solubilização de fosfato inorgânico por bactérias diazotróficas sob

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO INORGÂNICO POR
BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS SOB DIFERENTES DOSES DO
PESTICIDA FIPRONIL
ADIJAILTON JOSÉ DE SOUZA(1); FLAVIANA GONÇOLVES DA SILVA(2); ISANELI
BATISTA DOS SANTOS(2);
ANDREZA RAQUEL DE BORBOSA DE FARIAS(2); JOÃO TIAGO CORREIA
OLIVEIRA(3); FERNANDO JOSÉ FREIRE(4); JÚLIA KUKLINSKY-SOBRAL(5)

Introdução
A cultura da cana-de-açúcar é uma atividade econômica de enorme importância no cenário nacional, devido aos
seus amplos potenciais industriais, tanto na produção de açúcar, como na produção de etanol. Com uma área estimada
em 8.520,5 mil hectares e produção prevista de 595,13 milhões de toneladas (Conab, 2013). Devido ao significado e
importância na ecomonia nacional, são vários os estudos voltados para o aumento do desempenho agronômico da
cultura, bem como, a buscar por uma produção sutentável. O alto desempenho da cana-de-açúcar está atribuído às boas
condições edafoclimáticas que o Brasil oferece para a cultura e aos manejos de pragas e doenças. (SOUZA, et al.,
2013).
De acordo com Lira-Cadete et al. (2012), alguns micro-organismos, principalmente as bactérias, apresentam a
capacidade de se associar às plantas e estimular o desenvolvimento destas e portanto, torna-se importante a
bioprospecção de isolados bacterianos com potencial para promover o desenvolvimento vegetal, que atuem com
eficiência na solubilização de fosfato, contribuindo para um manejo sustentável da cana-de-açúcar.
O fósforo é um elemento que assume papel importnte na manutenção do metobolismo vegetal, sendo um
componente integral de compostos importantes das células vegetais, incluindo fosfato-açucares intermediários da
respiração e fotossíntese, bem como os fosfolipídios que compõem as membranas vegetais. É também componente de
nucleotídeos utilizados no metabolismo energético das plantas (como ATP) e no DNA e RNA (TAIZ & ZEIGER,
2004). Nesse sentido, o trabalho objetivou avaliar o comportamento de linhagens bacterianas mediante a presença do
pesticida fipronil no meio de cultura sobre a solubilização de fosfato inorgãncio in vitro.
Material e métodos
Foram avaliadas dez linhagens bacterianas diazotróficas da coleção do Laboratório de Genética e
Biotecnologia Microbiana (LGBM), isoladas e identificadas por Lima (2012) (Tabela 1).
As bactérias foram inoculadas em meio de cultura sólido, rico em fosfato de cálcio (SANTOS et al., 2012) e
acrescido de diferentes concentrações do pesticida fipronil: 0, 100, 200 e 400 g.ha -1, incubadas a 28°C por cinco dias. A
formação de área clara, halo, ao redor das colônias indicou a solubilização do fosfato. Todo o experimento foi realizado
em triplicata e para os isolados que apresentaram halo visível, foi estimado o índice de solubilização (IS), que expressa
a relação do diâmetro médio do halo de solubilização e o diâmetro médio do halo da colônia. E ainda com essa relação
pode-se classificar o IS como baixo (IS<2), médio (2≤IS<4) e alto (IS>4). As variáveis avaliadas no experimeto foram
concentração do pesticida e o tempo de exposição dos isolados bacterianos ao pesticida. Os dados dos índices de
solubilidade foram submetidos a análise de variância (ANOVA), e as médias foram comparadas através do teste de
Scott-Knott (P<0,05), pelo o software estatístico SISVAR® versão 5.3.
Resultados e Discussão
Para o teste de solubilização de fosfato inorgânico in vitro, sob três concentrações do pesticida fipronil e o
controle (ausência do pesticida) em função do tempo de cultivo, foi observado que todas as linhanens bacterianas foram
capazes de solubilizar fosfato mesmo quando expostas a presença do pesticida fipronil (tabela 2). Quando comparada a
relação índice de solubilização (IS) de fosfato, verificou-se que a maioria das linhagens apresentou um IS considerado
baixo (IS<2), exceto a linhagem UAGC 867, Burkholderia sp., que se destacou nas concentrações de 100 g.ha-1 de
fipronil, apresentando os repectivos índices de solubilização de fosfato de 2,27 e de 2,04. Foi observado também que o
tempo de cultivo foi um fator crucial para a expressão do potencial da solublização de fosfato por parte dos bactérias
testadas.
________________
(1)
Discente de Graduação em Agronomia, Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana (LGBM), Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG),
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. E-mail:
[email protected]; (2)Mestranda do programa de Pós-Graduação em Produção Agrícola, LGBM/UAG/UFRPE; (3)Doutorando do programa
Doutorado Integrado de Zootecnia da UFRPE; (4)Professor Adjunto, Departamento de Agronomia, UFRPE, Rua Dom Manoel de Medeiros, Dois
Irmãos, Recife, PE, 52171-900; (5)Professora Adjunta, Tutora Bolsista do Grupo PET Biotecnologia, LGBM/UAG/UFRPE
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Observou-se também que o tempo de exposição ao pesticida fipronil foi um fator limitante para a solubilização de
fosfato inorgânico, mesmo que não tenha inibido totalmente a solubilizaçaõ do fosfato, mas provocou uma redução
significatica nos índices de solubilização(IS) (Figura 1). Em estudo da variabilidade genética de bactérias diazotróficas
associadas a plantas de cana-de-açúcar capazes de solubilizar fosfato inorgânico, Lira-Cadete et al. (2012), observou
que a maior frequência de isolados capazes de solibilizar fosfato inorgânico in vitro se em contraram no nicho da raiz
com uma frequência de linhagens solubilizadoras de fosfato, acima de 84%, seguido da folha e rizoplano. Avaliando-se
o IS apenas das bactérias solubilizadoras, foi observado que 36% foram classificadas com médio IS e linhagens de baixo
e alto IS com 24% e 15% , respectivamente.
Pode ser verificado que após 15 dias de cultivo em meio rico em fosfato de cálcio e acrescido das
concentrações do pesticidas, os efeitos mais acentuados foram observados nas concentrações 100 g.ha -1 , apresentando
redução no (IS) de seis bactérias (tabela 2), 200g.ha-1 tendo sete linhagens com o potencial de solubilização afetado
quando comparadas as leituras de 5 dias após a inoculação (5 DAI) e 15 dias após a inoculação (15 DAI) (tabela 2).
Observou-se ainda que houve uma estabilidade do diâmentro do halo solubilização que apresentou acrescimos mínimos
em relação a primeira leitura, para algumas linhagens, fator esse que pode explicar o menor índice de solubilização de
fosfato ao longo das leituras de 10 e de 15 dias após a inoculação.
Os resultados do teste estatístico para o índice de solubilização de fosfato inorgânico in vitro se mostraram
significativos para as linhagens UAGC 895 (Burkholderia sp.) na leitura cinco dias após a inoculação (5 DAI) quando
exposta à concentração de 100 g ha-1 do pesticida fipronil, essa mesma linhagem apresentou-se nos tempos de exposição
de dez dias após a inoculação (10 DAI) e quinze dias após a inoculação (15 DAI), diferença estatística apenas sobre o
controle (0 g ha-1 do pesticida fipronil), as demais linhagens do gênero Burkholderia sp. (UAGC 587, UAGC 867,
UAGC 904 e UAGC 913) e gênero Enterobacter sp. (UAGC 903), não apresentaram diferença estatística entre as
médias do índice de solubilização de fosfato inorgânico, no tempo de exposição de cinco dias após a inoculação (5 DAI)
nos níveis de tratamento (0, 100, 200 e 400 g ha -1 do inseticida fipronil) (tabela 2).
Nos tempo de dez dias e quinze dias após a inoculação (10 DAI e 15 DAI), os isolados bacterianos do gênero
Burkholderia sp. (UAGC 867) e o gênero Enterobacter sp. (UAGC 903), apresentaram-se diferentes estatisticamente no
nível de tratamento de 200 e 400 g ha-1 do pesticida, respectivamente (tabela 2). Em estudo avaliando os efeitos desse
pesticida sobre a comunidade bacteriana dos solos cultivados com cana-de- açúcar SOUZA et al. (2011), verificaram
que o pesticida fipronil não exerceu influência significativa na comunidade, mas que possivelmente deve ter selecionado
grupos específicos, verificou-se também que o tempo de exposição ao microcosmo foi um fator preponderante para
incidência de maior diversidade bacteriana.
A linhagem do gênero Pantoea sp., no tempo de exposição (5 DAI) apresentou um incremente no índice de
solubilização na presença da concentração de 100 gha -1 que se mostrou significativo aos demais tratamentos, já para os
tempos de exposição ao pesticida (10 DAI) e (15 DAI), ocorreu um severa redução no índice de solubilização na
tratamento de 400 g ha-1 e não houve diferença significativa entre as médias, respectivamente. Para o gênero Erwinia sp.
não notou-se diferença estatística entre as medias do índice de solubilização de fosfato em nenhum dos níveis de
tratamento nos tempos de exposição ao pesticida de (5 DAI) e (10 DAI), enquanto que no tempo (15 DAI), houvesse
uma queda significativa na media do IS do controle e no nível de 100 g ha -1(tabela 2). A linhagem UAGC 869
(Stenotrophomonas sp.) apresentou um decréscimo significativo do IS na concentração de 400 g ha-1 do pesticida nos
tempos (10 DAI) e (15 DAI), a linhagem UAGC 895 (gênero não identificado) foi a que mais sofreu com os efeitos da
tempo de exposição e a presença do pesticida fipronil.
Portanto, diferentes concentrações do pesticida fipronil influenciaram na expressão da solubilização de
fosfato inorgânico, in vitro, de bactérias promotoras de crescimento vegetal associadas a plantas de cana-de-açúcar.
Agradecimentos
Agradecemos ao CNPq e a FACEPE pelo apoio financeiro.
Referências
[1] LIMA, D.R.M. Bactérias fixadoras de nitrogênio associadas a plantas de cana-de-açúcar cultivadas em
Pernambuco. Dissertação (Mestrado em Ciências do Solo) – Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Departamento Agronomia, Recife, 110fl. 2012.
[2] LIRA-CADETE, L.; FARIAS, A. R. B.; RAMOS, A. P. S.; COSTA, D. P., FREIRE, F. J.; KUKLINSKYSOBRAL, J. Variabilidade genética de bactérias diazotróficas associadas a plantas de cana-de-açúcar capazes de
solubilizar fosfato inorgânico. Bioscience Journal, Uberlândia, v. 28, Supplement 1, p. 122-129, Mar. 2012.
[3] SANTOS, I. B.; LIMA, D. R. M.; BABORSA, J. G.; OLIVEIRA, J. T. C.; FRIERE, F. F.; KUKLINSKYSOBRAL, J. Bactérias diazotróficas associadas a raízes de cana-deaçúcar: solubilização de fosfato inorgânico e
tolerância à salinidade. Bioscience Journal, Uberlândia, v. 28, Supplement 1, p. 142-149, Mar. 2012.
[4] MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do solo. Minas Gerais: Editora UFLA, 2006.
729p.
[5] PEREIRA, A. P. A.; SILVA, M. C. B.; OLIVEIRA, J. R. S.; RAMOS, A. P. S.; FREIRE, M. B. G. S.; FREIRE, J.
F.; KUKLINSKY-SOBRAL, J. Influência da salinidade sobre o crescimento e a produção de ácido indol acético de
burkholderia spp. Endofíticas de canade-açúcar. Biosci. J., Uberlândia, v. 28, Supplement 1, p. 112-121, Mar. 2012
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
[6] SOUZA, A.J.; TSCHOEKE, B.A.P.; SILVA, J.A.T.; SANTOS, C.G.G.; FREIRE, F.J.; KUKLINSHY-SOBRAL,
J. Solubilização de fosfato inorgânico por bacterias do gênero burkholderia sp. In vitro na presença do pesticida
fipronil. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O PROGRESSO DA CIÊNCIA, 65, Recife,
2013. Anais... Recife, Sociedade Brasileira Para o Progresso da Ciência.
[7] SOUZA, A.J. TSCHOEKE, B.A.P., RAMOS, A.P.S., FREIRE, F.J., SOBRAL, J.K. Influência do inseticida
fipronil sobre a comunidade bacteriana do solo cultivado com cana-de-açúcar em Pernambuco. In: XXXIII
CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO SOLO, 33., Uberlândia, 2011. Anais XXXIII Congresso Brasileiro
de Ciência do Solo. Uberlândia, Sociedade Brasileira de Ciências do Solo.
[8] TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. Porto Alegre: Artmed, 2004. p.95-113.
Tabela 1. Origem e identificação de bactérias diazotróficas associadas a plantas de cana-de-açúcar (LIMA, 2012).
Origem
Linhagem
Identificação
Nicho
Variedade
UAGC 857
Burkholderia sp.
endofítico de raiz
RB92579
UAGC 858
Pantoea sp.
endofítico de raiz
RB92579
UAGC 865
Erwinia sp.
endofítico de raiz
RB92579
UAGC 867
Burkholderia sp.
endofítico de raiz
RB867515
UAGC 869
Stenotrophomonas sp.
endofítico de raiz
RB867515
UAGC 890
―
rizosfera
RB92579
UAGC 895
Burkholderia sp.
endofítico de raiz
RB867515
UAGC 903
Enterobacter sp.
rizosfera
RB867515
UAGC 904
Burkholderia sp.
rizosfera
RB867515
UAGC 913
Burkholderia sp.
rizosfera
RB867515
Tabela 2. Índice de Solubilização (IS) das bactérias UAGC857, UAGC858, UAGC865, UAGC867, UAGC869,
UAGC890, UAGC895, UAGC903, UAGC904 e UAGC913 em meio de cultura com diferentes concentrações do
pesticida fipronil: 0 g.ha-1, 100 g.ha-1, 200 g.ha-1 e 400 g.ha-1 e o tempo de exposição: 5 (DAI) = 5 dias após a
inoculação, 10 (DAI) = 10 dias após a inoculação e 15 (DAI) = 15 dias após a inoculação. Os indices (a e b) e (c e d)
em mesma linha indicam diferença estatística pelo teste de Scoott-Knott a 5% de confiabilidade para as variáveis:
concentração do pesticida e tempo de exposição ao pesticida, respectivamente.
Solubilização de Fosfato Inorgâncio - Em Meio Fosfato de Cálcio
Identificação
Burkholderia sp.
Pantoea sp.
Erwinia sp.
Burkholderia sp.
L 5 (DAI)
L 10 (DAI)
L 15 (DAI)
Fipronil (g.ha-1 )
Fipronil (g.ha -1 )
Fipronil (g.ha-1 )
0
100
200
400
0
100
200
1,545 a d 1,526 a d 1,682 a d 1,591 a c 1,649 a c 1,607 a d 1,312 a d
1,432 a d 1,883 b d 1,389 a d 1,411 a c 1,686 b c 1,650 b d 1,633 b d
1,504 a d 1,630 a d 1,684 a d 1,800 a c 1,487 a c 1,442 a d 1,542 a d
1,327 a d 1,851 a d 1,527 a d 1,379 a c 1,838 b c 2,274 b d 1,605 a d
Stenotrophomonas sp. 1,570 a d 1,616 a d 1,854 a d 1,406 a c 1,642 b c 1,731 b d 1,440 b d
―
0,874 a c 1,230 b c 0,913 a c 1,463 b c 1,382 b c 1,289 b c 0,915 a c
Burkholderia sp.
1,776 b d 0,976 a c 1,514 b d 1,846 b c 1,512 b c 0,762 a c 0,448 a c
Enterobacter sp.
1,546 a d 1,471 a d 1,442 a d 1,368 a c 1,722 b c 1,631 b d 1,677 b d
400
0
100
200
400
1,379 a d 1,729 a c 1,536 a d 1,333 a d 0,944 a c
0,430 a c 1,916 a c 1,726 a d 1,688 a d 1,112 a c
1,496 a d 0,805 a c 0,797 a c 1,652 b d 1,895 a c
1,210 a d 1,569 b c 2,004 b d 0,997 a d 0,977 a c
0,857 a c 1,604 b c 1,621 b d 1,449 b d 0,422 a c
0,480 a c 1,308 a c 0,809 a c 0,492 a c 0,439 a c
0,933 a c 1,339 b c 0,434 a c 0,416 a c 0,484 a c
Burkholderia sp.
0,950 a c 1,677 a c 0,998 a c 1,118 a d 0,982 a c
1,549 a d 1,437 a d 1,660 a d 1,864 a c 1,420 a c 1,522 a d 1,381 a d 0,895 a c 1,437 a c 1,529 a d 1,467 a d 0,935 a c
Burkholderia sp.
1,498 a d 1,664 a d 1,579 a d 1,674 a c 1,598 a c 1,101 a c 1,441 a d 0,802 a c 1,584 a c 1,119 a c 1,447 a d 0,863 a c