Seleção de genes referência para RT

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55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
154
Seleção de genes referência para RT-PCRq durante o
desenvolvimento da musculatura esquelética de galinhas
Ninov, K1; Mourão, GB1; Andreote, APD1; Jorge, EC1; Villela, PMS1; Ledur, MC2; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia - ESALQ/USP, Piracicaba, SP - Brasil. 2Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC - Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Normalização, Genes referência, PCR quantitativa em tempo real, Desenvolvimento muscular, Genética animal
O sucesso na aplicação da técnica de RT-PCR quantitativa está na normalização adequada dos dados mensurados.
Logo, atenção especial deve ser dada a aspectos como: utilização da mesma quantidade inicial de amostra,
padronização da síntese de cDNA, escolha do gene de referência e do modelo matemático para a análise dos dados.
Os genes referência, ou normalizadores, são genes constitutivos também conhecidos como housekeeping, ou seja,
genes responsáveis por funções essenciais para a manutenção do funcionamento celular. Um gene referência ideal
deve ter expressão constante nos diversos estádios de desenvolvimento, em diferentes tipos celulares e em condições
fisiológicas distintas. No entanto, vários estudos utilizam genes referência sem prévia validação da estabilidade de
sua expressão, o que pode levar a interpretações errôneas dos resultados obtidos. No presente estudo, foi investigada
a estabilidade da expressão de cinco genes referência potenciais: EEF1 (Eukaryotic translation elongation factor 1,
alpha 1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), MRPS27 (Mitochondrial ribosomal protein S7), RPL5
(Ribosomal protein 5) e ß-actina na musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas
distintas: uma de corte (TT) e outra de postura (CC), desenvolvidas pela Embrapa Suínos e Aves. Foi avaliado
um total de 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase
embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. Neste estudo empregou-se a técnica de RT-PCRq em tempo real
e os resultados da expressão gênica foram gerados e registrados como valores de Cp (Crossing point). Os valores
de Cp de cada gene foram analisados pelo programa Bestkeeper para auxiliar na escolha dos pares de genes ideais.
O programa Bestkeeper detectou altas correlações entre os pares MRPS27-RPL5 (0,903), ß-actina-RPL5 (0,875),
ß-actina-MRPS27 (0,809) e GAPDH-RPL5 (0,701), que são indicativos da aplicabilidade da média geométrica destes
pares como fator de normalização. Adicionalmente, testaram-se os genes isolados e as médias geométricas das
combinações utilizando-se análises de variância, que incluíram os efeitos fixos de idade, linhagem e interação
idade x linhagem. Houve efeito significativo (P<0,05) da idade sobre os valores de Cp para todos os genes testados
individualmente e para as combinações das médias geométricas. Houve efeito significativo (P<0,05) da interação
para o gene GAPDH e MRPS27 e para as combinações das médias geométricas de MRPS27-RPL5 e ß-actinaMRPS27. Os resultados da análise de variância dos genes individuais ou agrupados pelo programa Bestekeeper são
demonstrativos de que esses genes e a técnica utilizada pelo programa têm limitações quanto a sua aplicabilidade
na normalização de dados da expressão relativa, pois no presente estudo apresentaram variação tanto entre
linhagens quanto entre idades. Com base nesses resultados, outras metodologias para a seleção e utilização de
genes referência deverão ser testadas.
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