universidade federal do rio grande do norte
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS JULIANA FERNANDES DE CARVALHO NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COM OXACILINA OBTIDA POR MOAGEM DE ALTA ENERGIA PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS 2013 JULIANA FERNANDES DE CARVALHO NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COM OXACILINA OBTIDA POR MOAGEM DE ALTA ENERGIA PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Artur Da Silva Carriço NATAL / 2013 Juliana Fernandes de Carvalho NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COM OXACILINA OBTIDA POR MOAGEM DE ALTA ENERGIA PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS Banca Examinadora _____________________________________ Prof. Dr. Artur da Silva Carriço Presidente - UFRN _____________________________________ Prof. Dr. Gustavo de Oliveira Gurgel Rebouças Examinador Externo – UFERSA/RN _____________________________________ Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior Examinador Interno - UFRN Natal, 26 de fevereiro de 2013 Natal / RN 2013 Dedico esse trabalho aos meus pais que me conduziram à educação desde a mais tenra idade, e que sempre estiveram torcendo por meu sucesso sem medir esforços para minha formação. Sem eles nada disso seria possível. AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador profº. Dr. Artur da Silva Carriço não somente pelo grande empenho em minha formação profissional, mas principalmente, por todo conhecimento compartilhado, tanto aqueles que me direcionavam a um maior entendimento acadêmico quanto àqueles que me fizeram mais gente. Obrigada pela confiança e apoio incessantes; Ao profº. Dr. Sócrates Egito, pela oportunidade de fazer parte do seu laboratório e conhecer as pessoas maravilhosas que fazem o LaSiD uma grande família; À Amanda Brun, que me abriu as portas da pesquisa e me fez almejar novos rumos; À Doutoranda-chefe do GM/Biomagnetismo Érica Freitas, pela amizade e o companheirismo à todo momento durante esse percurso; À Thales, Rafael, Kátia e Ítalo, colegas de grupo e bons que participaram diretamente deste trabalho e me deram o suporte necessário para mesclar estudo e laboratório; À CAPES e ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas que me concederam a bolsa de estudos que custeou minhas despesas desse período, e ao programa em particular, pela infraestrutura de material e pessoal disponibilizada; Ao profº. Dr. Aldo Medeiros por vislumbrar a utilização de vetorização magnética para tratamento de infecções, e por ser membro ativo do projeto de bolsa PRONEX da FATERN que deu início às atividades nessa vertente; Aos profºs. Drs. José Humberto e Suzana Nóbrega que disponibilizaram o laboratório experimental de magnetismo e o moinho de bolas; Ao GM e aos técnicos, graduandos, mestrandos e doutorandos do DFTE da UFRN que tanto me ajudaram nas análises e interpretações dos meus resultados experimentais; Aos profºs. Drs. Ana Dantas, Marco Morales e João Maria que me receberam de braços abertos na UERN e me confiaram a utilização do laboratório de física experimental da instituição; À profª. Dr. Nereide Magalhães por me receber em Recife para análises em seu laboratório; Ao NEPGN/UFRN e seus técnicos, que desde a graduação nos dão suporte com análises de MEV e DRX; Aos professores de minha banca de qualificação Arnóbio Júnior, José Luis, e Márcio Assolin que contribuíram bastante para essa dissertação; Ao LACEN na pessoa de Érica Lira, que disponibilizou sua infraestrutura para realização dos ensaios microbiológicos; Ao profº. Dr. Hugo Rocha por abrir as portas do BIOPOL e disponibilizar material e pessoal para iniciarmos os testes em células; Aos meus pais, familiares, amigos e namorado, pelo carinho e compreensão nas horas alegres e difíceis; E principalmente à Deus que iluminou meus passos, colocando pessoas admiráveis, atenciosas e amigas no meu caminhos e que me deu o imenso prazer de conhecer, conviver e/ou trabalhar com elas "Todo conhecimento imaginação, no inicia-se sonho; só na depois desce à realidade material e terrena por meio da lógica". Albert Einstein Resumo A vetorização de fármaco tem sido alvo de exaustivos trabalhos no intuito de desenvolver tratamentos sítio-específicos que minimizem efeitos adversos e torne mais efetiva a terapia antineoplásica. Apesar do grande interesse nessa classe, fármacos como os antibióticos também apresentam limitações, e têm sido negligenciados. Utilizando novas tecnologias farmacêuticas, o emprego de vetores magnéticos aparece como candidato promissor para sistemas de entrega de fármaco em inúmeros estudos. As pequenas partículas magnéticas ligadas ao fármaco de interesse podem ser moduladas de acordo com a orientação de um ímã externo ao corpo, localizado e retendo o ativo no local de interesse. Nesse trabalho nós propomos a utilização de Moagem de Alta Energia (MAE) para síntese do vetor magnético com características apropriadas para aplicações biomédicas por via de administração intravenosa, e para complexação do carreador à Oxacilina para obtenção de um sistema para tratamento de infecções por Staphylococcus aures. Os resultados da variação do tempo de moagem demonstraram que as propriedades estruturais e de tamanho do material formado se alteram com o aumento do tempo de moagem, e dentre os períodos estudados, 60 horas foi escolhido como o mais próximo das propriedades ideais do material. A complexação vetor-fármaco foi estudada em termos de estabilidade estrutural e de atividade antimicrobiana após o processo de moagem, que revelaram a integridade da molécula de Oxacilina e de sua ação bactericida sobre culturas de Staphylococcus aures ATCC. Palavras-chave: Oxacilina, nanopartícula magnética, sistema de entrega de fármaco Abstract The drug targeting has been the subject of extensive studies in order to develop site-specific treatments that minimize side effects and become more effective anticancer therapy. Despite considerable interest in this class, drugs like antibiotics also have limitations, and have been neglected. Using new pharmaceutical technologies, the use of magnetic vectors appear as promising candidate for drug delivery systems in several studies. Small magnetic particles bound to the drug of interest can be modulated according to the orientation of a magnet outside the body, locating and holding in a specific site. In this work, we propose the use of High Energy Milling (HEM) for synthesis of a magnetic vector with characteristics suitable for biomedical applications by intravenous administration, and for the formation of an oxacillin-carrier complex to obtain a system for treating infections caused by Staphylococcus aureus. The results of the variation of milling time showed that the size and structural properties of the formed material change with increasing milling time, and in 60 hours we found the sample closest to the ideal conditions of the material. The vector-drug system was studied in terms of structural stability and antimicrobial activity after the milling process, which revealed the integrity of the oxacillin molecule and its bactericidal action on cultures of Staphylococcus aureus ATCC. Keywords: oxacillin, magnetic nanoparticle, drug delivery system LISTA DE FIGURAS Fig.1. Mecanismos de resistência a antibióticos numa bactéria. Fig.2. Estrutura molecular da Oxacilina. Fig.3. Exemplo esquemático da vetorização magnética Fig.4. Influencia do tamanho das partículas no seu comportamento em diferentes regiões do organismo. Fig.5. Transição magnética de nanopartículas, de ferromagnéticas para superparamagnéticas: diagrama de energia de nanopartículas magnéticas com diferentes alinhamentos de spin, mostrando o ferromagnetismo em nanopartículas grandes (acima) e o superparamagnetismo em nanopartículas pequenas (abaixo). Fig.6. Estrutura fundamental da magnetita: (a) célula unitária e (b) sítios tetraédricos e octaédricos. Fig.7. Esboço esquemático do método de moagem de pós: (a) movimentação das bolas no cadinho, (b) processo de quebra e soldagem a frio. Fig.8. Difratogramas obtidos para as amostras sintetizadas nos tempos de 10, 40, 60 e 96 horas; os quadrados vazios indicam os picos característicos da magnetita e os quadrados preenchidos, os picos característicos do α-Fe. Fig.9. Parâmetro de rede e tamanho do cristalito dos produtos da reação de Fe e H2O no moinho de bolas em função do tempo de moagem. Fig.10. Difratogramas das amostras: (a) Fe60h; (b) Oxacilina; (c) mistura física; e (d) Fe60h-Ox. Fig.11. Espectros de Infravermelho das amostras: A) Fe60h; B) Oxacilina; C) MF; e D) Fe60h-Ox. Fig.12. Curvas de histerese das amostras com Oxacilina em comparação com o padrão Fe60h. Fig.13. Ensaio microbiológico de inibição de crescimento em placa: (A) controle com Oxacilina; e (B), (C) e (D) triplicata de Fe60h-Ox, e (E) controle com solução salina. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS Å Angstrom γ-Fe2O3 Maguemita λ Comprimento de onda µg Micrograma µL Microlitro µm Micrômetro θ Teta ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AO Ácido Oleico AAR Área de absorção relativa ATCC American Type Culture Collection BHf Campo magnético hiperfino cm Centímetro cm3 Centímetro cúbico Co Cobalto Cu Cobre C18H34O2 Ácido Oleico DRX Difração de Raio-X Δɛ Desdobramento quadrupolar EM Espectroscopia Mössbauer FeCl3 Cloreto férrico FeSO4 Sulfato ferroso 3+ Ferro trivalente Fe Fe3O4 Magnetita Fe2+ Ferro bivalente Fe10h Amostra de Fe e H20 moída por 10 horas Fe40h Amostra de Fe e H20 moída por 40 horas Fe60h Amostra de Fe e H20 moída por 60 horas Fe96h Amostra de Fe e H20 moída por 96 horas h Horas IS Deslocamento isomérico relativo ao α-Fe IF Infravermelho IT Índice terapêutico KBr Brometo de potássio LACEN Laboratório Central Dr. Almino Fernandes mCi Milicurie MEV Microscopia Eletrônica de Varredura MET Microscopia Eletrônica de Transmissão MF Mistura física mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mm Milímetro MRI Magnetic Ressonance Imagem nm Nanômetro pH Potencial hidrogeniônico PM Partícula magnética Rh Ródio rpm Rotações por minuto T Tesla UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte VSM Magnetometria de amostra vibrante SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 1 2. OBJETIVO .................................................................................................................... 2 2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 2 2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................. 2 3. REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 3 4. MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................................15 4.1. Materiais ...................................................................................................................15 4.2. Síntese das partículas magnéticas (PM) ...................................................................15 4.3. Síntese do sistema partícula magnética-fármaco (Fe60h-Ox ) ..................................15 4.4. Caracterizações ........................................................................................................16 4.5. Ensaio Microbiológico ...............................................................................................16 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................18 5.1. Síntese de magnetita ................................................................................................18 5.2. Partícula magnética com Oxacilina ...........................................................................20 6. CONCLUSÃO ..............................................................................................................25 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................26 7. APÊNDICE ..................................................................................................................33 7.1. ANEXAÇÃO DO ARTIGO .........................................................................................33 7.2. ABSTRACT...............................................................................................................34 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 1. INTRODUÇÃO Os sistemas magnéticos carreadores de fármacos são promissores instrumentos em medicina devida suas peculiares propriedades funcionais de alterar ou controlar a cinética de distribuição do fármaco, não somente direcionando-o ao foco da doença, mas também prevenindo que ele atinja setores onde sua atividade pode ser potencialmente tóxica ou a degradação facilitada (Yamada, Kurumada et al., 2007; Chertok, David et al., 2010; Cao, Han et al., 2011); e de produzir imagens através de intensificação de sinais de relaxação do núcleo do hidrogênio por ressonância magnética, possibilitando o diagnóstico de doenças, ou monitoramento em tempo real da distribuição do fármaco na área afetada (Okuhata, 1999; Jain, Reddy et al., 2008; Jain, Richey et al., 2008). Materiais como o óxido de ferro magnetita apresentam características magnéticas singulares que favoreceram sua disseminação na área biomédica como vetores para tratamentos sítio-específico de fármacos, contraste para obtenção de imagem por ressonância magnética, separação celular, estudos de motilidade gastrointestinal, hipertermia, entre outros (Honda, Kawabe et al., 1998; Dresco, Zaitsev et al., 1999; Cordova-Fraga T, 2004; Li, Kawashita et al., 2010). Entretanto, para o uso in vivo é necessário o uso de partículas nanométricas monodispersas e não-aglomeradas para que aja homogeneidade em suas propriedades (magnética, elétrica e mecânica), por isso diversas pesquisas tem sido desenvolvidas no intuito de obter partículas estáveis (Jiang, Wu et al., 2010; Suter, Ergeneman et al., 2011). A metodologia mais comumente empregada para síntese de magnetita é a co-precipitação de sais de ferro II e III (Massart, 1981), entretanto é comum obter ampla faixa de tamanhos de partícula, o que pode ser um problema para absorção e principalmente para administração intravenosa. Uma alternativa amplamente explorada é a utilização de revestimentos que confiram um impedimento estérico à união das partículas, prevenindo a aglomeração (Massart, 1981; Korolev, Ramazanova et al., 2002), e outra opção, ainda pouco explorada, é o emprego de uma rota alternativa com abordagem física como a Moagem de Alta Energia. 1 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 2. OBJETIVO 2.1. Objetivo Geral Obter um vetor magnético em escala nanométrica com boas propriedades para vetorização intravenosa magnética de Oxacilina para tratamento de infecções por S. aureus. 2.2. Objetivos Específicos * Produzir magnetita no moinho de bolas; * Verificar a influencia do tempo de moagem na síntese de magnetita; * Caracterizar as amostras quanto à estrutura interna, tamanho e propriedades magnéticas; * Promover a ligação direta de Oxacilina à magnetita; * Caracterizar o sistema quanto à estrutura interna, tamanho e propriedades magnéticas; * Verificar a integridade do fármaco após o processo de moagem de alta energia. 2 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 3. REVISÃO DA LITERATURA A resistência é um mecanismo de defesa dos organismos. Ela pode se desenvolver naturalmente em presença de substancias tóxicas, através de mutações genéticas que alteram a função ou expressão de genes próprios, ou pode ser adquirida através de troca de genes com outro organismo, e garantem uma maior adaptação a um meio ambiente hostil (Fernández, Breidenstein et al., 2011). Bioquimicamente essas alterações podem se refletir em três estratégias de escape (Fig.1.): (1) destruição da molécula nociva, (2) modificação do alvo celular, ou (3) síntese de bombas de efluxo. Fig.1. Mecanismos de resistência a antibióticos numa bactéria (adaptado de (Engler, Wiradharma et al., 2012)). O desenvolvimento de resistência em micro-organismos patogênicos tem gerado grande preocupação devido à significância clínica tomada quando a resistência resulta em redução na eficácia terapêutica a um tratamento empírico (Andersson e Hughes, 2010). Em consequência, o uso sequencial de antibióticos concede às bactérias a possibilidade de acúmulo de mutações e desenvolvimento de multirresistência (Harris, Worthington et al., 2012). Assim, há uma baixa 3 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas considerável no arsenal terapêutico, tornando a cura demorada e cara, ou, por vezes, inatingível (Costelloe, Metcalfe et al., 2010). Apesar de, por anos, ter se associado a resistência antimicrobiana à infecções hospitalares, as bactérias resistentes provenientes do cenário comunitário vêm tomando espaço em vários estudos ambientais. Devido à disseminada utilização de antibióticos tanto na clínica médica, quanto na agricultura e pecuária, tem sido observada grande pressão seletiva ambiental para o desenvolvimento e disseminação dos vários mecanismos de resistência. (Andersson e Hughes, 2012). A seleção de cepas é frequentemente atribuída à presença de antibióticos em doses subterapêuticas, como encontrada na maioria dos usos não-clínico e em caso de abandono de tratamento (Kohanski, Depristo et al., 2010; Hughes e Andersson, 2012). A atividade do fármaco é conferida pela capacidade de matar ou alterar o crescimento da bactéria, entretanto quando a dose não é suficiente para destruir toda a população bacteriana os micro-organismos mais resistentes sobrevivem. Staphylococcus aureus é um dos mais importantes patógenos oportunistas humanos e, provavelmente, o mais conhecido e estudado exemplo de desenvolvimento de resistência bacteriana, sendo capaz de reproduzir todos os mecanismos de resistência conhecidos (Mccallum, Berger-Bächi et al., 2010). É atualmente, um dos mais notórios micro-organismos envolvidos em infecções nosocomiais, encontrado frequentemente em superfícies de implantes contaminados com biofilmes (Shirtliff, O' May et al., 2011; Fangtham e Baer, 2012). O grande interesse no estudo de S. aureus se dá principalmente por se tratar de um patógeno comum e bastante virulento, que em essência, seria susceptível a todos os antibióticos empregados na clínica até então, não fosse sua versatilidade em desenvolver resistência (Chambers e Deleo, 2009). Os fármacos beta-lactâmicos têm sido a primeira escolha e a mais efetiva para o tratamento de infecções por S. aureus em anos, entretanto sua eficácia tem reduzido bastante com o surgimento de cepas multirresistentes, denominadas genericamente de MRSA – Methicillin-Resistant (Rodriguez, Agudelo et al., 2010). 4 Staphylococcus aureus Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas A Oxacilina (5 metil-3 fenil-4-isoxazolil penicilina sódica) (Fig.2.) é uma penicilina sintética resistente à penicilinase de grande importância para o tratamento de infecções estafilocócicas, entretanto sua perspectiva de uso tem sido reduzida com o aparecimento de cepas multirresitentes, apesar dos relatos de cepas com características de MRSA genotipicamente, mas que apresentam susceptibilidade a esse fármaco (Hososaka, Hanaki et al., 2006; Sharff, Monecke et al., 2012; Labrou, Michail et al., 2012). Fig.2. Estrutura molecular da Oxacilina (Sun, Nukaga et al., 2002). Alternativamente, o desenvolvimento de novas moléculas ativas para suprir a escassez de opções na reserva terapêuticas parece inviável, já que o tempo gasto para desenvolver e liberar a distribuição de um novo produto no mercado poderia implicar em mudança de cenário clínico, com um novo perfil de multirresistência. A estratégia atualmente proposta é o emprego de adjuvantes farmacológicos, sejam eles outro antibiótico ou uma molécula bioativa, moléculas carreadoras por exemplo (Kalan e Wright, 2011; Harris, Worthington et al., 2012). Após a administração dos medicamentos, os princípios ativos tendem a se distribuir para vários tecidos e órgãos segundo processos que ocorrem em função das propriedades físico-químicas da molécula, entretanto, com o emprego de carreadores, devido a suas características específicas, esses que passam a ser responsáveis pelas propriedades farmacocinéticas do princípio ativo (Pusieux F, Treupel Lr, 1989). 5 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Os vetores conhecidos atualmente podem ser definidos, quanto a sua natureza, em biológicos e físico-químicos. Eritrócitos, bactérias, vírus e príons são exemplos de vetores biológicos e, como tais, apresentam o inconveniente de ampla variedade de genótipos e fenótipos, além dos custos de processamento elevados. Por outro lado, os sistemas físico-químicos afirmam-se como vetores de alto potencial, pois suas características e propriedades são mais facilmente controladas e reproduzidas (Murilo, 2001). Dentre os vetores físico-químicos, os materiais particulados com propriedades magnéticas são candidatos promissores à vetorização de fármacos em virtude de sua capacidade de polarização e desenvolvimento de mobilidade magnetoforética na presença de um campo magnético. Assim, um fármaco associado a tais partículas pode ser ativamente direcionado ao local de interesse por meio da aplicação localizada de um campo magnético externo (Fig.3.) (Voltairas, Fotiadis et al., 2002). Fig.3. Exemplo esquemático da vetorização magnética (adaptado de (Alexiou, Tietze et al., 2011)). Outra propriedade relevante dos carreadores magnéticos é o potencial bactericida dos materiais utilizados. O emprego de metais na antibióticoterapia não é recente, de fato há várias classes de antibióticos que apresentam íons 6 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas metálicos em sua estrutura, os quais estão intimamente ligados a sua atividade antimicrobiana (Refat, El-Hawary et al., 2012). E nas últimas décadas, os esforços têm sido direcionados no sentido de investigar a possível atividade antimicrobiana de partículas de óxido metálico em escala nanométrica (Stoimenov, Klinger et al., 2002; Jones, Ray et al., 2008; Gokulakrishnan, Ravikumar et al., 2012; Azam, Ahmed et al., 2012). Associada à essa possível atividade, a utilização de nanopartículas de materiais metálicos já é bastante difundida em estudos para diagnóstico, terapia e pesquisa médica (Honda, Kawabe et al., 1998; Dresco, Zaitsev et al., 1999; Cordova-Fraga T, 2004; Li, Kawashita et al., 2010). Apesar da grande versatilidade dos sistemas magnéticos como transportadores sítio-específico de moléculas ativas, a sua utilização em organismos vivos requer que algumas considerações sejam atentadas. Do ponto de vista biológico os vetores devem ser atóxicos e biocompatíveis, não suscitar uma resposta imunológica ou provocar danos ao ambiente orgânico; e do ponto de vista estrutural, características como tamanho, forma, área de superfície e propriedade magnética intrínseca devem ser cuidadosamente controlados. O tamanho das partículas é crítico em sistemas para uso in vivo, uma vez que células e elementos biológicos limitam-se às proporções de até 100 µm, e, portanto o mais conveniente seria que os carreadores não ultrapassassem muito essas dimensões (Tomitaka, Koshi et al., 2011). Adicionalmente, a internalização das partículas e as propriedades magnéticas dependem fortemente do tamanho das partículas (Fig.4.). A administração sistêmica de partículas grandes, com diâmetro superior à 200 nm, geralmente resulta em retenção no baço e/ou remoção pelas células do sistema fagocitário, implicando em uma diminuição do tempo de circulação das partículas na corrente sanguínea. Por outro lado, partículas pequenas, com diâmetro inferior a 10 nm, são rapidamente removidas através dos espaços intercelulares e pelo clearance renal (Hans e Lowman, 2002; Neuberger, Schopf et al., 2005). 7 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Fig. 4. Influencia do tamanho das partículas no seu comportamento em diferentes regiões do organismo (adaptado de (Alexiou, Tietze et al., 2011)). O tamanho mais adequado à administração intravenosa está entre 10 e 100 nm, pois são pequenas o suficiente para evadirem-se do sistema retículoendotelial e são capazes de permear os pequenos capilares sanguíneos promovendo assim uma distribuição tecidual efetiva (Hans e Lowman, 2002; Neuberger, Schopf et al., 2005). A superfície química das partículas está intimamente relacionada ao seu tamanho: quanto menores as partículas, maior a área de superfície. Consequentemente, é observada uma elevada razão superfície-volume, e as partículas tendem a se agregar para reduzir suas energias de superfície (Mohammad-Beigi, Yaghmaei et al., 2011). Contudo, como a faixa de tamanho requerida não pode superar os 100 nm, as nanopartículas são usualmente revestidas ou funcionalizadas. Esses tratamentos são vastamente descritos na literatura não somente para diminuir a instabilidade do sistema (Li, Church et al., 2012), mas também para aumentar ou prover biocompatibilidade (Covaliu, Jitaru et al., 2012), reduzir toxicidade (Park, Lim et al., 2006), proteger o vetor de alterações (Silva, Egito et al., 2008), promover interação carreador-fármaco 8 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas (Wang, Guan et al., 2012), favorecer uma liberação prolongada, tornar o sistema furtivo, ou fornecer ligantes específicos ao alvo desejado (Sung, Suk et al., 2013). Além da superfície, o tamanho também ditará a característica magnética do vetor. Em dimensões coloidais, é possível observar em alguns materiais o desenvolvimento de uma propriedade magnética bastante desejável a sistemas de utilidade médica, o superparamagnetismo. A propriedade superparamagnética surge como um efeito de tamanho finito (Mohammad-Beigi, Yaghmaei et al., 2011). Quando as dimensões de uma partícula magnética estão abaixo do valor crítico, (esse valor é dependente do material e da temperatura), a energia de anisotropia necessária para transpor a barreira energética de um estado de orientação magnética para outro é equiparável à energia térmica, assim à temperatura ambiente ocorrem flutuações na direção da magnetização (Fig.5.) (Pati, Bhushan et al., 2011; Suter, Ergeneman et al., 2011). É um fenômeno verificado em nanoestruturas quando há a transição do tamanho crítico, e o material passa de multidomínio à monodomínio ferri ou ferromagnéticas (Pati, Bhushan et al., 2011). Como resultado, não é verificado a presença de histerese nem remanência, o material não guarda “memória magnética”. Essa propriedade é de suma importância em aplicações biomédicas uma vez que a ausência de magnetismo residual previne a aglomeração das partículas e eventual bloqueio de capilar, ou formação de depósitos. Caso apresentem momento magnético diferente de zero, essas podem se atrair mutuamente gerando um aglomerado. No entanto, na presença de campo magnético aplicado teremos magnetização e atração das partículas na direção do campo, consequentemente, aglomeração no local de interesse, esse fato torna essas partículas fortes candidatas na área de vetorização. 9 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Fig.5. Transição magnética de nanopartículas, de ferromagnéticas para superparamagnéticas: diagrama de energia de nanopartículas magnéticas com diferentes alinhamentos de spin, mostrando o ferromagnetismo em nanopartículas grandes (acima) e o superparamagnetismo em nanopartículas pequenas (abaixo) (adaptado de (Jun, Seo et al., 2008)). Nanopartículas de núcleos metálicos ou de semi-condutores são exemplos de sistemas que oferecem propriedades magnéticas interessantes para aplicações em sistemas biológicos, e representam uma significativa classe de materiais inorgânicos que contribuiu ativamente para o desenvolvimento e consolidação dos estudos de tecnologia em nanomedicina (De, Ghosh et al., 2008). Os óxidos de ferro magnetita e maguemita (Fe3O4 e – Fe3O2) são os materiais mais adequados para aplicações in vivo, pois outros óxidos, contendo cobalto e níquel, por exemplo, apesar de apresentarem altos valores de magnetização, são bastante susceptíveis à oxidação e potencialmente tóxicos (Tran, Tran et al., 2012). 10 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas A magnetita (Fe3O4) é um dos compostos mais discutidos para o uso na área biomédica (Alexiou, Tietze et al., 2011). Mineral magnético abundante, amplamente distribuído tanto no meio ambiente quanto em organismos vivos, tendo sido descrito em organismos unicelulares como bactéria, até os mais complexos como os seres humano (Størmer, Mysterud et al., 2011). Trata-se de uma estrutura cúbica de espinélio inverso com parâmetro de rede a = 0,8397 nm, composta por cátions de ferro de valência +3 ocupando sítios tetraédricos, e Fe 3+ e Fe2+ ocupando sítios octaédricos (Fig.6.) (Friák, Schindlmayr et al., 2007; Hamie, Dumont et al., 2012). Essa flutuação de cátions di e trivalentes em posições octaedrais confere à magnetita boa condutividade à temperatura ambiente e propriedades magnéticas singulares como o superparamagnetismo (Mei, Valter et al., 2012). Fig.6. Estrutura fundamental da magnetita: (a) célula unitária e (b) sítios tetraédricos e octaédricos (Friák, Schindlmayr et al., 2007). A magnetita pode ter vários estados de oxidação, dependendo da quantidade de Fe+2 na estrutura (Gorski e Scherer, 2010). O grau de oxidação do material pode ser calculado comparando as razões de Fe +2 e Fe+3 (x), segundo a equação: x = Fe2+/Fe3+ = (1 − 3δ)/(2 + 2δ), onde encontramos magnetita pura quando δ = 0 e x = 0,5, com valores de δ = 1/3 temos magnetita completamente oxidada (Gorski e Scherer, 2010; De Carvalho, De Medeiros et al., 2013). Esse grau de oxidação, além de indicar o grau de pureza demonstra alterações no 11 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas parâmetro de rede do material, e consequentemente, alterações em sua estrutura e características magnéticas. É importante ressaltar que no organismo a magnetita é biodegradada, sofrendo metabolização em ferro e oxigênio pelas enzimas presentes nos vacúolos digestivo de células e pelo baixo pH lisossômico, sem gerar componentes tóxicos nesse processo (Kuznetsov, A. Brusentsov et al., 1999). Estudos mostraram que o ferro integra-se às reservas normais do organismo, sendo encontrado em hemácias e no fígado, onde ficam armazenadas grandes reservas de ferro do organismo (Mishra, Patel et al., 2010). Como a homeostase do ferro é regulada pela excreção e absorção, espera-se que após a administração das partículas, a absorção intestinal seja reprimida e a excreção seja aumentada (Weissleder, Bogdanov et al., 1995; Brigger, Dubernet et al., 2002). A magnetita utilizada na pesquisa é geralmente obtida de forma sintética, e sua produção representa um passo fundamental e crítico para o desenvolvimento de sistemas de vetorização magnéticos. Variações nos parâmetros de síntese podem resultar em mudança na ordem estrutural, criação de fronteiras antifase, e até no surgimento de camadas na superfície da partícula sem atividade magnética (Gupta e Gupta, 2005). Convencionalmente, partículas de magnetita são sintetizadas pelo método da co-precipitação de sais de ferro FeSO4 e FeCl3 1:2 em meio alcalino (Massart, 1981). Entretanto, há grande dificuldade tecnológica no controle de tamanho, forma, estabilidade e dispersividade, por essa técnica. As partículas obtidas apresentam alta energia de superfície, o que conduz ao crescimento da partícula (Wu, He et al., 2008). Além disso, o meio polar favorece as interações hidrofóbicas entre as partículas (Gupta e Gupta, 2005), fazendo necessária a adição de uma nova etapa na síntese da magnetita, de modificação da superfície (Silva, Egito et al., 2008). Assim estabilizantes como tensoativos, óxidos ou polímeros são rotineiramente empregados para conferir estabilidade e por vezes, grupos funcionais às partículas, restringindo a formação de aglomerados (Li, Huang et al., 2008; Jiang, Wu et al., 2010). Outras técnicas como decomposição térmica, microemulsão, síntese hidrotérmica, sonoquímica, reações sol-gel, entre outras, se propõem a 12 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas aperfeiçoar a produção de partículas magnéticas com o desenvolvimento de rotas mais rápidas (com menos etapas), ou que proporcionem material de melhor qualidade e menor tamanho, no entanto essas metodologias empregam solventes orgânicos, que requerem maior cuidado no descarte de seus resíduos pois são potenciais poluentes ambientais e findam por encarecer o processo (Wu, He et al., 2008). Uma alternativa ainda pouco explorada é a moagem física. Esse processo é correntemente utilizado em farmácia para redução e homogeneização de pós. Em engenharia, o emprego de moinhos coloidais de alta energia é visado tanto como instrumento para redução de tamanho de minerais, como para criação de efeitos mecanoquímicos (transformação de fase e reação de estado sólido), e na síntese de ligas (Fig.7.) (Gaisford, Dennison et al., 2012; Khayati e Janghorban, 2012). Fig.7. Esboço esquemático do método de moagem de pós: (a) movimentação das bolas no cadinho, (b) processo de quebra e soldagem a frio (Khan, Zhang et al., 2000). O uso de materiais modificados pelo processo de moagem vem sendo discutido no campo da engenharia tissular, uma vez que modificações por 13 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas funcionalização da superfície podem influenciar interações celulares (Rahman, Seth et al., 2009). Outras vertentes estudadas são o preparo de biomateriais, como ligas biocompatíveis para aplicações ortopédicas (Nouri, Hodgson et al., 2011) e síntese de materiais magnéticos de alta magnetização de saturação, especialmente superparamagnéticos para aplicações em clonagem genética, vetorização de fármacos, MRI, separação magnética, entre outras (Lemine, Bououdina et al., 2011; Bai e Wang, 2005). Nos trabalhos de Janot e Guérard há a proposta inicial da síntese parcial de magnetita quando água e ferro metálico são submetidos à alta energia num moinho de bolas, objetivando a obtenção de maguemita (Janot e Guérard, 2002). Posteriormente, Can e cols., baseados nesses estudos iniciais, propuseram a técnica como um procedimento novo, barato e efetivo, para produção de magnetita (Can, Ozcan et al., 2010). Suas vantagens incluem a obtenção do material na forma de pó fino com tamanho de partícula e grão muito pequenos devido ao impacto das bolas do moinho promovendo abrasão do material; e aquisição de matéria seca, o que previne processos de oxidação que ocorrem no meio aquoso ou durante a secagem do ferrofluido (Can, Ozcan et al., 2010; Poudyal, Altuncevahir et al., 2004; Chen, Ni et al., 2007; Katubilwa, Moys et al., 2011). Baseando-se nessa técnica, nós avaliamos variações na síntese de magnetita à base de água para obter um vetor melhorado de forma simples e efetiva (De Carvalho, De Medeiros et al., 2013), e para promover a interação vetor-fármaco. 14 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Materiais Para a síntese de magnetita foram utilizados ferro metálico obtido da Merck e água destilada, previamente pesados e submetidos à moagem em um Moinho de Bolas Planetário (Fritsch Pulverisette 6) equipado com cadinho de aço inoxidável de 45 cm3 de capacidade, contendo dez bolas (do mesmo material do recipiente) de 10 mm de diâmetro. Oxacilina cristalina obtida da Sigma-Aldrich foi utilizada na preparação do sistema para vetorização de antibióticos; e o Ágar Caseína Soja e a cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538 (do Banco de Cepas da Fiocruz-RJ) foram gentilmente cedidos pelo Laboratório Central Dr. Almino Fernandes - LACEN/RN. 4.2. Síntese das partículas magnéticas (PM) A magnetita preparada por moagem mecânica teve o pó de ferro metálico e água destilada como matérias-primas para síntese. O equipamento foi operado na razão 1:20 massa/bola, à 300 rpm de acordo com a equação (1): 3Fe + 4H2O → Fe3O4 +4H2, (1) seguindo a metodologia de Can e cols. (Can, Ozcan et al., 2010) com algumas modificações. As moagens foram realizadas em tempos de 10, 40, 60 e 96 h. 4.3. Síntese do sistema partícula magnética-fármaco (Fe60h-Ox ) A preparação de Fe60h-Ox foi realizada por moagem de alta energia, empregando magnetita obtida após 60 h de moagem e Oxacilina cristalina na proporção 1:1 em peso molecular. As amostras foram preparadas por moagem, forçadas à interação por atrito no interior de um moinho de bolas contendo 10 bolas de 10 mm com razão massa/bola 1:20 à 300 rpm durante um período de 10 h. Foi feita também a mistura física (MF) de Fe60h e Oxacilina para servir de branco para a análise de Infravermelho. Para essa preparação foi utilizada a 15 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas mesma proporção de Fe60h-Ox, com diferença na homogeneização, nesse caso, os reagentes foram misturados em almofariz de ágata até aparente uniformidade. 4.4. Caracterizações Os produtos obtidos foram caracterizados quanto a estrutura cristalina por Difração de Raio-X (DRX) em um difratômetro Rigaku Uniflex II, operando com radiação Cu Kα (λ= 1.5406 Å) e passo de 0.05º à velocidade de 5 min-1, no intervalo de 10º < 2θ < 90º, temperatura ambiente. Os espectros de Infravermelho (IF) foram obtidos pelo equipamento de Infravermelho Perkin-Elmer Modelo Spectrum 65, varrendo de 4000 – 400 cm-1. Cerca de 10 mg de cada amostra foi pesado e misturado com 100 mg de KBr em almofariz de ágata até a homogeneidade. Posteriormente o material foi prensado para obtenção dos discos utilizados no aparelho. As curvas de magnetização foram obtidas por técnica de magnetometria de amostra vibrante (VSM) em equipamento elaborado no DFTE da UFRN. As amostras foram submetidas a campos magnéticos de magnitude de -1,5 a +1,5 T, temperatura ambiente. 4.5. Ensaio Microbiológico O ensaio para verificação da manutenção da atividade antimicrobiana foi realizado pelo método de difusão em ágar para as amostras PM e Fe60h-Ox. A inoculação foi feita partir de uma cultura em placa da cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538. Toca-se na superfície de três a quatro colônias com a mesma morfologia e suspende em 3 a 4 mL de solução fisiológica estéril. O ajuste do inoculo é feito para a escala de Mac Farland 0,5. Dentro de 15 minutos após o ajuste do inoculo, procedeu-se a semeadura introduzindo um swab na suspensão ajustada e semeou-se na superfície do Agar em três direções diferentes. Em seguida, foi feito um poço no centro da placa com cilindro de material inoxidável de diâmetro interno de 6 mm ± 0.1 mm e diâmetro externo de 8 mm ± 0.1 mm na superfície da placa inoculada (Anvisa, 2010). Adicionou-se 25µl de um suspensão 3,1 µg/µL de Fe60h-Ox (amostra) e 2 µg/µL de Oxacilina padrão (controle) nos poços, realizando-se para a amostra e controle o ensaio em triplicata. As placas foram mantidas em estufa 16 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas microbiológica à temperatura de 35 ºC por 24 h para então verificar-se o halo de inibição. 17 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Síntese de magnetita De acordo com os resultados do DRX podemos notar que mesmo nos tempos mais curtos é observada a formação de magnetita (Fig.8.), e que o aumento no tempo de moagem implica em maior pureza da magnetita obtida. Fig.8. Difratogramas obtidos para as amostras sintetizadas nos tempos de 10, 40, 60 e 96 horas; os quadrados vazios indicam os picos característicos da magnetita e os quadrados preenchidos, os picos característicos do α-Fe. Os dados do DRX mostram claramente a redução de tamanho do cristalito com o tempo de moagem, atingindo um valor mínimo de 12 nm na amostra de Fe96h, e o α-Fe parece ser totalmente consumido para formação de magnetita em tempos superiores à 40 h de moagem. Esse resultado contradiz o achado de Can e cols, onde tempos superiores à 48h resultavam em partículas de tamanho superior à 33nm (Can, Ozcan et al., 2010). 18 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Os parâmetros de rede calculados para das amostras batidas em 10 e 40 horas apresentaram valores bem próximos ao descrito para a magnetita pura (Cornell e Schwertmann, 2003). Entretanto esses valores vão reduzindo com moagens mais longas, provavelmente devido à parcial oxidação do Fe2+ das amostras, levando à formação de magnetita não-estequiométrica. Quando a oxidação é completa o material transforma-se em maghemita (γ-Fe2O3). Então podemos verificar que, através do parâmetro de rede podemos discutir a estequiometria da magnetita produzida. A tabela 1 mostra os parâmetros de rede e tamanhos calculados para as amostras e as intensidades relativas das fases observadas. Tabela1: Intensidades relativas das fases, parâmetros de rede e tamanhos obtidos na análise de DRX. Intensidade Parâmetro de rede Tamanho (nm) relativa (%) (Å) Amostra Fe Fe3O4 Fe Fe3O4 Fe Fe3O4 Fe10h 28 Fe40h Fe60h Fe96h Fonte: Dados do DRX 72 100 100 100 2,866 8,398 8,401 8,366 8,351 56 20 20 15 12 Com os dados da tabela 1 foi plotado um gráfico relacionando o tempo de moagem ao tamanho e parâmetro de rede dos produtos obtidos em 10, 40, 60 e 96h (Fig.9.). É possível observar inicialmente, que todos os tamanhos alcançados estão dentro do limite superparamagnético, indicando que todos os materiais apresentam essa propriedade. Analisando os parâmetros de rede encontrados, verificamos que a amostra produzida após maior tempo de moagem, amostra de 96 horas (Fe96h), apresenta o parâmetro de rede mais distante do valor característico da magnetita (linha vermelha superior) e mais próximo do parâmetro de rede da maguemita (linha vermelha inferior), indicativo de maior oxidação do material. Dentre as amostras mais próximas ao valor padrão de parâmetro de rede da magnetita, o produto de 10 horas (Fe10h) apresenta um alto teor de Fe que não reagiu e tanto esse quanto o produto de 40 horas moendo (Fe40h) apresentam tamanhos de cristalito próximos ao valor limite para o aparecimento da característica superparamagnética. Então a amostra sintesada 19 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas após 60 horas (Fe60h) foi a escolhida como material de melhores propriedades para ser utilizado na vetorização de Oxacilina. Fig.9. Parâmetro de rede e tamanho do cristalito dos produtos da reação de Fe e H2O no moinho de bolas em função do tempo de moagem. 5.2. Partícula magnética com Oxacilina A amostra Fe60h, escolhida como vetor de melhores propriedades para nosso estudo, foi forçada à interação com o fármaco Oxacilina através da moagem de alta energia durante 10 horas no moinho de bolas, e o resultado esperado é que a afinidade da magnetita por grupamentos amina e carboxílico (Chen, Ni et al., 2007; De, Ghosh et al., 2008) como os encontrados na molécula de Oxacilina, interajam formando um sistema estável. Para verificação das alterações que o processo de moagem poderia incutir à molécula do fármaco, foi feita também uma mistura física (MF) dos pós do vetor e do fármaco, nas mesmas proporções dos reagentes submetidos à moagem. 20 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Nas caracterizações das amostras com o fármaco podemos notar no DRX (Fig.10.) que os picos do fármaco apresentam uma queda considerável da intensidade quando comparado o padrão de Oxacilina (b), à mistura física (MF) (c) e à amostra vetor-fármaco (Fe60h-Ox) (d), possivelmente devido à inserção de nova fase no sistema. Entretanto, quando comparadas as fases de magnetita padrão Fe60h (a) à demais amostras, a intensidade se mantém com sutis alterações. A redução da organização cristalina da Oxacilina indica redução em seu tamanho e pode estar associado à desordem causada pela interação com o vetor magnético, quando submetido à ação mecânica. Fig.10. Difratogramas das amostras: (a) Fe60h; (b) Oxacilina; (c) Mistura física; e (d) Fe60h-Ox. As análises de Espectroscopia de Infravermelho, realizadas para verificação da integridade da molécula do fármaco frente à precária identificação dos picos característicos da Oxacilina na amostra Fe60h-Ox por DRX (Fig.11.) não mostraram diferenças significativas entre a amostra moída (d) e a MF (c) em relação ao padrão de Oxacilina pura (b). 21 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas Fig.11. Espectros de Infravermelho das amostras: A) Fe60h; B) Oxacilina; C) MF; e D) Fe60h-Ox . As frequências das vibrações C=C aromático, νNH e νC=O amídico, (νC=O) β-lactâmico e (νsCOO−)(νasCOO−) carboxilato, assinaladas para βLactâmicos (Fogazzi, Cantù et al., 2003) foram identificadas em todas as amostras com fármaco. Já estiramento Fe-O característico da magnetita (Roca, Marco et al., 2007; Cabrera, Gutierrez et al., 2008) parece encoberto pela vibração da ligação C-S, contribuindo para o alargamento dessa banda. É importante ressaltar que a integridade do anel β-lactâmico, responsável pela função bactericida do fármaco, parece ser conservada. A Tabela 2 trás a identificação das bandas citadas. Tabela 2 – Bandas relevantes de absorção no infravermelho para a Partícula Magnética (PM), Oxacilina pura, e sistemas Fe60h-Ox obtido por moagem e MF. Grupo Funcional ν C=O (β-lactâmico) ν C=O (amida) C=C (aromático) ν asCOO− δ NH (amida) ν sCOO− Fe60h (cm-1) Oxacilina Padrão (cm-1) Fe60h-Ox 1:1 MF 1:1 1760 1648 1622 1557 1470 1414 1760 1648 1623 1557 1470 1414 1759 1648 1622 1557 1470 1414 22 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas ν C–N e δ N–H (amida 1263 1263 1263 secundária) N–H (estiramento) 1015 1015 1015 C–O (flexão) ν C-S 581 580 580 v Fe-O 571 Fonte: Adaptado de (Roca, Marco et al., 2007; Cabrera, Gutierrez et al., 2008). Nas análises de magnetização (Fig.12) a curva de magnetização da amostra Fe60h se sobressai, como esperado já que a massa total da amostra fornece contribuição magnética. Nas amostras de Fe60h-Ox é verificada uma magnetização por volta de 15 emu/g, o que revelar que 34,9 % da amostra contribui magneticamente com o sistema, enquanto na MF a magnetização é inferior (10 emu/g) apesar dessa conter as mesmas quantidades de Fe60h e Oxacilina que a Fe60h-Ox . Justifica-se o resultado por uma não uniformidade da amostra MF. Fig.13. Curvas de histerese das amostras com Oxacilina em comparação com o padrão Fe60h. 23 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas O ensaio microbiológico foi realizado para verificar a integridade do fármaco e manutenção de sua atividade farmacológica após o processo de moagem. E como pode ser visto na figura 13 (Fig.13.), a placa apenas com solução salina (E), cresce homogeneamente em todo o meio, enquanto a triplicata de Fe60h-Ox (B), (C) e (D) formou um halo de inibição de 5,1 cm de diâmetro, equiparável ao padrão de Oxacilina (A), comprovando que o fármaco resiste ao processo proposto e mantém sua atividade bactericida. Fig.14. Ensaio microbiológico de inibição de crescimento em placa: (A) controle com Oxacilina; (B), (C) e (D) triplicata de Fe60h-Ox , e (E) controle com solução salina. 24 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 6. CONCLUSÃO Em conclusão, nós reportamos uma metodologia simples e de baixo custo para a produção de magnetita na forma de pó seco e fino. As características estruturais das magnetitas obtidos foram estudadas e comparadas em função do tempo de moagem, sendo escolhido o produto da reação de ferro e água processado durante 60 horas de moagem como o de melhores características e, portanto com boas perspectivas para vetorização. Em adição foi descrito um processo diferenciado utilizando moagem de alta energia em um moinho de bolos coloidal para fazer a interação da oxacilina diretamente sobre a superfície da magnetita, que de acordo com as caracterizações, não altera a molécula do fármaco e preserva a atividade bactericida da molécula e a atividade magnética do vetor, confirmando o desenvolvimento de um potencial sistema para tratamento de infecções localizadas ocasionadas por Staphylococcus aureus. 25 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alexiou, C., R. Tietze, et al. 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ANEXAÇÃO DO ARTIGO Título do Artigo: Synthesis of magnetite nanoparticles by high energy ball milling REVISTA: Applied Surface Science 33 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 7.2. ABSTRACT We report on the preparation of magnetite nanoparticles, with size ranging from 12 nm to 20 nm, by high energy ball milling. The synthesis is made using stoichiometric amounts of distilled water and metallic iron powder. The milled powder samples were analyzed by Mossbauer spectroscopy (MS), X-ray diffraction (XRD) and vibrating sample magnetometry (VSM). Our results indicate that the milling time is a key parameter of the synthesis. By increasing the milling time one achieves high purity magnetite samples. Also, the particle size decreases with the milling time. The sample milled during 10h contained a fraction of 56 nm metallic Fe particles and 20 nm magnetite particles. By increasing the milling time to 96h we have obtained samples made of only 12 nm magnetite particles. MS performed at room temperature showed a spectrum consisting of two sextets with hyperfine parameters related to iron ions occupying octahedral (A) and tetrahedral (B) sites. We have used a self-consistent method to investigate the impact of the dipolar interaction to drive the system to a magnetically blocked regime. Keywords: magnetite, iron, water, milling 34 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 35 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 36 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 37 Nanopartículas de magnetita com oxacilina obtida por moagem de alta energia para aplicações biomédicas 38
