55º Congresso Brasileiro de Genética Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009 Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2 154 Seleção de genes referência para RT-PCRq durante o desenvolvimento da musculatura esquelética de galinhas Ninov, K1; Mourão, GB1; Andreote, APD1; Jorge, EC1; Villela, PMS1; Ledur, MC2; Coutinho, LL1 Departamento de Zootecnia - ESALQ/USP, Piracicaba, SP - Brasil. 2Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC - Brasil. [email protected] 1 Palavras-chave: Normalização, Genes referência, PCR quantitativa em tempo real, Desenvolvimento muscular, Genética animal O sucesso na aplicação da técnica de RT-PCR quantitativa está na normalização adequada dos dados mensurados. Logo, atenção especial deve ser dada a aspectos como: utilização da mesma quantidade inicial de amostra, padronização da síntese de cDNA, escolha do gene de referência e do modelo matemático para a análise dos dados. Os genes referência, ou normalizadores, são genes constitutivos também conhecidos como housekeeping, ou seja, genes responsáveis por funções essenciais para a manutenção do funcionamento celular. Um gene referência ideal deve ter expressão constante nos diversos estádios de desenvolvimento, em diferentes tipos celulares e em condições fisiológicas distintas. No entanto, vários estudos utilizam genes referência sem prévia validação da estabilidade de sua expressão, o que pode levar a interpretações errôneas dos resultados obtidos. No presente estudo, foi investigada a estabilidade da expressão de cinco genes referência potenciais: EEF1 (Eukaryotic translation elongation factor 1, alpha 1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), MRPS27 (Mitochondrial ribosomal protein S7), RPL5 (Ribosomal protein 5) e ß-actina na musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas distintas: uma de corte (TT) e outra de postura (CC), desenvolvidas pela Embrapa Suínos e Aves. Foi avaliado um total de 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. Neste estudo empregou-se a técnica de RT-PCRq em tempo real e os resultados da expressão gênica foram gerados e registrados como valores de Cp (Crossing point). Os valores de Cp de cada gene foram analisados pelo programa Bestkeeper para auxiliar na escolha dos pares de genes ideais. O programa Bestkeeper detectou altas correlações entre os pares MRPS27-RPL5 (0,903), ß-actina-RPL5 (0,875), ß-actina-MRPS27 (0,809) e GAPDH-RPL5 (0,701), que são indicativos da aplicabilidade da média geométrica destes pares como fator de normalização. Adicionalmente, testaram-se os genes isolados e as médias geométricas das combinações utilizando-se análises de variância, que incluíram os efeitos fixos de idade, linhagem e interação idade x linhagem. Houve efeito significativo (P<0,05) da idade sobre os valores de Cp para todos os genes testados individualmente e para as combinações das médias geométricas. Houve efeito significativo (P<0,05) da interação para o gene GAPDH e MRPS27 e para as combinações das médias geométricas de MRPS27-RPL5 e ß-actinaMRPS27. Os resultados da análise de variância dos genes individuais ou agrupados pelo programa Bestekeeper são demonstrativos de que esses genes e a técnica utilizada pelo programa têm limitações quanto a sua aplicabilidade na normalização de dados da expressão relativa, pois no presente estudo apresentaram variação tanto entre linhagens quanto entre idades. Com base nesses resultados, outras metodologias para a seleção e utilização de genes referência deverão ser testadas. Apoio Financeiro: CAPES