universidade federal fluminense faculdade de veterinária

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO
ANIMAL
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E
VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
NITERÓI
2013
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E
VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária
da
Universidade
Federal
Fluminense, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre. Área de
concentração: Clínica e Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM
Co-orientador: Prof. Dr. MARCELO DE LIMA
Niterói
2013
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E
VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária
da
Universidade
Federal
Fluminense, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre. Área de
concentração: Clínica e Reprodução Animal.
Aprovada em 25 de fevereiro de 2013.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof. Dr. WALTER LILENBAUM – Orientador - UFF
_____________________________________________________
Profª. Drª. TATIANA XAVIER DE CASTRO - UFF
_____________________________________________________
Profª. Drª. MELISSA HANZEN PINNA – UFBA
Niterói
2013
EPÍGRAFE
“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a
forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos
mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos
ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.”
Fernando Pessoa
AGRADECIMENTOS
À minha família, pelo apoio e paciência.
Ao meu orientador Walter Lilenbaum, por apostar na idéia, e pela oportunidade.
Ao meu co-orientador Marcelo de Lima, que foi meu grande mestre nessa jornada, e
cuja parceria imprescindível fez com que esse projeto desse certo. Obrigada por
tudo!
À Renata Ferreira, o link para que esse projeto se tornasse meu.
À Ana Paula Loureiro, minha grande parceira, especialmente durante as coletas pelo
Rio de Janeiro.
Aos colegas e professores do Departamento de Virologia da UFF, por todo seu
apoio e ajuda. Em especial à professora Ana Maria Pinto, que praticamente me
adotou durante as minhas aventuras com cultura de células.
Aos colegas do Departamento de Bacteriologia da UFF, pela força.
Aos colegas e professores do Departamento de Virologia e Imunologia da UFPel,
que muito me ajudaram na execução da parte prática do experimento, e me
aceitaram de braços abertos em seu convívio. Aos amigos de Pelotas, que
amenizaram o frio julino do Sul com sua companhia.
Aos novos e velhos amigos do mestrado, fonte de diversão e desabafo ao longo
desses dois anos.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
RESUMO
A infecção pelo herpesvírus equino (EHV) e o vírus da arterite equina (EAV)
tem sido associada a perdas econômicas importantes para a equideocultura em
nível mundial. Alguns estudos sorológicos têm demonstrado a circulação destes
agentes no Brasil. O presente trabalho teve como objetivo principal estudar a
ocorrência de anticorpos específicos contra o EAV e EHV em cavalos oriundos de
diferentes regiões do estado do Rio de Janeiro. Para este propósito, foram coletadas
amostras de soro de 581 animais não vacinados e de 44 éguas provenientes de um
plantel vacinado regularmente contra a rinopmeunonite equina. Todas as amostras
foram submetidas ao teste de soroneutralização para a pesquisa de anticorpos
específicos contra cada um dos vírus. Os resultados demonstraram 29,6% (172/581)
de animais soropositivos para o EHV (títulos entre 2 e ≥ 256) e 0,79 % (05/630) para
o EAV (títulos entre 2 e 4096). Considerando os animais não vacinados, os achados
demonstram que os anticorpos específicos foram induzidos após exposição natural
aos respectivos vírus indicando uma provável circulação destes agentes nos
rebanhos analisados. Além disto, a avaliação da soroconversão contra o EHV em
animais imunizados a campo com uma vacina comercialmente disponível contra o
EHV-1 indicou que apenas 50% (22/44) dos animais soroconverteram (títulos entre 4
e ≥ 256). Estes resultados sugerem, nas condições de campo analisadas neste
estudo, uma incapacidade da vacina contra o EHV-1 em induzir anticorpos
específicos na grande maioria dos animais após o protocolo vacinal recomendado
pelo fabricante.
PALAVRAS-CHAVE: EHV, EAV, anticorpos, soroneutralização, equinos.
ABSTRACT
Equine herpesvirus (EHV) and equine arteritis virus (EAV) infections have
been associated with important economic losses for the equine industry worldwide.
Some serological studies have demonstrated the presence of these agents in Brazil.
The aim of this study was to evaluate the occurrence of specific antibodies against
EAV and EHV in horses from different regions of Rio de Janeiro state. For this
purpose, serum samples of 581 non-vaccinated animals and 44 breeding mares
regularly vaccinated against equine rhinopneumonitis were collected. All samples
were submitted to the virus neutralization test for the detection of specific antibodies
to each virus. The results showed 29.6% (172/581) of seropositive animals for EHV
(titers between 2 and ≥ 256) and 0.79% (05/630) for EAV (titers between 2 and
4096). Considering the non-vaccinated animals, the findings demonstrated that
specific antibodies were induced after natural exposure to the respective viruses,
indicating a probable circulation of these agents in the herds analyzed. In addition,
the evaluation of seroconversion against EHV in the immunized animals using a
commercially available vaccine against EHV-1 indicated that only 50% (22/44) of
animals seroconverted (titers between 4 and ≥ 256). These results suggest, under
field conditions analyzed in this study, the failure of the EHV-1 vaccine to induce
specific antibodies responses in most animals following the vaccination protocol
according to the manufacturer’s recommendations.
KEYWORDS: EHV, EAV, antibodies, virus neutralization, horses.
SUMÁRIO
Resumo
p. 06
Abstract
p. 07
Lista de ilustrações
p. 10
Lista de tabelas
p. 11
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
p. 12
1. Introdução
p. 13
2. Herpesvirus equino
p. 15
2.1. O agente e a enfermidade
p. 15
2.2. Situação da enfermidade em nível mundial e nacional
p. 21
2.3. Diagnostico clínico e laboratorial
p. 23
2.4. Profilaxia e controle
p. 26
3. Vírus da arterite viral equina
p. 29
3.1. O agente e a enfermidade
p. 29
3.2. Situação da enfermidade em nível mundial e nacional
p. 33
3.3. Diagnóstico clínico e laboratorial
p. 37
3.4. Profilaxia e controle
p. 40
4. Objetivo Geral
p. 43
4.1. Objetivos específicos
p. 43
5. Material e métodos
p. 44
5.1. Animais
p. 44
5.2. Amostras para sorologia
p. 46
5.3. Células e vírus
p. 47
5.4. Diagnóstico sorológico
p. 47
6. Resultados
p. 49
7. Discussão
p. 53
8. Conclusões
p. 60
9. Obras citadas
p. 61
10. Apêndices e Anexos
p. 71
10.1 Planilha de coleta de dados dos animais utilizados
nas amostras
p. 72
10.2 Autorização do Comitê de Ética (CEUA) - UFF
p. 73
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01: Efeito citopático (ECP) característico de EHV-1 em células da linhagem
RK13.
p. 25
Figura 02: Efeito citopático (ECP) característico de EAV em células da linhagem
RK13.
p. 38
Figura 03: Mapa político do estado do Rio de Janeiro com a identificação dos
respectivos municípios (área preenchida em cor preta) de onde foram coletadas as
amostras de soro equino.
p. 46
Figura 04: Variação nos títulos de anticorpos neutralizantes contra o EHV-1 em
animais não-vacinados contra a rinopneumonite equina e oriundos de diferentes
municípios do Estado do Rio de Janeiro. O título de anticorpos (eixo Y) é dado pela
recíproca da diluição (base 2) do soro capaz de prevenir a produção de ECP na
monocamada de células.
p. 50
Figura 05: Número de animais soropositivos com o respectivo título de anticorpos
neutralizantes específicos contra o EHV provenientes de um grupo de 44 éguas
vacinadas contra a rinopneumonite equina. Foram consideradas soronegativas todas
as amostras com títulos de anticorpos inferiores a 2. *Soros tóxicos (n=3) foram
desconsiderados.
p. 51
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Relação dos municípios e distribuição das propriedades com o respectivo
número de animais utilizados no estudo. Todos os municípios são pertencentes ao
estado do Rio de Janeiro.
Tabela 02. Total de
p. 45
animais não
vacinados e
reagentes no
teste
de
soroneutralização frente ao herpesvírus equino (EHV) e vírus da arterite equina
(EAV)
p. 49
Tabela 03. Resultados dos testes de soroneutralização para o herpesvírus equino
tipo-1 em amostras provenientes de animais não vacinados contra a rinopneumonite
equina oriundos de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro.
p. 50
Tabela 04: Resultados dos testes de soroneutralização para o vírus da arterite
equina (EAV) em amostras provenientes de animais não vacinados oriundos de
diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro.
p. 52
Tabela 05: Procedência das amostras de soro equino consideradas positivas no
teste de soroneutralização com os respectivos títulos de anticorpos contra o EAV.
p. 52
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
EHV: Equine herpesvirus (herpesvirus equino)
EAV: Equine arteritis virus (Virus da arterite equina)
RK-13 : Rabbit kidney cells (células de rim de coelho)
VERO: sigla de células de rim de macaco verde
nm: nanômetros
kDa: kilo Dáltons
DNA: ácido desoxirribonucleico
RNA: ácido ribonucleico
ORF: open reading frame
EHM: encefalomielite causada pelo herpesvirus
ECP: efeito citopático
SN: soroneutralização
PCR: reação em cadeia da polimerase
IPX: imunoperoxidase
IFA: imunofluorescência
ELISA: enzyme -linked immunosorbent assay
MEM: meio essencial mínimo
SFB: soro fetal bovino
13
1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui o quarto maior rebanho de equinos do mundo com estimados
5,5 milhões de animais (IBGE 2010, FAO 2010). Este número expressivo de animais
representa a importância da equideocultura nacional do ponto de vista social e
econômico. A movimentação financeira desta atividade é da ordem de R$ 7,3
bilhões anuais e a ocupação direta de cerca de 640 mil pessoas; número esse que
pode chegar a 3,2 milhões de pessoas se contabilizados os empregos considerados
indiretos (BARROS, 2006).
Também cresceu no país o interesse de criadores e associações de criadores
de equinos em pesquisas voltadas à reprodução assistida e na aplicação de
biotécnicas voltadas à reprodução equina, visando o melhoramento genético e
seleção de animais mais adaptados ao perfil do criador. No cenário mundial, o Brasil
ocupa a primeira posição na utilização da técnica de transferência de embriões em
equinos, com 41% da atividade mundial, seguido por Argentina com 31% e Estados
Unidos com 20% (STROUD, 2010).
Porém, apesar do grande investimento em tecnologia reprodutiva para
potencializar a produtividade, ainda há falhas no manejo clínico e sanitário dos
rebanhos, o que com frequência resulta em prejuízos econômicos significativos nos
diversos setores da equideocultura. Adicionalmente, a ocorrência de doenças
infecciosas com impacto na reprodução tem sido diversas vezes observada por
técnicos e produtores, resultando em perdas embrionárias e a ocorrência de
abortamentos. Nos haras, a aquisição de equinos do exterior ou de outros rebanhos
associada à criação conjunta de animais de diversas faixas etárias podem facilitar a
entrada ou difusão dos agentes infecciosos.
As enfermidades de etiologia viral estão entre as mais importantes na espécie
equina,
pois
determinam
importantes
prejuízos
econômicos
decorrentes,
essencialmente, de perdas reprodutivas e restrições no comércio e trânsito de
equinos (AGUIAR et al, 2008). Dentre as doenças virais, a infecção pelo herpesvirus
equino tipos 1 (EHV-1) e 4 (EHV-4) e pelo vírus da arterite equina (EAV) são
14
reconhecidamente importantes por causarem quadros clínicos respiratórios,
reprodutivos e, com menos frequência, sinais neurológicos (OSTLUND, 1993). A
detecção de anticorpos específicos em animais não vacinados é um indicativo de
exposição prévia a estes agentes. No caso do EHV-1, o animal permanece
latentemente infectado após a primo-infecção, sendo uma fonte importante de
disseminação aos demais animais da mesma propriedade devido a reativações com
excreção viral. No caso do EAV, o garanhão com infecção persistente torna-se um
reservatório natural do vírus, disseminando o agente pelo sêmen.
No campo, têm sido comumente observado relatos de abortamentos em
éguas, porém em muitos casos não se consegue chegar a um diagnóstico etiológico
conclusivo. Por esta razão, é essencial o conhecimento regional da situação
epidemiológica e da circulação dos principais agentes infecciosos associados com
prejuízos econômicos à indústria equina. Alguns estudos sorológicos de caráter
regional têm demonstrado a circulação do EHV-1 e do EAV no território nacional,
enfatizando a importância da implementação de estratégias de controle e prevenção
dessas
enfermidades
além
de
uma
maior
vigilância
desses
agentes.
Particularmente, no estado do Rio de Janeiro, apesar do rebanho equino de 114.778
animais (IBGE, 2011), não existem dados acerca da circulação destes agentes virais
nos rebanhos.
15
2. Herpesvírus equino
O herpesvirus equino (equine herpesvirus – EHV) é considerado um dos
principais patógenos virais de equinos em nível mundial (OSTLUND, 1993).
Atualmente, são reconhecidos quatro tipos de herpesvírus associados com
enfermidades em equinos. Dentre eles, as infecções pelo EHV-1 e EHV-4 têm sido
apontadas como as mais relevantes e estão associadas, essencialmente, com
enfermidades respiratória e reprodutiva (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006).
2.1 O agente e a enfermidade
Os herpesvírus são vírus envelopados, com cerca de 150 nm de diâmetro,
possuem um nucleocapsídeo icosaédrico e DNA linear de cadeia dupla (MURPHY et
al, 1999). O sequenciamento genômico completo do EHV-1 indicou que o genoma
viral possui 150.223 nucleotídeos, contendo cerca de 80 ORFs (open reading
frames) (TELFORD et al, 1992). O genoma viral contém 76 genes com potencial
para codificar 77 proteínas diferentes (PATEL et al, 2005). O vírus do herpes simplex
(HSV) é o protótipo da família Herpesviridae, tendo todos os seus genes transcritos
e traduzidos de forma sequencial (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006). A
transcrição é dividida em três fases ou três grupos de genes: immediate early (IE),
early (E) e late (L). O genoma viral possui um único gene IE, 55 genes E e 20 genes
L. Foram ainda identificados seis genes com funções essencialmente regulatórias
[IE (1), E (4) e L (1)], controlando a regulação da cascata de expressão gênica
(SLATER et al, 2007).
Os genes IE são sintetizados inicialmente pela RNA polimerase II celular, e
seus produtos são basicamente fatores de transcrição requeridos para iniciar a
síntese dos RNAm early (RNAmE). Subsequentemente, as proteínas early atuam
regulando negativamente a transcrição de RNAm IE, e estão envolvidas na síntese
do DNA viral, usualmente como enzimas ou como proteínas ligadas ao DNA. Além
disso, estas proteínas são requeridas para a transcrição dos genes late. As
16
proteínas late (L) são sintetizadas nas últimas fases do ciclo de replicação viral, e
muitas delas são componentes estruturais dos vírions (SÁENZ & URCUQUIINCHIMA, 2006).
As glicoproteínas do envelope viral possuem um importante papel no
processo de infecção, mediando a entrada e difusão célula-célula dos vírions. No
EHV já foram identificadas 10 glicoproteínas: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL e
gM. Além dessas, também foram identificadas outras glicoproteínas como a gp2, gp
21/22a e gp10, uma proteína encontrada no tegumento – substância amorfa
presente entre o envelope e o capsídeo (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006).
Nove tipos de herpesvirus já foram isolados a partir de amostras clínicas de
equídeos. Entre estes vírus, as infecções pelo EHV-1 e EHV-4 parecem ter o
impacto mais perceptível no desempenho e saúde dos cavalos. Sete dos nove tipos
de herpesvirus equino já identificados (1, 3, 4, 6, 7, 8 e 9) foram classificados como
membros da subfamília Alphaherpesvirinae enquanto que o EHV-2 e 5 são membros
da subfamília Gammaherpesvirinae (OSTERRIEDER, 2009). O equino é o
hospedeiro natural dos alfaherpesvirus EHV-1, EHV- 3 e EHV-4 e dos
gamaherpesvirus EHV-2 e EHV-5, enquanto o asno é o hospedeiro dos
alfaherpesvirus AHV-3 (homólogo ao EHV-1) e AHV-1 (homólogo ao EHV-3), e do
gamaherpesvirus AHV-2. Há ainda o EHV-9, isolado de gazelas, muito similar
geneticamente ao EHV-1 (PATEL et al., 2005).
As características principais dos alfaherpesvírus podem ser resumidas em um
ciclo replicativo rápido causando lise de células infectadas e, principalmente, o
estabelecimento de infecções latentes. A transmissão normalmente ocorre por
contato direto, principalmente entre mucosas, ou a transmissão pode ocorrer via
aerossóis, mais comum em locais com alta concentração de animais (MURPHY et
al, 1999).
Os herpesvírus de equinos estão classificados em quatro tipos principais:
EHV-1 – associado com surtos de abortamentos, quadros respiratórios e
neurológicos; EHV-2 – menos patogênico, podendo causar faringite crônica e
conjuntivite; EHV-3 – vírus do exantema coital equino; EHV-4 – associado com
quadros clínicos respiratórios (DONALDSON, 2003).
O EHV-1 pertence à subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus;
possui distribuição mundial e se constitui em um importante agente causador de
17
abortamento em éguas. O EHV-1 está mais associado a abortamentos e a doença
neurológica; entretanto também pode causar infecções respiratórias. O abortamento
pode ocorrer entre 14 e 120 dias após a infecção, porém é mais frequentemente
observado após o sétimo mês de gestação (CHRINSIDE et al, 2000). O quadro
respiratório aparece sob a forma de surtos acometendo principalmente animais
jovens (idade inferior aos dois anos), com sinais de febre alta (até 41 ºC), fluxo nasal
seroso, congestão de mucosa nasal e das conjuntivas palpebrais. Pode ocorrer
aumento de volume dos linfonodos submandibulares. Esses sinais clínicos são mais
raros em equinos mais velhos, onde se observa infecções subclínicas. O quadro
abortivo comumente se dá após um surto do quadro respiratório, onde a égua não
apresenta qualquer sintoma, ocorrendo geralmente no terço final da gestação (LARA
et al, 2003).
O EHV-1 tem sido associado a perdas econômicas importantes, tanto na
esfera clínica (atrasos no treinamento e redução de desempenho além dos gastos
com tratamento) como na esfera reprodutiva, com o óbito do potro (OSTLUND,
1993). Pelo fato de ser geneticamente e antigenicamente relacionado com o
herpesvírus equino tipo 4 (EHV-4, agente da rinopneumonite equina), estes dois
vírus eram antigamente considerados subtipos 1 e 2 do EHV-1, respectivamente. O
sequenciamento genômico demonstrou uma homologia de 55 a 84% entre o EHV-1
e o EHV-4 (TELFORD et al, 1998).
Uma
das
características
mais
importantes
dos
herpesvirus
é
o
estabelecimento de latência como uma estratégia de evasão do sistema imunológico
do hospedeiro. Nas fases iniciais da infecção do trato respiratório, o EHV-1 infecta
neurônios periféricos e alcança o gânglio trigêmeo em 48 h após a infecção,
estabelecendo uma infecção latente com persistência do DNA viral de forma
epissomal no núcleo neuronal. Além da latência neuronal, o DNA viral pode persistir
de forma latente nos linfócitos T circulantes, e no sistema linforreticular após o
término da fase virêmica. Durante a latência, a expressão do genoma viral é
suprimida e somente um RNA viral transcrito do gene IE, conhecido como LAT
(latent associated transcript) está presente. (SLATER, 2000; PAILLOT et al, 2008).
Durante o período de latência não há replicação e excreção viral; as células
latentemente infectadas não expressam antígenos virais e, consequentemente não
são detectadas e eliminadas pelo sistema imune. A reativação da latência parece
18
ser o fator mais importante na indução de surtos neurológicos causados pelo EHV-1
(PAILLOT et al, 2008).
Muitos aspectos relacionados com a reativação da infecção latente e a
consequente recrudescência clínica ainda não foram completamente elucidados.
Entretanto, é frequentemente observada a reativação viral após episódios de
estresse, como desmame, castração, transporte, doenças, mudança de local, e em
casos experimentais onde se induziu uma imunossupressão por meio da
administração de corticosteróides (PATEL et al, 2005; SLATER, 2000).
A infecção pelo EHV-1 ocorre pela inalação de aerossóis ou por meio de
fômites. Ocorre replicação primária em células epiteliais da nasofaringe, traquéia e
brônquios, resultando em lise celular e no aparecimento de erosões na mucosa
nasal (OSTLUND, 1993). Após a replicação inicial no epitélio da mucosa respiratória,
o EHV-1 rapidamente alcança a membrana basal e lâmina própria permitindo
disseminação sistêmica do vírus através dos sistemas linfático e circulatório. O vírus
infecta então linfócitos T (CD5+ e CD8+) circulantes e células endoteliais, levando à
viremia associada a células. Aparentemente, os linfócitos T se infectam inicialmente
na lâmina própria do epitélio respiratório alcançando os linfonodos regionais em até
48 h pós-infecção (PAILLOT et al, 2008). A viremia é responsável pela disseminação
viral pelo organismo, sendo um pré-requisito para a ocorrência de sequelas
importantes como quadros abortivos e neurológicos (PATEL et al, 2005).
O vírus é geralmente transmitido de forma horizontal, por contato direto e
indireto entre animais suscetíveis e animais que estão excretando o vírus durante a
infecção aguda ou em episódios de reativação da infecção latente. Geralmente, a
duração e magnitude de excreção viral são significativamente superiores durante a
infecção aguda, porém, a excreção após a reativação é suficiente para permitir a
transmissão do vírus. Os equinos são os únicos hospedeiros naturais conhecidos
deste agente e animais de todas as idades são suscetíveis à infecção pelo EHV
(FRANCO, 2012).
Surtos abortivos estão associados ao EHV-1, porém o EHV-4 já foi
relacionado a casos esporádicos. As éguas que abortam normalmente não possuem
nenhuma sintomatologia respiratória. Os abortamentos ocorrem de duas semanas a
meses após a exposição ao vírus, e em sua maioria nos quatro meses finais de
gestação. A viremia leva à vasculite no endométrio e ou à infecção do feto. Na
19
maioria dos casos o feto abortado contém grande quantidade de vírus sendo uma
importante fonte de infecção nos rebanhos (OSTLUND, 1993).
Embora a patogenia da encefalomielite ou do abortamento pareça ser
multifatorial, a fase virêmica da infecção pelo EHV-1 é crítica pelo transporte
intracelular do vírus desde o trato respiratório e tecido linfoide associado até o SNC
ou útero (GOEHRING et al, 2011). O abortamento é consequente à isquemia
resultante da vasculite no endotélio vascular uterino. Essa inflamação leva a um
quadro de necrose trombo-isquêmica dos microcotilédones e do estroma
intercotiledonário. Se as lesões vasculares forem extensas, o feto será expulso
antes de infecção viral transplacentária. Em outros casos, a interrupção na barreira
uteroplacentária permite a entrada do vírus ou de células infectadas pelo EHV-1 na
circulação fetal (SMITH & BORCHERS, 2001; SLATER, 2000).
Existem duas hipóteses diferentes quanto à patogenia dos abortamentos
decorrentes da infecção pelo EHV-1. A primeira indica que o abortamento ocorre
pela infecção placentária ou do feto, ou de ambos. A segunda hipótese surgiu de
estudos onde não foram detectados antígenos virais em fetos abortados e placentas,
após infecção experimental das mães. De acordo com essa teoria, o abortamento
ocorre devido ao infarto placentário resultante de lesões endoteliais causadas pela
infecção viral na vasculatura endometrial (MUKAIYA et al, 2000).
Edington et al (1991), em um estudo utilizando uma cepa virulenta do EHV-1
(Army 184), demonstraram a infecção inicial das células endometriais e tecidos
placentários, seguido de trombose, hemorragia e isquemia endometrial secundária
levando ao abortamento na fase final da gestação. A presença de RNAm do EHV-1
no citoplasma de trofoblastos e nas células epiteliais que recobrem os vilos
alantocoriônicos placentários sugerem infecção direta célula a célula entre o
endométrio e os trofoblastos (MUKAIYA et al, 2000). Szeredi et al (2003)
detectaram, além do ácido nucleico viral, a presença de antígenos virais nos
trofoblastos das membranas fetais, reforçando a hipótese de que o vírus pode
infectar o tecido placentário através desse caminho.
A razão pela qual a grande maioria dos abortamentos causados pelo EHV-1
ocorre no terço final da gestação ainda não é totalmente esclarecida, porém,
estudos indicam que fatores hormonais relacionados à gestação podem ter
influência no quadro inflamatório decorrente da infecção pelo EHV-1. Foi observado
20
que as mudanças vasculares endometriais e a expressão de antígenos virais nas
células endoteliais foi inferior nas éguas em inicio de gestação. A progesterona,
cortisona e o estrógeno em alta concentração inibem a resposta linfocitária, e a
progesterona tem um efeito imunossupressor nas concentrações encontradas na
interface materno-fetal, tanto em humanos como em animais de laboratório. É
provável que qualquer efeito direto da progesterona na facilitação da infecção viral
no endométrio seja maior quando o hormônio é secretado na interface
uteroplacentária na fase final gestacional do que quando liberado na circulação pelo
corpo lúteo nos primeiros 4-5 meses de gestação (SMITH et al, 1996). Além disto, foi
recentemente demonstrado que a regulação da expressão de moléculas de adesão
na superfície endotelial pode ser dependente do ambiente hormonal na fase final da
gestação (LUNN et al, 2009).
Em abortamentos decorrentes da infecção pelo EHV-1, a placenta encontrase normal ou levemente edemaciada, e é expulsa juntamente com o feto ou em
poucos minutos após, como ocorre em um parto normal. Lesões fetais
macroscópicas
incluem
edema
pulmonar,
icterícia,
edema
subcutâneo,
esplenomegalia e acúmulo de líquido peritoneal e pleural. Numerosos pontos
necróticos branco-acinzentados medindo 1-5 mm de diâmetro estão presentes no
fígado (DONALDSON, 2003).
A mieloencefalopatia causada pelo herpesvirus tipo 1 em equinos consiste em
uma manifestação esporádica e incomum. Os sinais neurológicos incluem
mieloencefalite difusa e multifocal, secundária a vasculite, hemorragia, trombose e
injuria isquêmica neuronal. Normalmente se observa um inicio súbito e manifestação
precoce de ataxia, paresia e incontinência urinária, podendo haver o envolvimento
de diversos animais com um histórico recente de febre, abortamentos ou doença
respiratória (PUSTERLA et al, 2009).
Tem sido sugerido que as diferenças de patogenicidade do EHV-1 sejam
devido à circulação de linhagens distintas do vírus. Nugent et al. (2006) compararam
geneticamente duas cepas de EHV-1 circulantes (cepa Ab4, conhecidamente
neuropatogênica, isolada de um caso de paralisia, e a cepa V592, nãoneuropatogênica, isolada de um surto abortivo, sem sinais neurológicos). As
análises indicaram que a cepa neuropatogênica possuía uma mutação na ORF30,
onde há uma troca da base de adenina para guanina na posição 2254 do gene que
21
codifica a subunidade catalítica da DNA polimerase. Esta mutação resulta em um
aumento na duração e magnitude da viremia em animais infectados (LUNN et al,
2009).
2.2 Situação da enfermidade em nível mundial e nacional
O herpesvirus equino é considerado endêmico na população equina em todo
o mundo (OSTLUND, 1993). Estudos sorológicos realizados no estado de Kentucky
(EUA), na década de 1960, já indicavam que 85% dos potros entre 6-8 meses após
desmame eram soropositivos para o vírus da rinopneumonite equina. Estudos
subsequentes confirmaram a soroprevalência da infecção pelo EHV em potros no
mesmo estado, porém com a observação que a grande maioria das infecções estava
associada especificamente com o EHV-4 (GILKERSON et al, 1998). Estudos
anteriores conduzidos pelo mesmo grupo de pesquisadores demonstraram que a
infecção de potros lactentes pelo EHV-1 pode ocorrer antes dos 30 dias de vida, e
que as éguas em lactação são as prováveis fontes primárias da infecção para outras
éguas e potros no mesmo rebanho (GILKERSON et al, 1997).
A encefalomielite herpética (EHM – equine herpes myeloencephalopathy) tem
apresentado um aumento de sua prevalência nos Estados Unidos e Europa,
afetando inclusive outras espécies, com surtos neurológicos fatais causados pelo
EHV-1 em ursos-negros, porquinhos da índia e gazelas e pelo EHV-9 em um ursopolar, gazelas e girafa (WOHLSEIN et al, 2011; SCHRENZEL et al, 2008). Em 2000
foi relatado um surto neurológico na Virgínia (EUA), onde 19 de 44 cavalos
desenvolveram sintomatologia nervosa (FRIDAY et al, 2000). Outro surto ocorrido
em 2003 onde 117 cavalos apresentaram sinais de infecção pelo EHV-1 e 44 destes
apresentaram sinais de EHM (HENNINGER et al, 2007). Mais recentemente em
Utah (EUA), foram 26 casos confirmados com EHM no ano de 2011 (KYDD et al,
2012). No Canadá, 20 de 104 cavalos apresentaram o quadro neurológico em um
surto ocorrido em 2008 (BURGESS et al, 2012). No continente europeu têm sido
reportados surtos neurológicos na Holanda, Bélgica, Croácia e França (GOEHRING
et al, 2006; GRYSPPERDT et al, 2011; BARBIC et al, 2012; PRONOST et al,
2010b).
22
Recentemente, um surto abortivo em éguas não-vacinadas foi relatado na
Inglaterra (IRWIN et al, 2007). Na Turquia, um estudo demonstrou a presença de
anticorpos específicos para o EHV-1 e 4 em equídeos com 14,5% (42/290) dos
equinos, 37,2% dos muares e 24,2% dos asininos reagentes ao EHV-1 (ATASEVEN
et al, 2009). Na Polônia, uma análise de 452 amostras de tecidos provenientes de
potros abortados ou natimortos no período compreendendo os anos de 1977 a 2010
detectou o EHV-1 em 106 (23,5%) das amostras analisadas por isolamento do vírus
e detecção de antígenos virais por imunofluorescência direta (BAZANOW et al,
2012).
No Brasil, vários estudos sorológicos demonstraram que os herpesvirus
encontram-se amplamente disseminados entre os equinos de nosso país. Em 2000,
Moreira et al. detectaram 17,7% de soros positivos em
299 amostras de soro
sanguíneo de animais não-vacinados contra rinopneumonite equina na região de
Curitiba, Paraná. Neste mesmo estudo não foi observado relação entre a
soropositividade e a raça, sexo ou procedência dos animais, porém houve relação
direta do percentual de animais soropositivos com a evolução da idade dos animais.
Esta mesma tendência de níveis altos de soropositividade observado em animais
mais velhos foi também observada em estudos posteriores (LARA et al, 2003; 2010).
No Rio Grande do Sul, Diel et al. (2006) observaram
4,5% de animais
soropositivos para o herpesvirus equino em 1.506 amostras provenientes de 65
municípios do estado. Em São Paulo, um percentual de 27,2% de soropositividade
para o herpesvirus equino em 1.341 equinos não vacinados contra o EHV foi
detectado em rebanhos no noroeste do estado em 2002. Lara et al.(2003)
detectaram também em São Paulo anticorpos anti-EHV-1 em 33,4% dos 659
animais não vacinados testados no período entre 1995-1996. Em 2009 foi detectado
que 26% de 163 equídeos (143 equinos e 20 muares) na região sul de SP foram
soropositivos para o EHV-1 (CUNHA et al, 2009).
Um inquérito sorológico realizado em Minas Gerais demonstrou um
percentual de soropositividade para o EHV de 17,6% em 826 amostras de equídeos
analisadas (LARA et al, 2010). Já na região norte do Brasil, no município de Monte
Negro em Rondônia, Aguiar et al. (2008) detectaram em um total de 176 equídeos
não-vacinados contra o EHV (15 muares e 161 equinos), 22,7% de animais reativos
ao EHV-1. Heinemann et al., (2002) encontraram em equinos não-vacinados de
23
propriedades familiares rurais de Uruará, no Pará, 17,71% de animais soropositivos
para o herpesvirus equino num total de 96 amostras de 32 propriedades. Também
no Pará, Pena et al (2006) em um estudo para estimar a prevalência de anticorpos
contra os vírus da influenza equina, arterite equina e herpesvirus equino,
observaram 45,5% de soropositividade para o EHV em um total de 506 soros de
equinos não-vacinados.
2.3 Diagnóstico clínico e laboratorial
De um modo geral, as manifestações clínicas decorrentes da infecção pelo
herpesvirus equino tipo 1 e o vírus da arterite equina são semelhantes em muitos
aspectos, podendo resultar desde infecções subclínicas até manifestações
respiratórias seguidas de abortamento (HEINEMANN et al, 2002). A sintomatologia
clínica da infecção pelo EHV-1 e EAV é semelhante à doença respiratória decorrente
das infecções causadas por outros agentes infecciosos tais como o herpesvírus
equino tipo 4 (EHV-4), rinovírus equino, vírus da influenza equina (EIV), vírus da
anemia infeciosa equina
(EIAV), Streptococcus spp e Rhodococcus equi
(CHRINSIDE, 2000). Por este motivo, o diagnóstico diferencial das infecções pelo
EAV e pelo EHV-1 deve obrigatoriamente ser confirmado por exames laboratoriais
(TIMONEY, 2002; BELL et al, 2006; HOLYOAK et al, 2008; CHRINSIDE et al, 2000).
Em surtos ou episódios de abortamento em equinos, o diagnóstico presuntivo
da infecção pelo EHV-1 pode ser realizado de acordo com algumas características
clínicas e epidemiológicas tais como o período gestacional de ocorrência, sinais
clínicos apresentados pelas fêmeas, histórico de enfermidade respiratória no local
de criação ou histórico de estresse além do histórico de surtos abortivos (OSTLUND,
1993). Somado a estas informações, devem ser observadas as características
macroscópicas do feto e da placenta além de achados de necropsia onde
24
frequentemente são observadas lesões vasculares graves com exsudato seroso ou
sero-sanguinolento nas cavidades serosas; mucosas aparentes podem estar
ictéricas, assim como o tecido subcutâneo; petéquias no baço, rins, pleura e ás
vezes no epicárdio e endocárdio. O fígado geralmente se apresenta congesto e com
necroses focais puntiformes (THOMASSIAN, 2005).
O diagnóstico laboratorial da infecção pelo EHV-1 pode ser realizado pelo
isolamento e identificação viral a partir de amostras clínicas ou ainda pela sorologia
pareada. As amostras clínicas a serem coletadas e enviadas ao laboratório incluem
swabes naso-faríngeos, capa leucocitária do sangue coletado de animais na fase
aguda da doença; amostras do pulmão, baço, fígado ou timo de fetos abortados ou
natimortos além do soro dos animais suspeitos. O swabe contendo exsudato nasofaríngeo deve ser acondicionado em meio de transporte (meio de cultivo celular)
refrigerado. As amostras fetais devem ser coletadas de forma asséptica e
transportadas a 4 ºC preferencialmente em meio de cultivo celular. As amostras que
não forem rapidamente processadas devem ser congeladas a -70 ºC (OIE, 2008).
O EHV-1 é capaz de se multiplicar em cultivos celulares de outras espécies
além da equina, o que auxilia a diferenciá-lo do EHV-4, que só se multiplica em
células de origem equina. Células das linhagens RK-13 (rabbit kidney cells) e VERO
(African green monkey kidney cells) são rotineiramente utilizadas para o isolamento
e multiplicação do EHV-1 em laboratórios de virologia (FRANCO, 2012). Em células
suscetíveis in vitro, o EHV-1 produz efeito citopático (ECP) típico de herpesvírus:
arredondamento celular, formação de aglomerados semelhantes a cachos de uva,
produção de focos de destruição da monocamada de células (Figura 01).
25
Figura 01: Efeito citopático (ECP) característico de EHV-1 em células da linhagem
RK13.
A identificação do vírus pode ser feita pelo uso de anticorpos monoclonais
em testes de imunofluorescência (IFA) ou imunoperoxidase (IPX). Essas técnicas
têm sido também utilizadas para demonstrar a presença de antígenos virais em
cortes de tecidos congelados e/ou em células infectadas (FRANCO, 2012).
O diagnóstico direto da infecção pelo EHV-1 por técnicas moleculares, como
a reação em cadeia pela polimerase (PCR), oferece uma boa alternativa ao
isolamento viral em cultivo celular, sendo um método sensível de detecção do EHV1 em secreções respiratórias, linfócitos circulantes e outros tecidos. Os resultados
geralmente são obtidos em poucas horas após o processamento das amostras,
permitindo a implementação precoce de medidas de controle e reduzindo a
disseminação viral. Como a PCR tem como base a amplificação e detecção de um
segmento do genoma viral, não há distinção entre vírus viável, latente ou inativado
(VARASSO et al, 2001; HARLESS & PUSTERLA, 2006; LUNN et al, 2009).
A detecção de anticorpos no soro de animais com suspeita de infecção pelo
EHV-1 pode ser realizada por soroneutralização (SN), fixação de complemento (FC)
e ELISA (OIE, 2008). Um aumento de quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos
26
em amostras de soro coletadas na fase aguda e na fase convalescente da
enfermidade (geralmente intervalo de 14-21 dias) fornece o diagnóstico definitivo da
infecção pelo EHV-1 (LUNN et al, 2009). A imunidade humoral contra o EHV-1 é
relativamente de
curta duração. Anticorpos neutralizantes e fixadores de
complemento aparecem cerca de duas semanas após a infecção e tanto IgG como
IgM podem ser detectados. Anticorpos fixadores de complemento tem meia vida
curta e desaparecem em cerca de três meses, enquanto que anticorpos
neutralizantes podem persistir por mais de um ano (PAILLOT et al, 2008).
O teste de soroneutralização (SN) é utilizado para se detectar anticorpos
específicos presentes no soro com capacidade de neutralizar a infectividade viral. O
teste pode ser feito em amostras individuais ou em soros pareados. Basicamente, o
soro suspeito é testado frente a uma cepa padrão de vírus previamente quantificada
(BRUM, 2012).
Entretanto, a SN não permite a diferenciação entre os anticorpos induzidos
após infecção pelo EHV-1 ou EHV- 4 pela reatividade sorológica cruzada entre
esses dois agentes. Devido a sua similaridade antigênica, a interpretação dos dados
de estudos sorológicos realizados até o inicio dos anos 1990 foi complicado pela
falta de um teste especifico para cada subtipo viral. Além disto, os testes sorológicos
convencionais não permitem a diferenciação dos anticorpos vacinais daqueles
induzidos pela infecção natural (PATEL & HELDENS, 2005; FOOTE et al, 2006).
2.4 Profilaxia e Controle
A profilaxia e o controle das infecções por herpesvírus em equinos consistem,
essencialmente, em medidas de higiene e manejo adequadas associadas à
vacinação. Os programas de controle geralmente possuem três objetivos básicos:
prevenir a entrada do agente no local de criação, limitar a extensão da disseminação
e severidade dos sinais clínicos uma vez que o agente já atingiu a propriedade, e
limitar a disseminação do EHV a outras propriedades durante um surto (SLATER,
2007).
27
Na década de 1960, logo após a descoberta do isolamento e adaptação do
EHV-1 em cultura de células, foi desenvolvida uma vacina replicativa resultante da
atenuação da cepa RacH por sucessivas passagens em células de rim suíno.
Alterações genômicas com a deleção do gene IR6 durante passagens do vírus em
células heterólogas in vitro, poderiam explicar a base genética da atenuação viral
justificando sua segurança em relação à reversão da virulência (ROSAS et al, 2006).
As vacinas atualmente utilizadas para a profilaxia contra o EHV-1 são na sua
maioria inativadas, apesar de diversos estudos demonstrarem a importância da
imunidade celular para a proteção clínica (ALLEN et al, 1995). Apesar dos níveis de
anticorpos neutralizantes não estarem correlacionados com o nível de proteção, a
frequência de linfócitos T citotóxicos específicos para o EHV-1 parece ser maior em
indivíduos protegidos contra a doença do que os não protegidos (BRESGEN et al,
2012).
A maioria das vacinas contendo antígenos do EHV-1 é comercializada como
vacinas polivalentes, associadas com antígenos do EHV-4, EIV (vírus da influenza
equina), tétano, e os vírus da encefalite equina venezuelana, leste e oeste (VEEV,
EEEV, WEEV). Apenas três vacinas foram licenciadas para a proteção contra o
abortamento induzido pelo EHV-1, uma na Europa (Prodigy®, Intervet) e duas nos
EUA
(Pneumabort
K®,
Duvaxyn®,
Fort
Dodge).
Nenhuma
das
vacinas
comercialmente disponíveis tem como foco principal a proteção contra a forma
neurológica da infecção (ROSAS et al, 2006). No Brasil, todas as vacinas
licenciadas e aprovadas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA) são inativadas.
Uma vacinação eficiente contra o EHV-1, com a indução de imunidade
protetora de longa duração ainda não está disponível comercialmente. O aumento
da ocorrência de surtos de EHV-1 em nível mundial, particularmente com a
apresentação neurológica, tem resultado numa reavaliação dos imunógenos
utilizados atualmente para o controle da infecção em rebanhos equinos (VAN DE
WALLE et al, 2010). A ineficácia das atuais vacinas inativadas ou de vírus vivo
modificado em promover completa proteção contra a infecção do EHV-1 estimulou a
pesquisa e o desenvolvimento de diversas vacinas experimentais tais como vacinas
de DNA, de subunidades e deleção de genes (FOOTE et al, 2006; SOBOLL et al,
2006, 2010; PATEL et al, 2003).
28
Como medidas profiláticas, podemos ainda citar a restrição da movimentação
de equinos e o isolamento de animais com sintomas respiratórios; separação das
éguas prenhes e com potros de outras categorias de animais, principalmente onde
existam equinos jovens que são mais susceptíveis à infecção respiratória; evitar
situações estressantes como desnutrição, transporte e superlotação, evitando assim
possíveis reativações de infecções latentes (CHRINSIDE et al, 2000; FRANCO,
2012). Em casos de abortamentos em éguas, o vírus é excretado junto com o feto e
a placenta, que podem conter altos títulos de vírus, e são importantes fontes de
infecção. O contato direto ou indireto com esse material frequentemente resulta na
disseminação do EHV-1 em uma propriedade (FRANCO, 2012; TIMONEY et al,
2006).
29
3. Vírus da arterite viral equina
A arterite viral equina (AVE) é uma doença infecciosa de equídeos, assim
chamada pelas características das lesões inflamatórias nos pequenos vasos
sanguíneos, especialmente nas arteríolas durante a fase aguda da infecção
(TIMONEY, 2002). A enfermidade possui distribuição mundial e está associada a
prejuízos econômicos importantes para a indústria equina. Embora a doença possa
ser confundida com diversas outras enfermidades com características clínicas
semelhantes, a infecção pelo vírus da arterite equina (EAV – equine arteritis virus)
deve ser considerada em casos esporádicos ou epizoóticos de síndromes
respiratórias e/ou abortivas, morte de potros associada a sinais respiratórios e/ou
entéricos, ou morte súbita em potros (DEL PIERO, 2000a).
Identificado como o agente do “Complexo aborto-influenza equina” por muitos
anos, o vírus da arterite equina finalmente foi classificado como um agente
etiologicamente distinto após um surto de doença respiratória e abortamentos em
uma criação de cavalos próximo a cidade de Bucyrus, Ohio (EUA) em 1953. Nesta
ocasião o vírus foi isolado e posteriormente caracterizado a partir do pulmão de um
feto abortado (TIMONEY, 2002).
3.1 O agente e a enfermidade
O vírus da arterite equina é o protótipo do gênero Arterivirus, Família
Arteriviridae (SNIJDER & MEULENBERG, 1998). Baseado na estrutura genômica e
estratégias de replicação, três outros vírus são classificados dentro do mesmo
gênero: vírus elevador da lactato desidrogenase em camundongos (LDEV), vírus da
febre hemorrágica dos símios (SHFV) e o vírus da síndrome respiratória e
reprodutiva dos suínos (PRRSV) (LIMA & OSÓRIO, 2012).
O EAV é um vírus esférico com diâmetro variando entre 50-70 nm. Possui um
nucleocapsídeo possivelmente icosaédrico envolto por um envelope lipoprotéico
contendo projeções de glicoproteínas virais (DEL PIERO, 2000a). O genoma
30
consiste em uma molécula linear de RNA fita simples de sentido positivo de
aproximadamente 12,7 kb e nove ORFs (open reading frames) que são traduzidas
em proteínas estruturais e não-estruturais (METZ et al, 2008). As ORFs 1a e 1b
estão localizadas na região proximal 5’, ocupando três quartos do genoma e são
traduzidas em 12 polipeptídeos não estruturais com funções de proteases e
complexo replicase. As demais ORFs (2a, 2b, e 3 a 7) estão localizadas na porção 3’
do genoma e codificam as proteínas estruturais (GP2a, GP2b, E, GP3, GP4, GP5,
M, e N respectivamente) do vírus (YOUNG GO et al, 2011).
Dentre as proteínas do envelope viral, a proteína de membrana nãoglicosilada de 16-kDa (proteína M) e a proteína glicosilada de 30-42 kDa
denominada GP5, são as mais abundantes e ocorrem como heterodímeros ligados
covalentemente (DE VRIES et al,1995). A Gp2b (anteriormente denominada Gs),
GP3 e GP4 são glicoproteínas de menor importância do envelope viral. A pequena
proteína E, hidrofóbica, com 6-10.5 kDa é detectada em maior quantidade no
envelope do que as outras glicoproteínas com exceção das proteínas M e GP5
(WIERINGA, 2004). A glicoproteína 5 (gp5) é a mais variável dentre as proteínas
estruturais, e juntamente com a glicoproteína M é a principal responsável pela
interação com a célula hospedeira e indução de anticorpos neutralizantes (METZ et
al, 2008).
Atualmente, somente um sorotipo do EAV é reconhecido, o sorotipo Bucyrus;
porém, isolados de campo geralmente possuem diferentes graus de virulência (LIMA
& OSÓRIO, 2012). A análise e caracterização filogenética com base na sequência
parcial da ORF5 (nucleotídeos 11296-11813) permitiu a subdivisão das cepas do
EAV em dois grupos distintos: Norte-americano e o Europeu que ainda é subdividido
em dois subgrupos: europeu 1 (EU1) e europeu 2 (EU2) (ZHANG et al, 2007).
A transmissão do EAV ocorre principalmente pela via respiratória a partir de
secreções de animais na fase aguda da infecção. Outra forma importante de
infecção é a venérea, pelo sêmen contaminado. Ainda foi demonstrada a
transmissão horizontal via fômites ou infecção vertical do feto, sendo estas formas
incomuns ou raramente observadas. O período de incubação da infecção varia de 3
a 14 dias, e o vírus é excretado em altas concentrações nas secreções respiratórias
de 7 a 14 dias (BELL et al, 2006).
31
Há uma grande variação nos sinais clínicos e na severidade da infecção pelo
EAV.
A maior parte das infecções são subclínicas, e apesar de só haver um
sorotipo do EAV, a doença clínica causada por diferentes cepas podem possuir
diferentes graus de severidade. Assim como na maioria dos quadros infecciosos,
animais velhos, debilitados ou imunossuprimidos além de potros muito jovens
geralmente apresentam doença clínica mais grave (HOLYOAK et al, 2008).
Após a exposição, o vírus da arterite equina replica inicialmente nos
macrófagos alveolares e rapidamente se dissemina pelo organismo e infecta
diversos tipos celulares, incluindo células endoteliais, da musculatura lisa nas
arteríolas e miométrio, epitélio tubular renal, epitélio adrenal e, com menor
frequência, no parênquima hepático além de células das criptas intestinais e epitélio
bronquial (GLASER et al, 1997). Cerca de 10 dias após a infecção, ocorre redução
do antígeno viral em todos os locais, com exceção da túnica média das arteríolas
musculares. Aparentemente o último local invadido é o epitélio renal tubular, onde o
vírus persiste por mais duas semanas. Partículas infecciosas do EAV geralmente
não são detectadas nos tecidos após 28 dias de infecção, com exceção ao trato
reprodutivo de alguns machos (DEL PIERO, 2000a).
Os sinais clínicos mais consistentes da doença são a febre (geralmente ≤
41ºC) contínua por dois a nove dias seguido de leucopenia acentuada. Além disso,
tem sido frequentemente observado em casos da enfermidade a ocorrência de
depressão, anorexia, conjuntivite e rinite com descarga nasal e ocular, edema peri e
supra-orbital, edema de escroto e prepúcio ou glândula mamária e nos membros
(principalmente membros pélvicos), urticária localizada na tábua do pescoço ou na
face, ou até mesmo generalizada por todo o corpo, abortamento, pneumonia
intersticial ou pneumoenterite em potros jovens (HOLYOAK et al, 2008; TIMONEY,
2002).
O abortamento normalmente não é precedido por sinais premonitórios e
ocorre no final da fase aguda ou na fase convalescente da infecção pelo EAV. Pode
ocorrer entre três a dez meses de gestação, e a taxa de abortamentos em surtos de
EVA variam desde 10% até 50-60% (TIMONEY & MCCOLLUM, 1993). O feto pode
ser expulso parcialmente autolisado, e lesões macroscópicas não são frequentes. O
EAV pode ser isolado da placenta e dos tecidos e fluidos fetais que são
32
considerados importantes fontes de infecção para animais suscetíveis (GLASER et
al, 1997).
Especula-se que a patogenia do abortamento esteja associada ao
desenvolvimento de miometrite. Neste caso, a redução do fluxo sanguíneo para o
feto ocorreria em função da compressão dos vasos sanguíneos pelo edema
endometrial, ou por alteração do tônus vascular por diversos mediadores
inflamatórios. Os níveis de progesterona sérica diminuem de seis a 48 horas antes
do abortamento, e não são detectáveis à necropsia. A diminuição da produção de
progesterona pela placenta hipóxica combinada com a liberação local de
prostaglandinas desencadeia o descolamento coriônico. Vasculite com trombose
associada também induzem a isquemia (DEL PIERO, 2000a).
O garanhão é o reservatório natural do vírus da arterite equina, que garante a
sua persistência nas populações equinas por todo o mundo. O estado de portador só
foi identificado no garanhão e parece ser dependente de testosterona uma vez que
não foi identificado em éguas, potros sexualmente imaturos ou machos castrados
(TIMONEY, 2002). Em um estudo realizado por Holyoak et al (1993), o EAV foi
recuperado a partir das glândulas sexuais acessórias de potros pré-púberes por
mais de 180 dias após infecção experimental. Os andrógenos exercem diversos
efeitos nos tecidos reprodutivos que podem facilitar a persistência do EAV, como a
manutenção da população celular suscetível ou supressão dos linfócitos T. A
castração causa mudanças nessas barreiras, permitindo a eliminação viral do trato
reprodutivo (MCCOLLUM et al,1994; HEDGES et al, 1999).
Durante a infecção aguda, garanhões passam por um período de
subfertilidade temporária, associada com redução de libido, da motilidade e
concentração espermática, e da porcentagem de espermatozoides de morfologia
normal no sêmen. Essas alterações podem persistir por mais de 16 semanas, e
provavelmente são resultantes do aumento da temperatura escrotal e não por
alteração direta induzida pelo vírus (NEU et al, 1992).
Os machos portadores liberam o vírus no sêmen constantemente, sendo uma
potencial fonte de transmissão para animais suscetíveis na época da reprodução
(TIMONEY, 2002). Como uma das medidas de controle adotadas pelo Governo
brasileiro, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem como
33
uma das exigências para a importação de sêmen um atestado sorológico negativo
do garanhão contra o EAV.
Estudos indicam a ocorrência de diversidade genética e fenotípica das cepas
do EAV durante a infecção persistente no garanhão (ECHEVERRIA et al, 2010).
Análises genéticas de sequências do RNA viral no sêmen desses garanhões
indicam que as quasispecies de EAV evoluem consideravelmente durante o longo
período de infecção persistente nestes animais (HEDGES et al,1999).
3.2 Situação da enfermidade no Brasil e em nível mundial
O grande surto abortivo causado pelo EAV no estado norte-americano do
Kentucky em 1984 despertou um grande interesse de técnicos e criadores em
relação a este agente viral (TIMONEY, 2002). Atualmente, diversos estudos
soroepidemiológicos têm demonstrado que a infecção pelo EAV está amplamente
distribuída em cavalos das Américas do Norte e Sul, Europa, Austrália, África e Ásia,
com variação considerável na soroprevalência da infecção entre países e entre as
populações equinas dentro de alguns países (HOLYOAK et al, 2008; LIMA &
OSÓRIO, 2012).
A prevalência da infecção pelo EAV varia consideravelmente de acordo com a
localização geográfica dos rebanhos. Em um estudo realizado em 1998, 2% dos
cavalos não-vacinados nos EUA foram considerados soropositivos para o EAV,
demonstrando a baixa soroprevalência e a alta suscetibilidade da população em
caso de um eventual surto (BELL et al, 2006). Semelhantemente, cavalos residentes
e não-vacinados da Califórnia tiveram uma soroprevalência de 1,9%, enquanto
18,6% dos cavalos importados para a Califórnia de fora dos EUA (mais comumente
da Europa) foram positivos para EAV. Um estudo de 1973 demonstrou a presença
de anticorpos anti-EAV em 2,3% dos cavalos ingleses, e de 11,3% em cavalos
suíços. Cerca de 14% dos soros coletados entre 1963 e 1975 de cavalos na
Holanda foram positivos. Na Alemanha, 1,8% dos cavalos foram soropositivos em
1987; todavia, a soroprevalência subiu para 20% em 1994 (BELL et al, 2006).
34
O primeiro isolamento do EAV na Austrália foi a partir de sêmen proveniente
de garanhões importados dos Estados Unidos. Um estudo sorológico revelou que
em 107 amostras de garanhões Standardbred obteve-se 73% de soropositividade,
enquanto em Puros-Sangue essa soropositividade caiu para 8% (HUNTINGTON et
al, 1990).
A soroprevalência da infecção pelo EAV varia não somente entre países, mas
também entre raças. Nos EUA, foi observado uma diferença importante em relação
as taxas de soropositividade entre Standardbred
e os cavalos Puro-sangue
(Thoroughbred). Neste caso, a infecção foi considerada endêmica com 77-84,3% de
soropositividade no primeiro grupo, contra somente 0-5,4% de animais soropositivos
da raça Puro-sangue (HOLYOAK et al, 2008). Estas diferenças específicas quanto à
raça podem refletir diferenças genéticas que conferem resistência à infecção, porém,
muito provavelmente são um reflexo da diferença cultural e de manejo dentro dessas
populações e raças equinas. Outros estudos não demonstraram nenhuma variação
especifica da raça na suscetibilidade à infecção pelo vírus da arterite equina ou no
estabelecimento do estado de portador (HOLYOAK et al, 2008).
Na última década, tem sido observado um aumento nos surtos decorrentes da
infecção pelo EAV. Em 2005 foi relatado um surto de arterite viral equina em uma
propriedade de cavalos quarto de milha no estado do Novo Mexico, EUA,
caracterizado por sintomatologia clínica pouco evidente com episódios de
abortamentos causados pelo vírus. Em 2006 e 2007, um grande surto envolveu
diversos estados americanos. O início se deu em uma propriedade em Novo Mexico,
onde cerca de 50% das éguas sofreram abortamentos, e quatro garanhões foram
infectados. O vírus se disseminou para outros seis estados americanos através do
transporte de sêmen ou das éguas visitantes dessa propriedade (TIMONEY et al,
2006). Posteriormente, comprovou-se que este surto foi consequente ao ocorrido em
2005, causado pela movimentação de animais infectados entre os estados (ZHANG
et al, 2010). Cabe ainda ressaltar que o uso difundido da prática de transferência de
embriões em cavalos Quarto de Milha e a proliferação do número de propriedades
com éguas receptoras nos últimos anos são fatores que desempenham um papel
importante na epidemiologia do EAV, e que não eram reconhecidos anteriormente
(TIMONEY et al, 2006).
35
Durante o verão de 2007, ocorreu um surto na região da Normandia, França,
com animais infectados pertencentes a 18 propriedades de cinco regiões diferentes
do país. Após a investigação epidemiológica, foi sugerido que um garanhão portador
teria sido o foco inicial do surto (MISZCZAK et al, 2012), e o sêmen infectado usado
para a inseminação artificial em outras propriedades foi o responsável pela
dispersão (PRONOST et al, 2010a). Neste surto, oito mortes foram observadas,
incluindo um feto, cinco potros jovens e dois cavalos adultos. Quarenta e três
animais foram confirmados positivos através de RT-PCR. A análise filogenética
revelou que os 33 isolados do EAV pertenciam ao subgrupo EU-2 (PRONOST et al,
2010a).
Na Bélgica foram relatados dois surtos da enfermidade: o primeiro em 2000,
em uma propriedade cuja única característica clínica foi um surto abortivo com
isolamento do agente e observação de animais soropositivos em 95,5% do plantel; e
o segundo surto em 2008 onde dois potros neonatos morreram após apresentarem
sintomatologia respiratória aguda e severa (VAIRO et al, 2012). Adicionalmente,
uma pesquisa sorológica das amostras submetidas à Faculdade de Medicina
Veterinária de Ghent, demonstrou um aumento de 10 a 30% de soropositividade
para o EAV em equinos além do isolamento viral a partir de animais nos diferentes
surtos (VAIRO et al, 2012).
Um estudo realizado por Lee et al (2010), na Coréia do Sul investigando a
ocorrência de doenças infecciosas em cavalos importados entre os anos de 2003 e
2008 demonstrou a presença de 28 animais soropositivos para o EAV em um total
de 6.043 animais.
A Argentina é o país sul-americano onde há o maior número de casos
registrados. O primeiro isolamento do EAV neste país ocorreu em 2001 a partir do
sêmen de um garanhão soropositivo (LIMA &OSORIO, 2012). Em 2010, foi relatado
um surto de EAV na província de Buenos Aires, onde a fonte de infecção viral foi o
sêmen de um garanhão importado da Holanda. Este sêmen foi utilizado para
inseminar éguas de cinco propriedades diferentes, e de onde a infecção se espalhou
através de movimentação animal para outras sete propriedades (BARRANDEGUY,
2010).
Na Venezuela, de 1.008 soros equinos pertencentes a cinco estados
diferentes, foi observado
2,48% de soropositividade com uma proporção
36
significativamente maior em cavalos importados em relação aos cavalos locais
(SAÉNZ, 2010).
No Brasil, o primeiro surto causado pelo EAV foi relatado em 1993, em Ibiúna,
SP a partir de sorologia pareada (BELLO et al, 2007). Diversos estudos sorológicos
posteriores tem confirmado a circulação do agente em diferentes regiões do país
(LIMA & OSÓRIO, 2012). Bello et al. (2007) detectaram sete amostras positivas
(0,85%) para a presença de anticorpos específicos de um total de 826 amostras de
equídeos (equinos, muares e asininos) no estado de Minas Gerais.
Diel et al. (2006), encontraram 33 animais sororreativos de 1.506 amostras
analisadas, correspondendo a 2,2% do total dos animais testados no Rio Grande do
Sul. Em São Paulo, Lara et al (2002) encontraram uma prevalência de 18,2% em
um total de 659 amostras. Essa alta prevalência em São Paulo pode ser um reflexo
da grande concentração de animais, e o intenso uso de técnicas reprodutivas como
a inseminação artificial, onde o sêmen infectado pode ser a fonte de introdução em
um plantel negativo. Anteriormente em São Paulo, Fernandes & Souza (1999)
observaram 23,52% de animais soropositivos em um grupo de animais com sinais
clínicos respiratórios, e 10,34% de animais soropositivos para o EAV para animais
com quadro de abortamento. Em um estudo mais recente foi encontrada uma
prevalência de 5,7% (80 amostras positivas) num total de 1400 amostras
provenientes de mesorregiões paulistas entre 2007 e 2008 (BRAGA et al, 2012).
Não foram detectados animais reagentes à pesquisa de anticorpos contra o
EAV, em um estudo com 176 amostras, na região de Monte Negro, Rondônia
(AGUIAR et al, 2008). Ainda na região Norte, Heinemann et al (2002) também não
detectaram animais reagentes contra o EAV no estado do Pará, num total de 96
animais. A ausência de anticorpos anti-EAV nessa região pode ser devido à baixa
aglomeração de animais, do pouco uso das técnicas de inseminação artificial ou da
baixa importação de animais.
37
3.3. Diagnóstico clínico e laboratorial
O diagnóstico da infecção pelo vírus da arterite equina tem como base inicial
as características clínicas e epidemiológicas onde se verifica sinais de enfermidade
respiratória incluindo dispneia, lacrimejamento, edema de conjuntiva e partes baixas.
Os abortamentos precoces ajudam a fundamentar a suspeita clínica (THOMASSIAN,
2005).
A principal preocupação na doença clínica é o abortamento na fase aguda da
infecção, geralmente ocorrendo entre os três e 11 meses de gestação,
concomitantemente ou logo após a infecção. As éguas que abortam podem ou não
apresentar
sintomatologia
clínica
da
infecção
ou
sinais
premonitórios
de
abortamento enquanto que o feto pode apresentar diferentes graus de autólise ou
não apresentar lesões macroscópicas aparentes (CHRINSIDE et al, 2000; BELL et
al, 2006; DEL PIERO, 2000a). Durante a avaliação histopatológica de casos
confirmados da enfermidade, frequentemente observa-se a panvasculite que é mais
pronunciada nas arteríolas, particularmente no ceco, cólon, baço, gânglios linfáticos
associados e córtex adrenal. A presença de arterite necrotizante disseminada
envolvendo células endoteliais e mediais dos vasos afetados é considerado clássico
para o EAV (OIE, 2008).
Quando há suspeita de infecção aguda pelo EAV, a confirmação pode ser
obtida baseada no isolamento viral ou na detecção de ácido nucléico ou antígenos
virais (TIMONEY & MCCOLLUM, 1993). Para o isolamento viral, o material a ser
coletado inclui swabes naso-faríngeos e conjuntivais além de amostras de sangue
com anticoagulante EDTA ou citrato. O EAV pode ser isolado a partir do soro ou
plasma sanguíneo por 7-9 dias após infecção aguda. Uma redução na viremia
coincide com a produção de anticorpos neutralizantes específicos (HOLYOAK et al,
2008). O vírus pode ainda ser isolado de uma grande variedade de tecidos e fluidos
corpóreos de animais a partir de um a dois dias após infecção experimental pela via
respiratória (HOLYOAK et al, 2008; OIE, 2008). Em casos de abortamentos pelo
EAV, tanto o feto como a placenta contém grandes quantidades de vírus. Deve ser
realizada a tentativa de isolamento viral nos tecidos e fluidos placentários e nos
38
tecidos fetais, como pulmão, fígado e tecido linforreticular (TIMONEY, 2002;
GLASER et al,1997).
Para aumentar as chances de isolamento e detecção do agente, as amostras
clínicas devem ser obtidas o mais precocemente possível, logo após o aparecimento
de febre ou outros sinais suspeitos da infecção. Os swabes devem ser
acondicionados em meio de transporte (meios de cultura celular ou solução salina
balanceada contendo 5% de soro fetal bovino) sob refrigeração ou congelados e
enviados imediatamente em embalagem
isolante térmica até o laboratório de
diagnóstico. As amostras de soro sanguíneo devem ser enviadas refrigeradas, mas
não congeladas (TIMONEY, 2002; HOLYOAK et al, 2008).
As linhagens celulares normalmente utilizadas para o isolamento do EAV a
partir de amostras clínicas são a RK-13, VERO e células pulmonares equinas (DEL
PIERO, 2000a). As culturas celulares in vitro são examinadas diariamente para o
aparecimento do efeito citopático viral, que normalmente se evidencia entre 2-6 dias
após a infecção (OIE, 2008) (Figura 02).
Figura 02: Efeito citopático (ECP) característico de EAV em células da linhagem RK13.
39
A imunohistoquímica também pode ser utilizada para detecção de antígeno
viral, na presença ou não de lesões características da infecção (DEL PIERO,
2000b). A detecção de antígenos virais já foi demonstrada em tecidos de pulmão,
coração, fígado, baço e na placenta de fetos abortados (SZEREDI et al, 2005).
Vários testes moleculares de diagnóstico incluindo a RT-PCR (reação em
cadeia da polimerase precedida pela transcrição reversa) e RT-PCR em tempo real
vêm sendo desenvolvidos para detecção de ácidos nucléicos em culturas de tecidos,
secreções nasais e sêmen, e são cada vez mais utilizados na rotina laboratorial.
Porém, a validação destes testes ainda é necessária antes da plena aceitação como
um instrumento de confiabilidade equivalente ao teste de isolamento viral,
considerado o teste de diagnóstico padrão-ouro pela OIE (LU et al, 2008).
A detecção da soroconversão utilizando a técnica de soroneutralização é um
método seguro de identificação dos animais infectados. A infecção aguda pode ser
confirmada sorologicamente pela detecção do aumento dos títulos de anticorpos
neutralizantes anti-EAV entre a fase aguda e convalescente da doença, com um
aumento de quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos neutralizantes
específicos. A soroconversão também pode ser detectada em éguas que sofreram
abortamentos, sendo uma ferramenta útil de diagnóstico quando não se consegue
recuperar os restos placentários e fetais para o isolamento viral (TIMONEY &
MCCOLLUM, 1993; GLASER et al, 1997; DEL PIERO, 2000a). Infecções naturais ou
experimentais com o EAV resultam em imunidade duradoura contra reinfecções com
diferentes isolados/cepas do vírus. Anticorpos específicos podem ser detectados
entre os dias sete e 14 pós-infecção, coincidindo com o desaparecimento do vírus
da circulação sanguínea. Altos títulos neutralizantes são geralmente detectados em
animais com infecção persistente (LIMA & OSÓRIO, 2012).
De acordo com a OIE, a detecção de anticorpos específicos ao EAV é
baseada no teste de soroneutralização. No entanto, diversos tipos de ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos ao longo dos anos na tentativa de
simplificar o diagnóstico sorológico do EAV.
Os primeiros testes tinham como
característica negativa o grande numero de falso-positivos devido a reações
cruzadas com antígenos provenientes de vacinas produzidas em cultura celular
(GLASER et al, 1997). Dois testes desenvolvidos, um por Cho et al. (2000)
utilizando um anticorpo monoclonal de bloqueio e o outro por Nugent et al. (2000)
40
utilizando a proteína de envelope G têm sido extremamente promissores, com
sensibilidade de 99,4 e 96,7% e especificidade de 97,7 e 95,6 % respectivamente
(NEWTON et al, 2004).
A identificação do estado de portador de um garanhão deve ser
primeiramente realizada a partir de um exame sorológico para detectar a presença
ou não de anticorpos neutralizantes contra o EAV. Garanhões com título de 4 ou
superiores sem histórico de vacinação prévia para o EAV devem ser considerados
potenciais portadores. Neste caso deve ser realizado o isolamento viral ou a
detecção de ácido nucléico viral em amostra de sêmen do animal (TIMONEY, 2002).
3.4. Profilaxia e controle
A implantação de estratégias de controle como minimizar ou eliminar o
contato direto ou indireto de cavalos suscetíveis com as secreções ou excreções de
animais infectados pelo EAV, isolamento de animais recém-chegados na
propriedade por duas a três semanas, separação das éguas prenhes e potros jovens
dos demais cavalos, determinar o status sorológico dos garanhões e a presença ou
não de vírus no sêmen destes, e o uso de vacinas são medidas importantes que
devem ser adotadas (TIMONEY, 2002). A prevenção do estabelecimento do estado
de portador em garanhões e potros pré-púberes pode ser feita através da vacinação
dos potros entre seis e 12 meses de idade. Essa medida pode reduzir
significativamente o reservatório natural do vírus, principalmente em criatórios onde
a infecção é endêmica (GLASER et al, 1997; TIMONEY, 2002, BELL et al, 2006;
HOLYOAK et al, 2008).
A vacinação tem sido usada com sucesso no controle da transmissão viral,
garantindo proteção contra a doença clínica por vários anos. A imunidade após a
infecção natural ou após a vacinação parece durar anos. Os primovacinados quando
em contato com o vírus de campo pela primeira vez podem ter um ciclo curto de
reinfecção e transmissão viral, devendo ser isolados de animais suscetíveis por 21
dias. A revacinação normalmente resulta em um aumento pronunciado nos títulos de
41
anticorpos neutralizantes, garantindo proteção contra a doença clínica (HOLYOAK et
al, 2008).
Atualmente, são utilizados imunógenos contendo vírus atenuado ou antígenos
inativados do EAV. Vacinas atenuadas tem eficácia comprovada para garanhões,
éguas vazias e potros, porém não é recomendada em éguas prenhes e potros com
menos de seis semanas de vida. A vacina inativada é utilizada de forma segura nas
éguas prenhes, porém não possui uma boa imunogenicidade. Duas vacinações ou
mais são necessárias para estimular uma resposta de anticorpos neutralizantes
detectável e a duração da imunidade ainda não foi estabelecida (TIMONEY, 2002;
BELL et al, 2006).
Não há vacinas disponíveis contra a arterite viral equina no mercado nacional,
e apesar de estudos epidemiológicos demonstrarem uma provável circulação do
agente no país, só haverá registro e comercialização de vacinas após o
reconhecimento oficial da doença pelas autoridades e órgãos oficiais. Nos Estados
Unidos e Canadá, uma vacina atenuada produzida por passagens sucessivas em
cultivo celular está disponível comercialmente, sendo recomendada para minimizar a
difusão do vírus e as perdas econômicas decorrentes da infecção. Vacinas
inativadas também estão comercialmente disponíveis em diversos países europeus
(GAMA, 2013; LIMA &OSÓRIO, 2012).
Um ponto importante em um programa de controle é a identificação do
garanhão persistentemente infectado e a consequente prevenção da entrada do
EAV em populações suscetíveis através da infecção de éguas pela inseminação
artificial ou monta natural. O garanhão que possuir sorologia positiva para o EAV
deve ter seu sêmen testado. A presença do EAV no sêmen deve ser diagnosticada
através de exames laboratoriais como o isolamento viral ou RT-PCR. Os garanhões
positivos para o EAV podem ser usados na reprodução, porém devem ser
manejados isoladamente dos outros cavalos e só devem se reproduzir com éguas
soropositivas ou previamente vacinadas contra o EAV (GLASER et al, 1997; BELL et
al, 2006).
A transferência de embriões também deve ser considerada como uma fonte
de infecção em potencial. O EAV está presente nas secreções do trato reprodutivo
de éguas infectadas, e essas secreções estão em contato intimo com o embrião até
a realização de sua coleta cerca de sete dias após a inseminação. Alguns protocolos
42
de desinfecção embrionária contra diversos micro-organismos têm sido testados
para a desinfecção do EAV, porém ainda não há confirmação da sua eficácia
(TIMONEY, 2002; BROADDUS et al, 2011).
43
4. OBJETIVO GERAL
Estudar a ocorrência da sororeatividade contra o herpesvírus equino tipo 1
(EHV-1) e o vírus da arterite equina (EAV) em equinos distribuídos em diferentes
regiões do estado do Rio de Janeiro.
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Investigar a ocorrência de anticorpos específicos contra o herpesvírus
equino-1 pela técnica de soroneutralização em equinos não vacinados provenientes
das regiões Metropolitana e Serrana do estado do Rio de Janeiro;
- Investigar a ocorrência de anticorpos específicos contra o vírus da arterite
equina pela técnica de soroneutralização em equinos não vacinados provenientes
das regiões Metropolitana e Serrana do estado do Rio de Janeiro;
- Avaliar a soroconversão em animais imunizados a campo com uma vacina
comercial contendo antígenos do herpesvírus equino.
44
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Animais
Seiscentos e trinta amostras de soro foram analisadas. Um total de 625
amostras foram provenientes de fêmeas equinas utilizadas em manejo reprodutivo
nas categorias de doadoras, matrizes e receptoras de embriões e cinco amostras
foram oriundas de potros lactentes não-vacinados pertencentes ao rebanho com
animais vacinados contra a rinopneumonite equina. Estes potros foram avaliados
somente para a presença ou não de anticorpos específicos contra o EAV.
Os animais não possuíam histórico recente ou sinais clínicos compatíveis com
doença respiratória. Algumas éguas distribuídas nos diferentes rebanhos possuíam
histórico de abortamento prévio, porém sem indícios de surtos abortivos nas
propriedades. Nenhum dos animais tinha histórico prévio de vacinação contra o
EAV.
Foram obtidas 581 amostras de soro provenientes de éguas não-vacinadas
contra o EAV e o EHV-1 distribuídas em 13 propriedades nos municípios de
Seropédica, Paracambi, Japeri, Queimados, Itaboraí, Cachoeiras de Macacu, Três
Rios, Friburgo e São Sebastião do Alto no estado do Rio de Janeiro. Além disto,
foram ainda coletadas 49 amostras de soro provenientes de uma propriedade com
vacinação anual contra rinopneumonite equina, na cidade de Teresópolis,
totalizando 630 amostras (Tabela 01).
Todos os animais selecionados para este estudo pertenciam a plantéis de
reprodução equina, com assistência veterinária e acompanhamento reprodutivo
individual.
45
Tabela 01. Relação dos municípios e distribuição das propriedades com o respectivo
número de animais utilizados no estudo. Todos os municípios são pertencentes ao estado
do Rio de Janeiro.
Município
Nº propriedades
Nº animais
Cachoeiras de Macacu
01
98
Nova Friburgo
01
02
Itaboraí
01
55
Japeri
01
07
Paracambi
01
46
Queimados
01
27
São Sebastião do Alto
03
122
Seropédica
03
115
Teresópolis
01
49
Três Rios
01
109
13
630
TOTAL
O cálculo da amostra utilizou os seguintes parâmetros: N= 114.778
(população equina do estado do Rio de Janeiro em 2011 segundo dados do IBGE),
com uma prevalência estimada de 26% (CUNHA, 2009); nível de confiança de 0,95
e margem de erro de 5%. O n total de amostras exigido foi de 295 amostras. O total
obtido para esse estudo foi de 630 amostras, sendo representativo da população
equina do estado do Rio de Janeiro.
Para uma análise mais detalhada, os resultados foram agrupados em três
categorias, considerando como títulos baixos os resultados entre dois e 16, títulos
médios entre 32 e 128 e como títulos altos aqueles superiores ou iguais a 256. Esta
classificação teve como base os estudos de Goehring et al ( 2010) e Goodman et al
(2012).
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da UFF, sob número de registro 185/12, em 17 de maio de 2012 (Anexo
10.2).
46
5.2 Amostras para sorologia
Amostras de sangue foram coletadas para a pesquisa de anticorpos
específicos contra o EHV-1 e contra o EAV de um total de 630 equinos. Destas, 581
amostras foram oriundas de animais não-vacinados e 49 provenientes de uma
propriedade com animais submetidos a imunização anual contra a rinopneumonite
equina. O sangue total foi coletado através de venopunção jugular em tubos estéreis
sem anticoagulante (BD Vacutainer®), e após a retração do coágulo o soro
sanguíneo foi separado e armazenado em tubos de microcentrífuga estéreis. Todas
as
amostras
de
soro
foram
devidamente
identificadas
e
posteriormente
armazenadas à -20 ºC até a sua avaliação.
As amostras de soro foram coletadas de equinos distribuídos em dez
municípios do estado do Rio de Janeiro localizados principalmente na região
metropolitana e serrana do RJ (Figura 03).
Figura 03. Mapa político do estado do Rio de Janeiro com a identificação dos respectivos
municípios (área preenchida em cor preta) de onde foram coletadas as amostras de soro
equino.
47
A escolha das propriedades foi consequente à disponibilidade dos
proprietários e veterinários (amostra por conveniência). A relação dos diferentes
municípios e a distribuição das propriedades com o respectivo número de animais
está apresentada na Tabela 01. Não foi possível classificar os animais de acordo
com a faixa etária, pois os produtores não dispuseram da documentação dos
mesmos, já que a maioria das amostras foi proveniente de éguas receptoras, onde o
controle é menor.
Uma planilha com os dados referentes à identificação dos animais, raça, data
de coleta, localidade, função reprodutiva e observações sobre disfunções
reprodutivas foi devidamente preenchida para controle e análise posterior (Apêndice
10.1).
5.3 Células e vírus
As cepas padrão dos vírus da arterite viral equina (EAV) e herpesvírus equino
tipo 1 (EHV-1) foram gentilmente cedidas pelo prof. Dr. Luiz Carlos Kreutz,
Universidade de Passo Fundo (UPF), RS. Para a realização dos testes de
soroneutralização foram utilizadas células da linhagem RK13 (rabbit kidney),
cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB).
5.4 Diagnóstico sorológico
Todas as amostras de soro foram submetidas à técnica de soroneutralização
(SN) para a pesquisa de anticorpos específicos. Brevemente, diferentes diluições na
base dois das amostras de soro (1:2 – 1: 256) foram testadas em microplacas de
48
poliestireno de 96 cavidades frente a uma dose constante (100-200 DICC50) de uma
cepa viral padrão previamente conhecida. Após um período de incubação de 1h em
estufa de CO2 a 37 °C, foi adicionada uma suspensão de células da linhagem RK13.
As placas, contendo a mistura soro-vírus-células, foram então incubadas a 37ºC em
atmosfera com 5% de CO2 por 48 a 96 h. Soros de coelhos experimentalmente
infectados com o EHV ou EAV foram gentilmente cedidos pelo professor Luiz Carlos
Kreutz, UPF-RS e usados como controles positivos. O monitoramento foi realizado
diariamente em um microscópio ótico invertido. O título de anticorpos presente na
amostra é dado pela recíproca da diluição do soro capaz de prevenir a produção do
efeito citopático (ECP) característico de cada um dos vírus na monocamada de
células.
49
6. RESULTADOS
Os resultados dos testes de soroneutralização demonstraram que 29,6%
(172/581) das amostras analisadas apresentaram resultado positivo para a presença
de anticorpos específicos contra o herpesvírus equino e 0,79% (05/630) de animais
soro-reagentes frente ao vírus da arterite equina (EAV) (Tabela 02).
Tabela 02. Total de animais não vacinados e reagentes no teste de soroneutralização frente
ao herpesvírus equino (EHV) e vírus da arterite equina (EAV)
EHV-1 (%)
EAV (%)
NEGATIVO 1
401 (69,01)
615 (97,63)
POSITIVO 2
172 (29,60)
5 (0,79)
8 (1,39)
10 (1,58)
581 *
630
TÓXICO
3
TOTAL
* Animais imunizados contra o EHV foram desconsiderados
1
título < 2
2
presença de anticorpos neutralizantes
3
efeito tóxico do soro impediu a interpretação do resultado final do teste
Animais reagentes ao EHV foram detectados em praticamente todas as
propriedades analisadas, porém os maiores percentuais foram observados em
rebanhos localizados nos municípios de São Sebastião do Alto (53%) e Seropédica
(32%) (Tabela 03).
50
Tabela 03. Resultados dos testes de soroneutralização para o herpesvírus equino tipo-1 em
amostras provenientes de animais não vacinados contra a rinopneumonite equina oriundos
de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro
MUNICÍPIO
REAGENTES
Cachoeiras de Macacu
NÃO REAGENTES
TOTAL
26
67
93
Nova Friburgo
0
02
02
Itaboraí
22
33
55
Japeri
05
02
07
Paracambi
07
39
46
Queimados
08
19
27
53
66
119
Seropédica
32
83
115
Três Rios
19
90
109
São Sebastião do Alto
TOTAL (%)
172 (30,02%)
401 (69,98%)
573*
*Soros tóxicos (n = 8) não foram considerados
Os títulos de anticorpos contra o EHV nos animais não vacinados variaram
entre 2 e ≥ 256, como demonstrado na Figura 04.
50
46
46
45
38
Número de animais
40
35
30
25
20
10
15
10
9
9
6
8
5
0
2
4
8
16
32
64
128
>256
Titulo de anticorpos neutralizantes
Figura 04:Variação nos títulos de anticorpos neutralizantes contra o EHV-1 em animais nãovacinados contra a rinopneumonite equina e oriundos de diferentes municípios do Estado
do Rio de Janeiro. O título de anticorpos (eixo Y) é dado pela recíproca da diluição (base 2)
do soro capaz de prevenir a produção de ECP na monocamada de células.
51
Das 172 amostras reagentes ao EHV, foi observada uma predominância de
títulos mais baixos correspondendo a 79,07% do total das amostras analisadas.
Outros 15,70 % foram pertencentes a títulos medianos e 5,23 % foram classificados
como títulos superiores ou iguais a 256 (recíproca da maior diluição do soro utilizada
no presente estudo).
Na avaliação da resposta vacinal dos 44 animais analisados no presente
estudo, foi observado que os títulos de anticorpos neutralizantes específicos contra o
EHV variaram de 4 até ≥ 256 (Figura 05).
Número de animais
25
22
20
15
10
8
2
5
0
2
3
2
1
1
0
<2
2
4
8
16
32
64
128
>256
Titulos de anticorpos anti-EHV-1
Figura 05: Número de animais soropositivos com o respectivo título de anticorpos
neutralizantes específicos contra o EHV-1 provenientes de um grupo de 44 éguas vacinadas
contra a rinopneumonite equina. Foram considerados soronegativos todos as amostras com
títulos de anticorpos inferiores a 2.* Soros tóxicos (n=3) foram desconsiderados
Os resultados desta avaliação demonstraram ainda que 53,65% das amostras
(22/41) foram consideradas negativas no teste de SN, ou seja, os títulos de
anticorpos foram inferiores a 2 (limite de detecção da prova sorológica).
Os animais soro-reagentes ao EAV foram pertencentes ao município de
Teresópolis (duas amostras do plantel de éguas vacinadas para o EHV-1), Três
Rios, Japeri e Cachoeiras de Macacu (Tabela 04).
52
Tabela 04: Resultados dos testes de soroneutralização para o vírus da arterite equina (EAV)
em amostras provenientes de animais não vacinados oriundos de diferentes municípios do
estado do Rio de Janeiro.
Município
Reagentes
Não reagentes
Total
Cachoeiras de Macacu
1
91
92
Nova Friburgo
0
02
02
Itaboraí
0
55
55
Japeri
1
06
07
Paracambi
0
46
46
Queimados
0
27
27
São Sebastião do Alto
0
121
121
Seropédica
0
115
115
Teresópolis
2
44
46
Três Rios
1
108
109
TOTAL (%)
05 (0,79)
617 (98)
620
*Soros tóxicos (n = 10) não foram considerados.
Títulos altos de anticorpos neutralizantes (1.024 e 4.096) específicos contra o
EAV foram detectados em dois animais provenientes de um rebanho equino do
município de Teresópolis (Tabela 05).
TABELA 05: Procedência das amostras de soro equino consideradas positivas no teste de
soroneutralização com os respectivos títulos de anticorpos contra o EAV.
Identificação
Título neutralizante
Município - RJ
Animal n°1
2
Cachoeiras de Macacu
Animal n°2
4
Três Rios
Animaln°3
4
Japeri
Animaln°4
1024
Teresópolis
Animaln°5
4096
Teresópolis
53
7. DISCUSSÃO
Os testes de soroneutralização demonstraram que 29,6% (172/581) das
amostras analisadas apresentaram resultado positivo para a presença de anticorpos
específicos contra o herpesvírus equino (EHV). Por outro lado, apenas 0,79%
(5/630) apresentaram resultado positivo no teste de SN frente ao vírus da arterite
equina (EAV). Neste caso, é importante ressaltar que os resultados positivos
observados indicam uma exposição prévia destes animais aos vírus em questão,
tendo em vista que todas as amostras foram provenientes de animais sem histórico
de vacinação contra estes agentes. Entretanto, a simples presença de anticorpos
neutralizantes específicos em uma amostra clínica não pode ser relacionada com
infecção recente ou sinais clínicos compatíveis com a infecção (FLORES, 2012). O
diagnóstico confirmatório poderia, eventualmente, ser realizado por sorologia
pareada seguida da observação de um aumento de pelo menos quatro vezes nos
títulos de anticorpos neutralizantes.
Estudos sorológicos prévios já demonstraram a ampla distribuição do
herpesvírus equino no Brasil, com percentuais de soropositividade variando desde
4,5% (67/1.506) no Rio Grande do Sul (DIEL et al, 2006) até 45,45% (230/506) no
Pará (PENA et al, 2006). O percentual de animais soropositivos para o EHV neste
estudo (29,6%) foi semelhante aos resultados observados em São Paulo de 26 e
27,2% (CUNHA et al, 2009; 2002) e 33,4% (LARA et al, 2003).
A presença de anticorpos específicos contra o herpesvírus equino em animais
vacinados tem importância epidemiológica tendo em vista o estabelecimento de
infecções latentes após infecção primária. Apesar de a doença aguda se resolver em
poucas semanas após a infecção primária, é comum haver uma infecção persistente
caracterizada pela latência seguida de episódios de reativações com recrudescência
clínica e excreção viral. Animais latentemente infectados são portadores
assintomáticos capazes de eliminar o vírus em grandes concentrações após
situações de estresse, caracterizando um importante mecanismo de disseminação
da infecção dentro dos rebanhos (PATEL & HELDENS, 2005; PENA et al, 2006). A
infecção primária com o EHV-1 normalmente resulta numa resposta imunológica
54
capaz de proteger o animal contra reinfecções por quatro a oito meses, embora
alguns relatos tenham demonstrado períodos inferiores a três meses (PAILLOT et al,
2008).
Apesar de quase todos os rebanhos apresentarem animais reagentes ao
EHV-1, somente em quatro deles havia histórico prévio de abortamentos (totalizando
12 animais). O baixo índice de abortamentos nestes rebanhos pode ser atribuído à
ocorrência de infecções subclínicas ou com sinais clínicos leves. Reações cruzadas
com o EHV-4, que não possui característica abortigênica são muito comuns e devem
ainda ser consideradas. Nenhuma dessas 12 éguas apresentou sorologia positiva
contra o EAV; porém em duas éguas receptoras pertencentes ao mesmo rebanho foi
detectada a presença de anticorpos específicos contra o EHV (título de 8). A
presença de sorologia positiva nesses animais poderia sugerir uma possível
associação do EHV-1 com os episódios de abortamentos. Entretanto, o diagnóstico
definitivo somente seria possível após a realização da sorologia pareada para avaliar
o aumento dos títulos de anticorpos específicos contra o EHV, ou ainda pelo
isolamento viral a partir de secreções ou do aborto.
Outro aspecto investigado no presente trabalho foi a avaliação de 44
amostras de soro provenientes de éguas vacinadas contra a rinopneumonite equina
durante a prenhez. O protocolo vacinal utilizado pelo veterinário responsável
consistiu na administração de uma vacina inativada comercialmente disponível no
mercado nacional (Pneumabort K® - Fort Dodge) pela via intramuscular no 5º, 7º e 9º
mês de gestação, conforme recomendações do fabricante.
A análise crítica destes dados é de fundamental importância, pois fornece aos
veterinários informações relevantes em relação às taxas de soro-conversão no
rebanho e dos níveis de anticorpos induzidos após imunização sendo, deste modo,
um bom indicativo da eficácia vacinal. Níveis moderados ou até mesmo
relativamente altos de anticorpos neutralizantes são geralmente induzidos pelas
vacinas inativadas disponíveis no mercado para proteção contra o aborto equino.
Isto pode ser atribuído, embora que parcialmente, a uma maior carga antigênica nas
preparações vacinais além da associação dos antígenos com potentes adjuvantes.
Porém, as vacinas inativadas estão geralmente associadas a indução de uma
resposta imune celular pouco efetiva e que é de fundamental importância na
proteção clínica contra o EHV-1 (ROSAS et al, 2006).
55
As vacinas utilizadas na profilaxia e controle das infecções pelo EHV devem
proteger os animais da infecção viral, do desenvolvimento de doença respiratória e
da subsequente disseminação viral pela nasofaringe. A vacinação deve ainda
prevenir a disseminação sistêmica pela viremia associada a células, e limitar a
reativação viral, evitando quadros neurológicos e de abortamentos (PAILLOT et al,
2008). Considerando estes aspectos, é evidente que se faz necessário uma
resposta imune efetiva com estimulação tanto da resposta celular e humoral. Altos
títulos de anticorpos neutralizantes reduzem a infecção epitelial e a disseminação
viral através da neutralização de partículas virais extracelulares. Porém, a resposta
imune celular é essencial na estimulação de células e moléculas que possuem a
capacidade de interferir com etapas intracelulares do ciclo de replicação viral
(PAILLOT et al, 2008).
Anticorpos neutralizantes têm sido correlacionados com proteção contra
alguns sinais clínicos da doença e do tempo de viremia em infecções experimentais
ou testes de eficácia vacinal (GOODMAN et al, 2012; GOEHRING et al, 2010). Tais
anticorpos são direcionados contra as glicoproteínas do envelope viral, reduzindo a
disseminação viral quando os vírions são liberados de células infectadas. Estudos
recentes indicam ainda que os anticorpos neutralizantes parecem ser mais eficientes
na fase inicial da infecção onde ocorre intensa replicação viral no epitélio respiratório
(GOODMAN et al, 2012).
Neste estudo foi observado que 53,65% das amostras oriundas de animais
vacinados (22/41) foram consideradas negativas no teste de SN, ou seja, os títulos
de anticorpos foram inferiores a 2 (limite de detecção da prova sorológica). Estes
dados são relevantes e devem ser analisados criteriosamente, pois demonstram,
inicialmente, uma incapacidade dos imunógenos em induzir anticorpos específicos
nos animais após o protocolo de vacinação recomendado pelo fabricante. Esta
parcela significativa de equinos vacinados contra a rinopneumonite equina e com
títulos baixos ou indetectáveis de anticorpos neutralizantes, mesmo após três
imunizações consecutivas, tem sido frequentemente observada na rotina do
diagnóstico laboratorial (Dr. Marcelo de Lima, comunicação pessoal).
Embora já tenha sido demonstrada a importância da imunidade celular na
proteção contra herpesvírus, a indução de anticorpos específicos tem sido
considerada um bom parâmetro para avaliação da resposta vacinal (ALLEN, 1995).
56
Segundo Goehring et al (2010), apenas a detecção de um aumento na frequência do
precursor de LTC MHC I poderia predizer uma proteção contra as consequências
mais graves da infecção pelo EHV-1, como a EHM e o abortamento. Porém, a
quantificação desse precursor é extremamente laboriosa e possui um custo
impraticável para uso em grandes experimentos. Por este motivo, as comparações
entre imunógenos e avaliações de eficácia vacinal são frequentemente dependentes
da mensuração de anticorpos.
Resultados similares aos observados no presente estudo foram descritos em
um estudo de campo na Austrália onde foi avaliada a soroconversão de 159 éguas e
101 potros após imunização com uma vacina contendo antígenos inativados do
EHV-1 (Duvaxyn®, Fort Dodge). Mesmo seguindo criteriosamente as orientações do
fabricante, os autores demonstraram que menos de 30% das éguas e menos de
50% dos potros responderam à vacinação (FOOTE et al, 2002).
Considerando que somente a resposta humoral possui correlação limitada
com proteção clínica contra o EHV aliado ao fato de que 50% dos animais
imunizados não possuíam títulos detectáveis de anticorpos neutralizantes, os dados
do presente estudo sugerem que, pelo menos neste caso específico, a vacinação
pode resultar em uma falsa sensação de proteção para o rebanho. Estudos
envolvendo um número maior de animais e diferentes imunógenos contendo
antígenos do EHV devem ser conduzidos no sentido de comprovar tais observações.
Em relação ao vírus da arterite viral equina (EAV), o percentual de animais
soropositivos nesse estudo (0,79%) foi muito similar ao encontrado por Bello et al
(2007) em MG (0,85%), e inferior aos 2,2% detectados no RS por Diel et al (2006) e
dos 18,2% e 5,7% em São Paulo (LARA et al, 2002; BRAGA et al, 2012). Esses
índices superiores de animais soropositivos encontrados em SP pode ser um reflexo
da grande movimentação de animais importados nesse estado, que é o maior
criador e importador da raça Quarto de Milha no Brasil, além da importação de
animais de salto e provas hípicas. No Rio Grande do Sul, a proximidade da fronteira
com outros países, particularmente com a Argentina, poderia facilitar a entrada e/ou
trânsito de animais infectados sem um maior controle da fiscalização. Minas Gerais
e Rio de Janeiro têm como maioria no seu plantel de equinos as raças nacionais
Mangalarga Marchador e o Campolina, diminuindo as possibilidades de entrada do
EAV nos rebanhos pela importação de sêmen ou de animais vivos.
57
As éguas eliminam o vírus naturalmente após uma infecção aguda e
desenvolvem uma resposta imune efetiva na proteção contra reinfecções (HOSTNIK
et al, 2011).
No presente estudo, foram observados títulos de anticorpos
neutralizantes relativamente baixos (entre 2 e 4) em três das cinco amostras
positivas de soro testadas (Tabela 05) sugerindo uma provável infecção prévia pelo
EAV antes do ingresso destes animais nas respectivas propriedades. No estudo
realizado por Lara et al. (2002), os títulos de anticorpos detectados em animais não
vacinados variaram entre 4 e 256.
No caso do animal de número 2, que apresentou títulos neutralizantes igual a
4, trata-sede uma égua doadora de embriões, e o contato com o EAV pode ter
ocorrido por transmissão venérea através de inseminação artificial com sêmen
contaminado.
Como normalmente éguas dessa categoria são criadas em baias separadas e
dificilmente têm contato direto com o garanhão, é possível a ocorrência de uma
infecção subclínica que normalmente é observada na grande maioria dos casos. Os
animais de número 1 e de número 3 são éguas receptoras de embrião, e que não
apresentaram histórico de abortamentos ou sinais clínicos compatíveis com arterite
viral equina. Destes três animais, somente a égua de número 3 apresentou sorologia
positiva também para o herpesvírus equino (titulo de 8).
Títulos relativamente altos de anticorpos neutralizantes (≥ 512) são
geralmente induzidos em animais experimentalmente infectados com cepas do EAV
(MACLACHLAN et al, 1998) ou imunizados com vacinas atenuadas (SUMMERSLAWYER et al, 2011). Neste sentido, os resultados observados referentes às duas
éguas soropositivas da região de Teresópolis merecem atenção especial pelos
títulos elevados de anticorpos detectados (1024 e 4096). Estes altos níveis de
anticorpos são sugestivos de uma infecção recente pela estimulação imunológica
devido a replicação viral.
A égua nº 04 não pertencia à propriedade onde foi coletada a amostra,
estando hospedada no local durante a estação reprodutiva até a confirmação de sua
prenhez, o que levou cerca de três meses, quando a mesma retornou à sua
propriedade de origem, próximo ao local de coleta. Não se obteve maiores
informações acerca do histórico dessa égua ou de outros animais dessa
58
propriedade, sendo interessante uma avaliação sorológica do plantel para maiores
esclarecimentos acerca da circulação do EAV neste local.
A égua n°05 foi importada da Europa para o estado de São Paulo e
posteriormente transferida para o RJ cerca de três meses antes da coleta da
amostra de soro utilizada neste estudo. Há a possibilidade de que a referida égua
tenha sido vacinada em seu país de origem na Europa, porém é pouco provável a
manutenção destes títulos elevados por um período prolongado de tempo. Por outro
lado, infecções prévias (e não recentes) não podem ser descartadas pelo fato de
que animais infectados naturalmente pelo EAV desenvolvem anticorpos específicos
que permanecem detectáveis por vários anos. Infecções persistentes são bem
documentadas em garanhões (TIMONEY, 2002) e poderiam justificar, embora que
parcialmente, a indução de títulos altos de anticorpos pela re-estimulação constante
do sistema imunológico devido a replicação viral.
Ambas as éguas com títulos altos de anticorpos contra o EAV conviveram
com outros animais da propriedade, e não houve relatos de quadros clínicos
respiratórios ou abortivos desde a época da coleta até o presente momento. Estes
dados são consistentes com o fato de que o estado de portador ainda não foi
identificado em fêmeas equinas (TIMONEY, 2002).
A égua nº 05 foi inseminada com sêmen congelado e importado de um
garanhão de alto valor zootécnico, negativo para EAV, e que tem seu sêmen
monitorado constantemente. Outra égua da propriedade também foi inseminada com
o mesmo sêmen e não apresentou títulos anti-EAV no teste de SN (dados não
mostrados). O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem
como uma das exigências para a importação de sêmen um atestado sorológico
negativo contra o EAV.
É importante salientar que as éguas n°04 e n°05 foram inseminadas com
sêmens distintos, não tiveram contato direto e foram separadas em lotes diferentes.
Diante dos dados disponíveis, não foi possível identificar a causa precisa desses
altos títulos encontrados nessas éguas. Cabe ainda destacar que não foi possível
uma avaliação do histórico das éguas antes de seu ingresso nas propriedades,
dificultando uma investigação epidemiológica mais detalhada em relação a provável
origem da infecção destes animais pelo EAV.
59
Apesar do baixo percentual de animais positivos no teste de SN contra o EAV,
fica demonstrada a ocorrência do agente no estado do Rio de Janeiro, já que a
presença de anticorpos específicos em animais não vacinados é um indicativo de
exposição prévia ao agente. Considerando que a apresentação assintomática da
infecção pelo EAV é relativamente comum, medidas de profilaxia e controle devem
ser tomadas a fim de se evitar a disseminação viral e o surgimento de surtos da
enfermidade no estado do Rio de Janeiro e em nível nacional.
O presente trabalho representa a primeira investigação da ocorrência de sororeatividade perante o herpesvírus equino (EHV) e o vírus da arterite equina (EAV)
pela detecção de anticorpos neutralizantes em tropas de equinos não vacinados
distribuídos em diferentes regiões do estado do Rio de Janeiro.
60
8. CONCLUSÕES
- Animais reagentes ao EHV foram detectados em grande escala, e em
praticamente todos os rebanhos analisados, porém os maiores percentuais foram
observados em rebanhos localizados nos municípios de São Sebastião do Alto
(53%) e Seropédica (32%);
- A presença de anticorpos específicos em animais não imunizados indica
exposição prévia ao EHV e EAV demonstrando a possibilidade da circulação destes
agentes em rebanhos equinos do estado do RJ;
- É baixa a ocorrência da sororreatividade perante o vírus da arterite equina,
no entanto foram verificados pela primeira vez no estado do RJ;
- Após imunização com vacina comercial de vírus inativado verificou-se baixa
soroconversão, indicando possíveis limitações no uso desta vacina.
61
9. OBRAS CITADAS
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71
10. APÊNDICES E ANEXOS
.
10.1 Planilha de coleta de dados dos animais utilizados nas amostras
OBS
PRENHEZ
FUNÇÃO
LOCALIDADE
DATA COLETA
RAÇA
IDENTIFICAÇÃO
Nº ANIMAL
10.2 Autorização do Comitê de Ética (CEUA) - UFF.