i PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS
SELEÇÃO DE ÁRVORES MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. PARA
PRODUÇÃO DE SEMENTES
FERNANDO DOS SANTOS ARAÚJO
MACAÍBA-RN, DEZEMBRO DE 2014
i
FERNANDO DOS SANTOS ARAÚJO
SELEÇÃO DE ÁRVORES MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. PARA
PRODUÇÃO DE SEMENTES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como pré-requisito para obtenção do
título de Mestre em Ciências Florestais.
Orientador:
Prof. Dr. Mauro Vasconcelos Pacheco
Coorientadores:
Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira
Drª. Cibele dos Santos Ferrari
MACAÍBA-RN, DEZEMBRO DE 2014
ii
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte.
Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba
Biblioteca Setorial Professor Rodolfo Helinski
Araújo, Fernando dos Santos.
Seleção de árvores matrizes de Mimosa caesalpiniaefolia Benth. para produção
de sementes /Fernando dos Santos Araújo. - Macaíba, RN, 2014.
47 f. : Il
Orientador (a): Prof. Dr. Mauro Vasconcelos Pacheco.
Co-orientadores: Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira.
Profa. Cibele dos Santos Ferrari.
Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais). Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba.
Programa de Pós- Graduação em Ciências Florestais.
1. Sementes Florestais - Dissertação. 2. Marcador Molecular - Dissertação.
3. Qualidade de Semente - Dissertação. 4. Reflorestamento - Dissertação. 5. Diversidade
Genética - Dissertação. I. Pacheco, Mauro Vasconcelos. II. Vieira, Fábio de Almeida.
III. Ferrari, Cibele dos Santos. IV. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
V. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba. VI. Título.
RN/UFRN/BSPRH
CDU: 631.528.2
iii
SELEÇÃO DE ÁRVORES MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. PARA
PRODUÇÃO DE SEMENTES
Fernando dos Santos Araújo
Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais, Área
de Concentração em Manejo e Utilização dos Recursos Florestais, e aprovada em sua
forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais da Unidade Acadêmica
Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio Grande do Norte em 16
de dezembro de 2014.
Coordenação do PPGCFL
________________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Santos Pimenta (UAECIA/UFRN)
Coordenador do PPGCFL
Banca examinadora
________________________________________________
Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira (UAECIA/UFRN)
Presidente
________________________________________________
Prof. Dr. Márcio Dias Pereira (UAECIA/UFRN)
Examinador interno
________________________________________________
Profª. Drª. Cristiane Gouvêa Fajardo (UAECIA/UFRN)
Examinador externo ao programa
________________________________________________
Profª. Drª. Clarissa Santos da Silva (Universidade da Região da Campanha - URCAMP)
Examinador externo à instituição
MACAÍBA, RN, DEZEMBRO DE 2014
iv
DEDICATÓRIA
__________________________________________________________________________
Dedico
À minha mãe Maria José dos Santos Araújo, pelo amor e dedicação para que eu
pudesse concretizar meus objetivos pessoais e profissionais e aos meus orientadores e
amigos Mauro Pacheco, Cibele Ferrari e a Prof. Riselane Bruno que acreditaram no meu
potencial para seguir a carreira acadêmica e hoje compartilham este importante momento
comigo.
v
AGRADECIMENTOS
__________________________________________________________________________
Agradeço
Ao senhor Deus por ter me dado sabedoria, sensibilidade e serenidade para
enfrentar os desafios cotidianos, transformando-os em aprendizado para minha vida pessoal
e profissional.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais UAECIA/UFRN pela
oportunidade e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do Norte que em parceria
com a CAPES me concederam bolsa de estudos.
Ao meu orientador Mauro Pacheco pela sua amizade, paciência e confiança em mim
depositada desde o tempo da graduação.
À Cibele Ferrari, uma amiga com quem tenho aprendido muito acerca da pesquisa e
da importância de enxergar as coisas de uma forma positiva, o que contribuiu muito na
elaboração deste trabalho.
Ao professor Fábio Vieira pela dedicação integral na elaboração deste trabalho
juntamente com toda a equipe do Laboratório de Genética e Melhoramento Florestal da
UAECIA/UFRN a quem quero agradecer em especial a Richeliel Albert, Kyvia Pontes,
Rodrigo Ferreira, Daniel Garça, Luciana Pinheiro e Cristiane Fajardo
À equipe do Laboratório de Sementes Florestais da UAECIA/UFRN pelo apoio
técnico no desenvolvimento deste trabalho: Mirella Avelino, Zalenska Negreiros, Heriberto
Junior, Luiz Augusto, Josenilda Aprígio, Priscilla Barros, Francival Cardoso, Sarah Nunes e
Mariana Duarte.
Aos professores que gentilmente aceitaram participar das bancas de qualificação e
de defesa: Dr. Eduardo Luiz Voigt, Dr. Márcio Dias Pereira, Drª. Cristiane Fajardo e Drª.
Clarissa Santos da Silva.
Aos laboratórios de Sementes e Análises de Solo e Vegetal da UAECIA/UFRN pelo
apoio técnico para realização de algumas análises.
Ao professor Dr. Gualter Guenther por ter nos cedido à Área de Experimentação
Florestal da UAECIA/UFRN para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas de turma do PPGCFL pelo companheirismo.
Aos meus amigos e colegas de profissão: Ewerton Torres, Shara Borges, Rafaela
Pereira, Amanda Kelly, Givanildo Zildo, Karialane Belarmino, Izabela Taís, Anderson Rodrigo
pela troca de experiências na área acadêmica.
vi
Aos meus melhores amigos Raul Antunes, Ewerton Torres, Shara Borges e Rafaela
Pereira pela amizade sincera, a Lui Silva pelo companheirismo, amizade, paciência e amor
e a meus pais e irmãos pelo amor familiar e as doces palavras de incentivo e orgulho.
vii
SUMÁRIO
__________________________________________________________________________
APRESENTAÇÃO ................................................................................................................. 1
RESUMO ............................................................................................................................... 3
ABSTRACT ........................................................................................................................... 4
INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 4
CAPÍTULO 1. MARCADORES MOLECULARES ISSR PARA ESTUDO DA DIVERSIDADE
GENÉTICA DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. ............................................................. 8
RESUMO ............................................................................................................................... 9
ABSTRACT ......................................................................................................................... 10
INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 10
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 12
Coleta de material vegetal e extração de DNA..................................................................... 12
Amplificação do DNA com iniciadores de ISSR.................................................................... 12
Número suficiente de locos para estudo da diversidade genética ........................................ 14
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 14
Seleção dos iniciadores de ISSR ......................................................................................... 14
Determinação do número suficiente de locos para estudo da diversidade genética ............. 17
CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 18
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 19
CAPÍTULO 2: DIVERSIDADE GENÉTICA E QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES
DE ÁRVORES MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. ................................... 23
RESUMO ............................................................................................................................. 24
ABSTRACT ......................................................................................................................... 25
INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 25
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 27
Área de estudo e amostragem ............................................................................................. 27
Qualidade fisiológica de sementes das árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia ................ 27
Diversidade genética de árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia e entre suas progênies .. 29
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 31
Qualidade fisiológica de sementes de diferentes árvores matrizes ...................................... 31
Diversidade genética de diferentes árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia e entre suas
progênies ............................................................................................................................. 33
CONCLUSÕES.................................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 35
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................................. 41
viii
LISTA DE FIGURAS
__________________________________________________________________________
CAPÍTULO 1
Figura 1. Valores de correlação de Pearson (r) e estresse de Kruskal (E) em função do
número de locos ISSR utilizados para estimar a diversidade genética de nove indivíduos de
M. caesalpiniaefolia ............................................................................................................. 18
CAPÍTULO 2
Figura 1. Dendrograma UPGMA de distância genética de Nei para um conjunto de nove
árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia. ............................................................................ 40
ix
LISTA DE TABELAS
__________________________________________________________________________
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Iniciadores de ISSR com suas respectivas sequências de nucleotídeos e número
total de locos amplificados ................................................................................................... 15
Tabela 2. Número total de locos, número de locos polimórficos, taxa de polimorfismo e valor
do conteúdo de informação polimórfica (PIC) de sete iniciadores de ISSR em nove
indivíduos de M. caesalpiniaefolia........................................................................................ 16
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Sequência de nucleotídeos de sete iniciadores de ISSR ...................................... 38
Tabela 2. Médias de grau de umidade (GU), germinação (G), emergência (E), índice de
velocidade de emergência (IVE), condutividade elétrica (CE) e lixiviação de K+ (LK+) de
sementes provenientes de nove árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia .......................... 39
Tabela 3. Coeficientes de correlação de Spearman entre os testes de germinação,
condutividade elétrica e lixiviação de K+ com os testes de emergência e índice de velocidade
de emergência em campo ................................................................................................... 39
Tabela 4. Parâmetros de diversidade genética obtida a partir da análise de marcadores ISSR
em nove árvores matrizes e 18 progênies de polinização aberta provenientes de um plantio
de M. caesalpiniaefolia ........................................................................................................ 40
Tabela 5. Matriz de distância genética de Nei de um conjunto de nove árvores matrizes de
M. caesalpiniaefolia ............................................................................................................. 40
x
APRESENTAÇÃO
__________________________________________________________________________
A presente dissertação aborda a seleção de árvores matrizes de Mimosa
caesalpiniaefolia Benth. com vistas à produção de sementes, estando organizada em dois
capítulos apresentados na forma de artigos científicos formatados conforme as normas das
revistas científicas escolhidas para submissão.
O primeiro capítulo corresponde ao artigo “Marcadores moleculares ISSR para
estudo da diversidade genética de Mimosa caesalpiniaefolia Benth.”, preparado para envio à
revista “Ciência Agronômica”. Objetivou-se com este trabalho selecionar iniciadores de ISSR
(Inter sequências simples repetidas) capazes de detectar polimorfismo genético entre
indivíduos de Mimosa caesalpiniaefolia Benth. para o estudo da diversidade genética desta
espécie.
O segundo capítulo intitulado de “Diversidade genética e qualidade fisiológica de
sementes de árvores matrizes de Mimosa caesalpiniaefolia Benth.” foi preparado para envio
à revista “Pesquisa Agropecuária Brasileira” e teve como objetivo avaliar a qualidade
fisiológica das sementes e estimar o nível de diversidade genética de um conjunto de
árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia provenientes de uma área plantada no Estado do
Rio Grande do Norte, Brasil.
1
RESUMO
__________________________________________________________________________
SELEÇÃO DE ÁRVORES MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH. PARA
PRODUÇÃO DE SEMENTES
Plantios florestais com espécies nativas podem ser realizados com o intuito de
reverter o quadro de escassez de produtos florestais e mitigar a degradação ambiental no
bioma Caatinga. Nestes casos, as sementes florestais de boa qualidade constituem-se em
insumos importantes para a formação desses plantios. Assim, objetivou-se com este estudo
avaliar a qualidade fisiológica de sementes e a diversidade genética de diferentes árvores
matrizes de Mimosa caesalpiniaefolia Benth. provenientes de uma área plantada no Estado
do Rio Grande do Norte, Brasil. Dessa área foram amostradas nove árvores matrizes que
tiveram suas sementes avaliadas pelos testes de germinação e vigor e sua diversidade
genética e de suas progênies estimada por meio de marcadores moleculares ISSR (Inter
Sequências Simples Repetidas). Todas as matrizes produziram sementes com elevada taxa
de germinação e emergência, porém foram constatadas diferenças sutis de vigor quando
avaliadas pelos testes de condutividade elétrica e lixiviação de potássio. Os marcadores
ISSR revelaram que existe diversidade genética entre as matrizes e entre suas progênies. A
produção de sementes com alta qualidade fisiológica aliada à existência de diversidade
genética das nove árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia permite que as mesmas sejam
exploradas para produção de sementes, priorizando-se as mais divergentes geneticamente
e que produzem sementes de melhor qualidade.
Palavras-chave: sementes florestais, marcador molecular, qualidade de sementes,
reflorestamento, diversidade genética.
2
ABSTRACT
__________________________________________________________________________
SELECTION OF MAIN TREES OF Mimosa caesalpiniaefolia Benth. FOR SEED
PRODUCTION
Forest plantations with native species can be performed in order for reverse the
shortage of forest products and mitigate environmental degradation in the Caatinga biome. In
these cases the quality seeds good are important inputs for the formation of these
plantations. Thus, the aim of this study was to evaluate the physiological quality of seeds and
genetic diversity of different main trees of Mimosa caesalpiniaefolia Benth. from a planted
area in the state of Rio Grande do Norte, Brazil. This area were sampled nine main trees
whose seeds were evaluated by germination and vigor and genetic diversity estimated by
molecular markers ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). All arrays produced seeds with
high germination and emergence rate, but feature subtle differences in vigor when evaluated
by electrical conductivity and potassium leaching tests. ISSR revealed that there is genetic
diversity among individuals and among their progeny. The production of seeds with high
physiological quality coupled with significant genetic diversity of nine main trees of M.
caesalpiniaefolia allows them to be exploited for seed production, prioritizing the most
divergent genetically and produce better quality seeds.
Keywords: forest seeds, molecular marker, quality seeds, reforestation, genetic diversity.
3
INTRODUÇÃO GERAL
__________________________________________________________________________
O bioma Caatinga, que ocupa o equivalente a 11% do território nacional, vem
sofrendo ações de desmatamento, as quais atingem atualmente 46% da sua área, como
resultado, principalmente, da exploração madeireira realizada de forma ilegal e insustentável
(MMA, 2014). Diante da ameaça de que espécies florestais de importância econômica atual
ou potencial estão sofrendo frente a esse ritmo crescente de desmatamento, o Ministério do
Meio Ambiente (MMA) tem buscado estratégias para minimizar os seus impactos, tendo
criado em 2004, através do Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da Diversidade
Biológica, uma lista unificada de espécies prioritárias para o bioma Caatinga (PAREYN,
2010).
Dentre as espécies listadas, está a Mimosa caesalpiniaefolia Benth., uma espécie
arbórea de médio porte, conhecida popularmente como sabiá, sansão-do-campo e unha-degato cuja importância econômica para o setor florestal da região está na ampla utilização da
madeira como lenha, carvão e na forma de estacas para a construção de cercas.
Antes de ser incluída como uma espécie prioritária pelo MMA, plantios artificiais
haviam sido implantados no Nordeste em decorrência da escassez de povoamentos
naturais para exploração de estacas (DRUMOND et al., 1999). Desde então, estudos
relacionados ao aproveitamento tecnológico da madeira (GONÇALVES et al., 2010;
ALENCAR, et al., 2011), produção e qualidade da forragem (CARVALHO et al., 2004;
VIEIRA et al., 2005; LIMA et al., 2008) e recomposição florestal (ARAÚJO FILHO, et al.,
2007; COSTA et al., 2014) têm sido realizados com esta espécie.
Estes estudos permitem que as potencialidades de M. caesalpiniaefolia sejam
racionalmente exploradas, contudo, outros aspectos comprovadamente importantes
continuam sendo negligenciados como a falta de informações relacionadas à qualidade
fisiológica e genética das sementes utilizadas para implantação de novas áreas.
A obtenção de sementes de boa qualidade e em quantidade suficiente requer
planejamento técnico das etapas de produção que começa com a seleção das árvores em
que as sementes serão coletadas, as quais devem apresentar características tecnológicas
superiores às demais da mesma espécie quando o objetivo é a produção de madeira e
outros produtos não madeireiros, mas desprezando-se esses aspectos quando se destinam
a restauração florestal (NOGUEIRA e MEDEIROS, 2007). Contudo, ainda segundo este
autor, algumas características são comuns para todos os objetivos de produção, tais como,
alto vigor, boa condição fitossanitária e produção de sementes em grande quantidade e com
qualidade elevada.
4
Rotineiramente, a qualidade fisiológica das sementes é avaliada por meio do teste de
germinação em condições favoráveis de laboratório de forma a obter-se a máxima
germinação possível (BRASIL, 2009), cuja metodologia para muitas espécies florestais
encontra-se descrita por Brasil, (2013) nas Instruções para Análise de Sementes Florestais.
Como complemento ao teste de germinação tem-se utilizado testes de vigor que possibilitam
detectar diferenças na qualidade fisiológica das sementes que não podem ser detectados
pelo teste de germinação (KRZYZANOWSKI e FRANÇA NETO, 2001).
Estudos sobre a qualidade das sementes são imprescindíveis para qualquer
finalidade a que sejam destinadas, porém, quando o objetivo principal é a recomposição
florestal também deve-se verificar se as mesmas possuem diversidade genética adequada
(SILVA e PINTO (2009).
As estimativas de diversidade genética de espécies vegetais têm sido realizadas por
meio de marcadores moleculares capazes de detectar diferenças entre indivíduos ao nível
de DNA (VELASCO-RAMÍREZ, et al., 2014). Como exemplo da ampla utilização dos
marcadores moleculares pode-se citar os trabalhos desenvolvidos por Sebbenn et al.
(2003), Melo Júnior et al. (2004) e Manoel et al. (2012) que têm demonstrado o grande
potencial dos marcadores moleculares para estimar a diversidade genética de espécies
florestais arbóreas brasileiras visando a coleta de sementes com variabilidade genética.
Objetivo geral:
 Avaliar a qualidade fisiológica de sementes e a diversidade genética de diferentes
árvores matrizes de Mimosa caesalpiniaefolia Benth. provenientes de uma área plantada no
Estado do Rio Grande do Norte, Brasil.
Objetivos específicos:
 Avaliar a qualidade fisiológica de sementes de diferentes árvores matrizes de
caesalpiniaefolia.
 Selecionar iniciadores de ISSR (Inter Sequências Simples Repetidas) capazes
detectar polimorfismo genético entre indivíduos de M. caesalpiniaefolia para estudo
diversidade genética da espécie.
 Estimar o nível de diversidade genética entre um conjunto de árvores matrizes e
suas progênies por meio de marcadores ISSR.
M.
de
da
de
BIBLIOGRAFIA
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7
CAPÍTULO 1
__________________________________________________________________________
MARCADORES MOLECULARES ISSR PARA ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE
Mimosa caesalpiniaefolia BENTH.
8
Marcadores moleculares ISSR para estudo da diversidade genética de
Mimosa caesalpiniaefolia Benth.1
Fernando dos Santos Araújo2*, Mauro Vasconcelos Pacheco2, Fábio de Almeida Vieira2, Cibele dos
Santos Ferrari2, Kyvia Pontes Teixeira das Chagas2
RESUMO – Conhecer a diversidade genética de espécies florestais arbóreas vítimas da
exploração predatória no semiárido brasileiro pode contribuir com a elaboração de estratégias
efetivas para sua conservação e aproveitamento futuro. Assim, objetivou-se com este estudo
selecionar iniciadores de ISSR (Inter Sequências Simples Repetidas) capazes de detectar
polimorfismo genético entre indivíduos de Mimosa caesalpiniaefolia Benth. para estudo da
diversidade genética da espécie. Um total de 27 iniciadores de ISSR foram testados quanto à
sua capacidade de amplificar o DNA genômico de três indivíduos (bulk) e todos amplificaram
regiões entre sequências simples repetidas no genoma, porém sete foram selecionados por
apresentarem bom padrão de amplificação em relação aos demais. Os sete iniciadores
selecionados foram utilizados para amplificar o DNA genômico de nove indivíduos e geraram
um total de 78 locos, sendo 52,7% polimórficos. O valor do conteúdo de informações
polimórfica dos iniciadores variou de 0,261 a 0,489, revelando que os mesmos são
mediamente informativos e através da análise de bootstrap foi determinado que 51 locos
foram suficientes para estimar a diversidade genética da amostra de indivíduos analisada.
Conclui-se que os marcadores gerados pelos iniciadores UBC807, UBC824, UBC827,
UBC840, UBC851, UBC873 e UBC881 permitem detectar polimorfismo genético entre
indivíduos de M. caesalpiniaefolia, podendo ser utilizados para estimar a diversidade genética
desta espécie.
Palavras-chave: biologia molecular, semiárido, espécie florestal, DNA, polimorfismo.
____________________________
*Autor para correspondência
1
Trabalho extraído da Dissertação de Mestrado do primeiro autor no Programa de Pós-Graduação em
Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte financiado pela
FAPERN/CAPES
2
Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Macaíba, Rio Grande do Norte, Brasil. ([email protected]);
9
Molecular markers ISSR for diversity genetics study of Mimosa caesalpiniaefolia
BENTH.
ABSTRACT - Know the genetic diversity of forest tree species victims of predatory logging
in the Brazilian semiarid region may contribute to the development of effective strategies for
conservation and future use. Thus, the aim of this study was to select primers of ISSR (Inter
Simple Sequence Repeats) capable of detecting genetic polymorphism between individuals of
Mimosa caesalpiniaefolia Benth. for study the genetic diversity of the species. A total of 27
ISSR primers were tested for their ability to amplify genomic DNA the three individuals
(bulk) and all primers amplified regions between repeated simple sequences in the genome,
but seven were selected because of their good standard of amplification compared to the
others. Os seven selected primers were used to amplify genomic DNA of nine individuals and
generated a total of 78 loci, which 52.7% polymorphic. The value of the information content
polymorphic ranged from 0.261 to 0.489, showing that they are moderately informative and
through bootstrap analysis was determined that 51 loci were sufficient to estimate the genetic
diversity of the sample of analyzed individuals. We conclude that the markers generated
through primers UBC807, UBC824, UBC827, UBC840, UBC851, UBC873 and UBC881 can
detect genetic polymorphism between individuals of M. caesalpiniaefolia and can be used to
estimate the genetic diversity of this species.
Key words: molecular biology, semiarid, forest species, DNA, polymorphism.
INTRODUÇÃO
Na região semiárida do Brasil, a escassez de produtos florestais provocada pelo
desmatamento fez surgir a necessidade de conservar e utilizar de forma sustentável as
espécies florestais nativas de importância econômica atual ou potencial, de modo que o
governo do país criou em 2004 uma lista unificada de espécies prioritárias, acreditando que o
cultivo e aproveitamento destas poderia ser uma alternativa para reduzir a exploração
predatória em áreas naturais (PAREYN, 2010).
10
Das espécies listadas, apenas quatro são cultivadas comercialmente, entre elas a Mimosa
caesalpiniaefolia Benth., uma árvore de pequeno porte de ocorrência natural no semiárido
nordestino, tendo seu maior índice de ocorrência nos estados do Ceará e do Piauí (MAIA,
2004). É uma espécie importante para a exploração florestal no semiárido nordestino que
possui estudos avançados de aproveitamento e cultivo (PAREYN, 2010) voltados,
principalmente, para exploração de madeira utilizada na forma de estacas e mourões para
confecção de cercas e como fonte energética (RIBASKI et al., 2003).
Diante e tal importância, justifica-se o desenvolvimento de estudos que possam
subsidiar a conservação e melhoramento genético de M. caesalpiniaefolia como forma de
garantir sua utilização futura. Para tanto, torna-se relevante caracterizar a sua diversidade
genética, pois segundo Srihari et al. (2013) a existência de diversidade genética na popluçaõ a
ser conservada permite a evolução de novas combinações de genes, conferindo uma maior
capacidade de evolução e adaptação às mudanças nas condições ambientais que são
características importantes tanto para conservação, quanto para o melhoramento genético.
Atualmente existem várias técnicas disponíveis que permitem o estudo da diversidade
genética em plantas como os marcadores morfológicos, bioquímicos e moleculares
(VASHISHTHA et al., 2013). Destes, os que mais prosperaram, sendo desenvolvidos e
utilizados com sucesso nas últimas duas décadas foram os marcadores moleculares baseados
na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) como SSR (Sequências
Simples Repetidas), RAPD (Amplificação Arbitrária de DNA Polimórfico) e ISSR (Inter
Sequências Simples Repetidas) (SEMAGN et al., 2006).
Na técnica de ISSR são utilizados iniciadores compostos por repetições di-, tri-, tetraou pentanucleotídicas, com ou sem uma sequência de ancoragem de um a três nucleotídeos
que têm como alvo as regiões microssatélites no genoma (ZIETJIEWICZ et al., 1994) sem
que seja necessário o sequenciamento prévio do genoma (BARTH et al., 2002).
11
Em contraste com outros marcadores moleculares, as sequências alvo dos iniciadores de
ISSR são abundantes ao longo do genoma eucariótico e evoluem rapidamente e,
consequentemente, ajudam a revelar um número muito maior de locos polimórficos que
outros marcadores dominantes como RAPD (ANSARI et al., 2012).
Essas características tornam os marcadores ISSR atrativos, sobretudo, quando se trata
de espécies que ainda não foram estudadas do ponto de vista genético utilizando marcadores
moleculares como a M. caesalpiniaefolia. Assim, o objetivo deste estudo foi
selecionar iniciadores de ISSR capazes de detectar polimorfismo genético entre indivíduos de
M. caesalpiniifolia para estudo da diversidade genética da espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta de material vegetal e extração de DNA
Foram coletadas amostras de folhas de nove indivíduos de M. caesalpiniaefolia
provenientes da Área de Experimentação Florestal (5º53'52,5"S e 35º21'31,6"W) pertencente
à Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UAECIA/UFRN) no município de Macaíba, Estado do Rio Grande do
Norte, Brasil. As amostras foram acondicionadas em recipiente térmico com gelo e levadas ao
Laboratório de Genética e Melhoramento Florestal da UAECIA/UFRN onde foram
transferidas para tubos contendo solução tampão contendo 2% de CTAB e armazenadas a -20
ºC. O DNA genômico foi extraído utilizando-se o protocolo proposto por Doyle e Doyle
(1987), com modificações, e sua quantificação foi realizada em espectrofotômetro de
microplacas (Epoch™), segundo orientações do fabricante.
Amplificação do DNA com iniciadores de ISSR
As reações para amplificação do DNA foram realizadas em termociclador (Veriti® 96Well) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 ºC durante 2 minutos; 37 ciclos de
15 segundos a 94 ºC para desnaturação, 30 segundos a 47 ºC para anelamento do iniciador ao
12
DNA molde e 1 minuto a 72 ºC para extensão; um ciclo de extensão final durante 7 minutos a
72 ºC; resfriamento até atingir 4,0 ºC.
As amplificações de PCR foram realizadas em 12 μl reação contendo 2,0 µL de DNA
diluído (1:50) adicionados a 10 μL de mix de reação [0,33 µM de iniciador; 1,2 µL de tampão
de PCR (Buffer IC Phoneutria®); 0,25 mg.mL-1 de BSA; 2,0 mM de MgCl2; 0,25 mM de
dNTP; 0,5 U de Taq DNA polimerase] e completado o volume final com água ultrapura.
Os produtos da PCR foram corados com Azul de Bromofenol associado à GelRed™ e
separados por eletroforese horizontal em gel de agarose (1,5% p/v) imerso em tampão TAE
1X (Tris-Acetato-EDTA) a uma voltagem constante (100V) durante aproximadamente três
horas. Um controle negativo contendo apenas mix de PCR e um padrão de peso molecular
com 1.000 pares de base (pb) (K181 DNA Ladder Invitrogen®) foram utilizados em cada
eletroforese. Os géis foram fotografados sob luz ultravioleta em um sistema de
fotodocumentação (E-Box VX2).
Foram testados 27 iniciadores de ISSR (University of British Columbia University de
British Columbia - UBC) utilizando-se DNA genômico, em bulk, de três indivíduos de M.
caesalpiniaefolia amostrados aleatoriamente do conjunto total de indivíduos. Foram
selecionados os iniciadores que apresentaram os melhores padrões de amplificação (locos
inequívocos, reprodutíveis, com boa qualidade de resolução e em maior número), os quais
foram utilizados para amplificar o DNA genômico dos nove indivíduos amostrados.
Cada iniciador foi avaliado quanto ao número total de locos amplificados, número total
de locos polimórficos, taxa de polimorfismo e valor do conteúdo de informação polimórfica
conforme a equação proposta por Anderson et al. (1993):
Onde: Pij é a frequência do alelo "j" no marcador "i".
13
A frequência alélica foi obtida através dos dados de presença (1) e ausência (0) dos
locos amplificados por cada iniciador nos nove indivíduos utilizando-se o software
POPGENE versão 1.3 (YEH et al. 1997).
Número suficiente de locos para estudo da diversidade genética
A determinação do número suficiente de locos para obter com precisão as estimativas de
diversidade genética dos indivíduos amostrados foi realizada por meio da análise de bootstrap
utilizando-se o software GENES (CRUZ, 2001). A partir de uma matriz binária construída
com os dados de presença (1) ou ausência (0) dos locos amplificados foi estimada, para cada
par de indivíduos, a distância genética de Nei (1978). Em seguida, foram estimados, para cada
par de indivíduos, valores de distância genética simulados a partir de reamostragens
utilizando-se diferentes números de locos (1, 6, 11, ..., 78 locos) com 10.000 permutações.
Com os valores de distância genética simulada foram geradas matrizes, as quais foram
correlacionadas (r) com a matriz de distância genética original. O ajuste entre as duas
matrizes foi verificado por meio do valor de estresse de Kruskal (KRUSKAL, 1964). O
número de locos foi considerado suficiente para realização das estimativas de diversidade
genética quando o estresse atingiu valor inferior a 0,05 e a correlação se aproximou do valor
máximo (r = 1,0).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seleção dos iniciadores de ISSR
Todos os 27 iniciadores testados amplificaram sequências entre regiões simples
repetidas (microssatélites) no genoma de M. caesalpiniaefolia (Tabela 1). O número de locos
amplificados por iniciador variou de 2 a 12, sendo que a maioria amplificou regiões com 5 a
10 locos.
14
Tabela 1 – Iniciadores de ISSR com suas respectivas sequências de nucleotídeos e número
total de locos amplificados
Iniciador ISSR
Sequência de nucleotídeos (5’– 3’)
Número total de locos
UBC807
AGAGAGAGAGAGAGAGT
9
UBC808
AGAGAGAGAGAGAGAGC
5
UBC809
AGAGAGAGAGAGAGAGG
5
UBC810
GAGAGAGAGAGAGAGAT
9
UBC813
CTCTCTCTCTCTCTCTT
9
UBC818
CACACACACACACACAG
10
UBC821
GTGTGTGTGTGTGTGTT
2
UBC822
TCTCTC TCTCTCTCTCA
7
UBC824
TCTCTCTCTCTCTCTCG
8
UBC825
ACACACACACACACACT
7
UBC826
ACACACACACACACACC
4
UBC827
ACACACACACACACACG
12
UBC829
TGTGTGTGTGTGTGTGC
6
UBC830
TGTGTGTGTGTGTGTGG
8
UBC840
GAGAGAGAGAGAGAGAYT
11
UBC841
GAGAGAGAGAGAGAGAYC
10
UBC842
GAGAGAGAGAGAGAGAYG
4
UBC843
CTCTCTCTCTCTCTCTRA
5
UBC844
CTCTCTCTCTCTCTCTRC
7
UBC851
GTGTGTGTGTGTGTGTYG
9
UBC857
ACACACACACACACACYG
6
UBC859
TGTGTGTGTGTGTGTGRC
10
UBC860
TGTGTGTGTGTGTGTGRA
7
UBC862
AGCAGCAGCAGCAGCAGC
8
UBC873
GACAGACAGACAGACA
11
UBC880
GGAGAGGAGAGGAGA
6
UBC881
GGGTGGGGTGGGGTG
9
R, purina (A ou G); Y, pirimidina (C ou T).
Os iniciadores selecionados por apresentarem bom padrão de amplificação em relação
aos demais foram UBC807, UBC824, UBC827, UBC840, UBC851, UBC873 e UBC881. Ao
avaliar o padrão de amplificação desses iniciadores utilizando DNA genômico de nove
indivíduos (Tabela 2) pode-se verificar que apenas UBC807, UBC881 e UBC840
amplificaram o mesmo número de locos observados na pré-seleção, enquanto que UBC851
amplificou um número menor e UBC824, UBC827 e UBC873 um número maior de locos.
Essa diferença no perfil de amplificação dos iniciadores está relacionada ao tipo de amostra
15
de DNA utilizado, pois de acordo com Yanaka et al. (2005) quando se utiliza amostras de
DNA em bulk, locos com baixa frequência na população podem não ser amplificados.
A análise dos nove indivíduos com sete combinações de iniciadores revelou um total de
78 locos, com número médio de 11 locos por iniciador (Tabela 2). Analisando outros trabalhos
com iniciadores de ISSR, verificou-se que o número médio de locos por iniciador obtidos
nesta pesquisa aproximou-se dos observados em Pongamia pinnata (L.) Pierre (10,75 locos)
(KESARI et al., 2010), Praecox chimonanthus (L.) Link (10,45 locos) (ZHAO et al., 2007) e
Spondias sp. (10 locos) (SANTANA et al., 2011), sugerindo que o número médio de locos
amplificados pelos iniciadores selecionados para M. caesalpiniaefolia, neste estudo, possa ser
considerado satisfatório.
Tabela 2 - Número total de locos, número de locos polimórficos, taxa de polimorfismo e
valor do conteúdo de informação polimórfica (PIC) de sete iniciadores de ISSR em um
conjunto de nove indivíduos de M. caesalpiniaefolia.
Iniciador
UBC 807
UBC 824
UBC 827
UBC 840
UBC 851
UBC 873
UBC 881
Média
Total
Número
total de locos
9
16
14
11
7
12
9
11
78
Número total de
locos polimórficos
5
9
4
7
3
8
5
6
41
Taxa de
polimorfismo
55,6
56,3
28,6
63,6
42,9
66,7
55,6
52,7
Valor de PIC
0,451
0,450
0,261
0,334
0,381
0,489
0,416
0,397
A combinação dos sete iniciadores revelou um total de 41 locos polimórficos, ou seja,
52,7% do total de locos amplificados. Porém, a capacidade de detectar polimorfismo foi
bastante variável entre os iniciadores, que variou de 28,6% (UBC827) a 66,7% (UBC873),
com um valor médio de 52,7 % de polimorfismo por iniciador. Essa taxa de polimorfismo
pode ser considerada baixa quando comparada aos valores obtidos por outros conjuntos de
iniciadores de ISSR em Hagenia abyssinica (Bruce) J.F. Gmel. (81,0%) (FEYISSA et al.,
2007), Spondias sp. (80,0%) (SANTANA et al., 2011), Thuja sutchuenensis Franch. (76,1%)
16
(LIU et al., 2013), Larix gmelinii (Rupr.) (98,83%) (ZHANG et al., 2013) e Erythrina
velutina Willd. (98,0%) (GONÇALVES et al., 2014).
Entretanto, isso não significa que, necessariamente, os iniciadores avaliados para M.
caesalpiniaefolia neste estudo amplifiquem regiões com baixo polimorfismo. A taxa de
polimorfismo dos iniciadores pode variar em função da população ou grupo de indivíduos que
esteja sendo avaliado como demonstrado por Oliveira et al. (2010) em populações de
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. provenientes de diferentes regiões geográficas; bem como
observado por Yiing et al. (2014) em florestas plantadas e naturais de Neolamarckia cadamba
(Roxb.) Bosser.; da mesma forma, constatado por Qian et al. (2013) entre populações de
Calanthe tsoongiana Tang & F.T.Wang e por Dai et al. (2013) entre populações de Madhuca
hainanensis Chun & F.C. How.
Para o conteúdo de informação polimórfica foram obtidos valores de 0,261 (UBC827) a
0,489 (UBC873) e valor médio de 0,397 para a combinação dos sete iniciadores, que segundo
Botstein et al. (1980), podem ser classificados como mediamente informativos (Tabela 2).
Essa avaliação confirma que os iniciadores selecionados podem ser utilizados para estimar a
diversidade genética de M. caesalpiniaefolia, pois iniciadores ISSR classificados como
mediamente informativos também foram utilizados com sucesso em outras espécies como
Pongamia pinnata (L.) Pierre (KESARI et al., 2010), Dioscorea spp. (VELASCO-RAMÍREZ
et al., 2014), Quercus brantii Lindl.
(ALIKHANI et al., 2014 ) e Trifolium ssp.
(ARYANEGAD et al., 2013).
Número suficiente de locos para estudo da diversidade genética
Por meio da análise de bootstrap foi possível estimar o número suficiente de locos para
o estudo da diversidade genética de M. caesalpiniaefolia (Figura 1). Verifica-se que, com o
aumento do número de locos analisados, a cada reamostragem, houve elevação dos valores de
17
correlação e redução dos valores de estresse de Kruskal. Quando a reamostragem foi realizada
com 51 locos, o estresse assumiu valor de 0,046 e o coeficiente de correlação de 0,840.
Figura 1 – Valores de correlação de Pearson (r) e estresse de Kruskal (E) em função do
número de locos de ISSR utilizados para estimar a diversidade genética de nove indivíduos de
M. caesalpiniaefolia.
0,552
Valor de estresse (E)
Correlação de Pearson (r)
1,000
0,900
0,483
0,800
0,414
0,700
0,345
0,600
0,276
0,500
0,207
0,400
0,138
0,300
0,069
0,200
0,000
Correlação de Pearson (r)
Valor de estresse de Kruskal (E)
0,621
0,100
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81
Número de total de locos
Valores de estresse abaixo de 0,05 indicam que as estimativas possuem alta precisão
(Kruskal, 1964) e valores de r próximos a 1,0 indicam alta correlação positiva entre a matriz
de distância genética original e a matriz de distância genética simulada. Dessa forma, assumese que o número de locos utilizados (78 locos) para a realização das estimativas de
diversidade genética para os indivíduos amostrados foi considerado suficiente.
A determinação do número mínimo de locos de ISSR para estudo da diversidade
genética através da análise de bootstrap tem sido realizada para diversos táxons como, por
exemplo, em Spondias sp. (SANTANA et al., 2011), Erythrina velutina Willd
(GONÇALVES et al., 2014) e orchidaceaes dos gêneros Cattleya e Brassavola (FAJARDO;
VIEIRA; MOLINA, 2014). Sua utilização tem contribuído para a otimização do uso de
recursos e tempo, traduzidos em menor número de marcadores representativos da amostragem
do genoma para caracterização da diversidade genética (GONÇALVES et al., 2014).
CONCLUSÃO
18
Os marcadores gerados pelos iniciadores UBC807, UBC824, UBC827, UBC840,
UBC851, UBC873 e UBC881 permitem detectar polimorfismo genético entre indivíduos de
M. caesalpiniaefolia, podendo ser utilizados para estimar a diversidade genética da espécie.
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22
CAPÍTULO 2
__________________________________________________________________________
DIVERSIDADE GENÉTICA E QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE ÁRVORES
MATRIZES DE Mimosa caesalpiniaefolia BENTH.
23
Diversidade genética e qualidade fisiológica de sementes de árvores matrizes de
Mimosa caesalpiniaefolia Benth.
Fernando dos Santos Araújo (1), Mauro Vasconcelos Pacheco (1), Fábio de Almeida Vieira (1),
Cibele dos Santos Ferrari (1) e Francival Cardoso Félix (1)
(1)
Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias/ Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UAECIA/ UFRN). Rodovia RN-160, Km 3, Distrito de Jundiaí, CEP
59280-000, Cx. Postal 07, Macaíba/ RN, (E-mail: [email protected],
[email protected],
[email protected],
[email protected],
[email protected]).
Resumo - Mimosa caesalpiniaefolia Benth. é uma espécie florestal arbórea da Caatinga que
possui potencial para implantação de plantios comerciais visando a exploração da madeira e para
recomposição florestal no semiárido nordestino. Sendo assim, este estudo objetivou avaliar a
qualidade fisiológica de sementes e estimar o nível de diversidade genética de um conjunto de árvores
matrizes de M. caesalpiniaefolia provenientes de uma floresta plantada no Estado do Rio Grande do
Norte, Brasil. Dessa área foram amostradas nove árvores matrizes que tiveram suas sementes
avaliadas pelos testes de germinação e vigor e sua diversidade genética e de suas progênies estimada
por marcadores moleculares ISSR (Inter Sequências Simples Repetidas). Todas as matrizes
produziram sementes com elevada taxa de germinação e emergência, porém foram constatadas
diferenças sutis de vigor quando avaliadas pelos testes de condutividade elétrica e lixiviação de
potássio. Os marcadores ISSR revelaram que existe diversidade genética entre as matrizes e entre suas
progênies. Conclui-se que as árvores matrizes apresentam diversidade genética e produzem sementes
de alta qualidade fisiológica com diferenças sutis de vigor, podendo ser exploradas para produção de
sementes, priorizando-se aquelas mais divergentes geneticamente e que produzem sementes de melhor
qualidade.
Termos para indexação: sementes florestais, marcador molecular, semiárido, Fabaceae, sabiá.
24
Genetic diversity and physiological quality of seeds of main trees
Mimosa caesalpiniaefolia Benth.
Abstract - Mimosa caesalpiniaefolia Benth. is an arboreal forest species from the Caatinga
that has potential for deployment of commercial plantations aimed at logging and
reforestation in the northeastern semiarid. Thus, this study aimed to evaluate the physiological
quality of seeds and estimate the level of genetic diversity of a set of main trees M.
caesalpiniaefolia from a planted area in the state of Rio Grande do Norte, Brazil. This area
were sampled nine main trees whose seeds were evaluated by germination and vigor and
genetic diversity estimated by molecular markers ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). All
arrays produced seeds with high germination and emergence rate, but feature subtle
differences in vigor when evaluated by electrical conductivity and potassium leaching tests.
ISSR revealed that there is genetic diversity among individuals and among their progeny. We
conclude that the main trees present genetic diversity and physiological produce high quality
seeds with subtle differences in force and can be exploited for seed production, giving priority
to those most genetically divergent and produce better quality seeds.
Index terms: forest seeds, molecular marker, semiarid, Fabaceae, sabiá.
Introdução
Mimosa caesalpiniaefolia Benth. é uma espécie arbórea lenhosa, pertencente à família
Fabaceae, nativa do semiárido brasileiro, de relevante interesse econômico para esta região
devido, principalmente, à produção de madeira utilizada como lenha e carvão e de estacas
para a construção de cercas (Ribaski et al., 2003). Além disso, vem sendo recomendada para
utilização em programas de recuperação de áreas degradadas (Pereira, 2011), de forma que se
25
estima um aumento na demanda de sementes para produção de mudas desta espécie, quer seja
com fins de plantio exploratório da madeira, como para restauração florestal.
Para a obtenção de sementes florestais de alta qualidade é necessário um planejamento
técnico de todas as etapas de produção, iniciando-se com a seleção das árvores matrizes em
que serão coletadas as sementes, as quais devem apresentar características produtivas
superiores às demais da mesma espécie na área (Nogueira e Medeiros 2007; Oliveira, 2012).
Dentre os parâmetros avaliados para seleção de matrizes, a qualidade das sementes é um dos
mais importantes (Nogueira e Medeiros, 2007), por isso se faz necessário realizar o controle
de qualidade das sementes de cada matriz em laboratório antes de elegê-las como
fornecedoras de sementes (Lima et al., 2014).
Estudos sobre a qualidade fisiológica das sementes são imprescindíveis para qualquer
finalidade a que sejam destinadas, porém, quando o objetivo principal é a recomposição
florestal também se deve verificar se as mesmas possuem variabilidade genética adequada
(Silva e Pinto, 2009). Assim torna-se relevante estimar a diversidade genética das árvores das
quais as sementes serão coletadas, pois segundo Sebbenn (2002) estas devem apresentar baixo
grau de parentesco a fim de evitar endogamia nas futuras gerações e conservar o potencial
evolutivo da população formada.
A avaliação da diversidade genética de espécies florestais arbóreas brasileiras visando
a coleta de sementes tem sido realizada por meio de marcadores moleculares baseados em
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) como RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao
Acaso) (Rabbani et al., 2012) e SSR (Repetições de Sequência Simples) (Gaino et al., 2011) e
também por meio de marcadores moleculares bioquímicos como os isoenzimáticos (Sebbenn
et al., 2003).
Outro marcador molecular que tem sido utilizado para estimar a diversidade genética
de espécies arbóreas é o ISSR (Inter Repetições de Sequências Simples). Este foi
26
desenvolvido por Zietjiewicz et al. (1994) e pertence à classe dos marcadores dominantes
baseados em PCR. O ISSR não necessita de sequenciamento prévio do genoma (Shi et
al., 2010) como o RAPD, entretanto, tem sido considerado mais vantajoso devido à
amplificação de fragmentos com maior reprodutibilidade e menor custo de operação quando
comparado ao RAPD (Brandão et al., 2011).
Considerando a importância da qualidade fisiológica e da diversidade genética das
sementes de espécies nativas para programas de recuperação ou conservação e melhoramento
vegetal, o objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade fisiológica das sementes e estimar o
nível de diversidade genética de um conjunto de árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia
provenientes de uma área plantada no estado do Rio Grande do Norte, Brasil.
Material e Métodos
Área de estudo e amostragem
A amostragem foi feita em um plantio de M. caesalpiniaefolia localizado na Área de
Experimentação Florestal (5º 53' 52,5" S e 35º 21' 31,6" W) pertencente à Unidade Acadêmica
Especializada em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UAECIA/UFRN) no município de Macaíba, Estado do Rio Grande do Norte, Brasil. Essa
população consta de 355 plantas com três anos de idade e distribuídas em espaçamento 2 x 2
m (2500 planta.ha-1). Seu cultivo foi realizado a partir de mudas propagadas por sementes de
polinização livre coletadas em plantas inermes (sem acúleos) no município de Macaíba/ RN.
Foram amostradas, aleatoriamente, nove árvores dentre aquelas que apresentavam
frutos maduros no momento da coleta que forneceriam sementes em quantidade suficiente
para a realização dos testes propostos. Estes frutos foram beneficiados manualmente,
descartando-se as sementes com má formação, danificadas e predadas por insetos.
Qualidade fisiológica de sementes das árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia
Determinação do grau de umidade
27
Foi realizado pelo método da estufa a 105 ± 3 ºC durante 24 horas conforme Brasil
(2009) utilizando-se duas subamostras de 50 sementes. Os resultados foram expressos em
porcentagem.
Teste de germinação
As sementes foram submetidas a tratamento para superar a dormência (desponte na
região oposta à micrópila) e desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio (2,5% de cloro
ativo) durante cinco minutos conforme recomendações de Brasil (2013). Em seguida, foram
semeadas em papel toalha (tipo Germitest®) umedecido com água destilada e organizado em
forma de rolos. Os rolos foram acondicionados em sacos plásticos transparentes e incubados
em germinador tipo B.O.D. (Biochemical Oxygen Demand) regulado à temperatura de 25 ºC
com luz constante. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado,
utilizando-se um total de 100 sementes subdivididas em quatro subamostras de 25. No sétimo
dia após o início do teste foram contabilizadas as sementes germinadas (plântulas normais),
sendo os resultados expressos em porcentagem.
Teste de emergência em campo
As sementes de cada matriz foram submetidas a tratamento para superar a dormência
(desponte na região oposta à micrópila) e, em seguida, semeadas a 2,0 cm de profundidade em
um canteiro de solo arenoso a pleno sol. O delineamento experimental utilizado foi em blocos
casualizados, utilizando-se 100 sementes subdivididas em quatro subamostras de 25. No 12º
dia após a semeadura foram contabilizadas as plântulas normais emersas, sendo os resultados
expressos em porcentagem.
Índice de velocidade de emergência
Foi calculado a partir da fórmula proposta por Maguire (1962) utilizando-se o número
de plântulas emersas diariamente no teste de emergência.
Teste de condutividade elétrica e lixiviação de K+
28
Foram realizados de acordo com metodologia proposta por Avelino (2014), utilizandose amostras de 100 sementes (subdivididas em quatro subamostras de 25), previamente
despontadas, de cada matriz. Cada subamostra foi pesada em balança analítica e colocada para
embeber em 50 mL de água deionizada por um período de oito horas à temperatura de 30 ºC.
Após esse período, foram realizadas as leituras da condutividade elétrica (μS.cm-1.g-1 de
semente) e da concentração de K+ (mg.L-1.g-1 de semente) da solução de embebição,
utilizando-se condutivímetro de bancada (Tecnal® modelo TEC-4MP) e fotômetro de chama
(Micronal®, modelo B462), respectivamente.
Análise dos dados
Os dados que atenderam aos pressupostos para análise paramétrica (índice de
velocidade de emergência e lixiviação de K+) foram submetidos ao teste F pela Análise de
Variância (ANOVA) e os que não atenderam (germinação, emergência e condutividade
elétrica) foram analisados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. As médias foram
comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Posteriormente, foram
calculados os coeficientes de correlação de Spearman (não paramétrico) entre as variáveis,
sendo a significância dos valores de r verificadas pelo teste t, aos níveis de 5,0 e 1,0% de
probabilidade. As análises foram realizadas com o software estatístico ASSISTAT versão 7.6
beta.
Diversidade genética de árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia e entre suas progênies
Coleta de material vegetal e extração de DNA
Foram coletadas amostras de material vegetal (folha) das plantas amostradas e, em
seguida, transferidas para tubos contendo solução tampão (2% de CTAB) e armazenados a -20
ºC para posterior extração do DNA. Também foram coletadas aleatoriamente amostras de
material vegetal de 18 progênies de uma população de 210 plantas formada a partir de
sementes das nove árvores matrizes selecionadas.
29
O DNA genômico foi extraído conforme o protocolo proposto por Doyle & Doyle
(1987) com modificações e sua quantificação foi realizada em espectrofotômetro de
microplacas (Epoch™), segundo orientações do fabricante.
Amplificação do DNA com iniciadores ISSR
As reações para amplificação do DNA foram realizadas em termociclador (Veriti® 96Well) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 ºC durante 2 minutos; 37 ciclos de
15 segundos a 94 ºC para desnaturação, 30 segundos a 47 ºC para anelamento do iniciador ao
DNA molde e 1 minuto a 72 ºC para extensão; um ciclo de extensão final durante 7 minutos a
72 ºC; resfriamento até atingir 4,0 ºC.
As amplificações de PCR foram realizadas em 12 µL de reação contendo 2 µL de DNA
diluído (1:50 v/v) adicionados a 10 μL de mix de reação [0,33 µM de iniciador; 1,2 µL de
tampão de PCR (Buffer IC Phoneutria®); 0,25 mg.mL-1 de BSA; 2,0 mM de MgCl2; 0,25 mM
de dNTP; 0,5 U de Taq DNA polimerase] e completado o volume final com água ultrapura.
Os produtos da PCR foram corados com Azul de Bromofenol associado à GelRed™ e
separados por eletroforese horizontal em gel de agarose (1,5% p/v) imerso em tampão TAE
1X (Tris-Acetato-EDTA) a uma voltagem constante (100V) durante aproximadamente três
horas. Um controle negativo contendo apenas mix de PCR e um padrão de peso molecular
com 1.000 pares de base (pb) (K181 DNA Ladder Invitrogen®) foram utilizados em cada
eletroforese. Os géis foram fotografados sob luz ultravioleta em um sistema de
fotodocumentação (E-Box VX2).
Análise dos dados
A análise dos marcadores ISSR foi feita a partir de uma matriz binária com os dados
de presença (1) ou ausência (0) do loco, a partir da qual foram estimados o número de alelos
observados, número de alelos efetivos, distância genética de Nei (Nei, 1978) e índice de
30
diversidade de Shannon para os conjuntos de matrizes e para as 18 progênies, utilizando-se o
software estatístico POPGENE versão 1.3.
Uma matriz de distância genética baseada na diversidade genética de Nei foi gerada
para obtenção de dendrogramas através do método de agrupamento hierárquico UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) utilizando-se o software NTSYS.
Resultados e Discussão
Qualidade fisiológica de sementes de diferentes árvores matrizes
Os resultados das avaliações de qualidade fisiológica das sementes provenientes de
nove matrizes de Mimosa caesalpiniaefolia bem como seu grau de umidade são apresentados
na Tabela 2.
Ao analisar os resultados da determinação do grau de umidade, verifica-se que as
sementes das árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia apresentam de 9,1 a 11,0% de
umidade. Essa variação entre as sementes encontra-se dentro do limite máximo permitido de
2% que é necessário para padronizar as avaliações e obter resultados consistentes nos testes
de vigor (Marcos Filho, 2005). Também se pode verificar que as porcentagens de germinação
das sementes e emergência das plântulas de todas as árvores matrizes foram elevadas, não
sendo detectada diferença estatística significativa entre o desempenho das mesmas nesses
testes. Entretanto, para as demais variáveis (IVE, CE e LK+) constatou-se diferenciação
(p<0,05) quanto à qualidade fisiológica entre as sementes das diferentes matrizes.
Com base no índice de velocidade de emergência, as sementes das matrizes 6 e 9
foram classificadas como de maior vigor e as sementes da matriz 1 como de menor vigor em
relação às demais. Já na avaliação do vigor baseado no teste de condutividade elétrica, as
sementes das matrizes 6 e 9 também foram classificadas como de maior qualidade fisiológica,
enquanto as sementes das matrizes 1 e 5 foram classificadas como de menor vigor (Tabela 2).
No teste de lixiviação de potássio, apenas as sementes da matriz 9 foram classificadas como
31
sendo as mais vigorosas, enquanto as das matrizes 1 e 5 foram classificadas como de menor
vigor em relação às demais.
Os resultados desses testes indicam que as sementes das diferentes matrizes
apresentam diferenças sutis de vigor que são resultados de processos iniciais de deterioração,
como os danos nas membranas celulares, que têm sido apontados como um dos primeiros
sinais de declínio da qualidade fisiológica das sementes (Panobianco et al., 2007; Shaban,
2013).
A variação entre a qualidade fisiológica das sementes das diferentes matrizes de M.
caesalpiniifolia encontrada neste estudo pode ser considerada inferior a de árvores matrizes
de espécies arbóreas como Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz (Lima et al., 2014) e
Sideroxylon obtusifolium (Roem. & Schult.) T.D. Penn. (Silva et al., 2014) mantidas em
estado selvagem. Para estas última, a maior variação observada foi atribuída à grande
influência ambiental e à alta variabilidade genética dos indivíduos.
A Tabela 3 apresenta a correlação entre os testes de germinação e vigor e o
desempenho das plântulas em campo. Verifica-se que não houve correlação (p>0,05) entre o
teste de germinação e os testes de emergência e índice de velocidade de emergência.
Entretanto, os testes de condutividade elétrica e lixiviação de K+ apresentaram correlações
negativas significativas (p<0,05) com o índice de velocidade de emergência, indicando que
quanto maior os valores de CE e LK+ das sementes, mais baixa será a velocidade de
emergência das plântulas em campo (IVE).
Esses resultados corroboram com Marcos Filho (2005) o qual descreve que a redução
da velocidade de emergência geralmente é determinada pela desorganização do sistema de
membranas, pois segundo este autor pode haver perda de constituintes (exsudados) essenciais
à manutenção do potencial osmótico interno da célula, além de que a liberação desses
32
exsudados estimula o desenvolvimento de microrganismos que podem ser prejudiciais à
germinação.
Diversidade genética de diferentes árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia e entre suas
progênies
Neste estudo, a aplicabilidade dos marcadores ISSR para avaliar a diversidade
genética de M. caesalpiniaefolia mostrou-se satisfatória, pois amplificaram sequências entre
regiões simples repetidas (microssatélites) no genoma de M. caesalpiniaefolia cuja avaliação
permitiu diferenciar geneticamente os indivíduos amostrados (Tabela 5 e Figura 1).
A taxa de locos polimórficos foi diferente para os conjuntos de indivíduos avaliados,
sendo de 52,7% para as matrizes e 64,6% nas progênies. As progênies também apresentaram
maiores valores de alelos observados (1,646 ±0,05), alelos efetivos (1,426±0,05), diversidade
genética de Nei (0,240±0,02) e índice de diversidade de Shannon (0,352±0,03) em relação ao
conjunto de árvores matrizes cujos valores para essas variáveis foram, respectivamente,
1,525±0,04; 1,404±0,05; 0,220±0,02 e 0,317±0,03 (Tabela 4), indicando que o conjunto de
progênies apresenta maior diversidade genética.
Assumindo-se que o sistema de reprodução tem papel determinante na diversidade
genética das populações (Liengsiri et al., 1999), esses resultados podem estar relacionados ao
sistema de reprodução de M. caesalpiniaefolia. Mesmo não existindo estudos nesse sentido,
acredita-se que a alogamia presente em outras espécies do gênero Mimosa (Seijo & Neffa,
2004; Silva et al., 2011) seja esperada para esta espécie. Além disso, quando se aceita a
hipótese de que se trata de uma espécie alógama, a alta densidade de indivíduos vizinhos pode
vir a favorecer uma maior taxa de cruzamento entre os indivíduos (Gusson, et al., 2006).
De uma maneira geral, um nível de diversidade genética baixo ou moderado para o
conjunto de matrizes e suas progênies era esperado, uma vez que os indivíduos analisados
fazem parte de uma população cultivada com histórico de seleção. Essa hipótese corrobora
33
com o estudo realizados por Yiing et al. (2014) os quais revelaram que populações cultivadas
da espécie arbórea Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser que também tiveram sua
reprodução assistida apresentam diversidade genética inferior (I = 0,149; P = 35,145%) a de
populações mantidas em estado selvagem (I = 0,176; P = 48,41%).
No dendrograma de distância genética para os conjuntos de árvores matrizes
apresentado na Figura 1 é possível observar que houve a formação de dois agrupamentos
principais, tomando-se como ponto de corte a maior distância genética: o grupo 1 formado
pelas matrizes 1, 2, 4, 5, 6 e 9 e o grupo 2 pelas matrizes 3, 7 e 8. Verifica-se que, dentro do
mesmo grupo genético (grupo 1), foram agrupadas as matrizes que produziram as sementes de
maior e menor vigor, indicando que a qualidade fisiológica das sementes é uma característica
fortemente influenciada por outros fatores intrínsecos que afetam as planta individualmente
como, o estado nutricional ou danos provocados pelo ataque de pragas e doenças durante a
formação das sementes.
As estimativas de distância genética de Nei para as nove matrizes de M.
caesalpiniaefolia estão apresentados na Tabela 5, na qual se verifica que as matrizes 4 e 5
(0,100) são as mais próximas e as matrizes 7 e 9 (0,333) as mais distantes geneticamente.
Essas estimativas permitem que a coleta de sementes seja realizada nas matrizes mais
distantes geneticamente, o que resultaria na produção de sementes com maior variabilidade
genética, pois quanto mais divergentes forem os genitores selecionados, maior será a
variabilidade das suas progênies (Manfio et al., 2012), o que é de grande valia quando as
sementes se destinam à recomposição florestal (Sebbenn, 2002).
Estes resultados indicam que o conjunto de matrizes estudado apresenta diversidade
genética e produzem sementes com altas porcentagens de germinação e emergência cujo
potencial pode ser explorado para produção de sementes.
34
Conclusões
As árvores matrizes apresentam diversidade genética e produzem sementes de alta
qualidade fisiológica com diferenças sutis de vigor, podendo ser exploradas para produção de
sementes, priorizando-se aquelas mais divergentes geneticamente e que produzem sementes
de melhor qualidade.
Agradecimentos
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN) e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro para o desenvolvimento deste estudo.
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Tabela 1. Sequência de nucleotídeos de sete iniciadores de ISSR
Iniciador ISSR
Sequência de nucleotídeos (5’– 3’)
UBC807
AGAGAGAGAGAGAGAGT
UBC824
TCTCTCTCTCTCTCTCG
UBC827
ACACACACACACACACG
UBC840
GAGAGAGAGAGAGAGAYT
UBC851
GTGTGTGTGTGTGTGTYG
UBC873
GACAGACAGACAGACA
UBC881
GGGTGGGGTGGGGTG
R, purina (A ou G); Y, pirimidina (C ou T).
38
Tabela 2. Médias de grau de umidade (GU), germinação (G), emergência (E), índice de
velocidade de emergência (IVE), condutividade elétrica (CE) e lixiviação de K+ (LK+) de
sementes provenientes de nove árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia.
Matriz
GU (%)1
G (%)2
E (%)2
IVE3
CE (μS.cm-1.g-1)4
LK+ (mg.L-1.g-1)3
1
11,0
93
66
2,75 c
254,11 d
7,89 d
2
11,0
98
77
3,52 b
140,95 b
5,09 b
3
10,0
95
82
3,05 b
148,84 b
5,90 c
4
11,0
93
71
3,21 b
193,49 c
6,36 c
5
11,0
97
72
3,25 b
255,30 d
7,19 d
6
9,1
98
68
4,03 a
111,30 a
4,71 b
7
9,5
93
77
3,55 b
152,02 b
5,90 c
8
9,6
96
81
3,38 b
160,07 b
4,92 b
9
9,8
92
83
3,97 a
129,16 a
3,29 a
4,32
12,19
16,23
8,90
13,35
CV (%)
1
Dados não analisados estatisticamente, 2 Não significativo pelo teste de Kruskal-Wallis, 3Significativo pelo teste
F (ANOVA), 4Significativo pelo teste de Kruskal-Wallis. Médias Seguidas pela mesma letra na coluna não
diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Tabela 3. Coeficientes de correlação de Spearman entre os testes de germinação,
condutividade elétrica e lixiviação de K+ com os testes de emergência e índice de velocidade
de emergência em campo.
Testes de laboratório
Teste de emergência
Índice de velocidade de emergência
Germinação
-0,0368 ns
0,0901ns
Condutividade elétrica
-0,1965ns
-0,3159*
Lixiviação de K+
-0,2764 ns
-0,3666*
*Significativo (p<0,05) e ns não significativo (p>0,05)
39
Tabela 4: Parâmetros de diversidade genética de um conjunto de nove árvores matrizes e 18
progênies de polinização livre provenientes de um plantio de M. caesalpiniaefolia.
Indivíduos
n
La
Lp (%)
Na
Ne
He
I
Matrizes
9
78
52,7
1,525±0,04
1,404±0,05
0,220±0,02
0,317±0,03
Progênies
18
65
64,6
1,646±0,05
1,426±0,05
0,240±0,02
0,352±0,03
Tamanho amostral (n), número de locos amplificados (La), taxa de locos polimórficos (Lp), número de alelos
observados (Na), número de alelos efetivos (Ne), diversidade genética de Nei (He), índice de informação de
Shannon (I). Os valores representam a média ± erro padrão.
Tabela 5. Matriz de distância genética de Nei de nove árvores matrizes de M.
caesalpiniaefolia.
Matriz
1
2
3
4
5
6
7
8
1
-
2
0,180
-
3
0,182
0,140
-
4
0,120
0,220
0,160
-
5
0,197
0,200
0,243
0,100
-
6
0,182
0,160
0,167
0,180
0,205
-
7
0,227
0,240
0,167
0,140
0,231
0,256
-
8
0,218
0,256
0,149
0,205
0,298
0,254
0,179
-
9
0,151
0,140
0,269
0,200
0,205
0,231
0,333
0,298
9
-
Figura 1. Dendrograma UPGMA de distância genética de Nei para um conjunto de nove
árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia.
40
CONSIDERAÇÕES FINAIS
__________________________________________________________________________
A produção de sementes com alta qualidade fisiológica aliada à existência de
diversidade genética das nove árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia permite que as
mesmas sejam exploradas para produção de sementes, priorizando-se as mais divergentes
geneticamente e que produzem sementes de melhor qualidade.
41