Marta Halfeld Ferrari Alves Lacordia ESTUDO COMPARATIVO DA

Marta Halfeld Ferrari Alves Lacordia
ESTUDO COMPARATIVO DA AÇÃO DA TOXINA
BOTULÍNICA TIPO A E DA CROTOXINA SOBRE AS
CÉLULAS SATÉLITES DA MUSCULATURA EXTRÍNSECA
OCULAR EM MODELO ANIMAL
Belo Horizonte
Faculdade de Medicina da UFMG
2007
2
Marta Halfeld Ferrari Alves Lacordia
ESTUDO COMPARATIVO DA AÇÃO DA TOXINA
BOTULÍNICA TIPO A E DA CROTOXINA SOBRE AS
CÉLULAS SATÉLITES DA MUSCULATURA EXTRÍNSECA
OCULAR EM MODELO ANIMAL
Tese
apresentada
ao
Curso
de
Pós-Graduação
em
Medicina, área de Oftalmologia, da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial à obtenção do grau de Doutor em Medicina.
Orientador: Prof. Dr. Henderson Celestino de Almeida
Co-orientador: Prof. Dr. Geraldo de Barros Ribeiro
Belo Horizonte
2007
3
L143e
Lacordia, Marta Halfeld Ferrari Alves
Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre as células satélites da musculatura extrínseca ocular em modelo animal. / Marta Halfeld Ferrari Alves Lacordia. – 2007.
140 f.
Orientador: Henderson Celestino de Almeida
Co-orientador: Geraldo de Barros Ribeiro
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina.
1. Músculos oculomotores. 2. Células satélites de músculo esquelético. 3. Toxina botulínica Tipo A. 4. Crotoxina 5. Estudo comparativo
6. Animais. I. Almeida, Henderson Celestino de. II. Ribeiro, Geraldo
de Barros. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. IV. Título.
NLM: WW 400
CDU: 617.7
4
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Reitor
Prof. Ronaldo Tadêu Pena
Pró-Reitor de Pós-Graduação
Prof. Jaime Arturo Ramirez
Pró-Reitor de Pesquisa
Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares
Diretor da Faculdade de Medicina
Prof. Francisco José Penna
Diretora do Hospital das Clínicas
Profª. Tânia Mara Assis Lima
Coordenador do Centro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina
Prof. Carlos Faria Santos Amaral
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Oftalmologia
Prof. Joel Edmur Boteon
Chefe do Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia
Profª. Ana Rosa Pimentel de Figueiredo
Membros do Colegiado do Curso de Pós-Graduação em Medicina, área de Oftalmologia
Prof. Fernando Oréfice
Prof. Henderson Celestino de Almeida
Prof. Homero Gusmão de Almeida
Prof. Joel Edmur Boteon
Prof. Márcio Bittar Nehemy
Prof. Marco Aurélio Lana Peixoto
Prof. Sebastião Cronemberger Sobrinho
Representante discente: Leonardo Rodrigues Pereira
5
6
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, Amaury, pelo amor incondicional e pelo exemplo de vida, de caráter
e de força.
À minha mãe, Dalva, também pelo amor, carinho e apoio constantes.
À minha irmã, Mírian, pela amizade e pela maneira de estar sempre presente na
minha vida, apesar da distância geográfica.
Ao meu irmão, Mauro, pelo modelo de dedicação aos estudos e à profissão.
Ao meu marido, Roberto, pelo amor, pelo companheirismo e por nunca ter me
deixado desistir.
E especialmente à minha filha, Raquel, que veio junto com este meu sonho,
trazendo mais alegria para a minha vida.
Eu te quero a todo instante
Nem mil alto-falantes
Vão poder falar por mim.
Eu não existo longe de você
E a solidão é meu pior castigo
Eu conto as horas
Pra poder te ver
Mas o relógio tá de mal comigo
Abdullah/ Cacá Moraes
7
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me poupado a vida e por ter me dado forças para continuar minha
missão.
Ao Professor Dr. Henderson Celestino de Almeida, pelo incentivo, pela dedicação,
pelo carinho e por ter contribuído tanto para meu aprimoramento científico e para a realização
deste grande sonho.
Ao Professor Dr. Geraldo de Barros Ribeiro, pela disponibilidade, pela competência,
pela simplicidade e por sua extraordinária orientação.
Ao Dr. Carlos Henrique Reis de Araújo Silva, médico veterinário e diretor da
Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC
Campus VI – Juiz de Fora), pelo grande auxílio prestado no desenvolvimento deste trabalho,
pela excelência e pelo profissionalismo.
Ao Dr. Raul Fernando Binato Lamim e à Dra. Maria do Carmo Jordão Coelho,
professores adjuntos do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Juiz de Fora, pelo auxílio no estudo imunoistoquímico.
Ao Dr. Márcio José Martins Alves, professor adjunto do Departamento de Saúde
Coletiva da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Juiz de Fora, pela dedicação e
pela disponibilidade em ajudar na realização deste estudo.
À Dra. Maria de Lourdes Motta Moreira Villas Boas, por ter despertado em mim o
gosto pelo estudo do estrabismo e pelo privilégio de tê-la como amiga.
Ao Dr. Galton Carvalho Vasconcelos, pelos constantes incentivos.
Ao Professor Dr. Joel Edmur Boteon, coordenador do Curso de Pós-Graduação em
Oftalmologia da Faculdade de Medicina da UFMG, por ter acreditado em mim e por ter me
apoiado sempre.
8
Ao Professor Dr. Márcio Bittar Nehemy, subcoordenador do Curso de Pós-Graduação
em Oftalmologia da Faculdade de Medicina da UFMG, pelos incentivos desde a minha
residência médica no Instituto Hilton Rocha e pelas gentilezas que lhe são peculiares.
A Rosemary Rodrigues Silva e a Maria do Rosário Pompéia de Aquino, secretárias do
Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina da UFMG,
por terem sempre sido prestativas, acolhedoras, carinhosas e bem humoradas.
Ao Dr. Rafael Vidal Mérula, pelo apoio, pela amizade, pelos desabafos, pelos
estímulos e por ter entendido verdadeiramente o significado desta tese para mim.
À Dra. Juliana Lambert Oréfice, pelo coleguismo, pelo exemplo e pelo apoio.
Ao Laboratório de Anatomia Patológica da Santa Casa de Misericórdia de Juiz de Fora
e, em especial, a Débora Tavares Grizendi, pelo trabalho de preparação das lâminas.
À Universidade Federal de Juiz de Fora, por ter contribuído para a realização desta
etapa tão importante na minha vida profissional.
À UNIPAC (Faculdade de Medicina Veterinária), por ter cedido o espaço físico para a
realização do experimento com coelhos.
Ao Cleber Ornelas e à Beth Halfeld, por terem me hospedado com muito carinho
durante o curso do doutorado, incentivando-me a todo o momento. À Dona Cleonice, à Karla,
ao Pierre, à Renata, ao Nélson e a todos os familiares, pela torcida. Aos meus lindinhos
Alberto, Bernard, Henrique, Manuela, Pedro e Gustavo, por conseguirem, juntamente com
minha Raquel, me fazer sorrir.
9
Aos amigos:
Se alguma coisa me consome e me envelhece é que a roda furiosa da vida não me
permite ter sempre ao meu lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo
comigo, todos os meus amigos, e, principalmente os que só desconfiam ou talvez nunca vão
saber que são meus amigos!
Vinícius de Moraes
Cristine Sotto-Maior (pela generosidade), Ronaldo (merci beaucoup), Monica
(companheira de estrada), Cristiana, Martinha e família (tão importantes para mim, desde
minha residência no Instituto Hilton Rocha), Christiane Marie (“meu anjo da guarda”), Eliane,
Carla, Angelina e Cleide (pela ajuda nos momentos mais críticos), Rubens, Ema, Dale (thank
you), Regina Beluco, Lucianno e Hélio De Maria (amigos da pós-graduação), Dilourdes,
Neide e Lúcia Gerhein (minha torcedora fiel e sempre presente) e todos aqueles que de
alguma maneira acreditaram em mim e me ajudaram nesta conquista.
10
Dias inteiros de calmaria, noites de ardentia, dedos no leme e olhos
no horizonte, descobri a alegria de transformar distâncias em tempo. Um
tempo em que aprendi a entender as coisas do mar, a conversar com as
grandes ondas e não discutir com o mau tempo. A transformar o medo em
respeito, o respeito em confiança. Descobri como é bom chegar quando se
tem paciência. E para chegar, onde quer que seja, aprendi que não é preciso
dominar a força, mas a razão. É preciso, antes de mais nada, querer.
Amyr Klink
11
RESUMO
Lacordia MHFA. Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre
as células satélites da musculatura extrínseca ocular em modelo animal. Tese [Doutorado].
Belo Horizonte: Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais; 2007.
Introdução: Quando ocorre uma lesão muscular, as células satélites tornam-se ativas,
dividem-se e reparam as fibras lesadas ou formam novas miofibras. Ao contrário da
musculatura esquelética, que é pós-mitótica, os músculos extrínsecos oculares apresentam-se
em contínua renovação celular, devido às células satélites. O tratamento cirúrgico do
estrabismo visa equilibrar as forças geradas pelos músculos oculares extrínsecos, porém
compromete a dinâmica muscular normal e, inevitavelmente, provoca cicatrizes,
incomitâncias e, ocasionalmente, estrabismos secundários. A necessidade de se descobrir um
tratamento farmacológico para o estrabismo que não cause enfraquecimento muscular
permanente, mas que tenha uma duração maior que a da toxina botulínica, estimula a
comunidade científica a pesquisar novas substâncias. Estudos recentes verificaram que a
crotoxina é capaz de induzir uma paralisia transitória em músculo reto superior de coelhos e
que sua ação e seu efeito foram semelhantes aos da toxina botulínica do tipo A.
Objetivo: Avaliar o efeito da toxina botulínica do tipo A e da crotoxina na ativação de células
satélites das fibras musculares de músculos retos superiores de coelhos.
Material e métodos: Os músculos retos superiores do olho direito de 29 coelhos machos
albinos neozelandeses foram inoculados com toxina botulínica do tipo A, ou com crotoxina,
em diferentes doses. Os músculos retos superiores contralaterais de cada coelho foram
inoculados com solução salina em volume igual ao das toxinas. Os animais foram sacrificados
12, 18 e 25 dias após as aplicações. Os olhos foram enucleados, mantendo-se os músculos
12
retos superiores intactos. Cada músculo foi preparado para análise imunoistoquímica, com
marcadores de células satélites – Myo D e PCNA. Foi realizada contagem dos núcleos
corados pelos marcadores a cada cem miofibras.
Resultados: A aplicação de toxina botulínica e de crotoxina provocou um aumento no
número de células satélites ativadas e em proliferação nos músculos retos superiores dos
coelhos. A inoculação de solução salina nos músculos contralaterais não causou aumento
significativo. Uma maior ativação celular foi observada após a aplicação de crotoxina embora,
estatisticamente, a diferença do efeito de ativação entre os grupos botox e crotoxina não tenha
sido considerável. Nos grupos botox e crotoxina, não houve correlação estatisticamente
significativa entre a dose e o aumento na ativação das células. Da mesma forma, não foi
encontrada correlação entre o volume de substância aplicada e a ativação celular nos grupos
botox, crotoxina e controle. O tempo de vida após a aplicação contribuiu para o aumento de
células satélites ativadas em todos os grupos. No estudo histológico, o grupo crotoxina
revelou acentuado desarranjo na arquitetura das fibras musculares e mais evidências de
regeneração.
Conclusão: A observação de maior desorganização na estrutura muscular e de sinais de
regeneração mais evidentes no grupo crotoxina parece estar correlacionada ao aumento de
células satélites ativadas. Supõe-se que o processo de regeneração das fibras musculares após
a aplicação da crotoxina seja mais lento que após a aplicação da toxina botulínica, o que
explicaria a ação mais duradoura da crotoxina.
Palavras-chave: Células satélites. Toxina botulínica do tipo A. Crotoxina. Estrabismo.
Regeneração de fibra muscular.
13
ABSTRACT
Lacordia MHFA. A comparative study of the effects of type A botulinum toxin and crotoxin
on satellite cells of extraocular muscles in rabbits. Thesis (Doctorate) Belo Horizonte:
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais; 2007.
Introduction: When muscle lesions occur, the satellite cells spring into action, by dividing
and either repairing damaged fibers or forming new myofibers. Unlike skeletal muscle which
is postmitotic, the extraocular muscles are in a continuous process of cellular regeneration,
due to these satellite cells. Surgical treatment of strabismus attempts to balance the forces
generated by extraocular muscles. However, this procedure modifies the normal muscle
dynamics and unavoidably causes scarring, incomitant gaze and, occasionally, secondary
strabismus. The need to discover pharmacological treatment for strabismus, which does not
cause permanent muscle weakening, but has a longer lasting effect than botulinum toxin, has
stimulated the scientific community to seek alternative substances. Recent studies have
verified that crotoxin was successful in inducing temporary paralysis in the superior rectus
muscles of rabbits and that its action and effects were similar to those produced by botulinum
toxin A.
Purpose: To evaluate the effect of botulinum toxin A and crotoxin on satellite cell activation
in the muscle fibers of superior rectus muscles of rabbits.
Material and Methods: The superior rectus muscles in the right eyes of 29 male, albino,
New Zealand rabbits were inoculated with different doses of botulinum toxin A or crotoxin.
The contra-lateral superior rectus muscles in each rabbit were inoculated with the same
volume of saline solution only. The animals were sacrificed either 12, 18 or 25 days after the
inoculation. The eyes were enucleated, maintaining the superior rectus muscles intact.
14
Subsequently, each muscle was prepared for immunohistochemical analysis, using satellite
cell markers – Myo D and PCNA. The positive nuclei, revealed by the markers in each 100
myofibers, were counted.
Results: The application of the botulinum toxin A and crotoxin triggered a more significant
increase satellite cell activation and proliferation in right superior rectus muscles in rabbits
when compared with a saline solution inoculation in the contralateral muscles. Greater cell
activation was observed after crotoxin application, although, statistically, the difference in the
effects of this activation between the botox and crotoxin groups was not significant. There
was no statistically significant correlation between the dose applied and resulting cell
activation in the botox and crotoxin groups. Similarly, no correlation was found between the
volume of the applied substance and cell activation in the botox, crotoxin and control groups.
Post-application survival time contributed to the increase in activated satellite cells in all
groups. Histological examination revealed more accentuated disorganization in muscle fibre
architecture and more evidence of regeneration in the crotoxin group.
Conclusion: The observed increase in disorganization in the muscle structure together with
more obvious signs of regeneration in the crotoxin group suggests a correlation with the
increase in satellite cell activation. It may be concluded that the process of muscle-fibre
regeneration after the crotoxin application is slower than that which occurs after the
botulinum toxin A application, which may explain the longer lasting action of crotoxin.
Key words: Satellite cells. Botulinum toxin A. Crotoxin. Strabismus. Muscle-fibre
regeneration.
15
Lista de ilustrações
Figura 1- Desenho esquemático ilustrando a organização do músculo estriado
esquelético...................................................................................................................................9
Figura 2- Diagrama ilustrando a estrutura e a posição dos filamentos finos e grossos do
sarcômero....................................................................................................................................9
Figura 3- Estrutura dos tecidos conectivos orbitários e suas relações com as camadas de
fibras musculares.......................................................................................................................11
Figura 4- Desenho esquemático de uma célula satélite quiescente envolta pela lâmina basal e
pelo sarcolema da miofibra justaposta......................................................................................14
Figura 5- Modelo computacional da estrutura da crotoxina....................................................34
Figura 6- Aplicação de toxina no músculo reto superior do olho direito de
coelho........................................................................................................................................44
Figura 7- Fase final da aplicação de toxina no músculo reto superior do olho
direito........................................................................................................................................44
Figura 8- Globo ocular de coelho enucleado...........................................................................48
Figura 9- Lâmina preparada para análise imunoistoquímica ..................................................52
Figura 10- Corte longitudinal do músculo reto superior de um coelho, submetido à marcação
pelo anticorpo anti- Myo D.......................................................................................................53
Figura 11- Corte longitudinal do músculo reto superior de um coelho, submetido à marcação
pelo anticorpo anti- PCNA........................................................................................................54
Figura 12- Ptose palpebral discreta em olho direito do coelho 12...........................................60
Figura 13- Ptose palpebral moderada em olho direito do coelho 23.......................................60
Figura 14- Coelho 28 com lesão na pálpebra inferior esquerda causada por provável
ferimento traumático.................................................................................................................61
16
Figura 15- Corte histológico de área do músculo reto superior normal de coelho (aumento
de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina)..................................................................101
Figura 16 - Corte histológico de área do músculo reto superior normal de coelho (corte
transversal, aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina)................................101
Figura 17- Corte histológico do músculo reto superior do olho esquerdo do
coelho1..................................................................................................................................102
Figura 18 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho esquerdo do coelho
2............................................................................................................................................102
Figura 19 - Corte histológico de músculo reto superior do olho direito do coelho
6............................................................................................................................................103
Figura 20- Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
6............................................................................................................................................103
Figura 21- Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
7............................................................................................................................................104
Figura 22 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
7............................................................................................................................................104
Figura 23 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
7............................................................................................................................................105
Figura 24 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
7............................................................................................................................................105
Figura 25 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
7............................................................................................................................................106
Figura 26- Corte histológico de músculo do reto superior do olho direito do coelho
9............................................................................................................................................106
17
Figura 27- Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
9...............................................................................................................................................107
Figura 28- Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
15.............................................................................................................................................107
Figura 29- Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
15.............................................................................................................................................108
Figura 30- Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
15.............................................................................................................................................108
Figura 31- Corte histológico de músculo reto superior do olho direito coelho
16.............................................................................................................................................109
Figura 32 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
19.............................................................................................................................................109
Figura 33 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
20.............................................................................................................................................110
Figura 34 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
20.............................................................................................................................................110
Figura 35 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
21.............................................................................................................................................111
Figura 36 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
23.............................................................................................................................................111
Figura 37 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho
23.............................................................................................................................................112
Figura 38 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................112
18
Figura 39 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................113
Figura 40 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................113
Figura 41 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................114
Figura 42 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................114
Figura 43 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25.............................................................................................................................................115
Figura 44 - Corte histológico do músculo reto superior do olho esquerdo do coelho
25.............................................................................................................................................115
Figura
45-
Esquema
dos
estágios
de
regeneração
da
reparação
muscular....................................................................................................................................86
19
Lista de tabelas
Tabela
1-
Núcleos
corados
e
total
de
núcleos
em
cada
grupo
(botox
e
controle).................................................................................................................................100
Tabela 2- Núcleos corados e total de núcleos em cada grupo (crotoxina e
controle)..................................................................................................................................100
Tabela 3- Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e PCNA nos grupos controle, botox e
crotoxina....................................................................................................................................63
Tabela 4- Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e PCNA nos grupos botox e
crotoxina....................................................................................................................................66
Tabela 5- Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo
com as doses..............................................................................................................................67
Tabela 6- Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo
com os volumes.........................................................................................................................71
Tabela 7- Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo
com os dias de vida após a aplicação.....................................................................................................................75
20
Lista de quadros
Quadro 1- Ações dos músculos oculomotores a partir da posição primária do
olhar............................................................................................................................................7
Quadro 2- Distribuição dos coelhos em grupos.......................................................................43
Quadro 3- Toxina botulínica aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 1
a 14............................................................................................................................................45
Quadro 4- Crotoxina aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 15 a
29...............................................................................................................................................46
Quadro 5- Relação dos dias em que foram realizadas as eutanásias dos coelhos, coelhos
sacrificados e número de olhos enucleados..............................................................................47
Quadro 6- Ocorrência de ptose palpebral no olho direito dos coelhos após a aplicação de
toxina botulínica e de crotoxina................................................................................................59
Quadro 7- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados
Botox® 10 U e solução salina em igual volume.......................................................................80
Quadro 8- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados
Botox® 5 U e solução salina em igual volume.........................................................................80
Quadro 9- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados
Botox® 2,5 U e solução salina em igual volume......................................................................81
Quadro 10- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas
crotoxina 10 U e solução salina em igual volume....................................................................81
21
Quadro 11- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas
crotoxina 5 U e solução salina em igual volume......................................................................82
Quadro 12- Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas
crotoxina 2 U e solução salina em igual volume......................................................................82
22
Diagrama
Diagrama 1- Representação gráfica das variáveis do presente estudo....................................56
23
Lista de gráficos
Gráfico 1- Representação em box-plot dos percentuais de núcleos de CS ativados e marcados
pelo Myo D...............................................................................................................................64
Gráfico 2- Representação em box-plot dos percentuais de núcleos de CS ativados e marcados
pelo PCNA................................................................................................................................65
Gráfico 3- Diagrama de dispersão representando a correlação entre a dose (U) e o percentual
de núcleos ativados marcados pelo Myo D..............................................................................68
Gráfico 4- Diagrama de dispersão representando a correlação entre a dose (U) e o percentual
de núcleos ativados marcados pelo PCNA...............................................................................69
Gráfico 5- Diagrama de dispersão representando a correlação entre o volume (ml) e o
percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D.............................................................72
Gráfico 6- Diagrama de dispersão representando a correlação entre o volume (ml) e o
percentual de núcleos ativados marcados pelo PCNA..............................................................73
Gráfico 7- Diagrama de dispersão representando a correlação entre os dias de vida após a
aplicação e o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo
D................................................................................................................................................76
Gráfico 8- Diagrama de dispersão representando a correlação entre os dias de vida após a
aplicação e o percentual de núcleos ativados marcados pelo
PCNA........................................................................................................................................77
Gráfico 9- Relação entre a média de núcleos ativados para cada grupo, para cada marcador,
em cada período de vida após a aplicação das substâncias.......................................................78
24
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
ANOVA- análise de variância
Brd U- bromodeoxiuridina
°C- grau Celsius
CETEA- Comitê de Ética em Experimentação Animal
CICS- crotoxin inhibitor from Crotalus serum
COBEA- Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
Crtx- crotoxina
CS- células satélites
DAB- diaminobenzidina
DFP- di-isopropil-fluor-fosfato
DL-50- dose letal em 50% dos animais inoculados
EUA- Estados Unidos da América
FDA- Food and Drug Administration
FGF- fibroblast growth factor
FUNED- Fundação Ezequiel Dias
g- grama
GB- grupo botox
GC- grupo controle
GCrtx- grupo crotoxina
H0- hipótese de nulidade
HGF- hepatocyte growth factor
IGF - I- insulin-like growth factor I
IGF- II- insulin-like growth factor II
25
IL-6- interleucina 6
kDa- quilodalton
kg- quilograma
LIF- leukemia inhibitory factor
M- mol
mg- miligrama
MG- Minas Gerais
MIFs- multiply innervated muscle fibers (fibras de contração lenta)
ml- mililitro
MOE- músculos oculares extrínsecos
Myo D- myogenic determination gene D
μg- microgramas
nº- número
N-CAM- neural cell adhesion molecule
OD- olho direito
OE- olho esquerdo
p- nível de significância
PBS- phosphate-buffered saline
PCNA- proliferating cell nuclear antigen
pH- potencial de hidrogênio iônico
PR- Paraná
r- coeficiente de correlação
SIFs- singly innervated muscle fibers (fibras de contração rápida)
SP- São Paulo
SPSS- Statistical Package for Social Science
26
TGF-β- transforming growth factors
U- unidade
UFMG- Universidade Federal de Minas Gerais
UNIPAC- Universidade Presidente Antônio Carlos
%- percentual
®- marca registrada
™- marca comercial
27
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................1
2 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................5
2.1 Musculatura ocular externa e células satélites....................................................6
2.1.1 Anatomia dos músculos oculares extrínsecos...........................................6
2.1.1.1 Aspectos macroscópicos................................................................6
2.1.1.2 Organização celular.......................................................................8
2.1.1.3 Tipos de fibras da musculatura extrínseca ocular........................10
2.1.2 Células Satélites.......................................................................................13
2.1.2.1 Identificação das células satélites musculares.............................15
2.1.2.2 Marcadores para células satélites................................................15
2.1.2.3 Distribuição e quantificação das células satélites........................17
2.1.2.4 Fatores de crescimento como reguladores das células satélites..18
2.1.2.5 Respostas funcionais das células satélites a estímulos
fisiológicos...........................................................................................................21
2.1.2.5.1 Estímulo hipertrófico...................................................21
2.1.2.5.2 Estímulo atrófico.........................................................22
2.1.2.5.3 Envelhecimento...........................................................23
2.1.2.6 Respostas funcionais e estados de doença...................................23
2.1.2.7 Modelos de regeneração muscular..............................................24
2.1.3 Particularidades da musculatura ocular extrínseca.................................24
2.2 Revisão da toxina botulínica............................................................................26
2.2.1 Introdução...............................................................................................26
2.2.2 Farmacologia...........................................................................................28
2.2.3 Mecanismo da ação.................................................................................28
2.2.4 Preparações comerciais............................................................................29
2.2.5 Imunologia da toxina botulínica..............................................................30
2.2.6 Efeitos colaterais......................................................................................30
2.2.7 Indicações................................................................................................31
2.3 Revisão da crotoxina........................................................................................33
2.3.1 Introdução................................................................................................33
28
2.3.2 Estrutura...................................................................................................34
2.3.3 Mecanismo de ação..................................................................................34
2.3.4 Imunologia da crotoxina..........................................................................36
2.3.5 Utilização da crotoxina.............................................................................36
3 OBJETIVOS...............................................................................................................38
4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................40
4.1 Estudos anatomopatológico e imunoistoquímico.............................................47
4.2 Metodologia estatística.....................................................................................55
5 RESULTADOS...........................................................................................................58
5.1 Análise estatística dos dados............................................................................62
5.1.1 Comparação das médias entre os grupos independentemente dos
co-fatores........................................................................................................................62
5.1.1.1 Comparação com o grupo controle...............................................62
5.1.1.2 Comparação sem o grupo controle...............................................66
5.1.2 Avaliação da influência dos co-fatores nos grupos..................................67
5.1.2.1 Comparação entre a dose e a resposta..........................................67
5.1.2.2 Comparação entre o volume e a resposta......................................70
5.1.2.3 Comparação entre os dias de vida após a aplicação e a resposta.74
5.2 Análise histológica.........................................................................................79
6 DISCUSSÃO...............................................................................................................83
7 CONCLUSÕES...........................................................................................................88
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................90
ANEXO A......................................................................................................................99
ANEXO B....................................................................................................................100
ANEXO C....................................................................................................................101
ANEXO D....................................................................................................................102
29
30
1 Introdução
31
1 Introdução
O estrabismo é um desalinhamento dos olhos, freqüentemente associado à hiper ou à
hipofunção de músculos oculares extrínsecos. Quando surge na infância, pode causar
ambliopia e incapacidade visual permanente; quando surge na fase adulta, pode acarretar
diplopia.
O objetivo do tratamento cirúrgico do estrabismo é equilibrar as forças musculares, de
maneira que, na presença de impulsos motores eferentes anormais, o alinhamento binocular
normal possa ser alcançado ou mantido. Normalmente, um ou mais músculos oculares
extrínsecos são fortalecidos ou enfraquecidos, o que altera o comprimento do músculo
(ressecção) ou a inserção do músculo no globo ocular (retrocesso). (1, 2)
Embora eficaz na mudança da posição rotacional do globo ocular, a cirurgia
compromete a dinâmica muscular normal. O arco de contato com o globo ocular, a
elasticidade intrínseca dos músculos envolvidos na cirurgia, a tensão latente no
agonista/antagonista e a contração muscular mudam após a cirurgia. Além disso, tal
procedimento inevitavelmente provoca cicatrizes que podem alterar a função do músculo
ocular extrínseco. Ressecções e retrocessos amplos podem resultar em incomitâncias e,
ocasionalmente, em estrabismos secundários. (1)
Em 1977, Scott começou a utilizar a toxina botulínica do tipo A para a correção do
estrabismo em seres humanos. A toxina foi aprovada para uso clínico na década de 1980 e
tem sido utilizada eficazmente para o enfraquecimento de músculos hiperfuncionantes no
estrabismo de crianças e adultos, o que mostra que a idéia de um tratamento medicamentoso
para o estrabismo é possível. A toxina botulínica gera um enfraquecimento do músculo em
que é aplicada, sem alterar sua inserção e sem causar as cicatrizes e/ou fibroses que um
procedimento incisional produziria. (3, 4)
32
Outras toxinas e outras substâncias começam a ser estudadas com o objetivo de se
aprimorar o tratamento do estrabismo.
A crotoxina, principal neurotoxina do veneno da cobra cascavel sul-americana
Crotalus durissus terrificus, atua como bloqueador neuromuscular. Ribeiro (2001) avaliou,
em coelhos, a ação e a aplicabilidade da crotoxina na indução da paralisia da musculatura
extrínseca ocular, comparando seus efeitos com os da toxina botulínica do tipo A. (5)
As fibras musculares esqueléticas dos mamíferos adultos não são substituídas nem
remodeladas sem que haja algum processo de crescimento ou trauma. Entretanto, tais
músculos possuem uma população quiescente de células progenitoras, conhecidas como
células satélites. Após um trauma, essas células tornam-se ativas e dividem-se, promovendo,
assim a regeneração do músculo lesado. (6)
As células satélites foram identificadas e descritas pela primeira vez por Mauro, em
1961, como células intimamente associadas à periferia de fibras musculares de rãs. Tal
denominação se deve a sua localização anatômica. (7)
Em 2002, McLoon et al. utilizando marcadores específicos, demonstraram a existência
de células satélites ativadas na musculatura extrínseca ocular de mamíferos, incluindo
coelhos, macacos e humanos. (8, 9) McLoon e Wirtschafter (2003) identificaram, em macacos
e humanos adultos, células satélites ativadas em miofibras de músculos extrínsecos oculares
que não haviam sofrido qualquer trauma. (9) Ugalde et al. (2005) estudaram o efeito da
paralisia induzida pela toxina botulínica nas fibras musculares remodeladas de músculos
extrínsecos oculares de coelhos. (10) O aumento de células satélites nos músculos retos de
coelhos submetidos à ressecção foi verificado por Christiansen e McLoon, em 2006. (11)
Antunes-Foschini et al. (2006) observaram um aumento de células satélites ativadas nos
músculos oblíquos inferiores hiperfuncionantes de pacientes com estrabismo, quando
33
comparados com os músculos oblíquos inferiores de pacientes sem história de estrabismo.
(12)
A compreensão do efeito dos procedimentos cirúrgicos, assim como da utilização de
toxinas na ativação de células satélites musculares, é útil para o aperfeiçoamento do
tratamento do estrabismo.
Este estudo tem o propósito de verificar comparativamente o efeito da aplicação da
toxina botulínica do tipo A e da crotoxina sobre as células satélites de músculos retos
superiores de coelhos, o que poderá ajudar na investigação da ação dessas toxinas e na
melhoria da correção dos estrabismos.
34
2 Revisão da literatura
35
2 Revisão da literatura
2.1 Musculatura ocular externa e células satélites
2.1.1 Anatomia dos músculos oculares extrínsecos
2.1.1.1 Aspectos macroscópicos
Os músculos oculares extrínsecos (MOE) exercem uma função importante para a
visão, promovendo não só um ajuste estático para o alinhamento binocular, necessário para se
obter a fusão e a estereopsia, como também movimentos dinâmicos precisos, importantes para
adquirir e manter a visão foveal, independentemente da movimentação da cabeça e do corpo.
(2)
Os MOE e suas ações a partir da posição primária do olhar estão resumidos no
QUADRO 1. (2)
Os quatro músculos retos originam-se de um anel tendinoso, o anel de Zinn, que
envolve o forame óptico e uma porção da fissura orbital superior, circundando o nervo óptico.
(2, 13) Eles inserem-se na esclera, perto do limbo, a distâncias crescentes em relação a este,
partindo do reto medial (RM) em direção horária e formando uma espiral imaginária chamada
espiral de Tillaux.
O músculo oblíquo superior também se origina do anel de Zinn, no ápice da órbita.
Entretanto, sua origem funcional é a tróclea, situada na porção súpero-medial, próxima à
borda orbitária. Nos humanos, o músculo é tendinoso após passar por esse anel
fibrocartilaginoso, e o tendão direciona-se póstero-lateralmente para inserir-se no quadrante
36
temporal súpero-posterior do globo ocular. O músculo oblíquo inferior origina-se da parede
medial da órbita e insere-se no quadrante temporal ínfero-posterior do globo ocular. (2, 13)
QUADRO 1
Ações dos músculos oculomotores a partir da posição primária do olhar
Músculo
Ação primária
Ação secundária
Reto medial
Adução
---
Reto lateral
Abdução
---
Reto superior
Elevação
Adução, inciclodução
Reto inferior
Depressão
Adução, exciclodução
Oblíquo superior
Inciclodução
Depressão, abdução
Oblíquo inferior
Exciclodução
Elevação, abdução
O III nervo craniano (nervo oculomotor) inerva os músculos reto medial, reto
superior, reto inferior e oblíquo inferior. O IV nervo craniano (nervo troclear) inerva o
oblíquo superior. O VI nervo craniano (nervo abducente), inerva o reto lateral. (2, 13)
As artérias musculares provêm dos ramos musculares medial e lateral da artéria
oftálmica e dirigem-se anteriormente, pelos corpos dos músculos retos. A partir das inserções
dos músculos retos, percorrem um curto trajeto pela episclera e, denominando artérias ciliares
anteriores, perfuram a esclera e passam a constituir importantes vias de irrigação para o
segmento anterior do olho. Cada músculo reto possui duas artérias musculares, exceto o reto
lateral, que possui apenas uma. (2)
37
2.1.1.2 Organização celular
Embora a musculatura ocular extrínseca difira em vários aspectos da musculatura
esquelética típica, algumas características são comuns. (13)
O músculo é envolvido por uma membrana de tecido conjuntivo chamada
epimísio. Do epimísio, partem septos muito finos de tecido conjuntivo, que se dirigem para o
interior do músculo, dividindo-o em fascículos. Esses septos são denominados perimísios.
Cada fibra muscular, por sua vez, é envolvida por uma camada muito fina de fibras
reticulares, formando o endomísio. (13)
A fibra muscular é delimitada por uma membrana, o sarcolema. O seu citoplasma
(sarcoplasma) é preenchido principalmente por fibrilas paralelas, as miofibrilas, que
correspondem ao tecido contrátil. (FIGURA 1) (13, 14)
As miofibrilas possuem estriações que alternam zonas claras (bandas I) e escuras
(bandas A). No centro de cada banda I, aparece uma linha transversal escura – a linha Z. A
banda A apresenta uma zona mais clara no centro – a banda H, que possui uma linha escura
central, chamada banda M. (13, 14)
A unidade contrátil da miofibrila chama-se sarcômero e localiza-se entre duas
linhas Z sucessivas. Quando estimulado, o sarcômero contrai-se pela aproximação das bandas
I e A. (FIGURA 2) (13, 14)
38
FIGURA 1: Desenho esquemático ilustrando a organização do músculo
estriado esquelético. À direita, esboço de um músculo do qual foi retirado um
segmento, representado na figura maior, à esquerda.
Fonte: Junqueira LC, Carneiro J. Histologia básica. 5ª edição. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan; 1982.
FIGURA 2: Diagrama ilustrando a estrutura e a posição dos filamentos finos
e grossos do sarcômero.
Fonte: adaptado de Junqueira LC, Carneiro J. Histologia básica. 5ª edição. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan; 1982.
39
As miofibrilas do músculo estriado contêm pelo menos quatro proteínas principais:
miosina, actina, tropomiosina e troponina. Os filamentos grossos são formados de miosina, e
as outras três proteínas são encontradas nos filamentos finos. (14)
A miosina e a actina, juntas, representam 55% do total de proteínas do músculo
estriado. (14)
A força contrátil de um músculo é gerada pela interação da miosina e da actina. As
bandas I (regiões claras) são compostas de filamentos finos (actina); as bandas A (escuras)
são compostas de filamentos espessos (miosina) e de filamentos finos (actina) interpostos. A
banda H apresenta apenas filamentos espessos. (13, 14)
A contração muscular é estimulada por impulsos nervosos que levam à liberação
de cálcio do retículo sarcoplasmático, gerando mudanças nas interações entre as pontes de
ligação formadas entre a porção globular da molécula de miosina e a molécula de actina. Isso
resulta no deslizamento dos filamentos finos sobre os espessos. A banda A permanece com o
mesmo tamanho, e as bandas I e Z diminuem de tamanho quando ocorre contração. (14)
2.1.1.3 Tipos de fibra da musculatura extrínseca ocular
As miofibras da musculatura ocular externa são derivadas do mesoderma,
enquanto o tecido conectivo adjacente e a musculatura lisa da órbita são derivados da crista
neural. (2, 15, 16)
A miogênese dos músculos estriados oculares ocorre em duas fases: primária e
secundária. (2, 15)
Cedo, na primeira etapa da miogênese, na 11ª semana de gestação, os tecidos
conectivos perimusculares, assim como a tróclea e as polias dos músculos retos, iniciam as
40
associações com as condensações de mioblastos que irão formar os MOE. Os tecidos
conectivos perioculares desenvolvem-se posteriormente, por volta da segunda etapa da
miogênese. O desenvolvimento dos MOE induz a inervação pelos nervos cranianos
correspondentes. (2)
A musculatura ocular externa é classicamente dividida em duas camadas distintas.
(FIGURA 3) A camada orbital periférica estende-se ao longo da superfície muscular,
faceando a parede da órbita. Essa camada circunda outra, a camada global, próxima ao globo
ocular. (13, 16, 17, 18, 19) Uma zona intermediária entre as camadas orbital e global tem sido
descrita. (2)
FIGURA 3: Estrutura dos tecidos conectivos orbitários e suas relações com as
camadas de fibras musculares. IO: oblíquo inferior; IR: reto inferior; LPS:
elevador da pálpebra superior; LR: reto lateral; MR: reto medial; SO: oblíquo
superior; SR: reto superior.
Fonte: Demer JL, Oh SY, Poukens V. Evidence for active control of rectus
extraocular muscle pulleys. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41 (6): 1280-90.
41
A camada orbital contém fibras de diâmetro menor, com numerosas mitocôndrias
e abundantes vasos. A camada global contém fibras de diâmetro maior, com variável
conteúdo mitocondrial e poucos vasos. (16)
A camada global existe por toda a extensão de cada músculo reto, desde a origem,
no ápice da órbita, até a continuidade com o tendão, que se insere no globo. (2) A porção
média do músculo (correspondente à região entre a terminação anterior das miofibras no
tendão e sua origem posterior no ápice da órbita) contém de 8 280 a 16 374 fibras, com
variação discreta entre os quatro músculos retos. (17)
Na porção média da camada orbital, o número de fibras varia amplamente de
acordo com o músculo reto considerado, sendo maior no músculo reto medial (de 7 845 a 14
991 fibras) e menor no músculo reto superior (de 5 119 a 9 367 fibras). (2, 17)
As fibras da camada orbital não são contíguas com as inserções esclerais, pois se
inserem nas polias dos respectivos músculos. (19)
Estudos anatômicos recentes confirmaram que cada músculo reto passa através de
uma polia, que consiste em um anel (ou uma bainha) de colágeno, localizado próximo ao
equador do globo ocular, na fáscia de Tenon. (18)
No mínimo seis tipos diferentes de fibras musculares foram identificados nos
músculos oculares. Esses tipos podem ser divididos em duas categorias principais: fibras
musculares de contração lenta e fibras musculares de contração rápida. (20) Pela classificação
de Siebeck e Krüger (1955), as fibras de contração lenta são aquelas com inervação múltipla
(multiply innervated muscle fibers - MIFs) e são chamadas de “Felderstruktur”; as fibras de
contração rápida são inervadas por terminações nervosas simples (singly innervated muscle
fibers - SIFs) e denominadas de “Fibrillenstruktur”. (13, 20, 21)
As fibras de contração rápida (SIFs) são o tipo de fibra muscular que constitui
todos os músculos esqueléticos. Elas não respondem ao estímulo elétrico, tampouco
42
apresentam contração total, que se propaga ao longo de toda fibra. São inervadas por nervos
relativamente grandes (de 7 a 11 μm), que terminam como uma grande placa motora no terço
central do músculo. (20)
As fibras de contração lenta (MIFs) são incomuns em mamíferos, ocorrendo
apenas em músculos oculares, na laringe e em músculos do ouvido médio. Entretanto, são
comuns em músculos de anfíbios. Elas são resistentes à fadiga e respondem ao estímulo
elétrico com uma contração tônica lenta que se propaga ao longo da fibra muscular. São
inervadas por fibra nervosa mielinizada, usualmente de calibre fino (de 3 a 5 μm). As placas
motoras são tipicamente pequenas e estão distribuídas ao longo de toda a fibra, mas têm uma
concentração maior na metade distal do músculo. (13, 20)
A camada orbital dos MOE contém dois tipos de fibras musculares.
Aproximadamente 80% das fibras são de contração rápida e 20% são de contração lenta. (2,
13)
A camada global possui um tipo de fibra de contração lenta e três tipos de fibra de
contração rápida. (2)
2.1.2 Células satélites
Em 1961, Mauro identificou e descreveu pela primeira vez células intimamente
relacionadas com a fibra muscular esquelética de rãs. Denominou-as de células satélites (CS)
devido à localização anatômica – periferia da fibra muscular. (FIGURA 4) (7)
Os músculos esqueléticos de mamíferos adultos apresentam uma notável
capacidade de adaptação a exigências como crescimento, remodelação e trauma. Os
processos pelos quais essas adaptações ocorrem são largamente atribuídos à pequena
população de células que se localiza nos músculos esqueléticos adultos, as CS. (6)
43
CS quiescentes distinguem-se fisicamente das fibras musculares adultas por
localizarem-se nas identações entre o sarcolema e a lâmina basal. Fibras musculares
esqueléticas são terminalmente diferenciadas, de modo que o crescimento muscular e a
regeneração são realizados pelas CS. (6, 22)
FIGURA 4: Desenho esquemático de uma célula satélite quiescente
envolta pela lâmina basal e pelo sarcolema da miofibra justaposta.
Fonte: adaptado de Vierk J, O’Reilly B, Hossner K, Antonio J, Byrne K,
Bucci L, et al. Satellite cell regulation following myotrauma caused by
resistance exercise. Cell Biol Int 2000; 24: 263-72.
Enquanto o tecido muscular esquelético encontra-se livre de agressões, as CS
permanecem em um estado não proliferativo, quiescente. Entretanto, em resposta a
estímulos como trauma, as CS tornam-se ativas, proliferam-se e expressam marcadores
miogênicos, sendo então denominadas mioblastos. Essas células fundem-se a fibras
musculares pré-existentes ou a CS vizinhas para formar novas fibras musculares. (6, 22,
23)
44
2.1.2.1 Identificação das células satélites musculares
Tais células constituem uma população de células miogênicas mononucleadas
e indiferenciadas. São encontradas nos músculos esqueléticos de mamíferos, aves, répteis
e anfíbios. (24)
Uma característica importante das CS é que a lâmina basal que as circunda e a
fibra muscular associada são contínuas. Outras características das CS são: alta relação
núcleo/citoplasma com poucas organelas; núcleo menor em comparação com os núcleos
adjacentes da fibra muscular; e aumento na quantidade de heterocromatina nuclear,
comparada à do mionúcleo. (6, 22, 23, 24)
Essas características morfológicas são compatíveis com a idéia de que, em
condições normais, as CS são relativamente quiescentes e menos ativas, mas desaparecem
após a ativação ou a proliferação das CS em resposta ao crescimento, à remodelação ou ao
trauma muscular. (6, 22, 23, 24)
Após a ativação, as CS são mais facilmente identificadas, pois aparecem como
um edema na fibra muscular devido ao aumento na relação citoplasma/núcleo. Em
associação com o aumento da atividade mitótica, existe uma redução na heterocromatina e
um aumento no número de organelas intranucleares. (6, 23, 24)
2.1.2.2 Marcadores para células satélites
O método mais fidedigno para identificar as CS é a microscopia eletrônica.
Porém esse método não é muito acessível. (25) Conseqüentemente, grande interesse foi
dado a bons anticorpos para a identificação de proteínas específicas nas CS quiescentes e
ativadas in vivo pela luz do microscópio. (6, 25, 26)
45
O perfil de expressão gênica das CS quiescentes ou ativadas ainda é pouco
conhecido. (6, 27)
Através da identificação de marcadores de CS, pesquisadores estarão aptos a
lidar com a origem das CS, com o controle do ciclo celular e com a regulação molecular
dessa população única de células durante o crescimento e a regeneração. (6)
Diversos marcadores de CS foram identificados, mas são restritos para os
estados quiescente, ativado ou proliferativo. (6, 23, 24, 27)
Alguns marcadores já bem estabelecidos são:
a) Myo D (Myogenic determination gene D)
É um fator de transcrição descoberto em 1987, pertencente à família de
proteínas basic helix-loop-helix, à qual também pertencem outras proteínas, como o Myf
5, a miogenina e o MRF 4. Tais proteínas controlam a diferenciação de células da
linhagem miogênica. (23)
CS Myo D negativas apresentam capacidade de diferenciação reduzida e
retardada. (28)
O Myo D é um excelente marcador para CS ativadas. (28) É encontrado em
elevados níveis no músculo em regeneração e em recém-nascidos. Sua função na
musculatura esquelética após o nascimento de mamíferos ainda não é clara. Doze horas
após o trauma muscular, pode-se detectar a presença de Myo D e de outras proteínas
relacionadas à diferenciação de células da linhagem miogênica, como desmina e
miogenina. Em relação às fases do ciclo celular, o Myo D apresenta-se em altos níveis
durante a fase G1 da interfase, quando tem início a diferenciação celular. Cai para níveis
46
baixos na transição G1/S e aumenta novamente no transcorrer da fase S para a mitose
propriamente dita. (23, 27, 29)
b) PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)
É uma proteína cuja síntese ocorre no início das fases G1 e S do ciclo celular.
Mesmo sendo inespecífica, é um excelente marcador para CS em proliferação. (23)
2.1.2.3 Distribuição e quantificação das células satélites
A quantificação da população de CS na musculatura esquelética de adultos
tornou-se possível graças à utilização de técnicas ultraestruturais. Recentemente, técnicas
imunoistoquímicas foram utilizadas para identificação de CS. (6)
A expressão de Myo D ocorre precocemente durante a ativação de CS
(aproximadamente seis horas após o trauma muscular). (6)
Vários marcadores não seletivos para proliferação celular têm sido utilizados
também para caracterizar a proliferação de CS. Esses marcadores incluem antígeno
nuclear de células proliferativas, bromodeoxiuridina (Bdr U) e [³H] timidina. (6)
O número de CS depende da espécie animal, da idade e do tipo de fibra
muscular. (6, 23, 24, 31, 32, 33, 34, 35)
Em ratos, as CS constituem aproximadamente 30% dos núcleos no músculo de
neonatos. Decrescem para cerca de 4% nos adultos e para 2% nos idosos. (6, 23, 24, 31,
32, 35)
A diminuição da porcentagem de CS com a idade é resultado de um aumento
de mionúcleos. (6, 23, 24, 31)
47
A distribuição de CS entre os grupos de músculos é resultado da
heterogeneidade no conteúdo de CS nos diferentes tipos de fibras musculares. Há um
aumento no número de CS nas proximidades de capilares, nos mionúcleos e nas junções
mioneurais. (6, 23, 33)
2.1.2.4 Fatores de crescimento como reguladores das células satélites
O processo de regeneração muscular requer a influência de fatores de
crescimento e uma seqüência de eventos celulares que resulta na regulação da população
de CS. (6, 24)
Muitos dos estudos que analisaram o efeito dos fatores de crescimento na
biologia das CS têm utilizado cultura de CS. Esses estudos têm definido o efeito de
fatores de crescimento isolados ou combinados e têm proporcionado um discernimento
preciso sobre a regulação de CS. (6)
Os estudos in vitro são limitados devido à carência de fatores permissivos ou
repressivos que estão presentes in vivo e que podem influenciar a atividade celular. (6, 23)
A maioria das culturas de CS é feita na musculatura esquelética neonatal
devido à abundância delas nesses tecidos em comparação com indivíduos mais idosos. (6)
Fatores de crescimento que são importantes na regulação da proliferação,
diferenciação e motilidade das CS:
48
a) Fatores de crescimento semelhantes à insulina
Músculos esqueléticos secretam fatores de crescimento semelhantes à insulina
(IGF – insulin-like growth factor) I e II (IGF-I e IGF-II). Tais fatores são importantes na
regulação do metabolismo da insulina. Também são importantes na regulação da
regeneração da musculatura esquelética. Tanto o IGF-I quanto o IGF-II aumentam a
proliferação e a diferenciação de CS in vitro. (6)
b) Fator de crescimento do hepatócito
O fator de crescimento do hepatócito (HGF – hepatocyte growth factor) é uma
citoquina multifuncional, inicialmente descrita como um mitógeno para hepatócitos
maduros. (6)
Atualmente, o HGF é considerado um dos fatores de crescimento mais
importantes no que diz respeito à regeneração orgânica devido às suas propriedades
mitogênica e motogênica. (24)
O HGF é a chave reguladora da atividade das CS durante a regeneração
muscular. (24)
O HGF e seu receptor c-Met têm sido localizados nas CS e miofibras
adjacentes, mas estão ausentes nos fibroblastos adjacentes. (6)
A expressão do HGF é proporcional ao grau de lesão muscular. (2) O
estiramento mecânico induz a ativação das CS em cultura, com liberação de HGF. Assim,
o HGF pode estar envolvido na ativação das CS após uma perturbação mecânica. (36)
49
c) Fatores de crescimento de fibroblastos
O fator de crescimento de fibroblastos (FGF – fibroblast growth factor) tem
nove isoformas diferentes (FGF-1 a FGF-9). A isoforma FGF-6 é restrita para músculos
esqueléticos. (37)
Os FGFs estimulam a síntese de tecido conjuntivo, induzem a proliferação de
CS e suprimem a diferenciação miogênica. (23)
Os níveis dos FGFs são proporcionais ao grau de expressão dos seus
receptores. Quando ocorre um aumento na expressão dos receptores para o FGF, há
aumento na proliferação e redução na diferenciação de CS. (23)
d) Fatores de crescimento de transformação
Fatores de crescimento de transformação (TGF-β - transforming growth
factors) são importantes citoquinas que regulam o crescimento celular. (6, 24)
Geralmente, a função dos membros da família dos TGF-β é a inibição da
proliferação e da diferenciação musculares através da inibição da transcrição de genes da
família Myo D. (6)
e) Citoquinas interleucina-6
O fator inibidor de leucemia (LIF – leukemia inhibitory factor) e a
interleucina-6 (IL-6) são membros da família de citoquinas IL-6 produzidas por diferentes
células, incluindo mioblastos e macrófagos. (6)
50
A regeneração de músculo esquelético é atenuada após lesão no LIF de
camundongo mutante. A administração exógena de LIF aumenta o processo de
regeneração e produz aumento de miofibras. (6, 24, 38)
A IL-6 promove a degradação de tecido necrótico, sincroniza o ciclo de CS e
induz a apoptose de macrófagos após trauma muscular. (6, 30)
Diferente do LIF, a expressão de IL-6 em músculo lesado não aumenta a
proliferação de CS. Coletivamente, essa família de fatores de crescimento parece ter a
função integral na regeneração da musculatura esquelética. (6)
Muitos outros fatores podem estar envolvidos na regulação de CS de músculo
esquelético adulto, como, por exemplo, óxido nítrico e testosterona. (6)
2.1.2.5 Respostas funcionais das células satélites a estímulos fisiológicos
2.1.2.5.1 Estímulo hipertrófico
Exercícios de resistência e de carga induzem à hipertrofia muscular, tanto em
humanos como em modelos animais. (6) A hipertrofia muscular ocorre através de um
processo de ativação, proliferação e quimiotaxia de CS, além da fusão dessas células a
miofibras já existentes, para contribuir com o crescimento muscular. (39)
A capacidade migratória (quimiotaxia) das CS depende da integridade da lâmina
basal. Após a ruptura ou interrupção na lâmina basal ocasionada por miotrauma, CS podem
migrar para as miofibras adjacentes, utilizando pontes de tecidos. (40) Em resposta a
miotrauma em que não ocorra ruptura da lâmina basal, CS migram da porção proximal intacta
da miofibra, por baixo da lâmina basal, para o local do trauma, com a finalidade de participar
do processo de reparo. (39, 41)
51
Miotrauma induzido por exercícios provoca uma resposta imunológica, resultando
no fluxo de macrófagos para a região lesada. Após a fase aguda, a infiltração de macrófagos
chega ao máximo em quarenta e oito horas. Inicialmente, acreditava-se que a função desses
macrófagos era limitada à fagocitose e à digestão de fibras musculares necrosadas. Entretanto,
novas funções dos macrófagos, durante o estágio inicial do reparo muscular, foram descritas.
Os macrófagos são essenciais na orquestração do processo de reparo muscular, pois secretam
uma coleção de fatores citoquímicos que regulam o número de CS. (41, 42, 43)
Não há regeneração muscular na ausência de uma resposta dos macrófagos, mas,
na presença dessa resposta, ocorre aumento na proliferação e na diferenciação de CS. (44)
Na resposta a exercícios de resistência, o miotrauma resulta na liberação de fatores
de crescimento que irão, em parte, regular a população de CS durante a regeneração. (42)
Embora ainda existam dúvidas sobre a função das CS na remodelação muscular, a
conseqüência fisiológica primária da resposta hipertrófica é produzir um músculo com
capacidade para gerar força máxima. (6)
2.1.2.5.2 Estímulo atrófico
A atrofia de um músculo esquelético resulta na redução do número de núcleos da
miofibra e pode ser induzida por diversos fatores, como denervação, imobilização e nutrição
deficiente. (45)
Em experiências com ratos pré-púberes, a imobilização de um músculo levou à
diminuição do número e da capacidade proliferativa de CS, o que alterou irreversivelmente a
remodelação muscular. Isso não ocorreu em animais adultos, nos quais as CS proliferaram e
repovoaram o músculo atrófico. (46)
52
Após a denervação, há um aumento de CS na fase aguda; posteriormente, na fase
crônica, ocorre um decréscimo dessas células. (47)
2.1.2.5.3 Envelhecimento
O aumento da idade está associado à diminuição da capacidade de proliferação e
de diferenciação das CS. (6, 23, 48)
2.1.2.6 Respostas funcionais a estados de doença
A maioria das miopatias apresenta uma mutação molecular que afeta as proteínas
musculares, acarretando alterações estruturais no músculo esquelético. (6, 23)
A distrofia muscular de Duchenne é a mais comum e a mais devastadora das
distrofias musculares. (6, 23, 49) A progressão da doença e a morte ocorrem porque as CS
falham em manter a regeneração muscular. (6) É uma doença recessiva ligada ao cromossoma
X, que resulta em mutação em um gene relacionado a uma proteína do citoesqueleto da fibra
muscular. A ausência dessa proteína no citoesqueleto torna a fibra muscular extremamente
frágil. O estresse mecânico associado a contrações repetidas leva a uma degeneração difusa.
As CS respondem a essa lesão repovoando o músculo esquelético com miofibras defeituosas,
com falta de distrofina. Tal processo resulta em ciclos contínuos de degeneração-regeneração,
culminando com a exaustão das CS. (6, 23, 50, 51)
Renault et al. demonstraram que a sobrevida das CS provenientes de um paciente
de nove anos com distrofia muscular de Duchenne era de aproximadamente um terço da
sobrevida das CS de um indivíduo sadio com a mesma idade. (48)
53
2.1.2.7 Modelos de regeneração muscular
Uma estratégia para o estudo da ativação, da proliferação e da regeneração de CS
é produzir experimentalmente uma lesão muscular controlada. Estratégias incluindo
compressão, congelamento e lesão química induzida foram utilizadas com sucesso para o
estudo biológico das CS. (6, 38)
Um dos modelos mais estudados consiste na injeção da cardiotoxina (purificada
do veneno da cobra Naja nigricollis) no músculo gastrocnêmico, levando a uma degeneração
de cerca de 80% a 90% das fibras musculares. Seis horas após a lesão, as CS tornam-se ativas
e proliferam durante dois a três dias. A arquitetura do músculo lesado regenera-se após dez
dias. (6, 23)
2.1.3 Particularidades da musculatura ocular extrínseca
A presença de um grande número de isoformas da cadeia pesada da miosina (uma
das proteínas responsáveis pela contração muscular) representa uma das características que
tornam a musculatura ocular extrínseca distinta dos outros músculos esqueléticos. As
isoformas rápida e lenta, a específica para a musculatura cardíaca e as isoformas encontradas
no período de desenvolvimento e no período neonatal estão presentes na musculatura ocular
extrínseca. Existe também uma co-expressão de mais de um tipo de isoforma em uma mesma
fibra. (52, 53, 54)
Outra característica das fibras musculares da musculatura ocular extrínseca é a
expressão da forma imatura do receptor da acetilcolina e da N-CAM (neural cell adhesion
molecule). Essa é uma molécula de adesão celular envolvida entre células que se expressam
54
em fibras musculares em desenvolvimento ou em regeneração; ela é ausente em fibras
musculares esqueléticas adultas. (55, 56)
Fibras musculares esqueléticas normais de mamíferos adultos não são substituídas
nem remodeladas, a menos que sofram algum trauma. Após o trauma, as CS tornam-se ativas
e dividem-se, resultando na regeneração do músculo lesado. Os músculos em regeneração
expressam um número de fatores de crescimento miogênico e isoformas de cadeia pesada de
miosina imatura que permanecem metabolicamente ativas na musculatura ocular extrínseca
adulta lesada. (9,57)
McLoon e Wirtschafter demonstraram, em 2002, que existe uma adição contínua
de mionúcleos a miofibras normais, não lesadas, na musculatura ocular extrínseca de coelhos
e ratos adultos. (8, 57) Em 2003, os mesmos autores descreveram a presença de CS ativadas
nos MOE de macacos e humanos adultos normais. (9)
Novos estudos sobre o papel das CS na musculatura ocular extrínseca são
necessários para aumentar os conhecimentos e a capacidade de tratar desordens musculares
como, por exemplo, a distrofia muscular de Duchenne. (58)
55
2.2 Revisão da toxina botulínica do tipo A
2.2.1 Introdução
O fisiologista Claude Bernard, em 1875, escreveu que “venenos podem ser
empregados com o objetivo de destruir a vida ou como agentes terapêuticos na doença”.
Diversas substâncias tóxicas de origem animal e vegetal foram usadas na prática médica
durante sua época. Atualmente, uma grande variedade de substâncias venenosas de plantas,
animais e microrganismos é utilizada em estudos de fisiologia animal, e algumas já são
aplicadas medicinalmente em humanos. (59, 60)
A primeira descrição dos sintomas do botulismo foi publicada entre os anos de
1817 e 1822, pelo médico e poeta alemão Justinus Kerner (1786-1862). Kerner descreveu
clinicamente o botulismo: os sintomas, a duração dos sintomas e os achados clínicos (o
desaparecimento da secreção lacrimal, as pupilas dilatadas, a paralisia dos músculos oculares
extrínsecos, a supressão da secreção salivar, o ressecamento da pele, a paralisia dos músculos
esqueléticos e a preservação da cognição). Finalmente, Kerner sugeriu o uso terapêutico da
toxina causadora do botulismo para bloquear movimentos anormais, como na coréia, e o uso
em desordens como hipersecreção. (61, 62, 63)
Em 1895, a bactéria Bacilinum (posteriormente denominada Clostridium
botulinum) foi identificada por E. P. van Ermengem, professor de bacteriologia da
Universidade de Gante, na Bélgica. Na década de 1920, a toxina botulínica do tipo A foi
isolada na forma purificada pelo Dr. H. Sommer, da Universidade da Califórnia, São
Francisco. Em 1946, a toxina foi isolada na forma cristalina por Edward J. Schantz, ph.D. da
Universidade de Wisconsin-Madison. Na década de 1950, o Dr. Vernon Brooks provou que a
toxina botulínica bloqueia a liberação de acetilcolina nas extremidades nervosas motoras,
56
provocando um relaxamento dos músculos. Na década de 1960-1970, o processo de
purificação da toxina botulínica do tipo A foi aprimorado. (64)
A idéia de injetar um agente farmacológico nos músculos extrínsecos oculares
para produzir uma paralisia temporária foi de Conrad Behrens. Ele injetou álcool, método que
se demonstrou ineficaz. Em 1973, Alan Scott e colaboradores experimentaram várias drogas
como o di-isopropil-fluor-fosfato (DFP), a neurotoxina bungaro (toxina do veneno da cobra
Bungarus multicinactus), o álcool e a toxina botulínica tipo A – na tentativa de paralisar os
músculos extrínsecos oculares de macacos Rhesus. (3, 4, 65, 66)
A intoxicação alimentar, ou seja, o botulismo, provoca sintomas oculares como
visão embaçada e diplopia, pois paralisa os músculos oculares intrínsecos e extrínsecos. Daí a
idéia de se utilizar a toxina botulínica para provocar o enfraquecimento transitório de
músculos oculares e mudanças permanentes no alinhamento ocular, sem efeitos colaterais
severos. (3)
Scott iniciou a utilização da toxina botulínica do tipo A em seres humanos em
1977. Seus relatos preliminares haviam demonstrado que a toxina poderia ser utilizada como
alternativa à cirurgia tradicional de estrabismo. (3, 66)
Posteriormente, a toxina botulínica foi considerada eficaz para o tratamento de
outras patologias, como blefaroespasmo, espasmo hemifacial, mioquimias, entrópio da
pálpebra inferior, oftalmopatia de Graves, nistagmo, úlcera corneana e regeneração aberrante
do sétimo nervo. (65)
Em 1982, a toxina passou a ser utilizada, ainda experimentalmente, por vários
pesquisadores nos Estados Unidos e em outros países, sob a orientação de Scott. Foram
tratados 5 725 pacientes com estrabismo, 9 983 pacientes com blefaroespasmo e 3 571
pacientes com espasmo hemifacial. (65)
57
Em 29 de dezembro de 1989, o FDA (Food and Drug Administration) liberou a
toxina botulínica para o tratamento do estrabismo, do espasmo hemifacial e do
blefaroespasmo, em pacientes acima de 12 anos de idade. (60, 65)
2.2.2 Farmacologia
As toxinas do Clostridium botulinum (bactéria anaeróbica, Gram positivo) são
potentes neurotoxinas. São classificadas em oito sorotipos (A, B, C1, C2, D, E, F e G),
baseados nas propriedades imunológicas. Os tipos A, B e E são comumente associados à
intoxicação humana. O tipo A foi o primeiro a ser obtido na forma cristalizada, altamente
purificada e estável. (3, 60, 65, 66, 67)
A forma cristalizada do tipo A é uma proteína de alto peso molecular (cerca de 900
kDa [quilodaltons]) e consiste em duas subunidades que se dissociam em solução. Cada
subunidade (450 kDa) consiste de três cadeias peptídicas de peso molecular semelhante (150
kDa). Uma das cadeias é tóxica, enquanto as outras duas não têm toxidade. A cadeia peptídica
tóxica consiste de uma unidade pesada (100 kDa) e de uma leve (50 kDa). (65, 66, 67)
2.2.3 Mecanismo de ação
A ação da toxina botulínica do tipo A ocorre na terminação nervosa e é processada
em três etapas: acoplamento, internalização e paralisia. A toxina, quando injetada, é rápida e
firmemente acoplada aos receptores das fibras colinérgicas. O acoplamento ocorre através da
porção pesada da cadeia peptídica tóxica. A penetração da toxina através da membrana até o
compartimento intracelular é realizada pelas vesículas sinápticas. A paralisia muscular é
58
causada pela inibição da liberação da acetilcolina. A toxina ocupa os sítios que seriam
ocupados pelo cálcio e, desse modo, previne a exocitose da acetilcolina, que é cálciodependente. (65, 68, 69)
O efeito parético da toxina botulínica é dose-dependente, e o efeito máximo ocorre
de cinco a sete dias após a injeção. (70)
Histopatologicamente, o músculo denervado mostra atrofia muscular e um grau
leve de mudanças desmielinizantes na terminação nervosa, com subseqüente regeneração. O
tempo é de seis a nove meses para que se recupere totalmente dos efeitos da toxina. (3, 70, 71)
Os experimentos de Scott com macacos Reshus indicaram que:
1- a toxina botulínica produziu um enfraquecimento transitório dos músculos
oculares extrínsecos e mudanças permanentes no alinhamento ocular, sem efeitos colaterais
severos;
2- o início e a duração da denervação foram dose-dependentes;
3- o efeito da toxina foi reduzido pela injeção de antitoxina no músculo tratado (se
a injeção fosse aplicada de 0 minuto a 30 minutos após a primeira injeção);
4- injeções repetidas de toxina não foram reconhecidas pelo sistema imune;
5- os efeitos tóxicos locais foram evitados por imunização prévia com toxóide. (3,
70)
2.2.4 Preparações comerciais
A toxina botulínica do tipo A é comercializada com o nome de Botox® 100 U
(Allergan Herbert, Irvine, Califórnia), Dysport® 500 U (Speywood Group Beautour-Ipsen) e
Prosigne® 100 U (Cristália). (69)
59
Recentemente, a toxina botulínica do tipo B tornou-se disponível nos Estados
Unidos, com o nome de Myobloc™ (Elan Pharmaceuticals, South San Francisco, Califórnia),
e na Europa, com o nome de Neurobloc™. (72)
2.2.5 Imunologia da toxina botulínica
Como a toxina botulínica é uma proteína de origem não humana, ela pode
estimular a formação de anticorpos. Uma vez que anticorpos neutralizadores estejam
presentes, a eficácia da toxina será perdida. Entre os fatores que aumentam o risco de
formação de anticorpos estão altas doses e curtos intervalos entre os tratamentos.
Recomendações para minimizar a imunorresistência incluem a utilização de doses efetivas,
porém baixas, e em intervalos maiores. Quando a resistência a um sorotipo da toxina
botulínica desenvolve-se, a troca por outro sorotipo pode restaurar a resposta terapêutica. (5,
71, 73)
2.2.6 Efeitos colaterais
As injeções de toxina botulínica são geralmente bem toleradas. Após a aplicação, a
toxina se difunde dentro do músculo e de outros tecidos. O efeito é menor em áreas distantes
do local da injeção. Quando a toxina é aplicada em altos volumes, ela se espalha pelos
músculos adjacentes. (5)
Foram relatados casos de erupção difusa na pele e de edema no local da aplicação
durante alguns dias após a injeção. (65)
A ptose palpebral temporária é a complicação mais freqüente quando a toxina é
aplicada na região ocular. (65, 66)
60
Quando a toxina é injetada nos músculos do pescoço, pode ocorrer disfagia. (5, 74)
O eletromiógrafo ajuda a localizar acuradamente os músculos. (74)
2.2.7 Indicações
A toxina botulínica tornou-se um importante agente terapêutico, com ampla
aplicação em várias patologias.
O primeiro uso terapêutico da toxina botulínica purificada e altamente diluída foi
no tratamento de estrabismo, na década de 1970. (4)
Nos últimos anos, a toxina botulínica tem demonstrado ser útil no tratamento de
espasmos, movimentos involuntários, posturas anormais e dores associadas a várias
desordens.
A terapia com toxina botulínica tornou possível o controle de algumas condições
neurológicas que antes exigiam tratamento sistêmico, bem como tem evitado as
conseqüências dos espasmos musculares e dos movimentos involuntários de longa duração.
(74)
Injeções de toxina botulínica são agora consideradas o tratamento de escolha para
a maioria dos pacientes com distonia focal ou segmentar. A distonia é uma desordem
neurológica caracterizada por contrações repetitivas e padronizadas dos músculos, o que
produz movimentos e posturas anormais. (71)
A toxina botulínica também é o tratamento de escolha para o blefaroespasmo
primário (fechamento involuntário dos olhos). As aplicações são feitas no músculo orbicular
das pálpebras superior e inferior. (75, 76)
A distonia oromandibular é manifestada pelo fechamento involuntário da
mandíbula, pelo bruxismo, pela abertura da mandíbula ou pelo desvio desta. A injeção da
61
toxina botulínica no músculo masseter, no temporal e no pterigóide interno dos pacientes com
distúrbio de fechamento da mandíbula, bem como no digástrico e pterigóide externo dos
pacientes com distúrbio de abertura da mandíbula, melhora acentuadamente os sintomas da
síndrome da articulação têmporo-mandibular e de outros problemas orais e dentais. (5, 71)
O espasmo hemifacial é outra desordem para a qual se indica o tratamento com a
toxina botulínica. Ao contrário do blefaroespasmo, o espasmo hemifacial é unilateral e
usualmente causado por compressão ou irritação do nervo facial devido a uma artéria
aberrante ou a vascularização anormal. (71, 77)
Outras indicações:
a) distonia cervical; (71)
b) distonia laringeal; (5, 71, 74)
c) câimbras (distonias ocupacionais); (5, 71, 78)
d) doença de Parkinson; (71)
e) tremores; (79)
f) desordens no tônus muscular, incluindo espasticidade associada à paralisia
cerebral, acidente vascular cerebral, traumatismo cranioencefálico e esclerose
múltipla; (80,81)
g) fissura anal; (82)
h) cefaléia por contração muscular e enxaquecas; (83)
i) hiper-hidrose palmar; (84)
j) desordens geniturinárias; (85)
l) rugas ou linhas de expressão. (86)
62
2.3 Revisão da crotoxina
2.3.1 Introdução
Em 1938, Slotta e Fraenkel-Conrat isolaram a crotoxina (Crtx) do veneno da
cobra Crotalus durissus terrificus (a cascavel sul-americana), tendo sido essa a primeira
toxina de veneno de cobra a ser obtida na forma cristalizada. (87, 88)
A
Crtx
pertence
à
classe
das
β-neurotoxinas,
que
bloqueiam
a
neurotransmissão nas junções neuromusculares, primariamente, em nível pré-sináptico,
impedindo a liberação da acetilcolina. Todas β-neurotoxinas são fosfolipases A2. (89)
A Crtx é composta por duas subunidades distintas: a subunidade B - a
crotactina de peso molecular de aproximadamente 14,5 kDa, enzima fosfolipásica A2
básica, com fraca toxicidade - e a subunidade A - chamada de crotapotina, com peso
molecular de aproximadamente 9,5 kDa, ácida, não tóxica, não enzimática e constituída
de três cadeias polipeptídicas (α, β e γ). (90, 91, 92, 93)
As duas subunidades da Crtx atuam de maneira sinérgica. A subunidade B
sozinha pode ser fracamente tóxica e bloquear a transmissão neuromuscular, embora altas
doses sejam necessárias para provocar o mesmo efeito. A ligação da subunidade B às
membranas sinápticas não é específica. A subunidade A se comporta como
potencializador da ação da subunidade B, pois reduz a ligação não específica. (92, 94, 95)
Após interagir com a membrana sináptica, o complexo Crtx se desassocia: a
subunidade B se liga à membrana, enquanto a subunidade A é liberada. (92, 94, 95)
63
2.3.2 Estrutura
Em 1985, Achari et al. obtiveram cristais da Crtx, e Mascarenhas et al. (1992)
construíram um modelo computacional da estrutura da toxina. (FIGURA 5) (96, 97)
FIGURA 5: Modelo computacional da estrutura da crotoxina. Np, Cp:
extremidades de amino e carboxi terminal da subunidade básica. Na ,Ca, Nb,
Cb, Nc, Cc : extremidades amino e carboxi terminal das cadeias α, β, γ da
subunidade ácida.
Fonte: Mascarenhas YP, Stouten PFW, Beltran JR, Laure CJ, Vriend G.
Structure-function relationship for the highly toxic crotoxin from Crotalus
durissus terrificus. Eur Biophys J 1992; 21: 199-205.
2.3.3 Mecanismo de ação
Foi demonstrado, em estudos eletrofisiológicos, que a Crtx produz um
bloqueio neuromuscular em três fases. Na fase inicial, há uma redução na amplitude dos
potenciais provocada pela inibição transitória da liberação do neurotransmissor,
relacionada provavelmente à ligação da toxina ao sítio receptor. (5, 97)
64
Na fase seguinte, ocorre um aumento na amplitude dos potenciais, durante 20 a
30 minutos, em conseqüência de uma estimulação na liberação do neurotransmissor. (98,
99)
A última fase mostra um progressivo decréscimo na amplitude dos potenciais,
até o seu completo desaparecimento. Essa última fase leva a um bloqueio completo na
transmissão neuromuscular. (98, 99)
Em 1983, Muniz e Diniz observaram uma redução na contração da
musculatura lisa dos fragmentos de músculo longitudinal do plexo mioentérico de íleo de
cobaia; tal redução foi ocasionada pela ação da Crtx. Adicionando-se acetilcolina, a
contração permaneceu inalterada. Portanto, a redução na contração parece ser de natureza
pré-sináptica. (100, 101)
A hipótese de que o bloqueio fosse pré-sináptico foi confirmada, uma vez que
a liberação de acetilcolina foi significativamente deprimida pela Crtx. (101)
A Crtx também afeta a cinética do potencial de ação demonstrado em estudos
realizados em músculos esqueléticos de rãs. (97)
A Crtx aumenta a duração do potencial de ação e diminui a velocidade de
despolarização e repolarização. Provavelmente, interfere nos canais de sódio e, assim,
retarda a repolarização. (5)
O potencial de repouso não é afetado, o que se acredita que a inativação dos
canais de sódio e a ativação dos canais de potássio ocorram. Essas alterações nos
potenciais de ação devido à atuação nos canais iônicos não dependem da atividade
fosfolipásica da crotoxina e são inibidas ao substituir-se cálcio por estrôncio. (102, 103)
A Crtx também inibe a captação por sinaptossomas de noradrenalina,
dopamina e serotonina. Observou-se que a Crtx pode inibir a captação de colina,
dependendo do tempo e da atividade fosfolipásica. (104, 105, 106)
65
A Crtx pode causar miotoxicidade, necrose degenerativa do músculo
esquelético, hemólise, neurotoxicidade e insuficiência renal aguda com necrose tubular.
Através da microscopia eletrônica, observou-se que a Crtx lesa as estruturas pré-sinápticas
antes de lesar o músculo. As primeiras estruturas afetadas, quando administradas doses
letais de Crtx em cobaias, foram as mitocôndrias e depois as vesículas sinápticas. Apenas
posteriormente é que surgiram os sinais de intoxicação sistêmica. (107, 108, 109, 110,
111)
2.3.4 Imunologia da crotoxina
Uma proteína denominada crotoxin inhibitor from Crotalus serum (CICS)
neutraliza a toxicidade e inibe a atividade enzimática da Crtx. (112, 113)
A interação molecular entre a CICS e a Crtx é semelhante ao mecanismo de
ligação entre a Crtx e seu receptor. Supõe-se que a CICS atue como um falso receptor
para a Crtx. Desse modo, a ligação da Crtx com a membrana do neurônio periférico é
evitada. A CICS liga-se à subunidade básica da Crtx, o que impede a atividade
neurotóxica e fosfolipásica. (112, 113)
2.3.5 Utilização da crotoxina
A Crtx tem sido mencionada no tratamento de vários pacientes com câncer.
Cura et al., em 2002, realizaram a primeira fase de um ensaio clínico com a Crtx em
pacientes com tumores sólidos, refratários ao tratamento convencional. Vinte e três
pacientes foram avaliados após a administração de Crtx (injeções intramusculares diárias,
por trinta dias, em doses acima de 0,9 mg). Nenhuma morte relacionada à toxina ocorreu
66
durante esse estudo. Reações locais e diplopia foram os efeitos colaterais mais
observados. Nenhuma alteração respiratória foi observada. Dezoito dos 23 pacientes
relataram uma progressiva melhora ou mesmo o desaparecimento da dor. Não houve
progressão da doença em quatro pacientes. Pacientes com carcinoma de tireóide e
carcinoma retal tiveram suas massas tumorais reduzidas. (114)
Yan et al., em 2006, investigaram a participação da autofagia e da apoptose na
morte induzida por Crtx da linhagem de células K562 da leucemia mielóide crônica. A
neurotoxina, dependendo da dose, inibiu a viabilidade de células K562. (115)
Outros estudos têm demonstrado que, além do potente efeito antitumoral, a
Crtx tem um alto efeito analgésico, o que contribui para torná-la uma valiosa droga contra
o câncer. (115)
Em 2001, Ribeiro realizou um estudo em 12 coelhos para avaliar a ação e a
aplicabilidade da Crtx na indução da paralisia da musculatura extrínseca ocular,
comparando seus efeitos com os da toxina botulínica do tipo A. Verificou-se que a Crtx
foi capaz de induzir uma paralisia transitória do músculo reto superior (músculo no qual
foi realizada a aplicação da toxina). Esse efeito foi caracterizado pela redução na
amplitude dos potenciais de ação e sinais inespecíficos de fibrilação. A ação da Crtx
proporcionou efeito semelhante ao da toxina botulínica do tipo A, o que foi comprovado
através dos estudos anatomopatológico e eletromiográfico. (5)
67
3 Objetivos
68
3 Objetivos
1)Verificar a ocorrência de ativação ou inibição de células satélites miogênicas após a
aplicação de toxina botulínica do tipo A e de crotoxina no músculo reto superior de coelhos.
2) Avaliar comparativamente o efeito da aplicação de toxina botulínica do tipo A e de
crotoxina nas células satélites de músculos retos superiores de coelhos.
3) Verificar se há correlação entre a dose de toxina botulínica ou de crotoxina a ser
aplicada e a ativação ou inibição das células satélites.
4) Verificar se há correlação entre o volume de toxina botulínica ou de crotoxina a ser
aplicado e ativação ou inibição das células satélites.
5) Verificar se o tempo de vida após a aplicação de toxina botulínica ou de crotoxina
contribui para a ativação ou inibição das células satélites.
6) Analisar histologicamente o músculo reto superior de cada coelho e verificar se há
correlação com a ativação ou inibição da células satélites.
69
4 Material e métodos
70
4 Material e métodos
A amostra deste estudo experimental e longitudinal foi constituída de 29 coelhos
machos albinos, da raça Nova Zelândia, com peso variando de 1,5 kg a 2,5 kg, clinicamente
sadios, provenientes da Fazenda Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais
(Igarapé – MG). O projeto da presente pesquisa (Protocolo número 28/2006) foi aprovado
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG), em 28/6/2006. (ANEXO
A)
A pesquisa foi conduzida obedecendo-se aos critérios recomendados pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e respeitando a Lei Federal Brasileira
número 6 638, de maio de 1979, que “estabelece normas para a prática didático-científica da
vivissecção de animais”. Os animais foram mantidos em gaiolas suspensas, com água e ração
específica para a espécie ad libitum, no biotério da Faculdade de Medicina Veterinária da
Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC), em Juiz de Fora, Minas Gerais.
Os coelhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo botox (GB) e grupo
crotoxina (GCrtx).
O GB foi formado pelos coelhos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14. O GCrtx,
pelos coelhos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Aplicou-se a toxina
botulínica do tipo A ou a crotoxina no músculo reto superior do olho direito de cada coelho.
Em cada músculo reto superior do olho esquerdo dos coelhos do GB e do GCrtx, foi aplicado
soro fisiológico a 0,9%, em volume igual ao das toxinas. O grupo assim formado foi chamado
de grupo controle (GC). O QUADRO 2 mostra a distribuição dos grupos.
A aplicação foi realizada após a instilação de colírio anestésico de cloridrato de
benoxinato a 0,4% (oxibuprocaína - Oxinest® - Latinofarma Indústrias Farmacêuticas Ltda.,
Cotia, SP) no saco conjuntival de cada olho. A toxina botulínica do tipo A (Botox® –
71
Allergan Pharmaceuticals Ltd. – Westport, Irlanda) e a crotoxina (cedida pela Divisão de
Imunobiológicos da Fundação Ezequiel Dias de Belo Horizonte - MG [FUNED]) foram
injetadas no músculo reto superior do olho direito de cada coelho com uma seringa de insulina
(BD Plastipak® Becton Dickinson Ind. Cirúr. Ltda., Curitiba, PR). Foi utilizada a técnica de
aplicação segundo Ribeiro (5). Após a colocação de um blefarostato no olho do animal, foi
utilizada uma pinça denteada para elevar a conjuntiva. A agulha foi introduzida
transconjuntivalmente e penetrada no músculo reto superior, a aproximadamente 4 mm da
inserção muscular. A toxina foi injetada lentamente. As FIGURAS 6 e 7 ilustram a aplicação
da toxina no olho direito de um dos coelhos.
No coelho 5, não foi aplicada a solução salina a 0,9% no olho esquerdo, pois o animal
apresentava atrofia ocular, por provável trauma perfurante.
No coelho 13, houve extravasamento de toxina botulínica durante a aplicação.
A dose de crotoxina utilizada foi baseada na comparação entre a dose letal mínima da
crotoxina e a dose letal mínima da toxina botulínica do tipo A, ambas para camundongos
(DL-50: dose que mata exatamente metade de uma população de animais, geralmente no
período de 7 a 14 dias). Uma unidade de toxina botulínica do tipo A comercializada (Botox®)
equivale a uma DL-50 para camundongos. A crotoxina utilizada possuía uma DL-50 de 1,5
μg (equivalente a 1 U). A toxicidade é determinada pela dose letal mínima que mata 50% dos
animais inoculados - DL-50, (camundongos swiss-webster, com peso entre 18 g e 22 g). A
dose mínima eficaz estimada de crotoxina, comparada com a de toxina botulínica do tipo A,
em estudo de Scott, Rosenbaum e Collins (1973), seria de 0,15 μg. (3)
Os QUADROS 3 e 4 mostram as doses de toxina botulínica e crotoxina aplicadas em
cada coelho.
72
QUADRO 2
Distribuição dos coelhos em grupos
Grupos
Olho da aplicação
Identificação dos coelhos
Grupo Botox (GB)
*OD (14 olhos)
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13 e 14
Grupo Crotoxina (GCrtx)
OD (15 olhos)
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e
29
Grupo Controle (GC)
**OE (28 olhos)
1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28 e 29
* OD: olho direito
** OE: olho esquerdo
73
.
FIGURA 6: Aplicação de toxina no músculo reto superior do olho direito de
coelho.
FIGURA 7: Fase final da aplicação de toxina no músculo reto superior do olho
direito. Observa-se discreta quemose após a aplicação.
74
QUADRO 3
Toxina botulínica aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 1 a 14
Identificação
Toxina
Volume
dos coelhos
aplicada e
aplicado
Data da aplicação Músculo em que
foi aplicada
dosagem
1
Botox® 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD*
2
Botox® 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
3
Botox® 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
4
Botox® 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
5
Botox® 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
6
Botox® 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
7
Botox® 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
8
Botox® 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
9
Botox® 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
10
Botox® 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
11
Botox® 2,5 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
12
Botox® 2,5 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
13
Botox® 2,5 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
14
Botox® 2,5 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
* Reto superior do olho direito
75
QUADRO 4
Crotoxina aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 15 a 29
Identificação Toxina aplicada Volume
Data
dos coelhos
aplicação
e dosagem
aplicado
da Músculo
em
que
foi
aplicada
15
Crotoxina 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD*
16
Crotoxina 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
17
Crotoxina 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
18
Crotoxina 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
19
Crotoxina 10 U
0,5 ml
25/11/2006
RS OD
20
Crotoxina 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
21
Crotoxina 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
22
Crotoxina 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
23
Crotoxina 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
24
Crotoxina 5 U
0,25 ml
25/11/2006
RS OD
25
Crotoxina 2 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
26
Crotoxina 2 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
27
Crotoxina 2 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
28
Crotoxina 2 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
29
Crotoxina 2 U
0,1 ml
25/11/2006
RS OD
*Reto superior do olho direito
76
4.1 Estudos anatomopatológico e imunoistoquímico
Os animais foram sacrificados por médico veterinário, nos momentos estabelecidos (12º,
18º e 25º dias após as aplicações), com tiopental sódico (Thiopentax – Cristália), na dosagem
de 20 mg/kg, seguido de injeção intracardíaca de cloreto de potássio a 10%. O QUADRO 6
esquematiza os dias das eutanásias e os coelhos sacrificados.
QUADRO 5
Relação dos dias em que foram realizadas as eutanásias dos coelhos, coelhos sacrificados
e número de olhos enucleados.
Dia da eutanásia
Identificação dos coelhos sacrificados
Total de olhos
07/12/2006
1, 6, 11, 15, 20, 25
12
13/12/2006
2, 3, 7, 8, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27
22
20/12/2006
4, 5, 9, 10, 13, 14, 18, 19, 23, 24, 28, 29
23
Total: 29 coelhos
Total: 57 olhos
Posteriormente, os olhos foram cuidadosamente enucleados, mantendo-se os músculos
retos superiores intactos. (FIGURA 8) Os músculos mediam de 10 a 15 milímetros. Os globos
oculares foram colocados em frascos numerados, com formol tamponado a 10%.
Os músculos retos superiores foram desinseridos dos globos oculares com auxílio de
uma tesoura de ponta. Cada músculo foi colocado em cassete plástico e identificado com o
mesmo número contido no frasco de origem. O material foi levado para o processador de
tecidos (Autothecnicon), no qual foi submetido a seis lavagens com álcool absoluto (uma hora
77
cada lavagem), a três lavagens com xilol (uma hora cada lavagem) e a duas lavagens de
parafina a 68°C (uma hora e trinta minutos cada lavagem). Posteriormente, o material foi
incluído em blocos de parafina e igualmente identificado.
FIGURA 8 - Globo ocular de coelho enucleado.
Músculo reto superior preservado.
Os blocos foram cortados em micrótomo manual (Spencer 820), com navalha
descartável. Os cortes, com espessura de três micra, foram colocados em banho-maria à
temperatura de 60°C e, posteriormente, estendidos em lâminas especiais de silano
(dimetiltrietoxisilano-SIGMA - A - 3648), com a mesma identificação dos blocos. O material
foi desparafinado em estufa, a 70°C, por cinco minutos. As lâminas foram colocadas em
berços de vidro, passando por três cubas de vidro contendo xilol e três cubas de vidro
contendo álcool absoluto; finalmente, foram lavadas em água corrente.
Os cortes histológicos foram submetidos à coloração pela hematoxilina-eosina e a
estudo imunoistoquímico, conforme o seguinte protocolo:
78
Primeiro processo:
1- Bloqueio da peroxidase endógena por meio de quatro lavagens de cinco minutos em
água oxigenada 10 volumes.
2- Lavagem em água corrente por dez minutos.
3- Recuperação antigênica, feita em panela de pressão contendo solução de ácido cítrico
(0,01M, pH 6,0). Quando a panela soltou a pressão, fez-se a contagem de dois minutos e vinte
segundos; posteriormente, a panela foi esfriada em água corrente por quatro minutos.
4- Lavagem das lâminas em tampão salínico (PBS) de pH 7,40 (duas lavagens de cinco
minutos).
5- Diluição dos anticorpos em solução de PBS e soro de albumina bovina
(Sigma/B4287).
6- Para o anticorpo Myo-D1 (Novocastra Lab.), foi utilizada uma concentração de 1
microlitro de anticorpo para 50 microlitros de solução diluente. Para o anticorpo PCNA
(proliferating cell nuclear antigen – Kit EmVision TM Doublestain Syatem, DAKO Corp.,
Dinamarca), foi utilizado 1 microlitro de anticorpo para 200 microlitros de solução.
7- Incubação das lâminas com o anticorpo.
8- Secagem com papel absorvente, somente ao redor do corte. Colocação dentro de uma
vasilha plástica, sobre uma espuma umedecida (câmara úmida). Com auxílio de uma pipeta
graduada, instilou-se o anticorpo em torno de 100 microlitros ou até que cobrisse o corte. Isso
foi feito em cada lâmina.
9- Terminado o processo, a câmara úmida foi fechada com tampa própria e colocada na
estufa, a 40°C, por trinta minutos.
10- Após esse tempo, a câmara foi levada à geladeira, a 4°C, por quinze horas.
79
Segundo processo:
1- A câmara úmida foi retirada da geladeira e deixada à temperatura ambiente por
quinze minutos.
2- O anticorpo foi aspirado e lavado com tampão PBS (duas lavagens de cinco minutos).
3- Foi feita incubação com a solução de biotina (DAKO – kit LSAB/ K-690) pronta para
uso, a 40°C, por vinte minutos.
4- A câmara úmida foi retirada da estufa e deixada à temperatura ambiente por oito
minutos.
5- O anticorpo foi aspirado e lavado com tampão PBS (duas vezes, por cinco minutos).
6- Foi feita incubação com a solução de Streptavidina (DAKO - kit LSAB/K-690)
pronta para uso, a 40°C, por vinte minutos.
7- A câmara úmida foi retirada da estufa e deixada à temperatura ambiente por oito
minutos.
8- Foi feita aspiração e lavagem com tampão PBS (duas vezes, por cinco minutos).
9- As lâminas foram colocadas na solução cromógeno por cinco minutos, a 40°C.
(Solução cromógeno: 200 ml de PBS 7,40; 0,12 g de 3,3 diaminobenzidina – DAB [Sigma/D5 637]; 3 ml de água oxigenada 100 volumes. DAB dissolvido em PBS, filtrado com papelfiltro, mais 3 ml de água oxigenada). As lâminas foram colocadas em uma cuba de vidro e
levadas para a estufa.
10- Contra-coloração com hematoxilina de Harris.
11- Lavagem em água corrente por dez minutos.
12- Lavagem das lâminas em três banhos de álcool e três de xilol.
13- Montagem das lâminas com verniz Acrilex e lamínula.
80
Controles positivos (biópsia de rabdomiosarcoma) e negativos (omissão do anticorpo
primário) foram utilizados para avaliar e controlar as reações imunoistoquímicas.
Ao lado da identificação de cada lâmina, situou-se o corte histológico com Myo D; à
direita, o corte histológico com PCNA. (FIGURA 9)
Núcleos celulares corados em marrom são positivos para o Myo D; núcleos celulares
corados em azul são negativos para o Myo D (FIGURA 10).
Os núcleos positivos para o PCNA foram corados em marrom. (FIGURA 11)
As lâminas foram mantidas com suas identificações recobertas durante a análise,
realizada em microscópio da marca Nikon, por dois patologistas. As lâminas coradas pela
hematoxilina-eosina foram examinadas e fotografadas com máquina fotográfica digital Sony
Cyber-shot DSC-H1, acoplada à ocular do microscópio. Nas lâminas preparadas para a
avaliação imunoistoquímica, foram examinadas cem miofibras escolhidas ao acaso, com
aumento de mil vezes (ocular de dez vezes e objetiva de cem vezes); foi feita a contagem dos
núcleos positivos para o Myo D e para o PCNA, bem como a contagem do total de CS
(núcleos positivos e negativos para os marcadores).
81
FIGURA 9 - Lâmina preparada para análise imunoistoquímica. À esquerda,
identificação que foi recoberta durante toda a contagem no microscópio. A primeira
preparação foi feita com Myo D (seta em azul); a segunda (lado esquerdo), com PCNA
(seta em verde).
82
FIGURA 10 - Corte longitudinal do músculo reto superior de um coelho, submetido à
marcação pelo anticorpo anti-Myo D. Núcleo positivo para o Myo D é corado em
marrom (círculo verde). (Aumento de mil vezes).
83
FIGURA 11- Corte de músculo reto superior de um coelho submetido à marcação pelo
anticorpo anti-PCNA. Os núcleos marcados em marrom são positivos para o PCNA
(círculos verdes) (Aumento de mil vezes).
84
Encerrada a contagem das células em cada lâmina, os dados foram analisados,
calculando-se as médias aritméticas, o desvio-padrão e a amplitude da variação. Todas as
informações colhidas foram armazenadas em um banco de dados criado no programa Excel,
versão 7 (Microsoft Corporation, EUA); posteriormente, as informações foram analisadas
com o pacote estatístico SPSS (Statistical Package for Social Science), versão 11,0.
4.2 Metodologia estatística
Este estudo experimental caracterizou-se por uma amostra de 29 coelhos, dos quais
foram tomados como unidades independentes de análise os seus olhos (57 olhos, sendo 29
olhos direitos e 28 olhos esquerdos).
As variáveis independentes foram representadas pelas substâncias injetadas no
músculo reto superior do olho direito desses coelhos, bem como pelos co-fatores tempo de
vida após a aplicação, volume aplicado e dose das substâncias.
A avaliação do efeito foi realizada pela medida da ativação dos núcleos de células
satélites, pelos dois marcadores, segundo o cálculo:
% núcleos ativados = nº de núcleos ativados/100 miofibras
/ total de núcleos/100 miofibras
As variáveis dependentes foram representadas pela porcentagem de núcleos de CS
ativados. (DIAGRAMA 1)
85
Variáveis
Independentes
(causas)
Principal
(variável categórica)
Dependentes
(efeitos)
Co-fatores
(variáveis contínuas,
numéricas)
Toxina botulínica e
crotoxina
% dos núcleos de CS
ativados corados pelo
MyoD e PCNA(variável
contínua, numérica)
Tempo de vida após a
aplicação, volume aplicado
e dose da substância
aplicada
DIAGRAMA 1: Representação gráfica das variáveis do presente estudo.
O modelo estatístico empregou a comparação de médias de porcentagem de núcleos de
CS ativados entre os grupos definidos pelo tipo de substância. Isso foi representado através de
gráficos, tabelas e testes estatísticos.
Inicialmente, foram realizadas as análises entre os três grupos, utilizando-se testes de
diferenças de médias.
Para avaliar a diferença das médias de porcentagem de núcleos de CS ativados entre os
grupos de substâncias, utilizou-se o teste de ANOVA, quando foram atendidos os
pressupostos de normalidade e homogeneidade das variâncias. No caso do não atendimento
dos pressupostos, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis.
86
Para avaliação da normalidade, foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov.
Para avaliação da homogeneidade das variâncias, utilizou-se o teste de Levene.
Para avaliar a existência de correlação entre o percentual de núcleos ativados, as doses,
os volumes e os dias de vida após a aplicação, foram utilizados o coeficiente de Pearson e a
inspeção do diagrama de dispersão. Esse coeficiente fornece uma medida da força de
associação linear entre duas variáveis contínuas.
A interferência dos co-fatores nas associações foi avaliada com o teste ANOVA de
dois critérios, quando atendidos os pressupostos dos testes paramétricos.
Todos os resultados foram considerados significativos em um nível de significância de
5% (α = 0,05). Portanto, é possível ter 95% de certeza de que as conclusões estavam corretas.
Valores de p entre 0,05 e 0,10 foram considerados marginalmente significativos.
87
5 Resultados
88
5 Resultados
Os coelhos foram examinados diariamente, para observação de existência de efeitos
colaterais locais e sistêmicos. Não foram utilizados colírios nem medicação sistêmica na pósaplicação. Não houve mudança no comportamento dos animais nem prostração.
Ptose palpebral direita moderada ocorreu nos coelhos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, com duração média de cinco dias; ptose palpebral direita
discreta ocorreu nos demais coelhos, por dois dias. No olho esquerdo, não se observou ptose.
O QUADRO 6 resume a ocorrência de ptose palpebral no olho direito dos coelhos. As
FIGURAS 12 e 13 demonstram a ocorrência de ptose palpebral nos coelhos números 12 e 23.
QUADRO 6
Ocorrência de ptose palpebral no olho direito dos coelhos após a aplicação de toxina
botulínica e de crotoxina.
Coelhos
Ptose moderada em OD
Ptose discreta em OD
GB
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
11, 12, 13, 14
GCrtx
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24
25, 26, 27, 28, 29
89
FIGURA 12: Ptose palpebral discreta em olho direito do coelho 12.
FIGURA 13: Ptose palpebral moderada em olho direito do coelho 23.
90
Houve sinais de hiperemia conjuntival em todos os coelhos no primeiro dia após a
aplicação. Tais sinais desapareceram, na maioria dos animais, no terceiro dia após a aplicação.
Secreção conjuntival não foi observada. O coelho 28 apresentou, no terceiro dia, lesão na
pálpebra inferior do olho esquerdo (conforme indicada na FIGURA 14), ferimento
provavelmente causado por conflito com outros coelhos.
FIGURA 14: Coelho 28 com lesão na pálpebra inferior esquerda causada por provável
ferimento traumático.
91
5.1 Análise estatística dos dados
Dos 57 músculos retos superiores de coelhos estudados, 14 receberam aplicação de
toxina botulínica (grupo botox), 15 receberam crotoxina (grupo crotoxina) e 28 receberam
solução salina (grupo controle). O ANEXO B apresenta tabelas (TABELAS 1 e 2) que
sumarizam a contagem de núcleos de CS corados e o total de núcleos visualizados nos três
grupos.
Os pressupostos da normalidade foram atendidos para ambas as variáveis dependentes
(p = 0,20). Com relação à homogeneidade das variâncias, o teste de Levene indicou
homogeneidade para os núcleos marcados com Myo D (p = 0,626) e não homogeneidade para
os núcleos marcados com PCNA (p = 0,017).
5.1.1 Comparação das médias entre os grupos independentemente dos cofatores
5.1.1.1 Comparações com o grupo controle
Após a realização dos testes para a análise entre os grupos dos percentuais de
contagem dos núcleos corados respectivamente pelo Myo D e pelo PCNA, notou-se que a
diferença entre os efeitos mensurados foi estatisticamente significativa (p = 0,000).
A inspeção visual dos box-plots (GRÁFICOS 1 e 2) sugere que o grupo controle foi o
responsável pela significância apresentada.
A TABELA 3 mostra as análises descritivas das médias dos percentuais de núcleos
corados respectivamente pelo Myo D e pelo PCNA.
92
TABELA 3
Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e PCNA nos grupos controle, botox e
crotoxina
Marcadores Grupos
MyoD
(p=0,000)
PCNA
(p=0,000)
N
Média
33,6
Desvio
padrão
11,2
Valor
mínimo
14,4
Valor
máximo
51,8
Controle
28
Botox
14
47,6
13,1
30,1
66,9
Crotoxina
15
52,2
14,0
23,4
71,0
Controle
28
37,3
10,7
12,2
54,3
Botox
14
51,7
16,8
23,7
72,0
Crotoxina
15
56,9
11,5
35,7
73,4
93
Os GRÁFICOS 1 e 2 são representações em box-plot dos percentuais de núcleos de
CS ativados corados pelo Myo D e pelo PCNA em cada grupo.
80,00
70,00
pcmyo
60,00
50,00
40,00
30,00
48
20,00
10,00
controle
botox
crotox
Grupo
GRÁFICO 1: Representação em box-plot dos percentuais de núcleos de CS ativados e
marcados pelo MyoD.
94
80,00
70,00
pcPCNA
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
controle
botox
crotox
Grupo
GRÁFICO 2: Representação em box-plot dos percentuais de núcleos de CS ativados e
marcados pelo PCNA.
95
5.1.1.2 Comparação sem o grupo controle
A TABELA 4 mostra que não houve diferença estatisticamente significativa entre os
grupos botox e crotoxina em relação aos núcleos corados pelo Myo D (p = 0,374) e pelo
PCNA (p = 0,485).
TABELA 4
Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos botox e crotoxina
Myo D
(p = 0,374)
PCNA
(p = 0,485)
Grupos
N
Média
Desvio
padrão
Valor
mínimo
Valor
máximo
Botox
14
47,6
13,1
30,1
66,9
Crotoxina
15
52,2
14,0
23,4
71,0
Botox
14
51,7
16,8
23,7
72,0
Crotoxina
15
56,9
11,5
35,7
73,4
96
5.1.2 Avaliação da influência dos co-fatores nos grupos
5.1.2.1 Comparação entre a dose e a resposta
A TABELA 5 demonstra que a relação entre a dose e a resposta não foi significativa
em nenhum dos grupos analisados. Vale ressaltar que essa tabela mostra apenas o efeito da
dose dentro de cada grupo de substância, sem comparação dos grupos entre si.
TABELA 5
Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo com as
doses
Grupos
Doses
N Média Desvio padrão Valor mínimo Valor máximo
Botox
2,5 U
4
46,84
12,25
35,65
58,97
Marcador MyoD 5,0 U 5
(p=0,864)*
10,0 U 5
45,60
50,30
15,45
13,91
31,10
30,06
66,87
64,65
Botox
Marcador
PCNA
(p=0,761)**
2,5 U 4
5,0 U 5
10,0 U 5
54,12
46,95
54,51
17,58
19,28
16,42
34,38
23,66
27,73
70,54
72,05
68,01
Crotoxina
Marcador
MyoD
(p=0,936)*
2,0 U 5
5,0 U 5
10,0 U 5
52,31
50,43
53,88
14,11
18,26
12,12
28,91
23,37
37,56
64,95
71,02
69,13
2,0 U 5
Crotoxina
Marcador PCNA 5,0 U 5
(p=0,852)**
10,0 U 5
58,53
55,59
56,61
14,94
8,40
12,68
35,75
42,86
38,05
73,38
64,44
70,61
* ANOVA; ** Teste de Kruskal-Wallis
97
Os GRÁFICOS 3 e 4 são diagramas de dispersão que representam a correlação entre a
dose e o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D e pelo PCNA, respectivamente.
O coeficiente de correlação (r) para o grupo botox foi igual a 0,14 e a 0,06 (Myo D e PCNA,
respectivamente) e para o grupo crotoxina foi igual a 0,06 e a 0,05 (Myo D e PCNA,
respectivamente). Esses resultados sugerem que não houve correlação estatisticamente
significativa entre a dose e o aumento do percentual de núcleos ativados, ou seja, que a dose
não interferiu no aumento de ativação das CS.
GRÁFICO 3: Diagrama de dispersão representando a correlação entre a dose (U) e o
percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D.
98
GRÁFICO 4: Diagrama de dispersão representando a correlação entre a dose (U) e o
percentual de núcleos ativados marcados pelo PCNA.
Ao realizar-se a análise de variância de dois critérios (para o marcador Myo D), testouse também a hipótese de nulidade (H0), ou seja, de que não há interação entre os dois fatores
(substância e dose). Como a estatística de teste não excedeu o valor crítico, não se rejeitou a
H0 (p = 0,925). Portanto, há evidências para concluir que os efeitos substância/dose são
independentes. Os resultados desse tipo de análise sugerem significância marginal tanto para a
substância (p = 0,094) quanto para a dose (p = 0,100).
99
5.1.2.2 Comparação entre o volume e a resposta
A TABELA 6 demonstra que a relação entre o volume e a resposta não foi
significativa em nenhum dos grupos analisados. Vale ressaltar que essa tabela mostra apenas
o efeito do volume dentro de cada grupo de substância, sem comparação dos grupos entre si.
Os GRÁFICOS 5 e 6 são diagramas de dispersão que representam a correlação entre
o volume e o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D e pelo PCNA,
respectivamente. O coeficiente de correlação (r) para o grupo botox foi igual a 0,13 e a 0,05
(Myo D e PCNA, respectivamente); para o grupo crotoxina, foi igual a 0,06 e a 0,05 (Myo D
e PCNA, respectivamente); para o grupo controle, foi igual a 0,27 e a 0,04 (Myo D e PCNA,
respectivamente). Sugere-se que não houve correlação entre o volume e o aumento do
percentual de núcleos ativados, ou seja, que o volume não interferiu no aumento de ativação
das CS.
100
TABELA 6
Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo com os
volumes
Grupos
Volume
N
Média
46,84
45,60
50,30
Desvio
padrão
12,25
15,45
13,91
Valor
mínimo
35,65
31,10
30,06
Valor
máximo
58,97
66,87
64,65
Botox
Marcador
MyoD
(p = 0,864)*
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
4
5
5
Botox
Marcador
PCNA
(p = 0,761)**
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
4
5
5
54,12
46,95
54,51
17,58
19,28
16,42
34,38
23,66
27,73
70,54
72,05
68,01
Crotoxina
Marcador
MyoD
(p = 0,936)*
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
5
5
5
52,31
50,43
53,88
14,11
18,26
12,12
28,91
23,37
37,56
64,95
71,02
69,13
Crotoxina
Marcador
PCNA
(p = 0,852)**
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
5
5
5
58,53
55,59
56,61
14,94
8,40
12,68
35,75
42,86
38,05
73,38
64,44
70,61
Controle
Marcador
MyoD
(p = 0,269)*
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
9
10
9
38,58
31,81
30,56
10,59
12,28
9,99
17,23
14,39
19,05
48,28
51,78
45,19
Controle
Marcador
PCNA
(p = 0,676)**
0,10 ml
0,25 ml
0,50 ml
9
10
9
26,09
35,26
45,44
11,11
7,75
5,86
12,18
24,13
32,17
42,48
48,30
54,27
* ANOVA; ** Teste de Kruskal-Wallis
101
GRÁFICO 5: Diagrama de dispersão representando a correlação entre o volume (ml) e
o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D.
102
GRÁFICO 6: Diagrama de dispersão representando a correlação entre o volume (ml) e
o percentual de núcleos ativados marcados pelo PCNA.
Ao realizar-se a análise de variância de dois critérios (para o marcador Myo D), testouse também a hipótese de nulidade (H0), ou seja, de que não há interação entre os dois fatores
(substância e volume). Como a estatística de teste não excedeu o valor crítico, não se rejeitou
a H0 (p =0,815). Portanto, há evidências para concluir que os efeitos substância/volume são
independentes. Os resultados desse tipo de análise sugerem significância marginal tanto para a
substância (p = 0,004) quanto para o volume (p = 0,531).
103
5.1.2.3 Comparação entre os dias de vida após a aplicação e a resposta
A TABELA 7 demonstra que a relação entre os dias de vida após a aplicação e a
resposta foi estatisticamente significativa em todos os grupos analisados. Vale ressaltar que
essa tabela mostra apenas o efeito dos dias dentro de cada grupo de substância, sem
comparação dos grupos entre si.
Os GRÁFICOS 7 e 8 são diagramas de dispersão que representam a correlação entre
os dias de vida após a aplicação e o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo D e
pelo PCNA, respectivamente. O coeficiente de correlação (r) para o grupo botox foi igual a
0,72 e a 0,82 (Myo D e PCNA, respectivamente); para o grupo crotoxina, foi igual a 0,95 e a
0,95 (Myo D e PCNA, respectivamente); para o grupo controle, foi igual a 0,76 e a 0,70 (Myo
D e PCNA respectivamente). Sugere-se que houve forte correlação entre os dias de eutanásia
e o aumento do percentual de núcleos ativados, ou seja, o tempo de vida após a aplicação
interferiu no aumento de ativação das CS.
104
TABELA 7
Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos de acordo com os
dias de vida após a aplicação.
Dias de vida
N
Média
32,70
45,87
56,58
Desvio
padrão
3,71
13,54
7,91
Valor
mínimo
30,06
33,43
42,59
Valor
máximo
36,95
64,65
66,87
Botox
Marcador
MyoD
(p = 0,018)*
13
19
26
3
5
6
Botox
Marcador
PCNA
(p =0,016)**
13
19
26
3
5
6
28,59
50,41
64,33
5,41
13,44
7,98
23,66
36,70
50,33
34,38
68,01
72,05
Crotoxina
Marcador
MyoD
(p = 0,000)*
13
19
26
3
6
6
29,95
50,31
65,23
7,15
2,84
3,96
23,37
45,45
61,62
37,56
53,85
71,02
Crotoxina
Marcador
PCNA
(p = 0,002)**
13
19
26
3
6
6
38,88
55,14
67,70
3,63
2,27
4,40
35,75
52,22
61,78
42,86
58,77
73,38
Controle
Marcador
MyoD
(p = 0,000)*
13
19
26
6
11
11
22,27
29,83
43,52
10,31
8,33
3,92
14,39
19,71
38,37
42,55
45,49
51,78
Controle
Marcador
PCNA
(p = 0,001)**
13
19
26
6
11
11
26,09
35,26
45,44
11,11
7,75
5,86
12,18
24,13
32,17
42,48
48,30
54,27
* ANOVA; ** teste de Kruskal-Wallis
105
GRÁFICO 7: Diagrama de dispersão representando a correlação entre os dias de vida
após a aplicação e o percentual de núcleos ativados marcados pelo Myo
D.
106
GRÁFICO 8: Diagrama de dispersão representando a correlação entre os dias de vida
após a aplicação e o percentual de núcleos ativados marcados pelo
PCNA.
Ao realizar-se a análise de variância de dois critérios (para o marcador Myo D), testouse também a hipótese de nulidade (H0), ou seja, de que não há interação entre os dois fatores
(substância e dias). Como a estatística de teste não excedeu o valor crítico, não se rejeitou a
H0 (p = 0,246). Portanto, há evidências para concluir que os efeitos substância/dias de vida
após a aplicação são independentes. Os resultados desse tipo de análise sugerem significância
tanto para a substância (p = 0,007) quanto para os dias (p = 0,002). O tempo de vida após a
aplicação contribuiu para o aumento da ativação das CS, independentemente da substância.
O GRÁFICO 9 ilustra a relação entre as médias dos núcleos ativados em cada grupo,
para cada marcador (azul: Myo D; verde: PCNA), em cada período de vida após a aplicação
das substâncias.
107
GRÁFICO 9: Relação entre a média de núcleos ativados para cada grupo, para cada
marcador, em cada período de vida após a aplicação das substâncias.
108
5.2 Análise histológica
As lâminas com cortes histológicos dos músculos retos superiores dos grupos deste
estudo foram analisadas com coloração de hematoxilina-eosina. Inicialmente, foi realizado
um estudo com quatro músculos retos superiores retirados de coelhos que não receberam
inoculação de qualquer substância, com a finalidade de se conhecer histologicamente a
musculatura extrínseca ocular normal dos coelhos. O ANEXO C apresenta fotografias dessas
lâminas.
Nos grupos controle, botox e crotoxina, as alterações musculares observadas no
músculo reto superior foram focais, ou seja, encontradas no local da aplicação das
substâncias.
Os QUADROS de 7 a 12 esquematizam as alterações histológicas encontradas em
cada músculo. As cores destacam os dias de vida após a aplicação (azul: 13 dias; amarelo: 19
dias; verde: 26 dias).
Toda a documentação fotográfica referente aos achados histológicos encontra-se no
ANEXO D.
109
QUADRO 7
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados Botox®
10 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
Achados histológicos
0, 5 ml
Dias de
vida após
aplicação
13 dias
1 OD
Botox®
10 U
1 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
13 dias
Botox®
10 U
0, 5 ml
19 dias
2 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
19 dias
Necrose, reação inflamatória bem delimitada ao
local da aplicação; presença de núcleos
picnóticos enfileirados e centralizados
(FIGURA 17)
Fibras degeneradas, necrose e fagocitose;
congestão vascular
Necrose, fagocitose; desarranjo da arquitetura
das fibras no local da aplicação (FIGURA 18)
2 OD
3 OD
Botox®
10 U
0, 5 ml
19 dias
3 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
19 dias
4 OD
Botox®
10 U
0, 5 ml
26 dias
4 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
26 dias
5 OD
Botox®
10 U
0, 5 ml
26 dias
Núcleos reacionais levemente aumentados
Fibras degeneradas, necrose e fagocitose;
congestão vascular
Necrose, fagocitose; desarranjo da arquitetura
das fibras no local da aplicação
Arquitetura das fibras musculares
preservada
Arquitetura das fibras musculares preservada
Arquitetura das fibras musculares
preservada
QUADRO 8
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados Botox®
5 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
6 OD
Botox®
5U
0,25 ml
Dias de
vida após
aplicação
13 dias
6 OE
Solução salina
-
0,25 ml
13 dias
7 OD
Botox®
5U
0,25 ml
19 dias
7 OE
Solução salina
-
0,25 ml
19 dias
8 OD
Botox®
5U
0,25 ml
19 dias
8 OE
Solução salina
-
0,25 ml
19 dias
9 OD
Botox®
5U
0,25 ml
26 dias
9 OE
Solução salina
-
0,25 ml
26 dias
10 OD
Botox®
5U
0,25 ml
26 dias
10 OE
Solução salina
-
0,25 ml
26 dias
Achados histológicos
Núcleos reativos; raras fibras necrosadas,
(FIGURAS 19 e 20)
Arquitetura das fibras musculares
preservada
Necrose; presença de infiltrado
inflamatório; congestão vascular
(FIGURAS 21 a 25)
Pouco desarranjo da arquitetura das fibras
musculares
Necrose; presença de infiltrado
inflamatório
Pouco desarranjo da arquitetura das fibras
musculares
Presença de fibras degeneradas e
necrosadas (FIGURAS 26 e 27)
Arquitetura das fibras musculares
preservada
Arquitetura das fibras musculares
preservada
Arquitetura das fibras musculares
preservada
110
QUADRO 9
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicados Botox®
2,5 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
Dias de
vida após
aplicação
Achados histológicos
11 OD
Botox®
2,5 U
0,1 ml
13 dias
Presença de núcleos centralizados com nucléolos
evidentes; ausência de macrófagos
11 OE
Solução salina
-
0,1 ml
13 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
12 OD
Botox®
2,5 U
0,1 ml
19 dias
12 OE
Solução salina
-
0,1 ml
19 dias
Arquitetura
das
fibras
musculares
discretamente agredida; não houve congestão
vascular
Arquitetura das fibras musculares preservada
13 OD
Botox®
2,5 U
0,1 ml
26 dias
13 OE
Solução salina
-
0,1 ml
26 dias
14 OD
Botox®
2,5 U
0,1 ml
26 dias
14 OE
Solução salina
-
0,1 ml
26 dias
Arquitetura
das
fibras
discretamente agredida
Congestão vascular discreta
musculares
Arquitetura
das
fibras
musculares
discretamente agredida
Arquitetura das fibras musculares preservada
QUADRO 10
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas crotoxina
10 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
15 OD
Crotoxina
10 U
0, 5 ml
Dias de
vida após
aplicação
13 dias
Achados histológicos
15 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
13 dias
16 OD
Crotoxina
10 U
0, 5 ml
19 dias
16 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
19 dias
17 OD
Crotoxina
10 U
0, 5 ml
19 dias
17 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
19 dias
Congestão vascular; núcleos enfileirados e
centralizados
Arquitetura das fibras musculares preservada
18 OD
Crotoxina
10 U
0, 5 ml
26 dias
Núcleos reativos; fibras em necrose
18 OE
Solução salina
-
0, 5 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
19 OD
Crotoxina
10 U
0, 5 ml
26 dias
19 OE
Solução salina
-
0,5 ml
26 dias
Núcleos reativos; núcleos picnóticos; fibras
em necrose (FIGURA 32)
Arquitetura das fibras musculares preservada
Miofagocitose;
núcleos
com
nucléolos
evidentes;
núcleos
enfileirados
e
centralizados; endomísio espessado; núcleos
em picnose (FIGURAS 28 a 30)
Arquitetura das fibras musculares preservada
Desarranjo da arquitetura das fibras;
congestão vascular; núcleos enfileirados e
centralizados (FIGURA 31)
Arquitetura das fibras musculares preservada
111
QUADRO 11
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas crotoxina
5 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
20 OD
Crotoxina
5U
0,25 ml
Dias de
vida após
aplicação
13 dias
Achados histológicos
20 OE
Solução salina
-
0,25 ml
13 dias
21 OD
Crotoxina
5U
0,25 ml
19 dias
21 OE
Solução salina
-
0,25 ml
19 dias
22 OD
Crotoxina
5U
0,25 ml
19 dias
22 OE
Solução salina
-
0,25 ml
19 dias
23 OD
Crotoxina
5U
0,25 ml
26 dias
23 OE
Solução salina
-
0,25 ml
26 dias
Desarranjo da arquitetura das fibras; núcleos
centralizados (FIGURAS 36 e 37)
Arquitetura das fibras musculares preservada
24 OD
Crotoxina
5U
0,25 ml
26 dias
Miofagocitose
24 OE
Solução salina
-
0,25 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
Núcleos reativos no centro das fibras; núcleos
picnóticos (FIGURAS 33 e 34)
Arquitetura das fibras musculares preservada
Processo inflamatório discreto; infiltrado
perivascular; núcleos picnóticos; núcleos
centralizados e enfileirados (FIGURA 35)
Arquitetura das fibras musculares preservada
Núcleos picnóticos; núcleos centralizados e
enfileirados
Arquitetura das fibras musculares preservada
QUADRO 12
Alterações histológicas de cada músculo reto superior em que foram aplicadas crotoxina
2 U e solução salina em igual volume.
Coelho/olho
Substância
aplicada
Dose
Volume
25 OD
Crotoxina
2U
0,1 ml
Dias de
vida após
aplicação
13 dias
Achados histológicos
25 OE
Solução salina
-
0,1 ml
13 dias
26 OD
Crotoxina
2U
0,1 ml
19 dias
Aumento da vascularização; presença de vasos
no endomísio; miofagocitose; congestão vascular
perimisial; presença de processo inflamatório
(FIGURAS 38 a 43)
Reação inflamatória perivascular no local da
aplicação (FIGURA 44)
Desarranjo da arquitetura das fibras
26 OE
Solução salina
-
0,1 ml
19 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
27 OD
Crotoxina
2U
0,1 ml
19 dias
Desarranjo da arquitetura das fibras
27 OE
Solução salina
-
0,1 ml
19 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
28 OD
Crotoxina
2U
0,1 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
28 OE
Solução salina
-
0,1 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
29 OD
Crotoxina
2U
0,1 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
29 OE
Solução salina
-
0,1 ml
26 dias
Arquitetura das fibras musculares preservada
112
7 Discussão
113
7 Discussão
A necessidade de se descobrir um tratamento farmacológico para o estrabismo que não
cause enfraquecimento muscular permanente, mas que tenha uma duração maior que a toxina
botulínica, estimula a comunidade científica a estudar novas substâncias. O conhecimento da
participação das células satélites no funcionamento dos músculos oculares extrínsecos assim
como os métodos de se controlar a ativação dessas células, têm se tornado um campo de
estudo de grande interesse.
Christiansen et al. (2000) injetaram ricin-mAb 35, uma imunotoxina que se liga aos
receptores de acetilcolina nos músculos esqueléticos, no músculo reto superior de coelhos,
com o objetivo de determinar os efeitos histológicos e ultra-estruturais nos músculos.
Verificaram lesões focais dose-dependentes, processos inflamatórios auto-limitantes e
significante perda de fibras musculares. Notaram uma lenta regeneração das miofibras. (1)
Em 2003, Christiansen et al. voltaram a estudar os efeitos dessa imunotoxina na força
muscular de músculo extrínseco ocular. Concluíram que esse lento processo de regeneração
poderia explicar a longa duração da ação da ricin- mAb 35. Demonstraram através de estudos
histológicos que a aplicação da substância resultava em lesão citotóxica discreta, com boa
preservação das miofibras periféricas no local da injeção. Sugeriram que a ricin-mAb poderia
ser uma alternativa para o retrocesso cirúrgico e também uma opção mais duradoura que a
toxina botulínica no tratamento farmacológico do estrabismo. (116)
Ugalde et al. (2005) observaram que a paralisia dos MOE induzida por toxina
botulínica em olhos de coelhos resultou em aumento da ativação de CS a curto intervalo de
tempo, em comparação com olhos em que havia sido injetada solução salina. (10)
Scott et al. (2007) relataram um caso de uma paciente que fora tratada previamente
com cirurgia para correção de estrabismo, mas que persistia com uma esotropia de 14
dioptrias prismáticas e diplopia. A inoculação de bupivacaína 0,75% no músculo reto lateral
114
foi, então, o tratamento escolhido. Houve paresia do reto lateral por sete dias. A melhora da
função muscular, um desvio convergente de apenas quatro dioptrias prismáticas e a
eliminação da diplopia ocorreram 33 dias após a aplicação. Cinqüenta e quatro dias após a
aplicação, o desvio se mantinha estável (quatro dioptrias prismáticas). A ressonância
magnética revelou um aumento no tamanho do músculo reto lateral de 58%, no local da
inoculação. Os autores sugeriram que, por volta de dois dias após a aplicação, CS foram
ativadas e a regeneração iniciou-se, com o músculo alcançando seu tamanho e força originais
em aproximadamente 21 dias. As CS continuaram a elaborar novas fibras musculares, o que
resultou em hipertrofia por vários dias. (119)
Este estudo confirma tais relatos, demonstrando haver um aumento significativo na
ativação das CS após a utilização da toxina botulínica e, de forma um pouco mais acentuada,
após a aplicação da crotoxina. O estudo histológico das fibras musculares dos grupos botox e
crotoxina revelou sinais de regeneração (centralização de núcleos), sem apresentar sinais
significantes de atrofia muscular. Demonstrou também que as lesões foram focais.
Ao contrário do que foi demonstrado por Christiansen et al., verificou-se que a
dosagem das toxinas não foi tão importante no acréscimo das CS. O volume de solução salina
ou de toxina aplicado também não influenciou no aumento das CS. Os animais sacrificados
mais tardiamente apresentaram maior aumento na ativação das CS e pouco desarranjo da
arquitetura das fibras musculares.
Porter et al. (1991) demonstraram que as alterações histológicas causadas pela toxina
botulínica são reversíveis. (117) Supõe-se que o aumento na ativação das CS esteja
diretamente relacionado à regeneração das fibras.
Neste estudo, observou-se, no exame histológico do grupo crotoxina, maior agressão
na estrutura das fibras e sinais de regeneração mais evidentes, o que poderia estar
correlacionado com o aumento de CS ativadas. Quando foram aplicadas 10 U de toxinas, o
115
grupo crotoxina ainda apresentou alterações histológicas marcantes após 26 dias (núcleos
reativos e fibras em necrose); já no grupo botox a arquitetura das fibras musculares foi
preservada. Acredita-se que o processo de regeneração das fibras musculares após a aplicação
da crotoxina seja mais lento que após a aplicação da toxina botulínica, o que poderia explicar
a ação mais duradoura da crotoxina. Entretanto, Ribeiro (2001) verificou que a crotoxina e a
toxina botulínica produziram paralisia transitória do músculo reto superior de coelhos, de
maneira semelhante, em determinadas concentrações.
Considerando-se os estágios regenerativos do processo de reparação muscular ativação (iniciada por volta de duas horas após o trauma) e proliferação (iniciada por volta de
dois a três dias após o trauma), seguidas da diferenciação e da maturação, foram utilizados os
marcadores de CS Myo D (julgado um excelente marcador para CS ativadas) e PCNA
(considerado um excelente marcador para CS em proliferação). (FIGURA 45) (118) Notou-se
um discreto aumento no percentual de núcleos marcados com o PCNA, o que demonstrou a
existência de maior porcentagem de CS em proliferação. No entanto, não foi detectada
diferença estatisticamente significativa entre o percentual de núcleos.
FIGURA 45: Esquema dos estágios de regeneração da reparação muscular.
Fonte: adaptado de Shi X, Garry DJ. Muscles stem cells in development, regeneration, and
disease. Genes & Dev. 2006; 20: 1692-708.
116
É importante ressaltar que o presente estudo tem limitações, incluindo o tamanho da
amostra e o tempo de acompanhamento, fatos importantes para uma melhor compreensão e
análise dos resultados encontrados. Estudos futuros são necessários para maiores
esclarecimentos sobre a ação a longo prazo da toxina botulínica e da crotoxina nas CS da
musculatura ocular extrínseca.
117
8 Conclusões
118
8 Conclusões
1) A aplicação de toxina botulínica e de crotoxina provocou o aumento no número de
células satélites ativadas e em proliferação nos músculos retos superiores de coelhos.
2) Estatisticamente, a diferença na ativação das células entre os grupos botox e
crotoxina não foi significativa.
3) Não houve correlação estatisticamente significativa entre a dose aplicada e o
aumento na ativação das células satélites nos grupos botox e crotoxina.
4) Não houve correlação estatisticamente significativa entre o volume de substância
aplicado e o aumento na ativação das células satélites nos grupos botox, crotoxina e controle.
5) O tempo de vida após a aplicação contribuiu para o aumento de células satélites
ativadas, independentemente da substância aplicada.
6) O grupo crotoxina apresentou ao estudo histológico maior desarranjo na arquitetura
das fibras musculares e mais evidências de sinais de regeneração, podendo tal fato estar
correlacionado com o aumento da ativação das células satélites.
7) Os resultados deste estudo sugerem que o processo de regeneração das fibras
musculares após a inoculação da crotoxina seja mais lento que após a inoculação da toxina
botulínica, podendo tal fato estar relacionado à ação mais duradoura da crotoxina.
119
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128
ANEXO A
129
ANEXO B
TABELA1: Núcleos corados e total de núcleos em cada grupo (botox e controle)
Coelho
grupo
botox:
(olho
direito)
Núcleos
positivos
para
MyoD
Número
total
de
núcleos
visualizados
na
lâmina
com MyoD
Núcleos
positivos
para
PCNA
Número
total
de
núcleos
visualizados
na
lâmina
com PCNA
Coelho
grupo
ccntrole:
(olho
esquerdo)
Núcleos
positivos
para
MyoD
Número
total
de
núcleos
visualizados
na
lâmina
com MyoD
Núcleos
positivos
para
PCNA
Número
total
de
núcleos
visualizados
na
lâmina
com PCNA
1
98
326
89
321
1
81
355
43
353
2
300
542
302
494
2
155
433
194
435
3
353
546
236
347
3
67
255
65
206
4
138
324
152
302
4
98
255
114
271
5
126
214
100
153
-
-
-
-
-
6
139
447
84
355
6
79
450
111
603
7
118
353
109
297
7
129
441
120
359
8
155
385
131
313
8
55
279
76
315
9
164
291
263
365
9
189
365
197
363
10
222
332
234
387
10
117
282
92
286
11
143
387
153
445
11
76
441
92
385
12
123
345
176
397
12
41
173
38
154
13
115
195
199
296
13
95
224
87
203
14
178
319
170
241
14
98
203
119
261
TABELA 2: Núcleos corados e total de núcleos em cada grupo (crotoxina e controle)
Coelho
grupo
crotoxina
(olho
direito)
Núcleos
positivos
para
MyoD
Número
total
de
núcleos
visualizados
na lâmina
com MyoD
Núcleos
positivos
para
PCNA
Número
total
de
núcleos
visualizados
na lâmina
com PCNA
Coelho
grupo
ccntrole:
(olho
esquerdo)
Núcleos
positivos
para
MyoD
Número
total
de
núcleos
visualizados
na lâmina
com MyoD
Núcleos
positivos
para
PCNA
Número
total
de
núcleos
visualizados
na lâmina
com PCNA
15
151
402
183
481
15
72
378
96
226
16
295
583
212
406
16
74
342
128
265
17
114
227
109
193
17
70
303
81
286
18
182
294
182
277
18
61
135
67
127
19
159
230
161
228
19
92
215
104
222
20
118
505
192
448
20
61
424
71
294
21
210
424
215
390
21
100
330
129
355
22
120
264
157
292
22
93
301
108
280
23
177
282
212
329
23
66
172
104
228
24
125
176
97
157
24
71
160
96
211
25
122
422
148
414
25
60
141
39
110
26
94
180
134
228
26
131
288
116
306
27
133
247
152
279
27
128
305
127
317
28
183
297
193
263
28
67
155
139
285
29
202
311
170
242
29
105
248
118
272
130
ANEXO C:
FIGURA 15- Corte histológico de área do músculo reto superior normal de coelho
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 16 - Corte histológico de área do músculo reto superior normal de coelho
(corte transversal, aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
131
ANEXO D:
FIGURA 17-Corte histológico do músculo reto superior do olho esquerdo do coelho 1.
Presença de necrose, núcleos picnóticos, enfileirados e centralizados
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 18 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho esquerdo do
coelho 2. Presença de necrose e fagocitose focal (local da aplicação
da toxina botulínica). Nota-se desarranjo da arquitetura das fibras
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina)
132
.
FIGURA 19 - Corte histológico de músculo reto superior do olho direito do coelho 6.
Presença de reatividade dos núcleos e fibras fragmentadas
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 20 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 6. Notam-se algumas fibras em necrose. A seta indica uma delas
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
133
FIGURA 21- Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 7.
Presença de necrose, infiltrado inflamatório e congestão vascular
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 22 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 7.
Presença de necrose e infiltrado inflamatório
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
134
FIGURA 23 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 7.
Presença de necrose e infiltrado inflamatório
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 24 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 7.
Presença de necrose e infiltrado inflamatório
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
135
FIGURA 25 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 7.
Presença de infiltrado inflamatório
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 26 - Corte histológico de músculo do reto superior do olho direito do
coelho 9. Notam-se fibras degeneradas (mais eosinofílicas)
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
136
FIGURA 27 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 9.
Notam-se fibras degeneradas (mais eosinofílicas) e outras necrosadas
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 28 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 15. A seta indica local onde existe fagocitose
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
137
FIGURA 29 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 15. A seta indica núcleos enfileirados, com nucléolos evidentes
(núcleos em regeneração) (aumento de 400 vezes, corado pela
hematoxilina-eosina).
FIGURA 30 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 15. Presença de núcleos centralizados e nucléolos evidentes
(núcleos reagentes). Fibras em necrose e miofagocitose.
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
138
FIGURA 31 - Corte histológico de músculo reto superior do olho direito coelho 16.
Presença de desarranjo da arquitetura
das fibras e congestão vascular. Pouca necrose
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 32 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do
coelho 19. Presença de núcleos reativos, fibras em necrose e
núcleos picnóticos
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
139
FIGURA 33 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 20. Núcleos picnóticos e necrose. A seta indica desarranjo
na arquitetura da fibra
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 34 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito
do coelho 20. Fibras onduladas com desarranjo da arquitetura.
Fibras necróticas e miofagocitose
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
140
FIGURA 35 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 21.
Presença de núcleos picnóticos, centralizados, enfileirados em fibras
com desarranjo da arquitetura
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 36 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 23.
Desarranjo da arquitetura da fibras e núcleos centralizados
(aumento de 400 vezes, corado com hematoxilina-eosina).
141
FIGURA 37 - Corte histológico do músculo reto superior do olho direito do coelho 23.
Presença de necrose e fagocitose. Hemorragia (local de aplicação)
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 38 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 25. A seta indica infiltrado inflamatório, com presença de neutrófilos
(aumento de 400 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
142
FIGURA 39 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito
do coelho 25. Nota-se auumento da vascularização endomisial.
Infiltrado perivascular neutrofílico.
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 40 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho
direito do coelho 25. Nota-se infiltrado perivascular perimisial,
vasodilatação e congestão
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
143
FIGURA 41 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do
coelho 25. Presença de processo inflamatório neutrofílico, perivascular e
endomisial
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).
FIGURA 42 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito
do coelho 25. Congestão vascular perimisial
(aumento de 100 vezes, corado pela hemtoxilina-eosina).
144
FIGURA 43 - Corte histológico de área do músculo reto superior do olho direito do coelho
25. Necrose com fagocitose. Infiltrado neutrofílico endomisial
(aumento de 400 vezes, corado pela hemtoxilina-eosina).
FIGURA 44 - Corte histológico do músculo reto superior do olho esquerdo do coelho
25. Presença de reação inflamatória neutrofílica no local da aplicação
de solução salina
(aumento de 100 vezes, corado pela hematoxilina-eosina).