Dissertação - Ariany Rafaella Neto Silva - 2015 - EVZ - PPGZ

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
EFEITO DO RESVERATROL NA QUALIDADE E
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS
CRIOPRESERVADOS OU CONSERVADOS EM MEIO HOLDING
Ariany Rafaella Neto Silva
Orientador: Prof. Dr. Marco Antônio de Oliveira Viu
GOIÂNIA
2015
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Tede
iii
3
ARIANY RAFAELLA NETO SILVA
EFEITO DO RESVERATROL NA QUALIDADE E
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS
CRIOPRESERVADOS OU CONSERVADOS EM MEIO HOLDING
Dissertação apresentada para obtenção do
título de Mestre em Zootecnia junto à
Escola de Veterinária de Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Área de Concentração:
Produção Animal
Linha de Pesquisa:
Interface entre desempenho produtivo,
reprodutivo, aspectos genéticos e
ambientais na produção animal.
Orientador:
Prof. Dr. Marco Antônio de Oliveira Viu
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Klayto José Gonçalves dos
Santos
GOIÂNIA
2015
4
iv
5
6
vi
À Deus, meu guia sempre.
À Derlizete Neto Silva, minha mãe, meu exemplo, minha vida.
Ao meu esposo, Deusdete Júnior, pela parceria e eterno amor.
Com gratidão, dedico.
vii7
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por nos proteger a todo o momento, e quando tudo parecia perdido
nos dar a força necessária pra continuar caminhando.
A minha querida mãe Derlizete por me apoiar e cuidar de tudo, preparar casamento,
cuidar da casa, do esposo e principalmente rezar por mim nos tantos dias que passei
fora.
Ao melhor esposo que existe, Deusdete Júnior, por ser tão compreensivo e amável, por
ter segurado minha mão e dito: “confia e segue até o final, que tudo vai dar certo”.
À professora Maria Lúcia Gambarini, pelo apoio na realização dos projetos, pelas
orientações, sempre auxiliando para que tudo se desenvolvesse da melhor maneira.
Assim como, por ser nossa “mãe onça” protegendo ou dando broncas quando
necessário.
À Elisa Santos, pelos ensinamentos e por não haver dificuldades que nos impedissem ao
trabalho quando você estava. E também pela amizade, os cinemas e companhia
agradável de sempre, volte logo.
À Thaisa Campos por estar comigo desde quando essa caminhada reprodutiva se
iniciou, pelos tantos momentos de trabalho, viagens e amizade. Sem você tudo seria
mais difícil.
À todos os Tiagos do Setor de Reprodução Animal pela convivência, em especial ao
Tiago Diesel por nos ensinar que cada detalhe é muito importante, e pela companhia até
altas horas na sala 09.
Ao meu orientador, Marco Antônio de Oliveira Viu, assim como a meu co-orientador,
Klayto José Gonçalves dos Santos agradeço pela oportunidade de expandir meus
horizontes frente à experiência que foi trabalhar com reprodução.
À D. Eneida, por cuidar do nosso setor sempre com muito carinho e competência, assim
como os demais servidores da UFG.
Aos nossos queridos estagiários Francine, Eduardo e Rafael, pela disponibilidade e
cuidado que sempre tiveram com nossos experimentos. Assim como aos demais colegas
do setor, que embora não trabalhássemos juntos, também foram nossos companheiros.
Ao Centro Espírita Paz, Amor e Caridade pelas companhias, ensinamentos, por ser
minha segunda casa, o lugar que amo estar e minha grande referência de Fé e amor ao
próximo.
Enfim, a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste
trabalho.
Muito Obrigada!
8
viii
"Devemos florir, onde Deus nos plantar"
Sta Terezinha
ix
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................... xv
1.
INTRODUÇÃO......................................................................................... 14
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................
16
2.1
Criopreservação.........................................................................................
16
2.2
Utilização do resveratrol............................................................................ 16
2.3
Relação estresse oxidativo – antioxidante.................................................
17
2.4
Grupo das situínas (SIRT1).......................................................................
19
2.5
Aquecimento e recultivo dos embriões.....................................................
19
3
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 21
3.1
Local..........................................................................................................
3.2
Delineamento experimental....................................................................... 21
3.3
Produção in vitro de embriões...................................................................
21
3.4
Maturação in vitro.....................................................................................
22
3.5
Vitrificação................................................................................................
23
3.6
Recultivo dos embriões com e sem resveratrol - (E1)............................... 25
3.6.1
Análise estatística do E1............................................................................ 26
3.7
Cultivo em palheta e meio holding - (E2).................................................
3.7.1
Análise estatística do E2............................................................................ 27
3.8
Avaliação do estresse oxidativo................................................................
27
3.9
Viabilidade embrionária – teste de TUNEL..............................................
28
4
RESULTADOS.........................................................................................
29
4.1
Resultados E1............................................................................................
29
4.2
Resultados E2............................................................................................
32
5
DISCUSSÃO.............................................................................................
39
5.1
Discussão E1.............................................................................................. 39
5.2
Discussão E2.............................................................................................. 42
6
CONCLUSÃO........................................................................................... 45
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
21
26
46
9
10
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Esquema representativo do processo da vitrificação.................. 24
Figura 2.
Esquema representativo do processo de aquecimento dos
embriões vitrificados.................................................................. 25
Figura 3.
Níveis de GSH e EROS em embriões bovinos
vitrificados/aquecidos expostos ou não em resveratrol 0.5 µM
31
por 24 horas após aquecimento...............................................
Figura 4.
Imagens teste de TUNEL E1, CIV+R indicam embriões
tratados com resveratrol no recultivo, E1 CONT embriões
recultivados em meio CIV padrão. Células coradas em azul
indicam o NTC e células coradas em verde indicam NCA,
imagem por microscopia de fluorescência...............................
32
Imagens teste de TUNEL E2, H+R 6h indicam embriões
tratados com resveratrol no meio holding pelo período de 6h
em que estavam envasados. H 6h indica embriões em meio
holding padrão envasados por 6h. Células coradas em azul
indicam o NTC e células coradas em verde indicam NCA,
imagem por microscopia de fluorescência................................
36
Figura 5.
Figura 6.
Imagens teste de TUNEL E2, H+R 10h indicam embriões
tratados com resveratrol no meio holding pelo período de 10h
em que estavam envasados. H 10h indica embriões em meio
holding padrão envasados por 10h. Células coradas em azul
indicam o NTC e células coradas em verde indicam NCA,
imagem por microscopia de fluorescência................................. 37
11
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Taxas de reexpansão e eclosão dos embriões produzidos in
vitro após a vitrificação............................................................ 29
Tabela 2.
Porcentagem de embriões de acordo com o estágio de
desenvolvimento E1................................................................. 30
Tabela 3.
Médias (± SEM) dos números totais de células (NTC),
número de células apoptóticas (NCA), para embriões
recultivados in vitro.................................................................
30
Tabela 4.
Porcentagem de embriões degenerados E1.............................. 31
Tabela 5.
Taxas de reexpansão e eclosão dos embriões frescos
produzidos in vitro envasados em meio holding.....................
33
Tabela 6.
Porcentagem de embriões de acordo com o estágio de
desenvolvimento E2................................................................. 34
Tabela 7.
Médias (± SEM) do número total de células (NTC), número
de células apoptóticas (NCA) para embriões PIV E2.............. 34
Tabela 8.
Porcentagem de embriões degenerados E2........................
Tabela 9.
Médias (± SEM) do índice de espécies reativas ao oxigênio
(EROS) e glutationa (GSH) emitida pelos embriões E2.......... 38
35
xii
12
LISTA DE ABREVIATURAS
Be
Bi
Bl
BSA
Bx
CAP
CCOs
CIV
CO2
D0
D2
D7
Deg
DIC
DNA
DVIT
E1
E2
EROS
FFC
FIV
GI
GII
GIII
GSH
HDP
hs
IETS
MCI
Min
MIV
mM
NAC
NaCl
NCA
NTC
Nm
Blastocisto eclodido
Blastocisto inicial
Blastocisto
Albumina sérica bovina
Blastocisto expandido
Meio de capacitação
Complexos cumulus oophorus
Meio de cultivo
Dióxido de carbono
Dia zero
Dia dois
Dia sete
Degenerado
Delineamento inteiramente casualizado
Ácido desoxirribonucleico
Meio de aquecimento
Experimento 1
Experimento 2
Espécies reativas do oxigênio
Fluido folicular centrifugado
Fertilização in vitro
Grau um
Grau dois
Grau três
Glutationa
Holding Plus
Horas
Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões
Massa celular interna
Minutos
Maturação in vitro
Mili Molar
N-acetil-cisteina
Cloreto de sódio
Número de células apoptóticas
Número total de células
Nanômetros
13
xiii
O2
PIV
Resv
SIE
SIRT1
Sol
TH6
TH10
TR6
TR10
VIT
β-ME
µM
Oxigênio
Produção in vitro
Resveratrol
Sistema de inspeção estadual
Sirtuina 1
Solução
Tratamento holding seis horas
Tratamento holding dez horas
Tratamento resveratrol seis horas
Tratamento resveratrol dez horas
Meio de vitrificação
β-mercaptoetanol
Micro Molar
14
xiv
RESUMO
Esse estudo foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a resposta de embriões
bovinos produzidos in vitro (PIV) à adição de resveratrol (Resv) aos meios de recultivo
para embriões vitrificados (Experimento 1 - E1) e Holding para embriões frescos
(Experimento 2 - E2) para verificar a manutenção ou melhora na qualidade desses
embriões. No E1 embriões bovinos PIV vitrificados foram aquecidos e recultivados em
meio contendo 0,5 µM de resveratrol, avaliando-se as taxas de reexpansão, eclosão e
qualidade celular através da análise de TUNEL. No E1, a taxa de eclosão após 24 horas
de recultivo foi superior (P < 0.05) no grupo Resv (37,7 vs 19,1%). Na taxa de embriões
de acordo com o estágio de desenvolvimento não apresentaram diferença entre
tratamentos. Ainda no E1, para os embriões PIV frescos o número total de células
(NTC) foi superior ao encontrado nos embriões vitrificados (131,6 vs 88,8 e 82,7%),
assim como o NCA (número de células apoptóticas) foi menor (6,3 ± 0,8) em relação
aos grupos controle e resveratrol (15,8 ± 1,2 e 13,5 ± 1,0), que não diferiram entre si
nessas variáveis. Não foi observada diferença nas taxas de embriões degenerados e
emissão de espécies reativas ao oxigênio (EROS) e glutationa (GSH). No E2 embriões
bovinos PIV frescos foram envasados em palhetas de 0,25mL com meio holding na
presença (TR6 e TR10) ou ausência (TH6 e TH10) de resveratrol e mantidos sobre
placa aquecedora a 36°C em diferentes tempos, seis e 10 horas, seguido do desenvase e
recultivo até 24 horas. As taxas de eclosão às 24hs dos embriões tratados com
antioxidante tenderam a ser maior que no controle. As taxas de Bx TR10 foi superior
(51,2%) ao TR6 (30,8%) (P < 0,05), os demais estágios de desenvolvimento
apresentaram-se semelhantes. O NTC foi menor no TH10, assim como a MCI. O índice
de EROS foi superior no TH10 (23,4126 ± 1,5661). Os valores de GSH do TR6
(95,2208) foram maiores que TH6 (30,7594) (P < 0,05), no TR10 a emissão de GSH
(49,5330 ± 6,5332) não diferiu do grupo TH10 (47,2044) (P > 0,05).
Palavras-chave: Estresse oxidativo, fertilização in vitro, glutationa, recultivo
reprodução, vitrificação.
15
xv
ABSTRACT
This study was developed with the objective of evaluating the response of bovine
embryos produced in vitro (PIV) the addition of resveratrol (Resv) to recultivo to
embryos vitrified (Experiment 1-E1) and medium Holding for fresh embryos
(Experiment 2-E2) to check the maintenance or improvement in the quality of these
embryos. In E1 PIV vitrified bovine embryos were heated and recultivados in the
medium containing 0.5 µM of resveratrol, evaluating the re-expansion rates, hatching
and cell quality by analysis of TUNEL. In E1, the hatching rate of recultivo more than
24 hours after (P < 0.05) in the Resv Group (37,7 vs. 19,1%). The rate of embryos
according to the stage of development did not show difference between treatments.
Even in E1, for fresh embryos PIV the total number of cells (NTC) was superior to that
found in the vitrified embryos (131,6 vs 88,8 and 82,7%) , as well as the NCA (number
of apoptotic cells) was lower (6,3 ± 0,8) compared with control groups and resveratrol
(15,8 ± 1.2 and 13,5 ± 1,0), which did not differ among themselves in these variables.
No difference was observed in embryos degenerates and reactive oxygen species (ROS)
and Glutathione (GSH). In E2 bovine embryos were fresh bottled PIV in 0,25 ml straws
with a holding in the presence (TR6 and TR10) or absence (TH6 and TH10) of
resveratrol and kept on warming plate to 36° C in different times, six and 10 hours,
followed by the unloading spouts and recultivo until 24 hours. Hatching rates at 24
hours of embryos treated with antioxidant tended to be greater than in the control. Bx
TR10 rates was higher (51,2%) the TR6 (30,8%) (P < 0.05), the other stages of
development were similar, the NTC was lower in TH10. The index of EROS was
superior in TH10 (23,4126 ± 1,5661). The values of the GSH TR6 (95,2208) were
larger than TH6 (30,7594) (P < 0.05), the TR10 issuing GSH (49,5330 ± 6,5332) did
not differ from TH10 group (47,2044) (P > 0,05).
Key words: oxidative stress, in vitro fertilization, glutathione, recultivo reproduction,
Glutathione.
16
1 INTRODUÇÃO
O aumento da população humana e da demanda por alimentos no mundo
tem servido de estímulo para os produtores buscarem alternativas para elevar a
produção ao longo dos tempos. Com o intuito de aumentar o ganho genético dos
animais eles têm introduzido em seus plantéis biotécnicas reprodutivas visando à rápida
multiplicação desse material genético de interesse para a produção animal. Nesse
contexto, a indústria de produção de embriões in vitro (PIV) tem aumentado
consideravelmente em todo mundo, especialmente no Brasil.
No mercado de embriões PIV, o país consolidou liderança absoluta,
respondendo por mais de 85% do total mundial. O crescimento da atividade até 2007 foi
refletido não apenas no número de embriões produzidos e transferidos, mas também no
número de laboratórios em atividade no Brasil e em suas filiais no exterior, no mercado
de insumos, serviços, treinamento e na demanda por pesquisa para melhoria dos
resultados da biotécnica1.
A PIV de embriões bovinos a partir de oócitos imaturos é um procedimento
comum em pesquisas na área de transgenia, clonagem e vem sendo utilizada
comercialmente em programas de reprodução. Atualmente, o método in vitro superou a
superovulação e transferência de embriões e tornou-se a técnica de escolha na produção
de embriões1, especialmente por ser mais utilizada em raças zebuínas, que em sua
maioria, como no caso do Nelore, fisiologicamente possui maior população folicular,
maior recuperação de oócitos por aspiração e, consequentemente, maior produção
embrionária2.
Na produção pecuária a eficiência da aquisição de embriões com alto valor
genético depende, entre outros aspectos, do sucesso das técnicas de estocagem em
baixas temperaturas. Com isso a criopreservação tornou-se de fundamental importância
no desenvolvimento do comércio internacional de embriões. A proposta dos
procedimentos de criopreservação é minimizar os danos celulares e contribuir para que
ocorra maior regeneração embrionária após o aquecimento3.
Vários fatores podem influenciar nos resultados da PIV de embriões, como
diferentes metodologias de maturação, cultivo, criopreservação e aquecimento. Sendo
que a adição de antioxidantes tem se apresentado como alternativa para melhorar esses
resultados. Pesquisas recentes mostraram que aditivos antioxidantes podem melhorar a
17
resposta dos embriões às injurias causadas pela criopreservação, sendo que o resveratrol
tem sido apontado como opção para favorecer a qualidade dos embriões, necessitando,
porém de estudos tanto em relação à sua adição aos meios de cultivo quanto pós cultivo
de embriões criopreservados suplementados com este metabólito4.
Pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de se aumentar a eficiência
do desenvolvimento de oócitos cultivados in vitro. O teste final para qualidade do
oócito é a sua habilidade em ser fertilizado e se desenvolver até o estágio de blastocisto,
finalmente estabelecendo uma gestação que resulte em um produto vivo5.
Apenas com o desenvolvimento de estudos que aumentem o conhecimento
sobre princípios e técnicas criobiológicas, será possível a identificação de pontos
cruciais para o desenvolvimento de metodologias que provoquem menores injúrias
causadas pelo processo de criopreservação, tornando-as totalmente reversíveis ou até
mesmo nulas ao desenvolvimento embrionário subsequente.
Esse estudo foi desenvolvido com base na hipótese de que a adição de
resveratrol aos meios utilizados para embriões PIV criopreservados ou frescos durante a
manutenção pré inovulação melhora a qualidade dessas estruturas.
Os objetivos foram verificar o efeito da adição do resveratrol ao meio de
recultivo de embriões PIV criopreservados e ao meio de manutenção (holding) para
embriões PIV frescos, por meio da avaliação da qualidade morfológica, da produção de
EROS e da quantidade de glutationa embrionária.
18
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Criopreservação
O objetivo de se realizar o congelamento de embriões é preservar o
metabolismo celular em estado de quiescência para que, posteriormente, este possa ser
restabelecido após um período de estocagem, continuando seu desenvolvimento normal.
Isso pode ser alcançado por meio do armazenamento em baixas temperaturas (-196ºC),
procedimento que induz à parada da atividade enzimática, do metabolismo e da
respiração celular, possibilitando a conservação de células por algum tempo3. A
capacidade de criopreservação de embriões, sem perda crítica de viabilidade, tem um
efeito profundo sobre o sucesso das técnicas de reprodução assistida6.
Apesar do avanço nas pesquisas, a criopreservação de embriões bovinos
PIV ainda encontra muitas limitações, em virtude das consequências sobre a expressão
gênica desses embriões, já alterada em decorrência das condições de maturação
ovocitária, fecundação e cultivo in vitro7. A criopreservação continua como um desafio
para a pesquisa, sendo que melhores resultados tem sido obtidos utilizando-se a
vitrificação dos embriões8, pois a formação de cristais de gelo é totalmente eliminada. A
solidificação é atingida pelo aumento extremo da viscosidade e não pela cristalização,
chegando diretamente à fase vítrea, permitindo a passagem pela zona crítica de
temperatura de maneira rápida, o que impede o desenvolvimento de injúrias causadas
pelos cristais de gelo. Em contrapartida, nessa técnica a concentração de crioprotetor
utilizada, em torno de 40% da solução, traz efeitos tóxicos, o que favorece a ocorrência
de injúrias causadas pela toxidade celular, embora a rapidez requerida durante o
processo reduza o tempo de exposição ao crioprotetor3.
2.2 Utilização do Resveratrol
O uso de aditivos tais como aqueles reguladores metabólicos, ou
antioxidantes, têm sido indicado para melhorar a resposta de embriões bovinos a
criopreservação8,6,9. O resveratrol (3, 4’, 5-trihydroxystilbene) é uma ocorrência natural
da fitoalexina, um metabólito vegetal secundário produzido pela interação das plantas
com um micro-organismo encontrado nas raízes do Polygonum cuspidatum e Vitis
19
vinífera, também presentes em vinhos tintos, amoras e framboesas. Sua ação
antioxidante confere ação protetora contra infecções fúngica e bacteriana nessas
plantas4. Assim sendo, o resveratrol tem sido apresentado como alternativa a ser usado
para melhorar os índices na PIV de embriões criopreservados.
Sua adição aos diferentes meios de trabalho durante a produção de embriões
PIV melhora a qualidade dos embriões, favorecendo o desenvolvimento dos embriões
criopreservados durante o recultivo, elevando a taxa de sobrevivência e eclosão após a
vitrificação e descongelamento6.
O significado biológico do resveratrol tem sido estudado com frequência, no
entanto, os mecanismos subjacentes às funções biológicas do resveratrol não são
totalmente compreendidos. Alguns estudos têm indicado que resveratrol melhora a
função mitocondrial ativando a enzima sirtuin-1 (SIRT1)10,11. Reforçando sua relação
na síntese de GSH, foi demonstrado em estudos12,13 que o resveratrol aumenta as
concentrações intracelulares de GSH em oócitos.
2.3 Relação estresse oxidativo - antioxidante
Durante a criopreservação os embriões estão susceptíveis aos danos
oxidativos, sendo que embriões PIV são mais predispostos ao estresse oxidativo
induzido por fatores endógenos e exógenos durante o cultivo14. Este é um dos fatores
responsáveis pela baixa eficiência dos sistemas de PIV. O estresse oxidativo tem como
definição o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) e os
agentes antioxidantes. Radicais livres do oxigênio, que diminuem consideravelmente a
viabilidade das células, formam-se durante a criopreservação de tecidos14, com isso
espermatozoides bovinos são susceptíveis as EROS, o que também pode resultar em
menores taxas de embrião15.
As EROS são metabólitos de oxigênio (O²), que em baixas concentrações
desempenham papel importante nos processos fisiológicos, no entanto em altas
concentrações podem danificar moléculas e estruturas celulares acarretando efeitos
deletérios na função celular levando a apoptose8.
Agentes antioxidantes são capazes de destruir, eliminar ou suprimir a
formação das EROS. Vários antioxidantes já foram utilizados na PIV de embriões com
o objetivo de promover a melhor resistência dos embriões reduzindo as EROS8,9,16.
20
Tanto a melatonina na fertilização in vitro
9
quanto o β-mercaptoetanol - βME8 nos
meios de cultivo e de criopreservação já foram utilizados com o objetivo de aumentar a
resistência dos embriões pela redução na produção/quantidade de EROS. Porém, os
mecanismos capazes de desencadear esses efeitos ainda não estão totalmente
elucidados.
O resveratrol utilizado durante a maturação de ovócitos suínos antes da
vitrificação reduziu a quantidade de células apoptóticas após descongelamento e
mostrou efeito positivo no desenvolvimento embrionário17,18. A suplementação do meio
de maturação com resveratrol aumentou a taxa de fertilização normal e o
desenvolvimento subsequente de embriões suínos, aumentando as quantidades de
glutationa nos oócitos4. Em bovinos, quando adicionado aos meios de cultivo elevou a
taxa de sobrevivência e eclosão após vitrificação e descongelamento6.
Um estudo mostrou que a quantidade de EROS é maior nos animais mais
velhos, mas a adição de resveratrol aumentou a quantidade de SIRT1 em oócitos e
melhorou o resultado da fertilização dos oócitos independente da idade das fêmeas, sem
afetar a quantidade de EROS produzidas pelos oócitos19.
A fecundação bem sucedida é relacionada com a oscilação de cálcio
provocada pela entrada do espermatozoide no oócito. A liberação do cálcio pelo retículo
endoplasmático ocorre pela interação com as mitocôndrias, visto que a qualidade
mitocondrial afeta a homeostase do cálcio4, devido a isso a quantidade e qualidade
mitocondrial são consideradas grandes marcadores de qualidade do oócito. Diante do
exposto11 pesquisadores formularam a hipótese que o resveratrol afeta a função
mitocondrial, que promove eventos fisiológicos responsáveis pela fertilização bem
sucedida. Isso porque o resveratrol é um ativador específico de SIRT1, que age no
controle da função mitocondrial11.
Também tem sido demonstrado que o resveratrol aumenta a concentração
intracelular de GSH protegendo contra o estresse oxidativo13. Sob condições ideais o
equilíbrio entre EROS e antioxidantes é mantido. No entanto, aumentando à geração de
EROS a capacidade antioxidante é superada, levando a um desequilíbrio do sistema. Há
um conjunto de antioxidantes (enzimáticos e não enzimáticos) que modulam as
concentrações de pró-oxidantes presentes na célula, sendo a GSH um desses agentes
responsáveis por esse equilíbrio12.
21
Uma diminuição dos níveis de GSH pode ter um efeito negativo sobre o
desenvolvimento embrionário subsequente. Como a GSH é conhecida por desempenhar
um importante papel no sistema de defesa antioxidante das células, o enfraquecimento
dessas defesas pode causar aumento do estresse oxidativo, que tem efeitos nocivos
sobre o desenvolvimento do embrião14. Sendo assim, estabelecer um sistema com altas
concentrações de GSH intracelular e baixos níveis EROS podem melhorar a viabilidade
de embriões.
2.4 Grupo das sirtuínas (SIRT1)
As sirtuínas são uma classe de enzimas que encontram-se num grande
espectro de organismos, desde as leveduras e bactérias aos humanos. Parecem estar
relacionadas com o envelhecimento e na regulação da transcrição, apoptose e resistência
ao estresse, como também na regulação de processos metabólicos em situações de baixa
quantidade de calorias11. Além disso, a SIRT1 tem um papel no controle da função
mitocondrial e o Resveratrol é um ativador específico de SIRT111.
Resultados obtidos em outros estudos fornecem novas provas sobre os
mecanismos pelos quais o resveratrol promove efeito antioxidante na maturação de
ovócitos bovinos e subsequente desenvolvimento embrionário por meio da indução de
secreção de progesterona, provavelmente de maneira dependente da SIRT113. O
resveratrol interferiu promovendo aumento nos genes da síntese de progesterona, e
reduziu a expressão dos genes de produção do estradiol. Estes resultados indicam que o
resveratrol pode promover a maturação de ovócitos bovinos estimulando a secreção de
progesterona pelas células do cúmulus13.
2.5 Aquecimento e recultivo de embriões
Devido às alterações metabólicas todos os embriões sofrem consideráveis
injúrias morfológicas e funcionais durante a criopreservação, mas a extensão dos danos
assim como as diferenças na sobrevivência e desenvolvimento pós-criopreservação
podem variar de acordo com diferentes fatores, tais como a espécie, o método de
congelamento, o tipo de embrião, o estágio de desenvolvimento, o ambiente de cultivo,
entre outros20. Funções fisiológicas e atividades biológicas do resveratrol para fins
22
terapêuticos têm sido bastante pesquisadas, no entanto, são limitadas as informações
disponíveis sobre os efeitos do resveratrol4 principalmente no recultivo.
A viabilidade de embriões PIV criopreservados, medida pela sobrevivência
no recultivo pós-aquecimento, é menor que em embriões produzidos in vivo21,22 .
Estudos tem demonstrado que antioxidantes exógenos aumentam a chance de embriões
para desenvolverem até blastocistos. Pesquisadores descobriram que embriões tratados
com β-ME no recultivo apresentam menor fragmentação de DNA8. Isto representa que o
uso de antioxidantes é efetivo e extremamente benéfico quando se trata de recultivo de
embriões PIV. Com isso, a inclusão de antioxidantes durante desenvolvimento do
embrião in vitro não é suficiente para manter a qualidade destes durante o período
crítico do aquecimento e recultivo, devendo haver uma fonte excedente de antioxidantes
exógenos durante o recultivo de embriões8.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local
O experimento foi realizado na Embrapa Cerrados - Centro de Transferência
de Tecnologias de Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira, localizado em Brasília/DF em
parceria com o Setor de Reprodução Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás, Campus II Samambaia, situado na Rodovia Goiânia Nova Veneza, Goiânia - Goiás.
Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Federal de Goiás, sob protocolo nº 049/2015.
3.2 Delineamento experimental
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em arranjo
fatorial 2 x 2 no E1 e no E2 DIC em parcelas subdivididas no tempo (SPLIT-PLOT).
3.3 Produção in vitro dos embriões
Para a produção in vitro de embriões os complexos cumulus oophorus
(CCOs) foram recuperados de ovários provenientes de fêmeas bovinas abatidas em
frigorífico com Sistema de Inspeção Estadual (SIE), imediatamente após abate e
evisceração os ovários eram removidos e imersos em uma garrafa térmica, os quais
eram transportados até o Laboratório Fertilização in vitro, em solução fisiológica estéril
(NaCl 0,9%) em temperatura de 30-35 ºC6. No laboratório os ovários foram transferidos
para uma nova solução fisiológica pré aquecida, e colocados em banho maria a 37ºC.
Os folículos ovarianos com diâmetro de 2,0 - 8,0 mm foram aspirados com
auxílio de uma agulha hipodérmica (40 x 1,2mm, BD®), o líquido folicular foi
depositado em tubos Falcon 15ml (BD®) por 10’, para que ocorresse a decantação dos
ovócitos. Posteriormente o “pellet” formado no fundo cônico foi recuperado com
auxílio de uma pipeta de Pasteur (CralPlast®) e transferidos para uma placa de Petri (90
x 15 mm, Cral®) mantida em placa aquecedora a 37ºC, técnica adaptada6,8. Com o
auxílio de uma micropipeta, a seleção dos ovócitos foi realizada no próprio fluido
24
folicular (FFC) previamente centrifugado por cinco minutos (Mini Spin, Eppendorf®)
sendo a identificação dos CCOs conduzida sob lupa estereomicroscópica.
Escores de pontuação foram utilizados para avaliação da qualidade dos
ovócitos recuperados com base na aparência do citoplasma e densidade das células do
cumulus ao redor do ovócito23. Para tanto se utilizou lupa estereomicroscópica,
classificando-se os ovócitos em: grau I (GI), mais de três camadas compactas de células
do cumulus e citoplasma homogêneo; grau II (GII), duas camadas compactas de células
do cumulus com o citoplasma menos homogêneo em relação ao anterior; grau III (GIII),
camada irregular com poucas células do cumulus e citoplasma escuro; e degenerados
(DEG), ausência ou expansão de células do cumulus, citoplasma escuro e irregular, de
acordo com a classificação da Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões
(IETS).
3.4 Maturação in vitro
Os oócitos GI e GII foram transferidos para outra placa de Petri (90x60mm,
®
Cral ) onde foram lavados três vezes em FFC e três vezes em meio maturação (MIV) de
composição TCM 199 com sais Earle e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand
Island, NY, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v), 0,2 mM piruvato, 5
mg/mL hormônio luteinizante (Lutropin-V®, Bioniche Co., Belleville, ON, Canada), 1
mg/mL hormônio folículo estimulante (Folltropin®, Bioniche Co., Belleville, ON,
Canada), 75 µg/ml amicacina e 1mM cistamina - Progest® Botucatu, São Paulo, Brasil.
Após a lavagem foram distribuídos em número de 25 a 30 oócitos por
microgota da placa de maturação, contendo 200 µl de meio de maturação por poço, que
devidamente identificadas, eram mantidas por 22 – 24 horas em estufa de cultivo
(Thermo®) a 38 °C com atmosfera de 5% de CO2 e umidade saturada24.
Após a maturação os CCOs foram lavados em uma gota de 100 µL de meio
fecundação - FIV (TALP-FIV suplementado com 6 mg/mL BSA-livre de ácido graxo,
0,2 mM piruvato, 30 µg/mL heparina, 20 µM penicilamina, 10 µM hipotaurina, 1 µM
epinefrina e 75 ug/ml amicacina - Progest®).
Os espermatozoides foram selecionados através da centrifugação (9000 G –
5min) de sêmen descongelado de touros com comprovada capacidade de produção
embrionária. O sêmen foi submetido ao gradiente de 45 e 90% de Percoll (Progest®) 25.
25
O sedimento formado foi lavado em 1mL de meio de capacitação - CAP, através de
nova centrifugação (9000 G- 5 min) (Tyrode's HEPES-buffered medium, suplementado
com 0,2 mM piruvato e 75 ug/ml amicacina - Progest®). O novo sedimento formado foi
ressuspendido em 100 µl de meio FIV, e utilizado para proceder a FIV, contendo uma
dose inseminante de 1 x 106 espermatozoides/ml. Os oócitos foram incubados com os
espermatozoides em gotas de 200 µl de meio FIV por 18-20 horas, em estufa de cultivo
a 38 °C com atmosfera de 5% de CO2 e umidade saturada.
Após a fecundação, as células do CCOs foram removidas através de
pipetagens sucessivas, lavados em três gotas de 50 µl de meio de cultivo - CIV (SOFaa Holm, P, Schimidt, MH, Greve, T, Callesen 1999) suplementado com 2,7 mM mioinositol, 0,2 mM piruvato, 2,5% soro fetal bovino (v/v), 5 mg/mL BSA-livre de ácido
graxo, 75 ug/ml amicacina – (Progest®) e transferidos para gotas de 200 µl de CIV,
onde os grupos de prováveis zigotos foram cultivados até D7 em estufa de cultivo nas
mesmas condições da maturação.
As avaliações da clivagem foram realizadas no dia dois (D2), considerando
a fecundação como dia zero (D0) sendo a taxa de clivagem o número de estruturas
clivadas em relação à quantidade de oócitos viáveis. Ao final do período de cultivo (dia
sete - D7) foram determinadas as taxas de blastocisto, que consistia no número de
blastocistos (blastocisto inicial - Bi, blastocisto - Bl, blastocisto expandido - Bx e
blastocisto eclodido - Be) também em relação ao número de oócitos viáveis.
3.5 Vitrificação
Depois de fertilizados e cultivados por sete dias, os embriões foram
submetidos ao procedimento de criopreservação por vitrificação. Utilizaram-se somente
embriões classificados como GI e GII (melhor qualidade) com células homogêneas, boa
espessura da zona pelúcida, ausência de defeitos morfológicos ou extrusões celulares e
mais de 50% da massa celular íntegra, de acordo com a classificação da IETS.
Os embriões foram retirados da placa de CIV e transferidos para uma placa
de Petri (90 x 15 mm, Cral®), contendo gotas uma gota de 70 μL de meio SM [HEPES
tamponado com TCM-199 [(GIBCO® BRL, Invitrogen Gibco®, Invitrogen Co, Grand
Island, NY, USA) Progest®] suplementado com 20% de soro fetal bovino e três gotas de
meio de vitrificação SV1 [HEPES tamponado com TCM-199 (GIBCO® BRL,
26
Invitrogen Co, Grand Island, NY, USA) suplementado com 20% de soro fetal bovino,
7,5% de etilenoglicol e 7,5% de dimetilsolfóxido - Progest®]. Os embriões foram
mantidos por 3 minutos (min) em SM com a primeira gota de SV1, através da união
destas duas gotas. Após este tempo, foi unida a segunda gota de SV1 e mantidos mais 3
min. Ao final deste processo, foram colocados na ultima gota de SV1 por 3 min. Em
seguida foram lavados três vezes em gotas de 50 μL da solução de vitrificação SV2
(meio SM com 15% de etilenoglicol, 15% de DMSO e 0,5 molar de sacarose - Progest®,
Botucatu, São Paulo, BR) no tempo de 45 a 90 segundos e depositados na porção final
da haste de polipropileno de 0,7 mm de espessura (Vitri-Ingá® INGAMED, Maringá,
PR), conforme o protocolo descrito anteriormente26, sendo retirada quase a totalidade do
meio em que estavam imersos os embriões9, Figura 1.
FIGURA 1 - Esquema representativo do processo de vitrificação dos embriões.
As hastes foram mergulhadas em nitrogênio líquido e seus protetores
acoplados, posteriormente as hastes foram introduzidas em raques previamente
identificadas e armazenadas em botijões criogênico. No momento determinado para o
aquecimento dos embriões, as hastes foram retiradas do nitrogênio líquido e tiveram sua
a porção final imersa em uma gota de 200 μL de solução de aquecimento DV1 (meio
SM suplementado com 1,0 M de sacarose - Progest®), até que os embriões saíssem da
haste e logo transferidos para uma nova gota de 100 μL DV1 por 1 min. Em seguida, os
embriões foram transferidos para uma gota de 200 μL da solução DV2 (meio SM
suplementado com 0,5 molar de sacarose - Progest®) por três min e, por fim, em duas
gotas de 100 μL de SM (Progest®) por cinco min cada, Figura 2. Todo o processo de
aquecimento foi realizado em placa aquecedora a 38 °C.
27
FIGURA 2 - Esquema representativo do processo de aquecimento dos embriões vitrificados.
3.6 Recultivo dos embriões com e sem resveratrol - Experimento 1
Para o preparo do meio de recultivo na presença de resveratrol,
primeiramente foi preparado uma solução stock A na concentração 252,3652 mM, dessa
solução foi retirado a quantia de 0,25 μL e diluído em 12,615 μL de meio de CIV (Sol.
Stock), na concentração de 5 μM. A solução de recultivo com resveratrol foi preparada
em meio CIV na concentração de 0,5 μM 8, e o grupo controle com meio CIV padrão.
Desta solução foram feitas as gotas de 200 μL, de recultivo com resveratrol, sendo a
gota sem resveratrol preparada com meio de CIV padrão. As placas de petri (60 x 15
mm, Cral®) foram preparadas previamente, e ao final do processo de aquecimento, os
embriões eram divididos uniformemente e transferidos para as gotas de 200 μL de meio
de CIV com e sem o tratamento de resveratrol. Os embriões foram recultivados in vitro,
à temperatura de 38,5ºC e atmosfera de 5% CO2 e umidade saturada. As taxas de
sobrevivência pós aquecimento foram avaliados com base na reexpansão da blastocele,
porcentagens de embriões que retomaram o desenvolvimento pós recultivo, bem como o
taxas de eclosão as seis e 24 horas distintamente. As sondas para avaliação do estresse
oxidativo, EROS e GSH, foram realizadas com 25% de cada tratamento também às 24
horas. E o teste de TUNEL para verificar a integridade dos embriões, foi realizado às
24hs, também foi realizado teste de TUNEL em embriões que não passaram pela
vitrificação com a finalidade de compará-los com os vitrificados. O processo foi
realizado em oito repetições.
28
3.6.1 Análise estatística experimento 1
As análises estatísticas foram realizadas por meio do pacote computacional
Sigma Plot 11.0 (Systat software Inc, EUA). As variáveis porcentagem de embriões
degenerados, estágio de desenvolvimento embrionário e taxas de reexpansão e eclosão
entre os tratamentos foram comparadas pelos testes qui-quadrado e exato de Fischer
quando aplicável. A média do número total de células (NTC), contagem de células
apoptóticas (NCA) por embrião foram comparadas entre os tratamentos pelo teste de
Kruskal-Wallis. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para analisar os níveis de EROS
e GSH entre os tratamentos. Os dados foram apresentados na forma de média (± erro
padrão da média) e porcentagem, e os resultados foram considerados significativos
quando P < 0,05.
3.7 Cultivo em palheta em meio Holding - Experimento 2
Para o experimento 2 os embriões foram produzidos seguindo a mesma
metodologia do experimento 1. Os embriões GI e GII obtidos em D7 no estágio de
blastocisto foram selecionados e colocados em meio de manutenção TQC Holding Plus
(HDP) (Progest®) em dois tratamentos, com resveratrol na mesma concentração do
experimento um, 0,5 µM e sem o antioxidante. Logo foram envasados em palhetas de
0,25ml. Para o envase, após o êmbolo foi feita duas colunas meio HDP, seguida de uma
pequena bolha de ar. Na terceira coluna foram colocados grupos de cinco embriões
ainda em meio HDP, seguida por uma bolha de ar uma coluna de meio outra de ar,
terminando com o meio para vedar e fazer o vácuo27.
As palhetas com os embriões foram deixadas em placa aquecedora a 36ºC
em dois tratamentos, um que foi avaliado às seis horas e o outro às 10 horas de cultivo
na palheta em HDP. Esses embriões foram avaliados quanto às taxas de reexpansão,
eclosão e qualidade embrionária. No tempo determinado conforme o tratamento os
embriões foram retirados das palhetas e recultivados em meio CIV até o tempo de 24
horas após o envase, nesse período foi realizada mais uma avaliação do estágio e
qualidade embrionária, sendo uma parcela reservada para análise de fluorescência. As
sondas para avaliação do estresse oxidativo, EROS e GSH, foram realizadas com 25%
dos embriões de cada tratamento. O teste de TUNEL foi realizado para verificar a
29
integridade dos embriões às 24hs. O tratamento das 6 horas foi repetido seis vezes, e o
tratamento das 10 horas quatro repetições.
3.7.1 Análise estatística experimento 2
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se os procedimentos do
pacote computacional Sigma Plot 11.0 (Systat software Inc, EUA). As variáveis
porcentagem de embriões degenerados, estágio de desenvolvimento embrionário, e
taxas de reexpansão e eclosão entre os tratamentos foram comparadas pelos testes quiquadrado e exato de Fischer quando aplicável. A média do número total de células
(NTC), contagem de células apoptóticas (NCA) por embrião foram comparadas entre os
tratamentos pelo teste de Kruskal-Wallis. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para
analisar os níveis de EROS e GSH entre os tratamentos. Os dados foram apresentados
na forma de média (± erro padrão da média) e porcentagem. A probabilidade de P <
0.05 indicaram que a diferença foi significante, e valores entre P > 0.05 e P ≤ 0.1
apontaram tendência a significância.
3.8 Avaliação de estresse oxidativo
Para se determinar a quantificação de estresse oxidativo, para as avaliações
28,29
das EROS
, foi utilizada marcações com a sonda CM-H2DCFDA (C 400, molecular
probes). Para avaliação da quantificação de GSH a foi utilizada a sonda CellTracker
Blue
CMF2HC:
(C
12881,
4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycounmarin;
Molecular Probes). Tais avaliações foram realizadas conforme adaptações das
metodologias anteriormente descritas4,16,30.
Os embriões foram colocados entre lâmina e lamínula e observados com
auxílio de um microscópio de fluorescência, de forma que as estruturas foram marcadas
e fotografadas para determinar, conforme a intensidade de fluorescência mensurada em
pixels, o índice de EROS e GSH. Cada pixel de intensidade de fluorescência foi
transformada para obter um medida quantitativa, utilizando o software de imagem-J
(NIH, Bethesda, MD, EUA) 30.
Os embriões foram lavados três vezes em gotas de 50 µL PBS/PVA sem as
sondas. As estruturas foram então incubadas em gotas de 100 µL (PBS/PVA com as
30
sondas), sob óleo mineral, durante 30 min em estufa. Após o período foram lavadas
novamente em três gotas de PBS/PVA e colocadas em lâmina lamínula, utilizando
vaselina na lamínula para manter formato esférico das estruturas. A avaliação foi
realizada em microscópio de fluorescência (Olympus® BX43 – Center Valey, PA,
USA). Para análise de EROS o filtro utilizado foi 460 nm e glutationa 370 nm.
3.9 Viabilidade embrionária - Teste de TUNEL
Para verificar os níveis de apoptose dos embriões foi realizada a técnica de
TUNEL adaptada da metodologia de estudos anteriormente realizados28,9. Com
amostras das estruturas de cada tratamento, os embriões foram lavados em PBS, da
solução 50 ml de PBS contendo 0,05g PVP e fixados em paraformaldeído a 3,7% por
1h. Os embriões foram então permeabilizados por 1h em 0,5% Triton X-100 e 0,1% de
citrato de sódio diluído em PBS/PVP, sempre no final das fases os embriões foram
lavados em três gotas de PBS-PVP deixando 2 minutos na última gota.
Os embriões foram então divididos em três grupos: controle positivo,
controle negativo e amostra. O grupo positivo foi lavado em uma gota de solução
DNAse composta por Tris-HCl, MgCl2, Solução DNase mãe, colocados em solução
DNAse e mantidos por 1h em câmara úmida a 37˚C.
O grupo negativo permaneceu em PBS/PVP a 37˚C por 1 hora. Ao final
novamente foram lavados em três gotas de PBS/PVP deixando dois minutos na última
gota. Posteriormente, foi incubado em solução marcadora mix (Solução kit-TUNEL
Vial 2) por 1 hora a 37˚C, em câmara úmida. Em seguida todos os grupos de embriões
foram incubados em solução Hoeschst 33342.
Para visualização em microscopia de fluorescência, dos núcleos em
coloração verde (corante FITC), que são as células TUNEL positivas com DNA
fragmentado foi utilizado o filtro verde (450 nm). E para visualização do núcleo com
coloração azul (corante Hoeschst 33342), que marca todo o material genético o filtro
utilizado foi o azul (365 nm).
31
4 RESULTADOS
4.1 Resultados experimento 1
Para os dois experimentos foram produzidos um total de 1008 embriões.
Destes, 400 foram utilizados no E1 e 213 no E2, o que resulta em uma taxa de
aproveitamento média de embriões de qualidade G1 e G2 de 60,81 %. A classificação
foi realizada em função do estádio de desenvolvimento e da qualidade morfológica dos
embriões, sendo os principais parâmetros considerados para avaliação da qualidade
formato, simetria, coloração, extrusão celular e integridade da zona pelúcida31.
A Tabela 1 apresenta as taxa de reexpansão e eclosão dos embriões PIV do
experimento 1, que após 24 horas de recultivo não apresentaram diferença (P < 0.05)
entre o tratamento controle (TC) e o tratamento resveratrol (TR).
TABELA 1. Taxas de reexpansão e eclosão dos embriões produzidos in vitro após a
vitrificação
Reexpansão (%)
Eclosão (%)
Tratamento
6 horas
24 horas
6 horas
Controle
38.3 (41/107)A 56.6 (47/83)A
Resveratrol
37.5 (45/120)A 51.9 (53/102)A 13.3 (6/45)A
A,B
14.6 (6/41)A
24 horas
19.1 (9/47)A
37.7 (20/53)B
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença (P < 0.05).
Na Tabela 2 estão as porcentagens de embriões por estágio de
desenvolvimento, às 6 horas constatou-se que os grupos controle e resveratrol não
diferiram. Do mesmo modo na avaliação realizada às 24 horas os blastocistos não
apresentaram diferença (P > 0,05) embora os valores de Bn e Be tenham sido quase o
dobro no TR comparado ao TC.
O NTC e NCA obtidas através do teste de TUNEL avaliado para embriões
frescos, vitrificados e recultivados em meio padrão, vitrificados e recultivados na
presença do resveratrol encontram-se na Tabela 3.
32
TABELA 2. Porcentagem de embriões de acordo com o estágio de desenvolvimento
Tratamento
Bl
70.0
Controle
Estágio de desenvolvimento (%)
6 horas
24 horas
Bx
Bn
Be
Bl
Bx
Bn
Be
24.3
1.8
3.7
53.0
(75/107) (26/107) (2/107) (4/107) (44/83)
Resveratrol
62.5
32.5
4.1
0.01
48.0
36.1
3.6
7.2
(30/83)
(3/83)
(6/83)
32.3
6.8
12.7
(75/120) (39/120) (5/120) (1/120) (49/102) (33/102) (7/102) (13/102)
(blastocisto - Bl, blastocisto expandido - Bx, blastocisto em eclosão - Bn, blastocisto eclodido Be) (P > 0,05)
A avaliação de TUNEL foi realizada com os embriões frescos em D7, com
o objetivo de demonstrar a qualidade dos embriões produzidos durante do experimento
com base na aferição do NTC, visto que a qualidade embrionária é um fator
determinante para a criotolerância32, destes foram testados 25 embriões amostra das
rotinas, divididos em cinco repetições.
Para embriões frescos o NTC foi superior (P < 0,05) aos vitrificados, que
apresentaram mais células apoptóticas. Não houve diferença para as variáveis NTC e
NCA entre o grupo controle e resveratrol (P > 0,05).
TABELA 3. Médias (± SEM) dos números totais de células (NTC) e número de células
apoptóticas (NCA) para embriões recultivados in vitro
Tratamento
NTC
CV
NCA
CV
Embriões frescos
131.6 ± 5.9A
23,20
6.3 ± 0.8A
71,86
Controle
88.8 ± 6.2B
35,59
15.8 ± 1.2B
41,39
37,35
B
45,62
Resveratrol
A,B
B
82.7 ± 5.3
13.5 ± 1.0
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (P < 0,05).
A Tabela 4 traz as taxas de embriões degenerados às seis e 24 horas, sendo
que não foram observadas diferença entre o TC e TR quanto a porcentagem de
degenerados (P > 0,05).
33
TABELA 4. Porcentagem de embriões degenerados E1
Embriões degenerados (%)
Tratamento
6 horas
24 horas
Controle
46.5 (93/200)
58.5 (117/200)
Resveratrol
43.1 (91/211)
51.6 (109/211)
(P > 0,05)
Na Figura 3 constam os valores de intensidade luminosa em pixels, que
definem a quantidade de EROS e GSH emitida por embrião avaliado. No TR os valores
de EROS foram inferiores quando comparados aos tratamento controle. A quantidade de
glutationa apresentada no tratamento controle foi superior quando comparado ao grupo
tratado com a presença do antioxidante resveratrol P > 0,05.
FIGURA 3 - Níveis de GSH e ROS em embriões bovinos vitrificados/aquecidos expostos ou
não em resveratrol 0.5 µM por 24 horas após aquecimento.
Na Figura 4 encontram-se imagens de embriões corados pelo teste de
TUNEL do E1, que permite visualizar através do número de células a qualidade do
embrião, avaliações dinâmicas como coloração para identificação de células apoptóticas
podem auxiliar na determinação do potencial real dos embriões.
As células coradas em azul representam o NTC do embrião, e as células
coradas em verde, representam as células com DNA fragmentado, ou seja, células em
processo de apoptose.
34
E1 CONT
E1 CONT
CIV + R
CIV + R
FIGURA 4 - Imagens teste de TUNEL E1, CIV+R indicam embriões tratados com
resveratrol no recultivo, E1 CONT embriões recultivados em meio CIV
padrão. Células coradas em azul indicam o NTC e células coradas em
verde indicam NCA, imagem por microscopia de fluorescência (40X).
4.2 Resultadoss Experimento 2
A Tabela 5 apresenta os dados da taxa de reexpansão e eclosão no
tratamento em holding seis e 10 horas (TH6 e TH10) e também do tratamento
resveratrol seis e 10 horas (TR6 e TR10). O desenvolvimento da blastocele determina o
aumento do diâmetro embrionário, como consequência de sua expansão e devido a
elasticidade, a zona pelúcida torna-se
torna se delgada o que aumenta a tensão superficial,
culminando com o seu rompimento e eclosão da massa celular embrionária. Sendo
denominado inicialmente de blastocisto
b
em eclosão
closão e após ser liberado da zona
pelúcida, blastocisto eclodido 33.
35
A taxa de reexpansão do TH6 e TR6 às 6 horas diferiu do TH10 e TR10 às
10h (P < 0,05) e no TR10 foi superior aos outros tratamentos (P < 0,05) o que também
ocorreu às 24h. Na taxa de eclosão, às seis horas o TH6 e o TR6 não apresentaram
nenhum embrião eclodido, já no TH10 e TR10 houve taxa de eclosão porém sem
diferença entre si. Avaliada às 24h nenhum tratamento apresentou significativamente
superior.
TABELA 5. Taxas de reexpansão e eclosão dos embriões frescos produzidos in vitro
envasados em meio holding
Reexpansão (%)
Eclosão (%)
Tratamento
6 horas
24 horas
6 horas
24 horas
AC
A
Holding 6H
28.9 (20/69)
54.5 (30/55)
- (0/20)
43.3 (13/30)AB
Resveratrol 6H
23.3 (18/77)A
48.5 (33/68)A
- (0/18)
10 horas
24 horas
10 horas
BC
A
48.4 (16/33)A
24 horas
A
Holding 10H
43.2 (29/67)
62.0 (36/58)
Resveratrol 10H
57.6 (30/52)B
80.4 (33/41)B 36.6 (11/30)A
20.6 (6/29)
25.0 (9/36)B†
27.2 (9/33)AB
A,B
†
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (P < 0,05).
Tendem a diferir para resveratrol 6H (P = 0.07)
O estágio de desenvolvimento dos embriões encontram-se na Tabela 6. No
TH6 e TR6, as taxas de Bl foram superiores TH10 e TR10, no entanto as taxas de Bx
foram superiores TH10 e TR10 (P < 0,05) para a primeira avaliação, que não apresentou
em processo de eclosão às 6h e sim às 10h. Na avaliação observada às 24h a taxa de Bl
no TR6 superou o TR10, mas esse tratamento apresentou maiores taxas de Bx que o
TR6. No entanto, os valores de Bn e Be foram semelhantes entre todos os tratamentos.
Os dados obtidos do NTC e NCA estão na Tabela 7. Foi observado que o
NTC do TH10 foi inferior (P < 0,05) aos demais tratamentos, que não diferiram entre si.
O NCA no TR10 foi superior aos TH6 e TH10, mas foi semelhante ao TR6.
36
TABELA 6. Porcentagem de embriões de acordo com o estágio de desenvolvimento
Tratamento
Holding 6H
Bl
78.2A
(54/69) (15/69) (0/69) (0/69) (22/55) (20/55) (4/55)
A
Resveratrol 6H
Estágio de desenvolvimento (%)
6 horas
24 horas
Bx
Bn
Be
Bl
Bx
Bn
21.7A
40.0AB 36.3AB 7.2A
77.9
A
22.0
-
A
-
45.5
A
30.8
10 horas
Resveratrol 10H
7.3
(9/55)
16.1A
(60/77) (17/77) (0/77) (0/77) (31/68) (21/68) (5/68) (11/68)
B
Holding 10H
A
Be
16.3A
47.7
B
43.2
24 horas
A
4.4
A
4.4
AB
32.7
51.7B
3.4A
(32/67) (29/67) (3/67) (3/67) (19/58) (30/58) (2/58)
36.5B
51.9B
5.7A
5.7A
26.8B
51.2B
2.4A
(19/52) (27/52) (3/52) (3/52) (11/41) (21/41) (1/41)
12.0A
(7/58)
19.5A
(8/41)
(blastocisto - Bl, blastocisto expandido - Bx, blastocisto em eclosão - Bn, blastocisto eclodido Be) E2. A,B Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (P < 0,05).
TABELA 7. Médias (± SEM) do número total de células (NTC), número de células
apoptóticas (NCA) para embriões PIV E2
Tratamento
NTC
CV
NCA
CV
Holding 6H
120.1 ± 10.4A
44.45
15.0 ± 1.4A
50,84
Holding 10H
82.4 ± 6.0B
28.18
14.8 ± 1.4A
37,2
Resveratrol 6H
129.1 ± 6.0A
27.41
15.8 ± 1.1AB
43,92
Resveratrol 10H
114.8 ± 3.5A
11.92
19.0 ± 1.4B†
29,64
A,B
†
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (P < 0,05).
Tendem a diferir para Holding 6H (P = 0.08).
Na Tabela 8 consta a porcentagem de embriões degenerados obtidas no E2.
No TR10 não houveram embriões degenerados, o que de fato ocorreu no TR6 na
avaliação inicial, porém às 24h a porcentagem de deg não diferiu entre os tratamentos.
Às seis horas de avaliação a taxa no TR6 apresentou diferença (P < 0,05) comparada ao
TH10.
37
TABELA 8. Porcentagem de embriões degenerados E2
Embriões degenerados (%)
Tratamentos
6 horas
24 horas
Holding 6H
AB
2.8 (2/71)
22.5 (16/71)A
Resveratrol 6H
10.4 (9/86)A
20.9 (18/86)A
10 horas
24 horas
Holding 10H
Resveratrol 10H
A,B
B
1.4 (1/68)
14.7 (10/68)A
- (0/52)
21.1 (11/52)A
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença (P < 0,05).
A Figura 5 e Figura 6 apresenta imagens de embriões corados pelo teste de
TUNEL do TH6, TR6, TH10 e TR10. As células coradas em azul representam o NTC
do embrião, e as células coradas em verde, representam as células com DNA
fragmentado, ou seja, células em processo de apoptose. O TR6 na imagem apresenta
menor número de células em processo de apoptose em comparação com o grupo
controle. E na imagem referente ao TR10 o embrião apresenta maior número total de
células comparado ao tratamento somente em meio holding.
38
H +R 6h
H +R 6h
H 6h
H 6h
FIGURA 5 - Imagens teste de TUNEL E2, H+R 6h indicam embriões tratados com
resveratrol no meio holding pelo período de 6h (40x). H 6h indica embriões
em meio holding padrão envasados por 6h (20X). Células coradas em azul
indicam o NTC e células coradas em verde indicam NCA, imagem por
microscopia de fluorescência.
39
H + R 10
H 10h4
H + R 10h
A
4
H 10h
B
FIGURA 6 - Imagens teste de TUNEL E2, H+R 10h indicam embriões tratados com
resveratrol no meio holding pelo período de 10hs. H 10h indica embriões
em meio holding padrão envasados por 10h. Células coradas em azul
indicam o NTC e células coradas em verde indicam NCA, imagem por
microscopia de fluorescência (40X).
A Tabela 9 traz os valores de intensidade luminosa em pixels, que se refere
aos índices de EROS e GSH. O TR6 e TR10 não diferiram quanto as EROS, mas TH10
obteve o maior quantidade de EROS em relação aos outros tratamentos. Quanto à
análise de GSH o TR6 foi superior
super
(P < 0,05) aos demais, também houve diferença
entre TR10 que apresentou maiores taxas de GSH que o TH6 (P < 0,05).
40
TABELA 9. Médias (± SEM) do índice de espécies reativas ao oxigênio (EROS) e
glutationa (GSH) emitida pelos embriões E2
Tratamento
EROS (pixels)
GSH (pixels)
Holding 6H
13.3367 ± 4.4104A
30.7594 ± 11.6158A
Resveratrol 6H
14.4490 ± 1.6570A
95.2208 ± 12.4652C
Holding 10H
23.4126 ± 1.5661B
47.2044 ± 8.3257AB
Resveratrol 10H
11.7738 ± 0.8221A
49.5330 ± 6.5332B
A,B
Letras diferentes indicam diferença estatística (P < 0,05).
41
5 DISCUSSÃO
5.1 Discussão Experimento 1
Neste estudo foi realizada a técnica de produção in vitro de embriões, com o
foco principal nos processos de vitrificação e aquecimento, com o objetivo de testar a
hipótese de melhorar ou manter a qualidade dos embriões após a criopreservação
através da adição do antioxidante resveratrol ao meio de recultivo.
A taxa de reexpansão da blastocele em vários estudos6,8,9,16 demonstrou ser
um bom marcador morfológico para seleção de bons embriões. Nesse estudo a variável
taxa de reexpansão às seis e 24 horas no TC vs TR não mostrou diferença (P ˃ 0,05),
porém, autores34 avaliaram a velocidade de reexpansão da blastocele pós descongelação
de embriões humanos criopreservados e obtiveram taxas de reexpansão de 48 e 50% em
blastocistos humanos congelados nos dias 5 e 6, valores um pouco maiores dos
encontrados nesse estudo. Os autores relacionaram a rápida reexpansão da blastocele,
após duas a quatro horas do início do cultivo embrionário in vitro, com maiores taxas de
implantação e gestação, quando comparadas com reexpansão que não ocorre de forma
tão rápida, obtendo três gestações estabelecidas a partir de 42 transferências de 63
blastocistos sem reexpansão da blastocele.
Avaliando as taxas de eclosão dos embriões vitrificados, às 24 horas esse
estudo apresentou diferença (P < 0.05) entre o grupo controle e o grupo resveratrol. Os
embriões que tiveram o antioxidante adicionado ao meio de recultivo eclodiram sob
maiores taxas, o que pode configurar resultado do incremento promovido pelo
resveratrol que resultou em retorno ao desenvolvimento mais rápido em comparação aos
embriões não tratados. Pesquisadores6 que às 48h obtiveram (58,9%) de eclosão no
grupo tratado com resveratrol a 0,5µM no meio de cultivo, também tiveram resultado
superior ao grupo controle (30,9%) e encontraram taxa superior de sobrevivência e
eclosão após vitrificação e descongelamento.
Os resultados obtidos neste estudo apresentaram que o efeito benéfico do
resveratrol quando adicionado ao meio de recultivo ficou mais evidente após maior
tempo de exposição ao antioxidante, já que às seis horas a taxa de expansão e eclosão
não apresentou diferença entre tratamentos, mas sim às 24h de recultivo. Essa conclusão
é positiva, visto que a taxa de eclosão tem sido apontada6 como um importante fator
indicador de qualidade dos embriões.
42
Foi evidenciado nesse estudo, maiores porcentagens de blastocistos em processo
de eclosão e eclodidos no TR, quando avaliados às 24 horas, mas a estatística não
apresentou diferença, e possivelmente se houvesse maior número de embriões essa
diferença seria significativa. Maiores porcentagens de embriões com desenvolvimento
mais adiantado, evidencia o sincronismo de reexpansão da blastocele após a vitrificação
e cultivo pós-aquecimento, que está associada com a capacidade do embrião para
restaurar lesões de vitrificação o que é um confiável marcador da capacidade de
desenvolvimento de embriões vitrificados16.
Em contraste com embriões frescos, os embriões PIV criopreservados
sofrem maiores danos celulares, com isso apresentam número de células geralmente
menores21. Este fato pôde ser comprovado no E1 onde foi verificado maior NTC nos
embriões não vitrificados, assim como menores taxas de células apoptóticas comparado
com TC e TR, isso afirma a qualidade dos embriões usados no experimento, que quando
frescos apresentaram viabilidade superior aos PIV criopreservados21,22. No grupo TR as
variáveis NTC e NCA não apresentaram diferença quando comparado ao TC, com isso
pode-se observar que tanto o grupo controle como o grupo resveratrol foram de
qualidade inferior somente comparado aos embriões frescos.
A apoptose é um processo normal na pré implantação de embriões para
eliminar células anormais, porém a alta incidência de apoptose é correlacionado com
morfologia anormal e consequentemente degeneração do embrião6. Os dados obtidos de
porcentagem de embriões degenerados foram semelhantes para o tratamento controle e
o adicionado de resveratrol.
Em trabalho anterior21 realizado com embriões PIV de bovinos,
apresentaram que uma redução no NTC poderia explicar porque a sobrevivência in vitro
pós-criopreservação afeta a viabilidade do embrião após a transferência para as
receptoras, sendo que o resveratrol já teve resultados6 de melhora na criotolerância de
embriões depois de sua adição.
O cultivo in vitro de embriões de mamíferos, especialmente após a
vitrificação, produz mais radicais livres que oprimem a capacidade antioxidante dos
embriões9. Os valores de emissão de EROS encontradas neste trabalho no TR foram
semelhantes ao grupo controle, e a quantidade de GSH emitida pelos embriões não
apresentou neste caso uma superioridade que pudesse ser significativa. Apesar desses
encontrados resultados a literatura8,9,11 apresenta que o resveratrol exerce capacidade de
43
reduzir as EROS. Diferentemente do encontrado já foi relatado que o conteúdo de GSH
diminui acentuadamente após criopreservação em bovinos8 e embriões suínos FIV14,
confirmando que o estresse oxidativo ocorre também durante o processo de congelação
e descongelação. Um dos efeitos do resveratrol é para manter a qualidade celular e
protegê-las contra as lesões oxidativas, em estudos que realizaram a suplementação de
resveratrol durante a MIV verificaram que houve melhora na competência de
desenvolvimento de oócitos, aumento nos níveis de GSH e diminuição dos teores EROS
em oócitos suínos e bovinos4,13,18
Considerando que o processo de criopreservação promove acúmulo de
EROS e tornam embriões criopreservados ainda mais receptivos a seus efeitos
deletérios, embora os resultados não expressaram diferença, um agente antioxidante
parece desempenhar um papel importante na capacidade de embriões PIV para restaurar
suas funções metabólicas após aquecimento16.
Após a criopreservação, os embriões tornam-se mais sensíveis, resultando em
maiores taxas de peroxidação lipídica, lesão de membrana e destruição estrutural. Por
isso, medidas que possam reduzir as EROS durante o período crítico do cultivo pósaquecimento pode garantir maiores taxas de sobrevivência de embriões PIV vitrificados
e aquecidos. Estudos sugerem que embriões criopreservados e aquecidos devem ser
recultivados por 3 a 16 horas, de modo a facilitar a recuperação deles antes da
transferência35,36.
Assim como o resveratrol, vários antioxidantes têm sido estudados na PIV
de embriões, como o β-ME com resultados positivos no meio de cultivo, vitrificação e
aquecimento de bovinos8, a melatonina, com bons resultados quando adicionada ao
meio de recultivo após aquecimento em embriões de ovinos16 e também produziu
efeitos positivos em embriões de ratos9. Esses mesmos metabólitos promoveram os
níveis de EROS reduzidos em outros estudos37, confirmando a ideia que antioxidantes
são uma alternativa positiva para incrementar os índices de PIV de embriões,
principalmente criopreservados.
Neste estudo foi possível evidenciar que a inclusão de antioxidantes durante
desenvolvimento do embrião in vitro não é suficiente para manter a qualidade durante o
período crítico do aquecimento e recultivo, devendo haver uma fonte excedente de
antioxidantes exógenos durante o recultivo de embriões.
44
5.2 Discussão Experimento 2
Neste estudo foi observado se o resveratrol melhora a qualidade de embriões
PIV na manutenção pré inovulação dessas estruturas. Os resultados da taxa de expansão
foram superiores (P < 0,05) no grupo TR10 comparado com o TR6 na primeira
avaliação, o que foi confirmado na segunda avaliação, às 24 horas, quando o TR10 foi
superior (P < 0,05) aos demais, demonstrando nesse caso que o maior tempo de
exposição ao antioxidante resultou em desenvolvimento mais rápido do embrião, o que
segundo a literatura é um indício de maiores taxas de gestação34.
A taxa de eclosão no TR6 e TH6 não foi evidenciada, pois nesse período
ainda não haviam embriões em processo de eclosão, porém no grupo das 10h houve
eclosão mas sem diferença entre o TR10 e o TH10. Às 24h os grupos TR6 e TH6 foram
semelhantes, assim como o TR10 e TH10, comparando os dois tratamentos que usaram
antioxidante, também não foram observadas diferença. Corroborando com nossos
resultados, pesquisadores29 também obtiveram maiores taxas de expansão no grupo
tratado com resveratrol no meio de maturação, comparado com o grupo controle. Em
outro estudo anteriormente realizado, em que foi adicionado resv no meio de cultivo
também observaram maior taxa de expansão no grupo tratado com 0,5µM de
resveratrol6, esses resultados são indícios que o resveratrol é capaz de preparar o
embrião, proporcionando melhores respostas nas variáveis estudadas.
Avaliando o estágio de desenvolvimento dos embriões, o TR6 e TH6 na
primeira avaliação, apresentaram igualmente maior parte de seus embriões em estágio
Bl, já no TR10 e TH10 a maior parte dos embriões estavam na fase Bx (P < 0,05), mas
sem diferença entre si. Na avaliação às 24 horas, o TR6 e o TH6, ainda apresentavam
maior parte dos embriões, mas em taxas menores, em fase de Bl, e no TR10 e TH10 a
maior parte dos embriões já se encontrava expandidos, nestes casos não foi observado
efeito dos grupos na presença do antioxidante em relação aos grupos controle, mas
analisando o tempo de cultivo no resveratrol, observou-se o TR10 foi superior ao TR6.
Com esses resultados contatou-se que os embriões tratados com resveratrol
por período mais longo desenvolveram-se mais rapidamente, possivelmente pelo
incremento do resveratrol na qualidade do embrião. De acordo com estudos em que o
antioxidante tem sido apresentado como alternativa a ser usado para melhorar os índices
na PIV de embriões4 sua adição aos diferentes meios de trabalho têm elevado a taxa de
45
sobrevivência e eclosão6,13,29. Estudo anterior encontrou que apesar de um aumento no
número de embriões transferíveis obtido com 0,25 e 0,5µM de resveratrol no meio de
cultivo em relação ao grupo controle (66,5 e 70,1 vs 61,6%), nenhuma melhoria foi
observada em rendimentos de blastocistos bovinos, bem como no percentual de
desenvolvimento rápido de blastocistos6.
A capacidade de blastocistos bovinos para se recuperar após procedimentos
de criopreservação e descongelamento é frequentemente avaliada usando a reexpansão
durante o recultivo in vitro38. Porém, embriões PIV que serão transferidos a fresco
também passam por um período de cultivo utilizando meios de manutenção, no caso
deste estudo o holding, durante transporte do laboratório até a unidade de transferência.
O número de células apoptóticas foi semelhante entre os tratamentos com
holding e o TR6, mas o TR10 foi não diferiu do TR6 e apresentou tendência à diferença
para TH6 em P = 0,08. Nesse contexto, os tratamentos com adição de resveratrol foram
semelhantes, no entanto apresentaram maior número total de células, indicador de
qualidade do embrião que o TH10 (129,1 e 114,8 vs 82,4). Esses resultados é um forte
indicador que o resveratrol teve ação positiva na qualidade dos embriões frescos,
levando a ideia que o antioxidante pode ser utilizado com o objetivo de manutenção da
qualidade do embrião na pré inovulação. Corroborando com esse resultado, dois estudos
publicados anteriormente foram encontrados, onde um11 obteve 81,9 ± 3,4 de NTC para
o tratamento resv e 66,0 ± 3,0 para o grupo controle, e outro13 encontrou a média de
NTC também superior ao grupo na ausência de resveratrol, ambos utilizando o
antioxidante na fase de maturação.
A porcentagem de embriões degenerados encontrada neste estudo foi
semelhante no TR6 e TH6 e apresentou diferença nos tratamentos utilizando resveratrol,
TR6 (10,4%) e TR10 (0%) às seis horas de avaliação, porém às 24h as porcentagens
foram semelhantes em todos os tratamentos. Durante a produção dos embriões para este
experimento, a estação das secas já se iniciava, e é sabido que este período de transição
é crítico para produção de oócitos de qualidade. Em estudo realizado39 durante as
estações verão e inverno, observaram maior recuperação de ovócitos GIII durante o
inverno, fato ocorrido neste experimento e que pode ter contribuído para que os
embriões resv e controle obtivessem as mesmas taxas de degenerados.
O estresse oxidativo surge sempre que o equilíbrio entre antioxidantes e próoxidantes é perturbado. A geração de pró-oxidantes, como espécies reativas de oxigênio
46
é um fenômeno invariável na produção in vivo, e é possível que o estresse oxidativo
também exerça influência no desenvolvimento do oócito in vitro, e consequentemente
nas taxas de prenhez12. Foi observado que o grupo tratado com resveratrol por seis
horas, não apresentou diferença ao TH6 quanto os níveis de EROS, porém a quantidade
de GSH foi muito superior aos demais grupos. No tratamento utilizando o resveratrol
por dez horas, a taxa de EROS foi inferior ao TH10 e semelhante ao TR6. A presença
de GSH no TR10 foi menor que o TR6, que pode ser um indício que a síntese de GSH
foi induzida pelo resveratrol nas primeiras horas e logo começou a agir, provavelmente
devido a atividade antioxidante da GSH intracelular, por isso os valores de EROS foram
menores no TR10 vs TH10.
Em estudo com resveratrol em oócito de suínos4, apresentaram um
significativo aumento nos valores de GSH intracelular, assim como a presença de EROS
diminuíram significativamente. Também encontraram maiores taxas de formação de
blastocisto e número total de células (62,1% e 49,1 vs 48,8% e 41,4, respectivamente)
em comparação com o grupo controle, sem resveratrol.
A adição de resveratrol em outro estudo19 aumentou o nível de SIRT1 em
oócitos bovinos e melhorou o resultado da fertilização de grupos de animais velhos e
jovens testados, mas não afetou o nível de EROS. No meio de maturação in vitro
melhorou a taxa de fertilização de oócitos suíno também obteve redução nos níveis
intracelulares de EROS e aumento no nível GSH, que contribuíram para melhoria
subsequente do desenvolvimento embrionário4, confirmando os efeitos benéficos do
resveratrol na formação de blastocistos de qualidade.
47
6 CONCLUSÃO
Em conclusão, estes resultados demonstraram que a suplementação do meio
de recultivo para embriões bovinos vitrificados com resveratrol melhorou a taxa de
eclosão dos embriões, porém sem afetar as taxas de blastocisto, número de células e
porcentagem de embriões degenerados em embriões vitrificados. Para embriões PIV
que não passaram pela criopreservação, a adição de resveratrol no meio de manutenção
por dez horas melhorou a reexpansão dos embriões, assim como a taxa de blastocisto
expandido, concluindo-se ainda que a presença de glutationa aumentou em embriões
tratados com resveratrol, sendo necessários mais estudos do efeito do Resveratrol para
embriões PIV frescos e vitrificados pós aquecimento.
48
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