000735329

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
RELAÇÃO ENTRE O INFILTRADO INFLAMATÓRIO E AS
CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA IMUNE AOS
CARCINOMAS DO TIPO SIMPLES EM MAMA DE CADELAS
Mayara Caroline Rosolem
Médica Veterinária
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
RELAÇÃO ENTRE O INFILTRADO INFLAMATÓRIO E AS
CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA IMUNE AOS
CARCINOMAS DO TIPO SIMPLES EM MAMA DE CADELAS
Mayara Caroline Rosolem
Orientadora: Profa. Ass. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos
Co-orientadora: Profa. Ass. Dra. Daniela Bernadete Rozza
Dissertação
apresentada
à
Faculdade
de
Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP,
Campus de Jaboticabal, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre
em Medicina Veterinária (Patologia Animal).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
2013
Rosolem, Mayara Caroline
R822r
Relação entre o infiltrado inflamatório e as células dendríticas
na resposta imune aos carcinomas do tipo simples em mama de
cadelas / Mayara Caroline Rosolem. – – Jaboticabal, 2013
xvi, 61 p. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2013
Orientadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos
Banca examinadora: Geórgia Modé Magalhães, Hélio José
Montassier
Bibliografia
1. Cão. 2. Células Inflamatórias. 3. Evasão Imune. 4. Imunohistoquímica. 5. Neoplasia Mamária. I. Título. II. JaboticabalFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:616-006:636.7
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Campus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
MAYARA CAROLINE ROSOLEM – nascida em oito de dezembro de 1987, na
cidade de Araruna, Paraná, filha de Elio Rosolem e Vicentina Terezinha Ferreira
Rosolem. Iniciou sua graduação em Medicina Veterinária em janeiro de 2005 na
Faculdade Integrado de Campo Mourão (PR), tendo finalizado a mesma em
dezembro de 2009. Ingressou no programa de aprimoramento profissional na área
de Patologia Veterinária na Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba
(FMVA), da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP),
Campus de Araçatuba/SP, sob a orientação da Profa. Ass. Dra. Daniela Bernadete
Rozza, durante o período de janeiro de 2010 a janeiro de 2011. Ainda no ano de
2011, ingressou no programa de pós-graduação em Medicina Veterinária da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV - UNESP), Campus de
Jaboticabal/SP, sob a orientação da Prof a. Ass. Dra. Rosemeri de Oliveira
Vasconcelos.
93 Million Miles - Jason Mraz
93 million miles from the sun
People get ready, get ready
Cause here it comes, it's a light
A beautiful light, over the horizon
Into your eyes
Oh, my my how beautiful
Oh my beautiful mother
She told me, son in life you're gonna go far
If you do it right, you'll love where you are
Just know, wherever you go
You can always come home
240 thousand miles from the moon
We've come a long way to belong here
To share this view of the night
A glorious night
Over the horizon is another bright sky
Oh my my how beautiful, oh my irrefutable father
He told me, son sometimes it may seem dark
But the absence of the light is a necessary part
Just know, you're never alone, you can always come back home
Home, Home
You can always come back
Every road is a slippery slope
But there is always a hand that you can hold on to
Looking deeper through the telescope
You can see that your home's inside of you
Just know, that wherever you go, no you're never alone, you will always get back
home
Home, Home
Home
Ohhh
93 million miles from the sun
People get ready, get ready
Cause here it comes, it's a light
A beautiful light, over the horizon
Into our eyes
Dedico este trabalho aos animais que fizeram, fazem e farão parte da minha história.
Em especial a gata Cissa (in memorian). Sua companhia foi indispensável nestes
doze anos que esteve estudando comigo pelas madrugadas afora....
AGRADECIMENTOS
Deus, conhecedor dos meus caminhos. Obrigada Senhor, por me permitir
viver este dia.
Aos meus pais Elio e Terezinha. Nunca haverá distância geográfica ou
espiritual que vá nos separar.
A minha orientadora Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, que me possibilitou
conseguir dar mais um passo na minha longa caminhada. Saiba que o quanto sou
grata por ter me aceitado ser sua orientada naquele dia, em Belo Horizonte.
A professora Daniela Bernadete Rozza, que me co-orientou neste trabalho e
que também me orientou durante a residência.
Aos meus eternos cães e gatos! Desde o Mingau e o Apolo, ainda lá no Mato
Grosso, até o Biscuit, Pequininho, Rex, Cissa, Lobo, Maya, Paçoca, Fumaça,
Babaloo e a Tigresa. Todos me agraciaram com o simples fato de existirem.
Aos meus colegas Ana Carolina Silva, Andresa Matsui, Carolina Bellodi,
Claudia Momo, Eduardo Garrido, Érika Terra, Geórgia Magalhães, Giovana Varallo,
Janine Denadai, Luciana Curtio, Luis Rivera, Marcio Bandarra, Pamela Moreira,
Priscila Lopes, Roberta Lomonte, Rosana Lino, Thaís Castanheira e a todos que, de
alguma forma, partilharam comigo seus conhecimentos, aguentaram meus choros e
risadas, nos momentos de alegria e de desespero!
Aos professores do Departamento de Patologia Veterinária, Angelo Berchieri
Júnior, Gervásio Henrique Bechara e Hélio José Montassier por cederem espaço
nos seus respectivos freezers -80ºC, o que possibilitou armazenar todo o material
congelado utilizado neste trabalho.
Aos funcionários e ex-funcionários do Departamento de Patologia Veterinária
desta instituição, em especial à Francisca de Assis Ardison, Maria Inês Yamazaki de
Campos e Moema Makiko Ogassavara pela colaboração e carinho.
Ao Serviço de Oncologia e o Serviço de Reprodução e Obstetrícia desta
instituição, pelo atendimento clínico e cirúrgico dos animais que participaram deste
trabalho.
As cadelas que participaram desse projeto e seus proprietários.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo
auxílio financeiro fornecido a esta pesquisa (2011/03510-4).
ix
SUMÁRIO
Página
RESUMO...........................................................................................................
xi
ABSTRACT........................................................................................................
xii
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................
xiii
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................
xiv
LISTA DE TABELAS..........................................................................................
xvi
I. INTRODUÇÃO................................................................................................
1
II. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................
3
2.1 Neoplasias mamárias em cadelas...............................................................
3
2.2 Células dendríticas...................................................................................
5
2.1.1 Origem e tipos de células dendríticas...............................................
9
2.2.2 Processamento e apresentação antigênica......................................
12
2.3 As células dendríticas e o tumor de mama..............................................
14
2.4 As células dendríticas e os mastócitos....................................................
15
III. OBJETIVOS..................................................................................................
17
IV. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
18
4.1 Grupos experimentais, colheita do material e classificação histológica.
18
4.2 Protocolos imuno-histoquímicos..............................................................
20
4.3 Contagem das células imunomarcadas e dos mastócitos .....................
23
4.4 Estudo de seguimento.............................................................................
24
4.5 Análise estatística....................................................................................
24
V. RESULTADOS...............................................................................................
26
VI. DISCUSSAO.................................................................................................
37
VII. CONCLUSÕES............................................................................................
44
VIII. REFERÊNCIAS..........................................................................................
45
APÊNDICE.........................................................................................................
57
APÊNDICE 1......................................................................................................
59
APÊNDICE 2 .....................................................................................................
61
x
xi
RELAÇÃO ENTRE O INFILTRADO INFLAMATÓRIO E AS CÉLULAS
DENDRÍTICAS NA RESPOSTA IMUNE AOS CARCINOMAS DO TIPO SIMPLES
EM MAMA DE CADELAS
RESUMO – As células dendríticas despertam atualmente um grande interesse de
estudos, pois são alvos primários da atividade tumoral sobre o sistema imune. O
objetivo principal deste estudo foi avaliar a relação entre o infiltrado inflamatório e as
células dendríticas (DCs) nos carcinomas mamários do tipo simples em cadelas.
Dois grupos de amostras foram formados, o primeiro composto por 18 amostras de
tecido mamário sem alterações (grupo controle) e o segundo, de 26 carcinomas
mamários do tipo simples (grupo tumor). Além disso, foram analisados 15 linfonodos
provenientes das cadelas com tumor de mama e quatro linfonodos oriundos das
cadelas sem tumor de mama. Foi realizada a imunodetecção de DCs mieloides
imaturas e maduras, DCs plasmocitoides, linfócitos T, macrófagos e moléculas do
complexo de histocompatibilidade maior classe II (MHC-II). Foram também
identificados os mastócitos pela coloração especial de azul de toluidina. Para os
linfonodos, realizou-se apenas a imunodetecção de DCs mieloides imaturas e
maduras. A idade média das cadelas com tumor de mama foi de 9,3 anos (30%) e
os cães sem raça definida (SRD) foram os mais afetados. Nenhum linfonodo
apresentou focos de micrometástases. Das 17 cadelas acompanhadas para o
estudo de seguimento, nove estão vivas e oito vieram a óbito. A causa de morte
mais ocorrente foi a provocada por metástases (67%). Nas mamas com tumor,
observou-se que os mastócitos e as DCs mieloides maduras apareciam nas regiões
peritumorais. As DCs mieloides imaturas, as DCs plasmocitoides, os macrófagos e
as células imunomarcadas para MHC-II foram visualizados somente no estroma
tumoral. Já os linfócitos T foram encontrados nas porções tumoral e peritumoral. Nos
linfonodos a marcação das DCs mieloides imaturas concentrou-se nos folículos
linfoides e na zona paracortical; já as DCs maduras apareceram somente no centro
dos folículos linfoides. Nas mamas controle, a quantidade de células inflamatórias,
assim como as DCs foi ínfima. Houve diferença estatística significativa quando
comparado os grupos controle e tumor para as DCs mieloides imaturas, DCs
mieloides maduras, DCs plasmocitoides e macrófagos. Quanto aos linfócitos T,
MHC-II e mastócitos, não foi observada diferença estatística quando comparado os
grupos controle e tumor. A predominância de DCs imaturas no grupo tumor,
possivelmente esteja relacionada com uma resposta imune ineficiente, favorecendo
o desenvolvimento e a sobrevivência das células tumorais. A presença das DCs
plasmocitóides no mesmo grupo seria indicativa de um pior prognóstico para cadelas
com tumores de mama. Portanto, a diferenciação das células dendríticas caninas
poderia ser influenciada pelas células neoplásicas e pelo microambiente tumoral.
Estes efeitos parecem estender-se aos linfócitos T e aos macrófagos, que também
foram predominantes no grupo tumor.
PALAVRAS-CHAVE: cão, células apresentadoras de antígeno, evasão imune,
imuno-histoquímica, neoplasia de mama.
xii
RELATIONSHIP BETWEEN THE INFLAMMATORY INFILTRATE AND THE
DENDRITIC CELLS IN THE IMMUNE RESPONSE TO CARCINOMAS SIMPLE
TYPE IN MAMMARY GLAND OF FEMALE DOGS
ABSTRACT - Dendritic cells currently represent a big focus of studies, because
they’re primary targets of tumor activity on the immune system. The main objective of
this study was to evaluate the relationship between the inflammatory infiltrate and
dendritic cells (DCs) in mammary carcinomas simple type in female’s dogs. Two
groups of mammary gland samples were formed, the first was composed of 18
mammary tissue samples unchanged (control group) and the second, with 26
mammary simple carcinomas (tumor group). In addition, 15 lymph nodes were
analyzed from bitches with mammary gland tumor and four lymph nodes derived from
bitches without mammary gland tumor. Immunodetection was performed to immature
and mature myeloid DCs, plasmacytoid DCs, T cells, macrophages and molecules of
the major histocompatibility complex class II (MHC -II). Mast cells have also been
identified by the special staining toluidine blue. To lymph nodes, the
immunodetection was performed only to immature and mature myeloid DCs. The
average age of the bitches with mammary tumor was 9.3 years (30 %) and dogs
without breed (SRD) were the most affected. No lymph node showed foci of
micrometastases. From 17 bitches monitored for follow-up study, nine are alive and
eight died. The cause of death more occurred was caused by metastasis (67%). In
the mammary glands with tumor, it was observed that the mast cells and mature
myeloid DCs appeared in peritumoral regions. The immature myeloid DCs,
plasmacytoid DCs, macrophages and cells immunostained for MHC-II were seen
only in the tumor stroma. The T cells were founded into the tumor and in peritumoral
areas. Into the lymph nodes, the marking of immature myeloid DCs was concentrated
in lymphoid follicles and paracortical zone; the mature DCs appeared only in the
center of the lymphoid follicles. In mammary gland control, the number of
inflammatory cells as well as DCs was minimal. Statistically significant difference was
observed when the control group was compared with tumor group for immature
myeloid DCs, mature myeloid DCs, plasmacytoid DCs and macrophages. As for T
cells, mast cells and MHC-II, there was no statistical difference when compared
tumor and control groups. The predominance of immature DCs in the tumor group is
possibly related to an inefficient immune response, favoring the development and
survival of tumor cells. The presence of plasmacytoid DCs in the same group would
be indicative of a worse prognosis for female dogs with mammary tumors. Therefore,
differentiation of dendritic cells could be influenced by canine tumor cells and the
tumor microenvironment. These effects appear to extend to macrophages and T
cells, which were also prevalent in tumor group.
KEY-WORDS:
dog,
antigen
presenting
immunohistochemistry, mammary tumor.
cells,
immune
evasion,
xiii
LISTAS DE ABREVIATURAS
APCs – Células apresentadoras de antígeno
AT – Coloração de azul de toluidina
CD – Cluster of differenciation
CD3– Co-receptor de linfócitos T
CD11c – Integrina αX de membrana presente em células dendríticas imaturas
CD83 – Molécula co-estimulatória marcadora de superfície de células dendríticas
maduras
IL-3Rα– Interleucina3 (CD123) alfa, marcador de superfície de células dendríticas
plasmocitoides
DCs – Células dendríticas
CTLs – Linfócitos citotóxicos
IFN-1 – Intérferon tipo 1
FDCs – Células dendríticas foliculares
GM-CSF – Fator de estimulação de colônia de macrófagos e granulócitos
HE – Coloração de Hematoxilina e Eosina
IL-6 – Interleucina6
IL-10 – Interleucina 10
IL-12 – Interleucina 12
MCs – Mastócitos
M-CSF – Fator de estimulação de colônia de macrófagos
MHC – Complexo de histocompatibilidade principal
MHC I – Complexo de histocompatibilidade principal de classe I
MHC II – Complexo de histocompatibilidade principal de classe II
NK – Células natural killer
SNK – Teste de Student Newman-Keuls
TAMs - macrófagos associados ao tumor
TH2 – Linfócito T helper 2
TLRs – Receptores toll-like
TGF-β – Fator de transformação do crescimento beta
VEGF – Fator de crescimento do endotélio vascular
xiv
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. As múltiplas e controversas as vias de diferenciação de DCs
em humanos e camundongos, estabelecidas com base em
evidências experimentais. Caixas sólidos e setas sólidas
(pretas e verdes) indicam a existência comprovada das
populações precursoras e vias de diferenciação. A caixa
tracejada e as setas tracejadas (pretas e verdes) indicam a
existência das mesmas, porém não comprovadas formalmente.
Caixas vermelhas e setas vermelhas indicam a possível
existência de precursores para essas populações e vias de
diferenciação, respectivamente. (Adaptado de ARDAVÍN et al.
2001). No cão, estas relações ainda não foram discutidas
formalmente..................................................................................
9
Figura 2. Esquema básico demonstrando a diferenciação das DCs quanto
a sua origem e localização. (Adaptado de Pinã-Oviedo, OrtizHidalgo, 2007)..............................................................................
10
Figura 3. Fotomicrografias das neoplasias mamárias malignas em
cadelas. (A) Carcinoma tubular grau I, com evidente processo
inflamatório no interstício tumoral (setas) (barra = 100 µm). (B)
Carcinoma tubular grau II, com evidente aumento do número
de células neoplásicas no interior dos túbulos (setas) (barra =
90 µm). (C) Carcinoma tubular grau III apresentando infiltrado
inflamatório (setas) no interstício tumoral (barra = 60 µm). (D)
Carcinoma papilar grau I com focos de infiltrado inflamatório
focal (setas) no estroma tumoral (barra = 90 µm). Coloração de
Hematoxilina e eosina..................................................................
27
Figura 4. Fotomicrografias das neoplasias mamárias malignas em
cadelas. (A) Carcinoma papilar grau II com evidentes
formações papilares (setas). (barra = 90 µm). (B) Carcinoma
sólido grau II. Notar figuras de mitose (setas) (barra = 60 µm).
(C) Carcinoma sólido grau III em mama de cadela, com áreas
de infiltrado inflamatório multifocal (setas) (barra = 60 µm).
Coloração de Hematoxilina e eosina. (D) Infiltrado de
mastócitos no estroma e no interior de um carcinoma papilar
grau I (setas) (barra = 100 µm). Coloração de Azul de
Toluidina.......................................................................................
28
xv
Figura 5. Fotomicrografia das imunomarcações em tecido mamário de
cadelas. (A) Marcação de DCs mieloides imaturas em um
carcinoma tubular grau I (barra = 50 µm). (B) Marcação das
DCs mieloides maduras em região peritumoral de um
carcinoma tubular grau III (barra = 100 µm) (no detalhe, uma
DC madura no infiltrado inflamatório). (C) Marcação dos
linfócitos T em um carcinoma tubular grau I (barra = 50 µm), (D)
Marcação do MHC-II em um carcinoma tubular grau III (barra =
50 µm). (E) Marcação de macrófagos em um carcinoma tubular
grau III (barra = 50 µm). (F) Marcação de DCs plasmocitoides
em um carcinoma tubular grau III (barra = 50 µm).......................
30
Figura 6. Médias e erros-padrões para a contagem dos mastócitos
(p<0,1319) e das DCs mieloides imaturas (p<0,0001) e das
DCs mieloides maduras, (p<0,0198) nos grupos controle e
tumor nas mamas de cadelas. Teste Student Newman
Keuls.............................................................................................
31
Figura 7. Médias e erros-padrões para a contagem das marcações dos
linfócitos T, (Teste Mann-Whitney, p<0,0790), do MHC-II,
(Teste Student Newman Keuls, p<0,0593) do macrófago (Teste
Mann-Whitney, p<0,0472), e das DCs plasmocitoides (Teste
Student Newman Keuls, p<0,0214) nos grupos controle e tumor
nas mamas de cadelas.................................................................
32
Figura 8. Determinação do coeficiente de correlação de Spearman para a
avaliar a correlação entre a quantidade de DCs plasmocitoides,
tipo histológico e grau dos tumores de mama caninos dos
grupos controle e tumor................................................................
34
Figura 9. Determinação do coeficiente de correlação de Spearman para o
perfil celular (macrófagos, linfócitos, mastócitos e DCs imaturas
e maduras), bem como para MHC-II e IL-3, em tecidos
mamários caninos dos grupos controle e tumor...........................
35
Figura 10. Fotomicrografias das imunomarcações em linfonodos inguinais
de cadelas com tumor de mama e seus respectivos gráficos.
(A) Marcação das DCs mieloides imaturas (anti-CD11c)
concentrada no centro dos folículos linfoides e paracortical
(barra = 100 µm). (B) Médias e erros-padrões das marcações
das DCs mieloides imaturas (anti-CD11c, teste Mann-Whitney,
p<0,1567) nos linfonodos dos grupos controle e tumor. (C)
Marcação das DCs mieloide maduras (anti-CD83) localizada no
centro dos folículos linfoides (barra = 100 µm). (D) Médias e
erros-padrões das DCs mieloide maduras (anti-CD83, teste
Student Newman Keuls, p<0,0173) nos linfonodos dos grupos
controle e tumor............................................................................
36
xvi
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Total de tumores de mama classificados pelo tipo
histológico e graus de malignidade......................................
19
Tabela 2. Anticorpos utilizados para a imunomarcação das células
dendríticas, do infiltrado inflamatório e do MHC-II presente
nas mamas com e sem neoplasia.......................................
20
Tabela 3. Especificação do tipo e tempo de recuperação antigênica,
diluição e tempo de incubação do anticorpo primário e
respectivo substrato.............................................................
23
Tabela 4. Presença de imunomarcação para DCs plasmocitoides
(CD123) em glândula mamária de cães acometidos ou
não por tumor mamário........................................................
33
Tabela 5. Presença de imunomarcação para DCs plasmocitoides
(CD123) em relação ao tipo histológico dos tumores de
mama caninos......................................................................
33
Tabela 6. Médias, desvio padrão e erro padrão das contagens das
células imunomarcadas dos respectivos anticorpos nos
grupos controle e tumor.......................................................
34
1
I. INTRODUÇÃO
O estudo da neoplasia mamária apresenta grande significado no âmbito da
medicina veterinária devido a sua grande ocorrência na espécie animal,
principalmente nas cadelas. A glândula mamária é alvo do desenvolvimento de
tumores em virtude da variedade de tipos celulares existentes e potencialmente são
susceptíveis de sofrerem mutações e originarem diferentes tipos de tumores. Dada a
essa relevância, as neoformações em tecido mamário são continuamente
estudadas, a fim de se compreender os mecanismos de defesa do hospedeiro,
assim como os meios de evasão deste tumor.
Apesar dos intensos esforços em estudar a relação entre o sistema imune e o
câncer, a sua biologia ainda está longe de ser elucidada, pois existem inúmeros
mecanismos de evasão tumoral que dificultam o sistema imune responder
corretamente e eliminar o tumor. Um dos primeiros alvos de evasão imune dos
tumores são as células dendríticas (DCs), que, uma vez inibidas de amadurecer,
podem induzir a tolerância imunológica e prejudicar uma das suas principais
funções, que é apresentar antígenos e ativar os linfócitos T.
As DCs são consideradas as mais eficientes apresentadoras de antígeno,
pois funcionam como uma “ponte” entre as respostas imunes inata e a adquirida.
São células multifuncionais, que atuam como sentinelas em praticamente todos os
órgãos. Após a sua ativação, desencadeada pela resposta inflamatória ou pelo
contato direto com patógenos, processam fragmentos antigênicos e então migram
para os órgãos linfoides periféricos, onde atuarão como células apresentadoras de
antígenos maduras para os linfócitos T.
Atualmente, as DCs se tornaram um grande alvo de pesquisas. Estão no foco
de estudos para a confecção de vacinas antitumorais para pacientes humanos, uma
vez que apresentam baixa toxicidade. Muitos projetos são fundamentados na
pesquisa das DCs em diferentes tecidos e até mesmo em tumores de diversas
espécies. Todavia, a detecção destas células ainda é prejudicada dada a escassez
das mesmas in vivo. Ainda há a questão da ausência de marcadores específicos,
2
que prejudica ainda mais a compreensão do seu comportamento dentro dos
diversos microambientes tumorais.
Em meio a toda essa busca pelo entendimento do papel das DCs, não há
registros de estudos que relatem o verdadeiro papel destas células na resposta
imune em cães com tumor de mama. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a
presença de células dendríticas nos tumores de mama em cadelas, por meio da
técnica de imuno-histoquímica.
3
II. REVISÃO DE LITERATURA
2. 1 Neoplasia mamária em cadelas
A neoplasia mamária é comumente encontrada na rotina de médicos
veterinários por todo o mundo, devido ao progressivo aumento no diagnóstico desta
doença (LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007). O tumor de mama é considerado o
tipo de neoplasia mais diagnosticada em cadelas (MISDORP, 2002; QUEIROGA;
LOPES, 2002; ZATLOUKAL et al., 2005; LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007).
Não há predisposição racial, porém há um maior risco para animais de raças
puras (DALECK et al., 1998) serem alvos do tumor de mama. As fêmeas caninas de
meia idade a idosas são as mais acometidas e em mais de 50% dos casos as
neoformações são malignas (QUEIROGA; LOPES, 2002; OLIVEIRA et al., 2003;
ZATLOUKAL et al., 2005.; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010).
A cadela possui cinco pares de glândulas mamárias (torácicas craniais,
torácicas
caudais,
abdominais
craniais,
abdominais
caudais
e
inguinais)
(CARVALHO, 2006) e, aproximadamente 60% dos tumores ocorrem nas mamas
inguinais (QUEIROGA; LOPES, 2002). A razão desta ocorrência ainda não é clara,
mas pode estar relacionada ao maior volume das mamas inguinais e,
consequentemente,
à
maior
exposição
ao
estrógeno
(MOULTON,
1990;
CARVALHO, 2006).
A etiologia do tumor mamário canino, assim como de qualquer neoplasia, é
multifatorial. Alterações genéticas, influências hormonais, nutricionais e ambientais
já foram associadas ao surgimento de neoplasias nas mamas desta espécie (DE
NARDI et al., 2002; MISDORP, 2002; TORÍBIO et al., 2012). A alimentação caseira
composta por carnes de origem bovina e suína, assim como a obesidade no primeiro
ano de vida são fatores que predispõe o surgimento do tumor. A relação com vírus
ainda não foi totalmente elucidada, no entanto já foram detectadas partículas virais
em células de tumor de mama de cadelas e gatas (ZATLOUKAL et al., 2005;
CARVALHO, 2006).
4
A presença de receptores hormonais em alguns tipos de tumores de mama
reforça a hipótese de que o crescimento tumoral em cães tem uma estreita relação
com a presença de hormônios, como o estrógeno e a progesterona (CARVALHO,
2006; LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007).
A não realização da castração precoce e o fornecimento de progestágenos
exógenos podem influenciar no desenvolvimento de neoformações na glândula
mamária, já que os hormônios agem como promotores e não iniciadores da
neoplasia (FONSECA; DALECK, 2000; MARTINS; LOPES, 2005). A ováriohisterectomia é ainda a melhor forma de prevenção (DE NARDI et al., 2002;
MISDORP, 2002; ZATLOUKAL et al., 2005; LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007).
Quando realizada antes do primeiro estro, reduz o risco de desenvolvimento da
neoplasia em 0,5%; após o primeiro cio, este risco aumenta significativamente para
8,0% e depois do segundo cio, o risco sobe para 26%. Após os dois anos e meio de
idade, a proteção conferida pela castração desaparece (FONSECA; DALECK,
2000).
A primeira abordagem da cadela com nódulos mamários deve consistir na
avaliação clínica (TORÍBIO et al., 2012) e exame físico minucioso, não apenas das
glândulas mamárias, mas também de características gerais que possibilitem avaliar
o estado geral do animal (FELICIANO et al., 2012).Todo aumento de volume no
tecido mamário merece investigação a fim de descartar outros possíveis
diagnósticos diferenciais, e moldar uma linha de tratamento correta a ser seguida
(ZUCCARI; SANTANA; ROCHA, 2001; CARVALHO, 2006).
Os elementos prognósticos são representados por sinais objetivos que
permitem prever as características evolutivas do tumor e avaliar a resposta aos
tratamentos (CARVALHO, 2006). Em medicina veterinária, existe um esforço
crescente na tentativa de adicionar aos fatores prognósticos clássicos (tamanho do
tumor, presença de ulceração cutânea, invasão ganglionar linfática), novos
parâmetros de natureza molecular, que auxiliem a decisão clínica, à semelhança do
verificado em medicina humana (QUEIROGA; LOPES, 2002).
O diagnóstico é realizado através da avaliação microscópica, por intermédio
da citologia e histopatologia. A citologia possibilita avaliar o tipo celular e verificar
sua origem, além de auxiliar no descarte de outras causas como mastite, lactação,
5
ou até mesmo outros tumores, como os de pele (ZUCCARI; SANTANA; ROCHA,
2001). A análise histopatológica permite avaliar a arquitetura tecidual, inspecionar as
margens cirúrgicas, observar características de malignidade e invasão (FELICIANO
et al., 2012), assim como, verificar as adjacências que incluem linfonodos, vasos
sanguíneos e linfáticos (MORRISON; De NICOLA, 1993).
A classificação histológica usada em medicina veterinária não é consensual.
Têm sido utilizados diferentes sistemas para classificar microscopicamente as
neoformações mamárias caninas, de forma a prever o seu comportamento
(QUEIROGA; LOPES, 2002). A classificação estabelecida pela Organização Mundial
da Saúde (OMS) tenta obter uma divisão de peso prognóstico e é tida como sendo a
mais utilizada em todo o mundo, pois classifica os tumores de acordo com o seu
potencial de malignidade (LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007).
O mais recente consenso para classificação histológica das neoplasias
mamárias caninas é o de Cassali et al. (2011), que se baseou em Misdorp et al.
(1999) e que propôs alguns novos critérios, a fim de estabelecer um padrão para o
diagnóstico, prognóstico e tratamento da neoplasia mamária canina. Algumas
alterações, como em relação aos carcinomas do tipo simples, foram realizadas. Ao
considerar esse tipo de carcinoma, Misdorp et al. (1999) os subdividiu em
túbulopapilíferos, sólidos e anaplásicos; já Cassali et al. (2011) classificou como
carcinoma do tipo simples somente os tubulares, papilíferos e sólidos. A
classificação mais atual foi adotada como referência neste estudo por se tratar de
um consenso nacional e que teve por objetivo padronizar os critérios de avaliação
deste tipo de neoplasia no Brasil.
2. 2 Células dendríticas
O interesse em investigar a relação entre o sistema imune, as células
tumorais e seu microambiente é crescente e, a cada dia surgem novas pesquisas
que buscam ilustrar os mecanismos envolvidos no complexo processo do escape
tumoral. Para que um grupo de células neoplásicas seja eliminado é necessário que
6
haja o envolvimento das imunidades inata e adquirida, formando um sistema
integrado de defesa do hospedeiro, no qual diversas células e moléculas atuam
mutuamente (MATIAS, 2010). Os principais componentes da imunidade inata
incluem: barreiras físicas e químicas, fagócitos, células natural killer (NK) e citocinas.
A resposta imune adaptativa é mediada pelos linfócitos T, que desenvolvem
mecanismos efetores capazes de eliminar as células tumorais (ABBAS; LICHTMAN,
2007a; ONUCHIC; CHAMMAS, 2010; CRUVINEL et al., 2010). Um dos processos
de evasão do tumor é pela indução da tolerância imunológica, que favorece o
desenvolvimento tumoral (KRATHWOHL; SCHACKER; ANDERSON, et al., 2006).
No século 20, os imunologistas ainda buscavam compreender a relação
existente entre os antígenos e os linfócitos. A principal dúvida era compreender
como o sistema imune conseguia iniciar uma resposta mediada por células, no
momento em que o antígeno penetrava em um organismo. Somente em meados da
década de 1960 foi que um terceiro elemento, denominado primariamente de “novel
cells” (novas células) e posteriormente de células dendríticas (DCs), foi descrito e
inserido neste contexto imunológico, elucidando melhor a relação antígeno-linfócitos
(STEINMAN, 2012).
As DCs já haviam sido detectadas na pele humana graças à descrição feita
por Paul Langerhans, no ano de 1868. No entanto, a sua função era totalmente
desconhecida e somente na década de 70 que os pesquisadores Ralph Steinman e
Zanvil Cohn identificaram essa “nova” população celular no baço de camundongos.
Assim iniciaram os estudos com esta nova população de leucócitos. Portanto, a
partir daí o papel das DCs na imunidade e seu potencial imunoterápico tem sido
vastamente investigados (HART, 1997; MALDONADO-LÓPEZ; MOSER, 2001;
JOLLES, 2002; WIEDER, 2003).
O interesse especulativo aumentou ainda mais quando foi comprovado que as
DCs participavam do processo de rejeição aos transplantes de coração e rins
realizados em humanos. Muitos foram os fatores que contribuíram para dificultar a
compreensão das funções das DCs, tais como a escassez de marcadores
específicos, a dificuldade em distingui-las de monócitos e macrófagos, bem como os
problemas envolvendo a sua purificação. Porém os estudos persistiram, seguindo a
corrente mais plausível de que as DCs pertencem a uma população rara de
7
leucócitos
com
complexa
heterogeneidade
fenotípica
e
funcional.
São
especializadas em processar e apresentar antígenos, dando início à resposta imune
primária e secundária dos linfócitos T (HART, 1997; BANCHEREAU; STEINMAN,
1998; KAH-WAI et al., 2006).
Somente na década de 1980 que o conceito de que as DCs são células
apresentadoras de antígenos (APCs) profissionais foi finalmente aceito. As DCs são
altamente potentes em atuar na captura, processamento e apresentação dos
antígenos aos linfócitos T e B (WIEDER, 2003; KAH-WAI et al., 2006). Elas
expressam elevado nível de moléculas do complexo de histocompatibilidade
principal (MHC), moléculas co-estimulatórias e moléculas adesivas; um pré-requisito
para a ativação de linfócitos T (KAH-WAI et al., 2006).
A ativação dos linfócitos T depende diretamente da intervenção das DCs, pois
os linfócitos T só reconhecem um antígeno se este for apresentado por uma APC,
diferente dos linfócitos B que são capazes de reconhecer diretamente antígenos
através dos seus receptores. Por essa razão, as DCs são consideradas um ligante
entre as imunidades inata e a adaptativa (CRUVINEL et al., 2010). Os receptores de
antígenos presentes nos linfócitos T reconhecem os fragmentos de antígenos
apresentados pelas DCs, ligados a moléculas de MHC, tanto de classe I quanto de
classe II, as quais estimulam os linfócitos T citotóxicos (CTLs) e os linfócitos T
helper, respectivamente (BANCHEREAU; STEINMAN, 1998).
Existem outras APCs, ou seja, células capazes de processar e apresentar
antígenos, como os macrófagos e os próprios linfócitos B. Estas células podem ser
encontradas na maioria dos tecidos, estando em maior número que as DCs dentro
do organismo e são tão eficazes quanto elas em capturar, processar e apresentar
fragmentos de antígeno (KAH-WAI et al., 2006; ABBAS; LICHTMAN, 2007a).
Acreditava-se que as DCs eram muito semelhantes fenotipicamente e
funcionalmente aos monócitos e macrófagos, por terem morfologia e a capacidade
de realizar fagocitose, além de serem originadas na medula óssea. De fato, as
evidências geradas por diferentes abordagens experimentais suportaram esse
conceito até o momento em que as DCs foram descritas como sendo uma nova
população de leucócitos. No entanto, uma série de resultados gerados in vivo e in
vitro, tanto em seres humanos como em camundongos, originou outro conceito, de
8
que as DCs podem ser formadas também a partir de precursores linfoides e não
somente mieloides (ARDAVÍN et al., 2001; MALDONADO-LÓPEZ; MOSER, 2001).
Apesar dos cães serem utilizados em estudos com transplantes na medicina
aliado ao crescente interesse na utilização de vacinas com DCs, apenas poucos
ensaios clínicos foram realizados em cães até hoje. A principal causa se deve a falta
de técnicas de padronizadas de isolamento, bem como, informações limitadas sobre
o fenótipo e morfologia que caracterizem as DCs caninas in vivo. Por este fato, não
há um marcador de superfície celular que seja expresso somente por elas (WIEDER,
2003; QESKAA, BAUMGÄRTNERA, BEINEKEA, 2013).
Para a análise de citometria de fluxo, um painel de diferentes anticorpos
dirigidos contra moléculas de superfície (CD1a, CD11c, CD40, CD80, CD83, CD86,
CD206, CD209, e TLR-3) já foi proposto para classificar as DCs caninas (WIEDER,
2003; QESKAA, BAUMGÄRTNERA, BEINEKEA, 2013). Em se tratando de análise
imuno-histoquímica, mesmo para humanos, é necessário montar um grupo de
anticorpos que expressem a presença e ausência de vários marcadores celulares.
Em um estudo recente, verificou-se que as DCs caninas produzidas in vitro são
classificadas como CD1c+ , CD11c+ , MHCII+ , CD80+ , CD86+ e CD40+. No
entanto, ainda não foi descrito se o comportamento delas é o mesmo in vivo.
(RICKLIN-GUTZWILLER et al., 2010)
Para humanos, os marcadores sugeridos para imuno-histoquímica incluem o
MHC (classe II), marcadores de moléculas de adesão (como o CD1a, CD11c,
CD50, CD54, CD58 e CD102) e ainda os marcadores de moléculas co-estimulatórias
(como CD80, CD83 e CD86). Marcadores de linhagens celulares, como CD3
(linfócitos T), CD14 (monócitos), CD19 (linfócitos B), CD56 (células NK) e CD66b
(granulócitos), não são expressos pelas DCs. Com uma grande variedade de
marcadores de superfície disponível, o painel para a detecção de DCs pode tornarse confuso e extenso. Na prática, a sua identificação por fenotipagem de superfície
em tecidos com neoplasia pode ser conseguida demonstrando basicamente,
marcação de MHC classe II, marcação de uma molécula de adesão, marcação de
uma molécula co-estimulatórias, além de um marcador de linhagem que deve ser
incluído a fim de diferenciar de outras células (WIEDER, 2003).
9
2.2.1 Origem e tipos de células dendríticas
As DCs representam um grupo de leucócitos muito diversificado. A sua
heterogeneidade depende de populações precursoras, da localização anatômica, da
função e do resultado final da resposta imune. Nos últimos anos muitas tentativas
têm sido realizadas, a fim de classificar as subpopulações de DCs por análise
fenotípica e funcional. Até o ano 2000 ainda não havia um modelo completo
estabelecido para humanos (BANCHEREAU et al., 2000). Hoje, este modelo é bem
estabelecido para humanos (LIU; NUSSENZWEIG, 2010) e para camundongos
(ARDAVÍN et al. 2001 – Fig 1).
Figura 1. As múltiplas e controversas vias de diferenciação de DCs em humanos e camundongos,
estabelecidas com base em evidências experimentais. Caixas sólidos e setas sólidas (pretas e
verdes) indicam a existência comprovada das populações precursoras e vias de diferenciação. A
caixa tracejada e as setas tracejadas (pretas e verdes) indicam a existência das mesmas, porém não
comprovadas formalmente. Caixas vermelhas e setas vermelhas indicam a possível existência de
precursores para essas populações e vias de diferenciação, respectivamente. (Adaptado de
ARDAVÍN et al. 2001). No cão, estas relações ainda não foram discutidas formalmente.
As DCs podem ser classificadas de acordo com sua origem, sua localização
anatômica (Fig 2) e seu estágio de maturação (BANCHEREAU et al., 2000). Deve-
10
se levar em conta o fato de que existem diferentes subpopulações, com
características fenotípicas únicas e funcionais encontradas em diferentes locais
(ARDAVÍN et al., 2001).
Figura 2. Esquema básico demonstrando a diferenciação das DCs quanto a sua origem e
localização. (Adaptado de Pinã-Oviedo, Ortiz-Hidalgo, 2007).
Em humanos já foi estabelecido que as DCs são oriundas das células
pluripotentes CD34+ presentes na medula óssea e se diferenciam em duas vias
principais: a via mieloide e a via linfoide. Esta última aparece numa proporção menor
no organismo, quando comparada à primeira (BANCHEREAU; STEINMAN, 1998;
GOGOLÁK et al., 2003; CRUVINEL et al., 2010; MATIAS, 2010). Estas linhagens
são diferenciadas pelo marcador mieloide CD11c. As DCs mieloides possuem
marcação
CD11c+/CD123-,
enquanto
as
linfoides
são
CD11c-/CD123+
(PULENDRAN et al., 1999).
Notavelmente, as DCs mieloides e linfoides diferem não apenas nos seus
marcadores fenotípicos, mas também nas suas propriedades funcionais. As
mieloides são potentes APCs tipicamente associadas à ativação dos linfócitos T,
além de iniciarem a resposta imunitária adaptativa, produzem citocinas e estimulam
11
a citotoxicidade das células NK. Por outro lado, as DCs da linhagem linfoide
(plasmocitoides) são consideradas um subconjunto de células que se especializaram
na produção de interferon tipo I (IFN) na estimulação por vários tipos de vírus. Em
conformidade com seus papéis distintos na formação de uma resposta imune, as
DCs mieloides e linfoides expressam um conjunto complementar, porém distinto de
receptores toll-like (TLRs), indicando que respondem diferentemente aos patógenos
(KALINSKI et al, 2005).
Quanto à sua localização, as DCs são classificadas em epidérmicas (células
de Langerhans), circulantes (presentes na circulação sanguínea), intersticiais
(presentes no interstício de órgãos não linfoides) e as interdigitantes (presentes nos
órgão linfoides) (THOMAS; LIPSKY, 1996).
As DCs ainda são subdivididas de acordo com seu estágio de maturação, em
imaturas, maduras e semi-maduras (LUTZ; SCHULER, 2002). Uma importante
característica funcional das DCs imaturas é a sua capacidade de realizar endocitose,
mecanismo que sozinho não é capaz de transformá-las em maduras (LUTZ;
SCHULER, 2002). As DCs maduras são caracterizadas por apresentarem
numerosos processos de membrana que se estendem, a partir do corpo principal da
célula (semelhante aos dendritos dos neurônios), e de conterem estruturas
intracelulares abundantes, relacionadas ao processamento de antígenos, incluindo
endossomas, lisossomas e grânulos de Birbeck (presentes nas células de
Langerhans epidermais). Além disso, expressam altos níveis de MHC-II e moléculas
co-estimulatórias (WIEDER, 2003).
O terceiro tipo de maturação é observado apenas em situações patológicas.
As DCs com fenótipo semi-maduro migram para os linfonodos e induzem tolerância
nos linfócitos T, ao invés de imunidade. O amadurecimento completo requer tanto a
presença de um antígeno quanto um sinal químico de “invasão”. A principal
diferença entre as DCs semi-maduras das totalmente maduras é que apenas as
maduras secretam citocinas (especialmente as interleucinas IL-12 e 6), que levam a
promoção de uma resposta efetora de linfócitos T. Assim como acontece com as
DCs imaturas, as interações entre as semi-maduras e os linfócitos T resultam no
desenvolvimento de tolerância aos antígenos apresentados (KRATHWOHL;
SCHACKER; ANDERSON, et al., 2006).
12
As DCs são decisivas para a determinação da ativação e do tipo de
imunidade mediada pelos linfócitos T. Em geral, DCs semi-maduras são
tolerogênicas, enquanto DCs maduras são imunoestimuladoras (CRUVINEL et al.,
2010). Um estudo realizado por Krathwohl, Schacker e Anderson (2006) levantou a
hipótese de que o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) induz um estado de
semi-maturação nas DCs que acabam por se acumularem nos linfonodos, induzindo
a tolerância imunológica.
Existe ainda um último subtipo de DCs, as chamadas células dendríticas
foliculares (FDCs), presentes nos linfonodos e que fazem parte do grupo de células
que fornecem estrutura e estabilidade funcional para o microambiente nodal. As
FDCs tem a capacidade de manter um antígeno por um longo período (de meses a
anos) preso dentro de seus processos citoplasmáticos, que se entrelaçam para
formar uma densa malha tridimensional. Sua origem não é hematopoiética, no
entanto, supõe-se que sejam oriundas de células mesenquimais migratórias (REZK
et al., 2012).
2.2.2 Processamento e apresentação antigênica
As DCs são as principais células apresentadoras de antígenos aos linfócitos T
in vivo (KRATHWOHL et al., 2006). Os linfócitos T apresentam uma propriedade
peculiar, denominada de restrição pelo MHC, que significa que eles só reconhecem
um antígeno peptídico se estiver ligado pelas moléculas do MHC, presentes nas
APCs. Somente desta maneira a resposta imunológica será iniciada (ABBAS;
LICHTMAN, 2007b).
As precursoras das células dendríticas circulam no sangue na sua forma
inativa para subsequentemente, darem origem as DCs imaturas que residem nos
tecidos periféricos (KAH-WAI et al., 2006; WANG et al., 2007a). Perante um estímulo
antigênico, as DCs deixam a medula óssea para chegarem ao local da injúria e se
tornarem
imaturas,
onde
passarão
a
apresentar
grande
capacidade
de
capturar/processar antígenos e baixa habilidade em estimular linfócitos T virgens
(ABBAS; LICHTMAN, 2007b; MATIAS, 2010). Um aspecto curioso é que as DCs são
13
células que chegam muito rápido ao local de injúria, precedendo até mesmo os
neutrófilos (CRUVINEL et al., 2010). Ao mesmo tempo, a presença do antígeno
estimula as reações da imunidade inata e liga-se aos receptores TLRs das DCs,
assim como das células epiteliais e macrófagos residentes no tecido doente. Tudo
isto resulta na produção de citocinas e a sinalização direta do TLR, ativando as DCs
que passam por diversas alterações fenotípicas e funcionais (GOGOLÁK et al.,
2003; KAH-WAI et al., 2006; ABBAS; LICHTMAN, 2007b).
As DCs tornam-se ativadas e expressam receptores de superfície, que são
específicos para quimiocinas produzidas na zona dos linfócitos T, dentro dos órgão
linfoides. Tais quimiocinas direcionam as DCs a saírem do local da injúria e
seguirem para os linfonodos, por meio dos vasos linfáticos. Durante essa migração,
as DCs amadurecem, passando de células captadoras de antígenos para células
estimuladoras de linfócitos T virgens. Com o amadurecimento há o aumento na
síntese e na expressão estável de moléculas co-estimulatórias (como CD40, CD58,
CD80 e CD86), necessárias para uma resposta completa das células T (ABBAS;
LICHTMAN, 2007b; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008).
Os antígenos internalizados (microrganismo ou proteínas tumorais) são
apresentados aos linfócitos T, associados a moléculas de MHC de classe II. Já os
antígenos citosólicos (proteínas produzidas no citoplasma de células infectadas por
vírus) são apresentados aos linfócitos T pelo MHC de classe I. Essas duas vias de
processamento antigênico envolvem organelas e proteínas diferentes. São
projetadas para capturar amostras de todas as proteínas presentes nos ambientes
extracelular e intracelular. A segregação das vias de processamento também
garantem que diferentes classes de linfócitos T reconheçam antígenos de
compartimentos diferentes (BANCHEREAU; STEINMAN, 1998; ABBAS; LICHTMAN,
2007b).
Após os linfócitos T entrarem em contato com a células apresentadoras de
antígeno, que carrearam o antígeno até o linfonodo, os linfócitos T tornam-se células
efetoras. Em resposta a esse conjunto de reações, citocinas são liberadas para
estimularem a produção de linfócitos T específicos para o antígeno (expansão
clonal), que irá influenciar diversos grupos de células T. Uma parte destes linfócitos
sofre processo de diferenciação de células T virgens em células T efetoras; outro
14
grupo de células T permanece no linfonodo, eliminando as células infectadas ou
fornecendo sinais para os linfócitos B; algumas células T deixam o linfonodo e
partem em direção ao local injuriado, onde são capazes de erradicar o antígeno; há
ainda um outro grupo que prolifera em resposta ao antígeno e se torna célula T de
memória. O estímulo de diferenciação dos linfócitos cessa após a eliminação
completa do agente agressor (ABBAS; LICHTMAN, 2007b).
2.3 As células dendríticas e o tumor de mama
O sistema imunológico reage de diversas formas frente aos diferentes tipos
de neoplasias. Alguns antígenos tumorais podem ser fracamente imunogênicos, o
que enfraquece as funções do sistema imune. Nessas condições, o sistema de
defesa não consegue trabalhar corretamente e acaba por ser suplantado pelo tumor.
Acredita-se que a falha funcional das células dendríticas seja um dos principais
fatores que levam ao escape tumoral (KAH-WAI; JACEK; JACEK, 2006).
A produção de fatores derivados do tumor pode induzir a falha das DCs,
afetando a diferenciação destas e seus processos de maturação. Muitas citocinas
derivadas de tumores, que possuem atividade imunossupressora, podem impedir o
desenvolvimento de DCs totalmente maduras, como é o caso do VEGF (fator de
crescimento derivado do endotélio vascular), M-CSF fator estimulador de colônias de
macrófagos), IL-6, GM-CSF (fator estimulador de colônia de granulócitos), IL-10,
gangliosideos e TGF-β (fator de transformação e crescimento) (KAH-WAI; JACEK;
JACEK, 2006).
A maturação de uma DC é um ponto de controle na iniciação da resposta
imunológica. As DCs semi-maduras desempenham um papel significativo na
tolerância imunológica, através da indução de resposta de Th2. Como uma
consequência da maturação de células dendríticas defeituosas, há uma diminuição
de DCs maduras e funcionalmente competentes e um aumento de DCs imaturas. A
diminuição do número de DCs maduras faz com que haja uma incapacidade de
iniciar uma resposta imunitária específica contra o tumor, enquanto que um maior
15
número de DCs imaturas funcionalmente incompetentes induz a tolerância dos
linfócitos T. Como consequência, ocorre o escape tumoral da vigilância das DCs
(GABRILOVICH, 2004; KAH-WAI; JACEK; JACEK, 2006).
Estudos recentes em humanos com câncer de pulmão e de mama indicaram
uma diminuição significativa nas populações de DCs maduras. As DCs do sangue
periférico desses pacientes expressaram níveis inferiores de MHC II e de moléculas
co-estimulatórias, o que indicou falha na ativação das DCs. O entendimento da
relação dos defeitos das DCs com a progressão de tumores é clinicamente
importante. Embora muitos estudos tenham sido realizados para definir os
mecanismos que causam defeitos nas DCs no câncer, há muitos tipos de tumores
em que esses mecanismos moleculares ainda não foram totalmente definidos (KAHWAI; JACEK; JACEK, 2006).
Estudos anteriores mostraram que as DCs imaturas conseguem se infiltrar no
interior de carcinomas primários de mama em mulheres, e as DCs maduras ficaram
restritas apenas a periferia tumoral. Isso pode indicar que fatores estromais podem
determinar a adesão das DCs, uma vez que DCs maduras só são observadas em
órgãos linfoides (BELL et al., 1999). Já a infiltração de DCs plasmocitoides em
tumores mamários de mulheres já foi relacionada a baixa sobrevida das pacientes,
sugerindo uma contribuição destas células na progressão tumoral (TREILLEUX et
al., 2004).
2.4 As células dendríticas e os mastócitos
A capacidade de integrar os sinais derivados de patógenos invasores com
estímulos vindos de células vizinhas é uma característica muito importante das DCs
que lhes permitem regular e afinar a resposta imune adquirida contra os antígenos.
As DCs interagem e recebem sinais a partir de várias células do sistema imune,
como os mastócitos, neutrófilos, células NK, além das células epiteliais,
queratinócitos e células do estroma que servem como reguladores importantes de
funções das DCs (MAZZONI et al., 2013).
16
Os mastócitos (MCs) são amplamente distribuídos entre os tecidos dos
mamíferos, onde liberam significativas quantidades de mediadores pró-inflamatórios,
citocinas e fatores de crescimento. Eles se acumulam em sítios de crescimento
neoplásico em resposta a vários quimioatrativos derivados dos tumores, que
impedem a degranulação mastocitária (THEOHARIDES; CONTI, 2004). Por esta
razão, os mastócitos são considerados um dos possíveis coadjuvantes do
desenvolvimento tumoral (THEOHARIDES; CONTI, 2004). Desta forma, os tumores
podem controlar as atividades mastocitárias, dentre elas a atração de DCs imaturas
para o foco neoplásico (BACCI; PIMPINELLI; ROMAGNOLI, 2010). Essa tendência
dos mastócitos se acumularem em torno da área tumoral é visto por alguns
estudiosos como uma tentativa para se opor à progressão da população celular
anormal (ROVERE et al., 2007).
Cada vez mais surgem dúvidas sobre o envolvimento dos MCs no
crescimento dos tumores, dado ao grande número dessas células terem sido
detectadas em carcinomas mamários de mulheres, nas fases iniciais. Há discussão
sobre se a presença dos MCs seja um sinal de bom prognóstico, como já foi descrito
em tumores de mama em mulheres (DABIRI et al., 2004) e em carcinomas gástricos
em humanos (JIANG et al., 2002; HEIDARPOUR et al., 2007). Na veterinária, a
presença dos mastócitos já foi relacionada a mau prognóstico no tumor de mama em
cadelas, por estimularem a angiogênese tumoral (LAVALLE et al., 2010). Enquanto
na literatura médica vem se acumulando fortes evidências sobre a atividade dos
MCs na oncogênese humana, até o momento existem poucos relatos veterinários
focalizando o assunto (SFACTERIA et al., 2011).
Estudos anteriores mostram que há uma relação direta entre os mastócitos e
as DCs, no que se refere à maturação das últimas. Os MCs podem auxiliar na
maturação das DCs, com o aumento de moléculas co-estimulatórias circulantes
(DUDECK et al., 2011). Todavia, estudos relacionando as DCs e os mastócitos em
tumores de mama em cadelas são escassos, fato esse que estimulou a análise dos
dois tipos celulares nesse microambiente tumoral. A busca da compreensão da
relação destes achados com a agressividade dos carcinomas mamários tem o intuito
de esclarecer melhor a complexa biologia tumoral, bem como, identificar possíveis
mecanismos de escape imune envolvendo DCs e/ou MCs.
17
III. OBJETIVOS
O objetivo geral deste estudo foi avaliar a relação entre diferentes
subpopulações de células dendríticas e o infiltrado inflamatório nos carcinomas do
tipo simples em mamas de cadelas.
Os objetivos específicos foram:
- Determinar a densidade de DCs mieloides imaturas e maduras, por meio de
imuno-histoquímica, nos tumores de mama malignos;
- Verificar a imunodetecção de DCs imaturas e maduras nos linfonodos
inguinais das cadelas com tumor e sem tumor de mama;
- Determinar a densidade de células do infiltrado inflamatório tumoral
predominante (linfócitos, macrófagos e mastócitos) nos tumores de mama malignos;
- Verificar a associação entre a presença de mastócitos e de DCs mieloides
nos tumores de mama;
- Determinar a imunodetecção do receptor IL-3Rα (DCs plasmocitóides), nos
tumores mamários caninos e nas mamas sem tumor e verificar se existe relação
com mau prognóstico.
18
IV. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Grupos experimentais, colheita do material e classificação histológica
As
amostras
de
neoplasia
mamária
utilizadas
neste
estudo
foram
provenientes de 21 cadelas atendidas pelo Serviço de Oncologia Veterinária,
juntamente ao Serviço de Obstetrícia e Reprodução Animal do Hospital Veterinário
“Governador Laudo Natel” da FCAV – UNESP, Jaboticabal, SP, no período de 2011
a 2012. Destes animais foram selecionadas amostras de tumor de mama, que se
enquadraram dentro do tipo histológico proposto (carcinoma mamário do tipo
simples) e avaliados por histopatologia e imuno-histoquímica. Os linfonodos
inguinais provenientes destas mesmas cadelas com tumor (n=15), também foram
analisados por histopatologia e imuno-histoquímica. Além disso, amostras de
glândulas mamária hígidas foram obtidas de 12 fêmeas caninas necropsiadas no
Departamento de Patologia Veterinária da FCAV – UNESP – Jaboticabal, SP,
juntamente com linfonodos inguinais (n=4) foram analisados por histopatologia e
imuno-histoquímica. Foram utilizados mais de um tumor proveniente de uma mesma
cadela, assim como mais de uma mama controle proveniente de uma mesma
cadela.
As amostras de tecido mamário utilizadas neste estudo foram separadas em
dois grupos: grupo controle (formado pelas mamas sem neoplasia, totalizando 18
amostras) e grupo tumor (mamas com carcinoma do tipo simples, totalizando 26
amostras). Para todos os grupos não houve qualquer predileção por raça ou idade.
Os animais passaram por triagem clínica e eram encaminhados para o
procedimento cirúrgico (mastectomia radical unilateral), sob anestesia geral
inalatória. Durante o procedimento cirúrgico era aplicado um questionário com os
proprietários das cadelas com tumor de mama, a fim de obter mais informações
sobre a vida, comportamento e as alterações provocadas pela neoformação no
animal (Apêndice 1).
No momento da colheita dos tumores de mama, uma parte foi separada para
fixação em formol (10% tamponado com fosfatos, pH 7,4) e a outra parte foi
19
congelada. Para a congelação, os fragmentos foram imersos em solução
crioprotetora de N-hexano (Synth), congelados imediatamente em nitrogênio líquido
e estocados em freezer -80°C, onde permaneceram até serem cortados em
micrótomo de congelação. Os cortes foram armazenados em freezer -20ºC até a
realização da técnica de imuno-histoquímica.
Os fragmentos de tumor fixados em formol permaneceram nessa solução por
24 horas. Após esse período, eram armazenados em álcool 70%, para
posteriormente serem processados, incluídos em parafina, cortados em micrótomo
na espessura de 5µm e corados com Hematoxilina e Eosina (HE). Todo o
processamento histológico foi realizado no Departamento de Patologia Veterinária
da FCAV – UNESP – Jaboticabal.
Todas as amostras do grupo tumor utilizadas nesse trabalho foram
classificadas de acordo com o descrito no consenso para diagnóstico, prognóstico e
tratamento dos tumores mamários caninos (CASSALI et al., 2011) em: carcinomas
tubulares, carcinomas papilares e carcinomas sólidos (Tabela 1) e o grau de
malignidade foi baseado em Elston e Elis (1998) (apêndice 2).
Tabela 1. Total de tumores de mama classificados pelo tipo histológico e graus de
malignidade.
Tipo Histológico
Grau
Total
Carcinoma tubular
1
11
2
3
3
3
Carcinoma papilar
1
4
2
2
Carcinoma sólido
2
1
3
2
TOTAL
26
Para a determinação do grau de malignidade dos tumores levou-se em
consideração o grau de diferenciação tubular, pleomorfismo e número de mitoses.
Outros padrões como densidade celular, dimensão do tumor, encapsulamento, além
de padrões celulares como anisocariose, anisocitose, cariomegalia, invasão vascular
e invasão da cápsula. Necrose, hemorragia, inflamação, mineralização também
foram considerados para a aplicação do grau de malignidade.
20
Durante a classificação histológica dos tumores avaliou-se também o tipo de
infiltrado inflamatório presente intra/peritumoral. A presença dos mastócitos
associados ao tumor foi avaliada por meio da coloração de azul de toluidina (AT).
4.2 Protocolos imuno-histoquímicos
Para as análises imuno-histoquímicas foram utilizados os anticorpos CD11c
(WANG
et
al.,
2007b;
RICKLIN-GUTZWILLER
et
al,
2010;
QESKA,
BAUMGÄRTNER, BEINEKE, 2013), CD83 (WANG et al., 2007b; QESKA,
BAUMGÄRTNER, BEINEKE, 2013), CD123 (DELLA BELLA et al., 2003;
TREILLEUX et al., 2004), CD3 (KARPUS, 2007) e MHC-II (WANG et al., 2007b;
QESKA, BAUMGÄRTNER, BEINEKE, 2013) e macrófago (ZENG et al., 1996) em
todos os cortes de mama, incluídos em parafina ou congelados, de acordo com a
Tabela 3.
Tabela 2. Anticorpos utilizados para a imunomarcação das células dendríticas, do
infiltrado inflamatório e do MHC-II presentes nas mamas de cadelas com
e sem neoplasia.
Anticorpos
Clones
Tipo celular
Marca
marcado
CD11c
CA11.6A1
DCs mieloides
ABD Serotec
(mouse anti-dog,
imaturas
(ref. MCA1778S)
monoclonal)
CD83
1H4b
DCs mieloides
Abcam
(mouse anti-human,
maduras
(ref. ab49324)
monoclonal)
CD123
Policlonal
DCs
Abcam
(rabbit anti-human,
plasmocitoides
(ref. ab154402)
policlonal)
CD3
F7.2.38
Linfócitos pan T
Dako
(rabbit anti-human,
(ref. M7254)
monoclonal)
Anti-HLA-DR
TAL.1B5
MHC-II
Dako
(mouse anti-human,
(ref. M0746)
monoclonal)
Anti-macrófago
MAC387
Macrófagos
Abcam
(mouse anti-human
(ref. ab22506)
monoclonal)
21
O protocolo de imuno-histoquímica utilizado para o material emblocado em
parafina foi (marcação das DCs mieloides maduras, DCs plasmocitoides, linfócito T,
do MHC-II e macrófagos):
- Desparafinização dos cortes de mamas e linfonodos em estufa a 60ºC, por
uma hora;
- Hidratadação dos cortes em soluções decrescentes de xilol e álcool seguido
de 10 banhos em água destilada;
- Recuperação antigênica (Tabela 4). Após a recuperação, os cortes ficavam
resfriando por 20 minutos;
- Bloqueio da peroxidase endógena (8%), por 30 minutos, em câmara escura,
seguido de duas lavagens com Tris HCL (pH 7,4) e mais duas lavagens com
água destilada (cinco minutos cada);
- Bloqueio das reações (proteínas) inespecíficas (Protein Block serum-free,
DAKO, ref. X0909), por 30 min, em câmara úmida e em temperatura ambiente
seguido de três lavagens com TRIS HCL (pH7,4), por cinco minutos;
- Incubação do anticorpo primário a 4°C, por 18 horas, em câmara úmida
(visualizar as respectivas diluições na Tabela 4);
- Lavagem em solução de TRIS HCL (pH 7,4) por cinco minutos e aplicação
do substrato (Tabela 4). Para o CD83, CD3 e MAC387 foi utilizado o
Complexo de Polímeros ligados a Peroxidase (Kit Advance TM, DAKO, cod.
K4067) com incubação do HRP-link por 30 minutos, seguido da aplicação do
polímero, por mais 30 minutos em temperatura ambiente. Para o CD123,
utilizou-se o substrato o HRP-Polymer Kit (kit MACH-4 Universal, Biocare,
cod. M4BD53-4 G, H, L), com incubação por 30 minutos do link, em
temperatura ambiente, seguido da incubação do polímero, por mais 30
minutos em temperatura ambiente. Para a marcação dos macrófagos, foi
utilizado como substrato o HRP-link (Kit Dako EnVisionTM, cod.K5355), à
temperatura ambiente, por uma hora. Em seguida, os cortes foram lavados
com TRIS HCL (pH 7,4), por cinco minutos;
- Para a visualização da reação utilizou-se o cromógeno DAB (3,3diaminobenzidina, Dako, cód. K3468-1), durante três minutos, seguido da
imersão dos cortes em água deionizada;
22
- Contra-coloração com Hematoxilina de Harris, por 30 segundos, seguido de
lavagem em água correten, por 10 minutos;
- Desidratação em álcoois em concentrações crescentes, seguido de xilol e
montagem das lâminas com Permount (Fisher Scientific, cod. S70104).
O protocolo imuno-histoquímico utilizado para os cortes congelados
(marcação das DCs mieloides imaturas) teve algumas diferenças do já descrito, que
foram:
- O material foi cortado na espessura de 5μm, em criostato (Minotome –
Damon/IEC Division), sob temperatura de 4°C, onde eram depositados em
lâminas
polarizadas
(StarFrost®
Green,
Sakura).
Os
cortes
foram
armazenados em freezer a -20°C até a realização da técnica de imunohistoquímica.
- As lâminas eram retiradas do freezer e deixadas secar, por cinco minutos
em temperatura ambiente, onde em seguida eram fixadas em acetona gelada,
na temperatura de -20°C, por 10 minutos.
- Secagem dos cortes por 30 minutos seguido de três banhos em solução de
Tris HCL (pH 7,4), por cinco minutos cada.
- Bloqueio das proteínas inespecíficas (Protein Block serum-free, DAKO, ref.
X0909), por 30 minutos, seguido de uma lavagem com solução de Tris HCL,
por mais cinco minutos.
- Incubação do anticorpo primário (Tabela 4), em câmara úmida, a 4°C, por 18
horas. Seguiu-se lavagem com solução de Tris HCL por cinco minutos.
- Bloqueio da peroxidase (8%, por 30 min, em câmara escura, em
temperatura ambiente).
- Aplicação do HRP-link (Kit AdvanceTM, DAKO, cod. K4067.) em temperatura
ambiente, por 30 minutos seguido da aplicação do polímero, por mais 30
minutos, em temperatura ambiente. Os passos seguintes foram exatamente
iguais ao determinado no protocolo para cortes parafinados.
23
Tabela 3. Especificação do tipo e tempo de recuperação antigênica, diluição e
tempo de incubação do anticorpo primário e respectivo substrato.
Anticorpo
Recuperação
Tempo**
Diluição***
Substrato
primário
antigênica
CD11c*
1:900
Advance (dako)
CD83
Banho-Maria 97°C
30 min
1:100
Advance (Dako)
CD123
30 min
1:400
Mach-4 (Biocare)
CD3
Panela a vapor
(Pascal, DAKO)
Banho-Maria 97°C
30 min
1:150
Advance (Dako)
HLA-DR
Banho-Maria 97°C
30 min
1:500
Advance (Dako)
MAC387
Panela a vapor
(Pascal, DAKO)
30 min
1:4000
Envision (Dako)
* Corte congelado. ** Tempo de incubação na recuperação antigênica = 30 minutos (exceto para o
anticorpo CD11c). ***Tempo de incubação dos anticorpos 1º = 18 horas.
Os tecidos controles positivos utilizados para os anticorpos CD123, CD83,
CD3 e HLA-DR foram os recomendados pelo fabricante. Para o anticorpo CD11c foi
utilizado como controle positivo a tonsila canina. Para o MAC387 utilizou-se baço de
cão. Como controle negativo utilizou-se o diluente de anticorpo (Antibody diluent with
background reducing components, Dako, cod. S3022) em substituição ao anticorpo
primário, para todos os testes.
4.3 Contagem das células imunomarcadas e dos mastócitos
A contagem das células imunomarcadas e das células coradas com AT foi
realizada em microscópio de luz com equipamento para fotomicrografia digital (Nikon
E200). Para a quantificação foram escolhidos, aleatoriamente, cinco campos, onde
foi contabilizado o número total de células marcadas, na objetiva de 40x, em uma
área medindo 0,19625 mm2.
Para avaliação dos cortes de glândula mamária, foram realizadas as
contagens das DCs imaturas, DCs maduras, DCs plasmocitoides, macrófagos,
24
linfócitos T, MHC-II e mastócitos, tanto do grupo controle quanto no grupo tumor.
Para a avaliação dos linfonodos, foram realizadas as marcação para as DCs
imaturas e maduras, tanto nos grupos controle quanto no grupo tumor.
4.4 Estudo de seguimento (follow-up)
Foi realizado ainda um estudo de corte, do tipo follow-up, sendo as cadelas
deste experimento acompanhadas por um período médio de um no e meio após a
realização da mastectomia, a fim de obter informações sobre estado de saúde,
possíveis evidências de recidivas ou mesmo, de metástase. Das 21 cadelas com
tumor de mama que participaram deste estudo, em quatro não foram obtidas
informações. Portanto, 17 cadelas foram acompanhadas durante um ano e meio
pós-mastectomia.
4.5 Análise estatística
Para análise estatística realizou-se a análise de variância (ANOVA) a fim de
comparar a imunomarcação mamária para DCs mieloide imaturas (anti-CD11c), DCs
mieloide maduras (anti-CD83), DCs plasmocitoides (anti-CD123), MHC-II (anti-HLADR), linfócitos T (anti-CD3), macrófagos (anti-MAC387) e mastócitos (coloração de
AT) e em linfonodos para DCs imaturas e maduras. Para as pressuposições do
Anova foram realizados os testes de Brown-Forshyte, para homocedasticidade, e
Cramer
von
Mises
para
normalidade
dos
erros.
Quando
satisfeitas
as
pressuposições, o teste de Student Newman Keuls (SNK) foi utilizado para
comparação
das
médias.
Quando
não
satisfeitas,
foram
realizadas
as
transformações de dados segundo Bartlett (1947) e, então, submetidas ao SNK.
Quando as transformações não satisfizeram as pressuposições foi realizado o teste
não paramétrico de Mann-Whitney.
25
Tabelas de contingência foram utilizadas para analisar a frequência da
presença de imunomarcação para DCs plasmocitoides (CD123) em animais
acometidos ou não por tumores mamários, onde a presença de DCs plasmocitoides
foi determinada como 0 (para ausência) e 1 (para presença) de marcação positiva.
Uma segunda tabela de contingência foi construída a fim de relacionar a presença
da imunomarcação de DCs plasmocitoides com o tipo histológico do tumor. Para o
tipo histológico, a tabela foi categorizada com os seguintes índices: 1) controles; 2)
papiliares; 3) tubulares; e 4) sólidos. Para analisar a independência das variáveis foi
realizado o teste exato de Fisher. A determinação do coeficiente de correlação de
Spearman foi utilizada para determinar a relação entre o tipo histológico do tumor, a
gradação histológica do tumor e a quantidade de imunomarcação de DCs
plasmocitoides (CD123).
A definição do coeficiente de correlação de Spearman foi realizada também
para as DCs imaturas, MHC-II, linfócitos T, DCs maduras, DCs plasmocitoides,
macrófagos e mastócitos.
As
análises
estatísticas
foram
conduzidas
utilizando
o
programa
computacional SAS (SAS 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA). Para todas as análises
foi considerado α=5%.
Quanto ao grau de malignidade dos tumores, estes não foram considerados
na análise de variância, pois não houve números representativos de todos os graus
quando separados em grupos.
26
V. RESULTADOS
Os tumores foram classificados em carcinomas do tipo simples, padrões
tubular, papilar e sólido (Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 4A, 4B e 4C). No presente estudo,
dados com raça predominante e idade mais acometida foram considerados apenas
nas cadelas do grupo tumor. A idade média das cadelas com tumor de mama foi de
9,3 anos (30%) e foi predominante em cães sem raça definida (SRD) (43%).
Nenhum linfonodo apresentou focos de micrometástases.
Em relação à avaliação macroscópica dos tumores, de um total de 26
amostras, a média de tamanho dos nódulos foi de três centímetros. Destes, 19
tumores eram firmes e maciços e sete eram císticos e macios. A coloração interna
dos tumores variou de brancacenta, pardacenta a enegrecida. Os linfonodos tiveram
tamanho médio de 1,0 cm do grupo tumor e sua coloração variou de acastanhada a
enegrecida.
Das 17 cadelas acompanhadas para o follow-up, nove estão vivas (53%) e
oito morreram (47%). As causas de óbitos incluem: atropelamento (n=2) e parada
cardíaca (n=1), totalizando 33%, bem como, a metástase representando 67% e
correspondendo a maior causa de óbito nas cadelas. Os locais onde as metástases
foram identificadas foram cavidade oral, pulmão e vesícula urinária.
Na coloração pelo AT, observou-se infiltração de mastócitos no estroma
tumoral (Figura 4D). Não foi verificada diferença significativa (p<0,1319, Teste SNK),
entre os grupos controle e tumores, com média pouco maior no grupo tumores
(Figura 6).
Durante a avaliação em microscopia de luz foi possível observar que os
tumores de mama deste estudo apresentaram focos de infiltrado inflamatório de
origem mononuclear, composto principalmente de linfócitos, plasmócitos e
macrófagos. Ainda notou-se a dificuldade em observar as DCs somente com
coloração de HE, por serem semelhantes com os macrófagos. As DCs mieloides
imaturas apresentam poucos dendritos citoplasmáticos, citoplasma moderado,
núcleo arredondado. Não foi possível identificar as DCs mieloides maduras e as DCs
plasmocitoides na coloração de HE.
27
Figura 3. Fotomicrografias das neoplasias mamárias malignas em cadelas. (A)
Carcinoma tubular grau I, com evidente processo inflamatório multifocalno
interstício tumoral (setas) (barra = 100 µm). (B) Carcinoma tubular grau II,
com evidente aumento do número de células neoplásicas no interior dos
túbulos (setas) (barra = 90 µm). (C) Carcinoma tubular grau III apresentando
infiltrado inflamatório focal (setas) no interstício tumoral (barra = 60 µm). (D)
Carcinoma papilar grau I com focos de infiltrado inflamatório (setas) no
estroma tumoral (barra = 90 µm). Coloração de Hematoxilina e eosina.
28
Figura 4. Fotomicrografias das neoplasias mamárias malignas em cadelas. (A)
Carcinoma papilar grau II com evidentes formações papilares (setas). (barra =
90 µm). (B) Carcinoma sólido grau II. Notar figuras de mitose (setas) (barra = 60
µm). (C) Carcinoma sólido grau III em mama de cadela, com áreas de infiltrado
inflamatório multifocal (setas) (barra = 60 µm). Coloração de Hematoxilina e
eosina. (D) Infiltrado de mastócitos no estroma e no interior de um carcinoma
papilar grau I (setas) (barra = 100 µm). Coloração de Azul de Toluidina.
29
A imunomarcação das DCs mieloides imaturas (anticorpo CD11c) foi
citoplasmática. As células com marcação positiva foram observadas principalmente
em meio às células tumorais e, raramente fora do sítio tumoral (Figura 5A). Verificouse diferença significativa (p<0,0001, Teste SNK) para a marcação do anticorpo antiCD11c entre os grupos controle e tumor, com maior média no grupo tumor (Figura
6).
A imunomarcação de DCs mieloides maduras (anticorpo CD83) foi
citoplasmática, em grande parte localizada em meio ao estroma tumoral e raras
vezes fora do sítio tumoral (Figura 5B). A comparação entre os grupos controle e
tumor mostrou diferença significativa (p<0,00198, Teste SNK), com maior média no
grupo tumor (Figura 6).
A marcação dos linfócitos T (anticorpo CD3) foi em membrana plasmática,
localizada no infiltrado inflamatório, distribuído em meio ao estroma tumoral (Figura
5C). Não foi verificada diferença significativa (p<0,0790, Teste de Mann-Whitney)
entre os grupos controle e tumor (Figura 7).
A detecção de MHC-II (anticorpo HLA-DR) foi citoplasmática. Neste caso, a
marcação estava nos ácinos mamários, nas células tumorais e no infiltrado
inflamatório, composto predominantemente por linfócitos, plasmócitos e macrófagos
(Figura 5D). Não foi verificada diferença significativa (p<0,0593, Teste SNK), entre
os grupos controle e tumor (Figura 7).
Para os macrófagos (anticorpo MAC387), a marcação mostrou-se no núcleo e
citoplasma, sendo observada no estroma tumoral e no infiltrado inflamatório
predominantemente mononuclear (Figura 5E). Verificou-se diferença significativa
(p<0,0472, Teste de Mann-Whitney) entre os grupos controle e tumor, com maior
média neste último (Figura 7).
A marcação das DCs plasmocitoides (anticorpo CD123) foi citoplasmática e
as células localizavam-se em meio às células tumorais e do infiltrado inflamatório
predominantemente mononuclear (Figura 5F). Diferença significativa (p<0,0214,
Teste SNK) foi verificada entre os grupos controle e tumor, com maior média no
grupo tumor (Figura 7).
30
Figura 5. Fotomicrografia das imunomarcações em tecido mamário de cadelas. (A)
Marcação de DCs mieloides imaturas em um carcinoma tubular grau I
(barra = 50 µm). (B) Marcação das DCs mieloides maduras em região
peritumoral de um carcinoma tubular grau III (barra = 100 µm) (no detalhe,
uma DC madura no infiltrado inflamatório). (C) Marcação dos linfócitos T
em um carcinoma tubular grau I (barra = 50 µm), (D) Marcação do MHC-II
em um carcinoma tubular grau III (barra = 50 µm). (E) Marcação de
macrófagos em um carcinoma tubular grau III (barra = 50 µm). (F)
Marcação de DCs plasmocitoides em um carcinoma tubular grau III (barra
= 50 µm).
31
Figura 6. Médias e erros-padrões para a contagem dos mastócitos (p<0,1319) e das
DCs mieloides imaturas (p<0,0001) e das DCs mieloides maduras,
(p<0,0198) nos grupos controle e tumor nas mamas de cadelas. Teste
Student Newman Keuls.
32
Figura 7. Médias e erros-padrões para a contagem das marcações dos linfócitos T,
(Teste Mann-Whitney, p<0,0790), do MHC-II, (Teste Student Newman
Keuls, p<0,0593) do macrófago (Teste Mann-Whitney, p<0,0472), e das
DCs plasmocitoides (Teste Student Newman Keuls, p<0,0214) nos grupos
controle e tumor nas mamas de cadelas.
A frequência de imunomarcação para DCs plasmocitoides (CD123) em
animais acometidos ou não por tumor de mama está representada em uma tabela
de contingência (Tabela 4). O teste exato de Fisher (p<0,0019) mostrou que há
dependência entre a presença de DCs plasmocitoides positivas e a presença de
tumor mamário.
A análise da frequência da presença de imunomarcação das DCs
plasmocitoides com o tipo histológico (Tabela 5) mostrou, pelo teste exato de Fisher
(p<0,0080), que há dependência entre a presença de DCs plasmocitoides e o tipo
histológico tumoral.
33
Tabela 4. Presença de imunomarcação para DCs plasmocitoides (CD123) em
glândula mamária de cães acometidos ou não por tumor mamário.
Presença de CD123
C
T
Total
Frequência
Ausência
Esperado
Frequência
Presença
Esperado
Total
8
7
15
3,8
11,1
1
19
20
5,1
9
14,8
26
35
Legenda: na linha: C- grupo controle, T- grupo tumor. Teste exato de Fisher (p<0,0019).
Tabela 5. Presença de imunomarcação para DCs plasmocitoides (CD123) em
relação ao tipo histológico dos tumores de mama caninos.
Tipo Histológico
Presença de CD123
C
P
T
S
Total
Frequência
8
1
5
1
15
3,8
2.5
7.28
1,2
1
5
12
2
20
5.1
9
3.4
6
9.71
17
1,7
3
35
Esperado
Frequência
Esperado
Ausência
Presença
Total
Legenda: Na linha: C- Controle, P- Papilar, T- Tubular, S- sólido. Teste exato de Fisher (p<0,0080).
Pela determinação do coeficiente de correlação de Spearman (Figura 8)
houve correlação positiva fraca (0,34) entre a quantidade de DCs plasmocitoides
(CD123) e o tipo histológico do tumor. Houve ainda uma correlação positiva média
(0,57) entre DCs plasmocitoides (CD123) e o grau do tumor.
34
DCp
Tipo Hist.
Grau
1,00
0,34
0,57
DCp
1,00
0,77
Tipo Hist.
1,00
Grau
Figura 8. Determinação do coeficiente de correlação de Spearman para a avaliar a
correlação entre a quantidade de DCs plasmocitoides, tipo histológico e
grau dos tumores de mama caninos dos grupos controle e tumor.
Legenda: A tabela apresenta os resultados com significância estatística (vermelho) para a análise de
correlação de Spearman . As correlações são definidas, de acordo com seu índice como: 0,2 - 0,4 –
correlação fraca; 0,4 - 0,7 – correlação moderada; 0,7 - 0,9 – correlação forte. Índices positivos
apresentam correlações diretamente proporcionais, índices negativos apresentam correlações
inversamente proporcionais.
DCp (células dendríticas plasmocitoides), Tipo Hist. (tipo histológico), Grau (grau dos tumores de
mama).
As médias de células imunomarcadas em todas as análises imunohistoquímicas nos grupos controle e tumor estão descritas na Tabela 6.
Tabela 6. Médias, desvio padrão e erro padrão das contagens das células
imunomarcadas dos respectivos anticorpos nos grupos controle e tumor.
Controles
Tumores
Anticorpos
Média
6,93B
Desvio
Padrão
6,31
Erro
Padrão
2,10
DCi
MHC-II
51,71A
19,22
Linf T
10,17A
DCm
Média
53,10A
Desvio
Padrão
43,95
Erro
Padrão
8,61
6,40
107,54A
100,90
19,78
4,87
1,62
31,92A
36,49
7,15
0,53B
0,85
0,28
3,36B
2,76
0,54
Mac
1,00B
0,82
0,27
10,18A
14,46
2,83
MCs
3,31A
2,19
0,73
8,68A
8,00
1,57
DCp
0,15B
0,46
0,15
1,90A
3,22
0,63
Legenda: DCi (células dendríticas imaturas, Linf T (linfócitos T), DCm (células dendríticas maduras),
Mac (macrófagos), MCs (mastócitos), DCp (células dendríticas plasmocitoides).
Letras iguais na coluna não diferem entre si pela análise de variância.
O resultado das análises de correlação de Spearman está demonstrado na
Figura 9, para mostrar o grau de associação entre DC imatura, DC madura, DCs
plasmocitoides, MHC-II, linfócito T, macrófago e mastócitos em tumores de mama
caninos.
35
DCi
MHC-II
Linf T
DCm
MAC
MCs
DCp
0,37
0,37
0,35
0,30
0,30
0,49
DCi
0,41
0,13
0,01
0,17
0,17
MHC-II
0,19
0,35
0,44
0,03
Linf T
0,38
0,13
0,33
DCm
0,24
0,15
MAC
0,17
MCs
FIGURA 9. Determinação do coeficiente de correlação de Spearman para o perfil
celular (macrófagos, linfócitos, mastócitos e DCs imaturas e maduras),
bem como para MHC-II e IL-3Rα, em tecidos mamários caninos dos
grupos controle e tumor.
Legenda: A tabela apresenta os resultados com significância estatística (vermelho) para a análise de
correlação de Spearman . As correlações são definidas, de acordo com seu índice como: 0,2 - 0,4 –
correlação fraca; 0,4 - 0,7 –correlação moderada; 0,7 - 0,9 – correlação forte. Índices positivos
apresentam correlações diretamente proporcionais, índices negativos apresentam correlações
inversamente proporcionais.
DCi (células dendríticas imaturas, Linf T (linfócitos T), DCm (células dendríticas maduras), Mac
(macrófagos), MCs (mastócitos), DCp (células dendríticas plasmocitoides).
Quanto aos linfonodos, avaliou-se apenas a marcação das DCs mieloides
imaturas (anti-CD11c) e das DCs mieloides maduras (anti-CD83) nos linfonodos dos
grupos controle e tumor. Nos linfonodos, a marcação das DCs mieloides imaturas foi
concentrada em pequenos aglomerados celulares, localizadas nos folículos linfoides
e na porção paracortical (Figura 10A), onde a média de células marcadas no grupo
controle foi 35,34 ± 7,57 e para o grupo tumor foi de 77,32 ± 16,84. Não foi verificada
diferença significativa entre os grupos (p=0,1567, teste Mann-Whitney / Figura 10B).
A marcação das DCs mieloides maduras (anti-CD83) nos linfonodos ficou evidente
no centro dos folículos linfoides (Figura 10C), onde a média de células marcadas no
grupo controle foi de 0,6 ± 0,24 e de 1,62 ± 0,40 para o grupo tumor. Foi verificada
diferença significativa entre os dois grupos (p=0,0173, teste SNK / Figura 10D).
36
Figura 10. Fotomicrografias das imunomarcações em linfonodos inguinais de cadelas
com tumor de mama e seus respectivos gráficos. (A) Marcação das DCs
mieloides imaturas (anti-CD11c) concentrada no centro dos folículos
linfoides e paracortical (barra = 100 µm). (B) Médias e erros-padrões das
marcações das DCs mieloides imaturas (anti-CD11c, teste Mann-Whitney,
p=0,1567) nos linfonodos dos grupos controle e tumor. (C) Marcação das
DCs mieloide maduras (anti-CD83) localizada no centro dos folículos
linfoides (barra = 100 µm). (D) Médias e erros-padrões das DCs mieloide
maduras (anti-CD83, teste Student Newman Keuls, p=0,0173) nos
linfonodos dos grupos controle e tumor.
37
VI. DISCUSSÃO
A neoplasia de mama é uma doença muito frequente em cadelas de meia
idade a idosas, sendo considerada uma condição rara em fêmeas com menos de
cinco anos de idade (LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007). No presente estudo, a
idade média das cadelas com tumor de mama foi de 9,3 anos, dado este que está
de acordo com os achados de Oliveira Filho et al. (2010), Daleck et al. (1998) e
Lana, Rutteman, Withrow (2007). Deste mesmo grupo, a raça predominante foi a
SRD, totalizando 43% do total de cadelas. As demais raças observadas foram
rotweiller (13%), dachshund (13%), boxer (9%), labrador (9%) e poodle (9%). A
discussão da prevalência das raças mais acometidas neste estudo fica limitada, pois
não se conhece a população canina total da cidade de Jaboticabal (SP) e
principalmente, das cidades ao seu redor, pois grande parte do número das cadelas
que participaram deste estudo vieram de cidades vizinhas.
O volume médio dos tumores mamários foi de três centímetros, o que fica
dentro da média de acordo com os achados de Queiroga e Lopes (2005) que
descreveram que a maioria dos tumores malignos tem tamanho médio, entre três e
cinco centímetros. No entanto, o tamanho do nódulo na mama pode ser influenciado
pela fase do ciclo estral em que a cadela se encontra (FONSECA; DALECK, 2000).
Neste estudo, essa informação não pode ser avaliada, visto que grande parte dos
proprietários desconheciam o estágio do ciclo estral de suas cadelas.
Nenhum linfonodo analisado apresentou focos de micrometástases. Talvez
isso se explique pelo fato de que os tumores avaliados neste trabalho não
ultrapassaram três centímetros de comprimento, e segundo Chang et al. (2005),
cães com metástases para linfonodos geralmente apresentam tumores maiores que
cinco centímetros.
Durante a avaliação em microscopia de luz foi possível observar que os
tumores de mama deste estudo apresentaram focos de infiltrado inflamatório. Estes
eram compostos predominantemente por linfócitos, macrófagos e mastócitos. De
acordo com Whiteside (2008), durante muito tempo acreditou-se que a presença do
infiltrado inflamatório no microambiente tumoral seria a prova da atividade imune
38
contra o crescimento neoplásico. Todavia, esse conceito mudou e atualmente
preconiza-se que a reação inflamatória quando associada ao tumor, pode auxiliar no
progresso das células neoplásicas ao invés de promover uma resposta imune efetiva
(ASPORD et al., 2007). O que foi encontrado no presente estudo está bem próximo
ao que o último autor descreveu, pois a presença de inflamação foi observada
inclusive nos tipos histológicos mais agressivos.
Para a detecção das DCs é necessário o uso de técnicas especiais de
identificação, como a imuno-histoquímica, pois se tornam indistinguíveis quando
coradas apenas em HE (LINS, et al., 2006; NISHIKAWA et al, 2009), assim como foi
proposto e realizado no presente estudo, já que as DCs foram facilmente
confundidas com os macrófagos. Outras técnicas podem ser aplicadas para a sua
identificação, como a imunofluorescência (BELL et al. 1999; ASPORD et al., 2007),
citometria de fluxo (GERVAIS et al., 2005) e a reação em cadeia da polimerase
(PCR) (BELL et al. 1999).
No presente estudo, foi possível observar que as imunomarcações de DCs
mieloides imaturas e maduras foram significativamente maiores no grupo tumor do
que no grupo controle, sendo a média do número de DCs imaturas maior do que a
de maduras. Esta diferença reflete uma possível atividade do tumor sobre as DCs.
Na literatura destaca-se que frente a um microambiente tumoral, as DCs podem
apresentar falhas funcionais, como a baixa capacidade de estimulação dos linfócitos
T (BELL et al., 1999). A maturação das DCs é crucial na iniciação da resposta imune
e uma maturação ineficiente pode levar a diminuição de DCs maduras e
funcionalmente competentes e ao aumento de DCs imaturas. A predominância
destas últimas pode induzir a tolerância dos linfócitos T e ao escape tumoral da
vigilância das DCs (GABRILOVICH, 2004; KAH-WAI; JACEK; JACEK, 2006).
Neste estudo, as DCs imaturas foram encontradas, em sua maioria no
estroma tumoral e raramente no peri-tumoral e o inverso ocorreu com as DCs
maduras. Nossos achados foram semelhantes aos encontrados por Bell et al.
(1999), que relataram que em adenocarcinomas de mama em mulheres foi
detectado que DCs imaturas ficam compartimentalizadas no meio das células
tumorais, enquanto que DCs maduras ficam restritas à região peri-tumoral, todavia
diferiu dos achados de Sandel et al. (2005) que observou o inverso em tumores colo-
39
retais, em humanos. De acordo com Bell et al (1999), esta separação de populações
de DCs mieloides poderia indicar que os fatores estromais podem determinar a
adesão das DCs, visto que fisiologicamente, as DCs maduras só são observadas em
órgãos linfoides, onde elas interagem intimamente com os linfócitos T. No presente
estudo as DCs maduras também foram observadas nos linfonodos drenantes, além
do peri-tumoral. Da mesma forma, Bell et al. (1999) sugeriram que a presença das
DCs maduras dentro do tumor refletiria uma resposta imune em curso,
possivelmente tumor-específica. No presente estudo verificou-se predominância de
DCs imaturas, o que parece diferir da sugestão destes autores, ou seja, não estaria
ocorrendo uma atividade antitumoral. A presença de DCs maduras fora dos órgãos
linfoides não é típica e está relacionada com quadro de inflamação, como por
exemplo, na sinóvia de pacientes com artrite reumatoide ou no sangue de indivíduos
com doença auto-imune sistêmica (THOMAS et al., 1999) e as consequências
imunológicas das DCs maduras nos tumores permanecem desconhecidas (ASPORD
et al., 2007).
O anticorpo anti-CD83 foi escolhido para a marcação de DCs maduras neste
estudo, porque na medicina veterinária existem poucos relatos que mostrem a
aplicação deste marcador para DCs maduras (QESKA, BAUMGÄRTNER, BEINEKE,
2013) diferente ao que acontece com humanos (AERTS-TOEGAERT et al., 2007;
LECHMANN et al., 2008). Poindexter et al. (2004) relatam em suas pesquisas em
humanos, que o CD83 é um marcador que tem se mostrado eficiente em identificar
DCs maduras. De acordo com Cao, Lee e Lu (2005), durante a maturação das DCs
em humanos, a cinética da indução de superfície do CD83 é mais rápida do que a
do CD40, CD80 e CD86 quando exposto a LPS (lipopolissacarídeo), tornando-se um
eficiente marcador de DCs maduras. No presente estudo, sugere-se que o CD83 foi
um marcador de DCs maduras em tecidos de cadelas.
Em relação aos linfócitos T não foi verificada, no presente estudo, diferença
estatística entre os grupos controle e tumor. Talvez este resultado possa ser reflexo
de uma menor expressão dos linfócitos T no tecido com tumor de mama, ocasionada
pela grande população de DCs imaturas. A sua incapacidade em amadurecer
corretamente no momento da apresentação antigênica pode ter ocasionado a
40
intolerância dos linfócitos T, que não reconheceram o antígeno e, portanto não
seguiram para o sítio tumoral.
Embora tenha sido observado, no presente estudo, um acúmulo de linfócitos
T efetores no estroma tumoral, esse fato não pode ser considerado como evidência
de vigilância imunitária por parte do hospedeiro, pois estas células parecem ser
ineficazes em deter o crescimento tumoral, assim como descrito na literatura
(WARABI, KITAGAWA, HIROKAWA 2000; WHITESIDE, 2008). Isso reflete a
incapacidade das DCs em estimular os linfócitos T corretamente (GABRILOVICH,
2004). Castanheira (2013) verificou maior expressão de TNF-, IL-4 e IL-10 e
predominância de macrófagos e linfócitos T nos carcinomas mamários de cadelas.
Estes resultados estavam relacionados à malignidade e à progressão destes
tumores nas cadelas. Não se deve descartar o papel dos linfócitos T regulatórios
(Treg) no favorecimento do desenvolvimento tumoral. Em estudos futuros seria
interessante avaliar a presença destas células nos carcinomas mamários de cadelas
e verificar se elas poderiam influenciar na diferenciação e maturação das DCs no
microambiente tumoral, bem como no perfil de citocinas local. De acordo com o
estudo realizado por Aspord et al. (2007), tumores de mama humanos induzidos em
ratos apresentaram infiltração de linfócitos T CD4+ que expressavam IL-13. As
citocinas expressadas pelos linfócitos T, tanto Th1 (IFN-γ) quanto Th2 (IL-4 e IL-13)
foram mesuradas e foi observado que o câncer de mama em mulheres
polariza linfócitos T CD4 + in vivo por intermédio das DCs. Estes linfócitos T CD4+,
portanto, influenciados por DCs, originaram uma resposta Th2 e segregaram IL-13,
ilustrando mais uma forma do tumor manipular as DCs e as outras células
inflamatórias.
O MHC desempenha um papel importante em vários tipos de reações imunes
e uma delas é a participação na apresentação de antígenos. O MHC de classe I é
expresso em todos os tipos de células, enquanto que o MHC de classe II está
limitado a tipos celulares específicos como os macrófagos, linfócitos B e DCs que
apresentam antígenos, entre eles, os antígenos tumorais (WARABI; KITAGAWA;
HIROKAWA, 2000). No presente estudo não foi observada diferença estatística
significativa entre o grupo controle e tumor quanto à expressão da molécula de
MHC-II.
41
Neste estudo, a ineficiente expressão de moléculas do MHC-II, caracterizada
por sua imunodetecção no citoplasma das células inflamatórias e neoplásicas,
poderia explicar a incapacidade de apresentação antigênica para linfócitos T. Da
mesma forma, a menor quantidade de DCs maduras em relação às DCs imaturas
também pode estar relacionada, uma vez que apenas as DCs maduras podem
expressar moléculas de MHC em sua membrana citoplasmática. Na literatura
destaca-se que o aumento de IL-10 (resposta TH2) pode ocasionar a diminuição da
expressão de MHC II nas fases iniciais da resposta imune, contribuindo para a
inibição da ativação de células T (ABBAS; LICHTMAN, 2007b).
Os macrófagos são células comumente observadas no interior de tumores
(KLIMP et al., 2002) e quando estão neste ambiente são denominados de
macrófagos associados ao tumor (TAMs). Há a hipótese de que os TAMs sejam
recrutados para os sítios tumorais, através da expressão de potentes agentes
quimioatrativos, e neste local suas atividades são aproveitadas pelo tumor para
promover a progressão tumoral e a metástase (LIN; POLLARD, 2004), onde são
reprogramados para inibir a função de linfócitos, por meio de citocinas inibidoras,
tais como a IL-10 (WHITESIDE, 2008). Neste trabalho, os macrófagos foram
encontrados em moderada quantidade, principalmente no padrão histológico tubular.
Foi observada diferença estatística significativa entre os grupos controle e tumor,
onde a presença de macrófagos foi maior no grupo tumor. Talvez os resultados
obtidos possam ser reflexo dessa quimioatração dos macrófagos para o foco
tumoral. Castanheira (2013) verificou predominância de macrófagos em carcinomas
mamários caninos e de citocinas Th2 (IL-4 e IL-10). Outros estudos seriam
necessários para se determinar qual é a subpopulação de macrófagos está presente
no microambiente tumoral. Na literatura científica os macrófagos regulatórios (M2)
estão em evidência, como células que podem contribuir para a manutenção de um
ambiente tumoral imunossupressor (TANG, 2013).
Um dos possíveis coadjuvantes do desenvolvimento tumoral são os
mastócitos, que podem se acumular ao redor dos sítios de crescimento neoplásico,
em resposta a vários quimioatrativos derivados dos tumores (THEOHARIDES et al.,
2004). Desta forma, os tumores podem controlar a atividade mastocitária, o que
inclui a atração de DCs imaturas para o foco neoplásico (BACCI; PIMPINELLI;
42
ROMAGNOLE, 2010). Enquanto na literatura médica se acumulam fortes evidências
sobre o papel dos MCs na oncogênese humana, até o momento existem poucos
relatos veterinários focalizando o assunto (SFACTERIA et al., 2011). A ação de uma
neoplasia sobre as DCs causa retardo na maturação destas células e as impede de
amadurecer e apresentar o antígeno tumoral aos linfócitos T. Esse evento ocasiona
a diminuição do número de linfócitos T presentes no sítio tumoral. A depleção de
linfócitos T no tumor pode influenciar no controle da degranulação mastocitária, visto
que eles auxiliam na regulação desta atividade dos mastócitos (GRI, et al., 2008;
MEKORI; HERSHKO, 2012). O acúmulo de mastócitos ao redor do sítio neoplásico e
a maior quantidade de histamina podem beneficiar o desenvolvimento da neoplasia
(DABIRI et al., 2004). Em humanos já foi relatado que quando os MCs são
sensibilizados pelas células tumorais, liberam mediadores que podem alterar a
maturação das DCs, mantendo-as imaturas e ocasionando uma reação de tolerância
imunológica aos linfócitos T (DUDECK, et al., 2011). No presente estudo, houve
correlação moderada entre a presença de linfócitos T e a de mastócitos nas mamas
com tumor, além de correlação fraca entre os mastócitos e as DCs imaturas e
nenhuma correlação foi detectada entre os mastócitos e as DCs maduras.
As características do tumor podem afetar a resposta imune no seu linfonodo
sentinela. Dentro dos 15 linfonodos avaliados, houve predominância de DCs
imaturas nos linfonodos do grupo tumor, mas não diferença estatística entre os
grupos. Diferentemente, Iwamoto et al. (2003) e Poindexter et al. (2004)
identificaram um acúmulo significativo de DCs imaturas no linfonodo sentinela de
mulheres com tumor de mama. Esse excesso de DCS imaturas poderia facilitar a
formação de metástases para os linfonodos regionais. Já a marcação de DCs
maduras no presente estudo foi maior nos linfonodos de mamas com tumor do que
nos linfonodos das mamas controle, resultando em diferença estatística. Poindexter
et al. (2004) ressalvam que em seus estudos, verificou-se uma tendência para um
maior número de DCs maduras nos linfonodos sentinelas livres metástase do que
em linfonodos sentinelas com metástase, fato este que não pode ser comparado
neste estudo, uma vez que não foram observadas metástases nos linfonodos
caninos.
43
Alguns autores afirmam que o infiltrado de DCs mieloides no interior das
neoplasias pode influenciar no prognóstico dos tumores de mama da mulher
(IWAMOTO et al., 2003). Na realidade, a infiltração de DCs mieloides no interior de
carcinomas mamários em mulheres não é um fator prognóstico, pois de acordo com
Treilleux et al. (2004), a infiltração de DCs plasmocitoides é que tem relação com
baixa sobrevida. No presente estudo foi realizada esta mesma relação, onde se
buscou comparar a presença das DCs plasmocitoides no interior dos tumores
mamários em cadelas com o prognóstico e sobrevida das mesmas. Os nossos
resultados mostraram uma correlação positiva média entre o grau histológico (grau
1, 2 e 3) tumoral e a quantidade de DCs plasmocitoides infiltrantes no tumor, o que
indica que os tumores grau três foram os que tiveram maior infiltrado de DCs
plasmocitoides, corroborando com os achados de Treilleux et al, 2004. Da mesma
forma, no presente estudo, verificou-se dependência significativa entre a presença
de DCs plasmocitoides e a presença do tumor de mama nas cadelas, pelo Teste
Exato de Fisher.
Em suma, no estudo apresentado sugere-se que a ação dos linfócitos T
possivelmente foi suprimida pela falha na apresentação antigênica por DCs com
fenótipo imaturo. As DCs e o infiltrado inflamatório, dentro do microambiente tumoral,
possivelmente deixaram de exercer funções efetoras antitumorais e com isso teriam
favorecido o crescimento tumoral. Além disso, os mastócitos se acumularam ao
redor do sítio tumoral também, possivelmente sob o controle das células tumorais,
influenciando indiretamente na maturação das DCs mieloides. Sugere-se que em
estudos futuros possa ser avaliada a expressão de citocinas. Da mesma forma
avaliar o papel da histamina no microambiente tumoral seria interessante, pois na
literatura este mediador inflamatório também foi relacionado com o crescimento
tumoral. Associar estas observações com a atividade das DCs poderia contribuir
para a compreensão da complexa patogenia das neoplasias de mamas em cadelas.
44
VII. CONCLUSÕES
Foi possível concluir que:
- Há relação entre a presença de DCs mieloides maduras e imaturas e o
infiltrado inflamatório encontrado, principalmente entre as DCs e os linfócitos.
- Houve predominância de DCs imaturas nas mamas com tumor.
- As DCs imaturas predominaram e tiveram uma co-localização intimamente
associada ao tumor.
- Os linfócitos, macrófagos e mastócitos foram predominantes no grupo tumor
e podem ter influencia no desenvolvimento tumoral.
- Não houve associação entre a presença de mastócitos e DCs mieloides nos
tumores de mama das cadelas, talvez porque os MCs sejam importantes nos
estágios inicias do desenvolvimento tumoral.
- As presença das DCs plasmocitoides no sítio tumoral é um indicativo de
mau prognóstico do tumor de mama em cadelas, assim como em mulheres.
45
VIII. REFERÊNCIAS1
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56
57
APÊNDICE
58
59
APÊNDICE 1. Questionário aplicado aos proprietários das cadelas com tumor de mama.
ESTUDO SOBRE NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS
Nome do Animal:
Idade:
Proprietário:
Telefone:
RG HV:
Raça:
Cidade:
Castrada: ( ) Sim
( ) Não
Tempo de Evolução:
Ulcerado: ( ) Sim ( ) Não
Metastáse: ( ) Sim
( ) Não
Local:
Recidiva: ( ) Sim
( )Não
Uso prévio de contraceptivos: ( ) Sim ( ) Não
Conformação (estado corporal):
( )Magro
( )Normal
( )Sobrepeso
Ciclo estral:
( )6/6 meses
( )Menor que 6 meses
( )Maior que 6 meses
( )Não e observado
Obs. ...............................................................................................................................
Duração do estro (dias): .....................................................................................................
Número de partos: ..............................................................................................................
Número médio de filhotes por parto: .................................................................................
Tipo de parto:
( )Normal
( )Cesariana
Alterações patológicas com fetos (filhotes):
( )Não
( )Sim. Qual?.........................................................................................
Apresentação de pseudociese:
( )Não
( )Sim. Freqüência: ..............................................................................
Em caso de pseudociese:
( )Com produção láctea
( )Sem produção láctea
Mastite clinica:
( )Não diagnosticada
( )Uma vez
( )Duas vezes
( )Três ou mais vezes
( )Outros.......................................................................................................................
Presença de secreção mamária: ...........................................................................................
Presença de outros tumores: .....................Local:.................................................................
Alteração comportamental após a observação do tumor:....................................................
Ocorrência de tumor mamário em ascendentes ou descendentes com tumor mamário:
( )Sim. Quem?..............................................................................................................
( )Não
( )Não sabe informar
60
Ocorrência de ascendentes ou descendentes com outros tipos de tumores:
( )Sim. Quem e tipo:.....................................................................................................
( )Não
( )Não sabe informar
Obs. .........................................................................................................................................
ESQUERDA
DIREITA
TAMANHO
Esquerda
Direita
M1:
M1:
M2:
M2:
M3:
M3:
M4:
M4:
M5:
M5:
Linfonodo:
Linfonodo:
DATA:
PÓS-GRADUANDO RESPONSÁVEL PELA COLETA:
61
Apêndice 2. Gradação histológica de malignidade das neoplasias mamárias de
acordo com Elston & Ellis (1998).
Atributos
Escore
Formação Tubular
> 75% do tumor
1
De 10 a 75% do tumor
2
< 10% do tumor
3
Pleomorfismo Nuclear
Tamanho do núcleo semelhante a uma célula normal (2 a 3 vezes o
1
tamanho dos glóbulos vermelhos)
Aumento de tamanho moderado
2
Aumento de tamanho bem evidenciado
3
Número de Mitoses (10 campos de grande aumento*)
De 0 a 8 mitoses
1
De 9 a 16 mitoses
2
17 mitoses ou mais
3
* objetiva de 40x.