influências de polimorfismos de citocinas na

INFLUÊNCIAS DE POLIMORFISMOS DE CITOCINAS NA
SUSCEPTIBILIDADE AO DENGUE
Marcelo Jun Sakiyama, Viviane Lika Masaki (PIBIC/Fundação AraucáriaUEM), Jeane Eliete Laguila Visentainer (Co-orientadora), Ricardo Alberto
Moliterno (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Ciências Básicas da
Saúde/Maringá, PR.
Ciências da Saúde.
Palavras-chave: citocina, polimorfismo, genotipagem
Resumo:
Dengue é a doença viral mais importante transmitida por vetores artrópodes.
Além de fatores ambientais, os fatores genéticos parecem ter importância na
manifestação da doença, pois mesmo em áreas endêmicas somente uma
pequena proporção de pessoas desenvolve a forma mais grave da doença.
Recentemente, polimorfismos de genes de citocinas têm sido relacionados
com sua produção e, assim, poderiam conferir flexibilidade na resposta
imune do individuo. Alguns estudos têm mostrado a influência de certos
alelos de citocinas no curso de infecções virais e bacterianas. A proposta
deste estudo foi a genotipagem de alelos dos seguintes genes de citocinas:
IL1 alfa (-889), IL1 beta (-511, +3962), IL12 (-1188), IFN-gama (+874), TGFbeta1 (-819, -1082), TNF (-238, -318), IL2 (-330, +166), IL4 (-33, -590,
-1098), IL-6 (-174), IL-10 (-592, -819, -1082), pela técnica PCR-SSP, de uma
população saudável não aparentada e de uma população com dengue da
região sul do Brasil. Os resultados de genotipagem foram utilizados nos
cálculos das freqüências genotípicas e fenotípicas destes alelos, com o
objetivo de avaliar a existência de associação entre o polimorfismo destas
citocinas e a ocorrência da dengue. Com relação aos genótipos, observou-se
uma diferença significativa entre pacientes e controles na freqüência de
genótipos de IL-4 nos três locus analisados (-1098, -590, -33). Observou-se,
ainda, um aumento da freqüência do genótipo T/C no códon 10 de TGF-beta.
Com relação à freqüência alélica, apenas o alelo T de IL4 -1098 apresentou-se
menos freqüente nos controles.
Introdução
Dengue é uma doença de etiologia viral transmitida principalmente pela
picada de mosquito Aedes aejhipty. O vírus do dengue é classificado como
RNA-vírus pertencente ao gênero Flavivirus (Flaviviridae). Atualmente, são
conhecidos quatro sorotipos do vírus, DEN 1, 2, 3 e 4.(1)
Na resposta imune contra o vírus da dengue os linfócitos ativados
liberam de citocinas, as quais possuem um papel importante na patogênese
da infecção pelo dengue. IFN-gama TNF-alfa, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL10, IL-12, IL-18 e TGF-beta1 são exemplos de citocinas envolvidas na
resposta imunológica ao vírus da dengue.(2)
Recentemente, genes de regiões reguladoras de citocinas têm sido
descritos, os quais parecem estar correlacionados com a sua produção.
Devido à influência exercida na produção de citocinas, estes polimorfismos
podem conferir flexibilidade na resposta imune. A presença de certos alelos
poderia, então, influenciar no curso de infecções virais, como o dengue,
onde as citocinas exercem importante papel na imunopatogenicidade.(3-8)
Desta forma, um estudo de associação de genótipos de citocinas com
o desenvolvimento do dengue poderia determinar os indivíduos susceptíveis
à doença. Além disso, como o padrão de citocinas em indivíduos que
evoluem para formas mais graves parece bem estabelecido, o estudo dos
genótipos de citocinas (referentes à sua produção) em indivíduos que
desenvolveram dengue poderia informar ao clínico o risco de um paciente
com dengue evoluir para uma forma mais grave da doença.
Materiais e métodos
COLETA E CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS DE SANGUE:
No total, foram coletadas 420 amostras de indivíduos com sintomas de
dengue na região de Maringá. Trezentas amostras foram coletadas sem
anticoagulante pela Secretaria de Saúde de Maringá, para a realização de
sorologia de detecção de anticorpos IgM específicos para o vírus da dengue.
Outras 120 amostras foram coletadas com anticoagulante EDTA. Destas 420
amostras, 239 (56,9%) confirmaram diagnóstico de Dengue por ELISA,
sendo que 101 amostras foram analisadas neste estudo, compondo o grupo
de pacientes. Das 181 amostras que não confirmaram o diagnóstico de
dengue, 100 compuseram o grupo controle neste estudo.
TIPIFICAÇÃO DOS ALELOS DE CITOCINA PELA TÉCNICA DE BIOLOGIA
MOLECULAR
No Laboratório de Imunogenética (Bloco I-90 sala 102) da
Universidade Estadual de Maringá foi realizada a técnica de Biologia
Molecular para genotipagem dos genes de citocinas (IL1 alfa (-889), IL1 beta
(-511, +3962), IL12 (-1188), IFN-gama (+874), TGF-beta1 (-819, -1082),
TNF-alfa (-238, -318), IL2 (-330, +166), IL4 (-33, -590, -1098), IL-6 (-174), IL10 (-592, -819, -1082) dos 101 pacientes e 100 controles. Extração do DNA:
Após o descongelamento das amostras de sangue, o DNA foi extraído,
usando o kit de extração PuregeneTM (Gentra System, Mineapolis, MN,
USA). Após avaliação da pureza do DNA e ajuste da concentração por
densidade ótica, as tipagens dos alelos dos genes de citocinas foram
realizadas pela técnica PCR-SSP (“polymerase chain reaction-sequence
specific primers”), usando o kit de genotipagem de citocinas (One Lambda ,
Canoga Park, CA, USA). Os fragmentos de DNA amplificados foram
separados por eletroforese, em cuba micro SSP gel System (MGS-B, One
Lambda, CA, USA), em gel de agarose a 2,5%, a 150 volts por 10 minutos.
A visualização das bandas, quando expostas à luz ultravioleta, foi realizada
pela coloração com brometo de etídio e a interpretação dos resultados foi
baseada na presença ou ausência do fragmento específico de DNA
amplificado. Para verificar a integridade da reação de PCR, foi utilizado um
par de iniciadores como controle interno. Para a interpretação do produto
amplificado, foram utilizadas fichas-padrão fornecidas pelo fabricante. As
reações foram documentadas em fotografias. (aparelho de fotografia
Polaroide MP-4 Land). As freqüências genotípicas e alélicas para cada SNP
foram obtidas por contagem direta e comparadas pelo teste do qui-quadrado
com correção de Yates ou pelo teste exato de Fisher. Valores de P iguais ou
inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
Resultados e Conclusão
O grupo de pacientes foi constituído por 53,5% mulheres e 46,4% homens,
com idade entre 6 a 75 anos (média = 35,5 anos; desvio padrão = 17,0),
sendo 88% caucasóides, 8,3% pardos e 3,7% negros. Já o grupo controle foi
constituído de 181 indivíduos (43,1%); destes, 58,6% eram mulheres e
41,4% homens, com idade entre 7 e 80 anos (média = 36,9 anos; desvio
padrão = 17,0); 87,3% eram caucasóides, 8,8% pardos e 3,9% negros.
Com relação à freqüência alélica, apenas os alelos de IL4 -1098
apresentaram discrepância quando comparado o grupo controle e o grupo de
pacientes (Tab 1).
Com relação aos genótipos, observou-se uma diferença significativa
entre pacientes e controles na freqüência de genótipos de TGFβ1 -1082 e IL-4
nos três locus analisados
(-1098, -590, -33) (Tab.2). Os genótipos C/T na
posição -1082 para citocina TGFβ1 e T/T nas posições -1098, -590 e -33
para citocina IL4 foram mais freqüentemente encontrados em pacientes que
nos controles. Já os genótipos T/G na posição -1098 e T/C nas posições
-590 e -33 para citocina IL4 foram mais freqüentes no grupo controle.
Em resumo, os resultados demonstram que os genótipos de IL4-1089
TT, -590 TC e -33TC e o genótipo de TGFB1 -1082 CG apresentaram-se
mais freqüente nos pacientes, enquanto os genótipos de IL4 -1098 TG, -590
TT e -33 TT, e o alelo -1098 G apresentaram-se mais freqüente nos controles. Observa-se que estas citocinas são anti-inflamatórias e que os genótipos que se apresentaram mais freqüentes nos pacientes são alto produtores, indicando a importância de uma boa resposta inflamatória para controle
da infecção.
Tabela 1. Freqüência alélica dos genes de citocinas que apresentaram
diferença significativa entre o grupo de pacientes que desenvolveram
Dengue em Maringá e região em 2008 e o grupo controle.
DP (N=101)
DC (N=100)
Citocina
Alelo
n
%
n
%
P
IL4
T
187
92,6
169
84,5
0,02
(-1098)
G
15
7,4
31
15,5
0,02
DP= pacientes, DC= controles, n= número de indivíduos que apresentaram o alelo,
% Freqüência alélica, N= número total de indivíduos.
Tabela 2. Freqüência genotípica dos genes de citocinas que apresentaram
diferença significativa entre o grupo de pacientes que desenvolveram
Dengue em Maringá e região em 2008 e o grupo controle.
Citocina
TGFβ1
(-1082)
IL4
(-1098)
(-590)
(-33)
Genótipo
C/C
C/T
T/T
T/T
T/G
G/G
T/T
T/C
C/C
T/T
T/C
C/C
DP (N=101)
n
%
17
16,8
52
51,5
32
31,7
87
86,1
13
12,9
1
1,0
12
11,9
38
37,6
51
50,5
9
8,9
32
31,7
60
59,4
DC (N=100)
n
%
21
21,0
37
37,0
42
42,0
71
71,0
27
27,0
2
2,0
2
2,0
53
53,0
45
45,0
1
1,0
46
46,0
53
53,0
P
0,56
0,05
0,56
0,01
0,02
0,99
0,01
0,04
0,52
0,02
0,05
0,44
DP= pacientes, DC= controles, n= número de indivíduosque apresentaram o alelo,
% Freqüência genotípica, N= número total de indivíduos.
Referências
1. Sabin A.B.; Schlesinger RW. Production of immunity to Dengue virus
modified by propagation in mice. Science. 1945,101,640-642.
2. Braga E.L.A.; Moura P., Pinto L.M.O.; Ignácio S.R.N.; Oliveira M.J.C.;
Cordeiro M.T. et al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001,96,229-232.
3. Meenagh, A.; Williams, F.; Ross, O. A. et al. Frequency of cytokine
polymorphisms in populations from Western Europe, Africa, Asia, the Middle
East and South America. Human Immunol. 2002, 63, 1055-1061.
4. Awad, M. R.; El-Gamel, A.; Hasleton, P. et al. Genotypic variation in the
transforming growth factor-β1 gene. Transplantation. 1998, 66(8), 10141020.
5. Fishman, D.; Faulds, G.; Jeffry, R. et al. The effect of novel polymorphisms
in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels,
and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J Clin
Invest. 1998, 102: 1369-1376.
6. Pravica, V.; Asderakis, A.; Perrey, C. et al. In vitro production of IFNgamma correlates with CA repeat polymorphism in the human IFN-gamma
gene. Eur. J. Immunogenet. 1999, 26, 1-3.
7. Wilson, A. G.; Symons, J. A.; Mcdowell, T. L. et al. Effects of a
polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on
transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94, 3195-3199.
8. Turner, D. M.; Williams, D. M.; Sankaran, D. et al. An investigation of
polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. Eur. J. Immunogenet.
1997, 24, 1-8.