Tabela 2. Frequência alélica de sintomáticos - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq,
CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
Período: 02/2015 – 07/2015
(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho):
Variabilidade genética de genes imunorrelevantes em populações amazônicas
Nome do Orientador: Eduardo José Melo dos Santos
Titulação do Orientador: Doutorado
Faculdade: Biomedicina
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Genética Humana e Médica
Título do Plano de Trabalho: Associação de polimorfismos do gene HLA-C com a
Dengue
Nome do Bolsista: Camily Érica de Freitas Rodrigues
Tipo de Bolsa:
(X) PIBIC/ CNPq
1. INTRODUÇÃO
A dengue é uma infecção por arbovírus globalmente importante transmitida pelo
mosquito do gênero Aedes que põe em risco aproximadamente 2,5 bilhões de pessoas e
representa um problema de saúde pública em rápido crescimento (Whitehorn, 2011).
Vários estudos já foram desenvolvidos para a identificação de determinantes
genéticos humanos de susceptibilidade à doença para a maioria dos patógenos,
incluindo muitos vírus. No entanto, esses determinantes ainda não foram tão bem
definidos.
Embora a maioria das infecções por vírus Dengue (DENV) possam resultar em
nenhum sintoma, uma parte dos casos progride para doença fatal causando
aproximadamente 20.000 a 25.000 mortes por ano. Todos os quatro sorotipos do DENV
causam alterações patológicas e sintomáticas significativas em humanos, variando de
uma doença febril aguda, febre dengue leve (DF) que pode evoluir para a febre
hemorrágica da dengue (FHD) e Síndrome do choque da dengue (SSD) (Fang et al.,
2012).
A evolução da doença é determinada por uma série de fatores que envolvem
processos biológicos, imunológicos e genéticos. No ser humano, a extensão da doença é
afetada por fatores do sangue periférico, incluindo a duração da replicação viral, a
expressão de citocinas e imunoativação e proliferação de células (Jain et al., 2014).
Além disso, polimorfismos genéticos relacionados à resposta imunológica podem ter
um efeito significativo sobre a doença. Nesse caso, a imunidade do hospedeiro tem
grande importância na patogênese da dengue.
Na resposta imunológica à infecção pelo vírus DENV, antígenos virais são
apresentados ás células T em associação com o Complexo Principal de
Histocompatibilidade (HLA) de classe I e II. Este complexo está inserido no primeiro
passo do reconhecimento celular e apresentação de antígenos virais às células
imunitárias. Diante dessa possibilidade, alguns estudos testaram possíveis associações
entre os fenótipos clínicos de Dengue e HLA, encontrando associação de alguns alelos
desses genes com a doença. (Jain et al., 2014; Rasmussem et al, 2014; Stephens, 2010;
Alencar et al, 2013; Monteiro et al, 2012).
Uma das hipóteses para a interação entre HLA e a susceptibilidade a infecção
pelo DENV é que a natureza e magnitude da resposta imune gerada pela apresentação
de antígenos através das moléculas de MHC de classe I poderiam contribuir para a
imunopatologia do DENV. Por exemplo, os polimorfismos nos alelos HLA podem
correlacionar com perfis de células T diferenciais que conduzem a respostas antivirais
variáveis (Coffey et al., 2009).
No entanto, a patogênese da dengue assim como os fatores que envolvem os
mecanismos de infecção e a interação destes com componentes do sistema imune do
hospedeiro ainda é pouco compreendida. Um melhor entendimento desse processo
poderia contribuir para estudos que buscam compreender as diferenças na
susceptibilidade do hospedeiro e a influência da genética sobre a gravidade da dengue,
além do desenvolvimento de vacinas.
2. OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
O presente trabalho possui como objetivo principal investigar a associação de
polimorfismos de genes HLA clássicos de classe I com a infecção pelo vírus da
Dengue (DENV).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) descrever a variabilidade do gene HLA–C nas amostras estudadas;
b) associar os polimorfismos com a suscetibilidade ao desenvolvimento da Dengue;
2. JUSTIFICATIVA
A dengue é uma doença emergente, causada pela infecção de variantes
sorológicas do Vírus da Dengue (DENV), a partir da transmissão por mosquitos do
gênero Aedes, cuja distribuição global é comparável com a do vetor da malária. Estimase que cerca de três bilhões de pessoas estejam morando em áreas de riscos para
transmissão epidêmica, e, portanto, a morbidade e mortalidade associadas a essa grave
infecção são considerados sérios problemas de saúde pública em países de regiões
tropicais e subtropicais (Vasilakis et al, 2012; Mustafa et al, 2011).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) avalia que a incidência cresceu trinta
vezes nos últimos cinquenta anos (Navarro-Sanchez et al., 2005), estimando que
atualmente mais de 2,5 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco e 50 a 100 milhões
de novas infecções devam ocorrer por ano no mundo. No Brasil, aproximadamente
800.000 novos casos foram registrados em 2011, com a maior taxa de incidência
ocorrendo na Região Amazônica (Norte do Brasil; Ministério da Saúde).
A infecção por DENV pode ser assintomática ou se manifestar em duas formas
clínicas da doença: Dengue Clássica (DC) caracterizada principalmente por febre alta de
início abrupto, cefaleia, mialgia, artralgia, dor retro orbitária, desconforto abdominal e
usualmente exantema (Martina et al., 2009); e Febre Hemorrágica por Dengue (FHD),
que pode eventualmente progredir para choque hipovolêmico chamado Síndrome do
Choque por Dengue (SCD), cujos sintomas são caracterizados por quadros
hemorrágicos como petéquias, epistaxe e sangramento gengival, associados a achados
laboratoriais tais como leucopenia e trombocitopenia, coagulopatia, aumento na
fragilidade capilar (Ministério da Saúde).
Até agora, a dengue é a doença viral mais importante transmitida por artrópode
em humanos, com uma estimativa de cem milhões de casos sendo que mais de
quinhentos casos ocorrem todo ano (Navarro-Sanchez et al., 2005). A primeira epidemia
de dengue no Brasil foi registrada em 1980, depois se tornou endêmica e espalhou-se
para todo o país. Durante as últimas duas décadas a incidência aumentou gradualmente
e têm recentemente se tornado alarmante, sobretudo desde a introdução de outros
sorotipos virais (Azeredo et al., 2005).
Quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4)
foram identificados até o momento e são transmitidos para os humanos pelo mosquito
Aedes. Até o presente, a distribuição global do Aedes é comparável com o vetor da
malária, e é estimado que cerca de três bilhões de pessoas estejam morando em áreas de
riscos para transmissão epidêmica. O vírus da dengue é do gênero flavirírus da família
Flaviviridae. O vírus é composto de três proteínas estruturais, designadas C (proteína
cerne), M (membrana proteica) e E (envelope proteico) (Navarro-Sanchez et al., 2005).
Os alvos primários do DENV durante uma infecção natural são células de
linhagem fagocítica mononuclear (monócitos, macrófagos e células dendríticas),
incluindo queratinócitos e células de Langerhans residentes na pele (Jessie et al., 2004;
Wu et al., 2000; Limon-Flores et al., 2005).
As células infectadas migram então para os linfonodos que recrutam monócitos e
macrófagos que são infectados e disseminam a infecção pelo sistema linfático. Sendo
assim, muitas células da linhagem mononuclear são infectadas, como monócitos
sanguíneos, células dendríticas mielóides, bem como macrófagos hepáticos e esplênicos
(Martina et al., 2009).
Os efeitos da infecção de diferentes células pelo DENV têm sido abordados em
vários estudos, dentre eles destacam-se as alterações de expressão gênica. Os estudos
iniciais descrevendo o perfil de expressão gênica reportaram um grande número de
genes super-expressos associados à infecção pelo DENV, porém com baixa
reprodutibilidade. Este fato é compreensível em vista da heterogeneidade de métodos
usados e do tipo de estudo (in vitro, usando linhagens celulares, ou in vivo usando
pacientes infectados). Um dos principais resultados presente na maioria dos estudos é a
alteração na expressão de genes relacionados à resposta imune inata, mais
especificamente à via do interferon (IFN) tipo I, onde vários genes cuja expressão é
induzida por interferon tiveram sua regulação alterada (Ekkapongpisit et al., 2007; Fink
et al 2007; Chen et al., 2008; Warke et al 2008; Becerra et al., 2009; Simmons et al
2007; Kruif et al 2008; Ubol et al., 2008).
A importância das células NK na infecção por DENV também é indiscutível,
não só pela sua estreita relação com a via do interferon, mas também pelo seu papel no
combate a infecções virais de uma maneira geral. A atividade destas células é regulada
por um delicado equilíbrio entre receptores estimulatórios e inibitórios de sua
superfície, que respondem a uma gama de ligantes, dentre os quais se destacam
moléculas HLA de classe I. De fato, estas moléculas foram reportadas como superexpressas em linhagens humanas K562 e THP-1, sugerindo que o aumento da
concentração destes ligantes resultaria em um maior estimulo de receptores inibitórios
com baixa afinidade aos ligantes, resultando em uma baixa sensibilidade a lise pelas
células NK (Hershkovitz et al., 2008).
Uma família de receptores importante para a regulação da função de células NK
são os Receptores Imunoglobulina-símilies de células NK (KIR). Apesar das
características estruturais comuns, cada um dos 14 receptores KIR já descritos em
humanos apresenta propriedades funcionais distintas no que diz respeito a
especificidade de ligação entre receptor KIR e seu ligante, o que influencia na
transdução de sinal, levando à transmissão ou de um sinal de inibição ou de ativação,
dependendo dos tipos de receptores e ligantes envolvidos na interação molecular.
Moléculas de MHC de classe I clássica e não clássica podem servir como ligantes
naturais para vários KIR (Korner et al., 2014).
O controle da ação de células NK é dependente, principalmente, da interação dos
seus receptores KIR inibitórios e ativatórios com ligantes HLA de classe I
correspondentes nas células alvo. Os receptores inibitórios impedem a ativação e ataque
do próprio organismo por essas células (Boyton & Altmann, 2007).
Outro estudo in vitro em células de tecidos musculares em cultivo primário
também detectou um aumento na expressão de moléculas HLA (do inglês Human
Leucocyte Antigen - Antígeno Leucocitário Humano) de classe I, porém este aumento
foi observado apenas nas células não infectadas vizinhas às células infectadas, as quais
não apresentaram aumento na expressão de HLA de classe I, configurando um possível
mecanismo de escape da lise por células NK in vivo (Warke et al., 2008).
No entanto, exceto por genes de algumas vias, como os da apoptose e outras
vias inflamatórias colaterais, a maioria dos genes descritos como tendo sua transcrição
aumentada em consequência da infecção pelo DENV teve pouca ou nenhuma
confirmação. Esta observação sugere que a maioria dos estudos de expressão gênica
superestima o número de genes envolvidos e evoca a necessidade de estratégias mais
acuradas de caracterização da expressão de genes associadas à infecção por DENV,
visto que a falta de acurácia pode levar a inferências distorcidas sobre os processos
envolvidos na resposta a infecção.
Uma alternativa seria uma visão mais integrativa da expressão gênica na
infecção por DENV, descrevendo não só os genes com expressão alterada como
também caracterizando os processos epigenéticos de regulação da transcrição
envolvidos, como a metilação e a expressão de microRNA (miRNA).
Durante a revisão na literatura nenhum estudo de padrões de metilação do DNA
em infecção por DENV foi encontrado e apenas um estudo reportando a expressão de
miRNA (Bruni et al., 2011).
Neste contexto surge a necessidade de se estudar de forma mais focada o papel
de genes HLA na infecção por DENV, uma vez que estes genes são ligantes de genes
KIR e fundamentais na resposta imune e na regulação direta ou indireta de vias de
interferon, desta forma complementando os estudos integrativos de metilação,
microRNA e expressão gênica.
Estudos desenvolvidos em diferentes populações identificaram associação entre
as diferentes manifestações clínicas de Dengue com diversos genes, dentre eles HLA,
pertencentes a um complexo gênico conhecido como Complexo Principal de
Histocompatibilidade (MHC). Nessa região estão localizados mais de 200 genes, dos
quais pelo menos 40% estejam envolvidos com o sistema imune (Consortium, 1999).
Os produtos dos genes HLA estão envolvidos na apresentação de antígenos
próprios e não próprios aos linfócitos T. Os genes HLA de casse I (HLA-A, -B e -C são
os mais conhecidos), que são expressos em todas as células nucleadas humanas,
apresentam antígenos processados pela via endógena a células TCD8+, enquanto que os
genes HLA de classe II (os mais comumente estudados são: HLA-DRB1, -DQB1 e DPB1), expressos principalmente em células apresentadoras de antígeno (APC), são
responsáveis pela apresentação de peptídeos, processados pela via celular exógena, às
células TCD4+. Esse sistema de processamento e apresentação de antígenos é
fundamental para a identificação e desencadeamento da resposta imunológica a
antígenos não próprios e/ou patogênicos (Stern et al. 1994; Snustad e Simmons 2001;
Abbas 2000).
Os perfis alélicos de genes HLA determinam o repertorio de peptídeos que são
apresentados às células T e que conduzem a diferença de expressão de citocinas que
induzirão a um tipo específico de resposta imunológica e, portanto, podem influenciar
na expressão clinica de algumas doenças, inclusive a Dengue.
Estudos desenvolvidos em diversas populações relatam associação de genótipos
ou alelos de HLA I e II tanto com FHD quanto com SCD (Alagarasu et al., 2013;
LaFleur et al, 2002; Malavige et al ,2011; Nguyen et al., 2008).
Para genes HLA de classe II os estudos são pouco congruentes na determinação
de alelos ou linhagem associada às formas clinicas de Dengue. Alagarasu et al., (2013)
identificaram uma associação do genótipo HLA-DRB1*07/*15 com FHD em pacientes
cubanos, mas não conseguiram detectar associação com nenhuma manifestação clínica e
HLA-DQB1. Já no estudo de LaFleur et al. (2002), observou-se o efeito protetor de
alelos da linhagem HLA-DRB1*04 no desenvolvimento de FHD. Malavige et al (2011)
observaram em pacientes do Sri Lanka a associação do alelo HLA-DRB1*08:01 com os
quadros de SCD.
Os alelos HLA-DRB1*15 mostrou-se associado com FHD em
pacientes venezuelanos (Nguyen et al., 2008), enquanto que para pacientes vietnamitas
com um quadro de SCD, o alelos associado foi o HLA-DRB1*09:01.
Os estudos desenvolvidos usando genes HLA de classe I também não encontram
congruência entre seus resultados. Sierra et al. (2007) encontraram os alelos HLA-A*31
e HLA-B*15 em alta frequência em pacientes com um quadro sintomático de Dengue.
Nguyen et al. (2008) observaram alta frequência de HLA-A*24 em pacientes com FHD
e SCD do Vietnã. Em 2009, Falcón-Lezama et al. verificaram que a presença do alelo
HLA-B*35 estava negativamente associado com as manifestações sintomáticas de
Dengue. Monteiro et al. (2012), estudando populações brasileiras, observaram uma
maior frequência de HLA-A*01 em pacientes com FHD.
Estudos epidemiológicos indicam que a combinação presença de certos
haplótipos KIR/HLA podem afetar o resultado da infecção por HIV-1. Embora os
mecanismos subjacentes permaneçam ainda desconhecidos, o acúmulo de evidências
sugere que as alterações de repertório e de funções de NK juntamente com genes KIR
podem desempenhar um papel importante (Korner et al, 2014).
Rizzo et al (2014) verificaram resultados que suportam o envolvimento de alelos
HLA- C na infecção por HPV e desenvolvimento de lesões benignas. Nesse estudo foi
observado um aumento na interação de pares HLA-C1 /KIR2DL2 e pares HLA-C1 /
KIR2DL3 em pacientes de alto risco de infectados por HPV. Estes dados sugerem
HLA-C e KIR como marcadores de risco para a infecção pelo HPV e evolução da lesão.
Mostra-se que os genes que codificam o receptor inibitório da célula NK,
KIR2DL3, do grupo 1 (HLA-C1) podem influenciar diretamente na resolução de
infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Os dados sugerem fortemente que as
interações das células NK inibitórias são importantes na determinação de imunidade
antiviral e que respostas inibitórias diminuídas conferem proteção contra o HCV
(Khakoo et al., 2004).
Portanto, os diversos estudos que buscam associação entre os genes HLA e as
diferentes manifestações de Dengue demonstram falta de concordância entre os
resultados. Isso sugere que o papel de genes HLA na suscetibilidade a esta doença
infecciosa ainda é desconhecida, provavelmente pelo número escasso de estudos e pela
utilização de metodologias diferentes na detecção dos alelos e identificação de
polimorfismos.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Amostras Estudadas
Foram investigados 48 indivíduos, acima de 18 anos, classificados em dois
grupos de acordo com critérios sorológicos e clínicos estipulados pela OMS e pelo MS.
O primeiro grupo denominado de grupo assintomático foi constituído de 15 indivíduos,
todos residentes em Belém há mais de cinco anos, que relataram nunca terem sido
acometidos pela dengue ou que possuíam sorologia negativa para anticorpos IgG e IgM.
Os 33 restantes constituem o grupo amostral de pacientes com DC, caracterizados
conforme os critérios abaixo descritos, dos quais treze foram diagnosticados com FHD.
Os pacientes com DC foram diagnosticados de acordo com sintomatologia
clínica e sorologia indicativa de Dengue, confirmada por testes confirmatórios e
determinação do tipo viral. Pacientes com FHD foram rastreados no banco de dados da
Secretaria Municipal de Saúde da cidade de Belém (SESMA), uma vez que a FHD é
uma doença de notificação compulsória e o registro ocorre apenas após confirmação
clínica e sorológica.
As amostras de sangue foram coletadas em colaboração com o Instituto Evandro
Chagas e foram processadas e tiveram o DNA isolado no Laboratório de Genética
Humana e Médica, coordenado pelo Professor Eduardo José Melo dos Santos durante
projetos anteriores.
O sequenciamento pela metodologia de Sanger dos exons 2 e 3 do gene HLA-C
das amostras foi realizada em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Diogo Meyer, da
Universidade de São Paulo, no projeto desenvolvido durante o Doutorado do aluno
Rodrigo dos Santos Francisco. Os cromatogramas foram enviados para o Laboratório de
Genética Humana e Médica e compuseram e presente relatório
4.2 - Edição de sequências e determinação dos haplótipos e alelos de HLA
1º Etapa- ANÁLISE DOS CROMATOGRAMAS
Os éxons 2 e 3 do gene HLA-C de 48 amostras (15 assintomáticos e 33
sintomáticos) foram analisados com o auxílio do programa HLA SBT uType versão 6.0
(Figura 1).
Figura 1: Imagem do programa utilizado na análise dos cromatogramas dos éxons 2 e 3 de HLA-C.
2° Etapa - ANÁLISE DAS AMBIGUIDADES
Com o auxílio da planilha de ambiguidades do IMGT/HLA (planilha versão 3.20.0
http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html) foram identificadas as ambiguidades
com sequencias idênticas nos exons 2 e 3 (ex: 04:01:01/126:01 = 04:01:01G), o que
possibilitou a resolução do genótipo (ver Tabela 1).
Para as ambiguidades fora dos exons 2, não é possível resolver sem que outro exon seja
sequenciado. Portanto, para as amostras com esse tipo de ambiguidade, não foi possível
identificar o genótipo.
Os resultados dessas análises estão sumarizados na tabela 1 (onde é possível ver as
ambiguidades e o resultado final para as ambiguidades idênticas no exon 2).
3.5- Análise estatística
A frequência dos alelos observados foi calculada por contagem direta. A analise
de equilíbrio de Hardy-Weinberg foi feita com o auxílio do programa Arlequin Versão
3.5.2.1
As comparações entre amostras controle e pacientes foram feitas por teste exato
de Fish com o auxílio do software BioEstat 2009 5.8.3.0
5. RESULTADOS
Das 48 amostras analisadas apenas 6 delas apresentaram resultado sem
ambiguidade para HLA-C. As outras 42 amostras apresentaram ambiguidades que
podem ser classificadas em dois tipo: (1) as ambiguidades de genótipo resultante de
igualdade nas sequencias nucleotídicas dos exons 2 e 3 do gene; as regiões que foram
analisadas nesse estudo; e (2) as ambiguidades fora dos exons 2 e 3, para as quais a
única forma de resolução seria o sequenciamento de exons adicionais.
Tabela 1. Tipos de ambiguidades
Ambiguidades dentro do exon 2 de HLA-C
n
ID
Resultado final
Combinação de alelos heterozigotos ambíguos
1
C*07:01:01G + C*08:37
C*07:01+C*08:37
C*07:06+C*08:37
C*07:18+C*08:37
2
C*03:04:01G + C*16:01
C*03:04+C*16:01
C*03:100+C*16:01
C*03:101+16:01
3
C*15:02:01G + C*15:17
C*15:02+C*15:17
C*15:13+15:17
4
C*06:02:01G + C*17:01:01G
C*06:02+C*17:01
C*06:02+C*17:02
C*06:02+C+17:03
C*06:46N+C*17:01
1
5
C*04:01:01G + C*07:02
C*04:01+C*07:02
C*04:09N+C*07:02
C*04:28+C*07:02
C*04:30+C*07:02
3
6
C*14:02:01G + C*14:02:01G
C*14:02+14:02
C*14:02+C*14:23
C*14:23+14:23
7
C*03:04:01G + C*03:04:01G
C*03:04+C*03:04
C*03:04+C*03:100
C*03:04+C*03:101
C*03:100+C*03:101
2
8
C*07:01:01G + C*07:01:01G
C*07:01+ C*07:01
C*07:01+C*07:06
C*07:01+C*07:18
C*07:01+C*07:52
1
9
C*01:02 + C*04:01:01G
C*01:02+C*04:01
C*01:02+C*04:09N
C*01:02+C*04:28
C*01:02+C*04:30
1
10**
11
**
12**
C*04:01+ C*04:01:01G
C*04:01+C*04:01
C*04:01+C*04:09N
C*04:01+C*04:28
C*04:01+C*04:30
4
C*06:02 + C*07:02:01G
C*06:02:01+ C*07:02
C*06:02+ C*07:50
C*06:02+ C*07:66
C*06:02+ C*07:74
1
C*03:04 + C*06:02:01G
C*03:04+ C*06:02
C*03:04+C*06:46N
C*03:04+C*06:55
13
C*02:02:02G + C*02:10
C*02:02:02+ C*02:10
C*02:10 + C*02:29
C*07:52+C*08:37
1
1
1
1
1
1
14
C*07:01:01G + C*17:01:01G
C*07:01+ C*17:01
C*07:01+ C*17:02
C*07:01+ C*17:03
C*07:06 +C*17:01
1
15**
C*03:04:01G + C*07:01:01G
C*03:04 + C*07:01
C*03:04 + C*07:06
C*03:04 + C*07:18
C*03:04 + C*07:52
1
16**
C*03:03 + C*07:01:01G
C*03:03+C*07:01
C*03:03+C*07:06
C*03:03+C*07:18
C*03:03+C*07:52
1
Ambiguidades fora do exon 2 e 3 de HLA-C dos
n
ID
Resultado final
1
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2
3
4
5
6
7
8
9
10**
11
12
13**
14**
10
15**
16**
17**
18**
19
Combinação de alelos heterozigotos ambíguos
C*03:02+C*06:02
C*03:02+C*06:46
C*03:02+C*03:46N
C*03:02+C*03:55
1
C*04:01+C*12:03
C*04:01+C*12:23
C*04:09N+C*12:03
C*04:09N+C*12:23
1
C*04:01+C*04:54
C*04:09N+C*04:54
C*04:28+C*04:54
C*04:54+C*04:79
1
C*03:04+C*04:03
C*03:28+C+04:06
C*03:100+C*04:03
C*03:101+C*04:03
1
C*14:02+C*17:01
C*14:23+C*17:01
C*14:23+C*17:02
C*114:23+C*17:03
1
C*04:01+C*04:36
C*04:09N+C*04:36
C*04:10+C*04:29
C*04:28+C*04:36
1
C*03:03+C*03:04
C*03:03+C*03:100
C*03:03+C*03:101
C*03:04+C*03:20N
1
C*07:02+C*07:17
C*07:17+C*07:50
C*07:17+C*07:66
C*07:17+C*07:74
1
C*05:01+C*15:07
C*05:03+ C*15:07
C*05:20 +C*15:21
C*05:37 +C*15:07
1
C*07:02+C*15:02
C*07:02+C*15:13
C*07:19+C*15:17
C*07:39+C*15:03
2
C*07:01+C*08:02
C*07:06+C*08:02
C*07:16 +C*08:28
C*07:18+ C*08:02
1
C*02:02+C*02:02
C*02:02+C*02:29
C*02:02+C*02:29
C*02:02+C*02:38N
1
C*01:02+ C*16:01
C*01:12+ C*16:18
C*01:25 +C*16:01
C*01:44 +C*16:01
1
C*03:03+C*07:02
C*03:03+C*07:50
C*03:03+C*07:66
C*03:03+C*07:74
1
C*07:02+C*15:02
C*07:02+C*15:13
C*07:19+C*15:17
C*07:39+C*15:03
1
C*04:01+C*07:01
C*04:01+C*07:06
C*04:01+C*07:18
C*04:01+C*07:52
1
C*03:03+ C*04:01
C*03:03+C*04:09N
C*03:03+ C*04:28
C*03:03+C*04:30
1
C*14:02+C*15:02
C*14:02+C*15:13
C*14:02+C*15:08
C*14:12+C*15:07
1
C*07:01+ C*14:02
C*07:01+ C*14:23
C*07:06+ C*14:02
C*07:06+ C*14:23
1
C*07:01+ C*12:03
C*07:01+ C*12:23
C*07:06+ C*12:03
C*07:06 +C*12:23
1
Após a resolução das ambiguidades, foi possível solucionar os genótipos de 6
indivíduos assintomáticos e 15 sintomáticos. Portanto, no total restaram 6 indivíduos
para compor a amostra controle e 21 indivíduos para compor a amostra de pacientes,
somando 27 amostras no total. A Tabela 2 mostra as frequências alélicas observadas
para a amostra de assintomáticos, cujo alelo mais frequente foi o C*04:01, seguido do
C*06:01. A Tabela 3 representa as frequências alélicas observadas entre as amostras
dos pacientes sintomáticos para a febre por dengue. Dentre os alelos mais frequentes,
observam-se os alelos C*04:01 e o C*07:01.
Tabela 2. Frequência alélicas dos assintomáticos
Alelo
C*06:02
C*03:04
C*04:01
C*02:10
C*03:02
C*03:03
C*07:02
C*07:01
Total
Freq. Absoluta
3
1
5
2
1
1
2
1
16
Freq. Relativa
0.1875
0.0625
0.3125
0.125
0.0625
0.0625
0.125
0.0625
Tabela 2. Frequência alélica de sintomáticos
Alelo
Freq. Absoluta
Freq. Relativa
C*04:01
C*03:04
C*07:01
C*14:02
C*02:02
C*08:02
C*15:02
C*06:02
C*01:02
C*08:37
C*15:17
C*16:01
C*17:01
C*07:02
C*02:10
C*17:01
C*07:64
C*07:07
C*05:20
C*16:02
C*07:27
C*02:42
9
5
4
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
40
0,225
0,125
0,1
0,05
0,05
0,05
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
0,025
Total
Tabela 3. Frequências alélicas das amostras totais
Dados deste Estudo
Dados do Allele Frequencies
Alelo
Frequencia
Relativa
C*04:01
0.25423
14
0,118 (0,005-0,378)
0,18 (0,137-0,223)
C*03:04
0.11864
6
0,094 (0,005 - 0,52)
0,199 (0,047-0,351)
C*07:01
0.11864
5
0,098 (0,00073-0,212)
0,156
C*06:02
0.06779
4
0,082 (0.002-0,24)
0,024
C*02:10
0.05084
3
0,01 ( 0,00007-0,83)
0,009
C*07:02
0.06779
4
0,133 (0,008-0,714)
0,141 (0,08-0,202)
C*02:02
0.03389
2
0,044 (0,00026-0,244)
0,033
C*08:02
0.03389
2
0,03 (0,00026-0,89)
0,075
C*14:02
0.03389
2
0,025 (0,003-0,94)
0,049 (0,75-0,024)
C*17:01
0.03389
2
0,024 (0001-0,143)
0,033
C*01:02
0.01694
1
0,082 (0,002-0,378)
0,028 (0,024-0,032)
C*02:42
0.01694
1
***
***
C*03:03
0.01694
1
0,053 (0,002-0,281)
0,066 (0,047-0,085)
C*05:20
0.01694
1
0,00001
***
C*07:27
0.01694
1
***
***
C*08:37
0.01694
1
***
***
C*15:02
0.01694
1
0,036 (0,002- 0,232)
0,022 (0,033-0,011)
C*15:17
0.01694
1
0,014 (0,00003-0,98)
***
C*16:01
0.01694
1
0,038 (0,000151-0,283)
0,024
C*16:02
0.01694
1
0,009 ( 0,00061-0,042)
0,005
Total
Frequencia Média e intervalo das
Absoluta
frequências 1
Média e intervalo
das frequências 2 *
54
*Dados das frequências alélicas dos alelos do gene HLA-DPB1 nas populações mundiais
obtidos através do site http://www.allelefrequencies.net/.
5.1. Equilíbrio de Hardy Weinberg
A Análise de equilíbrio de Hardy-Weinbeg foi feita com o auxílio do programa
Arlequin e o resultado apontou para um excesso de homozigotos significativo.( Het.
Observado: 0,61; Het. Esperado: 0,911: p valor = 0,00)
6. DISCUSSÃO
Estudos desenvolvidos em diversas populações relatam associação de genótipos
ou alelos de genes HLA de classe I e II em casos de infecção da dengue.
Para genes HLA de classe I os estudos são pouco congruentes na determinação
de um alelo ou linhagem associada às formas clinicas de Dengue. Sierra et al (2007),
observaram associação do alelo HLA-A*02 em cubanos com história de infecção clínica
da dengue enquanto que alelos HLA-CW * 04, HLA-CW* 07 CW, HLA-CW * 06, HLAC* 08, e HLA-CW * 16 são as especificidades HLA-C coincidentemente detectados em
frequências semelhantes superiores a 5% tanto em grupos controles como em grupos de
pacientes. No lócus de HLA-DRB1, 26 alelos foram identificados e as mais frequentes
foram HLA-DRB1 * 0802, HLA-DRB1 * 1406, HLA-DRB1 * 0407, HLA-DRB1 * 0701,
HLA-DRB1 * 0404, HLA-DRB1 * 0102, HLA-DRB1 * 1001, HLA-DRB1 * 0405 e HLADRB1 * 1602. No locus HLA-DQB1, foram identificados 11 alelos, sendo o mais
frequente HLA-DQB1 * 0301, HLA-DQB1 * 0302, HLA-DQB1 * 0501, HLA-DQB1 *
0402 e HLA-DQB1 * 0202 segundo Lezama (2009).
Foi observado a alta frequência do alelo HLA-C* 04:01 nas amostras estudadas,
porém, não existem até o momento trabalhos que associem este alelo a dengue e a
outras doenças infecciosas. No entanto, é importante ressaltar que o alelo HLA-C*
04:01 é bastante encontrado em populações da América do Sul observada na tabela 3
tanta para assintomáticos quanto para o grupo de sintomáticos.
O alelo HLA-C* 07 observado neste trabalho como frequente entre os
sintomáticos, sem apresentar significância (dados não mostrados) foi correlacionado em
vários trabalhos já realizados em associação com a dengue e observado em alta
frequência em pacientes (tabela 3). Alagarasu et al (2013) verificaram que o alelo HLACw * 07 significativamente maior nos casos de infecção da dengue. Nesse mesmo
trabalho, o alelo HLA-Cw * 03 também foi observado em pacientes com dengue, porém,
em menor frequência.
Lezama et al (2009) identificaram dezessete alelos do locus de HLA-Cw, sendo
o mais frequente o HLA-Cw * 0702, HLA-Cw * 0401, HLA-Cw * 0102, HLA-Cw *
0801, HLA-Cw * 0701, HLA-Cw * 0602, HLA-Cw * 0303, HLA-Cw * 0802 e HLA-Cw
* 1601 em pacientes com dengue em população de mestiços mexicana.
Sierra et al (2007) identificaram o alelo HLA-Cw * 07 em maior frequência em
estudos com casos DF e DHF. Embora a frequência de HLA-Cw * 07 foi maior nos
casos de FHD em comparação com casos DF, não foi significativa. A tendência de
maior frequência de HLA-Cw * 15 foi observada em casos de FHD, em comparação
com casos DF, embora a diferença não foi significativa.
A associação de dos genes HLA com arboviroses tem sido relatado em poucos
trabalhos. Um estudo bastante interessante mostra a relação dos genes HLA-C e KIR em
pacientes Gaboneses com Chikungunya ou dengue (Petitdemangue et al, 2014). Com
base nisso, observaram combinações de KIR2DL2 / DL3 que poderiam estar associados
com a progressão retardada para o desenvolvimento de inflamação crônica persistente
em doentes infectados com vírus da Chikungunya (CHIKV). Além disso, foi observado
um aumento significativo na frequência de HLA-C2 em pacientes com CHIKV
principalmente em indivíduos homozigóticos em comparação com vírus da dengue
(DENV).
Nesse mesmo estudo, foi identificado que a expansão de células NK
altamente funcionais e o desenvolvimento de uma forte resposta de memória adaptativa,
são independentes de uma via de KIR / HLA específica na infecção DENV2, mas
certamente associada a uma interação entre KIR2DL1 e HLA-C2, em resposta à infecção
CHIKV.
Neste trabalho, após a análise das sequências foi observado a presença de alelos
HLA nulos nas amostras estudadas. A presença desses alelos pode estar associado com
o excesso de homozigotos significativamente encontrados e podem complicar a
interpretação dos desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Segundo Elsner et al
(2004), a identificação de genes HLA pode ser realizada sorologicamente e a presença
de alelos nulos implica na falta de produto não detectável. Nesse estudo a especificidade
dos primers utilizados pode ter ocasionado a não identificação desses alelos ou até
mesmo um alelo desconhecido. Nesse sentido, a partir de sequenciamento de regiões de
éxons 2 e 3 incluindo regiões intrônicas assim como a utilização de primers que possam
amplificar regiões até então não identificadas.
Diante do exposto, consideramos o trabalho pertinente para o cenário de estudos
que vêm buscando uma resposta para o desenvolvimento da Dengue. Porém, é
necessário ampliar o número amostral para melhor entendimento do desenvolvimento
da doença e sintomas, além de realizar o sequenciamento de regiões adicionais do gene
para esclarecer as questões relacionadas a alelos novos.
7. CONCLUSÃO
Neste trabalho não foi encontrada associação de polimorfismos de genes HLA- C
clássicos de classe I com a dengue. No entanto, dentre as amostras estudadas o alelo
encontrado mais frequente foi HLA-C*04:01, seguido do alelo HLA-C*07:01. Não foi
observada associação dos genes HLA-C entre os grupos estudados.
8. CONSIDERAÇÕES
Para o presente trabalho foram realizadas na etapa de padronização de Reação
em cadeia da polimerase (PCR) para HLA-B, 30 reações de PCR, 6 reações de
sequenciamento e analise/interpretação dos cromatogramas gerados.
O sequenciamento dos exons 2 e 3 foi feito em colaboração com a Universidade
de São Paulo, em um projeto desenvolvido com o Prof. Dr. Diogo Meyer durante o
doutorado de Rodrigo dos Santos Francisco. Isto foi possível visto que outras análises
para outros trabalhos já haviam sido realizadas no Laboratório de Genética Humana e
Médica. Os cromatogramas gerados na USP foram analisados por mim e os resultados
das análises compõem esse relatório.
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