universidade ceuma/uniceuma programa de pós

UNIVERSIDADE CEUMA/UNICEUMA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ANA CLÁUDIA PINHO DE CARVALHO
IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DO VÍRUS DA DENGUE PELA REAÇÃO EM
CADEIA DA POLIMERASE EM MULTIPLEX EM AMOSTRAS DE SORO DE
PACIENTES DO ESTADO MARANHÃO.
SÃO LUÍS
2015
ANA CLÁUDIA PINHO DE CARVALHO
IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DO VÍRUS DA DENGUE PELA REAÇÃO EM
CADEIA DA POLIMERASE EM MULTIPLEX EM AMOSTRAS DE SORO DE
PACIENTES DO ESTADO MARANHÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em
Biologia
Parasitária
da
Universidade
CEUMA/UNICEUMA, para obtenção do Grau de
Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Rosa Quaresma
Bomfim
SÃO LUÍS
2015
C331i
Carvalho, Ana Cláudia Pinho de.
Identificação dos sorotipos do Vírus da Dengue por MULTIPLEX-RT-PCR em
amostras de soro de pacientes do Estado Maranhão / Ana Cláudia Pinho de Carvalho.
São Luís :UNICEUMA, 2015.
69 p.:il..
Dissertação (Mestrado) –Programa de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária). Universidade CEUMA, 2015.
1. Multiplex-PCR. 2. Diagnóstico molecular. 3. Dengue. 4. Maranhão .I. Bonfim,
Maria Rosa Quaresma.(Orientador)
II. Grisotto,Marcos Augusto Grigolin
(Coordenados). III.Título.
CDU :616.98(812.1)
ANA CLÁUDIA PINHO DE CARVALHO
IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DO VÍRUS DA DENGUE PELA REAÇÃO EM
CADEIA DA POLIMERASE EM MULTIPLEX EM AMOSTRAS DE SORO DE
PACIENTES DO ESTADO MARANHÃO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA/UNICEUMA, para
obtenção do Grau de Mestre.
Aprovado em:_____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Profa. Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim (Orientadora)
Universidade CEUMA (UNICEUMA)
______________________________________________
Profa. Dra. Rosimary de Jesus Gomes Turri
Universidade Federal do Maranhão (UFMA)
_____________________________________________
Profa. Dra. Andrea Souza Monteiro
Universidade CEUMA (UNICEUMA)
Dedico, à minha filha Ana Victoria e minha sobrinha- filha Rafaela, para
que sintam o desejo de fazerem uma vida acadêmica.
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu criador.
Aos meus pais (in memorian) Edgar e Raimundinha, pelas primeiras letras, base de toda uma
vida.
À Prof. Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim, mais que orientadora, um modelo de pessoa a
quem eu copio no trato com os alunos.
À Mariana Maryelle Ferreira de Sousa, mestranda, que sempre me recebeu e ajudou com todo
carinho e paciência.
À aluna Bruna de Oliveira de Melo, que foi decisiva na complementação de meus dados.
À FAPEMA-Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Maranhão.
Ao Hospital UDI, pelo apoio a esta minha jornada.
Ao Dr. Mauro Martins Teixeira, Departamento de Imunologia da Universidade Federal de
Minas Gerais, pelas amostras de referência gentilmente cedidas.
“Digo: o real não está nem na saída nem na
chegada: ele se dispõe para a gente é no meio
da travessia.”
Guimarães Rosa – Grande Sertão: Veredas
RESUMO
A dengue é uma doença febril aguda causada pelo vírus dengue (DENV), um arbovírus que
inclui quatro sorotipos imunológicos: DENV-1 ao DENV-4, que é transmitido pelo mosquito
A. aegypti e responsável por mais de 400 milhões de casos de Febre do Dengue (FD) e de Febre
Hemorrágica do Dengue (FHD. O diagnóstico da dengue baseia-se em aspectos
epidemiológicos, clínicos e laboratoriais pela detecção de anticorpos do tipo IgM no início da
sintomatologia. O ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura de IgM ou MacELISA, tem
sido considerado o padrão ouro pelo Ministério da Saúde no diagnóstico de infecção pelo
DENV. No entanto, este método detecta os anticorpos anti-dengue a partir do sexto dia após o
aparecimento da febre em casos de infecção primária e, em alguns casos, é de difícil detecção
em infecções secundárias. Por isso, o MacELISA costuma ser utilizado somente a partir do
sexto dia do período febril para a confirmação do diagnóstico clínico. Neste contexto, é de
grande importância a utilização de um método que seja capaz de, não somente detectar a
presença do DENV, mas também identificar o sorotipo infectante. Neste contexto, a fim de se
obter uma visão epidemiológica molecular dos sorotipos do dengue circulantes na população
do Estado do Maranhão, utilizou-se a técnica de amplificação do material genético viral pela
Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase em multiplex
(mPCR). Para tal, foram utilizados iniciadores universalmente aceitos para o diagnóstico de
dengue, a fim de detectar e identificar os sorotipos circulantes no soro de pacientes com
suspeitas clínicas de dengue que foram atendidos em Unidades Básica de Serviços de Saúde de
diferentes municípios maranhenses. Ao todo foram utilizadas 200 amostras de soro escolhidas
aleatoriamente na soroteca do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Maranhão
(LACEN-MA) / Instituto Osvaldo Cruz (IOC-MA). Para a análise das variáveis gênero, etnia,
faixa etária, sinais e sintomas clínicos, resultado da sorologia pelo ELISA IgM e município de
origem das amostras, os dados de cada soro foram coletados no banco de dados do LACENMA. A análise dos dados revelou que 150 (75%) eram mulheres, 153 (76, 5%) dos pesquisados
pertenciam a etnia parda, a faixa etária mais afetada, com 93 (46,5%) foi de pacientes entre 21
e 45 anos de idade. Os sinais e sintomas clínicos da dengue mais encontrados nos prontuários
avaliados foram a febre, em 184 (92%), a cefaleia em 135 (67,5%), a mialgia em 124 (62%) e
a prostração em 112 (56%). Os resultados dos testes sorológicos mostraram que 114 (57%) dos
soros foram IgM positivos. Deste total, 86 (75,4%) eram de pacientes que procuraram os
serviços de saúde, na fase aguda da dengue, entre o primeiro e quinto dia do surgimento do
período febril, os 28 (24,6%) soros restantes, eram oriundos de pacientes que procuraram os
serviços de saúde, no início da fase convalescente, a partir do sexto dia do surgimento da febre.
Com relação aos 12 municípios de origem dos soros, o maior número 77 (38,5%) de soros
analisados era do município de Caxias. A técnica de RT-mPCR, proposta para o estudo, foi
padronizada com sucesso com o material genético das quatro linhagens de referência (sorotipos
1 a 4), usadas como controle positivo. Todas as amostras clínicas tiveram seu RNA extraído e
submetido aos ensaios de RT-mPCR para a detecção e identificação dos sorotipos do dengue.
Com relação aos sorotipos circulantes, constatou-se que o sorotipo 4 foi o mais encontrado,
com 59 (68,6%) das detecções, sendo encontrado como único sorotipo infectante em 54 dessas
detecções, e em 5 casos foi detectado coinfecção do sorotipo 1 com 4. O segundo sorotipo mais
identificado foi o sorotipo 1, em 19 (22%) dos soros. O sorotipo 2 foi encontrado em dois soros
e o sorotipo 3 em apenas um soro. Os resultados dos testes sorológicos e moleculares foram
correlacionados entre si, e observou-se que a sensibilidade do ELISA em detectar os anticorpos
IgM da fase aguda da dengue foi de 75,4% (n=86), enquanto o RT-mPCR, padronizada no
presente estudo, mostrou uma sensibilidade de 100% ao detectar a presença da partícula viral e
diferenciar os sorotipos infectantes em todos os soros de pacientes que procuraram os serviços
de saúde, na fase aguda da dengue, entre o primeiro e o 5º dia do período febril. Observou-se
100% de reprodutibilidade da RT-mPCR, uma vez que as amostras de referências utilizadas
como controle positivo, apresentaram-se sempre positivas nas sucessivas reações de
amplificação. Além disso, o material genético dos 50 soros, IgM e IgG negativos, usados como
controle negativo nos ensaios de RT-mPCR, em nenhum momento foram amplificados,
indicando assim, o sucesso da padronização da técnica. A somatória dos resultados apontaram
a necessidade de campanhas educacionais no sentido de orientar a população para que a mesma
procure os serviços básicos de saúde, logo após o aparecimento dos primeiros sinais e sintomas
sugestivos de dengue. Este simples gesto poderá facilitar o serviço de vigilância epidemiológica
no sentido de se conhecer o número real de pessoas que são infectadas anualmente no Brasil,
bem como permitir que métodos moleculares de diagnóstico sejam implementados, haja vista
que o sucesso dos mesmos é dependente de vários fatores, entre os quais a qualidade da amostra
clínica que pode ser considerada como fator determinante para a presença da partícula viral no
soro do paciente.
Palavras-chave: Multiplex-PCR. Diagnóstico molecular. Dengue. Maranhão.
ABSTRACT
Dengue is an acute febrile disease transmitted by the mosquito Aedes aegypti, vector for the
dengue virus (DENV), an arbovirus that includes four immunological serotypes: DENV-1 to
DENV-4, which is responsible for more than 400 million cases of Dengue Fever (DF) and
Dengue Hemorrhagic Fever (DHF). The diagnosis of dengue is based on epidemiological,
clinical and laboratory assessment by the detection of IgM antibodies at the onset of symptoms.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) of capture of IgM or MacELISA, has been
considered the gold standard for the diagnosis of DENV infection by the Ministry of Health.
However, this method detects anti-dengue antibodies from the sixth day after the onset of fever
in cases of primary infection and, in some cases; it is difficult to detect them in secondary
infections. Thus, the MacELISA is usually used only after the sixth day of the onset of the
febrile period to confirm the clinical diagnosis. In this context, it is of great importance to use
a method that is able not only to detect the presence of DENV, but also to identify the infecting
serotype. Based on this guideline, in order to obtain a molecular epidemiological view of
dengue serotypes circulating in population of the State of Maranhao, we used the amplification
technique of the viral genetic material by the reverse transcription reaction followed by
multiplex Chain Reaction Polymerase (mPCR). For this purpose, primers universally accepted
for the diagnosis of dengue were used in order to detect and identify circulating serotypes in
the serum of patients with clinical suspicion of dengue treated at the Primary Care Units of
different municipalities of Maranhão. Altogether 200 serum samples were randomly chosen
from the serum database of the Central Public Health Laboratory of the State of Maranhão
(LACEN-MA) / Instituto Oswaldo Cruz (IOC-MA). For the analysis of the variables: gender,
ethnicity, age, clinical signs and symptoms, serology results by IgM ELISA and municipality
of origin of the samples were collected from the LACEN-MA database. Data analysis revealed
that 150 (75%) were women, 153 (76, 5%) were from brown ethnicity and the most affected
group was between 21 and 45 years of age with 93 (46.5%) patients. The clinical signs and
symptoms of dengue more frequently recorded in the patients charts were fever in 184 (92%),
headache in 135 (67.5%), myalgia in 124 (62%) and prostration in 112 (56% ). The results of
serological tests showed that 114 (57%) of the serum were IgM positive. Of this total, 86
(75.4%) were patients who sought health care in the acute phase of dengue infection, between
the first and fifth day of the onset of the febrile period, 28 (24.6%)of the remaining serum came
from patients who sought health care in the early convalescent stage, after the sixth day of the
onset of fever. Regarding the 13 municipalities of origin of the sera, the largest number (77 38.5%) was from the city of Caxias. The RT-mPCR technique, proposed for this study, was
standardized successfully with the genetic material of the four reference strains (serotypes 14), and used as a positive control. Then, all clinical specimens had their RNA extracted and
undergone to RT-mPCR assays for the detection and identification of dengue serotypes.
Regarding the circulating serotypes, it was found that serotype 4 was the most frequent in 59
(68.6%) of detections, of which was found as single serotype infecting 54 of the samples, and
in 5 cases it was detected co-infections with serotype 1 and 4. Serotype 1 was the second most
identified serotype in 19 (22%) samples of serum. The serotype 2 was found in two sera and
serotype 3 in only one. The results of the serological, and molecular tests were correlated, and
it was observed that the sensitivity of the ELISA for detecting IgM antibodies of dengue in the
acute phase was 75.4% (n = 86), while the RT-mPCR, standardized in this study, showed a
100% sensitivity in detecting the presence of the viral particle and to differentiate the infecting
serotype in all sera of patients seeking the health services in the acute phase of dengue, between
the first and the 5th day of the febrile period. There was 100% RT-mPCR reproducibility, since
the samples used as positive control references, maintained always positive in several
amplification reactions. Additionally, the genetic material of 50 sera, IgM and IgG negative,
used as negative control in the RT-mPCR assays were not amplified anytime, thereby indicating
the success of technical standardization used in this study. The sum of the results showed the
need for educational campaigns to guide the population for seeking the primary health services
immediately after the onset of signs and symptoms of dengue. This simple gesture can facilitate
the work of epidemiologic surveillance in order to identify the real number of people who are
infected annually in Brazil. As well as to allow that molecular diagnostic methods can be
implemented, given the success of these methods is dependent on several factors, including the
quality of the clinical sample which may be considered as a determining factor for the presence
of viral particles in the patient's serum.
Keywords: Multiplex-PCR.Molecular diagnosis. Dengue. Maranhão.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADE - Anticorpos Dependentes
CF- Fixação do Complemento
DENV - Vírus do Dengue
DENV1 - Vírus do Dengue sorotipo 1
DENV2 - Vírus do Dengue sorotipo 2
DENV3 - Vírus do Dengue sorotipo 3
DENV4 - Vírus do Dengue sorotipo 4
FHD- Febre Hemorrágica da Dengue
FD - Febre da Dengue
RT-mPCR – Reação de Transcrição Reversa-Reação em Cadeia pela Polimerase em
Multiplex.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 – Distribuição dos casos de dengue segundo o município de notificação, no período
de 2012 a 2013..........................................................................................................................48
Figura 1 – Distribuição por gênero dos pacientes avaliados no Estado do Maranhão no período
de 2012 a 2013..........................................................................................................................51
Figura 2 – Distribuição por etnia dos pacientes avaliados no Estado do Maranhão no período
de 2012 a 2013..........................................................................................................................51
Figura 3 – Perfis eletroforéticos dos produtos da multiplex-PCR obtidos com o cDNA dos
controles positivos e iniciadores específicos para os quatro sorotipos do vírus da dengue…..55
Figura 4 – Perfis eletroforéticos dos produtos da mPCR obtido com o cDNA de amostras de
referência (DENV-1 e DENV-4) e de diferentes amostras de soros de pacientes de municípios
maranhenses..............................................................................................................................55
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 16
1.1. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................... 18
1.1.1.Dengue no Brasil ............................................................................................................... 18
1.1.2. Dengue no Estado do Maranhão ...................................................................................... 19
1.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO VÍRUS DA DENGUE ...................................................... 21
1.2.1 Ciclo de replicação do DENV em células humanas............................................................ 24
1.2.2 Ciclo de manutenção do DENV nos mosquitos ................................................................... 25
1.3 CARACTERÍSTICAS DA DENGUE ......................................................................................... 26
1.3.1 Manifestações clínicas da dengue ....................................................................................... 26
1.3.2 Patogênese e resposta imunológica na dengue ................................................................... 28
1.4 MÉTODOS LABORATORIAIS DE DIAGNÓSTICO DA DENGUE ....................................... 29
1.4.1 O isolamento do vírus da dengue ........................................................................................ 29
1.4.2 Inibição da hemaglutinação (IH) ........................................................................................ 30
1.4.3 Fixação do complemento (CF) ............................................................................................ 31
1.4.4 Fixação do complemento (CF) ............................................................................................ 31
1.4.5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).................................................................... 31
1.4.6 MacELISA ........................................................................................................................... 32
1.4.7 ELISA NS1 ........................................................................................................................... 32
1.5 MÉTODOS MOLECULARES PARA A DETECÇÃO DO VÍRUS DA DENGUE .................. 33
1.5.1 Hibridização dos ácidos nucléicos ...................................................................................... 33
1.5.2 Reação de transcição Reversa (RT) .................................................................................... 34
1.5.3 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ........................................................................ 34
1.5.4 Reação em Cadeia pela Polimerase em tempo real ............................................................ 35
2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................................... 38
3 OBJETIVOS .................................................................................................................................. 39
3.1 GERAL ............................................................................................................................ 39
3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 39
4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 40
4.1 ASPECTOS ÉTICOS ...................................................................................................... 40
4.2 AMOSTRAS CLÍNICAS E CONTROLE DOS EXPERIMENTOS .............................. 40
4.3 EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL ...................................................................................... 40
4.4 REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA (SÍNTESE DE cDNA) ............................. .41
4.5 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DO VÍRUS DENGUE
POR MULTIPLEX-PCR ....................................................................................................... .41
4.5.1. Análise eletroforética dos produtos amplificados.........................................................42
4.5.2 Ensaios de amplificação por multiplex-PCR com o cDNA dos soros dos pacientes com
suspeitas clínicas de dengue..............................................................................................
43
4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS......................................................................................
.44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................................45
5. 1. PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DA DENGUE NO ESTADO DO MARANHÃO................. .....45
5.2 AMPLIFICAÇÃO POR MULTIPLEX-PCR DO MATERIAL GENÉTICO EXTRAÍDO DOS
SOROS DOS PACIENTES COM DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE SUSPEITA DE DENGUE.... ..52
5.2.1. Padronização da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em multiplexPCR (mPCR)...............................................................................................................................52
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 57
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 59
ANEXOS ........................................................................................................................................ 68
16
1 INTRODUÇÃO
A dengue é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada pelo vírus dengue (DENV),
um arbovírus da família Flaviviridae, gênero Flavivírus, que inclui quatro sorotipos
imunológicos: DENV-1 ao DENV-4. O DENV e o seu principal vetor, o Aedes aegypti estão
geograficamente distribuídos em mais de 125 países, incluindo a África, as Américas, a Região
Leste do Mediterrâneo, o Sudeste Asiático e o Pacífico Ocidental, onde cerca de 2.5 bilhões de
pessoas estão sob o risco iminente de serem infectadas (KYLE; HARRIS, 2008). Anualmente,
o A. aegypti é responsável por quase 400 milhões de novos casos de Febre do Dengue (FD) e
da Febre Hemorrágica do Dengue (FHD) constituindo-se num sério problema de saúde pública
mundial, principalmente em países localizados em regiões tropicais e subtropicais (LEONG et
al., 2007; KYLE; HARRIS, 2008; MURRAY; QUAM; WILDER-SMITH, 2013; LIANG;
GAO; GOULD; 2015). Segundo a Organização Mundial de Saúde cerca de 550 mil doentes
necessitam de hospitalização e mais de 22 mil morrem diariamente em consequência da dengue
(WHO, 2015; LIANG; GAO; GOULD; 2015).
A infecção pelo DENV é um dos principais problemas de saúde pública no Brasil, com
a ocorrência de surtos epidêmicos em todos os estados e taxas de infecção que variam de região
para região. Atualmente, os quatro sorotipos do DENV estão circulando em todas as regiões
brasileiras, aumentando com isso o risco de surtos da dengue hemorrágica (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2015). Este fato tem causado inquietação à população, bem como uma grande
preocupação nos profissionais da área de saúde.
A região Nordeste é uma das mais afetada pelo DENV e todos os seus nove estados
apresentam risco muito alto de dengue. O estado do Maranhão é constituído de 217 municípios
e destes, 31 (14%) foram considerados, pelo Programa Nacional de Controle da Dengue do
Ministério da Saúde, como áreas de risco iminente de dengue. Dentre estes municípios está a
capital São Luís que já registrou a circulação dos quatro sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV3 e DENV-4 (SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE DO MARANHÃO, 2015,
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Apesar dos altos índices de infecção pelo DENV em mais de 125 países no mundo, até
agora não existe uma vacina ou uma terapia específica contra o DENV e o diagnóstico da
doença é feito inicialmente com base nas histórias clínica e epidemiológica acompanhadas do
17
exame físico do paciente. Atualmente, alguns métodos para a confirmação do diagnóstico
clínico de dengue têm sido usados, dentre eles o isolamento viral em culturas celulares; a
inibição da hemaglutinação; a fixação do complemento; teste de Neutralização o Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (KYLE; HARRIS, 2008). Destes, o ELISA de captura de IgM
ou MacELISA, tem sido considerado o padrão ouro pelo Ministério da Saúde no diagnóstico
de infecção pelo DENV. No entanto, este método detecta apenas os anticorpos produzidos
contra o vírus entre o quinto e décimo dia após do aparecimento da febre, em casos de infecção
primária e, em alguns casos, é de difícil detecção em infecções secundárias. Por isso, o
MacELISA costuma ser utilizado somente a partir do sexto dia da doença para a confirmação
do diagnóstico clínico (KYLE; HARRIS, 2008; SRINIVAS; SRINIVAS, 2015).
Neste contexto, é de grande importância a utilização de um método que seja capaz não
somente de detectar a presença do DENV, mas também de identificar o sorotipo infectante.
Assim, objetivando-se obter uma visão epidemiológica dos sorotipos circulantes no estado do
Maranhão, no presente estudo foi utilizada a técnica de multiplex-PCR, com iniciadores
universalmente aceitos como diagnóstico de dengue para detectar e identificar os sorotipos do
DENV em 200 amostras de soros de pacientes atendidos em serviços de saúde em diferentes
municípios maranhenses. As amostras foram escolhidas aleatoriamente na soroteca do
Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Maranhão (LACEN-MA) / Instituto
Osvaldo Cruz (IOC-MA) e todas já tinham sido previamente testadas para a detecção de
anticorpos contra o vírus da dengue pelo método imunoenzimático ELISA de captura de
anticorpos do tipo IgM da Panbio (PanBio Diagnóstico Inc, Austrália)
18
1.1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1.1 Dengue no Brasil
O Aedes aegypti foi introduzido no Brasil, no século XVI, com o tráfico de escravos.
Os primeiros relatos de epidemias de febre do dengue surgiram em 1916, em São Paulo, e em
1923, em Niterói, sem diagnóstico laboratorial. A primeira epidemia documentada clínica e
laboratorialmente ocorreu em 1981-1982 em Boa Vista-Roraima, causada pelos sorotipos 1 e 4
(GUBLER, 1998; OSANAI et al., 1983). A partir de 1986 foram registradas epidemias em
diversos estados. A mais importante ocorreu no Rio Janeiro onde, pelo inquérito sorológico
realizado, foi estimado que pelo menos 1 milhão de pessoas tivesse sido infectada pelo sorotipo
DENV-1, nos anos de 1986/1987 (SCHATZMAYR et al., 1986; FIGUEIREDO, 1996).
Nos últimos 20 anos, o DENV e o seu principal vetor, o mosquito A. aegypti se
disseminaram em todo o Brasil e surtos epidêmicos foram registrados em todas as regiões do
país, com taxas de infecção variando de região para região (FIGUEIREDO et al.,1997). A
incidência de dengue cresceu significativamente atingindo índices elevados em 1998, quando
foram oficialmente registrados cerca de 530 mil casos. Em 1999, houve uma redução em relação
ao ano anterior, com 210 mil casos. Em 2000, foram notificados 240 mil casos e em 2002, foi
registrado um aumento significativo na incidência de dengue, alcançando 794.219 casos
notificados, destes, 250.000 ocorreram no Rio de Janeiro (FIGUEIREDO et al., 1997;
FUNASA, 2002; SIQUEIRA et al., 2005). Neste período, o número de mortes causadas pela
FHD excedeu o número de mortes por malária, pela primeira vez no Brasil (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2015).
Em 2008 foram notificados 803.520 de casos de dengue o que representou um aumento
de 45,8% se comparado ao mesmo período de 2007. Neste mesmo ano, foram notificados
oficialmente pelas Secretarias Estaduais de Saúde 3.848 casos de FHD com 213 óbitos
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). Em 2009 foram registrados 529.237 casos suspeitos de
dengue, sendo 2.271 casos de FHD com 154 mortes. Em 2010 houve um aumento significativo
com relação ao ano anterior, com 985.260 notificações e até o final de novembro de 2011, foram
notificados 742.364 casos suspeitos de dengue em todo o país (MINISTÉRIO SAÚDE, 2015).
Com relação ao número de casos de dengue em 2012, a Secretaria de Vigilância em
Saúde do Ministério da Saúde, divulgou o total de 303.900 casos confirmados de dengue. Na
19
análise comparativa em relação ao ano de 2011, foi observada uma redução de 44% dos casos
no País (MINISTÉRIO SAÚDE, 2015). Entretanto, ressalta-se que no Levantamento de Índice
Rápido de Infestação por A. aegypti (LIRA) foi constatado que, em janeiro de 2013, 267
municípios brasileiros estavam em situação de risco para dengue e 487 em situação de alerta
(MINISTÉRIO SAÚDE, 2015).
De modo geral, pode-se perceber um caráter de sazonalidade da dengue no Brasil,
despertando uma necessidade constante de vigilância epidemiológica. Anualmente cerca de
1,02 bilhões de reais são gastos em campanhas educativas, controle populacional do mosquito
vetor, medicamentos, testes diagnósticos baseados na detecção da proteína NS1, treinamento,
capacitação do pessoal da área de saúde, entre outros (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Apesar de todos estes esforços ,essa luta ainda apresenta muitos pontos críticos, como por
exemplo: a crescente resistência do mosquito aos inseticidas de uso habitual; falta de pesquisa
de novos inseticidas eficazes e ecologicamente seguros; a facilidade de proliferação e
disseminação desse vetor oferecida pela condição atual de vida urbana; a falta de
aprimoramento da vigilância epidemiológica e na elaboração e execução de planos estratégicos
de organização da assistência aos casos suspeitos de dengue, bem como a falta e ou adesão
parcial da população às campanhas de combate ao vetor (TAUIL, 2002). As deficiências
existentes no sistema de combate à dengue e as condições socioambientais favoráveis, que
possibilitam a disseminação do mosquito transmissor A. aegypti, têm proporcionado a
recorrência de surtos epidemiológicos (principalmente durante os períodos chuvosos) e o
consequente aumento no número de casos (TAUIL, 2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
1.1.2 Dengue no Estado do Maranhão
Das cinco regiões brasileiras a Nordeste é uma das mais afetadas por surtos de dengue
e todos os seus nove Estados apresentam um risco muito alto de infecção (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2015). Dos Estados que compõe a Região Nordeste o Maranhão tem se destacado por
apresentar um número alto de casos de dengue.
O Estado do Maranhão situa-se entre as coordenadas de 01°01’ a 10°21’ lat. S e 41°48’
a 48°40’ long. W. Abrange uma área de 331.983,3 km², limitando-se a norte com o Oceano
Atlântico, a leste com o Piauí, a sul e sudoeste com o Tocantins e a noroeste com o Pará
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, MARANHÃO, 2009). As características geográficas e climáticas
20
têm possibilitado a circulação simultânea dos sorotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 e, em
2011 a introdução do DENV-4. O A. aegypti, principal vetor envolvido na transmissão do vírus
causador da dengue, foi introduzido no Estado do Maranhão em 1969, tendo como rota de
entrada a capital São Luís. Entretanto, o problema só chamou a atenção dos órgãos de saúde no
ano de 1995, quando foram detectados os primeiros casos de dengue clássica no bairro da
COHAB – Anil com um total de 1.776 notificações (NETO; REBÊLO, 2004). Em 1996
aconteceu a primeira epidemia na ilha de São Luís, com 4.641 casos notificados (REBÊLO et
al.,1999). O sorotipo 1 foi isolado pela primeira vez em São Luís no ano de 1996 e o sorotipo
2 foi isolado em 2001. No ano de 2002, na capital maranhense, foram detectados os primeiros
casos de dengue hemorrágica, o que coincidiu com a introdução e posterior prevalência do
sorotipo 3 (NETO; REBÊLO, 2004).
Apesar da escassa literatura sobre a incidência de dengue no Nordeste, foi possível fazer
uma estimativa do número de casos ocorridos no período de 2002 a 2009. Para tal, foram
utilizados boletins do Ministério da Saúde, constatando-se 1.025.401 casos notificados, o que
correspondeu a 35% das notificações ocorridas no Brasil; neste mesmo período no Maranhão
foram notificados 63.611 casos, representando 6,2% dos casos ocorridos no Nordeste
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
No estado do Maranhão, atualmente, há infestação pelo principal mosquito vetor, o A.
aegypti, em 73,3% dos municípios e a circulação dos quatro sorotipos virais. No início de 2011,
o Ministério da Saúde classificou 31 municípios maranhenses como áreas de risco iminente de
epidemia de dengue, dentre eles a capital São Luís (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). Em
2010, foram notificados 6.821 casos de dengue no Estado do Maranhão, contra 3.840 casos
ocorridos em 2009. Em janeiro de 2012, a coordenadora da Vigilância Epidemiológica da
Secretaria Estadual de Saúde do Maranhão afirmou que em 2011 foram notificados 14.026
casos de dengue com 2.262 internações (16,12%) e vinte e cinco óbitos. No topo da lista de
notificações de maior incidência apareceram os municípios de Itapecuru-Mirim, São Luís,
Presidente Dutra e Imperatriz (SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE DO MARANHÃO,
2013). Por outro lado, o sistema de monitoramento da Dengue, no ano de 2011, identificou até
a 52a semana epidemiológica, três sorotipos circulantes no Estado do Maranhão: DENV-1,
DENV-2 e o DENV-4. Neste mesmo período, sete amostras de DENV-4 foram isoladas a partir
do soro de pacientes atendidos pela rede básica de saúde das regiões: Tocantina (Estreito),
região metropolitana (São Luís) e região do Munim (Rosário) (SECRETARIA ESTADUAL
DE SAÚDE DO MARANHÃO, 2013). Neste cenário, a grande preocupação do Ministério da
21
Saúde é que circulação do sorotipo 4 possa aumentar o risco de surtos da FHD, a forma mais
grave da doença e abrir portas para novas epidemias, porque menos pessoas tiveram contato
com este sorotipo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
1.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO VÍRUS DA DENGUE
O vírus da dengue pertence à ordem Nidovirales, família Flaviviridae e gênero
Flavivirus. A família Flaviviridae é composta por três gêneros: Hepacivirus, ao qual pertence
o vírus da hepatite C; Pestivirus, que inclui os causadores da diarréia bovina (BVD) e
Flavivirus, onde estão importantes agentes etiológicos de relevância médica e veterinária, tais
como: o vírus da febre amarela (YF), o vírus da encefalite japonesa (JE), o vírus da encefalite
do Oeste do Nilo (WNE), o vírus da dengue, dentre outros (LUNA et al., 2003; COMITÊ
INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DE VÍRUS - ICTV, 2013).
O gênero Flavivirus inclui, ainda, aproximadamente outros 100 vírus, sendo em sua
grande maioria patógenos humanos transmitidos por artrópodes (GO; BALASURIYA, LEE,
2014). Esses vírus estão amplamente distribuídos na natureza onde são mantidos em ciclos de
transmissão envolvendo um hospedeiro vertebrado e um artrópode no papel de vetor biológico.
Os vírus desse gênero infectam diferentes tipos de células humanas, como células do sistema
imune e nervoso, fígado, rim e pâncreas (STEIN; SHI, 2008) causando uma variedade de
doenças como, por exemplo, a encefalite e febre hemorrágica (LINDENBACH; RICE, 2001)
Os Flavivírus compartilham características comuns quanto à morfologia, aos
determinantes antigênicos e à organização genômica (PUGACHEV et al., 2004). O genoma dos
Flavivirus é formado por RNA fita simples que contém aproximadamente 11.000 nucleotídeos
(nt), possui uma janela aberta de leitura ladeada por duas regiões 5´ UTR e 3´UTR (região não
codificadora), com 100 e 600 nt, respectivamente. A região 5’ terminal do genoma dos
Flavivirus apresenta uma estrutura “cap” tipo1 (m7GpppAm) seguida por uma sequência
dinucleotídica conservada 5’ –AG-3’. A 3´UTR apresenta uma estrutura de “stem-loop” muito
conservada que é necessária para a multiplicação viral (ALVAREZ et al., 2005; ZHOU et al.,
2007). Estudos de evolutiva dos vírus do gênero Flavivirus sugerem que a população viral vem
se diversificando devido a altas taxas de recombinação ou simplesmente pelo aumento do
número de hospedeiros humanos (COFFEY et al., 2013). Além disso, os vírus com genoma
22
RNA, que possuem RNA-polimerase RNA dependente, sofrem mutações frequentes, em
média, ocorre um erro a cada ciclo de replicação do genoma (HOLMES; TWIDDY, 2003).
A partícula viral do DENV apresenta forma esférica e capsídeo de simetria icosaédrica,
com diâmetro de 40 a 50 nm que é composta de 6% de RNA, 66% de proteína, 9% de
carboidratos e 17% de lipídios. O seu genoma é constituído de um RNA fita simples de
polaridade positiva, formado por uma longa janela aberta de leitura (open reading frame, ORF)
que após o processamento de clivagem origina três proteínas estruturais: a proteína do envelope
(E); proteína de membrana (M); proteína do capsídeo (C) e sete proteínas não estruturais (NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (MELINO; PACI, 2007; ALESHIN et al., 2007;
SHIRYAEV; STRONGIN, 2010). As proteínas estruturais se ligam a receptores celulares e
interagem com a membrana celular do hospedeiro por fusão e subsequente entrada, assim como
para direcionar a organização viral e o brotamento. Enquanto as proteínas de superfície
normalmente possuem determinantes antigênicos que induzem anticorpos neutralizantes
(WANG et al., 2007).
A proteína E, a maior proteína estrutural exposta na superfície do dengue é fundamental
para a ligação do vírus aos receptores da membrana celular do hospedeiro. Esta proteína tem
peso molecular aproximado de 53 kDa e é diferencialmente glicosilada de acordo com o
sorotipo viral e com a célula que o vírus está infectando (DE LA GUARDIA; LLEONAR,
2014). A proteína E possui vinte resíduos conservados de cisteína que formam seis pontes
dissulfídicas que contém importantes determinantes antigênicos em seus epítopos, que definem
a produção de anticorpos, constituindo-se, portanto, num dos mais importantes alvos da
resposta imune humoral (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006; LINDENBACH; THIEL; RICE,
2007).
Duas formas de proteínas de membrana têm sido caracterizadas: a proteína precursora
da membrana (prM) contida em vírions intracelulares imaturos e a proteína de membrana (M)
contida em vírions maduros extracelulares. A clivagem específica de prM (22 kDa) durante a
maturação viral resulta na formação da proteína M (8 kDa) (CHERRIER et al., 2009). A
proteína prM atua como uma chaperona para a proteína E, garantindo o seu dobramento correto
e protegendo o seu domínio de fusão. O evento de maturação de prM e necessário para expor o
domínio de ligação ao receptor da proteína E, evitando assim fusão da mesma antes da liberação
da partícula viral madura (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006).
A proteína estrutural C é formada por 100 aminoácidos, possui peso molecular em torno
de 13,5 kDa. A proteína do capsídeo (C) juntamente com o RNA forma o nucleocapsídeo viral.
23
Ela é o primeiro polipeptídio sintetizado durante a tradução, sendo essencial na montagem do
vírus, garantindo a encapsidação do genoma viral e liberação da partícula viral madura. Possui
ainda uma região apolar extensa constituída de uma alta proporção de aminoácidos básicos, que
parece neutralizar a carga negativa da molécula de RNA viral, com a qual está associada
(CHANG, 1997).
A proteína não estrutural NS1, cujo peso molecular é aproximadamente de 46 kDa é
altamente conservada e existe predominantemente na forma dimérica. Pode ser expressa em
três formas: (I) associada ao retículo endoplasmático, no mesmo local onde ocorre a replicação
viral, (II) ancorada à membrana e (III) secretada (sNS1). Sendo assim, a NS1 pode ser
encontrada tanto no meio intracelular, associada à membrana celular, quanto no meio
extracelular, onde é secretada por células de mamíferos, não ocorrendo em células de mosquito.
A função da sNS1 ainda não é totalmente conhecida, mas sabe-se que é um importante alvo da
resposta imune humoral, podendo ter implicações na patogênese da doença (CLYDE; KYLE;
HARRIS, 2006).
As proteínas NS2A, NS4A e NS4B, são pequenas proteínas de natureza hidrofóbicas
menos caracterizadas que estão potencialmente implicadas na síntese de RNA e montagem da
partícula viral. Recentemente, foi demonstrado que NS4B e, em um nível menor, NS2A e NS4A
são capazes de bloquear sinais de transdução mediados por Interferons (INF’s), atuando como
um mecanismo de escape viral ao sistema imune do hospedeiro. Enquanto as três proteínas em
combinação são mais efetivas, NS4B sozinha é um potente inibidor da sinalização de IFN- β e
IFN-I (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006).
A proteína NS3 é produzida nos passos iniciais da replicação viral, essa proteína é capaz
de elicitar a produção de anticorpos específicos, mas cujo papel ainda não está completamente
elucidado. Alguns autores têm relatado uma significante resposta de anticorpos contra a
proteína NS3 em casos de infecções primárias e secundárias pelo vírus da dengue, tendo sido
constatada uma forte associação entre a magnitude da resposta a NS3 e a severidade da doença
(LUO et al., 2008). A NS3 é multifuncional e executa reações enzimáticas essenciais para a
replicação viral, incluindo a proteólise da poliproteína através de seu domínio N-terminal serina
protease com um segmento de 40 resíduos hidrofóbicos da proteína NS2B, que atua como
cofator tem atividade helicase no dominio central envolvida na síntese do RNA viral, atividade
de nucleotídeo-trifosfatase nos ¾ restantes da região carboxi (BOOKS et al., 2002; LUO et al.,
2008).
24
A proteína NS5 (RNA polimerase dependente de RNA) é a maior das dez proteínas do
DENV possuindo 104 kDa correspondendo a 900 aminoácidos, é um multidomínio proteico
com pelo menos dois domínios com atividade enzimática que são cruciais para o ciclo de
replicação viral (BROOKS et al., 2002).
1.2.1 Ciclo de replicação do DENV em células humanas
A maneira como cada proteína está envolvida nos eventos que ocorrem durante a
replicação viral são em sua grande maioria, ainda desconhecidos, embora se tenha um
entendimento geral de como as proteínas do dengue regulam o ciclo de replicação viral
(BARTH, 1992). Após interação com os receptores e outras moléculas na superfície celular, os
vírus são endocitados e transportados em vesículas endossomais. Durante esse processo, a
glicoproteína do envelope (E) se liga especificamente aos receptores da célula alvo.
As partículas virais são encontradas em vesículas pré-lisossomais após a penetração.
Por um processo de fusão de membrana, catalisado pela acidificação da vesícula, ocorre a
trimerização irreversível da proteína E que promove a fusão do vírus com a membrana
endossomal, liberando o nucleocapsídeo no citoplasma. Com a dissociação do capsídeo e do
genoma, o RNA genômico viral é liberado no citoplasma, aonde irá se associar a ribossomos
para dar início à tradução da poliproteína viral (MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN,
2005). Após a produção suficiente de proteínas virais, são formados os complexos de replicação
do RNA e as fitas genômicas RNA positivas servem de molde para a produção de fitas
genômicas RNA negativas, que servirão de molde para a produção de mais fitas genômicas
RNAs positivas. Toda a síntese de RNA acontece em estreita associação a estruturas de
membrana do citoplasma. As fitas genômicas RNAs positivas geradas podem ser traduzidas ou
empacotadas na partícula viral. Após a produção de altos níveis de proteínas e genomas virais,
a partícula é montada e transportada através do complexo de Golgi para ser secretada da célula
(STEIN; SHI, 2008; TOMLINSON; MALMSTROM; WATOWICH, 2009).
25
1.2.2 Ciclo de manutenção do DENV nos mosquitos
As fêmeas de mosquitos do gênero Aedes ao se alimentarem de sangue, para suprir
necessidades proteicas da oviposição, infectam-se ao picar indivíduos que estejam na fase
virêmica da dengue (geralmente 4 a 5 dias depois da infecção), uma vez infectadas, ao picarem
um hospedeiro suscetível elas o infectam (KOW; KOON; PANG, 200l). Outra forma
importante de transmissão que ocorre no A. aegypti é a transovariana. As fêmeas de mosquitos
Aedes podem transmitir o vírus da dengue de forma transovariana diretamente para a sua prole,
dispensando o homem no ciclo mantenedor. A transmissão transovariana é observada em 1 ovo
contaminado em 500 ovos da prole, aproximadamente (MONTAH; HEINZ, 1996). Assim,
existência de mosquitos machos infectados é explicada pela transmissão transovariana. Além
disso, as fêmeas podem também serem infectadas através de cópula com machos infectados
(ROSEN, 1987). A fêmea do mosquito Aedes faz sua oviposição em depósitos artificiais de
água, tais como pneus, latas, tanques, barris, tonéis, caixas d’água e vasos de plantas. Os ovos
são postos alguns milímetros acima da linha de água fixando-se à parede do recipiente onde
resistem à dessecação, podendo permanecer viáveis por mais de um ano. Os ovos iniciam seu
ciclo evolutivo de larva, pupa e mosquito adulto quando em contato com água (GUBLER,
1998).
Em áreas tropicais, a transmissão do vírus da dengue ocorre durante todo o ano, mas no
verão e em períodos chuvosos, aumentam os surtos da doença. Estudos demonstraram que o
aumento da temperatura diminui o período de incubação extrínseco (WATTS et al., 1987). O
período extrínseco de incubação se refere ao intervalo de tempo entre a multiplicação viral no
mosquito até a migração para a glândula salivar de onde é capaz de ser transmitido. Este período
varia de 8 a 12 dias (MCBRIDE; BIELEFELDT-OHAMANN, 2000). O mosquito A. aegypti
está adaptado a se reproduzir nos ambientes domésticos e peridomésticos, utilizando-se de
recipientes que armazenam água potável e de recipientes descartáveis que acumulam água das
chuvas, comumente encontrados nos lixos das cidades (CAMARA et al., 2007). Estudos
demonstraram que a densidade populacional do vetor e fatores de exposição à fêmea do
mosquito infectada são fatores importantes na taxa de transmissão do vírus (ILKAL et al.,
1991). Outro fator importante é o hábito alimentar descontínuo da fêmea do mosquito A.
aegypti, que possibilita a transmissão rápida do vírus através da alimentação de sangue entre
uma postura e outra (RICE, 1996).
26
1.3 CARACTERÍSTICAS DA DENGUE
A Dengue é uma doença febril aguda causada pela infecção por qualquer um dos quatros
sorotipos do vírus dengue (DENV1-4) podendo provocar quadros clínicos variáveis. As
manifestações clínicas são muito polimórficas e variam de reações brandas a
comprometimentos graves e/ou letal sendo que a maioria dos indivíduos infectados é
assintomática ou desenvolve uma doença moderada conhecida como febre do dengue (FD)
(GUBLER, 1998). As manifestações mais graves são a febre hemorrágica do dengue (FHD) e
a síndrome do choque do dengue (SCD), que podem ser fatais se o indivíduo não receber suporte
terapêutico adequado o mais rápido possível (WHITEHEAD et al.,2007; KYLE; HARRIS,
2008). Por apresentar características clínicas semelhantes a outras infecções virais e
bacterianas, a febre do dengue pode facilmente ser confundida com outras doenças, ou ser
subdiagnosticada (GUBLER, 1998).
1.3.1 Manifestações clínicas da dengue
Após serem inoculados no hospedeiro, pela picada da fêmea de mosquito do gênero
Aedes, o vírus da dengue faz uma primeira replicação em células musculares estriadas, lisas e
fibroblastos, bem como em linfonodos locais, este é o período de incubação que é variável de
dois a sete dias (HALSTEAD et al.,1980). Seguindo-se a multiplicação, tem início a viremia e
a disseminação do vírus por todo o organismo circulando livre, no plasma ou no interior de
monócitos/ macrófagos, surgindo então os sintomas gerais da doença (HALSTEAD et
al.,1980). As infecções em humanos podem resultar em duas síndromes distintas: a Febre do
Dengue (FD) e Febre Hemorrágica do Dengue/Síndrome de Choque do dengue (FHD)/(SCD).
Em ambos os casos, a febre inicia-se abruptamente acompanhada de uma variedade de sinais e
sintomas inespecíficos, tais como: dor de cabeça frontal e retroorbital, dores no corpo, mialgia,
náusea e vômito, bradicardia, leucopenia, fraqueza, e erupção cutânea (KALAYANAROOJ et
al.,1997). Os pacientes podem ter anorexia, alteração da sensação de gosto, e dor de garganta.
Ocasionalmente, são descritos constipação, diarréia e sintomas respiratórios (GUBLER, 1998).
A FD pode durar de dois a sete dias, período que se correlaciona com a detecção do
vírus no sangue, podendo ser interrompida por alguns dias, voltando após 12 a 24 horas. A
erupção cutânea é variável e acontece em até 50% dos pacientes, coincide com a febre e
27
desaparece um a dois dias depois. Uma segunda erupção cutânea, variando de escarlatiniforme
para maculopapular, pode aparecer entre o 2º e 6º dias da doença e normalmente começa no
tronco e se expande para a face e extremidades, podendo também aparecer petéquias que podem
se espalhar ou confluir (MONATH; BURKE, 2001). Hemorragias do trato gastrointestinal e
hematúria podem ocorrer, porém são mais raras. Uma trombocitopenia (<100.000
trombócitos/mm3 de sangue) é frequentemente observada nos casos clínicos (HUANG et al.,
2000).
A FHD se inicia de forma similar a FD, com súbito acesso de febre e vários sintomas
inespecíficos e quando ocorre defervescência da febre, geralmente entre o terceiro e o sétimo
dia da evolução da doença, o paciente apresenta uma piora no quadro clínico. Alguns sinais
como resfriamento da pele e letargia começam a aparecer (MCBRIDE; BIELEFELDTOHMANN, 2000). Trombocitopenia e hemoconcentração são observadas e servem como sinal
de extravasamento plasmático. A doença pode progredir para congestão da pele, cianose ao
redor da boca e pulso rápido e fraco. Sintomas hemorrágicos como sangramento na pele, na
gengiva, no nariz, hemorragia do trato gastrointestinal e hematúria podem ser frequentemente
observados (GUBLER, 1998; 2002). Uma terapia de reposição de líquido plasmático é
recomendada quando o paciente apresenta este quadro, podendo evitar o óbito (GUBLER,
1998; 2002). A gravidade da FHD é classificada em quatro categorias de acordo com sinais
clínicos. Na categoria 1 estão classificados os casos que apresentam febre acompanhada de
sintomas não específicos, com teste do torniquete positivo. Na categoria 2 estão os casos que
apresentam sangramento espontâneo, usualmente gengiva, nariz e pele. Na categoria 3 estão os
casos que apresentam falha circulatória, com pulso rápido e fraco e hipotensão. Na categoria 4
estão os casos onde o paciente moribundo apresenta pulso e pressão não detectáveis
(MCBRIDE; BIELEFELDT-OHMANN, 2000). Nestes casos a gravidade do quadro clínico do
paciente depende da amostra viral, do estado imunológico, da idade e genética do hospedeiro
(HAYES; GUBLER, 1992). Além disso, as manifestações mais graves estão associadas às áreas
onde circulam mais de um sorotipo viral ou onde houve uma sequência de epidemias causadas
por diferentes sorotipos (HOLMES; BURCH, 2000). Neste cenário, o diagnóstico da dengue
torna-se extremamente difícil, uma vez que a doença apresenta um espectro variado e
inespecífico de manifestações clínicas, que vão desde uma doença febril leve até um quadro
hemorrágico grave e fatal.
28
1.3.2 Patogênese e resposta imunológica na dengue
Estudos sobre a patogênese do vírus da dengue têm sido limitados devido à ausência de
um modelo animal adequado que demonstre o tropismo do vírus por células do sistema
mononuclear fagocitário (macrófagos, monócitos e células B) (BALSITIS et al., 2009). Tem
sido proposto que essas células são os principais sítios de replicação viral (KURANEI;
EENNIS, 1992; MONATH; HEINZ, 1996). Foi observado em pacientes com dengue, a
presença do vírus em linhagens monocítico/macrofágica de órgãos linfóides, pulmão e fígado
(MCBRIDE; BIELEFELDT-OHMANN, 2000). Além disso, o DENV pode infectar mastócitos,
células dendríticas, células endoteliais (KING et al., 2000), leucócitos do sangue periférico,
fígado, baço, linfonodos, medula óssea, timo, coração, rins, estômago, pulmões e possivelmente
o cérebro, sugerindo a sua passagem pela barreira hematoencefálica (HAYES; GUBLER,
1992).
Os anticorpos neutralizantes são fatores chave na etiopatogênese da dengue. Entretanto,
a resposta imune celular também é importante. Kuranei e Ennis, (1992) demonstraram que a
resposta de memória do linfócito T à dengue após uma infecção primária inclui linfócitos T
sorotipo-específicos e linfócitos T que reagem cruzadamente. A imunidade conferida é sorotipo
específico de modo que é possível uma pessoa ter 4 episódios separados da febre do dengue.
Como o mesmo indivíduo pode ser infectado por sorotipos heterólogos do DENV, aqueles que
experimentarem a infecção mais de uma vez têm uma possibilidade mais elevada de
desenvolver a FHD (SANGKAWIBHA et al.,1984; THEIN et al.,1997). Este fato tem sido
explicado por duas teorias diferentes, porém complementares: a teoria do aumento de
anticorpos dependentes (ADE) que postula que anticorpos adquiridos em infecções prévias,
específicos para um determinado sorotipo do DENV, não seriam neutralizantes ou teriam títulos
muito baixos para neutralizarem um sorotipo diferente, responsável pela infecção atual. Estes
anticorpos não neutralizantes poderiam mediar um aumento da percepção do vírus em
monócitos/macrófagos via receptor Fc, levando ao aumento da replicação viral e ativação
imune acompanhada pela liberação de citocinas (WHITEHEAD et al., 2007; KYLE; HARRIS,
2008). A teoria complementar a ADE envolve a reativação de células T de memória específicas
para o sorotipo da infecção prévia, resultando em “clearence” viral atrasado e/ou aumento da
secreção de citocinas somado ao aumento de apoptose. Nas duas teorias, as citocinas possuem
um papel direto na imunopatogênese do DENV devido a seus efeitos inflamatórios sobre as
células do endotélio vascular que presumivelmente leva ao rompimento das junções e aumenta
29
a permeabilidade vascular (BRANDT et al.,1982; WHITEHEAD et al., 2007; KYLE; HARRIS,
2008).
Ressalta-se que nem todas as infecções secundárias levam a FHD/SCD e estas
síndromes podem ocorrer em uma infecção primária. Fatores genéticos relacionados ao vírus
determinam a existência de linhagens mais virulentas dentro do mesmo sorotipo (MCBRIDE;
BIELEFELDT-OHMANN, 2000). Análises genotípicas identificaram mutações associadas a
regiões conhecidas por afetarem a virulência “in vitro”. Um exemplo deste fato são mutações
na região 3’ -UTR, sequência fundamental para a replicação, tradução e brotamento viral, que
estimula anticorpos neutralizantes e induz resposta imune celular (HOLMES; BURCH, 2000).
1.4 MÉTODOS LABORATORIAIS DE DIAGNÓSTICO DA DENGUE
Apesar de diferentes técnicas diagnósticas já terem sido desenvolvidas e avaliadas, até
o momento, nenhuma delas foi padronizada para o uso laboratorial de rotina no diagnóstico da
dengue.
1.4.1 O isolamento do vírus da dengue
O isolamento viral comumente é feito até o quinto dia da doença, este procedimento
pode ser executado utilizando-se um dos quatro métodos, a saber: (i) inoculação intracerebral
em camundongos recém-nascidos, este método permite isolar todos os quatro sorotipos do
DENV, porém é caro, demorado e tem baixa sensibilidade; (ii) inoculação em culturas de
células de mamíferos, este método além de apresentar as mesmas desvantagens que o de
inoculação intracerebral, exige múltiplas passagens para que o efeito citopático seja observado,
por estes motivos, praticamente não é utilizado na rotina laboratorial; (iii) inoculação
intratorácica de mosquitos adultos é um método muito sensível mas é o menos utilizado. Para
a sua execução quatro espécies de mosquito têm sido usadas: Aedes aegypti, Aedes Albopictus,
Toxorhynchities amboinensis e Toxorhynchities. Splendens. A detecção é feita através de um
ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) em tecidos do mosquito, normalmente o cérebro
ou as glândulas salivares. As desvantagens incluem um trabalho árduo, a necessidade de
insetários para produzir grande um número de mosquitos para inoculação, bem como, as
30
precauções que devem ser tomadas para evitar a libertação dos mosquitos infectados e, (iv) a
inoculação em culturas celulares que é a mais recente metodologia desenvolvida para o
isolamento do DENV. Atualmente, a linhagem clonal C6/36 do Aedes albopictus, tem sido a
mais utilizada para o isolamento do vírus, fornecendo resultados rápidos, sensíveis e
econômicos (De PAULA; FONSECA, 2004). O uso de células C636 permite processar várias
amostras ao mesmo tempo e tornou-se a técnica padrão para o isolamento do DENV. Embora
alguns relatos tenham descrito um efeito citopático (formação de sincício e/ou presença de
células gigantes multinucleadas) induzido por todos os quatro sorotipos, estes efeitos são
difíceis de serem detectados, e podem ser variáveis (De PAULA; FONSECA, 2004).
1.4.2 Inibição da hemaglutinação (IH)
Este ensaio depende da habilidade dos anticorpos em inibir a aglutinação de hemácias
(ganso ou humanas) do grupo sanguíneo “O” pelas glicoproteínas virais (CLARKE; CASALS,
1958). Durante muitos anos a IH foi o método padrão utilizado no diagnóstico da dengue,
devido ao seu elevado grau de sensibilidade e facilidade de execução (GUZMAN; VÀZQUEZ;
KOURI, 2009). Anticorpos específicos do DENV foram detectados por este método durante
muitos anos (48 anos ou mais) sendo de grande valor em inquéritos soroepidemiológicos e para
diferenciar as infecções primárias das secundárias (GUZMAN; VÀZQUEZ; KOURI, 2009).
Em infecções primárias, na fase aguda os anticorpos são detectados a partir do quinto ou sexto
dia dos sintomas, onde geralmente os títulos de anticorpos estão acima de 1:10. Os títulos de
anticorpos da fase convalescente são geralmente abaixo de 1:640 em primo infecções. Por outro
lado, em infecções secundárias ou terciárias, anticorpos específicos são facilmente detectados,
existindo um rápido aumento do título durante os primeiros dias da infecção. Assim, um título
de 1:1280 ou superior em amostras recolhidas durante a fase aguda ou no início da fase
convalescente da doença é uma indicação de infecção secundária pelo DENV. Os elevados
níveis de anticorpos permanecem constantes durante dois a três meses, e em alguns pacientes o
título começa cair. As principais desvantagens da HI são a sua falta de especificidade, a
necessidade de amostras pareadas, e a incapacidade de identificar o sorotipo infectante
(VORDAM; KUNO, 1997).
31
1.4.3 Fixação do complemento (CF)
O teste CF não é usado rotineiramente para o diagnóstico da dengue, pois é de difícil
execução, requer técnicos altamente qualificados e treinados para a obtenção de bons
resultados. O teste baseia-se no princípio de que o complemento será consumido durante a
reação antígeno-anticorpo. Os anticorpos detectados por CF geralmente aparecem mais tarde
do por IH e eles persistem por curtos períodos, sendo, portanto, de valor limitado para estudos
soroepidemiológicos. Entretanto, CF é muito específico em primo infecções, contribuindo para
a determinação do sorotipo infectante (VORDAM; KUNO, 1997).
1.4.4 Teste de Soro neutralização (NT)
Este teste mede o título de anticorpos neutralizantes em soro de pacientes
convalescentes. A NT é o método sorológico mais sensível e específico para o diagnóstico da
dengue, detectando os anticorpos por um longo período. A alta especificidade do NT possibilita
a identificação do sorotipo infectante em primo infecções, desde que uma relativa resposta
monotípica seja observada no soro do paciente na fase convalescente. Entretanto, a
identificação do sorotipo nem sempre é possível no soro de pacientes com infecção secundária
ou terciária. As principais desvantagens do NT são o seu alto custo, o longo tempo gasto para
executá-lo e dificuldades técnicas (GUZMAN; KOURI, 1996).
1.4.5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
A sorologia para a detecção de anticorpos antidengue é feita após o quinto dia da doença.
A confirmação do diagnóstico de dengue é rotineiramente realizada por ELISA para a detecção
de anticorpos tipo IgM em amostras coletadas uma semana após o início dos sintomas
(GUZMAN; VÀZQUEZ; KOURI, 2009). Trata-se de uma análise "a posteriori", de utilização
limitada para o diagnóstico rápido do doente durante o início da fase sintomática. Entretanto, o
ELISA é o teste disponível nos Laboratórios Centrais (LACENs) do país. Para a execução do
teste diagnóstico é necessário o preenchimento de um formulário específico da Gerência de
Virologia (Núcleo de Arbovirologia) (FUNASA, 2002).
32
1.4.6 MacELISA
O MAC-ELISA, ou ELISA de captura de IgM é uma valiosa ferramenta para a
vigilância epidemiológica da FD e de FHD/SSD, esta técnica tem sido muito usada para a
confirmação da infecção recente. Durante epidemias este método tem a vantagem de
diagnosticar rapidamente a propagação da transmissão. Nas áreas onde a dengue é endêmica o
MAC-ELISA pode ser utilizado na avaliação de um grande número de amostras clínicas, com
relativa facilidade. Entretanto, como o MAC-ELISA detecta anticorpos do tipo IgM e a
produção dessa imunoglobulina varia consideravelmente entre os indivíduos, o perfil de
detecção pode ser variável, pois em algumas pessoas estes anticorpos podem ser detectados a
partir do segundo dia do início dos sintomas, enquanto que em outros, estes não são produzidos
até o oitavo dia do início da sintomatologia doença. Anticorpos IgM apresentam títulos
significantemente mais altos na primo infecção do que na infecção secundária ou terciária,
embora, em alguns casos, títulos altos como 1: 320 possam ser encontrados, mas isso não ocorre
comumente (VORDAM; KUNO, 1997; SUAYA; SHEPARD; BEATTY, 2006). O MACELISA tem mostrado ser menos sensível do que o teste IH em amostras de soro pareadas
coletadas de pacientes na fase aguda. Mas, tem apresentado especificidade similar ao IH em
amostras de soro de infecções primárias e secundárias em alguns casos. Em geral, no MACELISA ocorrem reações cruzadas com todos os sorotipos do dengue e de outros Flavivirus, tais
como os vírus da encefalite japonesa, da encefalite St. Louis e da febre amarela (VORDAM;
KUNO, 1997).
1.4.7 ELISA NS1
Durante o processo de replicação viral a proteína não estrutural NS1 é secretada no
sangue do indivíduo, sendo considerado um marcador precoce de infecção (GUZMAN;
VÀZQUEZ; KOURI, 2009). Como o antígeno NS1 está presente no soro de indivíduos
infectados desde o primeiro dia de doença, permanecendo na forma solúvel até o quinto ou
sexto dia, seu uso vem sendo avaliado como ferramenta de detecção precoce da dengue (XU et
al., 2006; GUZMAN; VÀZQUEZ; KOURI, 2009). O teste de ELISA para a detecção da
proteína viral NS1 está disponível no mercado, como por exemplo, no kit Pan Bio DengueTM
(Brisbane, Austrália) onde aos anticorpos contra o dengue são detectados no soro de indivíduos
33
com suspeita da doença, por testes em formato de ELISA de captura para IgM ou ELISA
indireto para IgG (VAJPAYEE; SINGH; BROOR, 2001). Entretanto, a taxa de sensibilidade
do ELISA NS1 ainda é baixa, variando de 60,4 a 87.4% mas a especificidade é alta, variando
de 97.9 a 100% (GUZMAN; VÀZQUEZ; KOURI, 2009). Em resumo, até o momento o ELISA
tem sido considerado o método mais útil para a confirmação do diagnóstico clínico da dengue,
devido sua sensibilidade e especificidade, facilidade de execução e por não exigir equipamentos
sofisticados. Ressalta-se que o ELISA com a proteína NS1 ainda está restrito aos laboratórios
de pesquisa.
De todos os métodos citados acima, o ELISA de captura de IgM ou MAC-ELISA, tem
sido considerado o padrão ouro pelo Ministério da Saúde para a confirmação de diagnóstico de
infecção pelo DENV. No entanto, este método detecta apenas os anticorpos produzidos contra
o vírus entre o quinto e décimo dias após do aparecimento da febre em casos de infecção
primária e, em alguns casos, é de difícil detecção em infecções secundárias. Por isso, o MACELISA costuma ser utilizado somente a partir do sexto dia da doença para a confirmação do
diagnóstico clínico.
1.5 MÉTODOS MOLECULARES PARA A DETECÇÃO DO VÍRUS DA DENGUE
Apesar de várias técnicas moleculares já terem sido testadas e avaliadas para o
diagnóstico molecular, até o presente momento, nenhum teste foi adotado como padrão para o
diagnóstico da doença. Espera-se que essas metodologias possam progredir o mais rapidamente
para serem utilizados rotineiramente (DENGUE BULLETIN, 2013).
1.5.1 Hibridização dos ácidos nucléicos
A hibridização dos ácidos nucléicos usando o RNA extraído do sobrenadante de culturas
de células infectadas com o dengue, ou de “pools” do mosquito A. albopictus infectado,
hibridizado quer com sondas de biotina ou de P32 foi inicialmente testado para estudos
epidemiológicos (IGARASHI,1978). A hibridização para o diagnóstico da dengue pode ser
feita em tecidos obtidos de necropsia usando um tipo de sonda. Entretanto, sondas biotinadas
são menos sensíveis e não podem ser usadas para a identificação do DENV diretamente em
34
amostras clínicas (HENCHAL et al.,1987). A hibridização RNA-RNA é uma técnica sensível
que pode ser aplicada quer diretamente em amostras frescas ou em análise retrospectiva de
amostras fixadas. Devido às dificuldades em trabalhar com RNA, que necessita de técnicos
experientes para obter resultados reprodutíveis, este método tem sido utilizado apenas como
instrumento de investigação e não como um método de diagnóstico de rotina (DEUBEL, 1997).
1.5.2 Reação de Transcrição Reversa (RT-PCR)
Várias técnicas de extração do RNA têm sido avaliadas de forma a permitir a eficácia
deste teste (De PAULA et al., 2001; SUDIRO et al.,2001). Através da RT-PCR o material
genético do vírus pode ser detectado diretamente no soro do paciente, no meio de cultura de
células de mosquito infectadas e em larvas trituradas (CHAN; KAUTNER; LAM; 1994;
URDANETA et al.,2005). A RT-PCR foi desenvolvida para o estudo de vários vírus RNA e
tem revolucionado os diagnósticos de laboratório. O método é sensível e reprodutível, podendo
ser usado para detectar RNA viral em amostras clínicas, tecidos de necropsia, mosquitos e
larvas. Um estudo que avaliou o desempenho da RT-PCR em detectar o DENV em amostras de
sangue, soro e tecido e demonstrou que o soro é o melhor tipo de amostra clínica para
amplificação do genoma do vírus (De PAULA; FONSECA, 2002). Entretanto, o sucesso com
a técnica de RT-PCR é dependente da região do genoma que é escolhida para ser transcrita,
bem como da escolha do iniciador (De PAULA; OLIVEIRA, 2004). Apesar das vantagens da
técnica de RT-PCR para a detecção do DENV, ela não deve ser usada como um substituto do
isolamento viral em cultivo de celular. O isolamento é importante para caracterizar diferenças
entre linhagens (LANCIOTTI et al.,1992).
1.5.3 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) a PCR é um poderoso método a ser
utilizado no diagnóstico da dengue, entretanto, ainda necessita ser padronizada, por essa razão,
ainda está restrita aos laboratórios de pesquisas. Variações da técnica original da PCR têm sido
testadas para o diagnóstico da dengue em amostras clínicas (DENGUE BULLETIN, 2013).
Neste contexto, o mais bem sucedido experimento até então descrito foi o de Lanciotti et al.
35
(1992), no qual eles desenharam um conjunto de iniciadores, considerados universais, para a
detecção e diferenciação dos quatro sorotipos do DENV. Neste experimento os autores
utilizaram a técnica de nested-RT-PCR, no qual inicialmente é feita a transcrição reversa, para
a produção do cDNA, com o iniciador denominado D2, a 420C durante 1 hora. Depois é
acrescentado o iniciador D1 e aplicada uma ciclagem de amplificação com 35 ciclos de
desnaturação (940C 30s), anelamento (510C por 1 minuto) e amplificação (720C por 2 minutos).
O produto obtido é então diluído e utilizado como molde para a reação de PCR específica, com
o iniciador D1 para os quatro sorotipos do DENV como segue: D1 mais o iniciador TS1 para
identificar o DENV-1; iniciador D1 mais o TS2 para o DENV-2; D1 mais TS3 para o DENV3 e D1 mais o TS4 para identificar o DENV-4(LANCIOTTI et al.,1992).
1.5.4 Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real
Outra técnica de biologia molecular que tem sido testada para diagnóstico da dengue é
a PCR em tempo real. Estudos têm mostrado que tanto em etapa única , quanto em duas, a
técnica tem gerado uma maior aceitação da técnica de PCR para o diagnóstico da dengue,
porque trouxe melhorias na sua rapidez, sensibilidade e reprodutibilidade além de ter reduzido
o risco de contaminações cruzadas (MACKAY; ARDEN; NITSCHE, 2002; NIESTERS, 2002).
A PCR em tempo real tem se mostrado sensível e reprodutível em quantificar concentrações do
DNA alvo em soluções biológicas (MACKAY; ARDEN; NITSCHE, 2002). Entretanto,
apresenta algumas importantes desvantagens: o elevado custo do equipamento e dos reagentes,
necessidade do uso de sondas específicas na maioria das vezes, um aporte técnico especializado
e não comporta reações de multiplex-PCR (mPCR).
1.6.5 Multiplex-PCR (mPCR)
Dentre as ferramentas moleculares para diagnóstico de doenças infecciosas a técnica de
Multiplex-PCR (mPCR) tem se destacado em todo o mundo para o diagnóstico de diferentes
patógenos. Uma série de estudos tem demonstrado a viabilidade da utilização da mPCR na
identificação de diversos patógenos virais envolvidos em diferentes contextos clínicos e
epidemiológicos. A mPCR tem sido extremamente utilizada para o rastreamento de uma grande
36
variedade de vírus associados à inúmeras doenças, incluindo àquelas causadas por herpes
simples (HSV), citomegalovírus (CMV); varicela-zoster (VZV); Epstein-Barr (EBV), herpes
virus humano 6 (HHV-6),
grupos entéricos (norovirus, adenovírus; rotavirus, entre outros)
(PEI; HUANG, 2004).
A técnica de mPCR permite a amplificação de vários alvos num único ensaio de PCR.
Neste caso, mais de uma sequência alvo é amplificada pela utilização de múltiplos pares de
iniciadores num único tubo de reação. Esta metodologia tem o potencial de promover economia
de tempo e de trabalho laboratorial, sem comprometer o desempenho do experimento
(ELNIFRO et al., 2000). Além disso, a técnica de mPCR tem demonstrado ser uma ferramenta
poderosa e de baixo custo para a genotipagem e subtipagem estirpes virais em diferentes estudos
epidemiológicos (PEI; HUANG, 2004).
Pelas vantagens apresentadas acima, neste trabalho a eficiência da técnica de
Transcrição Reversa seguida pela amplificação em mPCR (RT-mPCR) foi avaliada, uma vez
que o diagnóstico da dengue tem sido feito com base nos sinais e sintomas clínicos (histórico
mais o exame físico do paciente). A utilização dessa metodologia para a execução deste projeto
vem de encontro à necessidade de um monitoramento definitivo da dengue utilizando-se
métodos moleculares como ferramentas epidemiológicas. Ressalta-se que os métodos
moleculares poderão assumir um importante papel no diagnóstico laboratorial da FD e de
FHD/DSS, desde que sejam capazes de realmente detectar o vírus durante a fase aguda da
doença e até mesmo durante a fase convalescente. Em teoria, os testes moleculares são capazes
de cumprir este objetivo, bem como durante o período janela, pela avaliação da presença de
RNA viral em amostras de plasma/soro de indivíduos com suspeita de dengue (GUZMAN;
VÀZQUEZ; KOURI, 2009)
Diante do exposto, torna-se imprescindível a existência de um método laboratorial que
confirme a suspeita clínica de infecção pelo vírus dengue e que identifique o sorotipo infectante.
Por outro lado, a confiabilidade no resultado laboratorial é de vital importância para a tomada
de decisões e adoção de medidas terapêuticas, para o rastreamento da presença dos diferentes
sorotipos, em casos de epidemia e controle da doença.
Neste contexto, o objetivo deste projeto foi de utilizar a técnica de mPCR com os
mesmos iniciadores descritos por Lanciotti et al. (1992) e universalmente aceitos para a
diferenciação entre os sorotipos do vírus dengue. O diferencial deste trabalho é que o cDNA foi
confeccionado na reação de transcrição Reversa (RT) com um iniciador randômico e depois foi
utilizado como molde na reação de mPCR pela adição dos demais iniciadores. As principais
37
vantagens da m-PCR em relação à técnica de Nested - RT-PCR usada por Lanciotti et al. (1992)
é a diminuição da contaminação cruzada (comum em ensaios de Nested - PCR), a maior rapidez
na obtenção dos resultados, mais barata, uma vez que a detecção e diferenciação dos quatro
sorotipos ocorre em uma única reação e a facilidade na execução.
38
2 JUSTIFICATIVA
A febre do dengue e, particularmente a sua manifestação mais grave, a Febre
Hemorrágica do dengue, estão entre as doenças infecciosas mais importantes sob o ponto de
vista da saúde pública no Brasil.
A infecção por dengue é um dos principais problemas de saúde pública no Estado do
Maranhão onde há infestação pelo principal mosquito vetor, o A. aegypti, em 73,3% dos
municípios e a circulação dos quatros sorotipos. Além disso, dos 217 municípios que compõem
o Estado maranhense, 31 (14,2%) foram considerados pelo Ministério da Saúde como áreas de
risco eminente de epidemia de dengue.
No Estado do Maranhão, em 2011 foram identificados e confirmados os primeiros casos
de Dengue 4. Esse fato gerou preocupação aos profissionais da Saúde, uma vez que a circulação
de mais um sorotipo aumenta o risco de novos surtos, bem como o surgimento de casos de
Febre Hemorrágica do dengue (FHD), a forma mais grave da doença.
Por outro lado, como não existe vacina ou uma terapia específica e nem um marcador
capaz de prever a progressão da dengue clássica e formas graves da doença, faz-se necessário
um método diagnóstico que seja capaz de detectar a presença do RNA viral no soro do paciente
assim que o mesmo procure os serviços de saúde.
Neste contexto, a utilização de ferramentas moleculares que permitam identificar, no
soro do paciente, os sorotipos do DENV que estão circulando e vitimando a população poderá
contribuir significativamente para a configuração do perfil epidemiológico da doença no Estado
do Maranhão. A utilização de uma técnica que permita a identificação dos quatro sorotipos
virais em uma única reação vem de encontro aos interesses públicos, pois a localização rápida
de focos endêmicos, relacionada com o local de origem do paciente, poderá ajudar as secretarias
de vigilância epidemiológica no sentido de tomadas de ações preventivas que possam ajudar na
contenção dos focos.
39
3 OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Utilizar a técnica de Transcrição Reversa seguida pela Reação de Amplificação em
Cadeia pela Polimerase em multiplex (RT-mPCR) para detectar e diferenciar os sorotipos do
vírus da dengue em pacientes, atendidos Unidades Básicas de Saúde e Hospitais do Estado do
Maranhão.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Padronizar a técnica de multiplex-PCR para a utilização como ferramenta de
diagnóstico molecular da dengue.
 Traçar o perfil epidemiológico molecular da dengue no Estado do Maranhão.
 Identificar os sorotipos do vírus dengue que estão circulando em pacientes do Estado
do Maranhão.
40
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ASPECTOS ÉTICOS
Este projeto de pesquisa foi devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade CEUMA (CEP), parecer consubstanciado 28024/2012.
4.2 AMOSTRAS CLÍNICAS E CONTROLE DOS EXPERIMENTOS
Para a execução da pesquisa foram utilizadas ao todo 200 amostras de soro suspeito,
quatro linhagens de referência ou controle positivo (DENV-1, Hawaii; DENV-2, ThNH7/93;
DENV-3, PhMH-J1-97 e DENV-4, SLMC 318),e como controle negativo, 50 amostras de soro
de indivíduos que nunca tiveram contato com o vírus da dengue (IgG e IgM) negativas,
gentilmente cedidas pelo Dr. Mauro Martins Teixeira.
Para a investigação da infecção por dengue, utilizou-se 200 amostras de soros de casos
com suspeitas clínicas de dengue, obtidos no Laboratório Central de Saúde Pública do Estado
do Maranhão-LACEN-MA. As alíquotas de soro foram coletadas ao acaso na soroteca do
LACEN-MA. Os soros eram oriundos de pacientes atendidos em hospitais e Unidades Básicas
de Saúde do Estado do Maranhão, no período compreendido entre primeiro de janeiro de 2012
a 31 de dezembro de 2013. Os dados referentes aos pacientes, dos soros escolhidos, foram
coletados no sistema informatizado do LACEN-MA, e transferidos para uma planilha Excel
para as análises posteriores.
É importante observar que todas as 200 amostras de soro foram submetidas no LACENMA ao teste enzimático ELISA de captura de IgM com o kit PanBio®. Este kit é utilizado
rotineiramente para o diagnóstico sorológico da dengue na maioria dos LACEN do Brasil.
4.3 EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL
O RNA total foi extraído pelo Kit QIAMP RNA VIRAL (QIAGEN)® de todas as 254
amostras de soro utilizadas para o estudo. Inicialmente, em um tubo de microcentrífuga de 1,5
mL foi adicionado 140 µL do soro e 560 µL do tampão de Lise/Carreador de RNA. Após
41
homogeneização por 15 segundos em vortex a amostra foi incubada a temperatura ambiente
(15-25°C) por 10 min. Em seguida foi adicionado 800 µL de etanol (96-100%) à amostra
homogeneizando-a brevemente em vortex. Cuidadosamente, 780 µL dessa solução foi aplicada
na coluna (acoplada a um tubo coletor de 2 mL) e centrifugada a 8000 rotações por minuto
(rpm) por 1 min. A coluna foi colocada em outro tubo coletor de 2uL e adicionado 715 µL do
tampão de lavagem I, centrifugado a 8000 rpm por 1 min, descartado o sobrenadante e
adicionado 500 µL do Tampão de lavagem II, centrifugado a velocidade máxima (14000 rpm)
por 3 min e descartado o sobrenadante. A coluna foi acoplada em tubo de microcentrífuga de
1,5mL livre de RNase, adicionou-se 50 µL do Tampão. O tubo foi incubado a temperatura
ambiente por 1 min e depois centrifugado a 8000 rpm por 1 min. Depois da centrifugação o
filtrado, que é o RNA viral, foi recuperado e armazenado a -20 ou -70°C, até o uso.
4.4 REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado com o RNA extraído de todas as amostras
clínicas e dos soros controles utilizando-se um iniciador randômico C118A (Promega). A
confecção do cDNA com este iniciador randômico é uma adaptação para a técnica previamente
descrita por Lanciotti et al.(1992). Cada tubo de reação recebeu cerca de 2ug de RNA total mais
20 picomoles do iniciador, o tubo foi incubado, termociclador, a 70ºC, por 10 minutos. Em
seguida 10 minutos a 4ºC. Após a incubação em banho de gelo, foi adicionado à reação um mix
composto de: 5 ul de tampão de RT-PCR 5X (20 mM TRIS-CL pH 8,4, 50 mM KCL), 1 ul de
dNTPs (10mM), 1 ul de enzima M-MLV RT (200U/ul) (PROMEGA, USA) e 7uL de H2O.
Após homogeneização a mistura foi colocada no termociclador por duas horas a 42ºC e
posteriormente a 70ºC por 15 minutos para inativação enzimática. O cDNA obtido foi estocado
a – 20o C até o uso.
4.5 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DO VÍRUS DENGUE POR
MULTIPLEX-PCR
A fim de detectar e identificar os sorotipos circulantes no soro de pacientes foi utilizado
como molde para a amplificação por mPCR produzido no passo 4.4. A fim de padronizar a
42
reação, inicialmente foi feita uma PCR-especifica para identificar individualmente cada
sorotipo, como descrito a seguir: para o sorotipo 1 utilizou-se o iniciador senso universal D1:
5’
-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’;
mais
o
TS1:5’
-
TCTCAGTGATCCGGGGG-3’; para o sorotipo 2, usou-se o D1 mais iniciador TS2-5’ CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’; para o sorotipo 3, usou-se o iniciador D1 mais TS35’-ACATCATCATGAGACAGAGC-3’; e para o sorotipo 4, usou-se o D1 mais o D4: 5-’
GTTGTCTTAAACAAGAGAG-3’, todos esses os iniciadores foram previamente descritos
por Lanciotti et al. (1992), com exceção do D4 que foi modificado para este trabalho.
Para cada reação de 25ul foi utilizado 2,5 ul de cDNA, 2,5ul de tampão Taq 10X, 2ul
de MgCl2 (2,5 mM), 1ul de dNTP’s (10 mM) (dATP, dCTP, dTTP e dGTP), 1ul de Taq
polimerase (Promega) (5U/ul) e 10 pmol de cada oligonucleotídeo e H2O ultra pura q.s.p para
completar o volume. As amplificações foram feitas em um termociclador Perkin Elmer Cetus
(Perkin, USA®) modelo 2400 sob as seguintes condições: um ciclo inicial de desnaturação a
94ºC por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento a 54ºC por 1
minuto, extensão a 72ºC por 1 minuto, extensão final a 72ºC de 10 minutos.
4.5.1. Análise eletroforética dos produtos amplificados
Para verificar a eficiência do ensaio de PCR-específica em detectar e identificar os
sorotipos da dengue foi aplicado em gel de agarose 2%, em torno de 8ul do produto obtido, em
cada tipo de reação, acrescido de 2ul de tampão de amostra (Blue/Orange 6X Loading Dye
(Promega, EUA®). Os fragmentos foram separados por eletroforese em tampão TBE 0,5X
(Tris-borato-EDTA) [100mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido
bórico] a 85 Volts durante 1:30 horas (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS,1989). Para a
determinação do tamanho dos produtos amplificados foi incluído em cada corrida um marcador
de tamanho molecular 100 pares de base DNA ladder (PROMEGA, EUA®). Após a
eletroforese, os géis foram corados em uma solução de brometo de etídio e água destilada
(0,5µg/mL), durante 20 minutos e observados em transiluminador de UV. Os géis foram
fotografados para a documentação dos resultados.
43
4.5.2 Ensaios de amplificação por multiplex-PCR com o cDNA dos soros dos pacientes com
suspeitas clínicas de dengue.
Após a padronização, conforme descrito nos itens 4.5 e 4.5.1, foram feitos os ensaios de
amplificação por mPCR utilizando-se em cada tubo de reação a mesma quantidade de reagentes
acrescido
do
conjunto
de
iniciadores,
a
seguir:
D1:5’
-
TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’; TS1:5’ -TCTCAGTGATCCGGGGG-3’;
TS2-5’ -CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’; TS3: 5’ -ACATCATCATGAGACAGAGC3’; D4: 5-’ GTTGTCTTAAACAAGAGAG-3’. As mesmas condições de amplificação,
eletroforese e foto documentação foram utilizadas nos ensaios de mPCR.
Para se entender a metodologia empregada durante o processo de padronização deste
estudo é preciso conhecer o que a literatura considera como padrão universal de detecção e
diferenciação dos sorotipos do vírus da dengue, que é a utilização da técnica de Lanciotti et
al.(1992). Os autores utilizaram uma estratégia denominada Nested-PCR, inicialmente o RNA
viral extraído foi convertido em cDNA com a utilização do iniciador D2- 5'TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3', em seguida o cDNA obtido foi usado
como molde numa reação de amplificação por PCR-específica utilizando o conjunto de
iniciadores
(D1:5’
-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’
mais
D2-
5'-
TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3'). Após esta amplificação, uma alíquota do
produto obtido foi usado como molde numa outra reação de amplificação por PCR,
individualizada, para cada sorotipo (D1+TS1); (D1+TS2); (D1+TS3) e (D1 +TS4), do D1 ao
D4, respectivamente, com esta estratégia os autores foram capazes de diferenciar os sorotipos
entre si.
É importante ressaltar as importantes modificações introduzidas no presente estudo para
a utilização do conjunto de iniciadores descritos por Lanciotti et al (1992): (i) a produção do
cDNA molde, com um iniciador randômico (C118A) comercialmente disponível, (ii)
substituição do iniciador TS4:5’-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’ pelo iniciador D4-5’
- GTTGTCTTAAACAAGAGAG-3’, adaptado para o estudo e (iii) amplificação em multiplexPCR, ou seja, a detecção e diferenciação dos sorotipos em uma única reação.
44
4. 6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados referentes aos pacientes pesquisados obtidos no sistema eletrônico do
LACEN-MA foram tabulados em planilha Execel para análise dos dados e confecção dos
gráficos. Foi feita uma análise descritiva para todas as variáveis relevantes (gênero, faixa etária,
etnia, sinais e sintomas clínicos e sorotipos circulantes).
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. 1. PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DA DENGUE NO ESTADO DO MARANHÃO
A dengue é uma doença infecciosa de etiologia viral e de evolução aguda, cujo principal
vetor é um artrópode, o mosquito A. aegypti. Esse vetor é considerado, atualmente, o mais
importante transmissor de infecções virais em regiões tropicais e subtropicais do mundo (LUPI
et al., 2007; QUAM; WILDER-SMITH, 2013).
No presente estudo, a presença do vírus da dengue foi investigada pela técnica de RTmPCR em amostras de soro oriundas de pacientes atendidos em diferentes Unidades Básicas
de Saúde do Estado do Maranhão. No Quadro 1 estão demonstrados alguns dados
sociodemográficos que estavam disponíveis no sistema informatizado do LACEN-MA, tais
como: gênero, etnia, idade, município de origem do soro do paciente e resultado do teste
sorológico do ELISA IgM.
Quanto ao gênero mais afetado observou-se que a maioria, 150 (75%) era de pacientes
do sexo feminino (Quadro 1 e Figura 1). Nesse aspecto, a literatura relata resultados
diversificados, sendo que muitas vezes o número de casos de dengue sofre influência de alguns
fatores ambientais e sociais (FIGUEIREDO et al., 2004). Na presente pesquisa verificou-se um
predomínio no número total de casos de dengue diagnosticados no sexo feminino,
representando praticamente três vezes mais que no sexo masculino. Estes dados estão em
desacordo com estudos prévios (VACONCELOS et al., 1999; GLASSER et al., 2002; NETO;
REBÊLO, 2004) onde o gênero masculino predominou. Entretanto, Figueiredo et al. (2004) e
Assunção e Aguiar (2015) não observaram diferença estatística entre gêneros.
Com relação a esta discordância quanto ao gênero mais acometido pela dengue
observado nos municípios Maranhenses, aqui pesquisados, Barreto e Teixeira (2008) também
observaram que as mulheres foram as mais afetadas por dengue. Os autores ressaltaram que as
mulheres têm uma atividade peridomiciliar mais comum, enquanto os homens, geralmente
trabalham fora do lar.
Nesse sentido, é importante destacar que a investigação do Índice de Infestação Predial
ou LIRA, do Ministério da Saúde, apontou que é no ambiente peridoméstico onde são
encontrados os maiores focos do mosquito vetor (MS, 2015). Além disso, nota-se que, não
menos importante é o conhecimento das precárias condições de infraestrutura sanitária, que
46
despontam como requisitos importantes para a proliferação do vetor e consequentemente
transmissão do vírus, assim como os criadouros disponibilizados pelo homem como
consequência da precariedade nos serviços de coleta de lixo e abastecimento de água (TAUIL,
2001; NETO; REBÊLO, 2004).
Na Figura 2 estão mostrados os dados referentes a etnia dos pacientes, verificou-se que
o número de infecções foi maior em indivíduos da cor parda, com 153 (76, 5%) casos; enquanto
que 28 (14%) eram brancos e 19 (9,5%) eram da raça negra. Em relação a etnia, a literatura em
geral não aborda esse aspecto, e no Estado do Maranhão a predominância entre os pardos pode
ser explicada pela predominância desta população ,pois de acordo com o censo 2010, Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística (2015), o Maranhão é um dos Estados mais miscigenados
do Brasil, com 68,8 % da população auto declarada parda, seguida da etnia branca (24,9%).
(IBGE, 2015).
Quanto à distribuição de casos de dengue segundo faixa etária dos pesquisados
observou-se que indivíduos de diversas faixas etárias foram afetados, com uma grande variação
entre as idades, encontrou-se paciente com menos de um mês e até mesmo com 83 anos de
idade. Entretanto, a faixa etária com maior número 93 (46,5%) foi de pacientes entre 21 e 45
anos de idade. Resultados semelhantes a este foram encontrados por diferentes autores
(VASCONCELOS et al., 1999; FIGUEIREDO et al., 2004; ASSUNÇÃO; AGUIAR, 2015).
Convém ressaltar que essa faixa etária se manteve inalterada nos últimos 10 anos, conforme se
pode constatar quando se compara os resultados obtidos aqui com os obtidos no estudo Neto e
Rebêlo (2004) realizado no Maranhão.
No entanto, Barreto e Teixeira et al. (2008) chamaram a atenção para uma mudança no
perfil da faixa etária afetada por dengue, que até 2006 havia predominância de infectados com
idades entre 20 e 40 anos. Os autores enfatizaram uma tendência de acometimento das pessoas
mais jovens, na faixa entre 15 aos 20 anos. Em inquérito realizado nos anos de 2000 a 2007,
esse aspecto foi corroborado por Fernandes et al. (2013) que afirmaram que a presença de vasos
e utensílios domésticos com água favorecem a proliferação do mosquito, uma vez que o mesmo
tem como característica o hábito peridomicilar.
Os dados dos 200 soros com suspeitas clínicas de dengue coletados no banco de dados
do LACEN-MA mostraram o dia do início da sintomatologia, bem como o data em que o
paciente buscou o primeiro atendimento na Unidade Básica de Saúde. Estes dados foram
fundamentais para se entender os resultados da sorologia IgM feita no LACEN. Os resultados
dos testes sorológicos mostraram que 114 (57%) dos soros foram IgM positivos. Deste total, 86
47
(75,4%) eram de pacientes que procuraram o serviço de saúde, entre o primeiro e quinto dia do
surgimento o período febril, os 28 (24,6%) soros restantes, eram oriundos de pacientes que
procuraram os serviços de saúde a partir do sexto dia do surgimento da febre.
Com relação aos 12 municípios de origem dos soros, o maior número 77 (38,5%) de
soros foi proveniente de Caxias (Quadro 1). É importante ressaltar que, a taxa de positividade
encontrada para os soros, quanto aos municípios de origem estão em concordância com os
dados de boletins epidemiológicos da dengue, para o Estado do Maranhão, disponíveis no portal
do Ministério da Saúde que classificou pelo Levantamento de Índices Rápido do A. aegypti
(LIRA) a maioria destes municípios em situação de risco para a ocorrência de epidemias de
dengue (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
48
Quadro 1 - Distribuição dos casos de dengue segundo o município de notificação, no período de 2012 a 2013.
Município
Casos
Gênero Etnia (%)
P=49
(66,8)
Caxias
77
F=58 (*) N=14
(18,1)
M=19
B=14
(18,1)
F=20 (*)
Fortuna
24
M=4
P=24
(100)
Faixa etária
<1 -20=24 (F=14; M=10)
21-45=29 (F=22; M=7)
24
21-45=10 (F=9; M=1)
B=6 (25) 21-45=15 (F=12; M=3)
Codó
23
14
F=14 (*)
(#)=15
M=9
F=11 (*)
M=3
21-45=8 (F=4; M=4)
46-73=7 (F=6; M=1)
21-45=10 (F=8; M=2)
46-60=3 (F=3)
Neg=16 (F=14; M=2)
Coinfecção:DENV-1+DENV-4=2
(#)=17
Neg=17 (F=13; M=4)
Pos=8 (DENV-4=8)
(#)=15
<1 -20=1 (F=1)
P=14
(100)
Coinfecção:DENV-1+DENV-4=3
Pos=7 (DENV-1=3; DENV-4=2)
<1 -20= 8 (F=4; M=4)
P=23
(100)
Pos=33 (DENV-4=33)
Pos=8 (DENV-1=3; DENV-4=2);
F=20 (*) P=18 (75) <1 -20= 3 (F=3)
M=4
RT-mPCR/Sorotipo
Neg=44 (28F; 11M)
<1 -20=7 (F=6; M=1)
46-83= 6 (F=5; M=1)
Cantanhede
(#)=40
46-77=24 (F=23; M=1)
46-66= 7 (F=5; M=2)
Buriticupu
ELISA IgM
Neg=15 (F=7; M=8)
Pos=9 (DENV-4=4; DENV-1=3;
DENV-2=2)
(#)=5
Neg= 5 (F=4; M=1)
49
Quadro 1 (continuação) - Distribuição dos casos de dengue segundo o município de notificação, no período de 2012 a 2013.
Município
Casos
Gênero
Faixa etária
ELISA IgM
RT-mPCR/Sorotipo
Etnia (%)
Nova Olinda 12
Peri Mirim
Santa Inês
10
4
F=8 (*)
M=4
F=4
M=6
F=3 (*)
P=10 (90)
< 1 -20= 4 (F=3; M=1)
N=1 (5)
21-45=6 (F=4; M=2)
B=1 (5)
46-64=2 (F=1; M=1)
P=5 (50)
N=2 (20)
B=3 (30)
P=4 (100)
M=1
Pos=4 (DENV-3=1; DENV-4=3)
(#)=8
Neg= 8 (F=6; M=2)
<1 -20=2 (M=2)
21-45=6 (F=4; M=2)
46-70=2 (M=2)
<1 -20=1 (M=1)
(#)=5
(#)=0
21-45=2 (F=2)
Pos=5 (DENV-1=4; DENV-4=1)
Neg= 5 (F=1; M=4)
Pos=4 (DENV-1=3; DENV-4=1)
46-48= 1 (F=1)
Grajaú
2
F=1
M=1
P=2 (100)
<1 -20= 1 (M=1)
45-67= 1 (F=1)
(#)=2
Pos=0
Neg= 2 (F=1; M=1)
50
Quadro 1 (continuação) - Distribuição dos casos de dengue segundo o município de notificação, no período de 2012 a 2013.
Município
Bacabal
Casos
2
Gênero
Etnia (%)
F=1
P=2 (100)
M=1
Nina
Rodrigues
4
4
F=4
F=4
21-45=1 (F=1)
45-58 (M=1)
P=2 (50)
Cedral
Faixa etária
B=2 (50)
N=2
B=2
<1 -20=1 (F=1)
21-45=3 (F=3)
ELISA IgM
(#)=2
Pos=0
Neg= 2 (F=1; M=1)
Pos=2 (DENV-1=2)
(#)=2
Neg= 2 (F=2)
Pos=1 (DENV-1=1)
<1 – 20 = 1 (F=1)
21-45= 3 (F=3)
RT-mPCR/Sorotipo
(#)=3
Neg= 3 (F=3)
Legenda: F=Feminino; M=Masculino; P=Pardo; N=Negro, B=Branco; Pos=Positivo; Neg=Negativo; (#) =Nº de pacientes que procuraram o serviço de saúde
até o quinto dia do aparecimento da febre (n=114).
51
Figura 1 – Distribuição por gênero dos pacientes avaliados no Estado do Maranhão no período de 2012 a 2013.
Sexo
50 (25%)
150 (75%)
Masculino
Feminino
Fonte: O autor (2015)
Fugura 2 – Distribuição por etnia dos pacientes avaliados no Estado do Maranhão no período de 2012 a 2013.
Cor
19 (9,5%)
28 (14%)
153
(76,5%)
Parda
Fonte: O Autor (2015).
Branca
Negra
52
Para o diagnóstico precoce da dengue é necessário que o paciente procure os serviços de saúde
na fase inicial da sintomatologia, o que geralmente coincide com o aparecimento do período
febril e a circulação da partícula viral no sangue (KIM et al., 2015).
Com relação aos sinais e sintomas clínicos da dengue mais encontrados nos prontuários
avaliados a febre foi a mais relatada, em 184 (92%) dos casos, em seguida a cefaleia em 135
(67,5%), a mialgia em 124 (62%), a prostração em 112 (56%), a dor retroorbital em 100 (50%),
vômitos em 84 (42%), a artralgia em 61 (30,5%), a dor abdominal em 55 (27,5%), o exantema
em 40 (20%), o prurido em 32 (16%), a anorexia em 30 (15%) e a presença de petéquias em 17
(8,5%).
As manifestações clínicas da dengue podem variar desde quadros assintomáticos, febres
autolimitadas que geralmente se resolvem entre 3 a 7 dias e manifestações mais graves como o
choque hemorrágico da dengue e disfunção de órgãos (SIMMONS et al., 2012). Nesse sentido,
os resultados obtidos aqui estão de acordo com os dados de Xavier et al. (2014) que constataram
a presença de febre em cerca de 98% dos casos, seguida de cefaleia (95%) e mialgias (93%),
sendo que a dor retroobitária foi o quinto sintoma mais frequente, enquanto no presente estudo
esta foi a quarta queixa mais referida.
5.2 AMPLIFICAÇÃO POR MULTIPLEX-PCR DO MATERIAL GENÉTICO EXTRAÍDO
DOS SOROS DOS PACIENTES COM DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE SUSPEITA DE
DENGUE
5.2.1. Padronização da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em multiplex-PCR
(mPCR)
Nos últimos anos, inúmeras técnicas de biologia molecular têm sido testadas, em
laboratórios de pesquisa em todo mundo, para a detecção e ou identificação das infecções por
dengue em espécimes clínicos, principalmente a partir do soro. Entre essas metodologias a
Reação de Transcrição reversa seguida pela amplificação por PCR, tem se destacado por ser
um método rápido, sensível e específico (BHATNAGAR et al., 2012; DENGUE BULLETIN,
2013).
53
No presente estudo a padronização da Transcrição Reversa seguida pela PCR em
multiplex foi efetuada com sucesso, para tal, utilizou-se as modificações na metodologia de
Lanciotti et al. (1992) como descrito no item 4.5.2. Os resultados da amplificação com os
iniciadores específicos para dengue e o cDNA molde produzido com o iniciador randômico,
produziu perfis específicos para as quatros linhagens de referência, sorotipos de 1 a 4, do vírus
dengue. A RT-mPCR foi eficaz, amplificando em uma única reação, os fragmentos específicos
de tamanhos de 482 nucleotídeos (nt) para o DENV-1, de 119 nt para o DENV-2, de 290 nt
para o DENV-3 e de 392 nt para o DENV-4. Ou seja, a padronização da técnica de mPCR
mostrou um perfil eletroforético capaz de diferenciar os quatros sorotipos do DENV entre si
(Figura 3). Além disso, não houve amplificação dos controles negativos pelo RT-mPCR.
Em seguida a padronização, o cDNA produzido com o RNA extraído das 200 amostras
de soros, de pacientes com suspeita de dengue, foi submetido à amplificação pela mPCR. Os
resultados mostraram fragmentos específicos para a presença do RNA do dengue nos 86 soros
oriundos de pacientes que estavam na fase aguda da dengue, ou seja, no período virêmico, entre
o primeiro e o quinto dia do período febril. Além disso, o cDNA dos 50 soros IgM e IgG não
reagentes, utilizados como controles negativos não amplificaram e as quatro linhagens de
referência, utilizadas como controles positivos, foram amplificadas em todas as reações de RTmPCR.
A Figura 4, mostra alguns perfis de amplificação por mPCR obtidos com o cDNA
produzido a partir do RNA extraído de amostras de soro de pacientes com suspeitas clínicas de
dengue. Os resultados obtidos aqui concordam com a Organização Mundial de Saúde (WHO,
2009), que considera como diagnóstico definitivo de dengue, o isolamento viral, a detecção de
antígenos virais, a detecção de anticorpos específicos e a presença do RNA viral por métodos
moleculares.
Segundo Muñoz-Jordán et al. (2009) a RT-PCR é mais sensível em detectar a partícula
viral na fase aguda da dengue, entre o primeiro e o quinto dia do surgimento da febre, ou seja,
no período virêmico. Os autores ressaltaram que além dessa limitação, alguns fatores podem
também interferir na sensibilidade dos métodos moleculares em detectar a partícula viral do
dengue, tais como: a temperatura da amostra durante o transporte e armazenamento,
procedimentos de extração do RNA, ou do método de detecção dos produtos da PCR. Além
disso, a configuração em multiplex PCR pode influenciar negativamente na sensibilidade
quando comparada ao sistema único de amplificação (MUÑOZ-JORDÁN et al., 2009).
54
Quanto a identificação dos sorotipos circulantes constatou-se que o sorotipo 4 foi o mais
encontrado, com 59 (68,6%) das detecções, sendo encontrado como único sorotipo infectante
em 54 dessas detecções, e em 5 casos de coinfecções com o sorotipo 1. O segundo sorotipo
mais identificado foi o sorotipo 1, em 19 (22%) dos soros, mais as referidas cinco coinfecções
com dengue sorotipo 4. O sorotipo 2 foi encontrado em dois soros e o sorotipo 3 em apenas um
soro (Quadro 1 e Figura 4).
O sorotipo 4 foi introduzido no Estado do Maranhão no final do ano de 2011, e apesar
das notificações de novos casos de dengue terem diminuído, entre 2012 e 2013, é importante
observar que houve um total de 29 notificações de febre hemorrágica do dengue, a forma mais
grave da doença, no período estudado, o que correspondeu a nove óbitos (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2015).
A recente introdução do sorotipo 4 pode ser considerada como um importante fator de
risco para o aumento de novos casos de FHD, pois segundo a literatura, aqueles indivíduos que
experimentarem a infecção pelo DENV mais de uma vez têm uma possibilidade mais elevada
de desenvolver a FHD (SANGKAWIBHA et al.,1984; THEIN et al.,1997; CHUAN-LIANG et
al., 2005). A teoria da infecção sequencial pelos vírus da dengue se caracteriza pela
imunoamplificação dependente de anticorpos pré-existentes e tem sido amplamente aceita
(MAIRUHU et al., 2004; KYLE; HARRIS, 2008). Na teoria sequencial, a febre hemorrágica
do dengue ocorre após epidemias de febre clássica do dengue, realidade essa, vivenciada no
Brasil, nos últimos 20 anos.
55
Figura 3. Perfis eletroforéticos dos produtos da multiplex-PCR obtidos com o cDNA dos controles positivos e
iniciadores específicos para os quatro sorotipos do vírus da dengue.
PM
D1
D2
D3
D4
500
400
300
250
200
150
100
50
Legenda: Gel de agarose 2% corado com brometo de etídio mostrando os perfis dos produtos da mPCR
de DENV1 (482pb); DENV2 (119 pb); DENV3 (290pb) e DENV4 (392 pb). PM=padrão molecular 50
pares de bases (50pb DNA ladder, Promega).
Figura 4. Perfis eletroforéticos dos produtos da mPCR obtido com o cDNA de amostras de referência (DENV-1
e DENV-4) e de diferentes amostras de soros de pacientes de municípios maranhenses
Legenda: Gel superior: Perfis eletroforéticos dos produtos da mPCR obtido com o cDNA dos controles positivos
DENV1 e DENV4 e das amostras de soro (103,143,149, 163,150,14,13279,1244 e 13305) de pacientes do estudo.
CN refere-se ao perfil de um dos soros controle negativo. 50pb marcador de tamanho molecular. Gel inferior:
Perfis eletroforéticos: 100pb (marcador de tamanho molecular), D4 controle positivo e amostras: 11, 104, 105,
148, 149, 160, 198 e 231, todas com perfil de D4. Mix refere-se ao controles dos reagentes utilizados para fazer
as reações de mPCR. 100pb DNA ladder (Promega).
56
Quanto aos municípios de origem das amostras de soro, dos 217 municípios que
compõem o Estado do Maranhão, apenas 12 tiveram amostras avaliadas, uma vez que a seleção
dos soros ocorreu ao acaso. Dos municípios pesquisados, os que apresentaram maior número
de pacientes com diagnósticos molecular positivos para dengue foram: Caxias com 33 casos,
sendo todos do sorotipo 4, seguido de Codó com 9 soros positivos, seguido de Fortuna,
Cantanhede e Buriticupu. Os casos de coinfecção foram verificados em 5 (5,8%) destes soros,
sendo o material genético dos sorotipos 1 e 4, encontrado em três amostras do município de
Fortuna e em duas de Buriticupu (Quadro 1).
Os resultados dos testes sorológicos e moleculares foram correlacionados entre si, e
observou-se que a sensibilidade do ELISA em detectar os anticorpos IgM da fase aguda da
dengue foi de 75,4% (n=86), enquanto o RT-mPCR mostrou uma sensibilidade de 100% ao
amplificar o RNA viral de todos esses soros. Os resultados das amplificações por RT-mPCR
para o RNA extraído dos soros oriundos de pacientes que procuraram os serviços de saúde a
partir do sexto dia do surgimento da febre, foram semelhantes ao do ELISA IgM, ou seja, não
houve detecção da partícula viral em nenhum destes soros.
É importante notar que o método imunoenzimático ELISA de captura de IgM da PanBio
(PanBio Diagnóstico Inc, Austrália) é utilizado rotineiramente para o diagnóstico sorológico da
dengue no LACEN-MA. Este kit detecta apenas os níveis de anticorpos do tipo IgM após o
terceiro dia do início do período febril. Logo, não detecta a presença da partícula viral, mas
apenas a resposta do hospedeiro à infecção. Neste sentido, os resultados obtidos aqui estão de
acordo com Kim et al. (2015) que também observaram uma sensibilidade de 57% para o este
kit de ELISA. Além disso, estes autores afirmaram que a sensibilidade em diagnosticar a
presença do RNA viral em amostras clínicas, por técnicas de PCR, está diretamente relacionada
com o aparecimento dos sintomas clínicos, ou seja, o período febril, que geralmente ocorre
entre o primeiro e o quinto dia da dengue.
Neste sentido, a metodologia RT-mPCR padronizada no presente estudo foi 100%
sensível em detectar a presença da partícula viral em todos os soros de pacientes que procuraram
o hospital entre o primeiro e o 5º dia do aparecimento da febre. Ferraz et al. (2013), usando um
ensaio de multiplex-PCR em tempo Real, com dois pares iniciadores, considerados Pandenv,
obtiveram uma taxa de 89% de sensibilidade para amostras de onde o vírus da dengue foi
isolado, em células C636 (mosquito A. albopicus). Por outro lado, estes autores observaram
uma taxa de 76,2% de positividade para amostras de soro obtidas de pacientes, com uma média
57
de três dias após a instalação do período febril, o que corresponde à fase aguda da dengue, onde
o vírus ainda está na corrente sanguínea.
No presente estudo observou-se que os enfermos dos quais os dados foram coletados,
procuraram tardiamente as Unidades Básicas de Saúde, consequentemente, isso dificultou e ou
impossibilitou a detecção da partícula viral em todas as 200 nas amostras de soro. Este aspecto,
provavelmente retrata a realidade da saúde de um modo geral no Brasil, onde a maioria dos
doentes busca o atendimento médico somente após o agravamento dos sintomas,
impossibilitando assim, um provável diagnóstico na fase aguda da dengue.
Outros importantes fatores a serem considerados aqui são: a coleta, o acondicionamento
e o transporte adequados do espécime clínico a ser utilizado para o diagnóstico da dengue, uma
vez que o sucesso dos métodos moleculares de diagnóstico é dependente de vários fatores, entre
os quais a qualidade da amostra clínica pode ser considerada como fator determinante para a
presença da partícula viral no soro do paciente. Além disso, uma amostra clínica coletada e
mantida em condições inadequadas praticamente impossibilita o isolamento viral, bem como a
detecção da partícula viral no espécime clínico, principalmente no soro, que é utilizado não
somente para a detecção de anticorpos anti-dengue, mas também para a sua detecção por
metodologias moleculares (KIM et al., 2015).
6 CONCLUSÕES
No presente estudo foram estabelecidas as condições de padronização da técnica de
extração do RNA viral e amplificação por RT-mPCR. Apesar do baixo número de amostras
analisadas foi possível delinear o perfil epidemiológico molecular dos sorotipos do vírus da
dengue que estão circulando na população do Estado do Maranhão. Observou-se que houve
uma disseminação muito rápida do sorotipo 4, bem como a manutenção da circulação dos
demais sorotipos, sendo o DENV-1 o segundo mais detectado.
A metodologia proposta aqui mostrou-se 100% sensível em detectar ao material
genético no soro de indivíduos na fase aguda da dengue, ou seja, pelo menos a partir do primeiro
dia do surgimento do período febril. Além disso, houve 100% de reprodutibilidade dos
resultados, uma vez que as amostras de referências utilizadas como controles, apresentaram-se
58
sempre positivas nas inúmeras reações de amplificação, e as amostras clínicas de paciente
sabidamente fora do período de viremia se mostraram negativas, indicando assim, o sucesso da
padronização da técnica.
A somatória dos resultados apontaram a necessidade de campanhas educacionais no
sentido de orientar a população para que a mesma procure os serviços básicos de saúde, logo
após o aparecimento dos primeiros sinais e sintomas sugestivos de dengue. Este simples gesto
poderá facilitar o serviço de vigilância epidemiológica no sentido de se conhecer o número real
de pessoas que são infectadas anualmente no Brasil, bem como permitir que métodos
moleculares de diagnóstico sejam implementados, uma vez que o sucesso dos mesmos é
dependente da presença da partícula viral, geralmente circulante a partir de um dia antes do
surgimento do período febril, e se estendendo até no máximo ao quinto dia da febre.
59
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68
ANEXO A – COMPROVANTE DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM FORMA DE
POSTER NO I CONGRESSO NORTE/NORDESTE DE DOENÇAS NEGLIGENCIADAS
E REEMERGENTES, 2015. (POSTER) IDENTIFICAÇÃO POR MULTIPLEX PCR DOS
SOROTIPOS DO VIRUS DA DENGUE EM AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES
ATENDIDOS EM HOSPITAIS DE SÃO LUIS MARANHÃO.
69
ANEXO B – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO CIENTÍFICO
SUBMETIDO À REVISTA PATOLOGIA TROPICAL. TÍTULO: LEVANTAMENTO
EPIDEMIOLÓGICO DE CASOS DE DENGUE NO MUNICÍPIO DE SÃO LUÍS,
MARANHÃO, BRASIL, 2002 – 2012.
70
ANEXO C – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE TRABALHO EM FORMA DE
POSTER AO 28º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA 2015. TÍTULO DO
TRABALHO: DEVELOPMENT AND EVALUATION OF A DIAGNOSTIC TEST FOR
THE DETECTION AND DIFFERENTIATION OF THE DENGUE VIRUS SEROTYPES.