Resultados Tratamento de aborto recorrente

RESULTADOS DE PROTOCOLO DE INVESTIGAÇÃO E
TRATAMENTO DE CAUSA IMUNE EM PACIENTES COM
ABORTO RECORRENTE
1,
2
3
Autores: Ricardo Barini Egle Couto , Sara Tosetti Ribeiro , Sofia da Rocha
4
Leiber , Simone Corte Batista
Mendes dos Santos
5,
6
Marcos Mathias Motta , Carolina Taddeo
6
Instituição: Serviço de Reprodução Humana - Ambulatório de Aborto Recorrente
Centro de Assistência Integral À Saúde da Mulher
Departamento de Tocoginecologia - Faculdade de Ciências Médicas UNICAMP
Endereço: Rua Alexander Fleming 101
Cidade Universitária Zeferino Vaz
CEP 13092-340 Campinas SP
Caixa Postal 6030 CEP 13083-970
FAX/FONE: 019/2394161
1
Prof. Dr. Disciplina Obstetrícia DTG/FCM/UNICAMP
Médica DTG/ FCM/UNICAMP
3
Pós Graduanda DTG/FCM/UNICAMP
4
Médica Responsável Lab. Cultura de Tecidos Hemocentro/FCM/UNICAMP
5
Bióloga Laboratório Cultura de Tecidos Hemocentro/FCM/UNICAMP
6
Graduando em Medicina, bolsista de Iniciação Científica CNPq
2
1
RESULTADOS DE PROTOCOLO DE INVESTIGAÇÃO E TRATAMENTO DE
CAUSA IMUNE EM PACIENTES COM ABORTO RECORRENTE
INTRODUÇÃO
O termo aloimunidade refere -se a diferenças imunológicas entre indivíduos
da mesma espécie. Em 1966, Clarke & Kirby, (1) formularam a hipótese de que a
disparidade antigênica materno-fetal fosse benéfica para o desenvolvimento do
embrião. Desde então a aloimunidade têm sido associada ao aborto recorrente de
causa desconhecida, que estima-se acometer entre 40 e 60% dos casais
investigados (2, 3).
A histocompatibilidade materno-fetal pode provocar distúrbios da interação
entre mãe e feto por prevenir a indução de fatores humorais e celulares de origem
materna, essenciais para a vitalidade do embrião e o sucesso da gestação.
O sistema composto pelas células T e B processam e apresentam os
antígenos aos linfócitos. As células T originam as células citotóxicas específicas.
As células B diferenciam-se no plasma em células produtoras de anticorpos
específicos. Cada tipo de célula do sistema imune tem uma superfície de adesão
diversa. Quando um antígeno processado é apresentado à célula T, ele é
associado fisicamente com marcadores de superfície celular derivados de um
grupo de genes, o Complexo Maior de Histocompatibilidade, conhecido como
MHC. O MHC humano é localizado no braço curto do cromossomo 6, e é chamado
de “Human Leucocyte Antigens” (HLA ). Divide-se em antígenos de classe I e II. O
HLA classe I é composto dos antígenos HLA A, B, e C e estimulam o antígeno de
superfície CD8 (citotóxico supressor) das células T. O HLA classe II inclui o HLA
D, sub-tipos Dq e Dr, que ativam o CD4 da célula T.
Seria esperado que na implantação do concepto os derivados paternos do
HLA estimulassem o sistema imune materno. Isto não acontece na gestação
normal pois não tem sido detectada expressão do HLA no blastocisto ou no
sinciciotrofoblasto. A perda do HLA clássico no trofoblasto sugere que este é
imunologicamente inerte, com importante papel de proteção, juntamente com
imuno-modulação ativa do sistema imune materno. Tem sido detectados antígenos
não clássicos na superfície da placenta, em culturas de células trofoblásticas (4)
denominados HLA-G. Estes antígenos induzem a produção de anticorpos antiHLA-G e anticorpos anti-idiotípicos anti -anti-HLA-G detectados por citometria de
fluxo em fase inicias de gestações que evoluem normalmente (5). Estas
observações sugerem a participação de uma rede de anticorpos anti-idiotípicos na
modulação da resposta aloimune materno-fetal que culmina com atividade
supressora do organismo materno em relação ao feto(6). Sugere-se que uma
interação entre os antígenos HLA-G e as células granulres linfocíticas de grande
2
volume (“large granular lymphocytes”) presentes no endométrio como responsável
por delimitar o grau de invasibilidade do endométrio pelo trofoblasto, o que em
última análise influenciaria o desenvolvimento da gravidez desde o princípio,
podendo culminar em aborto, passando por problemas de nutrição responsáveis
pelos óbitos fetais e retardos de crescimento intra-útero e inclusive se associar à
doença hipertensiva específica da gravidez (7)
A proposta terapêutica imunológica, utilizando-se imunização da mulher
com linfócitos paternos ou de doador, surgiu da observação de que pacientes
submetidos a transfusões sanguíneas seriadas apresentavam menor rejeição de
aloenxertos (8). Constatou-se uma redução da incidência de abortos em animais
por imunização prévia com células esplênicas paternas (9). A imunização com
células paternas passou a ser a forma mais utilizada nesta abordagem após a
identificação da síndrome de imunodeficiência adquirida, em detrimento da
utilização de células de doador.
Mowbray publicou em 1985 (10) o resultado do primeiro estudo duplo-cego
randomizado comparando o efeito da imunização da mulher com linfócitos
paternos versus seus próprios linfócitos. Observou significativa melhora nos
resultados reprodutivos no grupo tratado pela imunoterapia. Desde então inúmeros
estudos randomizados ou não tem relatado resultados divergentes em relação à
eficácia da imunização da mulher com linfócitos paternos. (11). Em 1994 (12), um
estudo mundial colaborativo realizou meta-análise dos dados referentes aos
estudo randomizados ou não na avaliação da imunoterapia com linfócitos
paternos. Este concluiu que esta abordagem terapêutica beneficiaria entre 8 a
10% das pacientes tratadas.
Entre as publicações sobre os resultados da imunoterapia com imunização
com linfócitos há evidências de que as mulheres portadoras de aborto recorrente
primário tem maiores benefícios que os outros grupos (13, 14)
Recentemente as publicações a respeito da imunoterapia para aborto têm
se concentrado na utilização da imunglobulina humana intravenosa (15, 16).
Sugere-se que esta medicação reduza a atividade das células NK deciduais (17),
efeito semelhante àquele conseguido com a imunização com linfócitos patern
lizados pelo Laboratório de Cultura de Tecidos e Histocompatibilidade do
Hemocentro UNICAMP.
MATERIAL E MÉTODOS.
Foram revistos retrospectivamente os dados de 182 pacientes com história
de três ou mais abortos espontâneos consecutivos e/ou com dois abortos e idade
3
acima de 35 anos. Destas, 116 engravidaram depois de submetidas à
investigação e tratamentos descritos abaixo. Seus dados serão objeto desta
avaliação.
As pacientes seguiram protocolo de investigação para etiologias
associadas a aborto recorrente. Foram realizadas dosagens seriadas de
progesterona na segunda fase do ciclo menstrual, T3, T4, TSH, glicemia de jejum,
biópsia de endométrio, pesquisa para Chlamydia e Micoplasma na secreção
cérvico uterina, exames sorológicos para sífilis, toxoplasmose, citomegalovírus,
listeriose, brucelose e cariótipo do casal. Foram submetidas a
histerossalpingografia, pesquisa de fator anti-núcleo, anti-DNA, pesquisa de
células LE, anticorpo anti-cardiolipina e fator anticoaguanlte lúpico. Os padrões de
normalidade para estes fatores estão classicamente definidos na literatura.
A pesquisa do fator aloimune se fez pela tipagem HLA do casal, cultura
mista de linfócitos com identificação de fator inibidor no soro materno na resposta
celular materna contra linfócitos paternos tratados com mitomicina (CML) e reação
de crossmatch por microlinfocitotoxicidade (X-M). Os antígenos HLA estudados
foram A, B, Dq e Dr. Considerou-se presente o fator aloimune quando a
porcentagem de inibição da reatividade das células maternas contra as células
paternas foi menor que 50% na presença de soro materno, em comparação com
pool de soro humano total na CML e/ou o X-M foi negativo, indicando ausência de
anticorpos maternos anti-HLA contra antígenos paternos presentes na superfície
dos linfócitos. Nestes casos, o parceiro foi submetido a sorologias para hepatite B
e C e para o vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV).
6
A imunização foi preparada com uma concentração de 80x10 linfócitos e
realizada por via intradérmica na face anterior do antebraço materno, em duas
ocasiões com intervalo de quatro a seis semanas entre uma e outra. Seis
semanas após a última imunização colheu-se nova amostra de sangue para X-M e
CML. Foi considerada como resposta adequada ao tratamento a porcentagem de
inibição maior que 50% na CML e X-M positivo contra linfócitos B e T paternos.
As pacientes que não responderam a este protocolo foram submetidas a
sequência de dois reforços de imunização com células paternas e repetiu-se os
exames de X-M e CML para reavaliação da resposta e considerados favoráveis
os parâmetros já descritos.
As pacientes que não responderam ao segundo tratamento foram
submetidas a duas imunizações com células de doador não aparentado,
comprovadamente não portador de hepatite B, C ou do
vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV) e células do marido, com o
mesmo intervalo que o esquema inicial. Seis semanas após a última imunização
foram repetidos o X-M e a CML.
4
A partir do resultado positivo dos exames X-M e CML, as pacientes foram
liberadas para engravidar. Foram orientadas para uso de ácido fólico (5mg/dia) e
progesterona (100mg/dia) a partir da segunda fase do ciclo. O ácido fólico foi
a
mantido até a 12 semana de amenorréia e a progesterona aumentada para
a
200mg/dia com a confirmação da gravidez e mantida até a 16 semana de
amenorréia. Foram realizados quatro reforços de imunização na gravidez, a partir
da sexta semana de amenorréia, a cada seis semanas. As pacientes que já
apresentavam resultado de X-M positivo e CML com inibição maior ou igual a 50%
na primeira avaliação, foram liberadas para engravidar e submetidas a
imunoterapia com linfócitos paternos durante a gestação da mesma maneira que
as que foram submetidas ao tratamento pré gestacional. Foram tratadas com
heparina por via sub cutânea em doses profiláticas desde a segunda fase do ciclo
pré concepcional até a 34ª semana de amenorréia.
Os dados obtidos foram computados e analisados no programa EPI INFO6, programa de domínio público, distribuído pelo “Center of Deseases Control”Atlanta, USA.
RESULTADOS.
A idade média das pacientes foi de 30,9 ± 4,4 anos, (intervalo de 21 a 42
anos), o número de gravidezes anteriores ao tratamento foi em média de 3,8 ±1,6
(intervalo 2 a 12). O número médio de abortos anteriores foi de 3,5 ±1,5 (intervalo
2 a 12). A classificação diagnóstica foi de aborto recorrente primário em 84,1%,
secundário em 14,3% e indefinido em 1,6%.
As tabelas 1 e 2 mostram os resultados da investigação de fator aloimune
pré e pós tratamento.
Tabela 1: Resultado do X-M pré e pós imunização.
Resultado
Pré imunização
%
N
Pós imunização
%
N
negativo
positivo
88.5
11.5
102
14
23,5
76,5
27
89
total
100.0
116
100
116
Tabela 2: Resultados da CML pré e pós imunização.
5
inibição CML
Pré imunização
%
N
Pós imunização
%
N
≤ 50 %
> 50 %
83,8
16,2
97
19
28,6
71,4
82
34
Total
100
116
100
116
As tabelas 3 e 4 mostram os resultados do X-M e da CML após o
tratamento de reforços com imunização de leucócitos paternos e/ou doador não
aparentado. Observar que todas as pacientes tiveram a viragem do X-M para
positivo após a imunização de reforço ou de doador, enquanto três pacientes
mantiveram resultados da cultura mista de linfócitos com inibição inferior a 50%
mesmo após a imunização com doador.
Tabela 3: Resultados do X-M após imunização de reforço com linfócitos paternos
e/ou doador.
Resultado
Pós imunização reforço
%
N
Pós imunização doador
%
N
negativo
positivo
28,6
71,4
9
25
0
100
0
15
total
100.0
34
100
15
Tabela 4: Resultados da CML pós imunização de reforço e/ou doador.
inibição CML
Pós imunização reforço
%
N
Pós imunização doador
%
N
≤ 50 %
> 50 %
45,5
55,5
15
19
27,3
72,7
3
8
Total
100
34
100
11
Nas tabelas 5 e 6 estão expressos os resultados da investigação de outros fatores
associados. Na tabela 7 estão expressos os resultados da investigação de
incompetência ístmico cervical por histerossalpingografia. O cariótipo feminino foi
normal em 81 de 83 pacientes e o masculino em 78 de 80 parceiros. Na
6
investigação dos fatores infecciosos houve dois resultados positivos, um para
Chlamydia e outro para Micoplasma.
Tabela 5: Distribuição de pacientes segundo o resultado da pesquisa de auto
anticorpos.
Positivo
Negativo
01
05
03
04
0
0
0
75
79
46
72
65
37
34
anti-DNA
Fator anti- núcleo
Fat. Anticoag. lúpico
Ac. Anti -cardiolipina
células LE
anti-Ro
anti-La
Tabela 6: Resultados da investigação hormonal.
Normal
Avaliação
progesterona lútea
função tireoideana
biópsia endométrio
diabetes mellitus
%
86.2
95.2
70.7
98.1
Anormal
N
25
40
29
51
%
13.8
4.8
29.3
1.9
N
4
2
12
1
Tabela 7 - Resultado da investigação de incompetência ístmico-cervical.
Histerossalpingografia
%
N
Normal
Incompetência ístmico-cervical
77,2
22,8
61
18
Total
100,0
79
7
Tabela 8 - Resultados da investigação do fator infeccioso
Positivo
Agente infeccioso
Sífilis
CMV
Toxoplasmose
Listeriose
Brucelose
Chlamydia
Micoplasma
Negativo
%
N
%
N
0,9
3,8
0
4,3
1,6
0
11,1
1
2
0
2
1
0
4
99,1
96,2
100,0
95,7
98,4
100,0
88,9
106
51
92
45
63
36
32
Durante o período de seguimento ocorreram 116 gestações, cujos
resultados estão expressos na tabela 8.
Tabela 8: Resultados gestacionais a pós tratamento
Forma de término da gestação
%
N
Aborto
Gravidez em evolução >20sem IG
Parto a termo
19,8
57,8
22,4
23
67
26
Total
100.0
116
DISCUSSÃO
A identificação das causas ou dos fatores associados ao aborto recorrente,
bem como a terapêutica tem sido tema de constante debate na literatura. Há
autores que sugerem que não há terapêutica específica necessária além do
seguimento minucioso e suporte emocional ao casal (19) e outros que sugerem a
existência de fatores imunológicos tão ou mais importantes que aqueles
tradicionalmente referidos como determinantes do aborto recorrente (10).
Consideramos fundamental que a investigação e tratamento do aborto
recorrente deva se pautar em uma avaliação sistemática de todos os fatores
descritos para o aborto recorrente e cada um deles abordado individualmente para
a terapêutica necessária.
8
Nessa casuística identificamos uma frequência de alterações da fase lútea
semelhante à descrita na maioria das publicações, bem como em relação aos
fatores uterino, infeccioso e genético(20). Estes fatores tem sua propedêutica e
terapêutica bastante estudada na literatura e daremos ênfase aos aspectos
imunológicos
Observamos neste grupo de pacientes que a identificação de fatores
associados ao aborto não atingiu metade dos casos se quando avaliação
aloimune é excluída da propedêutica. Este dado está de acordo com a literatura
revista até o momento(20).
Vários testes imunológicos têm sido investigados como marcadores
potenciais do risco de recorrência do aborto (21). Nesta categoria enquadram-se
o X-M e a CML (22). Pode-se observar que a frequência de X-M positivo subiu de
16,2% previamente ao tratamento para 71,4 % depois da série de duas
imunizações. Nenhuma paciente permaneceu com X-M negativo após a
imunoterapia com linfócitos paternos e/ou doador, enquanto apenas 3 pacientes
mantiveram o fator de inibição abaixo dos 50% do ponto de corte para
normalidade. Isto demonstra a alta eficácia da imunoterapia empregada neste
protocolo em induzir uma resposta imune celular na pacientes em relação aos seus
respectivos companheiros.
Ressaltamos que a positividade do crossmatch e do fator inibidor na cultura
mista de linfócitos nas pacientes tratadas com células de doador foram
consideradas como resultados satisfatórios em relação às células do
companheiro, independente do resultado da reatividade da paciente em relação
ao doador não aparentado. Este dado é importante para demonstrar que o
aumento relativo de compartilhamento de antígenos HLA demonstrado em casais
com aborto recorrente dificulta o reconhecimento antigênico entre os parceiros.
Sugere-se que este é uma das dificuldades que a mulher apresenta em
reconhecer a manifestação truncada do HLA placentáreo, confrome referido acima
como HLA-G. Dados da literatura referem que o sucesso da imunoterapia
depende tanto do tamanho do inóculo como do grau de compatibilidade HLA e
que a soro-conversão é menos frequente em casais que compartilham mais de um
antígeno HLA(11). No grupo de pacientes que analisamos esta dificuldade foi
vencida pelo uso de um coadjuvante da imunização, neste caso o doador não
aparentado. Quanto ao inóculo há varias abordagens possíveis e há dados na
literatura que sustentam que a via intradérmica resulte em soro-conversão com
inóculos menores e menos desconfortáveis para a implementação terapêutica(24).
Quanto aos auto-anticorpos estudados, nossos dados diferem daqueles
relatados na literatura, particularmente os anticorpos anti-fosfolípides e aqueles
dirigidos contra componentes nucleares como o fator anti-núcleo. Observamos que
há baixa frequência de positividade de ambas as classes de anticorpos
9
relacionados com a síndrome antifosfolipídica, dado também observado por
Cavalho (25) mas não por Ferriani (26) entre nós. Vários estudos tem chamado a
atenção para estes anticorpos como causa da redução da fertilidade destas
pacientes, tanto em aborto recorrente como em perdas em programas de
fertilização assistida (FIV-ET) (27). Na presença dos anticorpos anti-fosfolipídicos
a associação aspirina em baixas doses e heparina (28) propcia bons resultados
gestacionais, especialmente quando instituída desde o período pré concepcional.
Contudo parece ser independente da terapêutica a manutenção dos níveis
circulantes dos anticorpos, sabendo-se que as pacientes que evoluem com nova
interrupção apresentam ascenção dos títulos e as que mantém ou apresentam
queda nos níveis tem melhores resultados gestacionais (29). A imunoglobulina
intravenosa tem sido sugerida como alternativa terapêutica para estes casos,
associados ou não ao fator aloimune (30).
A controvérsia da eficácia da imunoterapia no tratamento dos abortos
recorrentes de causa imunológica está longe de ser esclarecida. Em séries não
controladas, a taxa de nascidos vivos em pacientes tratadas com linfócitos
paternos variou de 50 a 83% (11). Em estudos randomizados o resultado é
conflitante. Uma publicação avaliando por meta análise os vários relatos a respeito
da imunoterapia (23) refere que se incluídos apenas dados resultantes de estudos
randomizados, 68% das mulheres imunizadas com linfócitos paternos deram à luz
um filho vivo na gestação índice, comparado com 61% de nascidos vivos em
mulheres controles não tratadas.
Previamente ao tratamento, estas pacientes tiveram 340 gestações , com
uma taxa de aborto de 87,9 %. Após a terapia com imunização por linfócitos
paternos, ocorreram 116 gestações, com uma taxa de aborto de 19,8%.
Consideramos este resultado satisfatório, levando-se em conta o risco de
recorrência de novo aborto neste grupo, ainda que nã o se trate de estudo
randomizado duplo-cego que pudesse esclarecer a real eficácia terapêutica da
imunoterapia com linfócitos paternos.
CONCLUSÃO
Os dados obtidos parecem indicar que a imunização com linfócitos
paternos é eficiente em melhorar a resposta imunológica materna às células
paternas. O tratamento imunoterápico com células paternas melhora os resultados
gestacionais.
10
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associated with combined alloimmune and autoimmune
abnormalities. Am J Reprod Immunol. 36(4): 228-34, 1996
Agradecimentos: à pós graduanda Sara Tosetti Ribeiro e aos internos Marcos
Mathias Motta e Carolina pelo inestimável trabalho de coleta de dados das
pacientes envolvidas neste trabalho.
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