Efeito do triterpeno lupano Incorreta - pgbioexp

UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
NÚCLEO DE SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
Efeito do triterpeno lupano 3β, 6β, 16β-trihidroxilup-20(29)-ene isolado de Combretum
leprosum sobre as células mononucleares humanas do sangue periférico.
Fabianne Lacouth da Silva
Porto Velho
2012
FABIANNE LACOUTH DA SILVA
Efeito do triterpeno lupano 3β, 6β, 16β-trihidroxilup-20(29)-ene isolado de
Combretum leprosum sobre as células mononucleares humanas do sangue
periférico.
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-graduação
em
Biologia
Experimental, Núcleo de Saúde, da
Universidade
Federal
de
Rondônia,
como requisito para obtenção do título
de Mestre.
Orientadora: Dra Juliana Pavan Zuliani
PORTO VELHO/RO
2012
FABIANNE LACOUTH DA SILVA
Efeito do triterpeno lupano 3β, 6β, 16β-trihidroxilup-20(29)-ene isolado de
Combretum leprosum sobre as células mononucleares humanas do sangue
periférico.
COMISSÃO EXAMINADORA
____________________________________________________
Orientadora - Dra Juliana Pavan Zuliani
____________________________________________________
Dr. Fernando Berton Zanchi
____________________________________________________
Dr. Eduardo Rezende Honda
Porto Velho,________ de ______________________ de _______.
Resultado ________________________________________________
Ao meu pai Antônio Lopes da Silva(in memoriam)
exemplo de vida e caráter, minha gratidão e amor eterno .
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Dra. Juliana Pavan Zuliane pelo seu profissionalismo e
dedicação a pesquisa, pela valiosa oportunidade concedida, amizade, confiança e
orientação.
Ao Prof. Dr. Valdir Fancundo pelo fornecimento do triterpeno e pela
colaboração.
Ao Prof. Dr. Fernando Berton Zanchi pela imensa colaboração com seus
conhecimentos de bioinformática e principalmente pela paciência e atenção nos
momentos em que precisei.
Ao Prof. Dr. Eduardo Honda pelo importante auxilio prestado, atenção e
paciência sempre.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Stábeli e à Profa. Dra. Izaltina Jardim pela atenção e
colaboração com suas considerações.
À minha amiga Caroline Vargas Xavier pela amizade e companheirismo nos
vários momentos difíceis e alegres, dentro e fora do laboratório, por me escutar, ajudar e
ter paciência. Sua ajuda foi fundamental. Valeu alma-gêmea!
À Sulinha (sub-chefe) pela amizade, bom humor sempre, atenção, paciência para
me ensinar os cálculos e sábia orientação em todos os momentos.Tem minha
admiração!
À Juliana Loca pela amizade, carinho, ajuda e paciência desde que iniciei no
laboratório.
Ao amigo Onássis Boeri por ser sempre prestativo e pelo tempo despendido me
ajudando nos experimentos até altas horas. Sem palavras!
Às amigas Nery Monteiro e Adriana Pontes pelo auxilio no laboratório e
amizade.
À Leda Fabiélen por ser sempre prestativa e me ajudar com a complicada
química.
Às amigas Elis, Wanne e Aline por me ajudarem sempre que precisei e
principalmente pelos momentos de descontração.
À “galera” do CeBio, Kayano, Leandro, João Gabriel, Toninho por serem
sempre atenciosos.
A minha mãe pelo amor e apoio incondicional em tudo na minha vida, por me
dar força e não me deixar desistir.
Aos meus irmãos, Aurimar, Antônio, Almir e Alcimar pelo incentivo, apoio e
por torcerem sempre por mim.
Aos meus sobrinhos pelo carinho, apoio e momentos de alegria.
MUITO OBRIGADA!! 
RESUMO
A espécie vegetal Combretum leprosum Mart., conhecida como mofumbo, é
utilizada popularmente como agente antiinflamatório, analgésico e para o tratamento de
feridas. Dessa espécie é possível isolar três triterpenos: 3β, 6β, 16β-triidroxilup-20(29)eno (TTHL) denominado lupano, ácido arjunólico e ácido mólico. O objetivo deste
trabalho, através de ensaios pré-clínicos, foi avaliar o efeito do triterpeno lupano sobre a
citotoxicidade celular, a capacidade de ativação da função celular através da produção
de TNF-α, importante citocina inflamatória, e de IL-10 citocina imunoregulatória, assim
como o efeito do composto orgânico sobre a ação da enzima topoisomerase I e II. Para
isso, foram obtidas células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e a
citotoxicidade celular foi avaliada pelo método de MTT em três tempos diferentes (1, 15
e 24 horas) e, nas concentrações de 12µg/mL, 6µg/mL, 3µg/mL, 1,5µg/mL, 0,7µg/mL e
0,3µg/mL de triterpeno lupano. A função celular foi avaliada através da produção de
TNF-α e IL-10 por PBMC quantificada por ensaio imunoenzimático específico. A
atividade das topoisomerases foram avaliadas por ensaios biológicos e por docking
molecular. Os resultados obtidos mostraram que o triterpeno lupano nas concentrações
abaixo de 1,5µg/mL não foi tóxico para as células, nos períodos de tempo estudados.
Além disso, o triterpeno lupano não foi capaz de ativar a função celular, pois não
alterou a produção de IL-10 e de TNF-α. Quanto aos estudos sobre a atividade das
topoisomerases, os dados demonstraram que o triterpeno não interfere na ação das
enzimas I e II humana. Com base nos resultados pré-clínicos obtidos neste trabalho
podemos destacar que o triterpeno lupano possui moderada citotoxicidade celular, não
induz a produção de IL-10 e de TNF-α, e não age sobre as topoisomerases humanas.
Tomados em conjunto, os dados presentemente obtidos sugerem que o triterpeno lupano
pode ser uma importante ferramenta biotecnológica.
Palavras chave: Combretum leprosum, triterpeno lupano, PBMC, topoisomerase.
ABSTRACT
The plant Combretum leprosum Mart., popularly known as mofumbo, is used in
folk medicine as anti-inflammatory, analgesic and for the treatment of wounds. From
this specie is possible to isolate three triterpenes: 3 β 6 β, 16 β-triidroxilup-20 (29)-ene,
called lupane, acid arjunolic and acid molic. In this work, through pre-clinical tests, was
evaluated the effect of lupane triterpene on the cytotoxicity, the ability to activate
cellular function by production of TNF-α, important inflammatory cytokine and, the
immuno regulatory cytokine IL-10 as well as the effect of organic compounds on the
action of the enzyme topoisomerase I and II. To this, were obtained peripheral blood
mononuclear cells (PBMC) and cytotoxicity was assessed by the MTT method at three
different times (1, 15 and 24 hours), and the concentrations used were 12μg/mL,
6μg/mL, 3μg/mL, 1.5 mg/mL, 0.7 mg/mL and 0.3μg/mL of triterpene lupane. A cell
function was assessed by production of TNF-α and IL-10 by PBMCs quantified by
specific enzyme immunoassay (ELISA). The activity of topoisomerases were assayed
for biological assays and molecular docking. The results obtained showed that the
lupane triterpene concentrations below 1.5 μg/mL were not toxic to the cells, at the
periods studied. Furthermore the lupane was unable to activate the cellular functions, it
does not alter the production of IL-10 and TNF-α. Regarding studies on the activity of
topoisomerases, the data showed that the triterpene not interfere in the action of
enzymes I and II. Based on preclinical results obtained in this study we highlight that
the compound has moderate cytotoxicity, does not induce the production of IL-10 and
TNF-α, and not acting on human topoisomerases. Taken together, the data suggest that
the presently obtained triterpene lupane can be an important biotechnological tool.
Keywords: Combretum leprosum, lupane triterpene, PBMC, topoisomerase.
LISTA DE ABREVIATURAS
AP-1: Proteína ativadora 1
BSA: Soro albumina bovina
BSTFA-N: O(trimetilsilil) trifluoracetamida
CGAR/EM: Cromatografia gasosa de alta resolução/espectrometria de massa
CLFE: Extrato Etanólico das Folhas de Combretum leprosum;
CLFEC: Eluato de Acetato de Etila do Extrato Etanólico de Combretum leprosum;
CLFEH: Eluato Hexânico do Extrato Etanólico de Combretum leprosum;
CLFEM: Eluato Metanólico do Extrato Etanólico de Combretum leprosum.
DL50: Dose letal em 50%
DMSO: Dimetil sulfóxido
DO: Densidade óptica
E.P.M: Erro padrão da média
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra:acético
EIA: Ensaio imunoenzimático
GM-CSF: Fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos
IKK: IKB quinase
IL-10: Interleucina 10
IL-2: Interleucina 2
IL-8: Interleucina 8
INFγ: Interferon gama
IPEPATRO: Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais
KOH: Hidróxido de potássio
LPQPN: Laboratório de Química de Produtos Naturais
LPS: Lipopolissacarídeo
MAPK: Quinases ativadas por mitógenos
MPO: Mieloperoxidase
MTT: 3-[4-5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Brometo tiazoil
azul tetrazólio)
NBT: Nitroblue tetrazolium chloride (Cloreto azul de nitrotetrazólio)
NF-Κb: Fator de transcrição nuclear
NK: Natural Killer
PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells (Células mononucleares do sangue
periférico)
PBS: Phosphate buffered saline (solução salina tamponada com fosfato)
PMA: phorbol miristato acetato (acetato de forbol miristato)
PMSF: Fenilmetilsulfonilflúor
RMN: Ressonância Magnética Nuclear
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
TMB: 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina
TMCS: trimetilclorosilano
TNFR 1: Receptor do fator de necrose tumoral tipo 1
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
TNRF 2: Receptor do fator de necrose tumoral tipo 2
TOPO I: DNA topoisomerase I
TOPO II: DNA topoisomerase II
TOPO III: DNA topoisomerase III
TRL4: Receptor Toll like 4
TTHL: Triterpeno lupano 3β,6β,16β-trihidroxilup-20(29)-ene
LISTA DE FIGURAS
Figuras
Pág.
Fig 1: Combretum leprosum Mart..............................................................................
13
Fig 2: Estrutura molecular do triterpeno 3 β,6 β, 16 β-triidroxilup-20(29)-eno......... 15
Fig 3: Problemas topológicos associados á abertura da forquilha de replicação.......
20
Fig 4 A: Citotoxicidade celular do triterpeno lupano sobre PBMCs humanos
avaliado em 1hora....................................................................................................... 31
Fig 4 B: Citotoxicidade celular do triterpeno lupano sobre PBMCs humanos
avaliado em 15 horas..................................................................................................
31
Fig 4 C: Citotoxicidade celular do triterpeno lupano sobre PBMCs humanos
avaliado em 24 horas..................................................................................................
31
Fig 5 A: Efeito do triterpeno lupano sobre a produção de IL-10 por PBMCs
humanos......................................................................................................................
32
Fig 5 B: Efeito do triterpeno lupano sobre a produção de TNF-α por PBMCs
humanos......................................................................................................................
32
Fig 6 A: Avaliação da atividade da enzima topoisomerase I.................................
34
Fig 6 B: Avaliação da atividade da enzima topoisomerase II................................
34
Fig 7 A: Docking molecular da interação da topoisomerase I e triterpeno lupano
(visão total).................................................................................................................
36
Fig 7 B: Docking molecular da interação da topoisomerase I e triterpeno lupano
(visão localizada do sítio ativo)..................................................................................
36
Fig 8: Docking molecular da interação da topoisomerase II e triterpeno lupano....... 37
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................
12
1.1 Combretum leprosum Mart.......................................................................
12
1.2 Triterpeno.................................................................................................. 15
1.3 Leucócitos do sangue periférico...............................................................
17
1.4 DNA-Topoisomerases............................................................................... 19
2. OBJETIVOS.........................................................................................................
24
2.1 Objetivos gerais........................................................................................
24
2.2 Objetivos específicos................................................................................
24
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................
25
3.1 Triterpeno lupano...................................................................................... 25
3.2 Comissão de ética.....................................................................................
25
3.3 Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)......
25
3.4 Teste de citotoxicidade por MTT.............................................................. 26
3.5 Avaliação da produção de citocinas IL-10 e TNF-α................................. 27
3.6 Extração das topoisomerases I e II a partir de PBMCs............................. 28
3.7 Teste da atividade da enzima topoisomerase I e II...................................
28
3.8 Docking molecular....................................................................................
29
3.9 Análise estatística...................................................................................... 30
4. RESULTADOS.....................................................................................................
31
4.1 Avaliação da citotoxicidade celular por MTT........................................... 31
4.2 Avaliação da produção de IL-10 e TNF-α................................................
32
4.4 Avaliação da atividade das enzimas topoisomerase I e II......................... 33
4.5 Docking Molecular.................................................................................... 35
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................
38
6. CONCLUSÃO....................................................................................................... 45
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 46
8. ANEXOS................................................................................................................ 55
1. INTRODUÇÃO
As plantas constituem uma importante fonte de novos fármacos e apresentam-se
como uma alternativa viável para o tratamento de várias doenças no contexto da
medicina (SOERJATO, 1996). Esse é um costume praticado há vários séculos, pois
várias civilizações, tais como a da antiga Grécia, Roma, China, e antigo Egito, os quais
utilizavam as plantas para combater diversos tipos de doenças. Durante a Idade Média
atribuía-se a propriedade “curativa” dessas plantas à existência de substâncias presentes
nelas, de acordo com o princípio dos cinco elementos essenciais para a sobrevivência
(água, terra, ar, fogo e a Quinta Essência) (NORTON, 2005). Com o advento da
química orgânica tornou-se possível purificar e isolar, a partir de extratos brutos, as
substâncias responsáveis pelo efeito biológico predominante, as quais foram
denominadas de “princípios ativos” (CHESNUT, 1902).
Uma variedade de compostos orgânicos é produzida pelos vegetais, os quais não
parecem ter função direta no seu crescimento e desenvolvimento, porém protegem as
plantas contra os herbívoros e microrganismos, agindo também como atrativos (cor,
odor ou sabor) para animais polinizadores e dispersores de sementes. Tais substâncias
são chamadas de produtos naturais, produtos secundários ou metabólitos secundários
(TAIZ & ZEIGER, 2009).
Embora um considerável número de fármacos atualmente disponível para o
tratamento de várias enfermidades seja derivado de produtos naturais, apenas uma
pequena porcentagem das cerca de 250 mil espécies de plantas tem sido investigada
com relação as suas propriedades biológicas, químicas e farmacológicas (SOERJATO,
1996).
1.1 Combretum leprosum Mart.
Combretaceae é uma grande família com pelo menos 600 espécies (EXELL,
1970; HUTCHINGS et al., 1996) distribuídas em 18 gêneros, sendo os mais comuns os
gêneros Combretum, com aproximadamente 370 espécies, e Terminalia com
aproximadamente 200 espécies (LAWRENCE, 1951). O gênero Combretum encontrase distribuído na Ásia, África e nas Américas com hábito arbóreo, arbustivo ou lianas e
inflorescências em espigas, racemos ou panículas (BARROSO et al., 1984) (Figura 1).
Figura 1. Combretum leprosum Mart. Fonte: CNIP/APNE (2008)
No Brasil, a espécie Combretum leprosum Mart., conhecida popularmente como
cipoaba, mofumbo e mufumbo, é vegetação de caatinga e tem a sua área de maior
incidência entre o estado do Piauí até a Bahia (PIO CORREA, 1984), sendo esta espécie
a de maior incidência do estado do Ceará (FACUNDO et al., 1993). Nesta região, o
extrato de partes desta planta, como raízes, flores e folhas, é utilizado popularmente no
tratamento de feridas, em hemorragias ou como sedativo (LIRA et.al., 2002).
Em várias partes da África do Sul, espécies de Combretaceae são utilizadas para
fins medicinais. Estes incluem o tratamento de dores abdominais, dores nas costas,
tosse, resfriados, conjuntivites, diarréia, dores de ouvidos, febre, dores de cabeça,
combate a lombrigas, infertilidade na mulher, lepra, pneumonia, mordida de cobra e
escorpião, inflamação, inchaço causado pela caxumba, sífilis, dor de dente e fraquezas
em
geral
(WATT
&
BREYER-BRANDWIJK,
1962;
KOKWARO,
1976;
HUTCHINGS et al., 1996; VAN WYK et al., 1997).
Espécies do gênero Combretum são largamente usadas na medicina popular para
o tratamento de hepatites, malária, infecções respiratórias e câncer em diferentes partes
da Ásia e África (PETTIT et al., 1995) Na medicina popular da África pelo menos 24
espécies deste gênero são extensamente usadas para problemas no coração e tratamento
de doente mental (WATT & BREYER-BRANDWIJK, 1962). As folhas e a casca de
Combretum são predominantemente usadas. Os frutos não são característicos na
medicina por ter apresentado toxidade para humanos (ROGERS & VEROTA, 1996).
Várias investigações sobre a atividade antimicrobial de espécies de Combretum
têm sido realizadas nos últimos anos. Breytenbach e Malan (1989) constataram
atividade antimicrobial nas folhas e frutos de Combretum zeyhery. Uma nova
investigação foi realizada com o material das folhas e nesta pesquisa foram isolados e
identificados três compostos bactericidas.
McGaw et al., 2001 investigaram a atividade anti-inflamatória, antishistosomal,
antihelmíntico e DNA-damaging de extratos de folhas de 20 espécies de Combretum
usadas na medicina tradicional no Sul da África. Várias espécies exibiram significante
atividade em mais de um ensaio. O Combretum apiculatm foi altamente ativo no teste
anti-inflamatório, antihelmíntico e DNA-damage. Combretum mossambicense também
apresentou uma boa atividade, sendo efetivo nos testes anti-inflamatório, antihelmíntico
e DNA-damage. Combretum hereroense apresentou resultados promissores nos ensaios
antihelmínticos e DNA-damage. Combretum imberbe e Combretum molle apresentaram
atividades anti-inflamatória e antishistosomal.
Diante desses efeitos diversos pesquisadores avaliaram a atividade biológica
deste gênero e demonstraram que alguns extratos, assim como algumas substâncias
isoladas, de espécies diferentes de Combretum apresentaram uma ampla atividade
biológica incluindo atividade antiviral (ALI et al., 2002; ELLOF et.al.2008),
antibactericida (ALI et.al., 2002; MARTINI et al., 2004), atividade contra protozoários
(ASRES et al., 2001; ANCOLIO et al., 2002), antineoplásica (NABHA et al., 2000;
NAM et.al., 2003), analgésica (LIRA et al., 2002; PIETROVSKI et.al., 2006) antiinflamatória e hepatoprotetora (ADNYANA, et al., 2001).
Facundo et al. (1993) isolaram de raízes de C.leprosum, três triterpenos: 3 β,6 β,
16 β-triidroxilup-20(29)-eno (TTHL) (Figura 2), denominado lupano, ácido arjunólico e
ácido mólico. Estudos feitos com o extrato etanólico das raízes de C. leprosum por
CGAR-EM e após derivação com BSTFA/TMCS (1%) em piridina mostraram que 80%
do extrato são compostos por monossacarídeos, 5% por oligossacarídeos, 3% ácidos
graxos e, os triterpenos, apenas 10%, sendo que, entre os 3 triterpenos isolados, o ácido
arjunólico estava em maior quantidade (65%) (FACUNDO et al., 2005).
C30H50O3
Figura 2. Estrutura molecular do triterpeno 3 β, 6 β, 16 β-triidroxilup-20(29)-eno (TTHL)
(FACUNDO, et al., 1993).
Angeh et al. (2007) demonstraram que triterpenos isolados do extrato das folhas
de
Combretum
imberbe
apresentaram
forte
atividade
antibacteriana
contra
Staphylococcus aureus e Escherichia coli; atividade antiiflamatória ao inibirem de
maneira bastante potente a enzima 3a-hidroxiesteróide desidrogenase e ainda, uma
moderada atividade anti-proliferativa e citotóxica contra células das linhagens K-562,
L-929 e HeLa.
Pietrovski et al. (2006) avaliaram a atividade antinociceptiva do extrato
etanólico das flores de C. leprosum e, também, do composto isolado TTHL e
observaram que o extrato foi capaz de inibir a nocicepção em diferentes modelos como
a hiperalgesia visceral induzida pelo ácido acético, a hiperalgesia induzida pelo calor
(placa quente), e ainda, a hiperalgesia neurogênica e inflamatória induzida por
formalina, capsaicina e glutamato.
Corroborando com o uso popular, o extrato das frutas de C. leprosum apresentou
propriedades antiofídicas ao inibir a atividade proteolítica do veneno de Bothrops
jararacussu e também a hemorragia causada pelo veneno de Bothrops jararaca, o que
demonstra a habilidade da espécie em inibir importantes atividades causadas pelo
veneno de Bothrops (FERNANDES et al., 2007).
1.2 Triterpeno
Os constituintes odoríferos de uma planta podem ser concentrados na forma de
“óleo essencial” pelo aquecimento brando da matéria vegetal, realizado desde a
antiguidade. Após investigações, que se iniciaram no século XIX, descobriu-se alguns
hidrocarbonetos isoméricos de fórmula C10H16, a que se chamou de terpenos.
Considerando-se a unidade terpênica como sendo de dez átomos de carbono, tem-se a
nomenclatura: monopernos, 10 carbonos; sesquiterpenos, 15 carbonos; diterpenos, 20
carbonos; triterpenos, 30 carbonos (ALLINGER et al., 1976).
Assim sendo, os triterpenos são assim classificados por possuírem trinta átomos
de carbono ou 6 unidades de isoprenos. Esses compostos cíclicos vêm sendo estudados
devido as suas atividades biológicas e compreendem por volta de 4000 diferentes
compostos dentre eles: triterpenóides livres, triterpenos glicosídicos (saponinas),
“phytosteróides” e/ou seus precursores (CROTEAU & FAGERSON, 1974; KRISTO et
al., 2001, URECH et al., 2005). Sendo que a maioria dos triterpenos pentacíclicos são
pertencentes às subclasses ursano, oleano e lupano (XU et.al., 2004).
Triterpenóides ou glicosídicos esteróidais, conhecidos como saponinas, são
amplamente distribuídos na natureza, particularmente em plantas. Nas últimas duas
décadas diversas pesquisas vêm sendo realizadas, atribuindo a esses compostos uma
ampla atividade biológica como: hemolítico, anti-inflamatório, antibactericida,
antifúngico e antiviral (FRANCIS et. al., 2002; DZUBACK et. al., 2005). Francis et al.
(2002) reportaram que as saponinas têm potencial anti-tumoral, tanto na quimioterapia
quanto na prevenção. A atividade quimiopreventiva das saponinas inclui inibição da
mutagênese e inibição da progressão do tumor.
O fato dos triterpenos serem compostos naturais biologicamente ativos é
promissor para a indústria farmacêutica, desta forma pesquisas vêm sendo realizadas
com o intuito de buscar entre os triterpernos uma droga em potencial. Dentre esses
estudos, alguns já relataram que os triterpenos possuem atividade anti-inflamatória,
analgésica, antimicrobiana, imunoreguladora e leishmanicida (DZUBAK et. al, 2005;
PIETROVSKI et.al., 2006; TELES et al., 2011).
Dentre os triterpenos, os pentacíclicos da subclasse lupano, pode induzir
melanogênese em células de melanoma em camundongos, ambos os efeitos são
característicos na diferenciação de células de melanoma, porém eles são regulados
separadamente através da ativação da sinalização de p38MAPK e inibição da
sinalização de Rho, respectivamente (HATA et.al., 2006).
O efeito anti-inflamatório de triterpenóides tem sido descritos devido à
habilidade em inibir a enzima lipoxigenase e a elastase leucocitária humana (human
leukocyte elastase), além do potencial de modulação da resposta imune por afetar o
sistema complemento e a produção de anticorpos (WASSERMAN, 1983). O ácido
ursólico, composto amplamente distribuído em espécies do reino vegetal, apresenta
amplo aspecto anti-inflamatório, inibindo a elastase leucocitária humana (YING et.al.,
1991), proteína lisossomal estocada em grande quantidade nos grânulos dos
polimorfonucleares. Por décadas esta enzima tem sido estudada devido ao seu potencial
de destruição tecidual em alguns quadros inflamatórios, como no enfisema pulmonar e
na artrite reumatoide (DEWALD, et al., 1975; JONOFF, 1985).
1.3 Leucócitos
As células do sistema imune estão presentes como células circulantes no sangue
e na linfa. A organização anatômica destas células e a sua capacidade de circular e de
serem transportadas entre o sangue, a linfa e os tecidos são de importância crítica pra a
geração de respostas imunes, sendo essas respostas dependentes das propriedades de
suas células e tecidos constituintes (ABBAS et al., 1998).
As células do sistema imune incluem os linfócitos, células especializadas que
capturam e apresentam antígenos. Estas células possuem receptores específicos para
antígenos e por isso são responsáveis pela imunidade adquirida. Os linfócitos B
participam da imunidade humoral, pois são capazes de produzir anticorpos. Os
linfócitos T, da imunidade celular. As células natural killer (NK), são uma terceira
classe de linfócitos, os quais não expressam receptores antigênicos distribuídos
clonalmente encontrados somente nas células B e T, e participam como mediadoras na
imunidade natural. As células efetoras do sistema imune consistem de linfócitos e
outros leucócitos, como granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e de
macrófagos (ABBAS & LICHTMAN, 2007).
Frente a estímulos de diversas naturezas, como, por exemplo, um patógeno ou
substância desconhecida, o sistema imunológico responde com uma reação inflamatória,
mediada por substâncias químicas liberadas pelas células que irão promover diversas
alterações celulares e vasculares (RYAN & MAJNO, 1977). Dentre essas substâncias,
moléculas não antígeno-específicas ou citocinas são responsáveis por regular a atividade
dos linfócitos e monócitos. Estas células ativadas produzem citocinas que participam da
ativação de outras células do sistema imune, assim como da proliferação e
diferenciação, através da interação com receptores de membrana celular (SIGAL &
RON, 1994).
As citocinas constituem um grande número de proteínas que atuam como
mediadores da imunidade e da inflamação, tais como: crescimento e ativação celular,
inflamação, imunidade, reaparo tecidual, fibrose e morfogênese (ROITT et al., 1997).
O macrófago é a principal célula produtora de citocinas na resposta imune inata,
enquanto na resposta adaptativa, as células T tem participação fundamental. A primeira
citocina a ser produzida pelas células T CD4+ é a IL-2, também chamada de fator de
crescimento de célula T, que por ter ação autócrina estimula a sua própria proliferação.
As células T CD4+ podem, ainda, produzir grupos distintos de citocinas que diferenciam
as células T CD4+ efetoras em subpopulações Th1 e Th2 (ABBAS & LICHTMAN,
2007).
A IL-10, conhecida por sua ação inibitória na síntese de citocinas, inibe a
produção de IFN-γ, assim como a apresentação de antígenos e a produção de IL-1, IL-6
e TNF-α pelos macrófagos, e tem um papel importante na ativação de células B (ROITT
et al., 1997). As principais células produtoras de IL-10 são os monócitos e macrófagos
assim como os linfócitos T. No entanto, outras células também são capazes de sintetizar
IL-10, como as células dendríticas, linfócitos B, células T citotóxicas, células NK,
mastócitos, neutrófilos e eosinófilos (CHOMARAT et al., 1993; BLANCO et al.,
2008), em determinadas situações que vai depender do tipo de estímulo, do tecido
afetado e da fase do processo inflamatório. Monócitos e macrófagos secretam IL-10
após ativação por mediadores endógenos e exógenos, como por exemplo, o LPS, através
da ligação ao receptor Toll like 4 (TRL4). Durante o processo de clearance de células
apoptóticas, macrófagos e monócitos produzem IL-10, em um processo que depende do
CD36 e da p38 MAP kinase (COUPER et al., 2008).
O TNF-α, que tem como fontes celulares macrófagos e linfócitos, age sobre
fibroblastos e endotélio induzindo a inflamação, catabolismo (caquexia), fibrose, e
induz a produção de outras citocinas (IL-10, IL-6, GM-CSF) e expressão de moléculas
de adesão (ROITT et al., 1997). Estudos demonstraram que o TNF-α é membro de uma
grande família conhecida como superfamília TNF/TNFR, a qual é composta por mais de
40 membros (PARAMESWARAN & PATIAL, 2010). O TNF-α, a IL-1 e as
quimiocinas são as principais citocinas envolvidas no recrutamento dos neutrófilos e
monócitos para os locais de infecção. Em altas concentrações, o TNF-α produz
trombose sanguínea e reduz a pressão arterial por meio de uma combinação de
contratilidade miocárdica reduzida e vasodilatação. O LPS, produto de bactérias gramnegativas, induz a produção em excesso de TNF-α em infecções disseminadas graves e
acarreta diversas manifestações clínicas, deixando o paciente em um quadro grave
conhecido por choque séptico. O choque séptico se caracteriza por hipotenção arterial
(choque), coagulação intravascular disseminada e distúrbios metabólicos (ABBAS &
LICHTMAN, 2007).
As células do sistema imune possuem receptores próprios para citocinas, através
dos quais ocorre a ativação dos fatores de transcrição como o fator de transcrição NFκB e proteína ativadora-1 (AP-1) e também de proteínas quinases como a proteína
quinase C (PKC) e quinases ativadas por mitógenos (MAPK) que, por sua vez irão
regular a expressão de genes alvo envolvidos de forma indispensável na manutenção do
processo inflamatório. A ativação das MAPK, direta ou indiretamente, leva à
fosforilação de fatores de transcrição, como AP-1, os quais vão ligar-se a promotores de
genes pró-inflamatórios. Por sua vez, o complexo IkB quinase (IKK), quando ativado,
torna-se responsável pela fosforilação da subunidade IkB o que levará a ativação do NFκB que nas respostas imune e inflamatória tem papel de regulador central (CALIXTO et
al., 2004; LAWRENCE & GILROY, 2007).
1.4 DNA-Topoisomerases
Em 1971, James Wang descobriu, em Escherichia coli, uma proteína com
capacidade de cortar e de religar o DNA a qual chamou de topoisomerase. Passados
alguns anos, em 1976, Gellert et al., constataram uma segunda topoisomerase, que
chamaram de topoisomerase II ou DNA girase. Assim, chegou-se a conclusão que essas
duas enzimas, do ponto de vista funcional, tinham a capacidade de regular
conjuntamente a topologia do DNA procarioto.
Atualmente sabe-se que durante o processo de replicação a abertura da forquilha
de replicação ao longo da fita de DNA causa o “problema do enrolamento”. Para
resolver esse problema, sem grandes gastos de energia, proteínas então conhecidas
como DNA-topoisomerases têm a função de suporte giratório na hélice de DNA. Uma
DNA-topoisomerase pode ser entendida como uma nuclease reversível que se liga
covalentemente a um fosfato, clivando uma ligação fosfodiéster da cadeia de DNA.
Essa reação é reversível, e a ligação fosfodiéster é regenerada quando a proteína é
liberada (ALBERTS et al., 2010). O estresse torsional originado pelo superenrolamento positivo da hélice a frente da forquilha de replicação, e pelo super-
enrolamento negativo atrás desta, é apenas um dos desafios que a célula tem que
ultrapassar com o auxílio das DNA-topoisomerases (Figura 3) (WANG, 1996).
Maquinaria de replicação
Figura 3. Problemas topológicos associados á abertura da forquilha de replicação.
a) o avanço da maquinaria de replicação induz superenrolamento positivo; b) formação de pré-catenados
atrás da forquilha de replicação, causado por um superenrolamento negativo compensatório. (Fonte:
Wang, 2002).
Células somáticas de mamíferos apresentam seis genes para DNAtopoisomerases (TOP): dois TOP 1 (TOP 1 e TOP1 mitocondrial), dois TOP 2 (TOP2α
e β), dois topoisomerase III (TOP3α e β) (CHAMPOUX, 2001; WANG., 2002). A
classificação das topoisomerases é feita de acordo com o corte que executam na
molécula de DNA: as DNA-topoisomerases do tipo I (TOPO I) efetuam o corte de uma
cadeia do DNA e as DNA-topoisomerases do tipo II (TOPO II) clivam as duas cadeias
do DNA alvo. A TOPO I relaxa os superenrolamentos negativos e positivos com igual
eficiência (CHAMPOUX, 1998; FROHLIDH et al., 2007) à semelhança das TOPO IIβ,
porém, a TOPO IIα é mais eficiente relaxando superenrolamentos positivos
(McCLENDON et al., 2005) o qual é essencial tanto na replicação quanto na
transcrição. A ação catalítica da TOPO I não requer gasto de ATP ou ligação a cátion
bivalente (Mg2+), diferente da TOPO II, que requer 2 moléculas de ATP e Mg2+. Já, a
TOPO III necessita apenas do Mg2+ (CHAMPOUX, 2001; DEWEESE et al., 2008;
NITISS, 2009).
A TOPO I humana é uma fosfoproteína nuclear, com 765 aminoácidos e massa
molecular de 91 kDa (D’ARPA et al., 1988), expressa constitutivamente ao longo de
todo o ciclo celular (BAKER et al., 1995; MEYER et al., 1997). Essa enzima mostra
um padrão de distribuição difuso no nucleoplasma, com acúmulo no nucléolo
(CHRISTENSEN et al., 2002). A atividade catalítica da TOPO I é inibida
especificamente pela camptotecina, um alcalóide de origem vegetal (Camptotheca
acuminata) que apresenta uma poderosa atividade anti-tumoral por inibir a síntese de
ácidos nucléicos e por induzir fraturas na molécula de DNA (HSIANG et al., 1985;
LEPPARD & CHAMPOUX, 2005) e, por drogas análogas a esta, como o topotecano
(Hycantina®, GlaxoSmithKline) (BELDNER et al., 2007; LIM et al., 2007) e o
irinotecano (Camptosar®, Pfizer) (FRIEDMAN et al., 2003; HAN et al., 2007).
As topoisomerases II apresentam 2 isoformas: a isoforma α e a isoforma β
(DRAKE et al., 1987), as duas partilham o domínio N-terminal que mostram atividade
ATPásica e o domínio central que contém a tirosina catalítica (Tyr804 na isoforma α e
Tyr821 na β). O terceiro e último domínio, o C-terminal, é o que confere a especificidade
funcional as duas isoformas (KRIESER et al., 2001; LINKA et al., 2007). O dímero
formado pela isoforma α é indispensável à proliferação celular, pois é a única que
promove a separação das cromátides-filhas durante a mitose, função que não pode ser
substituída pela isoforma β (HECK et al., 1988; AGOSTINHO et al., 2004). A nível
tecidual, os tecidos com alto índice mitótico (timo, medula óssea, testículo, tumores)
exibem concentrações mais elevadas de topoisomerase IIα (HECK et al., 1988;
WOESSNER et al., 1990) que os tecidos diferenciados pós-mitóticos (HECK &
EARNSHAW 1986; UGGLA et al., 2001). Apesar de ter uma estrutura tridimensional
semelhante à da isoforma α, o dímero da isoforma β apresenta menor sensibilidade à
generalidade dos fármacos anti-topoisomerase II in vitro e in vivo (AUSTIN & MARSH
1998; ASANO et al., 2005). A distribuição tecidual da topoisomerase IIβ é universal e
inclui todos os tecidos pós-mitóticos como, por exemplo, o muscular e o nervoso
(TURLEY et al., 1997; AUSTIN & MARSH, 1998).
As topoisomerases, durante a proliferação celular, participam da manutenção e
replicação do DNA. Quando estas funções são desativadas, as células ficam vulneráveis.
Além disso, em tecidos tumorais, a expressão das topoisomerases I e II é maior do que
nas células de metabolismo normal (KELLNER et al., 2000), por esse motivo drogas
que tem ação sobre essas enzimas são utilizadas no tratamento de pacientes que
apresentam diversos tipos de câncer. Algumas drogas funcionam como inibidores
irreversíveis (ou “venenos”), pois causam fraturas na cadeia de DNA, como por
exemplo, o etoposídeo e a doxorubicina, enquanto outras são inibidores reversíveis, que
não lesam a molécula de DNA, como a bisdioxopiperazinas (JENSEN et al., 2000).
Além da ação anti-tumoral, os inibidores reversíveis têm sido usados na proteção do
tecido muscular cardíaco por diminuírem a formação de radicais livres pelas
antraciclinas usadas nos cocktails antineoplásicos (HASINOFF et al., 2003).
No processo para a descoberta de novos fármacos o docking molecular é a peça
chave para o Desenho Racional de Fármacos Baseado em Estrutura (DRBE), atraindo o
interesse dos cientistas, da indústria farmacêutica e empresas de bioctenologia
(MORGON & COUTINHO, 2007). O docking molecular é um procedimento
computacional de simulação que preve a interação do complexo receptor-ligante, onde o
receptor normalmente é uma proteína ou ácido nucleico (DNA ou RNA) e o ligante,
pode ser, tanto uma pequena molécula como outra proteína (DIAS & AZEVEDO Jr,
2008).
O docking receptor-ligante são amplamente utilizadas dentro do DRBE, tanto
para descoberta de novas substâncias quanto para o refinamento e otimização de
compostos protótipos previamente identificados. A primeira etapa consiste na escolha
do alvo terapêutico, posteriormente, a estrutura tridimensional do biorreceptor precisa
ser obtida, podendo ser utilizado banco de dados como o Protein Data Bank (PDB),
dentre outros (MORGON & COUTINHO, 2007). O próximo passo é a análise in silico
da interação das moléculas. Esses dados juntamente com dados de cristalografia de
raios X ou ressonância magnética nuclear permitem uma triagem de compostos
biologicamente ativos, sendo assim, uma das principais ferramentas de virtual screening
(DIAS & AZEVEDO Jr, 2008). O virtual screening é mais rápido e mais barato do que
os ensaios biológicos, também chamados de triagem cega, que consistem em testar
aleatoriamente várias micromoléculas, sem nenhum conhecimento dos mecanismos de
ação ou interação molécula ligante (MORGON & COUTINHO, 2007; TUCCINARDI,
2009).
Análises de bioinformática através docking molecular sugerem fortemente que o
lupano tem ligação de alta afinidade com a topoisomerase IB de Leishmania
braziliensis, em comparação a 100 ligantes já descritos, o triterpeno lupano apresentou a
menor energia de todos (score = -41,03) (WADA et al.; 2001; SILVA-JARDIM et al.,
submetido).
Uma vez que a literatura documenta que alguns triterpenóides possuem
atividade inibitória sobre a topoisomerase (NAGASE et al., 2003; WANG, et al.,
2010; SETHI et al., 2011), e ação leishmanicida por inibição de topoisomerase IB
(TELES et al., 2011, SILVA-JARDIM et al., submetido) torna-se interessante
investigar a ação do triterpeno lupano 3β,6β,16β-trihidroxilup-20(29)-ene, isolado de
Combretum leprosum, sobre as topoisomerases, assim como sua ação sobre as
células humanas, visto que ainda há poucos relatos a respeito do mecanismo de ação
desse triterpeno sobre a função celular de PBMCs humano.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito do triterpeno lupano 3β, 6β, 16β-triidroxilup-20(29)-eno isolado
de C. leprosum sobre os PBMCs humanos.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar o efeito do triterpeno lupano 3 β, 6 β, 16 β-triidroxilup-20(29)-eno
isolado de C. leprosum sobre a função de PBMCs humanos através dos seguintes
parâmetros:

Citotoxicidade celular
o Método de MTT

Produção de citocitas: IL-10 e TNF-α
o EIA

Atividade das TOPO I e II
o Enzimático

Docking Molecular (Triterpeno + DNA + TOPO I e II)
o Bioinformática
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Triterpeno Lupano
Para o isolamento do composto triterpeno lupano primeiramente é preparado um
extrato etanólico com as flores de Combretum leprosum, para tanto as flores secas e
trituradas (2,7 kg) foram submetidas à extração com etanol a temperatura ambiente (3 x
5 litros) por 7 dias. A destilação do solvente sob pressão reduzida forneceu 58,3 g de
extrato denominado CLFE.
Foram pulverizados 30.0 g de CLFE em grau de porcelana, adsorvido em 90 g
de gel de sílica e devidamente acondicionado sobre 200 g de gel de sílica em uma
coluna cromatográfica de 500 ml. Na eluição foram utilizados os seguintes solventes:
hexano, acetato de etila e metanol, obtendo-se desta forma os respectivos eluatos,
denominados CLFEH, CLFEC e CLFEM, respectivamente. O eluato CLFEC foi
submetido a uma cromatografia em coluna de sílica e eluido com hexano e acetato de
etila com gradiente de polaridade, fornecendo desta forma 50,0 mg de um sólido branco
o qual foi identificado, através de RMN 1H e 13C, como sendo o triterpeno 3β, 6β, 16βtrihidroxilup-20(29)-ene (FACUNDO et al., 1993).
O composto orgânico triterpeno lupano - 3 β,6 β, 16 β-triidroxilup-20(29)-eno,
presente no extrato das flores de Combretum leprosum Mart. foi isolado e fornecido
para esta pesquisa pelo Prof. Valdir Facundo, do Laboratório de Química de Produtos
Naturais (LPQPN) da Universidade Federal de Rondônia (UNIR).
A solução estoque de triterpeno foi preparada com etanol P.A.
Nos experimentos a concentração de diluente (etanol P.A.) foi inferior a 2% do
volume final da reação.
3.2 Comissão de ética
O presente estudo foi submetido à análise da comissão de ética em pesquisa do
Centro de Pesquisas em Medicina Tropical – CEPEM através da Plataforma Brasil e
aprovado sob número CAAE: 02312812.2.0000.0011.
3.3 Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
Para a obtenção dos PBMCs foi feita coleta sanguínea à vácuo em tubos com o
anticoagulante heparina. Para isso, foram escolhidos voluntários que não haviam feito
uso de medicação nas últimas 48h, os quais assinaram o termo de Consentimento Livre
e Esclarecido (ANEXO). Após a coleta sanguínea, os PBMCs foram isolados através do
método de gradiente de densidade por Histopaque 1077 (Sigma Aldrich), seguindo as
instruções do fabricante. Em tubos cônicos de 15 mL, acrescentou-se 7mL de
Histopaque 1077 e, posteriormente, 7mL de sangue diluído em tampão fosfato-salina
apirogênico, pH 7,4 (PBS) 1:1. Em seguida, os tubos foram centrifugados por 30
minutos a 400g. Os PBMCs (nuvem), na interface entre o plasma sanguíneo e o
Hystopaque 1077, foram cuidadosamente transferidos para outro tubo cônico e foram
lavados em 10mL de PBS, por 5 minutos a 405 x g. Esse processo foi repetido 3 vezes.
Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionado 1mL de RPMI
(Sigma Aldrich) suplementado com soro fetal bovino (SFB) (Gibco). A contagem das
células foi feita em câmara de Neubauer e, posteriormente, o volume foi ajustado de
acordo com a quantidade de células necessária para cada experimento.
3.4 Teste de citotoxicidade celular por MTT
O teste de citotoxicidade celular consiste na avaliação da atividade da enzima
desidrogenase mitocrondrial, a qual tem a capacidade de reduzir o sal 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium
bromide
(MTT)
(Sigma
Aldrich),
formando cristais de formazan, que apresentam a cor roxa e são solúveis em dimetil
sulfóxido (DMSO) (Serva) (REILLY et al., 1998). Para tanto, os PBMCs foram
incubados com o triterpeno lupano, em diferentes concentrações, nos tempos de 1h, 15h
e 24h. Para cada um dos experimentos foi utilizado um grupo controle contendo
somente células e um grupo controle do diluente (etanol a 2%). No teste de 1h, o
triterpeno foi utilizado nas concentrações de 12μg/mL, 6μg/mL, 3μg/mL, 1,5μg/mL e
0,7μg/mL. Para o teste de 15h, as concentrações de triterpeno foram: 12 μg/mL,
6μg/mL, 3μg/mL, 1,5μg/mL, 0,7μg/mL e 0,3μg/mL; em 24h de incubação as
concentrações utilizadas foram: 1,5μg/mL, 0,7μg/mL e 0,3μg/mL. Todos os
experimentos foram feitos utilizando placas de 96 poços, e células na concentração de
2x105 diluídas em meio RPMI suplementado com 10% de SFB e incubadas a 37°C e 5%
CO2. Após o tempo de incubação, as placas foram centrifugadas a 400xg por 5 minutos,
o sobrenadante foi desprezado e procedeu-se a lavagem com PBS 3 vezes. Ao
precipitado de células foi adicionado 90μL de RPMI e 10 μL de solução de MTT
(5µg/mL) e incubado por 4h ao abrigo da luz. As placas foram lavadas 3 vezes com
PBS e os cristais de formazan produzidos pelas células viáveis diluídos em 100μL de
DMSO. O grau de redução de MTT para formazan foi quantificado pela medida de
densidade óptica em espectrofotômetro a 540nm. A DL50 foi calculada através de curva
de células.
A porcentagem de células mortas foi calculada de acordo com a equação:
% células mortas = 100 – DO teste / DO controle x 100 (VICHAI &
KIRTIKARA, 2006).
3.5 Avaliação da produção de citocinas IL-10 e TNF-α
Para este ensaio, os PBMCs tiveram sua concentração ajustada para 2x105 em
meio RPMI suplementado com 10% de SFB e incubados com o triterperno, nas
concentrações de 1,5μg/mL, 0,7μg/mL e 0,3µg/mL, ou com RPMI suplementado
(controle negativo) em placas de cultura de 96 poços (Costar) por 15h, a 37°C e 5% de
CO2. Como controle positivo, foram utilizados LPS (1μg/mL). Após esse período, as
placas foram centrifugadas a 405 x g por 5 minutos e o sobrenadante utilizado para
detecção de citocinas (IL-10 e TNF-α). O ensaio de EIA foi realizado de acordo com o
protocolo fornecido pelo fabricante (BD biosciences). Para tanto, foram utilizadas
placas de 96 poços (NUNC MaxiSorp) sensibilizadas com anticorpo de captura (IL-10
ou TNF-α) dissolvidos em tampão fosfato 0,1M, por 12 horas, em temperatura
ambiente. Antes do bloqueio dos sítios ativos, com tampão de bloqueio (PBS com 1%
BSA), por 1h, as placas foram lavadas com PBS-Tween (PBS contendo 0,5% de Tween
20) por 3 vezes em lavadora de placas. Em seguida, as placas foram lavadas com PBSTween por 3 vezes e adicionados 100µL de sobrenadante de cultura de PBMCs ou de
padrões de citocina recombinante e, incubadas durante 2 horas, em temperatura
ambiente. Decorrido o tempo de incubação, as placas foram lavadas com PBS-Tween, e
100µL de solução de anticorpos biotinilados anti-citocinas foram adicionados e
incubados por 2 horas em temperatura ambiente, e as placas novamente lavadas. Para a
detecção dos anticorpos acrescentou-se 100μL de estreptavidina-peroxidase (1:200), por
20 minutos seguido de nova lavagem. Posteriormente, foi acrescentado 100μL do
reagente cromogênico TMB (0,1mg/mL) dissolvido em tampão fosfato-citrato 0,05M
(pH 5,0), contendo 0,03% de peróxido de hidrogênio, por 15 minutos, e a reação
interrompida com 100μL de ácido sulfúrico 2N. A leitura da placa foi realizada em
espectofotômetro a 450nm. Os cálculos, para obtenção da concentração das citocinas
em pg/mL, foram realizados a partir de uma curva padrão efetuada com a citocina
recombinante correspondente para a determinação da concentração desta citocina.
3.6 Extração das topoisomerases I e II a partir de PBMCs
Para testar a atividade da enzima topoisomerase, a extração foi realizada
seguindo
o
protocolo
fornecido
no
site
da
TopoGEN®
(HTTP://www.topogen.com/html/enzyme_extracts.html). Os PBMCs foram isolados
como descrito no item 3.3, sendo que, para este método, segundo protocolo, foram
utilizadas 1x106 células para a extração das topoisomerases. Assim, 1x106 células foram
ressuspendidas em PBS, em tubo cônico de 15mL, e centrifugadas a 800 x g por 3
minutos, a 4°C. A partir desse momento todo o procedimento foi realizado no gelo para
evitar a ação de proteases e a inativação da topoisomerase. As células foram
ressuspendidas em 5mL do tampão TEMP (10mM Tris-HCl, ph 7,5, 1mM EDTA, 4
mM MgCl2, 0,5 mM PMSF) gelado seguida de centrifugação. O sobrenadante
descartado e ao precipitado acrescentado 3mL do tampão TEMP gelado. Os tubos foram
colocados no gelo por 10 minutos. Decorrido esse período, os tubos foram
centrifugados a 1500 x g por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi descartado e ao
precipitado nuclear adicionado 1mL do tampão TEMP gelado e homogeneizado. O
material foi transferido para microtubos e, novamente centrifugado, nas mesmas
condições anteriores. A seguir, o sobrenadante foi descartado e adicionado 100μL de
tampão TEP (10mM Tris-HCl, ph 7,5, 1mM EDTA, 0,5 mM PMSF) e igual volume de
NaCl 1M, seguido de homogeneização e banho de gelo por 30 a 60 minutos.
Posteriormente, os microtubos foram centrifugados a 14.000xg por 15 minutos, a 4°C e
o sobrenadante, contendo as topoisomerases I e II, utilizado para análise da atividade
desta enzima como descrito a seguir.
3.7 Teste da atividade da enzima topoisomerase I e II
A análise da atividade enzimática da topoisomerase I e II foi realizada seguindo
as descrições do fabricante do Kit da TopoGEN©, separadamente para cada isoforma.
Para a TOPO I, utilizou-se 3μL do extrato nuclear, 11μL de água deionizada, 2μL
tampão de ensaio e 1μL de supercoiled DNA e 3μL de solução com triterpeno 6μg/mL
ou 1,5μg/mL ou 0,7μg/mL. Para o controle são utilizados 14μL de água deionizada.
Seguida de incubação por 90 minutos a 37°C e, posteriormente, a adição de 5μL de stop
loading dye. A visualização da atividade enzimática foi verificada em gel de agarose a
1% em tampão TAE na voltagem de 1-2,5 volts/cm. Como marcador, utilizou-se o
marcador de DNA plasmidial relaxado (Relaxed plasmid DNA marker) e DNA
supercoiled. Após a corrida, o gel foi corado com 0,5μg/mL de brometo de etídio por 10
minutos, a temperatura ambiente. Após esse processo, o gel foi fotografado usando o
fotodocumentador (Loccus L-PIX Touch).
Para a atividade da TOPO II , utilizou-se 3μL do extrato nuclear, 9,17μL de água
deionizada, 4μL tampão de ensaio completo 5X e 0,83μL de kDNA (200ng) e 3μL de
solução com triterpeno 6μg/mL ou 1,5μg/mL ou 0,7μg/mL. Para o controle negativo são
utilizados 12,17μL de água deionizada, e para o controle positivo foi usado 3μL de
inibidor de topoisomerase (etoposídeo, 100μM) seguida de incubação por 90 minutos a
37°C e, posteriormente, a adição de 4μL de stop loading dye. A visualização da
atividade enzimática foi verificada em gel de agarose a 1% com brometo de etídio
(0,5μL/mL) em tampão TAE na voltagem de 1-2,5 volts/cm. O Kit disponibiliza
marcadores de kDNA decatened e kDNA linear que também são colocados no gel.
Após esse processo, o gel foi fotografado em fotodocumentador (Loccus L-PIX Touch).
3.8 Docking Molecular
Para a obtenção da estrutura molecular das enzimas topoisomerases foi utilizado
o banco de dados PDB. O programa AUTODOCK 4.0 foi utilizado através da interface
PyRx – Python Prescription 0.8 em uma abordagem de docking rígido que consiste na
fixação das distâncias das ligações e ângulos do alvo biomolecular e do ligante durante
o cálculo.
O re-docking para a TOPO I foi feito com TOPO I Humana (1TL8) + DNA +
Indenoisoquinoline AI-III-52, baseando-se nos dados de Ioanoviciu et al. (2005), visto
que nessa interação o composto em questão teve atividade inibitória sobre a TOPO I
1TL8 (PDB).
No caso da TOPO II o modelo proposto por WU et al. (2011), utilizando TOPO
II (3QX3) + DNA + Etoposídeo, foi o escolhido para o re-docking.
Uma vez feito o re-docking conforme a literatura, foi processado o crossdocking utilizando a enzima TOPO I 1TL8 ou TOPO II 3QX3, mais dupla fita de DNA
e mais o triterpeno lupano.
3.9 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando análise de variância
(ANOVA) com pós teste de Bonferroni ou realizadas pelo Teste “t” Student, no
programa Graph Pad Prism 5.0. As diferenças foram consideradas significantes quando
p ≤ 0,05. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
4. RESULTADOS
4.1 Avaliação da citotoxicidade celular por MTT
A citotoxicidade do triterpeno lupano sobre PBMCs humanos foi avaliada pelo
método do MTT (ROSSA, et al., 2003; MOSMANN, 1983), No período de 1 hora, o
triterpeno nas concentrações de 12,0µg/mL e 6,0µg/mL apresentou toxicidade
significativa sobre os PBMCs, quando comparado ao controle (C) causando a morte de
52% e 40% das células, respectivamente. Já, nas concentrações de 3,0µg/mL, 1,5µg/mL
e 0,7µg/mL, esse efeito não foi observado (figura 4A).
No tempo de 15 horas foram testadas as concentrações de 12,0µg/mL, 6,0µg/mL,
3,0µg/mL, 1,5µg/mL, 0,7µg/mL e 0,3 µg/mL de triterpeno. Neste período as
concentrações de 12,0µg/mL, 6,0µg/mL e 3,0µg/mL causaram morte celular
significativa quando comparadas aos controles (figura 4B). A morte celular nas
concentrações de 12,0µg/mL e 6,0µg/mL foi de 74%, enquanto na concentração de
3,0µg/mL a morte foi de 32% sendo a DL50 neste tempo em torno de 4,3µg/mL.
Na figura 4C, no período de 24 horas, as concentrações de 1,5µg/mL, 0,7µg/mL
e 0,3 µg/mL de triterpeno, não apresentam citotoxicidade para os PBMCs.
A
MTT 1 hora
DO (540nm)
0.3
***
0.2
***
0.1
0.0
C
CD
0,7
1,5
3,0
6,0
12,0
____________________
g/mL
B
C
MTT 15 horas
0.3
DO (540nm)
0.3
DO (540nm)
MTT 24 horas
***
0.2
0.1
***
0.2
0.1
***
0.0
0.0
C
CD
0,3
0,7
1,5
3,0
6,0 12,0
_______________________
g/mL
C
CD
0,3
0,7
1,5
________________
g/mL
Figura 4. Avaliação da citotoxicidade do triterpeno lupano sobre PBMCs humanos. O sangue de
voluntários normais foi coletado, em seguida as células separadas por gradiente de densidade pelo
Histopaque 1077. 2x105 PBMCs foram incubados com diferentes concentrações de triterpeno lupano ou
RPMI (C), ou RPMI acrescido de etanol (Controle do diluente - CD) por 1hora (A), 15 horas (B) e 24
horas (C). A viabilidade dos PBMCs foi avaliada pelo método de MTT. Os dados representam a média +
EPM de 4 doadores.*p<0,05 em relação aos controles (ANOVA).
4.2 Avaliação da produção de IL-10 e TNF-α
Para avaliar a capacidade do triterpeno em induzir a ativação celular, investigouse a produção de IL-10 e de TNF-α por PBMCs. As células foram incubadas com
triterpeno por 15 horas (1,5µg/mL, 0,7µg/mL e 0,3µg/mL) ou RPMI (grupo controle
negativo) ou LPS (1µg/mL, controle positivo).
A figura 5A mostra que o LPS (controle positivo) induziu, significativamente, a
produção de IL-10 quando comparado ao grupo RPMI (controle negativo). Já, o
triterpeno, nas três concentrações utilizadas, não induziu a produção de IL-10, quando
comparado aos controles.
Da mesma forma, na figura 5B, observamos que o LPS (controle positivo)
induziu, significantemente, a liberação de TNF-α. O triterpeno, não alterou a produção
de TNF-α, quando comparado aos controles.
B
IL - 10
TNF - α
2400
2400
2000
2000
1600
1600
pg/mL
pg/mL
A
1200
800
***
1200
800
***
400
400
0
C
LPS
0,3
0,7
1,5
____________
g/mL
0
C
LPS
0,3
0,7
1,5
_____________
g/mL
Figura 5. Efeito do triterpeno lupano sobre a produção de IL-10 e TNF-α por PBMCs humanos.
2x105 PBMCs foram incubados com 1,5µg/mL, 0,7µg/mL e 0,3µg/mL de triterpeno durante 15 horas ou
RPMI para controle negativo (C) ou LPS (1µg/mL) para o controle positivo. Em seguida, o sobrenadante
foi coletado para a quantificação das concentrações de IL-10 (A) e TNF-α (B) por EIA. Os dados
representam a média ± EPM de 4 doadores. *p< 0,05 em relação ao controle (ANOVA).
4.4 Avaliação da atividade das enzimas topoisomerase I e II
Para avaliar o efeito do triterpeno sobre a atividade da topoisomerase I foi
utilizado o Kit TopoGen® no qual detectamos a capacidade da enzima agir sobre um
substrato de DNA “supercoiled”. Para visualizar a ação da enzima, como controle
positivo, foi utilizado somente o extrato nuclear de células. A figura 5A representa gel
com 2N e os resultados obtidos mostraram que há atividade da enzima TOPO I visto que
a maior parte do DNA está na forma linear, tanto no controle como no grupo
experimental triterpeno.
A atividade da TOPO II foi avaliada de acordo com o Kit TopoGen® específico
para TOPO II, podendo ser realizado em extratos nucleares mesmo na presença de
TOPO I, visto que o kDNA utilizado como substrato é específico para a isoforma II.
Além dos grupos controle e experimental triterpeno, foi inserido o grupo etoposídeo,
inibidor de TOPO II. A figura 5B representa gel com 2N e os resultados obtidos
mostraram, que assim como nos experimentos anteriores, não há interferência na
atividade da enzima pelo triterpeno visto que o DNA foi clivado, e também podemos
perceber um mesmo padrão no gel, se comparado o grupo triterpeno ao grupo controle.
A
B
Figura 6. Avaliação da atividade das enzimas topoisomerases I e II. Eletroforese em gel de agarose
1% para avaliação da atividade da TOPO I (A): extrato nuclear de PBMCs e DNA supercoiled
(TopoGen®) para o controle, triterpeno (1,5µg/mL ou 0,7µg/mL + extrato nuclear de PBMCs e DNA
supercoiled; marcadores (DNA relax e Supercoiled). Eletroforese em gel de agarose 1% com brometo de
etídio para avaliação da atividade da TOPO II (B): extrato nuclear de PBMCs e kDNA (TopoGen®) para o
controle, triterpeno (1,5µg/mL ou 0,7µg/mL + extrato nuclear de PBMCs + kDNA; extrato nuclear de
PBMCs + kDNA + etoposide (inibidor); marcadores (DNA linear e Decatenated kDNA). Géis
representativos de 2N.
4.5 Docking Molecular
O docking Molecular da TOPO I foi do tipo rígido, onde foi utilizado uma
molécula de triterpeno lupano, DNA e uma molécula da enzima, a partir dessa interação,
a melhor energia foi de -8,86kcal/mol (figura 7A e 7B). Uma vez que a energia da
interação desse mesmo conjunto (DNA + TOPO I) com o já conhecido inibidor de
TOPO I Indenoisoquinoline AI-III-52 foi de -10,35 kcal/mol (IOANOVICIU et al.,
2005), concluímos que, o lupano traz pouca ou nenhuma perspectiva de inibir a TOPO I,
visto que sua energia foi maior.
Após o procedimento do re-docking feito com a TOPO II, uma molécula de
DNA de dupla fita e mais o inibidor etoposídeo apresentou uma energia de -12,81
kcal/mol (WU et al., 2011). O cross-docking do mesmo complexo, porém utilizando o
triterpeno lupano no lugar do etoposídeo apresentou, em sua melhor configuração
estável (figura 8), energia de -9,91 kcal/mol. Como esta energia de configuração é maior
que a apresentada no complexo inicial com etoposídeo, concluímos que não há
perspectiva de atividade inibitória do lupano sobre a TOPO II.
(A)
(B)
Figura 7. Docking Molecular da interação da Topoisomerase I e Triterpeno Lupano. Complexo
molécula TOPO I (1TL8) + DNA + Triterpeno Lupano com o programa AUTODOCK 4.0 através da
interface PyRx – Python Prescription 0.8 em uma abordagem de docking rígido, energia liberada 8,86kcal/mol. (A) Visão total; (B) Visão localizada do sítio ativo.
Figura 8. Docking Molecular da interação da Topoisomerase II e Triterpeno Lupano. Complexo pela
molécula TOPO II (3QX3) + DNA + Triterpeno Lupano com o programa AUTODOCK 4.0 através da
interface PyRx – Python Prescription 0.8 em uma abordagem de docking rígido. Energia -9,91 kcal/mol.
5. DISCUSSÃO
Atualmente, os estudos envolvendo espécies do gênero Combretum vêm
crescendo e vários compostos com propriedades biológicas conhecidas, como taninos,
flavonóides, saponinas, cumarinas, triterpenos, derivados do ácido elágico, glicosídeos
antracênicos e derivados de fenantreno já foram isolados e identificados. Esses
compostos são, provavelmente, os responsáveis pelas diversas propriedades biológicas
comprovadas em pesquisas (FYHRQUIST, 2007).
No caso da Combretum leprosum Mart. foi isolado o triterpeno lupano 3 β,6 β,
16 β-triidroxilup-20(29)-eno (TTHL). Esse triterpeno, isolado em 1993 por Facundo
et.al., ainda não tem suas propriedades biológicas totalmente estabelecida. Dessa
maneira, estudos voltados para o esclarecimento dessas propriedades, revestem-se de
importância.
Os triterpenos são compostos encontrados em diversas espécies de plantas, e
alguns compostos desse grupo já demonstraram exercerem importantes atividades
biológicas, tais como efeitos anti-inflamatório, anti-neoplásico e antibacteriano. No
entanto, a citotoxicidade dos triterpenos é diferente para cada composto, podendo a
morte celular ser induzida por necrose ou apoptose. Neste estudo o teste de
citotoxicidade sobre PBMC humanos, realizado em três tempos diferentes (1, 15 e 24
horas), mostrou que quanto mais tempo o triterpeno permanece em contato com os
PBMCs maior a sua toxicidade. As concentrações utilizadas foram: 12µg/mL, 6µg/mL,
3µg/mL, 1,5µg/mL, 0,7µg/mL e 0,3µg/mL, dentre as quais somente as concentrações
abaixo de 1,5µg/mL não foram tóxicas para as células, nos períodos de tempo estudados.
No período de 15 horas as concentrações de 12µg/mL e 6µg/mL causaram a morte de
74% das células, e na concentração de 3µg/mL houve 32% de morte celular. Com
cálculo da DL50 para o triterpeno lupano, neste mesmo período de tempo, chegou-se a
concentração de 4,32µg/mL. Assim sendo, utilizamos as concentrações de 1,5µg/mL e
0,7µg/mL para avaliar a função celular, já que nessas concentrações o lupano não
alterou a viabilidade celular. Cabe ressaltar que o único relato do efeito do lupano sobre
a toxicidade celular, até o momento, é com macrófagos peritoneais elicitados de
camundongos, no qual foi observado que na concentração de 5µg/mL, no período de
24h, o lupano não apresentou toxicidade (TELES et al., 2011).
Em estudo prévio realizado no Laboratório de Quimioterapia do IPEPATRO,
foi descrito, pela primeira vez, a atividade leishmanicida do lupano isolado dos frutos
de C. leprosum. Tanto o extrato bruto quanto o lupano possuem uma atividade tóxica
potente contra promastigotas de L. amazonensis (TELES et al., 2011). Em estudo
recente, em andamento no Laboratório de Quimioterapia do IPEPATRO, evidenciouse que o lupano é eficaz na eliminação de amastigotas intracelulares, sem afetar a
viabilidade das células hospedeiras. Na concentração de 5µg/mL, há redução na taxa
de macrófagos infectados e no número de parasitas intracelulares, a partir de 24h de
tratamento. Devido às alterações observadas, foi sugerido que o lupano poderia
interferir na ação de enzimas importantes para a manutenção do cinetoplasto ou na
estrutura da mitocôndria.
A partir dos dados do Laboratório de Quimioterapia, os quais sugerem que esse
triterpeno possui propriedade biotecnológica, como protótipo de uma nova droga
leishmanicida, os ensaios pré-clínicos para investigação da citotoxicidade celular e a
ação desse composto sobre a função de células humanas revestem-se de importância.
A morte celular por apoptose é caracterizada pela separação do DNA,
condensação e fragmentação nuclear, e consequente formação de estruturas semelhantes
a bolhas constituídas de membrana plasmática que induzem as células fagocitárias a
fagocitá-las sem, no entanto, induzir uma reação inflamatória. Esse tipo de morte celular
é importante no desenvolvimento do linfócito, na regulação das respostas do linfócito a
antígenos externos e na manutenção da tolerância aos antígenos próprios (ABBAS &
LICHTMAN, 2007). No entanto, o processo de morte celular por necrose é
caracterizado por um processo no qual ocorre ativação de linfócitos T citotóxicos (LTC)
que desencadeiam a morte celular por diversos mecanismos, começando pela liberação
de perfurinas por exocitose, as quais iniciam lesão na membrana celular da célula alvo,
seguido da ruptura do citoesqueleto, porém o núcleo permanece intacto por um período
prolongado, até finalmente a célula-alvo se dissolver completamente, formando os
detritos celulares com resíduos de organelas e fragmentos de membrana que poderão ser
fagocitados por células fagocitárias (GROSCURTH & FILGUEIRA, 1998).
A literatura documenta que o celastrol, um triterpeno lupano isolado de plantas
da família Celastraceae, utilizada na medicina chinesa para o tratamento de câncer e
doenças inflamatórias, induz apoptose em células HL-60, através da inibição da
topoisomerase II e potencializa a apoptose induzida por TNF-α em células de linhagem
neoplásica (SETHI, et al., 2011; NAGASE, et al., 2003).
Ainda, Hata et al. (2008) testaram a capacidade de 6 diferentes triterpenos
lupanos em induzir a apoptose em células de melanoma. Os autores sugeriram que o
efeito observado pode ser devido a pequenas mudanças estruturais que ocorrem nos
compostos o que leva a alterar sua atividade. Assim sendo, compostos com o grupo
carboxila no C20 e C17 são mais eficientes em induzir apoptose nessa linhagem celular.
Ainda, os compostos com carboxila no C17 reduzem a proliferação de linhagens de
células de câncer de fígado e leucemia humana. Cabe mencionar que mudanças na
estrutura do composto levam a uma perda de atividade leishmanicida. Um estudo com
triterpeno lupano e os derivados sintéticos (1a-d) sobre a atividade leishmanicida
mostrou que os derivados 1b e 1d apresentaram atividade contra formas promastigotas.
O lupano, assim como os seus derivados sintéticos não apresentaram efeitos citotóxicos
sobre macrófagos peritoneais de camundongos até a concentração de 5μg/mL (TELES
et. al., 2011). Estudos adicionais para verificar o mecanismo pelo qual o triterpeno
lupano induz a morte celular, necrose ou apoptose, serão conduzidos, assim como a
atividade citotóxica de seus derivados sintéticos.
Diversos estudos têm sido realizados com o extrato etanólico de C.leprosum com
o objetivo de esclarecer a existência da atividade anti-inflamatória, além de avaliar o
efeito leishmanicida. Para a investigação da atividade anti-inflamatória, diversos
métodos experimentais podem ser empregados, in vivo ou in vitro, que permitem
auxiliar o estudo da reação inflamatória. Pietrovski (2006) conduziu estudos in vivo com
o triterpeno lupano e com o extrato etanólico de C. leprosum constatando que o extrato e
o composto isolado possuem efeito anti-inflamatório.
Como mediador da resposta inflamatória, o TNF-α, é uma citocina próinflamatória secretada por diversos tipos celulares e dentre eles, macrófagos e linfócitos.
Esta citocina ativa ou suprime vários genes responsáveis pela transcrição de outros
mediadores, de proteínas pró-inflamatórias e de proteínas de fase aguda (PORTEU &
NATHAN, 1990). Nesse sentido, para verificar o papel do triterpeno lupano na
produção de TNF-α por PBMCs, citocina abundante no processo inflamatório,
utilizamos o lupano em concentrações não tóxicas, 1,5µg/mL e 0,7µg/mL. Os resultados
mostraram que o lupano não foi capaz de induzir a produção de TNF-α por PBMCs.
O sistema imune produz substâncias com a intenção de regular a resposta
inflamatória, uma delas é a citocina IL-10 que tem como função modular as funções
monocíticas e macrofágicas, inibindo a capacidade destas células de secretar citocinas e
de apresentar antígenos (FRUCHT & FUKAO, 2001). As principais células produtoras
de IL-10 são monócitos e macrófagos assim como os linfócitos T (BLANCO et al.,
2008). Monócitos e macrófagos secretam IL-10 após ativação de mediadores endógenos
e exógenos, como por exemplo, o lipopolissacarídeo bacteriano, através de sua ligação
ao receptor “Toll-like” 4 (TRL4). Durante o processo de clearance de células
apoptóticas, macrófagos e monócitos produzem IL-10, em um processo dependente de
CD36 e p38 MAP kinase (COUPER et al., 2008).
Uma vez que a literatura mostra que a IL-10 é uma potente citocina antiinflamatória e desativadora de monócitos e supressora da síntese de TNF-α e de outras
citocinas pró-inflamatórias (MOORE et al., 1993), e que o triterpeno lupano não induz a
produção de TNF-α por PBMCs avaliou-se a produção de IL-10, citocina regulatória e
capaz de conter a resposta inflamatória. Os resultados obtidos neste estudo mostraram
que o composto triterpeno lupano não induziu a produção de IL-10 por PBMCs
humanos, desta forma sua ação anti-inflamatória não está relacionada à liberação dessa
citocina.
A atividade anti-inflamatória do triterpeno é pouco descrita na literatura.
Recentemente, Silva (2009) avaliou a atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de
C.leprosum (EE) e do triterpeno lupano em modelo murino de inflamação de pele agudo
e crônico, no qual ambos foram capazes de inibir a formação do edema na orelha,
induzido por óleo de cróton (éster de forbol), que produz uma resposta inflamatória
intensa. Neste mesmo experimento, ao avaliar a ação do triterpeno sobre a enzima MPO
de neutrófilos obtidos do edema, observou-se uma inibição máxima induzida pelo
composto lupano, sobre a enzima. Desse modo, é possível que o triterpeno lupano esteja,
pelo menos em parte, participando da ação anti-inflamatória demonstrada pelo extrato de
C. leprosum.
A literatura documenta que o triterpeno celastrol, relatado como agente
antitumoral com a capacidade de inibir a TOPO II, possui atividade anti-inflamatória por
suprimir o TNF- α e a IL-1β, além de diminuir a expressão de MHC-II e de interferir na
sinalização induzida por TNF-α, potencializando seus efeitos apoptóticos (SETHI, 2011,
NAGASE et.al., 2003). Além do celastrol, o etoposídeo, um inibidor de TOPO II,
importante droga no tratamento de oncologias, induz apoptose e, pode modular a função
de células mononucleares e a produção de citocinas ativadoras de linfócitos B.
As topoisomerases catalisam mudanças topológicas nas fitas de DNA durante os
processos de replicação, transcrição, recombinação e reparo do DNA (WANG, 2002).
Levando em consideração os diversos relatos da literatura sobre a capacidade dos
triterpenos em inibir as enzimas topoisomerases, testou-se o triterpeno lupano sobre
essas enzimas extraídas de PBMCs humanos. Os resultados obtidos mostraram que o
composto não interfere na atividade das topoisomerases isoladas de PBMCs humanos,
nem mesmo na concentração de 6μg/mL, a qual é citotóxica. Além disso, realizou-se,
ainda, dois modelos de docking molecular rígido, nos quais os resultados obtidos in
silico determinaram que há pouca ou nenhuma perspectiva do triterpeno lupano em
inibir as enzimas topoisomerases humanas, confirmando os resultados obtidos em
ensaios biológicos.
Como base para essa avaliação, através da bioinformática, utilizou-se a interação
das topoisomerases com compostos inibitórios já conhecidos, a Indenoisoquinoline AIIII-52 e o etoposídeo, inibidores de TOPO I e II respectivamente (re-docking)
(IOANOVICIU, et al., 2005; WU et al., 2011). A energia da TOPO I com o seu inibidor
foi de -10,35kcal/mol e a melhor energia com o lupano foi -8,86kcal/mol. No teste da
TOPO II com o inibidor etoposídeo a energia liberada foi -12,81kcal/mol, já com o
lupano a melhor energia foi -9,91kcal/mol, levado-se em consideração que para o
composto ser um provável inibidor deveria a apresentar -2,0kcal/mol que o ligante
original e isso não ocorreu nos testes, desta forma não há perspectiva de atividade
inibitória do lupano sobre as topoisomerases humanas.
As topoisomerases humanas participam da manutenção e replicação do DNA
durante a proliferação celular, e quando há alguma interferência durante esse processo,
as células ficam vulneráveis (KELLNER et.al., 2000). As enzimas topoisomerase I e a
IIβ estão presentes nas células constitutivamente, independentes da proliferação celular,
enquanto, a presença da topoisomerase IIα está relaciona ao ciclo celular e está superexpressa em células tumorais. Devido à superexpressão da isoforma IIα em células
neoplásicas, incluindo linfoma, glioma e câncer de cólon, sugere-se essa enzima como
marcador universal de tumores (PARK et al., 2010). Cabe ressaltar que para tratamento
clínico de diversos tipos de tumores é utilizado o inibidor de TOPO II, o etoposídeo. A
busca de novas drogas para o tratamento do câncer faz das enzimas topoisomerases,
principalmente a TOPO IIα, alvo para estudos de novas drogas quimioterápicas.
Ao utilizarmos neste estudo células normais, podemos supor que avaliamos o
efeito do triterpeno lupano sobre as isoformas de TOPO I e TOPO IIβ, enzimas
presentes constitutivamente em células normais e que participam da manutenção e
replicação do DNA, conclui-se, ainda, que a citoxicidade apresentada pelo lupano não
está relacionada ás enzimas topoisomerases.
No estudo do Laboratório de Quimioterapia do IPEPATRO, realizado por SilvaJardim et al. (submetido), com análises de bioinformática através docking molecular
sugerem fortemente que o lupano tem ligação de alta afinidade com a topoisomerase IB
de Leishmania braziliensis (SILVA-JARDIM, et al., submetido). As diferenças
estruturais entre as topoisomerases humanas e dos parasitas fazem dessas enzimas alvos
moleculares de interesse para intervenções quimioterápicas.
A topoisomerase I de Leishmania difere dos seus homólogos de outras células
eucarióticas. As topoisomerases I de mamíferos são enzimas monoméricas enquanto as
enzimas dos tripanossomatídeos são heterodiméricas (VILLA et al., 2003; REGUERA
et al., 2006). Além disso, em tripanossomatídeos, esta enzima tem uma localização
dupla, no núcleo associado ao DNA genômico e, no cinetoplasto associada ao kDNA
(BODLEY et al., 2003; DAS et al., 2004). Estas diferenças fazem desta enzima um alvo
potencial para a intervenção quimioterapêutica em doenças causadas por parasitas
tripanossomatídeos.
Os triterpenos possuem diversas propriedades biológicas, tais como: atividades
anti-inflamatórios, analgésica, antibacteriana e antifúngica, imunoreguladora e
antitumoral. Porém, a desvantagem do uso de triterpenos é a sua toxicidade que está
associada ás suas propriedades hemolítica e citostática (DZUBAK et al., 2006).
O ácido betulínico e o ácido ursólico, pertencentes ao grupo dos triterpenos
lupano, foram descritos como os responsáveis pelo efeito citotóxico do extrato de
Vauquelinia corymbosa sobre células de leucemia linfocítica, estudo, esse que ocorreu
em 1976 por Trumbull et al. A partir daí vários outros estudos se seguiram para
esclarecer a ação desses lupanos. Atualmente, sabe-se que esses dois ácidos, assim como
alguns derivados sintéticos, causam apoptose por interferir na permeabilidade da
membrana mitocondrial, causando a liberação de citocromo C e de fator indutor de
apoptose (AIF), resultando na ativação das caspases 3 e 8 (GOPAL et al., 2005).
Porém, os mecanismos de ação dos triterpenos variam muito de um composto
para outro, alguns trabalhos descrevem que a ação citotóxica dos triterpenos está
relacionada à ação inibitória sobre a enzima topoisomerase. Wang et al. (2010)
estudaram a ação 74 triterpenos, isolados de diferentes plantas, sobre a citoxicidade e as
TOPO I e II. Os resultados mostraram que desses triterpenos nenhum teve atividade
sobre a TOPO II (incluindo dois triterepenos lupanos) e, 16 agiram sobre a TOPO I. Em
outro estudo, usando o triterpeno celastrol, os autores descreveram sua ação inibitória
sobre a TOPO II com consequente apoptose em células HL-60 (NAGASE et al., 2003).
Com base nos resultados pré-clínicos obtidos neste trabalho e levando em
consideração os relatos na literatura sobre os efeitos anti-inflamatórios e leishmanicida
do triterpeno lupano isolado de C. leprosum, após estudos complementares para
esclarecer seu mecanismo de ação, podemos sugerir que o composto poderá se destacar,
no futuro, como ferramenta biotecnológica.
6. CONCLUSÕES

O triterpeno lupano em concentrações acima de 6µg/mL é citotóxico para
os PBMCs após 1 hora de incubação.

O triterpeno lupano em concentrações acima de 3µg/mL é citotóxico para
os PBMCs após 15 horas de incubação e a concentração da DL50 é
4,32μg/mL

Nas concentrações de 1,5µg/mL e 0,7µg/mL o triterpeno lupano não
induziu a liberação de IL-10 e TNF-α por PBMCs.

O triterpeno lupano não interfere na atividade das topoisomerases
humanas.
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8. ANEXOS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ANEXO __: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
VOCÊ ESTÁ SENDO CONVIDADO(A) COMO VOLUNTÁRIO(A) A PARTICIPAR DA
PESQUISA:
“Efeito do extrato de produtos naturais e/ou seus derivados sobre leucócitos
humanos in vitro.”
A JUSTIFICATIVA, OS OBJETIVOS E OS PROCEDIMENTOS:
O motivo que nos leva a estudar a ação dos produtos naturais e seus derivados
sobre as células sanguíneas humana in vitro, reside no fato de além de se conhecer seus
efeitos, procurar dentre essas ações, possíveis efeitos farmacológicos que poderiam
aprimorar a busca por novas moléculas para uso medicinal (farmacológico). A pesquisa
se justifica, pois, o entendimento da interação de produtos naturais e seus derivados
sobre as células nos dá a chance de estudar seus mecanismos de ação e procurar
medicamentos que possam ser utilizados no tratamento de patologias.
O (os) procedimento (s) de coleta de material e dados serão da seguinte forma:
Quando o voluntário sadio aceitar a participar da pesquisa, este receberá o TCLE, e as
explicações sobre a pesquisa. A seguir será coletado, á vácuo, 10mL de sangue
periférico em tubos com heparina, sob condições de assepsia e anti-sepsia de rotina
hospitalar. Em seguida o material colhido será utilizado para a extração dos leucócitos e
posteriormente serão feitos testes para avaliação do efeito sobre os leucócitos do
extrato do produto natural e/ou seus derivados “in vitro”.
DESCONFORTOS E RISCOS E BENEFÍCIOS:
Existe um desconforto mínimo, o de leve sensação dolorosa no momento da
coleta de sangue por punção justificada para que se possa obter as células, com quais
avaliaremos a ação das substâncias em estudo.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTO, LIBERDADE DE RECUSA E GARANTIA DE
SIGILO:
Você será esclarecido(a) sobre a pesquisa em qualquer aspecto que desejar.
Você é livre para recusar-se a participar, retirar seu consentimento ou interromper a
participação a qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em
participar não irá acarretar qualquer penalidade ou perda de benefícios.
O(s) pesquisador(es) irá(ão) tratar a sua identidade com padrões profissionais
de sigilo. Os resultados das determinações da inflamação que serão realizadas dentro
de laboratório de pesquisa serão guardados e poderão ser enviados para você e
permanecerão confidenciais. Seu nome ou o material que indique a sua participação
não será liberado sem a sua permissão. Você não será identificado(a) em nenhuma
publicação que possa resultar deste estudo. Uma cópia deste consentimento
informado será arquivada no Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais de
Rondônia e outra será fornecida a você.
CUSTOS
DA
PARTICIPAÇÃO,
RESSARCIMENTO
E
INDENIZAÇÃO
POR
EVENTUAIS DANOS:
A participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponível
nenhuma compensação financeira adicional.
DECLARAÇÃO
DA
PARTICIPANTE
OU
DO
RESPONSÁVEL
PELA
PARTICIPANTE:
Eu, _______________________________________ fui informada (o)
dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada e esclareci
minhas dúvidas. Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas
informações e motivar minha decisão se assim o desejar. A professora
orientadora Dra. Juliana Pavan Zuliani certificou-me de que todos os dados
desta pesquisa serão confidenciais.
Também sei que caso existam gastos adicionais, estes serão absorvidos
pelo orçamento da pesquisa. Em caso de dúvidas poderei chamar as
estudantes Sulamita, Adriana e Caroline ou o(a) professor(a) orientador(a)
Juliana
Pavan
Zuliani
no
telefone
(69)
3219-6009
OU
e-mail
[email protected]. Declaro que concordo em participar desse estudo.
Recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido e me foi
dada a oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas.
Nome
Assinatura do Participante ou
Data
Digital
Nome
Assinatura do Pesquisador
Data
Nome
Assinatura da Testemunha
Data