - Microrganismos
As
espécies
de
leveduras
Candida
parapsilosis
(CE002),
Pichia
membranifaciens (CE015), Candida tropicalis (CE017), Candida albicans (CE022),
Kluyveromyces marxiannus (CE025) e Saccharomyces cerevisiae (1038) foram
cedidas pela Profª. Vânia Maria Maciel de Melo do Laboratório de Microbiologia da
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil e os fungos filamentosos
Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium laterithium foram cultivados e
conservados juntamente com as cepas de leveduras no Laboratório de Fisiologia e
Bioquímica de Microrganismos, do Centro de Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, Campos dos
Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.
3.1.3 – Coelho
Coelhos da linhagem Nova Zelândia foram adquiridos comercialmente e
mantidos em biotério na UENF.
3.2 – Reagentes e outros materiais
- Reagentes para extração de proteínas de sementes
NaH2PO4, Na2HPO4, KCl, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e (NH4)2SO4
foram obtidos da Merck S/A e Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- Proteínas
Albumina sérica bovina (BSA) foi obtida da Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- Materiais e reagentes para cromatografias
A resina de DEAE-Sepharose e a coluna C2C18 foram adquiridas da GE
Healthcare e Shimadzu Co., respectivamente.
O Tris-hidroximetil-aminometano (Tris) e o NaCl utilizados foram obtidos da
Sigma Co, St Louis, U.S.A. e para C2/18 foram utilizados ácido trifluoroacético
(TFA) obtidos da Sigma Co, St Louis, U. S. A. e acetonitrila (ACN) obtida da Merck
S/A.
- Material para diálise
Membranas de celulose que retém moléculas de massa molecular acima de
1.000 Da foram adquiridas da Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- Materiais para eletroforese
Acrilamida, N,N’ metileno bisacrilamida (bisacrilamida), dodecil sulfato de sódio
(SDS), β-mercaptoetanol, azul de bromofenol, persulfato de amônio, Tris-base, N,
N, N’ ,N’ -tetrametiletilenodiamina (TEMED), tricina, glicerol e marcadores de peso
molecular foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A. Foram utilizados os
seguintes marcadores de massa molecular: mioglobina (16.950 Da), mioglobina I +
II (14.400 Da), mioglobina I + III (10.600 Da), mioglobina I (8.160 Da), mioglobina II
(6.200 Da), glucagon (3.400 Da) e mioglobina III (2.500 Da).
- Materiais para eletrotransferência e Western Blotting
Anticorpos anti-IgG de coelho conjugado com peroxidade, diaminobenzidina
(DAB) foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A e membranas de
nitrocelulose foram adquiridas da MFS (Micro Filtration System).
- Reagentes para a purificação de IgG
Acetato de sódio, ácido caprílico e (NH4)2SO4 foram obtidos da Merck S/A e
Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- Reagentes para quantificação de proteínas
O “Comassie brilliant blue G” foi obtido da Sigma Co, St Louis, U.S.A. O ácido
orto-fosfórico e o etanol foram obtidos da Merck S/A indústrias químicas. O ácido
bicinconínico foi adquirido da Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- Meios de cultura
Caldo Sabouraud e Agar Sabouraud foram adquiridos da Merck S/A Indústrias
Químicas.
- Reagentes usados para ensaios antifúngicos e acidificação
Glicose, NaH2PO4 e NaCl foram adquiridos da Sigma Co, St. Louis, U. S. A. e da
Merck S/A indústrias químicas.
- Corante usado para ensaios de permeabilização de membranas de fungos
filamentosos e leveduras
SYTOX Green foi adquirido da Molecular Probes Invitrogen
- Corante usado para ensaio de produção de ROS em células de levedura
2’ 7’- Diclorofluoresceína Diacetato foi adquirido da Calbiochem
- Outros reagentes
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e adquiridos
comercialmente.
3.3 - INSTRUMENTAL
EQUIPAMENTOS
MARCA
MODELO
Autoclave
Fabre Primar
103.02
Balança
Sartorius
2100
Balança
Sartorius
110S
Banho Maria
FANEM
102
Bomba Peristáltica
Pharmacia
P1
Coletor de Frações
Pharmacia
RediFrac
lâmpada germicida
VECO
VLFS 12
Célula de transferência
Bio-Rad
Trans-blot SD, Semi-dry
Capela de Fluxo laminar vertical com
Blotting System
Centrífuga
Hitachi
Himac CR 21
Environ Shaker
Lab-line
3527
Estufa
QUIMIS
Q316.14
Espectrofotômetro
SHIMADZU
UV VIS 1230
HPLC
SHIMADSU
Prominence
Leitor de ELISA
DYNATECH
MR 500
Liofilizador
Labconco
Freeze dry system/freezon 4.5
Microcentrífuga não refrigerada
Eppendorf
5415C
Microscópio óptico
ausJENA
JENAMED2
Microscópio óptico
Zeiss
Axioplan
pHmetro
QUIMIS
400-A
Placa agitadora/aquecedora
CORNING
PC 220
Sistema para eletroforese
Biorad
150A - gel Eletrophoresis cell
4. MÉTODOS
4.1 - Extração e purificação da defensina PvD1 de Phaseolus vulgaris
4.1.1 - Extração protéica das sementes
As sementes de feijão comum foram descascadas e trituradas com um
processador de alimentos até a formação de uma farinha bem fina. A farinha obtida
foi extraída em tampão fosfato (Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 15 mM, KCl 100 mM,
EDTA 1,5%) pH 5,4 na proporção de 1:5 (farinha:tampão de extração) sob agitação
constante por 2 h a 4 ºC, segundo a metodologia desenvolvida por Games et al.
(2008) (Esquema 1). Após homogeneização, o extrato bruto foi submetido à
centrifugação a 15.000 x g por 20 min a 4 ºC e o sobrenadante resultante foi
submetido à precipitação com sulfato de amônio a 70% de saturação e deixado a 4
ºC por 16 h. O precipitado resultante, obtido após nova centrifugação a 15.000 x g
por 20 min a 4 ºC, foi ressuspenso em 10 mL de água destilada e aquecido a 80 ºC
por 15 min e em seguida centrifugado a 10.000 x g por 8 min a 4 ºC. O precipitado
resultante desta última centrifugação foi descartado e o sobrenadante dialisado
durante três dias, contra água destilada e em seguida liofilizado para posterior
purificação dos peptídeos. Esta amostra, chamada ao final do processo de fração 070 (F/0-70), foi armazenada a -20 ºC e usada posteriormente para a purificação dos
peptídeos.
Homogeneizado
- 2 h a 4 °C sob agitação em tampão fosfato pH 5,4
- centrifugação 15.000 x g – 20 min
resíduo
sobrenadante
- adicionado sulfato de amônio
a 70% de saturação
- 16 h a 4 ºC
- centrifugação (15.000 x g – 20 min)
precipitado
sobrenadante
(ressuspendido em água destilada)
aquecimento a 80 ºC por 15 min
- centrifugação (10.000 x g – 8 min)
precipitado
sobrenadante
diálise e liofilização
(F/0-70)
Esquema 1 – Fracionamento com sulfato de amônio do homogeneizado obtido a partir da
extração da farinha das sementes de feijão comum (Games et al., 2008).
4.1.2- Cromatografia de troca iônica (DEAE–Sepharose)
Para a purificação da PvD1 foi inicialmente usada uma coluna de troca iônica,
DEAE-Sepharose, com 100 mL de resina. Esta foi montada sob a ação da gravidade
e depois da resina estar devidamente empacotada e foi lavada com 350 mL de
água. Em seguida passado aproximadamente 250 mL de hidróxido de sódio 0,1 M,
novamente foi passado 350 mL água e depois 250 mL de ácido clorídrico 0,1 M.
Posteriormente com a resina devidamente ativada foi passado o tampão de
equilíbrio, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, deixando a coluna preparada para o uso. A
amostra aplicada na coluna foi preparada da seguinte forma: 50 mg da F/0-70 foram
pesados e dissolvidos em 5 mL de tampão de equilíbrio e depois centrifugado a
16.000 x g por 3 min à temperatura ambiente e o sobrenadante aplicado sobre a
resina. A amostra foi eluída primeiramente no tampão de equilíbrio e em seguida em
um tampão Tris-HCl adicionado de NaCl na concentração de 1 M. Foram coletados
frações de 3 mL em 50 tubos em um fluxo de 60 mL.h-1. As absorbâncias das
frações foram lidas em um espectrofotômetro a 280 nm. O pico D1 obtido nesta
cromatografia foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 em
HPLC (Games et al., 2008).
4.1.3 - Cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em HLPC
Uma coluna de fase reversa C2C18 equilibrada com 0,1% de ácido
trifluoroacético (TFA) foi empregada sequencialmente no processo de isolamento da
defensina de sementes de feijão comum. O pico D1 não retido, oriundo da
cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose, foi solubilizado em
TFA 0,1% e 500 µL desta mistura foram injetados na coluna de fase reversa. A
cromatografia foi desenvolvida utilizando-se um fluxo de 0,5 mL.min-1, a temperatura
de 32 oC em sistema de HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi utilizado
um gradiente de acetonitrila (ACN) de 0 a 80%. Inicialmente (10 primeiros minutos) a
coluna foi lavada com TFA 0,1% em água ultrapura (solvente A), e em seguida um
gradiente foi sendo formado através da mistura do solvente A e 80% de acetonitrila
em TFA 0,1 % (solvente B) por cerca de 48 min. Após esse período a coluna foi
lavada com 100% do solvente B totalizando 60 min. A eluição da coluna foi
acompanhada por um detector de arranjo de diodo (DAD), sendo as absorbâncias
lidas a 220 nm (Games et al., 2008).
4.2 - Quantificação de proteínas
As determinações quantitativas de proteínas foram feitas pelo método de
Bradford (1976) sendo a BSA utilizada como padrão.
4.3 - Eletroforese em gel de Tricina na presença de SDS
A eletroforese em gel de tricina foi feita segundo metodologia de Schägger e
Von Jagow (1987). Foram usadas placas de vidro de 7 x 10 cm e 8 x 10 cm e
espaçadores de 0,5 mm. O gel de separação foi preparado numa concentração de
16,4% de acrilamida/bis-acrilamida e o gel de concentração numa concentração de
3,9%.
A F/0-70 e as frações protéicas obtidas na cromatografia de troca iônica,
DEAE-Sepharose, foram concentradas por liofilização e, em seguida, pesadas e
ressuspensas em tampão de amostra (Tris 0,125 M, SDS 2,5%, azul de bromofenol
0,25%, β-mercaptoetanol 5% e sacarose 15%). Estas foram aquecidas por 5 min a
100 ºC e centrifugadas a 16.000 x g por 2 min. Após este tratamento 20 µL das
amostras foram aplicadas no gel de concentração. A corrida foi feita a uma voltagem
constante de 20 V por um período de aproximadamente 16 h.
4.3.1 - Coramento e descoramento do gel
Após o término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas e
colocado na solução corante (Comassie Blue R 0,05%, ácido acético 70% e metanol
40%) por duas horas e após esse período, o gel foi transferido para uma solução
descorante (metanol 40% e ácido acético 7%) e mantido até a visualização das
bandas de proteína.
4.4 - Produção de anticorpo e Western blotting
4.4.1 – Obtenção do soro pré-imune e imunização
Primeiramente, foi obtido soro pré-imune a partir da sangria do coelho antes
da inoculação do peptídeo de interesse. Esta sangria consiste de um corte na
extremidade da orelha do animal com o auxílio de uma lâmina. Foram, então
coletados 4 mL de sangue em um béquer, deixados por 30 min em temperatura
ambiente, e posteriormente, por aproximadamente 16 h a 4 ºC para coagular. Após
formação do coágulo, o soro foi recolhido e submetido à centrifugação a 255 x g por
15 min a 4 ºC. Este procedimento permitiu a clarificação do soro deixando-o livre de
hemácias e este foi, então, armazenado a -20 ºC até o uso.
À defensina isolada PvD1 foi adicionado o adjuvante de Freud para
emulsificação na proporção de 2:1 e, posteriormente, aplicado no coelho. A primeira
imunização foi intramuscular e subcutânea (1 mL em cada local de inoculação) e
após um período de 30 dias foi feita a segunda imunização apenas subcutânea (500
µL em diferentes locais no dorso do coelho). Após sete dias foi feita uma nova
inoculação repetida no dorso. Quatro dias depois, foi feita a primeira sangria e, em
seguida, foi feita mais uma imunização subcutânea. E assim, o processo foi feito por
mais duas semanas com mais duas sangrias e duas aplicações subcutâneas.
A obtenção e estocagem do soro contendo o anticorpo de interesse foram
feitas nas mesmas condições que para o soro pré-imune (Steinbuch e Audran et al.,
1969).
4.4.2 - Purificação de IgG do soro
O soro obtido como descrito no item acima foi centrifugado a 790 x g por 10
min. O sobrenadante do soro foi então diluído 1:3 em tampão acetato de sódio 60
mM, pH 4,0, sob baixa agitação, em temperatura ambiente. Após esta diluição, foi
adicionado ácido caprílico 100% numa proporção de 0,4 mL para cada 10 mL de
volume original de soro. O ácido caprílico foi adicionado gota a gota à mistura, sob
agitação e permanecendo assim por mais 30 min. Em seguida, essa mistura foi
centrifugada a 5.000 x g por 10 min, em temperatura ambiente. O sobrenadante
obtido foi colhido e o pH ajustado para pH 7,2, com adição de Tris 3 M. Neste
momento, a etapa de centrifugação foi repetida, o sobrenadante resultante foi
concentrado com adição de sal de sulfato de amônio até 45% de saturação
(peso/volume), sob agitação, a temperatura ambiente, permanecendo em agitação
por mais 2 h. O material foi centrifugado a 5.000 x g, durante 15 min, em
temperatura entre 4 e 8 ºC. O precipitado foi ressuspendido em salina (NaCl 0,9%) e
dialisado contra salina, com duas trocas por dia, durante 3 dias. A concentração da
IgG purificada foi determinada, através de uma curva utilizando ácido bicinconínico,
de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do reagente (Steinbuch e
Audran et al., 1969).
4.4.3 - Eletrotransferência de proteínas para Western Blotting
Após o término da eletroforese, o gel foi retirado das placas e imerso em
tampão de transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20%) por 20 min.
Uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Amersham Biosciences), cortada
nas mesmas dimensões do gel, foi também imersa no tampão de transferência por
20 min. Após esse período foi montado, sobre uma célula de transferência, um
“sanduíche” com quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, previamente
embebidas em tampão de transferência. Sobre essa camada de papel foi colocada a
membrana e acima da membrana o gel, sendo então o “sanduíche” finalizado com
mais uma camada de quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, já embebidas
no tampão de transferência. Durante a montagem desse “sanduíche” as bolhas de ar
foram evitadas e/ou removidas entre as camadas, para não interferirem com a
transferência das proteínas. Após esse procedimento, a célula de transferência foi
fechada e foi aplicada uma corrente constante de 1mA/cm2 por 2 h no sentido gelmembrana. Após a transferência o “sanduíche” foi cuidadosamente desfeito e a
membrana submetida à coloração com Ponceau S (0,1%) (Amersham Biosciences)
para determinação do sucesso da transferência (Towbin et al., 1979).
4.4.4 - Imunodetecção de Proteínas
Após coloração com Ponceau S 0,1%, para a marcação com os anticorpos,
inicialmente a membrana foi bloqueada com tampão bloqueador (tampão fosfato
salino (PBS) contendo 5% de leite em pó) e foi deixada por 16 h a 4 ºC. Em seguida,
a membrana foi incubada com o anticorpo primário contra a defensina isolada de
sementes de P. vulgaris (1:500), diluído em tampão (PBS contendo 5% de leite em
pó e 0,1% de Tween 20) por 1 h, sob agitação e em temperatura ambiente. Após
esta incubação com o anticorpo primário, foram feitas 5 lavagens de 5 min cada,
com tampão de lavagem (PBS contendo 0,1% de Tween 20). Ao término desta
lavagem a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (1:2.000), conjugado
com peroxidase, diluído em PBS contendo 5% de leite em pó e 0,1% de Tween 20
por 1 h, sob agitação e em temperatura ambiente. Após esta incubação foram feitas
mais 5 lavagens de 5 min cada em tampão de lavagem. Ao término destas lavagens,
foi feita a revelação com diaminobenzidina (DAB) imergindo a membrana na solução
reveladora (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, DAB 1 mg.mL -1, imidazol 100 mM e peróxido
de hidrogênio 0,03%) até a visualização das bandas marcadas.
4.5 - Ensaio de inibição da germinação de esporos fúngicos em meio líquido
4.5.1 - Obtenção de esporos de fungos filamentosos
Os fungos F. oxysporum, F. solani, F. laterithium foram transferidos do
estoque e colocados para crescer em uma placa de Petri contendo ágar Sabouraud
por aproximadamente 15 dias a 30 ºC. Após esse período, 10 mL de caldo
Sabouraud foram vertidos sobre a placa contendo os fungos e os esporos foram
liberados com o auxílio de uma alça de Drigalsky. Essa suspensão foi devidamente
filtrada em gase para evitar a passagem de restos miceliais que pudessem estar em
solução juntamente com os esporos. Esses esporos foram então quantificados em
câmara de Newbauer, na presença de um microscópio óptico (Gomes et al., 1998).
4.5.2 - Análise da inibição do crescimento dos esporos fúngicos
Em placas de cultura de células (96 poços), contendo 200 µL de meio de
cultura caldo Sabouraud, foi adicionada PvD1 em concentrações de 25, 50 e 100
µg.mL-1 (D1 da DEAE) e 1 x 104
esporos.mL-1 dos fungos filamentosos F.
oxysporum, F. solani e F. laterithium. Para a observação da inibição do crescimento
dos fungos, foi determinada a densidade ótica calculada a partir de leituras em “um
leitor de ELISA” a 670 nm a cada 6 h, por um período de 60 h. Todo o ensaio foi feito
em triplicata e sob condições de assepsia em capela de fluxo laminar, segundo
metodologia adaptada de Broekaert et al. (1990).
4.6 - Avaliação do mecanismo de ação da PvD1 sobre fungos
4.6.1 - Efeitos da defensina isolada PvD1 sobre a permeabilização de membranas
de fungos filamentosos e leveduras
A permeabilização da membrana das células tratadas com PvD1 foi avaliada
através da utilização do corante fluorescente SYTOX Green, segundo metodologia
descrita por Thevissen et al. (1999) com algumas modificações. SYTOX Green é um
corante que possui alta afinidade para ácidos nucléicos e penetra em células apenas
quando sua membrana está comprometida. Imediatamente após 24 h de crescimento,
na ausência e presença de PvD1, uma alíquota das diferentes células de leveduras foi
incubada sob constante agitação por duas horas com o corante fluorescente SYTOX
Green a uma concentração final de 0,2 µM, de acordo com instruções fornecidas pelo
fabricante. Após este período, estas células foram transferidas para lâminas, cobertas
com lamínulas e analisadas por fluorescência em microscópio óptico (Zeiss; Axioplan).
As imagens foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado à câmera
“Cannon Power Shot A640”.
4.6.2 - Análise do efeito da defensina isolada PvD1 sobre a inibição da
acidificação do meio induzido por glicose por células de levedura
4.6.2.1 - Manutenção e preparo das células
Células das leveduras C. albicans e S. cerevisiae foram transferidas do ágar
inclinado (estoque) para placas de Petri contendo ágar Sabouraud, onde cresceram
por três dias a 30 °C. Após este período, 4 mL de meio de cultura líquido foram
vertidos sobre as colônias e as células ressuspensas e homogeneizadas com o
auxílio de uma pipeta. Posteriormente, 5 µL dessa suspensão celular foram
adicionados em 200 mL de meio de cultura (caldo Sabouraud) e mantidas sob
intensa agitação a 30 °C por aproximadamente 16 h. Após este período de
crescimento, o material foi centrifugado a 3.000 x g por 5 min a 4 °C. As células
precipitadas foram lavadas com água ultra pura e centrifugadas a 3.000 x g por 5
min a 4 °C, sendo este procedimento repetido três vezes, para que todo o meio de
cultura fosse retirado. Ao final das lavagens, as células precipitadas foram
ressuspensas em 3 mL de água ultra pura e utilizadas no ensaio de inibição da
acidificação do meio por células de leveduras (Gomes et al., 1998).
4.6.2.2 - Ensaio de acidificação
Células de C. albicans e S. cerevisiae (107 células.mL-1) foram pré-incubadas
em diferentes tempos (1, 2 e 4 h) em meio contendo tampão Tris-HCl 10 mM pH 6,0
na presença e na ausência da PvD1 em duas diferentes concentrações (100 e 200
µg.mL-1). Após os períodos de pré-incubação, foram adicionados 200 µL de glicose
0,5 M e em seguida foram feitas leituras do pH a cada minuto por um tempo de 30
min.
Este ensaio foi feito em triplicata e os cálculos de ∆pH foram feitos para
determinar a porcentagem de inibição obtida com o experimento. O volume final do
ensaio foi de 1 mL.
Todo o ensaio foi feito segundo metodologia adaptada de Gomes et al.
(1998).
4.6.3 - Efeitos da defensina isolada PvD1 sobre a indução da produção endógena
de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C. albicans
A indução da produção endógena de ROS em células da levedura C. albicans,
tratadas com a defensina PvD1 após ensaio de inibição do crescimento, foi avaliada
através da utilização do corante fluorescente 2’,7’ diclorofluoresceína diacetato,
segundo metodologia descrita por Aerts et al. (2007) com algumas modificações.
Imediatamente após 24 h de crescimento, na ausência e presença da PvD1, uma
alíquota foi incubada sob constante agitação por 2 h com o corante fluorescente a uma
concentração final de 20 µM, de acordo com instruções fornecidas pelo fabricante.
Após este período, estas células foram transferidas para lâminas, cobertas com
lamínulas e analisadas por fluorescência em microscópio óptico (Zeiss; Axioplan). As
imagens foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado à câmera “Cannon
Power Shot A640”.
5. RESULTADOS
5.1 - Purificação da defensina
A cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sepharose da F/0-70 obtida
por extração protéica das sementes de P. vulgaris, apresentou dois diferentes picos
denominados D1, que foi eluído com o tampão de equilíbrio da coluna, e D2, que foi
eluído com o tampão de equilíbrio da coluna acrescido com 1 M de NaCl (Figura 2).
No pico D1, encontra-se presente a defensina PvD1 previamente isolada de
sementes de feijão comum como descrita por Games et al. (2008). Este pico foi
então dialisado, liofilizado e utilizado para eletroforese, ensaios de inibição de
crescimento de fungos filamentosos e ensaios de acidificação induzido por glicose
por células de leveduras.
1,6
D2
1,4
Absorbância, 280nm
1,2
1
0,8
0,6
NaCl 1 M
0,4
0,2
D1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tubos
Figura 2 – Cromatograma da F/0-70 de sementes de feijão comum obtido após
cromatografia em coluna DEAE–Sepharose. A coluna foi previamente equilibrada com
tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0. D1 foi eluído da coluna com tampão de equilíbrio, D2 foi
eluído com tampão Tris-HCl 20 mM contendo 1 M de NaCl. O fluxo foi de 60 mL.h-1 e foram
coletadas frações de 3 mL em cada tubo, em um total de 50 tubos.
Para confirmar se realmente o pico D1 continha apenas a defensina PvD1, o
pico D1 obtido na cromatografia de DEAE-Sepharose, foi submetido a uma
cromatografia de fase reversa em coluna C2C18. Esta mostrou a presença de
apenas um único pico majoritário denominado H1 (Figura 3). Este pico foi então
dialisado, liofilizado e utilizado para a produção de anticorpos policlonais contra a
defensina isolada.
H1
Gradiente de acetonitrila
100%
0%
Tempo, min
Figura 3 – Cromatograma obtido após cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em
HPLC do pico D1 obtido após cromatografia em DEAE-Sepharose. A coluna foi equilibrada
com uma solução de TFA 0,1% e a amostra foi eluída utilizando-se um gradiente de
acetonitrila 80%-TFA 0,1% de 0 a 100%, a um fluxo de 0,5 mL.min-1. O padrão de eluição
dos peptídeos foi monitorado a 220 nm.
5.2 - Eletroforese em gel de tricina na presença de SDS
As proteínas presentes na F/0-70 e também nos picos obtidos após
cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e cromatografia em coluna de fase
reversa C2/C18 foram inicialmente analisados em gel de tricina, como pode ser
observado na figura 4. A F/0-70, representada na raia 2 apresenta diversas bandas
de peptídeos com diferentes massas moleculares, na raia 3 foi observada
a
presença de apenas um único peptídeo (defensina PvD1 previamente isolada por
Games et al., 2008), na raia 4 foi observada a predominância de proteínas de alto
peso molecular e na raia 5 está o perfil eletroforético da defensina isolada após
cromatografia em coluna C2/C18. Foi observada a presença única da defensina de
aproximadamente 6 kDa. As amostras foram tratadas com β-mercaptoetanol.
BkDa
M
M
F
F
D1
D1
D2
D2
H1
PvD1
16.9
14.4
10.6
8.1
6.2
Figura 4 – Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS da F/0-70 e dos
picos obtidos após cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e cromatografia em
coluna de fase reversa C2C18. Todas as amostras foram tratadas com β-mercaptoetanol. M
- marcador de massa molecular (kDa); F – fração 0-70 obtida de sementes de feijão comum;
D1 – pico não retido obtido em DEAE-Sepharose; D2 – pico retido em DEAE-Sepharose,;
H1 – pico obtido após cromatografia em coluna C2C18 em HPLC.
5.3 - Western Blotting
Várias estratégias e metodologias com uso de diferentes animais
(camundongo, porco-da-índia e galinha) foram utilizadas para se obter um anticorpo
que reconhecesse a PvD1. Através da metodologia descrita por Steinbuch e Audran,
1969, utilizando coelhos, foi possível obter um anticorpo que reconhecesse a PvD1.
O pico H1 obtido na cromatografia de fase reversa em coluna de HPLC foi utilizado
na imunização de coelho para a produção de anticorpos contra a defensina PvD1
isolada de sementes de P. vulgaris. Através da técnica de Western Blotting, foi
observado na figura 5, o reconhecimento da defensina isolada PvD1 pelo anticorpo
produzido, tanto no soro imune quanto na IgG purificada, enquanto que no soro préimune e no soro controle não houve qualquer reação imunológica.
1
2
3
4
Figura 5 – Western Blotting do anticorpo produzido em coelhos contra a defensina PvD1
isolada de sementes de P. vulgaris. 1 – Soro imune; 2 – Soro pré-imune; 3 – IgG purificada
e 4 – Soro controle. Foi utilizada uma concentração de 1:500 com todos os soros testados.
5.4 - Análise da inibição do crescimento de esporos fúngicos em meio líquido
Na figura 6 (A-C), foi observada o efeito da defensina PvD1 isolada de
sementes de P. vulgaris sobre o crescimento dos fungos F. oxysporum, F. solani e F.
laterithium. Notou-se que a PvD1 apresentou um efeito inibitório sobre o crescimento
de todos os fungos filamentosos testados F. oxysporum, F. solani e F. laterithium
especialmente nas duas concentrações maiores utilizadas (50 e 100 µg.mL-1), sendo
que a inibição foi mais acentuada na presença de 100 µg.mL-1 da defensina PvD1
para os fungos F. oxysporum e F. solani quando comparada com as outras
concentrações utilizadas. Pode-se notar também que, utilizando concentrações
maiores que 100 µg.mL-1 da defensina PvD1 é que iremos atingir seu IC50 (tabela 2).
A
10 0 0
B 10 0 0
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
0
60
6
12
18
30
36
42
48
54
60
T e m po ( h)
T e m po ( h)
C
24
10 0 0
800
600
400
200
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
T e m po ( h)
Figura 6 – Curva de crescimento mostrando a alteração do crescimento dos fungos
filamentosos (A) F. oxysporum, (B) F. solani e (C) F. laterithium na ausência (controle) e na
presença da defensina isolada PvD1, obtida após cromatografia em coluna de DEAESepharose. O crescimento foi observado até 60 h. (-♦-) Controle; (-■-) 25 µg.mL-1, (-▲-) 50
µg.mL-1 e (-x-) 100 µg.mL-1. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Tabela 2. Atividade antifúngica da defensina PvD1
Fungos filamentosos
µg.mL-1)*
Valores de IC50 (µ
Fusarium oxysporum
> 100
F. solani
> 100
F. laterithium
> 100
* Concentração de proteína mínima necessária para se obter 50 % de inibição do crescimento
após 60 h a 30 ºC.
Em recente trabalho publicado por Games et al. (2008), foi visto que a
defensina PvD1 inibiu significativamente o crescimento das leveduras C.
parapsilosis, P. membranifaciens, C. tropicalis, C. albicans e K. marxiannus nas
concentrações de 25, 50 e 100 µg.mL-1, enquanto que para as células da levedura S.
cerevisiae, observou-se uma acentuada redução no crescimento quando foi utilizada
a concentração de 100 µg.mL-1 de PvD1. A partir destes resultados obtidos, notouse que na presença de concentrações entre 50 e 100 µg.mL-1 a PvD1 foi capaz de
inibir 50 % do crescimento das leveduras P. membranifaciens e S. cerevisiae. Podese notar também um efeito bem acentuado sobre a levedura K. marxiannus e C.
albicans onde notamos que utilizando concentrações menores que 25 µg.mL-1 e
iguais a 25 µg.mL-1, respectivamente, é que iremos atingir o seu IC50 (tabela 3).
Tabela 3. Atividade antifúngica da defensina PvD1
-1 *
Leveduras
Valores de IC50 (µ
µg.mL )
Candida parapsilosis (CE002)
> 100
Pichia membranifaciens (CE015)
50 < 100
C. tropicalis (CE017)
> 100
C. albicans(CE022)
< 25
Kluyveromyces marxiannus (CE025)
= 25
Saccharomyces cerevisiae (CE1038)
50 < 100
* Concentração de proteína mínima necessária para se obter 50 % de inibição do
crescimento após 24 h a 30 ºC.
5.5 - Efeito da defensina isolada PvD1 sobre a permeabilização de membranas
de fungos filamentosos e leveduras
Na figura 7 foi observado o resultado obtido sobre a permeabilização de
membranas dos fungos filamentosos F. oxysporum, F. solani, F. laterithium quando
incubados na presença e na ausência da PvD1. Observou-se que nos controles de
todos os fungos testados, (figura 7 B, F e J) nenhuma fluorescência foi observada,
indicando que a membrana das células encontra-se íntrega não permitindo a entrada
e consequente marcação do corante. Já nos testes (figura 7 D, H e L) foi observada
a marcação nas células previamente tratadas com 100 µg.mL-1 da defensina PvD1
de todos os fungos testados, indicando, assim, que esta provocou danos nas células
que permitiram a permeabilização e marcação do corante SYTOX Green.
Figura 7 – Microscopia dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum (A-D), Fusarium
solani (E-H), Fusarium laterithium (I-L) tratados com Sytox Green após 24 h de incubação e
visualizados em microscopia óptica de campo claro e de fluorescência. (A, E e I) células
controle (crescidas na ausência da PvD1) visualizadas por campo claro; (B, F e J) células
controle (crescidas na ausência da defensina PvD1) visualizadas por fluorescência; (C, G e
K) células crescidas na presença da defensina PvD1 (100 µg.mL-1) visualizadas por campo
claro e (D, H e L) células crescidas na presença da defensina PvD1 (100 µg.mL-1)
visualizadas por fluorescência. Todas as células foram visualizadas com um aumento de
400X.
D
H
F
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Na figura 8 foi observado o resultado obtido sobre a permeabilização de
membranas de células das leveduras C. parapsilosis (A-D), P. membranifaciens (EH) e C. tropicalis (I-L) quando incubadas na presença e na ausência da PvD1.
Verificou-se que nos controles das células das leveduras C. parapsilosis (B) e P.
membranifaciens (F), nenhuma fluorescência foi observada, indicando que a
membrana dessas células encontra-se íntrega não permitindo a entrada e
consequente marcação do corante. Já nos testes (D, H e L), observou-se marcação
nas células previamente tratadas com 100 µg.mL-1 da defensina isolada PvD1 ,
indicando, assim, que esta provocou danos nas membranas das células causando a
permeabilização e marcação do corante SYTOX Green.
Figura 8 – Microscopia das células das leveduras C. parapsilosis (A-D), P. membranifaciens
(E-H), C. tropicalis (I-L) tratadas com Sytox Green após 24 h de incubação e visualizadas
em microscopia óptica de campo claro e de fluorescência. (A, E e I) células controle
(crescidas na ausência da defensina isolada PvD1) visualizadas por campo claro; (B, F e J)
células controle (crescidas na ausência da defensina PvD1) visualizadas por fluorescência;
(C, G e K) células crescidas na presença da defensina isolada PvD1(100 µg.mL-1)
visualizadas por campo claro e (D, H e L) células crescidas na presença da defensina
isolada PvD1(100 µg.mL-1) visualizadas por fluorescência. Todas as células foram
visualizadas com um aumento de 400X.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Conforme pode ser observado na figura 9, as células das leveduras C.
albicans (A-D), K. marxiannus (E-H) e S. cerevisiae (I-L) previamente tratadas com a
defensina PvD1, apresentaram-se marcadas pelo corante (D, H e L), sugerindo que
a defensina PvD1 foi capaz de causar permeabilidade as membranas das células e
permitindo a penetração do corante quando comparadas aos respectivos controles
(B, F e J) os quais não apresentaram marcação.
Figura 9 – Microscopia das células das leveduras C. albicans (A-D), K. marxiannus (E-H) e
S. cerevisiae (I-L) tratadas com Sytox Green após 24 h de incubação visualizadas em
microscopia óptica de campo claro e de fluorescência. (A, E e I) células controle (crescidas
na ausência da defensina isolada PvD1) visualizadas por campo claro; (B, F e J) células
controle (crescidas na ausência da defensina PvD1) visualizadas por fluorescência; (C, G e
K) células crescidas na presença da defensina isolada PvD1(100 µg.mL-1) visualizadas por
campo claro e (D, H e L) células crescidas na presença da defensina isolada PvD1 (100
µg.mL-1) visualizadas por fluorescência. Todas as células foram visualizadas com um
aumento de 400X.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
5.6 - Ensaio de acidificação do meio induzido por glicose em células de
levedura
Na figura 10 (A-C) observou-se a inibição da acidificação do meio por células
de S. cerevisiae nas concentrações de 100 µg.mL-1 e 200 µg.mL-1 da PvD1 com
tempos de pré-incubação de 1, 2 e 4 h respectivamente. A figura 10A mostra o grau
de inibição da acidificação do meio por células de S. cerevisiae com 1 h de préincubação na presença da PvD1, sendo observada uma pequena atividade inibitória
nas duas concentrações testadas. Na figura 10B, as células foram pré-incubadas por
2 h com a PvD1 e pode-se notar uma significativa inibição da acidificação em todas
as concentrações testadas, assim como na figura 10C, onde as células foram préincubadas por 4 h com a PvD1, observou-se uma intensa inibição da acidificação
onde se obteve 77% de inibição da acidificação na concentração de 100 µg.mL-1 .
A
100
% Acidificação
80
60
40
20
0
10
1002
3
200
-1
Concentração
(µ
µg.mL
)
Concentrações
(mg.mL-1)
B
100
% Acidificação
80
60
40
20
0
1
00
2
100
3
200
-1
Concentrações
(mg.mL-1)
Concentração
(µ
µg.mL
)
C
100
% Acidificação
80
60
40
20
0
100
2
01
-1
Concentração
(mg.mL-1)
Concentração
(µ
µg.mL
)
Figura 10 – Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura S. cerevisiae, na
presença da defensina PvD1 de sementes de feijão comum obtida após cromatografia em
coluna DEAE-Sepharose, nas várias concentrações testadas. Após (A) 1 h de pré
incubação; (B) 2 h de pré-incubação; (C) 4 h de pré-incubação. Os experimentos foram
realizados em triplicata.
Na figura 11 estão ilustrados os gráficos da inibição da acidificação do meio
por células da levedura C. albicans onde foram utilizadas as concentrações de 100 e
200 µg.mL-1 da PvD1, com tempos de pré-incubação de 1, 2 e 4 h respectivamente.
A figura 11A mostra a porcentagem da acidificação do meio quando as células são
pré-incubadas por 1 h com a defensina PvD1 e é possível verificar uma forte inibição
da acidificação em todas as concentrações testadas, entretanto na maior
concentração (200 µg.mL-1) a inibição atinge quase que 100% após esse tempo de
pré-incubação. Na figura 11B quando as células foram pré-incubadas por 2 h com
PvD1, foi observada também uma significativa inibição da acidificação nas duas
concentrações testadas, especialmente na concentração de 200 µg.mL-1, onde
aproximadamente 93% de inibição foi obtida. Na figura 11C notou-se que também
houve uma significativa inibição da acidificação quando as células foram préincubadas com 100 µg.mL-1 por 4 h, porém foi observado que a inibição da
acidificação foi menor, onde na concentração de 100 µg.mL-1 observou-se
aproximadamente 77% de inibição.
A 100
% Acidificação
80
60
40
20
0
10
2
100
100
3
200
Concentrações
(mg.mL-1)
Concentração
(µ
µg.mL
)
-1
B
100
% Acidificação
80
60
40
20
0
10
2
100
3
200
-1
Concentração
(mg.mL-1)
Concentração
(µ
µg.mL
)
C
100
% Acidificação
80
60
40
20
0
0
1
100
2
-1
Concentração
(mg.mL-1)
Concentração
(µ
µg.mL
)
Figura 11 – Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura C. albicans, na
presença da defensina PvD1 isolada de sementes de feijão comum obtida após
cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, nas várias concentrações testadas. Após (A) 1
h de pré-incubação; (B) 2 h de pré-incubação e (C) 4 h de pré-incubação. Os experimentos
foram realizados em triplicata.
5.7 - Efeitos da defensina isolada PvD1 sobre a indução da produção endógena
de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C. albicans
Na figura 12 foi observado o resultado obtido sobre a indução da produção
endógena de ROS em células de C. albicans quando incubadas na presença e na
ausência da PvD1. Observou-se que no controle (A) as células aparecem bem
separadas e nenhuma fluorescência pode ser observada (B). Diferentemente para
as amostras tratadas com 100 µg.mL-1 da defensina foi observada uma aglomeração
celular (C e E) e uma intensa marcação nas células de C. albicans (D e F), indicando
assim, que a defensina provocou danos nas células induzindo a produção de ROS e
a marcação pelo corante utilizado.
A
B
C
D
E
F
Figura 12 – Microscopia das células da levedura C. albicans tratadas com o corante 2’,7’
diclorofluoresceína diacetato vistas por microscopia óptica de campo claro e de
fluorescência. (A e B) células controle (crescidas na ausência da defensina isolada PvD1);
(C, D, E e F) células crescidas na presença da defensina isolada PvD1(100 µg.mL-1)
visualizadas em campo claro (C e E) e por fluorescência (D e F). Todas as células foram
visualizadas com um aumento de 400X.
6. DISCUSSÃO
As plantas, por serem organismos sésseis, estão constantemente expostas
aos diversos tipos de fatores físicos e químicos desfavoráveis no ambiente, incluindo
a presença de um grande número de organismos fitopatogênicos. Sendo assim, a
sua sobrevivência nessas condições exige uma rápida resposta de defesa (Castro e
Fontes, 2005).
Em anos mais recentes, muitos AMPs têm sido caracterizados de diferentes
tecidos de plantas, principalmente de sementes. Devido à capacidade que os AMPs
possuem de interagir com determinadas membranas celulares e, dessa forma,
conferir a eles uma eficiente atividade antimicrobiana contra determinados agentes
patogênicos, é que tem-se observado nos últimos anos, um grande interesse
biológico em estudar esse grupo de proteínas (Gallo et al., 2002).
Em 2008, Games et al. conseguiram isolar e caracterizar uma nova defensina
antifúngica de sementes de feijão comum P. vulgaris, denominada PvD1. Neste
trabalho foi então estudado o mecanismo de ação e a atividade antifúngica desta
defensina sobre diversas espécies de fungos filamentosos e leveduras. Este
trabalho foi iniciado com a obtenção da PvD1 através da extração da farinha das
sementes de feijão comum, seguindo metodologia descrita por Games et al., (2008)
ilustrado no esquema 1. A fração 0-70% obtida da extração foi submetida a uma
cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-Sepharose. O processo de
purificação foi efetivo (Figuras 2 e 3) e pode-se observar no pico D1, a presença de
apenas uma única banda protéica de aproximadamente 6 kDa (Figura 4),
correspondente a defensina PvD1 isolada, como descrita por Games et al., (2008).
Para a produção de anticorpo policlonal, à PvD1 isolada foi adicionado o
adjuvante de Freud para emulsificação na proporção de 2:1 e aplicada de forma
intramuscular e subcutânea em coelhos. Posteriormente, foi feita a purificação da
IgG obtida e a concentração da IgG purificada foi determinada, através de uma
curva utilizando ácido bicinconínico. Através da técnica de Western Blotting,
podemos observar o reconhecimento da defensina isolada PvD1 pelo anticorpo
produzido na concentração de 1:500, tanto no soro imune quanto na IgG purificada,
enquanto que no soro pré-imune e no soro controle não houve marcação (Figura 5),
segundo metodologia de Steinbuch e Audran, 1969. Vale ressaltar que várias
estratégias e metodologias com uso de diferentes animais (camundongo, porco-da-
índia e galinha) foram testados, porém apenas através desta ultima metodologia
descrita utilizando coelhos, foi possível obter um anticorpo que reconhecesse a
PvD1.
A atividade antimicrobiana das defensinas de plantas é principalmente
observada contra fungos. Diversas espécies de fungos têm o crescimento inibido e
entre eles estão vários patógenos de plantas (Osborn et al., 1995, Carvalho e
Gomes, 2009). Com o objetivo de analisar a atividade antimicrobiana da defensina
PvD1, ensaios antifúngicos foram realizados para verificar a capacidade que a
defensina PvD1 teria sobre a inibição do crescimento de diferentes espécies de
fungos filamentosos.
Os resultados obtidos mostraram que a defensina PvD1 apresentou um efeito
inibitório no crescimento de todos os fungos filamentosos testados F. oxysporum, F.
solani e F. laterithium, sendo que a inibição foi mais acentuada na presença de 100
µg.mL-1 da PvD1 quando comparada com as outras concentrações utilizadas, 25 e
50 µg.mL-1 (Figura 6). Quando usou-se concentrações maiores que 100 µg.mL-1 da
PvD1, é que esses fungos filamentosos foram capazes de atingir 50 % do seu
crescimento (tabela 2). Outros estudos já demonstraram que a concentração
inibitória das defensinas varia muito e é dependente do fungo testado. Van der
Weerden et al. (2008) mostraram que NaD1 na concentração de 1 µM inibiu 50% do
crescimento dos fungos Fusarium oxysporum e Leptosphaeria maculans e 65% dos
fungos Thielaviopsis basicola, Verticillium dahliae e Aspergillus nidulans. Já na
concentração de 5 µM de NaD1, o crescimento de todos os fungos filamentosos
testados, apresentou mais do que 90% de inibição.
O
completo
mecanismo
de
ação
de
inibição
do
crescimento
de
microrganismos por defensinas, ainda não foi totalmente determinado. Foram
realizados ensaios de permeabilização de membranas dos fungos filamentosos,
provenientes do ensaio de inibição do crescimento e verificou-se que a defensina
PvD1 era capaz de interagir com as membranas destes, provocando algum dano na
célula, uma vez que este corante somente consegue penetrar as células que
estejam com as suas membranas comprometidas. Nos controles de todos os fungos
testados F. oxysporum, F. solani e F. laterithium, nenhuma fluorescência foi
observada, indicando que a membrana das células encontra-se íntegra, não
permitindo a permeabilização e marcação do corante. Já nos testes, observou-se
marcação nas células previamente tratadas com 100 µg.mL1 da defensina PvD1 de
todos os fungos testados, indicando, assim, que esta provocou danos nas células
que permitiram a permeabilização e marcação do corante SYTOX Green (Figura 7).
Estes resultados se assemelham aos resultados obtidos por Thevissen et al. (1999)
que demonstraram que as defensinas de plantas são capazes de permeabilizar a
membrana tanto de fungos filamentosos quanto de leveduras (Thevissen et al.,
2007). Os resultados obtidos através de ensaio de inibição do crescimento, somados
aos obtidos no ensaio de permeabilização de membranas através de captação do
corante SYTOX Green sugerem que a defensina presente em sementes de feijão
comum atua comprometendo o funcionamento da membrana plasmática destas
células, alterando sua permeabilidade a íons e moléculas orgânicas como o SYTOX
Green.
Em recente trabalho publicado por Games et al. (2008), foi visto que a
defensina PvD1 inibiu significativamente o crescimento das leveduras C.
parapsilosis, P. membranifaciens, C. tropicalis, C. albicans e K. marxiannus nas
concentrações de 25, 50 e 100 µg.mL-1, enquanto que para as células da levedura S.
cerevisiae, observou-se uma acentuada redução no crescimento quando foi utilizada
a concentração de 100 µg.mL-1 de PvD1. Notou-se que na presença de
concentrações que variavam entre 50 e 100 µg.mL-1 da PvD1, as leveduras P.
membranifaciens e S. cerevisiae atingiram seu IC50, enquanto que as leveduras K.
marxiannus e C. albicans atingiram seu IC50 nas concentrações de 25 e menor que
25 µg.mL-1 de PvD1 respectivamente (tabela 3). Além disso, os autores analisaram
através de microscopia eletrônica de varredura, possíveis alterações causadas pela
defensina PvD1 em células de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e S.
cerevisiae. Um crescimento normal foi observado nas células controle, no entanto as
células de S. cerevisiae e C. albicans tratadas com a defensina PvD1, exibiram
alterações na formação e liberação do broto e aglomerações de células,
respectivamente. De posse destes resultados obtidos por Games et al. (2008), foram
realizados ensaios de permeabilização de membranas das células das leveduras C.
parapsilosis, P. membranifaciens, C. tropicalis, C. albicans, K. marxiannus e S.
cerevisiae e foi observado que a defensina PvD1 na concentração de 100 µg.mL-1 foi
capaz de interagir com as membranas destas leveduras. Nos controles das células
das leveduras C. parapsilosis, P. membranifaciens, C. albicans, K. marxiannus e S.
cerevisiae nenhuma fluorescência foi observada, indicando que a membrana dessas
células encontra-se íntegra não permitindo a permeabilização e marcação do
corante. Já nos testes, foi observada a marcação nas células previamente tratadas
com 100 µg.mL-1 da defensina isolada PvD1, indicando, assim, que esta provocou
danos nas células que permitiram também a permeabilização e marcação do corante
SYTOX Green (Figuras 8 e 9). Nos últimos anos foi reportado que outras proteínas e
peptídeos isolados de pimenta também apresentam essa propriedade de
permeabilização. Proteínas como albuminas 2S presentes em sementes de
maracujá amarelo, inibidores de proteinases e LTPs presentes em sementes de
pimenta foram capazes de causar danos às membranas de fungos e,
consequentemente, responder a ação do corante SYTOX Green (Agizzio et al.,
2006; Diz et al., 2006; Ribeiro et al., 2007).
Vários
trabalhos
sugerem
que
diferentes
proteínas
antimicrobianas
desempenham sua atividade antifúngica através da permeabilização da membrana
plasmática. No entanto, pouco se sabe sobre os possíveis sítios de ligação dessas
proteínas às estruturas da parede celular e membrana plasmática de fungos e o que
confere resistência ou susceptibilidade as diferentes proteínas de defesa (Thomma
et al., 2002; Thevissen et al., 1999). Recentemente, foi demonstrado por Diz et al.
(2006) que peptídeos presentes em sementes de pimenta inibem em até 100% a
acidificação do meio de células da levedura S. cerevisiae utilizando-se uma
concentração de 160 µg.mL-1 da fração F1 que em contato com as células da
levedura mostrou-se responsável por promover a permeabilização através da
membrana plasmática.
Um ensaio de acidificação do meio por células de S. cerevisiae e C. albicans
foi realizado para observar o grau de acidificação das células destas leveduras
quando incubadas com a PvD1, nas diferentes concentrações e tempos de
incubação testados. Os resultados mostraram que, na presença das células da
levedura S. cerevisiae, a inibição da acidificação foi proporcional ao tempo de
incubação com a PvD1, atingindo 76% de inibição quando incubadas com 200
µg.mL-1 da PvD1, por um período de 2 h (Figura 10). Ao observar a acidificação do
meio na presença de células da levedura C. albicans verificou-se uma forte inibição
da acidificação do meio atingindo aproximadamente 100% quando as células foram
incubadas com a maior concentração da PvD1 por um período de 1 h de incubação
(Figura 11). Verificou-se também que a variação do tempo de incubação dessas
células na presença da PvD1, não apresentou uma alteração significativa. Este fato
pode ser explicado primeiro por uma diferença nos mecanismos de resistência
usados por ambas as leveduras bem como pela diferença de componentes da
membrana plasmática. Os receptores de membranas para as defensinas são os
esfingolipídeos nela presentes. Já foi visto que a membrana de muitas leveduras,
tais como P. pastoris e C. albicans possui glicosilceramida, enquanto que a
membrana das leveduras S. cerevisiae e S. pombe, por exemplo, não sintetizam
glicosilceramida. (Thevissen et al., 1999; Thevissen et al., 2003a; Thevissen et al.,
2003b; Thevissen et al., 2004).
Estes resultados também sugerem que a inibição da acidificação na presença
da PvD1 pode ser mediada tanto pela formação de um poro, devido a
permeabilidade da membrana, como da alteração dos mecanismos de uma H+ATPase presente nas membranas das células da levedura. H+-ATPases são
enzimas presentes na membrana plasmática de fungos que desempenham um
importante papel na manutenção da homeostase . Resultados obtidos por Thevissen
et al. (1999) mostraram que quando os fungos Neurospora Crassa e Fusarium
culmorum foram incubados com defensinas de planta, Rs-AFP2 e Dm-AMP1, um
fluxo de íons através da membrana plasmática foi observado.
Recentemente, Aerts et al. (2007) demonstraram que a RsAFP2 , induz a
produção endógena de ROS em células de C. albicans e que tanto esta produção de
ROS quanto a atividade antifúngica desaparece na presença do antioxidante ácido
ascórbico, o que sugere uma ligação causal entre a atividade antifúngica de RsAFP2 e a produção de ROS por ela mediada. Estes autores sugerem ainda que, a
permeabilização da membrana é consequência de uma sinalização intracelular
gerada pela ligação de Rs-AFP2 com as glicosilceramidas da membrana e não
simplesmente a ação direta deste peptídeo na membrana através de sua interação
com este esfingolipídeo. Ao analisar os efeitos da defensina PvD1 isolada de
sementes de P. vulgaris sobre a indução da produção endógena de ROS em células
de C. albicans utilizando para a marcação o corante 2’,7’ diclorofluoresceína
diacetato, verificou-se
que no controle, nenhuma fluorescência foi observada,
indicando a não produção de ROS e consequentemente a não marcação pelo
corante. Já nas células tratadas com 100 µg.mL-1 da PvD1, foi observada uma
intensa marcação de ROS pelo corante 2’,7’ diclorofluoresceína diacetato indicando
uma grande aumento deste após tratamento com a defensina PvD1 (Figura 12).
Assim, o estudo da atividade antimicrobiana e das diferentes características
moleculares presentes nos diferentes grupos de proteínas e peptídeos é de
fundamental importância para que possamos compreender os mecanismos pelos
quais estes agem sobre o desenvolvimento de patógenos. Dessa forma, será
possível utilizá-los como agentes terapêuticos no tratamento de determinadas
infecções causadas por certos agentes patogênicos.
7. CONCLUSÕES
O sucesso da produção do anticorpo foi comprovado pelo reconhecimento da
defensina PvD1 isolada de sementes de P. vulgaris pelo anticorpo produzido;
PvD1 foi capaz de promover uma inibição sobre o crescimento dos fungos
filamentosos sendo que a inibição foi mais acentuada na presença de 100
µg.mL-1 da defensina para os fungos F. oxysporum e F. solani quando
comparada com as outras concentrações utilizadas;
PvD1 mostrou-se capaz de causar permeabilização na membrana de todos
os fungos filamentosos e leveduras testadas permitindo a penetração do
corante SYTOX Green;
PvD1 foi capaz de inibir a acidificação do meio estimulada por glicose, por
células das leveduras S. cerevisiae e C. albicans.
PvD1 foi capaz de induzir a produção endógena de espécies reativas de
oxigênio (ROS) nas células de C. albicans.
8. BIBLIOGRAFIA
Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Meert, E. M. K., Li, Q.-T., Cammue, B. P. A. e
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