Maria Edileuza Soares Moura - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
MARIA EDILEUZA SOARES MOURA
Resistência transmitida a antirretrovirais e diversidade genética do
HIV-1 em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí
Goiânia
2014
i
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS
TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL
DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade
Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos
autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões
assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de
divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): MARIA EDILEUZA SOARES MOURA
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
Vínculo
empregatício
autor
Agência de fomento:
do
[X] Tese
[X]Sim
[ ] Não
Universidade Estadual do Maranhão
Coordenação de Aperfeiçoamento Sigla:
CAPES
de Pessoal de Nível Superior
País:
Brasil
UF:
MA CNPJ:
Título: Resistência transmitida a antirretrovirais e diversidade genética do HIV-1 em
pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí.
Palavras-chave:
Epidemiologia molecular; HIV-1, Genotipagem.
Título em outra língua: HIV-1 transmitted drug resistance and genetic diversity
among patients from Maranhão and Piauí States.
Palavras-chave em outra língua:
Molecular Epidemiology; HIV-1; Genotyping.
Área de concentração:
Imunologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
11/02/2014
Programa de Pós-Graduação:
Medicina Tropical e Saúde Pública (IPTSP/UFG)
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Mariane Martins de Araújo Stefani
E-mail:
[email protected]
Co-orientador (a):*
Prof. Dr. Kelsen Dantas Eulálio (cpf: 328.178.603-06)
E-mail:
[email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
Concorda com a liberação total do documento [X] SIM
[
] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se
imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese
ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos
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antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança,
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impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
______________________________________ Data: 10 / 02 / 2015.
Assinatura do (a) autor (a)
1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
ii
MARIA EDILEUZA SOARES MOURA
Resistência transmitida a antirretrovirais e diversidade genética do
HIV-1 em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do
Título de
Doutor em Medicina
Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Prof.ª Dr.ª Mariane Martins
de Araújo Stefani
Coorientador: Prof. Dr. Kelsen Dantas
Eulálio
Goiânia
2014
iii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
M929r
Moura, Maria Edileuza Soares.
Resistência transmitida a antirretrovirais e diversidade
genética do HIV-1 em pacientes dos estados do Maranhão e
do Piauí [manuscrito] / Maria Edileuza Soares Moura. 2014.
128 f. : figs, tabs.
Orientador: Prof. Dr. Mariane Martins de Araújo Stefani.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014.
Bibliografia.
1. HIV (vírus) – Diversidade genética 2. Epidemiologia
molecular I. Título.
CDU: 616.98:578.828
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno (a): Maria Edileuza Soares Moura
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Mariane Martins de Araújo Stefani
Coorientador (a): Prof. Dr. Kelsen Dantas Eulálio
Membros:
1. Profª Drª Mariane Martins de Araújo Stefani
2. Prof. Dr. José Carlos Couto-Fernandez
3. Prof. Dr. Kelsen Dantas Eulálio
4. Profª Drª Sheila Araújo Teles
5. Profª Drª Simone Gonçalves da Fonseca
Data: 11/02/2014
v
Às pessoas vivendo com HIV/aids que, mesmo diante de tantas adversidades,
aceitam participar, como sujeitos, de pesquisas que somam no conhecimento sobre
o vírus e a epidemia.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por diariamente me inspirar na busca por o conhecimento que sustenta meu
cuidado ao próximo;
A Universidade Estadual do Maranhão - UEMA, instituição a qual pertenço por
proporcionar o Doutorado Interinstitucional aos seus docentes;
A Universidade Federal de Goiás / Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
por me proporcionar um estágio de bancada ao qual eu não teria oportunidade no
Maranhão;
Ao Laboratório Central de Saúde Pública "Dr Costa Alvarenga" / LACEN-PI,
especialmente, Symonara Karina Medeiros Faustino e Letiano Vieira da Silva por me
receberem tão cordialmente e me disponibilizarem o suporte laboratorial necessário
para a execução da coleta de material em Teresina - Piauí;
Ao Laboratório Central de Saúde Pública do Maranhão / LACEN - MA, em especial,
José de Ribamar Oliveira Lima e sua equipe por me oferecerem a retaguarda local
para armazenamento das amostras em São Luís - MA;
Ao Serviço de Atendimento Especializado do Instituto de Doenças Tropicais Natan
Portela / SAE - IDTNP, especialmente, ao Doutor Kelsen Dantas Eulálio por
compreender a proposta do estudo e ajudar na sua execução;
A minha estimada orientadora Professora Doutora Mariane Martins de Araújo
Stefani por aceitar o desafio de orientar uma candidata tão diferente do perfil dos
demais orientandos e, sobretudo, por me receber com grande cortesia e cordialidade
em Goiânia e em seu laboratório;
A equipe do Laboratório de Imunologia da Aids e Hanseníase / LIAH: Emerith,
Yanna, Aline, Regiane, Daniele, Rodrigo, Keila e Maurício por mostrarem-se tão
receptivos, disponíveis e solícitos.
vii
A Doutora Ludimila Paula Vaz Cardoso e a Mestre Mônica Nogueira da Guarda Reis
por todo o apoio e sugestões preciosas na construção de todo este estudo;
Ao meu amado esposo, Mauro Sérgio da Silva Lima por sua compreensão e
incentivo constante, reforçando a cada dia (com seu otimismo de sempre) que vai dar
tudo certo;
A meus pais e irmãos por aceitarem minha ausência passageira e reafirmarem em
cada encontro que três anos passam ‘rapidinho’;
A Vera Abreu e demais colaboradores da coleta do LACEN - PI por todo o calor
humano com que receberam os pacientes envolvidos neste estudo;
A Chrystianne Bringel por sua disponibilidade em me receber e ajudar com os
procedimentos de laboratório com os quais eu não tinha vivência;
A Iracema e Neide por sempre me chamarem quando tinha um novo paciente virgem
de tratamento no SAE-IDTNP, sem dúvida, uma ajuda valiosa;
A Isaura Danielle e Sâmia Maria Andrade por sua imensa colaboração no
recrutamento dos pacientes em São Luis – MA, muito obrigada pela disponibilidade,
mesmo com as correrias do mestrado e residência, respectivamente, ainda
colaboraram com o recrutamento de pacientes e coleta de amostras em São Luis MA;
Aos meus companheiros de DINTER por estarmos juntos nesta experiência de
superação, descobertas e aprendizado;
As demais pessoas que contribuíram de forma direta ou indireta para que eu
concretizasse este objetivo, registro aqui minha sincera gratidão.
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
01
1.1 Estrutura e características genômicas do vírus da imunodeficiência
01
humana
1.2 O ciclo replicativo do HIV-1
04
1.3 Diversidade genética do HIV-1
06
1.4 O curso da infecção por HIV-1
08
1.5 Classes de fármacos envolvidas no tratamento da infecção por HIV-1
11
1.5.1 Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos aos Nucleosídeos
12
(ITRNs)
1.5.2 Inibidores da Transcriptase Reversa Não Análogos aos Nucleosídeos
12
(ITRNNs)
1.5.3 Inibidores da Protease (IPs)
12
1.5.4 Inibidores da Integrase (INIs)
13
1.5.5 Inibidores de Fusão (IFs)
14
1.5.6 Inibidores de Entrada (IEs)
14
1.6 Terapia Antirretroviral (TARV)
14
1.7 Resistência do HIV-1 aos antirretrovirais
15
1.7.1 Resistência associada aos ITRNs
17
1.7.2 Resistência associada aos ITRNNs
19
1.7.3 Resistência associada aos IPs
20
1.8 Resistência Transmitida do HIV-1 aos ARVs
21
2. JUSTIFICATIVA
24
3. OBJETIVOS
26
ix
4. MÉTODOS
27
4.1 Área geográfica de abrangência e população alvo
27
4.2 Recrutamento dos pacientes e obtenção de amostras de sangue
28
4.3 Extração do RNA genômico
29
4.4 Síntese do DNA complementar através da retrotranscrição do RNA
29
4.5 Amplificação do Gene pol através da Reação em Cadeia da Polimerase
em duas etapas (“nested”-PCR)
30
4.6 Eletroforese em Gel de Agarose 1%
31
4.7 Purificação do produto amplificado obtido através da “nested”-PCR
31
4.8 Sequenciamento automatizado
32
4.9 Análise dos cromatogramas
33
4.10 Análise genética
33
4.11 Análise estatística
35
5. ARTIGOS
36
Artigo 1 - HIV-1 transmitted drug resistance and genetic diversity among
patients from Piauí State, Northeast Brazil
37
Artigo 2 - Low Rate Of Transmitted Drug Resistance May Indicate Low
Access To Antirretroviral Treatment In Maranhão State, Northeast Brazil
61
6. DISCUSSÃO
83
7. CONCLUSÕES
87
REFERÊNCIAS
88
ANEXOS E APÊNDICE
104
x
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Figura 1. Estrutura do HIV-1......................................................................................02
Figura 2. Genoma do HIV-1.......................................................................................03
Figura 3. Ciclo Replicativo do HIV-1.........................................................................05
Figura 4. Principais mutações no gene da TR associadas à resistência aos ITRNs....18
Figura 5. Principais mutações no gene da TR associadas à resistência aos ITRNNs.19
Figura 6. Principais mutações no gene da PR associadas à resistência aos IPs..........21
Artigo 1
Figure 1. Distribution of HIV-1 isolates obtained from ARV naïve patients across
Piauí State, located in Northeastern Brazil.. …..…………………………...…….....54
Table 1. Baseline and virologic characteristics of 96 HIV-1 ARV naïve subjects from
Piauí State, Northeast Brazil………………………………………………………...55
Figure 2. Phylogenetic classification in PR and RT regions of “pure” subtypes from
HIV-1 isolates obtained from ARV-naïve patients from Piauí State, Northeast Brazil
…………………………………………………..………………………………….. 56
Figure 3. Bootscanning analysis of recombinant HIV-1 sequences in protease and
reverse transcriptase regions from ten ARV-naïve patients from Piauí State,
Northeast Brazil…………………………………………………………………......58
xi
Table 2. Amino acid substitutions in protease and reverse transcriptase resistance-related
codons of patients from Piauí State, Northeast Brazil ……………..……..……...……...59
Artigo 2
Figure 1. Localization of HIV-1 resistant isolates obtained from ARV naïve patients
recruited in Maranhão State, located in Northeast Brazil.............…..……...…….....77
Figure 2. Phylogenetic classification of HIV-1 isolates from naïve patients with
concordant PR and RT regions from Maranhão State, Northeast Brazil………..….78
Figure 3. Bootscanning analysis of HIV-1 PR and RT regions of 15 recombinant
isolates from Maranhão State, Northeast Brazil.…...……………..………………...80
Table 1. Baseline characteristics of the subjects from Maranhão State, Northeast
Brazil………………………………………..……………………………………….81
Table 2. Amino acid substitutions in protease and reverse transcriptase resistancerelated codons of patients from Maranhão State, Northeast Brazil….….…………..82
Anexos
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa...............................................104
Anexo B – Comprovante de submissão dos artigos..................................................105
Anexo C – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.......................................106
Apêndice A – Questionário sobre a infecção pelo HIV............................................109
xii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
3TC - 2′,3′-dideoxy-3′-thiacytidine, comumente chamado, lamivudina
ABC - abacavir
Aids / SIDA - síndrome da imunodeficiência adquirida (do inglês, Acquired Immune
Deficiency Syndrome)
APV - amprenavir
ARV - droga antirretroviral
ATV - atazanavir
AZT – azidotimidina, comumente chamado, zidovudina
cDNA - DNA complementar
CPR - Calibrated Population Resistance
CRF - forma recombinante circulante (do inglês, Circulating Recombinant Form)
d4T - 2p,3p-dehydro-2p,3p-deoxy-thymidine 5p-triphosphate, comumente chamado
estavudina
ddI - didanosina
DNA - ácido desoxirribonucleico
dNTP - desoxirribonucleotídeo trifosfatado
DST / Aids - Doenças sexualmente transmissíveis / Aids
EDTA - ácido etilenodiaminotetracético
EFV - efavirenz
env – gene que codifica o envelope
FDA – Food and Drug Administration
FPV - fosamprenavir
FTC - emtricitabina
g - força centrífuga relativa a gravidade
HAART - terapia antirretroviral altamente ativa (do inglês, Highly Active
Antiretroviral Therapy)
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency
Virus)
HIV-1 - Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1
xiii
HIV-2 - Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 2
HR – região hepta repetida da gp41
IC/CI - intervalo de confiança (do inglês, confidence interval)
IDV – indinavir
IF/FI – inibidor de fusão (do inglês, fusion inhibitor)
INI - inibidor da integrase (do inglês, integrase inhibitor)
IN - integrase
IP/PI - inibidor da protease (do inglês, protease inhibitor)
IPTSP - Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
ITRN/NRTI - inibidor da transcriptase reversa análogo aos nucleosídeos (do inglês,
nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
ITRNN/NNRTI - inibidor da transcriptase reversa não análogo aos nucleosídeos (do
inglês, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
LACEN-PI - Laboratório Central e de Saúde Pública do Piauí
LACEN-MA - Laboratório Central e de Saúde Pública do Maranhão
LPV/r – lopinavir / ritonavir
LTR - repetições terminais longas (do inglês, Long Terminal Repeat)
MgCl2 – cloreto de magnésio
MS - Ministério da Saúde
MA - Maranhão
nef – gene que codifica a proteína nef (fator negativo)
NFV - nelfinavir
NVP – nevirapina
OMS - Organização Mundial da Saúde
pb - pares de base
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction)
PI - Piauí
PIC - complexo de pré-integração (do inglês, pre-integration complex)
pmoles/μL - picomolar/microlitro
pol – gene polimerase
PR – Protease
PVHA - pessoas vivendo com HIV/Aids
qsp - quantidade suficiente para
rev - gene regulador da expressão viral
xiv
RNA - ácido ribonucléico
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro
rpm - rotações por minuto
RT-PCR - transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase (do inglês, Reverse
Transcription - Polymerase Chain Reaction)
RTV - ritonavir
SAE – Serviço de Atendimento Especializado
SIV - Vírus da Imunodeficiência Símia (do inglês, Simian Immunodeficiency Virus)
SIVcpz - Vírus da Imunodeficiência Símia de chimpanzés
SQV - saquinavir
T-20 – enfuvirtida
TAE - Tris-Acetato-EDTA
TAMs – mutações dos análogos de timidina (do inglês, thymidine analog mutations)
tat – gene de transativação
TCD4+ - Linfócito T CD4+
TCD8+ - linfócito T CD8⁺
TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TDF – tenofovir disoproxil fumarate
TDR – Resistência transmitida a drogas (do inglês, transmitted drug resistance)
TDRM – mutações associadas a resistência transmitida a drogas antirretrovirais (do
inglês, transmitted drug resistance mutations)
TR/RT - Transcriptase Reversa (do inglês, Reverse Transcriptase)
UDI /IDU - Usuário de droga injetável (do inglês, injecting drug users)
UFG - Universidade Federal de Goiás
UNAIDS - Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/Aids (do inglês, Joint
United Nations Programme on HIV/AIDS)
UNESCO – Organização Educacional Científica e Cultural das Nações Unidas (do
inglês, United Nations Educational Scientific and Cultural Organization)
URF - forma recombinante única (do inglês, unique recombinant form)
vif - gene vif
vpr - gene vpr
vpu - gene vpu
WHO – Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization)
ZDV - zidovudina
xv
RESUMO
Em um país extenso como o Brasil, a vigilância da resistência transmitida a
antirretrovirais/TDR deve ser contínua e estendida a diferentes grupos populacionais
e regiões geográficas. Na última década, diferenças regionais significativas foram
relatadas na epidemia de HIV/aids no Brasil: redução na incidência de casos de aids
e mortalidade na região sudeste (epicentro da epidemia) contrastando com aumento
significativo de ambos parametros na região nordeste. O objetivo deste estudo foi
descrever a prevalência de TDR e subtipos de HIV-1 na protease-PR e parte da
transcriptase reversa-TR em isolados de pacientes virgens de tratamento que vivem
nos estados do Piauí e do Maranhão, nordeste, Brasil. Pacientes virgens de
tratamento antirretroviral/ARV recrutados
entre agosto 2011- junho 2012
(Maranhão, n=106; Piauí, n=89) tiveram o gene pol (protease/PR e 2/3 da
transcriptasecreversa/TR) sequenciado a partir do RNA. TDR foi avaliada mediante
uso da Calibrated Population Resistance (CPR) tool/Stanford HIV-1 Database,
subtipos de HIV-1 foram definidos pelo software REGA e por análise filogenética.
Entre os pacientes do Piauí (44 mulheres, 45 homens, 22 deles declararam-se homens
que fazem sexo com homens/HSH), a taxa de TDR foi 13,5%. TDR entre HSH foi
27,3%. Entre os homens heterossexuais, a taxa de TDR foi de 10% e entre as
mulheres 9,1%. Mutações de resistência a uma classe de ARV (inibidores
nucleosidicos ou não-nucleosidicos da TR/ITRN/ITRNN ou inibidores da PR/IP)
predominaram (10/12): M46L/V82F/L90M (IP); M41L/D67N (ITRN);
K103NS/E138A (ITRNN). Dois pacientes tiveram mutações de resistência a duas
classes de ARV: T215L (ITRN) e E138G/Y188L (ITRNN); T215N (ITRN) e F227L
(ITRNN). O subtipo B representou 86,6%, subtipos não B foram raros: subtipo F1
(n=1) e o subtipo C (n=1). Recombinantes intersubtipos B/F1, F1/B e B/C foram
observados em 11,2 % dos isolados. No Maranhão predominou mulheres (54,7%),
com mediana de idade de 31 anos (variação: 18-72); 78,3% relatou relação
heterossexual desprotegida, 17,9% dos homens declararam-se HSH, dois referiram
uso de drogas injetáveis. Entre os pacientes do MA 3,8% apresentou TDR (4/106).
TDR foi identificada em adultos (21-45 anos), a maioria do sexo masculino (3/4), 2
HSH, um usuário de droga injetável. Mutações associadas a resistência aos ITRN
(M184V; T215S) e aos ITRNN (K103S/N) foram detectadas. Mutações principais
aos IP não foram identificadas, quatro isolados apresentaram mutações acessórias aos
IP (L10I/F, A71T/V). O subtipo B representou 81,1% (86/106) dos isolados, o
subtipo F1 1,9% (2/106), o subtipo C 2,8% (3/106) e 14,2% (15/106) eram
recombinantes. A moderada prevalência de recombinantes BF detectada no PI e MA
onde a frequência de subtipo F1 é rara, sugere que recombinantes gerados no
sudeste/centro-oeste tenham sido introduzidos e estão circulando no nordeste. Nos
pacientes do PI, alta taxa de TDR observada entre HSH contrastou com taxa
moderada entre heterossexuais. Este resultado indica que a realização de testes de
genotipagem para resistência para avaliar TDR, principalmente entre HSH pode
contribuir para definir diretrizes de vigilância e delinear estratégias de prevenção
para auxiliar o controle da epidemia de aids na região nordeste, Brasil.
Palavras chave: Epidemiologia Molecular; HIV-1; Genotipagem.
xvi
ABSTRACT
In a vast country, like Brazil surveillance of transmitted drug resistance to
antiretroviral drugs/TDR should be continuous and extended to different locations
and exposure groups. In the last decade significant geographic differences have been
reported in the Brazilian AIDS epidemic: reduction in incidence of AIDS cases and
related mortality in the southeast region (epicenter of the epidemic) contrasting with
significant rise in both parameters in the northeast region. This study describes TDR
and HIV-1 subtypes in protease-PR and reverse transcriptase-RT regions among
antiretroviral (ARV) naïve patients from Piauí State (n=89) and Maranhão State
(n=106), northeast, Brazil recruited between August 2011 and June 2012. HIV-1 pol
gene (protease/PR and 2/3 of reverse transcriptase/RT) was sequenced from RNA.
TDR was evaluated using the Calibrated Population Resistance (CPR) tool/Stanford
HIV-1 Database, HIV-1 subtypes were defined by REGA software and phylogenetic
analyses. Among patients from Piauí State (44 females, 45 males, 22 of them were
men who have sex with men-MSM), overall TDR rate was 13.5%. TDR rate among
MSM was 27.3% while among heterosexual men TDR rate was 10% and 9.1%
among females. Single-class mutations to ARV (RT nucleoside and non nucleoside
inhibitors NRTI/NNRTI or PR inhibitors/PI) predominated (10/12):
M46L/V82F/L90M (PI), M41L/D67N (NRTI); K103NS/E138A (NNRTI). Two
patients had dual class mutations: T215L (NRTI) and E138G/Y188L (NNRTI);
T215N (NRTI) and F227L (NNRTI). Subtype B predominated (86.6%), non-subtype
B isolates were rare: subtype F1 (n=1), subtype C (n=1). B/F1, F1/B and B/C
intersubtype recombinants were observed in 11.2%. In Maranhão State females
predominated (54.7%), median age was 31 years (range: 18-72); 78.3%
reported heterosexual unprotected sex, 17.9% were MSM, two reported
intravenous drug use/IDU. SDRM TDR rate was 3.8% (4/106). TDR was
identified in adults (21-45 years), mostly males (3/4), 2 MSM, one IDU. Single-class
mutations associated with NRTI (M184V; T215S) or NNRTI (K103S/N) were
detected. No major PI mutation was identified; four isolates presented accessory
mutations to PI (L10I/F, A71T/V). Subtype B represented 81.1% (86/106), subtype
F1 1.9% (2/106), subtype C 2.8% (3/106) and 14.2% (15/106) were recombinants.
The moderate frequency of BF recombinants in PI and MA where subtype F1 is rare
suggests that recombinants generated in southeast/central-western were introduced
and are circulating in northeast Brazil. Among patients from PI, high TDR rate
observed among MSM ccontrasts with moderate rate among heterosexual patients.
This result indicates that genotyping tests to detect drug resistance and TDR, mainly
among MSM can contribute to define surveillance policies and to delineate
prevention strategies to help control AIDS epidemic in northeast, Brazil.
Keywords: Molecular Epidemiology; HIV-1; Genotyping.
xvii
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Estrutura e características genômicas do vírus da imunodeficiência humana
A síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA/aids) foi documentada pela
primeira vez em 1981 em uma publicação do Centers for Disease Control and Prevention
que descreveu casos de infecções oportunistas incomuns e doenças malígnas raras em jovens
homossexuais do sexo masculino (CDC 1981). Em 1983 o vírus da imunodeficiência
humana tipo 1 (HIV-1), o agente etiológico da aids, foi isolado (Barré-Sinoussi et al. 1983,
Gallo et al. 1983) e posteriormente classificado como um retrovírus da família Retroviridae,
do gênero Lentivirus (Case 1986).
Além do HIV-1, outro retrovírus denominado HIV-2 foi identificado em dois
pacientes com aids na África Ocidental, nos quais, as características do HIV diferia em
alguns componentes antigênicos (Clavel et al. 1986, Clavel 1987). Desta forma, o HIV-1 e
HIV-2 diferem na organização genômica (presença do gene vpx no HIV-2) e nas relações
filogenéticas com outros lentivírus de primatas.
O HIV-1 é o responsável pela pandemia e o HIV-2 está restrito a países no centro
oeste Africano com relatos de casos esporádicos de infecções nos países desenvolvidos
(Pinto & Struchiner 2006, de Silva & Weiss 2010). Uma das características mais
importantes do HIV-1 é seu extenso polimorfismo genético devido a sua alta taxa de
mutação. Esta diversidade genética pode estar relacionada a fatores distintos como: erros de
leitura da enzima transcriptase reversa (TR), alta taxa de replicação viral, rápido turnover
viral e eventos de recombinação entre diferentes subtipos (Spira et al. 2003).
O vírion ou partícula viral madura é composto por um envelope que consiste de
uma membrana de bicamada lipídica, derivada da célula hospedeira (Figura 1), e um
complexo de proteínas virais, com cadeias não covalentemente ligadas: a glicoproteína
gp120 (externa ao envelope) e gp41 (glicoproteína transmembrânica). O capsídeo viral é
composto pela proteína p24 e circundado por uma matriz proteica (p17), que está localizada
abaixo do envelope viral. As proteínas do nucleocapsídeo são, p7/p9, e dentro do capsídeo
viral se encontram o genoma de duas fitas simples de RNA e três enzimas virais, protease
1
(PR), TR e integrase (IN) que participam ativamente do ciclo replicativo (Barré-Sinoussi et
al. 1996).
Figura 1. Estrutura do HIV-1
Adaptada de [National Institute of Allergy and Infectious Diseases 2013]
Disponível em: [http://www.niaid.nih.gov/topics/hivaids]
O genoma do HIV-1 foi sequenciado em 1985 e apresenta estrutura típica dos
retrovírus, sendo formado por duas fitas simples e idênticas de RNA, com aproximadamente
9,2 quilobases (Kb) de comprimento flanqueado por duas regiões com repetições terminais
longas (LTR - long terminal repeat) que estão envolvidas na transcrição reversa do genoma
de RNA, na integração do provírus no genoma da célula hospedeira e na montagem de vírus
(Wain-Hobson et al. 1985, Sodroski et al. 1985).
O HIV-1 possui genes estruturais que codificam moléculas distintas: gene gag que
codifica as proteínas estruturais da matriz, capsídeo e nucleocapsídeo; gene env que codifica
as duas proteínas do envelope e o gene pol, responsável pela codificação das enzimas virais
TR, PR e IN (Figura 2) (Wain-Hobson et al. 1985, Barré-Sinoussi 1996).
Dentre as proteínas estruturais do HIV-1, a p24 representa a principal proteína do
capsídeo; a p17 é uma proteína da matriz; as proteínas p7 e p9 compõem o nucleocapsídeo e
2
ligam-se ao RNA; as proteínas p1 e p2 regulam a clivagem das proteínas de gag e p6 regula
o brotamento do vírus. As glicoproteínas do envelope gp41 e gp120 medeiam a ligação ao
receptor primário do HIV-1 que é a molécula CD4 e, a gp41 com ativação de seus peptídeos
fusogênicos atua na fusão do envelope viral com a membrana da célula hospedeira. As
enzimas necessárias para a replicação viral são: a TR (p66/p51), a PR (p10) e a IN (p32)
(Barré-Sinoussi, 1996). Além dos 3 genes estruturais env, gag e pol, o HIV-1 possui em seu
genoma 2 genes reguladores: tat e rev e 4 genes acessórios: vif, nef, vpu, vpr, que atuam em
diferentes etapas do ciclo replicativo, controlando a capacidade do HIV-1 de infectar uma
célula, produzir novas cópias de vírus ou causar a doença (Miller 1988, Barré-Sinoussi et al.
1996).
Enzimas
Proteínas acessórias
Proteínas estruturais
Figura 2. Organização do Genoma do HIV-1
Adaptada de [Stanford University 2013]
Disponível em:
[http://www.stanford.edu/group/virus/retro/2005gongishmail/HIV.html]
1.2 O ciclo replicativo do HIV-1
3
A entrada do HIV-1 na célula do hospedeiro acontece pela interação entre a gp120
e a molécula CD4 presente em linfócitos T, células dendríticas e macrófagos. A gp120
contém os domínios que interagem com o receptor primário (CD4) e correceptores (CXCR4,
CCR5). A gp41 ancora o complexo gp120/gp41 na membrana e também contém domínios
que são críticos para catalisar a reação de fusão entre o envelope viral e a membrana de
bicamada lipídica da célula do hospedeiro durante entrada do vírus (Figura 3) (Freed 2001).
Dentre os possíveis correceptores para o HIV-1, os mais importantes para a entrada
do vírus na célula do hospedeiro são o CCR5 (expresso em macrófagos e células
dendríticas) e o CXCR4 (expresso em linfócitos T CD4+ e algumas células natural killer). O
tropismo viral para linfócitos T CD4+ ou macrófagos/células dendríticas depende da escolha
do correceptor celular (CXCR4 ou CCR5, respectivamente) a ser usado no momento da
entrada na célula do hospedeiro (Zhang et al. 1998, Valentin et al. 2002, Bernstein et al.
2009, Funke et al. 2011, Valetin-Torres et al. 2012).
A glicoproteína gp120 possui cinco regiões constantes (C1 a C5) e cinco regiões
variáveis (V1 a V5). Ao ligar-se ao receptor CD4, a gp120 sofre alterações conformacionais
na região variável V3 e expõe os sítios de ligação para o correceptor. A partir destas
interações, ocorre na glicoproteína gp41 a ativação de peptídeos que ocasionam a fusão do
envelope viral à membrana celular hospedeira e, em seguida, ocorre a liberação do capsídeo
do vírus no citoplasma da célula e, por conseguinte, do RNA genômico viral e das enzimas
virais no citoplasma da célula do hospedeiro (Barré-Sinoussi et al. 1996).
Para estabelecer uma infecção na célula do hospedeiro, o HIV-1 precisa
transformar o seu genoma de RNA em uma molécula de DNA de fita dupla que, em seguida,
deve ser integrado no genoma celular. Pela ação da enzima viral TR se inicia a conversão do
RNA do genoma diplóide em um híbrido RNA-DNA. O RNA genômico é convertido em
DNA complementar (cDNA) e, em seguida, o cDNA é duplicado em DNA de fita dupla que
é transportado para o núcleo da célula hospedeira na forma de complexos de pré-integração
(PICs) para só então sofrer clivagens específicas e ser integrado pela enzima viral IN ao
DNA da célula do hospedeiro, constituindo o provírus. Uma vez que o genoma do vírus está
integrado, ele se comporta como um gene celular normal. O vírus pode tornar-se
transcricionalmente silencioso e entra em um estado de latência, sem ser replicado pela
célula hospedeira. Este DNA proviral integrado ao genoma da célula do hospedeiro servirá
de molde para a geração de RNA genômico e RNA mensageiro (RNAm) após a ativação da
célula infectada (Figura 3) (Barré-Sinoussi et al. 1996; Frankel &Young 1998).
4
Fusão HIVSuperfície da
Célula do
Hospedeiro.
RNA viral, transcriptase
reversa, integrase e
outras proteínas virais
entram na célula do hospedeiro.
Complexos de pré-integração.
Correceptor
(CCR5 ou CXCR4
Célula do Hospedeiro
DNA viral é
formado por
retrotranscrição
RNA viral
Transcriptase
reversa
DNA viral é transportado
até o núcleo e integrado
ao DNA do hospedeiro.
Iintegrase
DNA viral
DNA do hospedeiro
Virion Maduro
Novo RNA viral
Novo RNA viral é usado
como RNA genômico e
forma as proteínas virais.
O virus amadurece
pela PR e é liberado
da célula do
hospedeiro por
brotamento
Novo RNA viral e proteínas
movem-se pela membrana
celular, um novo, imaturo,
HIV é formado.
Figura 3. Ciclo Replicativo do HIV-1
Adaptada de [National Institute of Allergy and Infectious Diseases 2013]
Disponível em: [http://www.niaid.nih.gov/topics/hivaids]
Quando a célula infectada é ativada por antígenos ou citocinas, ocorre a ativação de
genes da célula hospedeira e do cDNA viral com consequente transcrição do DNA em
RNAm. O conjunto de RNAs transcritos é transportado para o citoplasma/ribossomos onde
as proteínas são produzidas. Os vírions são inicialmente montados próximo à membrana
celular na forma de partículas imaturas, compostas de um envelope glicoprotéico, RNA
5
genômico e poliproteínas virais. Durante ou após o “brotamento”, as partículas virais
passam por maturação que consiste na clivagem das poliproteínas gag e gag-pol pela ação
da PR viral, produzindo enzimas e proteínas estruturais do capsídeo (Kaplan et al. 1994).
O processamento das poliproteínas no vírion completa o ciclo de replicação do
HIV-1, tornando os vírions maduros capazes de infectar outra célula (Vaishnav & WongStaal 1991). A formação de novos vírions ocorre pelo empacotamento das proteínas
funcionais e do RNA viral, por fim os vírions são liberados por brotamento através da
membrana plasmática da célula infectada, permitindo, assim, que milhares de novas
partículas virais sejam geradas e infectem outras células propagando o ciclo replicativo
(Barré-Sinoussi et al. 1996).
1.3 Diversidade genética do HIV-1
A variabilidade genética do HIV-1 pode ser avaliada mediante análise filogenética
de sequências de genes virais ou mesmo do genoma completo do vírus. Baseado em
sequências de refrência dos genes gag, pol e env, o HIV-1 pode ser classificado em quatro
grupos genéticos distintos: M (Major), O (Outlier), N (New ou Non-M, Non-O) (Robertson
et al. 2000) e P (Plantier et al, 2009). O grupo M do HIV-1 é o mais prevalente globalmente
e pode ser classificado em nove subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K) e em seis subsubtipos
(A1, A2, A3, A4, F1 e F2). Além dos subtipos e subsubtipos há vírus híbridos denominados
formas recombinantes circulantes (CRFs) que podem causar micro epidemias (Hu & Temin
1990, Robertson et al. 1995, Tebit & Arts 2011, Peeters et al. 2013).
As CRFs são definidas por um mesmo evento de recombinação genética com dois
ou mais subtipos na mesma região genômica analisadas e identificadas em, no mínimo, três
indivíduos sem vínculo epidemiológico. Estas formas de mosaico aparecem através de
recombinação do HIV-1 durante o processo de transcrição reversa e esse fenômeno promove
uma fonte adicional de diversidade do HIV-1. A recombinação pode montar combinações
genéticas benéficas que seria difícil de ser gerada por uma única mutação e que também
pode eficazmente remover mutações deletérias que, de outra forma, reduziria o fitness viral
(Hu & Temin 1990, Smyth et al. 2012).
Em alguns casos o vírus recombinante não constitui uma classe ou grupo
filogenético definido, identificados em apenas um indivíduo ou em um grupo de indivíduos
com vínculo epidemiológico, nesta situação tem-se constituída uma forma recombinante
6
única (URF) (Murphy et al.1993; Gao et al. 1998, Robertson et al. 2000). Em dezembro de
2013 havia registro de 61 CRFs e várias URFs (Los Alamos 2013).
Há registro de casos de HIV-1 em todos os continentes, sendo este o responsável
pela pandemia de aids, mas a distribuição dos respectivos subtipos é heterogênea, variando
de acordo com a região geográfica. O subtipo mais frequente no mundo é o subtipo C
responsável por praticamente a metade dos casos de infecção pelo HIV-1, principalmente na
Índia e na África do Sul. O subtipo B é encontrado na Europa e nas Américas, representando
em torno de 12% das infecções no globo e apresentando uma frequência menor na África e
na Ásia (Requejo 2006, Huang et al. 2012).
No Brasil, um país de dimensão territorial continental, estudos de epidemiologia
molecular do HIV-1 indicam que o subtipo B é o prevalente na maioria das regiões
geográficas, exceto na região sul (onde o subtipo C é o prevalente), seguido pelos subtipos
F1 e C, recombinantes B e C e recombinantes B e F1, com casos identificados dos subtipos
D e A (Brígido et al. 2005, Couto-Fernandez et al. 2006, Pedroso et al. 2007, Queiroz et al.
2007, Cardoso et al. 2009, Machado et al. 2009, Monteiro-Cunha et al. 2011).
Dada a grande extensão do Brasil fica mais didático apresentar a diversidade
molecular do HIV-1 por regiões geográficas, quais sejam: sul, sudeste, centro-oeste,
nordeste e norte. O subtipo C do HIV-1 é altamente prevalente na região sul, seguido por
subtipos B, F1 e recombinantes envolvendo estes subtipos (Brindeiro et al. 2003, Soares et
al. 2003, Brígido et al. 2007, Dias et al. 2009, Silva et al. 2010, Simon et al. 2010, Medeiros
et al. 2011, Gräf et al. 2011, Silveira et al. 2012).
A região sudeste tem a maior variabilidade genética do HIV-1 no Brasil,
principalmente por ser desta região os primeiros casos de aids notificados e, atualmente,
deter um pouco mais de 50% de todos os casos do país. O subtipo B é o prevalente, seguido
do subtipo F1 e C, entretanto há registros dos subtipos A1 e mosaicos envolvendo os
subtipos B, F1, C, K, D, bem como de CRF_AG (Cabral et al. 2006, Sá-Filho et al. 2009,
Ferreira et al. 2010, Ferreira et al. 2013, Pilotto et al. 2013, Tupinambás et al. 2013).
A região centro-oeste tem apresentado um aumento na prevalência do subtipo C,
tanto ‘puro’ quanto na forma de mosaico intersubtipos, porém mantém a prevalência do
subtipo B, seguido do subtipo C e F1 (Alcântara et al. 2009, Cardoso et al. 2009, Cardoso et
al. 2010, Cardoso et al. 2011, Ferreira et al. 2011, Silveira et al. 2012, Costa et al. 2013).
Na região norte estudos envolvendo pacientes dos estados Amazonas, Pará, Amapá
e Tocantins têm mostrado a prevalência do subtipo B, seguido do subtipo F1, com registro
7
dos subtipos C e D e CRFAG_02 e mosaicos intersubtipos B, F1, C e D (Machado et al.
2009, Carvalho et al. 2011, Cunha et al. 2012, Macêdo et al. 2012).
Finalmente, a região nordeste tem estudos envolvendo três dos nove estados desta
região: Ceará, Pernambuco e Bahia. Nestes há prevalência do subtipo B, seguido do subtipo
F1 e, em menor frequência o subtipo C, também há registro de mosaico intersubtipos B/F1 e
B/C (Araújo et al. 2010, Monteiro-Cunha et al. 2011, Arruda et al. 2011, Santos et al. 2011,
Cavalcanti et al. 2012).
De um modo geral os estudos brasileiros indicam o predomínio do subtipo B do
HIV-1, seguido de subtipos não B minoritários como o subtipo F1 e C. Além disso, em todo
o país um número crescente de recombinantes intersubtipos principalmente envolvendo os
subtipos B/F1 e B/C tem sido descritos (Cavalcanti et al. 2007, Cardoso et al. 2009, Cardoso
et al. 2010, Ferreira et al. 2013). A epidemiologia molecular do HIV-1 está bem
caracterizada em todos os estados das regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil que
concentra cerca de 80% do total de notificações de aids do país. No entanto, ainda há
carência de estudos sobre os subtipos de HIV-1 que circulam entre os pacientes de nove
estados nas regiões norte e nordeste, dentre eles o Maranhão e o Piauí.
Diante dessa variabilidade de subtipos do HIV-1, em um país vasto como o Brasil,
estudos constantes para monitorar tanto a diversidade quanto a disseminação do vírus em
diferentes regiões do país tornam-se relevantes. Esses estudos podem melhorar o
entendimento da epidemia e oferecer informações que auxiliem no direcionamento de
políticas públicas voltadas para seu controle.
1.4 O curso da infecção por HIV-1
Imediatamente após a exposição e transmissão, o HIV-1 replica-se na mucosa,
submucosa e tecidos de drenagem linforreticular (Weiss et al. 2010), no entanto, o vírus não
pode ser detectado no plasma; esta etapa chamada fase de eclipse geralmente dura 7-21 dias
(Keele et al. 2008, Lee et al. 2009). As etapas que definem o início da infecção aguda pelo
HIV-1 são caracterizadas pelo aparecimento sequencial de marcadores virais e anticorpos no
sangue (Fiebig et al. 2003).
Dada às variadas rotas de transmissão do HIV-1 – sexual, vertical e parenteral - e as
características histológicas distintas destes tecidos, é aceito que vários tipos de células sejam
candidatas à infecção inicial. Os linfócitos T CD4+ e as células de Langerhans são
considerados os primeiros alvos do vírus (Hladik et al. 2007, Boggiano & Littman 2007),
8
mas as células dendríticas, também podem desempenhar um papel importante (Lackner &
Veazey 2007). No entanto, observações de mucosas infectadas com HIV-1 revelam que os
macrófagos derivados de monócitos são geralmente alvos pobres para a infecção em
comparação aos linfócitos T CD4+ (Salazar-Gonzalez et al. 2009, Li et al. 2010).
Independentemente da via de transmissão viral e das primeiras células infectadas, dentro de
poucos dias, a replicação viral converge do sistema linfoide local para o trato
gastrointestinal (tecido linfoide associado à mucosa gastrintestinal) (Brenchley et al. 2004,
Mehandru et al. 2004, Mattapallil et al. 2005).
A rápida expansão do HIV-1, primeiro no tecido linfoide associado à mucosa
gastrintestinal e, em seguida, sistemicamente (Schacker et al. 2001, Mattapallil et al. 2005)
juntamente com um aumento dos níveis de RNA viral no plasma, é clinicamente importante
porque há destruição irreversível de reservatórios de linfócitos T helper e integração de
DNA do HIV-1 no genoma de linfócitos T em repouso, um efeito que tem impedido o
tratamento eficaz (Chun et al. 1998, Richman et al. 2009).
O HIV-1 precisa atravessar várias camadas de tecido na vagina feminina ou mucosa
retal para entrar em contato com as devidas células receptoras. A cepa viral que tem
tropismo para os correceptores CCR5 (R5 trópicas) tem vantagens na transmissão seletiva e
variantes R5 compõem a maioria dos vírus primários transmitidos. Variantes que tem
tropismo para os correceptores CXCR4 (X4 trópicas) são transmitidas apenas raramente.
Vírus primário ao entrar em contato com as células de Langerhans ou com os linfócitos T
CD4+ no epitélio escamoso pode infectá-los (Weiss et al. 2010).
Não está claro se os macrófagos da submucosa são uma meta inicial, já que a
maioria dos vírus primários pouco infectam macrófagos in vitro. O desafio para transmissão
do HIV-1 no trato genital masculino difere um pouco da mucosa vaginal, devido a
diferenças na anatomia, mas o prepúcio do pênis e uretra abrigam criticamente, células
receptoras do vírus. Interações vírus-célula na submucosa do sexo masculino tendem a ser
semelhantes aos da submucosa do sexo feminino, com metas virais incluindo células de
Langerhans, outras células dendríticas da submucosa e linfócitos T CD4+ (Weiss et al.
2010).
Embora o tempo necessário para vírions do HIV-1 ou células infectadas por vírus
atravessarem as barreiras epiteliais seja curto (horas), provavelmente leva o tempo de 3 a 6
dias para propagação da infecção HIV-1 ocorrer e para que o vírus se espalhe para além dos
linfócitos T CD4+ da submucosa. Segue-se a disseminação em linfonodos de drenagem e na
circulação sistêmica rapidamente, com o estabelecimento dos reservatórios virais em
9
linfócitos T CD4+. Estudos, em primatas não humanos, que avaliaram o tempo de resposta à
profilaxia pós-exposição com ARV, sugerem que o tempo de estabelecimento de
reservatório em linfócitos T CD4+ pode ser tão curto quanto 24 horas (Emau et al. 2006).
Durante a infecção aguda do HIV-1 há uma depleção irrevogável de linfócitos T
CD4+ do trato gastrintestinal (Brenchley et al. 2004). Nos seres humanos, danos adjuvantes
nas barreiras da mucosa podem permitir o vazamento de produtos bacterianos intestinais
para a corrente sanguínea, levando à ativação imune que pode promover o aumento da
replicação do HIV-1 e favorecer a progressão da doença (Brenchley & Douek 2008). A
rápida, precoce e maciça perda de linfócitos T CD4+ em órgãos linfoides (que é pouco
refletida em contagens de linfócitos T CD4+ no sangue), provavelmente explica a resposta
de linfócitos T CD4+ em casos de infecção aguda pelo HIV-1 (Cohen et al. 2011).
Após a demonstração de que a infecção aguda por SIV em macacos Rhesus induzia
uma depleção grave e rápida de linfócitos T CD4+ de memória do intestino (Veazey et al.
1998) verificou-se, em seres humanos e macacos, que esta ruptura do sistema imune do
intestino, resultava num aumento significativo de componentes bacterianos, incluindo
lipopolissacarídeo (LPS), no sangue (Brenchley et al. 2004, Li et al. 2005, Brenchley et al.
2006). O LPS é um ativador conhecido de células do sistema imune inato via receptor Tolllike 4 (TLR-4), e as concentrações de LPS na circulação de indivíduos infectados com HIV1 está fortemente correlacionada com os níveis de ativação de linfócitos T (Brenchley et al.
2006, Gordon et al. 2010).
Portanto, o estímulo imune da translocação de produtos bacterianos contribui para a
ativação imune sistêmica, pela ativação de TLR de várias populações de leucócitos. Assim,
a infecção de linfócitos T CD4+ de memória no intestino pode ser uma determinante da
progressão da doença (Brenchley et al. 2006).
A ativação imune crônica induzida pelo HIV-1 impulsiona a progressão para aids.
Estudos entre diferentes espécies de primatas não-humanos mostraram que a diferença no
curso da infecção é determinada pela resposta do sistema imune ao vírus, e não a sua
capacidade citopática (Miedema et al. 2013). A ativação imune crônica é a direção primária
da patogênese do HIV-1, pois ambos linfócitos T CD4+ e CD8+ são ativados na infecção
aguda e crônica pelo HIV-1, e consequentemente, proliferam rapidamente, porém com uma
meia-vida curta. Isso explica por que tanto taxas de produção e morte de linfócitos T são
aumentadas ao longo da infecção por HIV-1 (Grossman & Paul 2000, Hellerstein et al.
2003). No início, a alta taxa de divisão dos linfócitos T CD4+ em pacientes infectados pelo
HIV-1 não tratados foi interpretada como reflexo de uma resposta homeostática à perda de
10
infócitos T CD4+ (Hazenberg et al. 2000, Lempicki et al. 2000, Mohri et al. 2001, Kovacs
et al. 2001).
Estudos em pacientes em uso de terapia antirretroviral (TARV) apontaram, no
entanto, que as taxas de proliferação de linfócitos T CD4+ caem concomitante à perda do
vírus, mesmo quando o número de linfócitos T CD4+ ainda está abaixo dos níveis saudáveis
de controle, sugerindo que o aumento da taxa de divisão de linfócitos T é causado pelo
próprio vírus. De fato, o nível de ativação imune é o melhor preditor de progressão para aids
(Zangerle et al. 1998, Giorgi et al. 1999) e morte (Giorgi et al. 1993, Liu etal. 1998,
Hazenberg et al. 2003, Deeks et al. 2004), independente da carga viral do HIV-1.
Com a ativação e diferenciação contínua de linfócitos T, a infecção crônica pelo
HIV-1 gradualmente esgota populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ virgens (Hazenberg et
al. 2003, Douek et al. 2003, Picker et al. 2004). Intrinsecamente diferentes respostas de
linhagens distintas de linfócitos T para a ativação podem determinar a expansão clonal ou a
contração (Ribeiro et al. 2002), e não a sensibilidade das diferentes populações de linfócitos
T para a ativação crônica. A ativação imune crônica também mostrou efeitos deletérios
sobre imunidade celular HIV-1 específica, mediada por linfócitos T CD4+ (Younes et al.
2003, Harari et al. 2004, Harari et al. 2005) e linfócitos T CD8+ (Migueles et al. 2002),
entre outras células, impedindo o estabelecimento de linfócitos T CD4+ e CD8+ de
memória, levando à progressão da doença e à imunodeficiência associada.
Na ausência de TARV a contagem de linfócitos T CD4+ tende a diminuir e a
infecção pelo HIV-1 torna-se sintomática, em função do aumento da carga viral, podendo
ser identificado sintomas como febre baixa, perda ponderal, sudorese noturna, fadiga,
diarreia crônica, alterações neurológicas, infecções bacterianas, virais e fúngicas. A
introdução da TARV leva à redução da morbidade e mortalidade associada a aids, em
função da elevação da contagem de linfócitos T CD4+, o que reflete a recuperação imune.
1.5 Classes de fármacos envolvidas no tratamento da infecção por HIV-1
A zidovudina (AZT) foi o primeiro ARV aprovado para o tratamento da aids e
pertence a classe dos inibidores da TR análogos a nucleosídeos (ITRNs), inicialmente usada
como monoterapia. O tratamento monoterápico levou a uma rápida seleção de isolados HIV1 resistentes a esta droga (Erice et al. 1993). Este evento encorajou a busca por outros
fármacos com outros mecanismos de ação. Assim, foram desenvolvidos os inibidores da TR
11
não análogos de nucleosídeos (ITRNNs), posteriormente foram lançados os inibidores da PR
(IPs) e, mais recentemente, os inibidores da IN (INI) e os inibidores de entrada (IE).
1.5.1 Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos aos Nucleosídeos (ITRNs)
Os ITRNs são drogas que agem após conversão em trifosfatos (forma ativa) e para
tanto, precisam sofrer fosforilação pelas enzimas celulares, as quinases. Os nucleosídeos
fosforilados competem com os desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) das células. A
inclusão de um ITRN trifosfato na fita de DNA viral em formação inibe a incorporação de
mais nucleotídeos, detendo a formação do DNA viral complementar (Meyer et al. 1998).
Atualmente o Ministério da Saúde distribui gratuitamente seis medicamentos da
classe dos ITRNs: Abacavir/ABC, Didanosina/ddI, Lamivudina/3TC, Tenofovir/TDF,
Zidovudina/AZT (Brasil 2013).
1.5.2 Inibidores da Transcriptase Reversa Não Análogos aos Nucleosídeos (ITRNNs)
Os ITRNNs ligam-se diretamente ao sítio ativo da enzima TR em uma região
hidrofóbica próxima do local de ligação do substrato para nucleosídeos. Como resultado
desta interação, o sítio ativo responsável pela formação da dupla hélice de DNA tem sua
mobilidade e flexibilidade restritas, tendo como consequência uma drástica redução da
eficiência da enzima TR (Shen et al. 2003).
No Brasil as drogas disponíveis desta classe incluem: Efavirenz/EFV,
Nevirapina/NVP e Etravirina/ETR (Brasil 2013).
1.5.3 Inibidores da Protease (IPs)
A inibição da PR previne a fragmentação proteolítica das poliproteínas virais gag e
pol e a maturação dos vírions provocando assim a produção de partículas virais imaturas,
incapazes de infectar novas células (Clavel & Hance 2004). Assim, os IPs agem
competitivamente, evitando a clivagem dos genes gag e gag-pol e impossibilitando a
replicação de partículas virais, produzindo vírions inativos, após a etapa de brotamento
(Hammer et al. 2006).
12
O ritonavir é um inibidor da PR usado para aumentar a farmacocinética desta classe
de antirretrovirais (indicado por /r) (Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and
Adolescents 2013).
Os ARV da classe IPs disponíveis no Brasil são: Atazanavir/ATV, Darunavir/DRV,
Fosamprenavir/FPV, Lopinavir/r/LPV/r, Saquinavir/SQV e Tipranavir/TPV (Brasil 2013).
1.5.4 Inibidores da Integrase (INIs)
Os inibidores de IN impedem a ação da enzima responsável pela integração do
DNA viral ao genoma da célula hospedeira, o que é essencial para a replicação viral.
O papel-chave da integrase no ciclo de replicação do vírus tornou essa enzima um
alvo terapêutico atrativo, o que levou ao esforço para o desenvolvimento destes inibidores
(Ingale & Bhatia 2011).
Em 2007 foi aprovado o primeiro inibidor de IN, o raltegravir/RAL, aumentando o
número de classes de ARVs disponíveis para uso na terapia combinada no tratamento da
aids (Nair & Chi 2007).
No Brasil o raltegravir está disponível desde 2009 e destina-se a pacientes que
desenvolveram multirresistência aos tratamentos comuns, indicado para esquemas de resgate
em pacientes multi experimentados em TARV.
1.5.5 Inibidores de Fusão (IFs)
Os inibidores de fusão impedem que o vírus entre nas células-alvo evitando assim,
a infecção de novas células. Os fármacos desta classe podem impedir dois tipos de
interação: com a gp41; da gp120 com o CD4 (Biswas et al. 2007).
O primeiro passo da entrada do HIV-1 na célula ocorre quando a gp120 se liga ao
receptor CD4 e posteriormente aos correceptores das quimiocinas, CCR5 ou CXCR4 da
célula alvo. Interações entre as duas regiões HR1 e HR2 na subunidade gp41 dão origem a
uma alteração conformacional na gp41, permitindo a fusão das membranas virais e
celulares, e consequentemente a entrada do HIV-1 na célula hospedeira.
O inibidor de fusão, Enfuvirtida/T-20, imita o domínio C-terminal HR2 da gp41 e
liga-se competitivamente ao HR1. Assim, T-20 liga-se à região da gp41 que medeia a
alteração conformacional intermediária para estrutura de fusão ativa, prevenindo a fusão e a
entrada viral na célula humana (Hirsch et al. 2008).
13
Vale destacar que o uso de T-20 está indicado para terapias de resgate de pacientes
multi experimentados, ou melhor, que já foram submetidos a muitos esquemas terapêuticos
e apresentam falha terapêutica comprovada pela genotipagem e identificação de vírus
multirresistentes.
Os vírus multirresistentes são aqueles que apresentam mutações que normalmente
conferem resistência a todos os medicamentos de uma mesma classe de ARVs (Diaz 2011).
1.5.6 Inibidores de Entrada (IEs)
Os inibidores de entrada impedem que o vírus entre nas células-alvo evitando a
interação da gp120 com os correceptores (Biswas et al. 2007).
O IE aprovado para a utilização nos esquemas terapêuticos foi o Maraviroc/MVC,
um antagonista seletivo dos correceptores de quimiocinas. Esse fármaco previne a interação
da glicoproteína gp120 com o correceptor CCR5 necessário para a entrada do vírus nas
células (Tsibris & Kuritzkes 2007, Pugach et al. 2008).
No Brasil o uso do MVC está indicado para os em que o paciente abriga vírus
multirresistente e deverá ser usado apenas nas terapias de resgate nos casos de falha
terapêutica comprovada por genotipagem (Brasil 2013).
1.6 Terapia Antirretroviral (TARV)
O Ministério da Saúde, em 1996, passou a disponibilizar gratuitamente o ‘coquetel’
ou terapia antirretroviral altamente ativa (HAART, do inglês, Highly Active Antiretroviral
Therapy) aos indivíduos infectados que apresentassem indicação de tratamento. A HAART
baseia-se na administração de pelo menos três drogas ARVs de duas classes diferentes, que
bloqueiam a ação de enzimas virais importantes para a replicação do HIV-1, evitando a
formação de novos vírions (WHO 2012). Os objetivos da HAART são obter supressão
máxima da replicação viral minimizando as chances de resistência a ARV, melhorar da
qualidade de vida do doente, e, por conseguinte reduzir a transmissão do HIV-1 (Hammer et
al. 2006, Hammer et al. 2008, Thompson et al. 2012).
Recomendações internacionais indicam que o esquema de tratamento inicial com
HAART deve incluir a combinação de três drogas: um ITRNN (geralmente efavirenz / EFV)
associado a dois ITRNs (tenofovir / TDF + emtricitabina / FTC) ou um IP (atazanavir /
ATV/r) associado a dois ITRNs (tenofovir / TDF + emtricitabina / FTC) ou um IP
14
(darunavir / DRV/r) associado a dois ITRNs (tenofovir / TDF + emtricitabina / FTC) ou um
INI (raltegravir / RAL) associado a dois ITRNs (tenofovir / TDF + emtricitabina / FTC)
(Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents 2013).
Já no Brasil a normatização do Ministério da Saúde institui que a terapia inicial
deve incluir combinações de três antirretrovirais, sendo dois ITRN (TDF/3TC) associados a
um ITRNN (EFV). Para os casos em que o esquema TDF + 3TC + EFV esteja
contraindicado, deve-se substituir o TDF por: AZT (primeira opção nos casos de
contraindicação ao TDF), ABC (segunda opção nos casos de contraindicação ao TDF e
AZT) e DDI (terceira opção nos casos de contraindicação ao TDF, AZT e ABC). Para os
casos de contraindicação ao EFV a alternativa no esquema inicial é substituí-lo por NVP e
em casos de exantema com EFV a opção é o uso de inibidores da protease (Brasil 2013).
Em uma publicação recente do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do
Ministério da Saúde, intitulada Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para Manejo da
Infecção pelo HIV em Adultos, foi recomendado estimular o início imediato de TARV para
todas as pessoas vivendo com HIV/aids (PVHA), independentemente da contagem de
linfócitos T CD4+, na perspectiva de redução da transmissibilidade do HIV, considerando a
motivação da PVHA. Essa medida justifica-se por evidências de que, mesmo em indivíduos
assintomáticos com contagens elevadas de linfócitos T CD4+, a replicação viral e a ativação
imune crônica estão associadas ao desenvolvimento de doenças não tradicionalmente
relacionadas à infecção pelo HIV-1, tais como eventos cardiovasculares (Brasil 2013).
Sustentado nas observações de que pessoas com reconstituição imune, em uso de
TARV, que mantêm contagens de linfócitos T CD4+ acima de 500 células/mm3 e carga viral
indetectável, atingem expectativa de vida semelhante à da população geral e no fato de que
quando o tratamento é iniciado precocemente, aumentam-se as chances de se alcançar níveis
elevados de linfócitos T CD4+, a recomendação do Comitê Assessor para Terapia
Antirretroviral em Adultos Infectados pelo HIV/Aids é iniciar o mais precocemente a
TARV. Entretanto, em nenhuma situação deverá haver qualquer tipo de coerção para seu
inicio e uma vez iniciada, não deverá ser interrompida.
1.7 Resistência do HIV-1 aos Antirretrovirais
Em 2012 a taxa de cobertura no Brasil para tratamento antirretroviral foi de 93,5%,
representando 313.175 pessoas em uso de TARV (Brasil 2013). Entretanto, como
consequência do extenso polimorfismo e da alta taxa de mutações do HIV-1 sob pressão
15
seletiva de drogas ARV pode ocorrer geração de vírus com mutações associadas à
resistência a ARVs. As mutações são a matéria-prima para a seleção natural e apoiam a
capacidade do HIV em escapar do sistema imune e da TARV. Como todos os retrovírus, a
maioria das mutações do HIV é introduzida durante a fase de transcrição reversa do ciclo
viral. A fonte mais importante é a própria enzima TR, que é propensa a erros, devido à falta
de uma capacidade de revisão (Smith et al. 2012).
A utilização da HAART prevê a supressão virológica sustentada e a redução
substancial da morbidade e mortalidade associadas à infecção pelo HIV-1. Entretanto há a
possibilidade de resistência transmitida pois a droga seleciona as mutantes virais mais aptas
a sobrevivência na sua presença, nestes casos a pessoa foi infectada por um vírus mutante de
outra pessoa em tratamento que selecionou um vírus resistente. Mutações associadas à
resistência transmitida a drogas (TDRM) são observadas em pacientes virgens de tratamento
ARV e representam importante problema de saúde pública, pois pode limitar a escolha da
HAART de primeira linha, diminuir a eficácia dos regimes antirretrovirais seguintes e
aumentar o risco de fracasso do tratamento ARV. Entretanto, neste momento, a
recomendação para a realização de genotipagem pré-tratamento no Brasil limita-se a pessoas
que tenham se infectado com um parceiro em uso atual ou prévio de TARV e também está
indicada para gestantes infectadas pelo HIV-1 (Brasil 2013).
Uma mutação na sequência de nucleotídeos pode gerar alterações de aminoácidos,
ocasionando modificação da estrutura e função proteica. Apesar disso, os vírus com mutação
de resistência podem apresentar fitness viral menor que os vírus selvagens. Assim, quando o
uso de drogas ARVs é interrompido, deixa-se de exercer pressão seletiva e os vírus
selvagens podem voltar a se replicar (Miller 2001).
A seleção de cepas de HIV-1 resistentes durante o tratamento ARV pode
comprometer o impacto positivo da TARV sobre a mortalidade e morbidade, pois estas
variantes escapam ao efeito dos ARV e podem ser transmitidas. Os testes de genotipagem
para resistência do HIV-1 a partir do RNA viral permitem detectar mutações associadas
resistência aos ARV e orientar terapia de resgate e novas decisões terapêuticas.
O
desenvolvimento e seleção de vírus com mutações de resistência podem levar a progressão
da doença e a um número crescente de pacientes com menores opções de tratamento (Shafer
2002).
A nomenclatura das mutações é baseada em um consenso das sequências de
referência do subtipo B do HIV, Sequence Database, do Laboratório Nacional de Los
Alamos, EUA (Korber et al. 1998). Para indicar a mutação, usa-se a letra do aminoácido
16
normalmente encontrado nessa posição seguido da sua posição no códon (locus gene) e
posteriormente a letra do aminoácido que o substituiu, levando a mutação. Por exemplo, na
mutação K103N houve uma substituição do aminoácido lisina (K) por o aminoácido
asparagina (N) no códon 103. Na presença de quasiespecies, o composto da mistura é
incluído após a posição, separado por uma barra (por exemplo: na mutação K103K/N a
sequência possui uma mistura do tipo de vírus selvagem no resíduo lisina (K) e a mutação
no resíduo asparagina (N) na posição no códon 103 (Shafer 2002).
Para alguns polimorfismos ainda não existem estudos que sustentem a possibilidade
de causarem resistência aos ARVs (in vitro ou in vivo), produzindo apenas variantes
genéticas com capacidade de replicação semelhante à variante selvagem. Estas variantes
polimórficas ocorrem com frequência em pacientes virgens de tratamento (Wilson & Bean
2000).
1.7.1 Resistência associada aos ITRNs
As mutações de resistência aos ITRNs predominam no mundo, haja vista que estes
foram a primeira classe de ARV introduzida no tratamento de pacientes com aids (Shet et al.
2006). Dois mecanismos acarretam resistência aos ITRNs. A inibição alostérica provocada
por mutações como M184V, Q151M, L74V ou K65R que permitem a TR distinguir entre
dNTP fisiológico e o ITRN, preferindo incorporar os dNTPs. A fosforilação via ATP
(trifosfato de adenosina) é provocada por mutações dos análogos da timina (TAM) como
M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y e K219Q, que removem os ITRNs que já tinham sido
incorporados na cadeia de DNA proviral em formação, permitindo assim, que seja retomada
a síntese do cDNA. Assim, a fosforilação promove a resistência cruzada entre ITRNs
(Naeger et al. 2001, Mendoza et al. 2003, Clavel & Hance 2004).
Uma única mutação ou um acúmulo sucessivo de mutações pode causar resistência
associada aos ITRNs. A resistência do HIV-1 à AZT desenvolve-se de forma ordenada, em
indivíduos assintomáticos em tratamento com AZT na qual primeiro ocorre a mutação no
códon 70, mas é substituída pela mutação, mais estável, no códon 215. Com o tratamento
prolongado, outras mutações nos códons 41, 67 e novamente 70 desenvolvem-se, conferindo
maior resistência do HIV-1 ao AZT (Hirsch et al. 1998).
17
Figura 4. Principais mutações no gene da TR associadas
à resistência aos ITRNs
Adaptada de [Stanford HIV Drug Resistance Database 2013]
Disponível em: [http://www.hivdb.stanford.edu/DR/NRTIResiNote.html]
São análogos à timidina a zidovudina/AZT e a estavudina/d4T. As mutações aos
análogos da timina (TAMs) são comuns em pacientes tratados com a combinação de ARVs
contendo análogos da timina. Estão definidos dois modelos de resistência das TAMs: tipo I
(M41L, L210W e T215Y), conferem elevado nível de resistência aos análogos da timina e
em grau moderado ao ABC, ddI e TDF. As mutações do tipo II (D67N, K70R, T215F e
K219Q/E) conferem susceptibilidade reduzida a todos ITRNs (Whitcomb et al. 2003).
As mutações de reversão T215A/C/D/E/G/H/I/L/N/S/V surgem na ausência da
pressão seletiva exercida pelos ARVs e são originadas da mutação T215Y/F. Estas mutações
não tem efeito sobre a suscetibilidade à droga, mas a presença de mutações de reversão em
indivíduos não tratados sugere que o paciente possa ter sido infectado originalmente com o
vírus contendo T215Y ou F que posteriormente sofreu reversão (Shaffer & Schapiro 2008).
Em indivíduos tratados a mutação T215Y/F é decorrente do uso do zidovudina/AZT e
Estavudina/d4T (Garcia-Lerma et al. 2004).
A mutação M184V consiste na troca de uma metionina por uma valina no códon
184 da TR, é uma mutação principal associada a um alto nível de resistência à
lamivudina/3TC e à entricitabina/FTC (Boucher et al. 1993, Johnson et al. 2013).
18
1.7.2 Resistência associada aos ITRNNs
Os ITRNNs compreendem uma família estruturalmente diversa de compostos que
agem no sítio hidrofóbico, localizado próximo ao domínio catalítico da TR. A ligação aos
ITRNNs afeta a flexibilidade desta enzima, bloqueando a síntese do DNA (Esnouf et al.
1997). Os ITRNNs não interferem com a ligação de dNTP, mas levam a formação de um
complexo improdutivo, alterando a conformação ou a mobilidade da TR, exercendo assim,
uma inibição não-competitiva (Xia et al. 2007).
As mutações associadas à resistência aos ITRNNs ocorrem em duas regiões: entre
os códons 100-108 e 179-190. Estas regiões estão próximas ao sítio alostérico de ligação da
TR do HIV-1 e estas mutações desestabilizam o local de ação das drogas, impedindo seu
acoplamento (Azijn et al. 2010). O uso de diferentes ITRNNs pode selecionar diferentes
mutações no sitio ativo da enzima, sendo as mutações K103N e Y181C as mais
frequentemente associadas à resistência aos ITRNNs (Boyer et al. 1993).
Em decorrência da baixa barreira genética para resistência aos ITRNNs, apenas
uma mutação no sítio de ligação da TR pode provocar alto nível de resistência a um ou mais
ITRNNs, possibilitando um alto nível de resistência cruzada (Lecossier et al. 2005).
Figura 5. Principais mutações no gene da TR associadas
à resistência aos ITRNNs
Adaptada de [Stanford HIV Drug Resistance Database 2013]
Disponível em: [http://www.hivdb.stanford.edu/DR/NNRTIResiNote.html]
As mutações principais K103N/S, V106A/M, Y181C/I, Y188L/C/H, G190A e
M230L causam elevado nível de resistência à nevirapina/NVP e níveis variados de
resistência ao efavirenz/EFV. As mutações secundárias L100I, K101P, P225H, F227L e
19
K238T usualmente ocorrem em combinação com uma das mutações principais de
resistência aos ITRNNs. As mutações L100I e K101P em combinação com a K103N
promovem uma diminuição da susceptibilidade à EFV, NVP e Etravirina/ETR (Johnson et
al. 2013).
1.7.3 Resistência associada aos IPs
As mutações no gene da PR ocorrem por substituições de aminoácidos no sítio de
ligação do substrato da enzima ou em sítios distantes. Estas alterações de aminoácidos
modificam a afinidade e os pontos de contato da PR com os IPs (Kaplan et al. 1994, Condra
et al. 1995). As mutações da PR nas posições 46, 54, 82 e 90 estão entre as mais frequentes
mutações de resistência associadas aos IPs (Shafer 2008).
Dentre as mutações de resistência aos IPs, as mutações primárias ou principais
ocorrem inicialmente, promovem redução substancial da sensibilidade ao IP e reduzem a
capacidade de replicação do vírus (Figura 6). Geralmente ocorrem no sítio de ligação das
drogas antirretrovirais (Hirsch et al. 1998). Mutações menores ou acessórias emergem
posteriormente e tem menor efeito na resistência isoladamente, podem alterar a taxa
replicativa viral e podem estar presentes como polimorfismos, principalmente em vírus de
subtipos não-B (Johnson et al. 2013).
A resistência a IPs desenvolve-se com o acúmulo de múltiplas mutações maiores e
menores. Esse acúmulo resulta em maior redução na susceptibilidade aos ARVs do que
mutações únicas (Scherrer et al. 2009). As mutações maiores são relativamente específicas a
cada fármaco, porém o acúmulo de mutações menores compartilhadas por várias drogas
pode gerar resistência a outros IPs, contribuindo para o aparecimento de resistência cruzada
(Schapiro et al. 1999).
A mutação L90M ocorre mais comumente em vírus dos subtipos C, F, G. Esse
aumento da predileção para certos subtipos em desenvolver L90M, pode estar relacionada
com a presença de outros aminoácidos distintos de leucina (o consenso do subtipo B) na
posição 89. No subtipo C, F e G, M89 é o aminoácido de consenso no tipo selvagem, em
comparação com L89 no subtipo B. Assim, aquisição de mutações M89I e L90M resultam
em diminuição da susceptibilidade ao nelfinavir/NFV nestes subtipos (Abecasis et al. 2005).
20
Figura 6. Principais mutações no gene da PR associadas
à resistência aos IPs
Adaptada de [Stanford HIV Drug Resistance Database 2013]
Disponível em: [http://www.hivdb.stanford.edu/DR/PIResiNote.html]
L90M reduz a susceptibilidade a NFV, SQV/r, ATV/r, e IDV/r.
Se estiver
associada com outras mutações também reduz a susceptibilidade a FPV/r e LPV/r. As
mutações G73S/T/C/A
parecem estar associadas à diminuição da susceptibilidade à
maioria, se não todos, os IPs. O efeito destas mutações sobre SQV/r e NFV e possivelmente
ATV/r parece ser maior do que o efeito sobre outros IPs (Stanford University HIV Drug
Resistance Database 2013).
1.8 Resistência Transmitida do HIV-1 aos ARVs
Com o crescente uso de drogas ARVs no tratamento da infecção pelo HIV-1, a
transmissão de cepas resistentes pode representar um entrave ao controle da epidemia (Grant
et al. 2002). A resistência aos ARVs pode ocorrer em pacientes que não fizeram uso prévio
de tratamento (resistência transmitida) sendo observada antes do uso de qualquer esquema
terapêutico. Esta pode ocorrer pela transmissão de cepas resistentes ou mais raramente pela
geração espontânea de mutações associadas a resistência. Assim, a resistência transmitida
pode reduzir a susceptibilidade aos ARVs comprometendo as opções para terapia de
primeira linha em indivíduos não tratados (Little 2001).
21
Para países em desenvolvimento a Organização Mundial de Saúde (OMS)
categorizou a resistência transmitida em três níveis: baixa quando se detecta uma taxa menor
que 5%, moderada (entre 5% e 15%) e alta (acima de 15%) (Bennet et al. 2009). Devido ao
seu alto custo, os testes de genotipagem antes do início da terapia ARV justificam-se apenas
em regiões onde os níveis de resistência transmitida sejam de moderado à alto (WHO 2003).
Estudos realizados em distintos estados brasileiros evidenciaram uma variação da
prevalência de resistência transmitida. Em 2002, na cidade de Recife um estudo com 84
isolados de pacientes sem uso prévio de TARV identificou baixa prevalência de resistência
transmitida (3,6%); com mutações para ITRNs (M41L e K219E) (Medeiros, et al. 2006).
Em 2007 e 2008, no estado de Goiás um estudo com 103 pacientes virgens de tratamento
identificou uma moderada prevalência de resistência transmitida, 10%; com mutações para
IPs (M46I, L90M, I85V), ITRNs (M41L, T215D/S, L210W) e ITRNNs (K103N, Y181C,
Y188L, G190S) (Cardoso et al. 2009). Em 2008 e 2009, no estado de São Paulo um estudo
envolvendo as cidades São Paulo e Campinas incluiu 225 isolados de indivíduos virgens de
tratamento identificou prevalência de resistência transmitida de moderada a alta (14,2%)
sendo a mutação K103N/S a mais frequente (Ferreira et al. 2012). Em Porto Alegre um
estudo com 108 isolados de pacientes virgens de tratamento identificou baixo nível de
resistência transmitida (3%); com mutações para os ITRNs e ITRNNs (M41L, K103N,
L210W e T215Y) (Rodrigues et al. 2006). Em 2008 e 2009, na cidade de Florianópolis um
estudo com 82 isolados de pacientes virgens de tratamento identificou moderado nível de
resistência transmitida (11%) com mutações para os IPs, (M46I), ITRNs (M41L e K219Q) e
ITRNNs (K103N, V106M, G190A e M230L) (Gräf et al. 2011).
Entretanto, estudo com isolados de HIV-1 de indivíduos com infecção recente da
cidade de Santos/São Paulo identificou 36% de resistência transmitida (Sucupira et al. 2007)
portanto, alta prevalência. Também em Salvador/Bahia 22% dos isolados apresentaram
mutações associadas a resistência transmitida (Pedroso et al. 2007).
Um estudo realizado em 2007 com 387 pacientes virgens de tratamento em 20
centros distribuídos em treze cidades brasileiras (Ribeirão Preto, Santo André, Santos, Nova
Iguaçu, Rio de Janeiro, Belo Horizonte, Curitiba, Florianópolis, Salvador, Brasília, 2 em
Campinas, 2 em Porto Alegre e 6 na cidade de São Paulo) identificou uma frequência de
resistência transmitida de 5,7%. A diferença na prevalência da resistência transmitida em
relação aos demais estudos realizados no mesmo estado pode sugerir microdiferenças que
podem ocorrer em uma mesma região (Sprinz et al. 2009).
22
Em 2009 foi publicado um estudo multicêntrico brasileiro realizado com 210
pacientes virgens de tratamento de seis grandes centros urbanos, que concentram mais de
70% dos casos de aids no país (São Paulo, Rio de Janeiro, Salvador, Porto Alegre, Brasília e
Belém). Este estudo revelou 8,1% de resistência transmitida sendo que em quatro cidades
(São Paulo, Rio de Janeiro, Belém e Brasília) níveis moderados de resistência foram
observados (entre 5% e 15%) contrastando com baixos níveis (< 5%) detectados em outras
cidades como Porto Alegre e Salvador, onde esta ficou abaixo de < 5% (Inocêncio et al.
2009).
As taxas de prevalência de resistência transmitida identificadas no Brasil são
equivalentes as taxas de outros países como Alemanha (12,4%) (Bartmeyer et al. 2010),
França (9%) (Descamps et al. 2013), Reino Unido (11,3%) (UK Collaborative Group on
HIV Drug Resistance et al. 2012), Estados Unidos (17%) (Ross et al. 2008) e Espanha
(8,3%-13%) (Yebra et al. 2013, Mulder et al. 2011) mesmo com o início do acesso gratuito
aos ARVs no Brasil ter ocorrido posteriormente ao período em que estes medicamentos
estavam acessíveis nos países desenvolvidos.
23
2 JUSTIFICATIVA
O Brasil é um dos países mais afetados por o HIV-1 na América Latina. Segundo o
Boletim Epidemiológico sobre aids e DST do Ministério da Saúde, o número de casos de
aids, acumulados desde 1980 e notificados até 2013, foi de 686478 casos. Estes casos
notificados no país encontram-se assim distribuídos: 379045 (55%) estão concentrados na
região Sudeste, 137126 (20%) no Sul, 95516 (14%) no Nordeste, 39691 (6%) no CentroOeste e 35100 (5%) na região norte do país (Brasil 2013).
Desde 1998 tem sido observado nos estados do sul (exceto Rio Grande do Sul) e
sudeste brasileiro um lento processo de estabilização da epidemia, acompanhado mais
recentemente pela estabilização da epidemia em estados do centro-oeste. As regiões norte e
nordeste mantêm a tendência de crescimento do número de casos de aids notificados. Como
resultado dessa dinâmica regional, a taxa de incidência de aids no epicentro da epidemia,
região sudeste do país, mantém-se estabilizada e concentrada em alguns grupos
populacionais em situação de vulnerabilidade (Relatório de progresso da resposta brasileira
ao HIV/AIDS 2010-2011, Brasil 2012), ainda que em patamares elevados (Granjeiro et al.
2010), já na região nordeste, um aumento importante na incidência (58%) foi observada ao
longo dos últimos dez anos (Brasil 2013).
Entretanto, as regiões norte e nordeste mantêm a tendência de crescimento do
número de casos de aids notificados. Com essa dinâmica regional da epidemia, a taxa de
incidência de aids no país mantém-se estável (20,2 casos para 100000 habitantes), ainda que
em patamares elevados (Brasil 2008, Granjeiro et al. 2010).
Evidência de taxas moderadas de resistência transmitida tem sido detectada em
alguns estados brasileiros (Cavalcanti et al. 2007, Cardoso et al. 2009, Sprinz et al. 2009,
Inocêncio et al. 2009). O estudo da epidemiologia molecular do HIV-1 em pacientes
provenientes de áreas distantes do epicentro da epidemia e que concentram populações de
baixo IDH, como Maranhão e Piauí trazem novas informações sobre a epidemia nestas
áreas.
24
Até o momento não existe publicação sobre a prevalência de resistência transmitida
em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí. Além disso, não existem dados
disponíveis sobre a diversidade genética do HIV-1 em pacientes destes estados brasileiros.
25
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
Avaliar a prevalência de resistência transmitida a ARVs e caracterizar diversidade genética
do HIV-1 em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí.
3.2 Objetivos específicos:
3.2.1 Estimar a prevalência de mutações genotípicas associadas à resistência transmitida a
ARV das classes ITRNs, ITRNNs, IPs em isolados de pacientes do Piauí e do Maranhão;
3.2.2 Estimar a prevalência de mutações genotípicas associadas à resistência transmitida a
antirretrovirais nos diferentes subtipos de HIV-1;
3.2.3 Identificar os subtipos genéticos do HIV-1 nas regiões PR e TR nos pacientes desta
área de estudo;
3.2.4 Caracterizar as formas recombinantes intersubtipos de HIV-1 que circulam nestes
estados;
3.2.5 Avaliar associação entre os subtipos de HIV-1 e variáveis laboratoriais, CD4 e carga
viral.
26
4 MÉTODOS
4.1 Área geográfica de abrangência e população alvo
A área geográfica de abrangência desse estudo de corte transversal sobre a
prevalência de resistência transmitida a antirretrovirais e caracterização da diversidade
genética do HIV-1 foi constituída por regiões metropolitanas de dois estados da região
nordeste: Maranhão e Piauí. O estado do Maranhão ocupa uma área de 331.983,293 km²
com população estimada pelo IBGE para 2008 de 6.305.539 habitantes. É o 4º estado com
maior produto interno bruto do nordeste e o 16° do Brasil. Entretanto, apresenta o 26° lugar
dentre os estados classificados por Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) do Brasil.
Além de sua capital, São Luís, outros municípios economicamente importantes foram
incluídos neste estudo: Imperatriz, Timon, Caxias e São José de Ribamar.
O Piauí ocupa uma área de 251.529 km², com população estimada pelo IBGE para
2009 de 3.032.421 habitantes. As cidades mais populosas do estado são: Teresina, capital do
estado, Parnaíba; Picos; Piripiri e Floriano. O estado apresentou em 2010 o 24° lugar dentre
os estados brasileiros classificados por Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) ficando à
frente apenas do Pará, Maranhão e Alagoas.
No período entre agosto de 2011 e junho de 2012 foram recrutados 96 pacientes
acompanhados em distintos Serviços de Atendimento Especializados (SAE) do estado do
Piauí, com o maior número de pacientes sendo acompanhados pelo SAE do Instituto de
Doenças Tropicais Natan Portela em Teresina (capital do estado). No período de janeiro a
junho de 2012 foram recrutados 138 pacientes acompanhados em distintos Serviços de
Atendimento Especializados (SAE) do estado do Maranhão, com o maior número de
pacientes sendo acompanhados pelo SAE do Hospital Presidente Vargas em São Luis
(capital do estado).
Para avaliação da prevalência de mutações associadas a resistência transmitida aos
antirretrovirais foram considerados os critérios de inclusão: pacientes com diagnóstico
recente de infecção aguda ou crônica pelo HIV-1, residirem no Estado do Maranhão ou do
Piauí, sem uso de qualquer terapia antirretroviral prévia, maiores de 18 anos, independente
27
do valor da contagem de linfócitos T CD4+ periféricos e com carga viral plasmática
detectável.
4.2 Recrutamento dos pacientes e obtenção de amostras de sangue
Foram selecionados pacientes que contemplaram os critérios de inclusão acima
mencionados assistidos nos Serviços de Atendimento Especializado dos municípios de São
Luis (MA) e Teresina (PI). É válido esclarecer o convite aconteceu quando os pacientes
aguardavam para a realização dos exames mensais e, portanto poderiam estar sendo
acompanhados em qualquer SAE dos estados. Entretanto, foi prioritário a eleição dos
serviços que são referência para cada estado. Portanto, a maioria dos pacientes faziam
acompanhamento no SAE do Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela (referência para
o estado do Piauí) ou no SAE do Hospital Presidente Vargas (referência para o estado do
Maranhão).
Os pacientes foram convidados a participar do estudo e aqueles que concordaram,
receberam informações sobre o estudo, foi garantido anonimato e sigilo dos dados
fornecidos e foram convidados a assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) (ANEXO A). O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
na Faculdade de Ciências Médicas (FACIME/UESPI) CEP-UESPI sob o Protocolo nº
022/2011 em 07 de junho de 2011.
Para o recrutamento dos sujeitos do estudo contou-se com a colaboração dos
coordenadores e demais profissionais dos SAE/CTA selecionados que também
contribuíram. Os participantes responderam a um questionário contendo informações sóciodemográficas e epidemiológicas, como idade, sexo, procedência, escolaridade, categoria de
exposição ao HIV e uso de antirretrovirais (APÊNDICE A). A aplicação do questionário e
os esclarecimentos acerca do estudo e solicitação da assinatura do TCLE foi realizado pela
autora, em local reservado, no momento em que os pacientes aguardavam para a coleta dos
exames de rotina do acompanhamento do tratamento.
Nos Laboratórios Nacional de Saúde Pública (LACEN) dos estados do Piauí e do
Maranhão foi coletado de cada participante 5 ml de sangue venoso periférico em tubo de
vacutainer – EDTA – ácido etilenodiaminotetracético- (Becton & Dickinson, San Jose – CA,
USA). As amostras de sangue total e plasma foram separadas, codificadas, aliquotadas,
congeladas e enviadas, por transporte aéreo, sob refrigeração, para o Laboratório de
Imunologia da AIDS e da Hanseníase no IPTSP/UFG onde foram estocadas em freezer a 28
80°C e submetidas a análise genômica. Ressalte-se que, a priori, somente os pesquisadores,
a equipe do estudo e os profissionais dos serviços envolvidos na pesquisa tiveram acesso aos
dados dos mesmos, garantindo-se, desta forma, sigilo e anonimato aos sujeitos.
4.3 Extração do RNA genômico
A extração do RNA genômico foi realizada através do kit de extração QIAamp®
Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), conforme protocolos do fabricante:
a partir de 140 µl de amostra de plasma, 5,6 µl da enzima Carrier-RNA e 560 µl do tampão
de lise, seguido por 10 min de incubação a temperatura ambiente (15 – 25º), as partículas
virais circulantes sofreram lise e o RNA foi precipitado com 560 µl de etanol absoluto
(Merck).
Durante uma rápida centrifugação [8000 rotações por minuto (rpm) por 1 min] o
RNA foi adsorvido a uma membrana de sílica. Seguiram-se duas etapas rápidas de
centrifugações com um volume de 500 µl de tampão de lavagem em cada etapa, para que as
proteínas e outros contaminantes fossem retirados, garantindo a pureza do RNA. A eluição
do RNA da coluna de sílica foi realizada com uma rápida centrifugação com 60 µl de
tampão de eluição. As amostras de RNA foram armazenadas à temperatura de -80ºC.
4.4 Síntese do DNA complementar através da retrotranscrição do RNA
A transcrição reversa do RNA para obtenção do DNA complementar (cDNA) foi
realizada através do kit de transcrição reversa do RNA (Invitrogen) conforme protocolos do
fabricante: a partir de 10 µl de RNA extraído (≤ 1 µg), 1 µl de desoxirribonucleotídeos
trifosfatados (mistura de dNTPs constituída por dATP desoxiTimina trifosfatada; dCTP
desoxiCitosina trifosfatada; dTTP desoxiTimina trifosfatase e dGTP desoxiGuanina
trifosfatada) (10 milimolar – mM) e 1 µl primer randômico (150 ng/ µl) seguiu-se uma
incubação de 5 min a 65ºC e após, choque térmico em gelo por 1 min. A seguir foi
adicionado 1 µl da enzima super script III RT (200 U/µl), 4 µl de tampão 5x, 1 µl do agente
redutor ditiotreitol (DTT a 0,1 M), 1 µl da enzima RNase out (40 U/ml) e 1 µl de água ultra
pura (Gibco). A reação de transcrição foi realizada com o período de ciclagem de 25ºC por
5min, 50ºC por 60 min, seguida de inativação da reação a 70ºC por 15 min. As amostras de
DNA complementar (cDNA) foram armazenadas à temperatura de -80ºC.
29
4.5 Amplificação do Gene pol através da Reação em Cadeia da Polimerase em duas
etapas (“nested”-PCR)
Duas regiões diferentes do gene pol foram alvo de amplificação por “nested”-PCR:
o gene completo da PR com 297 pb (HXB2, 2253-2549) e o fragmento de aproximadamente
750 pb do gene da TR (HXB2, 2550-3299).
Na primeira etapa da "nested"- PCR foram utilizados tampão de PCR 10x
(Invitrogen), MgCI2 a 15 mM (Invitrogen), dNTP a 25 mM (Invitrogen), Taq DNA
polimerase a 5 U/µl (Invitrogen), primers externos para a região pol, Kozal-1 e Kozal-2
(Gibco), 5 µl do cDNA obtido por RT-PCR e água ultra pura (Gibco) qsp 50 µl.
H2O Ultra Pura. ..................................................................................... 33, 5 µl
Tampão de PCR 10x .................................................................................... 5 µl
MgCI2 50 mM ........................................................................................... 3,5 µl
Mistura de dNTP 25 mM .............................................................................. 1 µl
Primer 10 pmoles/ µL .................................................................................. 1 µl
Primer 10 pmoles/ µL....................................................................................1 µl
Taq 5 Ul/ µL ........................................................................................... 0,25 µl
Amostra de cDNA ........................................................................................ 5 µl
Volume total .............................................................................................. 50 µl
Amostra de DNA ....................................................................................... 10 µl
Volume total ............................................................................................... 50 µl
Na segunda etapa da "nested"-PCR foram utilizados tampão de PCR 10x
(Invitrogen), MgCI2 a 50 mM (Invitrogen), dNTP a 25 mM (Invitrogen), Taq DNA
polimerase a 5 U/µl (lnvitrogen), primers internos para a região pol DP10 e Frenkel-2
(Gibco), 5 µl do produto da primeira etapa da "nested-PCR" e água ultra pura (Gibco) qsp
100 µl.
H20 Ultra Pura ......................................................................................... 71,9 µl
Tampão de PCR 10x .................................................................................... 10 µl
MgCI2 50 mM ............................................................................................... 7 µl
Mistura de dNTP 25 mM ............................................................................. 1,6 µl
Primer 10 pmoles/ µl .................................................................................... 2 µl
Primer 10 pmoles/ µl .................................................................................... .2 µl
Taq 5 U/ µl ................................................................................................ 0,5 µl
Produto da 1a etapa ...................................................................................... 5 µl
Volume total ............................................................................................. 100 µl
As duas etapas da "nested"-PCR foram realizadas em termociclador automático
(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). As duas
30
etapas de amplificação da região do gene pol foram realizadas utilizando o seguinte
programa de ciclagem: 1 ciclo 940C por 1 min, 35 ciclos a 940C por 45 seg, 550C por 45 seg,
720C por 2 min, 1 ciclo 720C por 10 min e 4ºC por tempo indeterminado.
Foram sequenciados o gene pol com os primers DP10, DP16, RT9, DP17, DP11,
RT1, F2 e F3.
4.6 Eletroforese em Gel de Agarose 1%
Os fragmentos de amplificação obtidos através da amplificação pela “nested”-PCR
do gene pol do HIV-1 foram analisados por meio de aplicação de uma mistura contendo 4 µl
de produto de amplicon e 1 µl de azul de bromofenol puro (Gibco) ao gel e paralelamente 4
µl de uma mistura de padrão de peso molecular (100 bp Low DNA Mass Ladder,
Invitrogen) e 1 µl de azul de bromofenol puro (Gibco). Este marcador de peso molecular em
uma mistura de fragmentos de 2000, 1200, 800, 400, 200 e 100 pb contendo 200, 120, 80,
40, 20 e 10 ng de DNA, respectivamente.
A corrida eletroforética foi realizada em cuba horizontal (Horizon 11-14 e 25-25
Gel Electrophoresis Apparatus, Gibco-Life Technologies, USA) durante 1 hora a 100 V, 400
mA em tampão TAE 1x. O gel foi analisado sob luz ultravioleta a 310 nm de comprimento
de onda para visualização de bandas fluorescentes.
4.7 Purificação do produto amplificado obtido através da “nested”-PCR
Os produtos amplificados da segunda etapa da “nested”-PCR do gene pol foram
purificados empregando-se o kit QIAquick® PCR Purification Kit/QIAGEN (Qiagen
GmbH, Hilden, Germany), conforme protocolos do fabricante: 96 µl do produto amplificado
da segunda etapa da “nested”-PCR foram adicionados a 480 µl de tampão com alta
concentração de sais caotrópicos que modificaram a estrutura da água e permitiram um pH
ótimo para ligação eficiente de produtos de PCR de dupla fita e, ainda é removedor de
primers, sais, enzimas e nucleotídeos não incorporados.
Mediante uma etapa rápida de centrifugação (13000 rpm por 1 min), o produto de
PCR foi adsorvido a uma membrana de sílica. Em seguida, mais uma etapa rápida de
centrifugação com um volume de 750 µl de tampão de lavagem, para que as proteínas e
outros contaminantes fossem retirados garantindo a pureza do produto de PCR. Uma etapa
de centrifugação adicional foi requerida para eliminação total de resíduos dos tampões. A
31
eluição do produto puro de PCR da membrana de sílica foi realizada com 50 µl de tampão
de eluição que provocou a redução do pH e da concentração de sais, seguida por uma
incubação de 1 min a temperatura ambiente e uma etapa rápida de centrifugação. As
amostras de produto de PCR purificadas foram armazenadas à temperatura de -20ºC.
4.8 Sequenciamento automatizado
Os produtos de PCR purificados do gene pol do HIV-1 foram submetidos ao
sequenciamento automatizado utilizando o Big Dye Terminator Sequencing Kit v.3.1
(Applied Biosystems, CA, USA). Em placas de 96 poços (Amplied Biosystems Inc, Foster
City, CA, USA) foram adicionados 2 µl de produto PCR purificado, 3 µl de tampão de
sequenciamento 5x (Amplied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA), 4 µl de cada um dos 8
primers separadamente a 1,5 pmol/ µl para o gene pol (Gibco) (DP10, DP16, RT9, DP17,
DP11, RT1, F2 e F3) e 5 µl de água ultra pura (Gibco). A reação de sequenciamento foi
realizada em termociclador automático com o seguinte programa de ciclagem: 25 ciclos de
95ºC por 20 seg, 50ºC por 15 seg e 60ºC por 60 seg.
Os produtos sequenciados foram submetidos à precipitação com isopropanol e
etanol para purificação do material. Foram adicionados à placa contendo amostra a ser
sequenciada, 60 µl de isopropanol 65% (Merck), homogeneizadas em vórtex por 30 seg,
seguida de incubação por 20 min à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Seguiu-se uma
centrifugação de 45 min a 2000 g (força centrífuga relativa à gravidade). Após este período
os sobrenadantes foram descartados por inversão das placas em papel absorvente por 2 min.
Foram adicionados 250 µl de etanol 60% (Merck) seguido por centrifugação por 10 min a
2000 g. Mais uma vez os sobrenadantes foram descartados e adicionados 100 µl de etanol
60% (Merck) seguido por centrifugação por 10 min a 2000 g. Os sobrenadantes foram
descartados e a placa invertida foi centrifugada por 1 min a 500 rpm para sua completa
secagem. As amostras foram ressuspensas em 10 µl de formamida Hi-Di (Amplied
Biosystems Inc, Foster City, CA, USA) para desnaturação da fita dupla de DNA, seguida
por um período de incubação de 2 min a 95ºC e choque térmico com gelo por 2 min.
Finalmente, a leitura dos eletroferogramas foi realizada em sequenciador automático (ABI
PRISM® 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, CA, USA) do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP/UFG).
32
4.9 Análise dos cromatogramas
Após obtenção dos cromatogramas, as sequências foram submetidas ao programa
Phred (Ewing et al. 1998) para serem avaliados quanto à qualidade. As sequências foram
editadas manualmente por comparação de complementaridade dos contigs e alinhadas com a
sequência de referência HXB2 através do programa Staden Package 1.6 para Windows
(http://staden.sourceforge.net/). Este programa consiste em uma série de ferramentas para
preparação das sequências (pregap4), montagem e edição (gap4) e análise de sequências de
DNA e proteínas (spin) e foi obtido gratuitamente no site http://standen.sourceforge.net/.
Todas as sequências geradas através da edição manual no programa Staden
Package foram submetidas a análise de controle de qualidade para garantir ausência de
possíveis contaminações entre as amostras (Learn et al. 1996). Esta análise foi realizada
através
do
programa
de
bioinformática
HIV
Quality
analysis
Pipeline
(http://www.sanbi.ac.za), que testa as sequências para possíveis existências de
contaminações usando BLAST (comparação) com um banco de dados público no GenBank
de aproximadamente 200000 sequências publicadas e um BLAST com o banco de dados
interno do laboratório.
4.10 Análise genética
A presença de mutações associadas à resistência aos ARVs foi avaliada com a
ferramenta de bioinformática do programa da Universidade de Stanford (Stanford HIV Drug
Resistance Database – http://hivdb6.stanford.edu) que, define as mutações a partir de
diferenças da sequência consenso do subtipo B do HIV-1. A resistência transmitida do HIV1 aos ARV foi avaliada de acordo com o Calibrated Population Resistance (CPR) Tool
Version 6.0.
A ferramenta CPR é um programa usado para analisar sequências de HIV-1 e
constitui uma abordagem padrão para determinar as sequências contendo uma mutação de
resistência transmitida do HIV-1 a drogas ARV, gerando uma lista padrão de mutações de
resistência a um fármaco ou a uma classe de fármacos (Gifford et al. 2009). Esta abordagem
foi aprovada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para a vigilância epidemiológica
de HIV com resitência transmitida a drogas ARV (Shafer et al. 2008, Bennet et al. 2008). A
análise foi feita usando o site CPR (http://cpr.stanford.edu/cpr.cgi).
33
Através da análise de similaridade genética, as mutações virais encontradas pela
técnica de sequenciamento foram interpretadas e forneceram informações do perfil de
resistência às drogas ARVs (suscetível, potencial de baixo nível, baixo nível, intermediário e
alto nível de resistência). Além disso, a análise de resistência aos ARVs também foi avaliada
através da comparação com o banco de dados da Sociedade Internacional de Antivirais dos
Estados Unidos da América (IAS-USA).
A definição dos subtipos genéticos dos isolados do HIV-1 estudados foi realizada
empregando diferentes ferramentas de subtipagem do HIV-1 como: programa REGA HIV-1
versão 2.0 (Oliveira et al. 2005) através do site http://www.bioafrica.net/subtypetool/html e
inferência filogenética.
A construção da árvore filogenética foi realizada através do alinhamento das
sequências de estudo com sequências de referência mais representativas dos diversos
subtipos puros e recombinantes do grupo M do HIV-1 obtido através do banco de dados Los
Alamos HIV Database (http://hiv_web.lanl.gov). O alinhamento foi obtido através do
programa Clustal X versão 2.0 (Thompson et al. 1994) disponível no site http://bips.ustrasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/. O alinhamento foi editado manualmente através do
programa
BioEdit
versão
5.0.9
(Hall
1999)
acessado
através
do
site
http://mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html. Por fim, a árvore filogenética foi construída
através do método neighbor-joining (Nei & Kumar 2000) e modelo evolutivo Kimura 2parâmetros (Kimura 1980) com valor de suporte (bootstrap) de 1000 replicatas, usando o
programa
MEGA
versão
4.0
(Tamura
et
al
2007),
obtido
através
do
site
http://www.megasoftware.net/fixed_bugs.html. A sequência do vírus da imunodeficiência
símia do chimpanzé (SIVcpz) foi utilizada como grupo externo.
Os isolados virais que apresentaram subtipos discordantes em mais de uma região
genômica do HIV-1 foram analisados para confirmação da recombinação através do
programa SIMPLOT versão 3.5.1 (Lole et al. 1999), sob os seguintes parâmetros: método
neigbor-joining, modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros com valor de bootstrap de 1000
replicatas, janela de 200 pb com passos de 20 pb, gap-stripped e taxa de
transversão/transição no valor de 2,0.
As sequências dos isolados do HIV-1 obtidas nesse estudo foram depositadas no
banco de dados GenBank e obtiveram os seguintes números de identificação: isolados de
pacientes do estado do Piauí, KF700948 – KF701036 e isolados de pacientes do estado do
Maranhão, KF782680 – KF782785.
34
4.11 Análise estatística
O banco de dados foi analisado pelo programa EpiInfo 3.4.3 (CDC Epidemiology
Program Office, Atlanta, USA & WHO Global Programme on AIDS, Geneva, Switzerland)
para cálculos de frequências, médias e medianas das principais variáveis e o intervalo de
confiança foi usado para comparar se há diferenças entre dois ou mais grupos.
.
35
5 ARTIGOS
Artigo 1 – HIV-1 transmitted drug resistance and genetic diversity among patients from
Piauí State, Northeast Brazil
Autores: Maria Edileuza Soares Moura, Mônica Nogueira da Guarda Reis, Yanna Andressa
Ramos Lima, Kelsen Dantas Eulálio, Ludimila Paula Vaz Cardoso, Mariane Martins de
Araújo Stefani.
Revista: Journal of Medical Virology
DOI: 10.1002/jmv.24087
Artigo 2 – Low Rate of Transmitted Drug Resistance May Indicate Low Access To
Antirretroviral Treatment In Maranhão State, Northeast Brazil
Autores: Maria Edileuza Soares Moura, Mônica Nogueira da Guarda Reis, Yanna Andressa
Ramos Lima, Kelsen Dantas Eulálio, Ludimila Paula Vaz Cardoso, Mariane Martins de
Araújo Stefani.
Revista: Aids Research and Human Retroviruses
DOI: 10.1089/aid.2014.0261
36
ARTIGO 1
HIV-1 transmitted drug resistance and genetic diversity among patients from Piauí
State, Northeast Brazil
Maria Edileuza Soares Moura1
Mônica Nogueira da Guarda Reis2
Yanna Andressa Ramos Lima2
Kelsen Dantas Eulálio3
Ludimila Paula Vaz Cardoso2
Mariane Martins Araújo Stefani2*
Affiliation:
1
University of Maranhão State, Caxias city, Maranhão State, Brazil
2
Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia
city/Goiás State, Brazil
3
Faculty of Medicine, University of Piauí State, Teresina city, Piauí State, Brazil
*Correspondence to: Mariane Martins de Araújo Stefani. Address: Tropical Pathology and
Public Health Institute, Federal University of Goiás. 235 Street, Setor Universitário, 74605050, Goiânia city, Goiás State, Brazil. Phone: 55 62 3209 6111. Fax: 55 62 3209 6363. Email: [email protected]
Running Title: HIV-1 transmitted drug resistance in Brazil.
37
ABSTRACT
HIV-1 transmitted-drug-resistance and genetic diversity are dynamic and may differ in
distinct locations/risk groups. In Brazil, increased AIDS incidence and related mortality
have been detected in the Northeast region, differently from the epicenter in the Southeast.
This cross-sectional study describes transmitted-dru- resistance and HIV-1 subtypes in
protease/PR and reverse transcriptase/RT regions among antiretroviral naïve patients from
Piauí State, Northeast Brazil. Among 96 patients recruited 89 (92.7%) had HIV-1 PR/RT
regions sequenced: 44 females and 45 males, 22 self-declared as men who have sex with
men. Transmitted-drug-resistance was investigated by CPR tool (Stanford HIV-1 Drug
Resistance/SDRM). HIV-1 subtypes were assigned by REGA and phylogenetic inference.
Overall, transmitted-drug-resistance rate was 11.2% (10/89; CI 95%: 5.8-19.1%); 22.7%
among men who have sex with men (5/22; CI 95%: 8.8-43.4%), 10% in heterosexual men
(2/20; CI 95%: 1.7-29.3%) and 6.8% in women (3/44; CI 95%: 1.8-17.4%). Singleton
mutations to protease-inhibitor/PI, nucleoside-reverse-transcriptase-inhibitor/NRTI or nonnucleoside-reverse-transcriptase-inhibitor/NNRTI
predominated
(8/10):
PI
mutations
(M46L, V82F, L90M); NRTI mutations (M41L, D67N) and NNRTI mutations (K103N/S).
Dual class resistance mutations to NRTI and NNRTI were observed: T215L (NRTI), Y188L
(NNRTI) and T215N (NRTI), F227L (NNRTI). Subtype B prevailed (86.6%; 77/89),
followed by subtype F1 (1.1%, 1/89) and subtype C (1.1%, 1/89). B/F1 and B/C
intersubtype recombinants represented 11.2% (10/89). In Piauí State extensive testing of
incidence and transmitted-drug-resistance in all populations with risk behaviors may help
control AIDS epidemic locally.
Keywords: HIV-1; Northeast Brazil; subtypes; transmitted drug resistance.
38
Introduction
HIV-1 surveillance programs should monitor incidence/prevalence, subtypes
distribution and drug resistance mutations among all exposure categories, especially risk
groups, such as men who have sex with men (MSM), commercial sex workers (CSW) and
intravenous drug users (IDU). Brazil has reported the largest number of AIDS cases and the
highest level of HIV-1 genetic diversity in Latin America and in this huge and diverse
country, AIDS epidemic reflects important regional differences. Although the epidemic has
been considered stable, over the last ten years an important increase in incidence (58%) has
been observed in the Northeast region of the country.
Successful antiretroviral (ARV) treatment, which comprises combinations of
nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs/NNRTIs) and
protease inhibitors (PIs)1, is important to reduce viral load and virus transmission.2
Distribution of ARV drugs by public health programs has been scaled up, raising concerns
about the selection of viral mutants associated with drug resistance, as they can lead to
virological failure, secondary resistance and transmission of resistant strains.1,3,4
Transmitted drug resistance (TDR) is an important public health issue that can jeopardize
reductions in mortality, morbidity and transmission.5,6
TDR levels have been described in several studies mainly from the Southeast and
South regions, which concentrate the Brazilian AIDS epidemic.7-12 There is scanty data on
HIV-1 molecular epidemiology in other regions away from the epicenter of the epidemics,
especially from the Northeast region of the country, constituted by nine States. This region
accounts for 88,830 AIDS cases and previous studies performed include data from only
three out of its nine States (Pernambuco, Ceará, and Bahia).13-17 In Brazil, low to moderate
levels of TDR have been described, and pre-ARV therapy genotyping is recommended to
pregnant women and to those infected by patients under ARV therapy.18,19
This study describes HIV-1 TDR and subtypes circulating among ARV naïve
patients, heterosexual and MSM recruited in Piauí State, Northeast Brazil. These data will
contribute to the understanding of molecular characteristics and epidemiology of HIV-1
epidemic in a Brazilian region of increasing incidence.
Materials and Methods
Study area and subjects
39
This study was a descriptive study designed to investigate the molecular
epidemiology of HIV-1 among ARV naïve patients attending public health services in Piauí
State, Northeast Brazil. This Brazilian State has 3,118,360 inhabitants and is characterized
by small agriculture-centered cities (soybeans, rice, corn and cotton) and livestock
production farms. Teresina city is the capital, with 814,230 inhabitants. Approximately half
of patients included in this survey lived in Teresina and the remaining ones came from 28
different small villages located throughout the State.
In Piauí State, 3,958 AIDS cases were reported from 2009 to 2013 and during the
study period (August 2011 to May 2012) 96 consecutive cases of HIV-1 ARV naïve patients
were recruited in Teresina. Patients were recruited while attending the Public Health Central
Laboratory (LACEN), a public reference health service responsible for CD4+ T cell count
and viral load determinations. The study group represents 28.7% of all ARV naïve patients
(n=334) that attended this reference center during the period of recruitment. Inclusion
criteria were: male or female patients with recent or previous diagnosis of HIV-1 infection
with no history of previous ARV exposure, subjects older than 18 years and living in Piauí
State. Standardized questionnaires were used by a trained person to obtain socio-behavioral
data by face-to-face interviews. Clinical and laboratory data, including plasma viral load
(bDNA; Siemens Medical Solutions, Mississauga, Ontario, Canada) and CD4+ T cell counts
(FACSalibur, Becton & Dickson, San Jose, CA, USA) were retrieved from medical files at a
reference hospital (Hospital de Doenças Tropicais Dr. Natan Portela) in Teresina city.
Genetic analysis
HIV-1 RNA was extracted from plasma (QIAamp Viral RNA Mini Kit, Qiagen
GmbH, Hilden, Germany), reverse transcribed into complementary DNA (cDNA)
(Invitrogen, Carlsbad, CA) and used as the target for a nested polymerase chain reaction
(nested-PCR) of pol region as previously described.20 The entire protease (PR) fragment
and approximately 750-bp of the reverse transcriptase (RT) fragment were amplified.21,22
After purification of amplicons (QIAquick PCR Purification Kit/QIAGEN, Qiagen GmbH),
genomic sequencing was performed (ABI Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA).
40
Phylogenetic analysis
HIV-1 subtypes were identified by REGA tool version 2.0 and by phylogenetic
inference using reference sequences obtained from Los Alamos HIV database.23,24 Trees
were generated by Neighbor-Joining method under Kimura’s two-parameter correction
model using MEGA5 software.25,26 Bootstrap values (1000 replicates) above 70% were
considered significant. The HIV-1 sequences with discordant subtypes in the PR and RT
fragments, which are suggestive of intersubtype recombination, were analyzed by
SIMPLOT 3.5.1.27
GenBank accession numbers of reference sequences used in the comparative
phylogenetic and SIMPLOT analyses are the following, for subtype B: U21135, FJ638434,
AY173956, K03455, EF379194, EF379210, FJ548795, FJ548804, and U63632; for subtype
C: AF110967, U46016, FJ548791, FJ594149, AF286228, AF067155, and U52953; for
subtype F1: DQ358801, AF077336, and AF005494; and for the simian immunodeficiency
virus sequence from the chimpanzee (SIVcpz) used as an outgroup: X52154. GenBank
accession numbers of HIV-1 pol sequences described in this study are KF700948KF701036.
Resistance analysis
TDR rate was analyzed using the Calibrated Population Resistance (CPR) tool
(Stanford Surveillance Drug Resistance Mutation-SDRM) and the International AIDS
Society-USA major mutation list (IAS-USA).28,29 Susceptibility profile of ARV mutations
was analyzed by the SDRM-2009 (Accessed: October/2013).
Statistical analysis
Continuous variables were described as medians with minimum and maximum
range. Categorical variables were presented as frequency and percentage. Chi-square or
Fisher´s exact test were used to analyze the differences among categorical variables, with a
significance level of 5%. All descriptive analyses were performed using Epi InfoTM version
7 (CDC, Atlanta).
41
Results
Among 96 ARV naïve patients recruited, 89 had both the PR and RT regions of
HIV-1 sequenced (89/96, 92.7%). The median age of participants was 34 years (range: 1880 years), 45 were males and among them, 22 self-reported as MSM. Heterosexual
unprotected sex was reported by 64 patients and one participant was an IDU. The median of
CD4+ T cell counts was 424 cells/µl (range: 27-1,290 cells/µl) and most patients (78/89) had
HIV-1 plasma viral loads ranging from <10,000-100,000 copies/ml. Baseline and virologic
characteristics of study subjects are described in Table 1.
Overall, the rate of TDR among patients from Piauí State was 13.5% (12/89; CI
95%: 7.5%-21.8%). Half (6/12) of HIV-1 isolates with resistance mutations were identifies
among MSM (Table 1). The TDR rate among MSM was 27.3% (6/22; CI 95%: 11.9%48.3%) and among heterosexual males it was 10% (2/20; CI 95%: 1.7%-29.3%). Among
women, TDR rate was 9.1% (4/44; CI 95%: 3.0%-20.5%). There were no significant
differences among TDR rates observed among different groups (p>0.05). Patients with TDR
(n=12) had a median of CD4+ T cell counts of 380 cells/µl (range 27-678 cells/µl); six
patients had viral loads between 10,000-100,000 copies/ml. Although patients in this study
came from 28 locations from all regions throughout Piauí State, TDR cases were
concentrated mainly in the North and Central North regions, near the capital, Teresina
(Figure 1).
Mutation profiles of ARV resistant HIV-1 isolates and the level of resistance to
distinct ARV drugs are depicted in Table 2. Analyses indicate that most isolates (10/12) had
single class resistance mutations: PI mutations (M46L, V82F, L90M); NRTI mutations
(M41L, D67N); NNRTI mutations (K103N/S, E138A). Dual class resistance mutations to
NRTI and NNRTI were observed among two isolates: first one (T215L-NRTI and E138G,
Y188L-NNRTI); second one (T215N-NRTI and F227L-NNRTI).
Regarding frequency distribution of HIV-1 subtypes among patients from Piauí
State, a clear predominance of sequences clustering with a single subtype (88.8%, 79/89)
was observed (Figure 2). Among concordant subtypes in PR and RT regions, subtype B
predominated (86.6%; 77/89). Non-subtype B isolates were infrequent: only one patient
harbored subtype F1 (1.1%) and one case of subtype C infection was identified (1.1%).
Moreover, B/F1 and B/C recombinant forms were identified among ten female patients
(11.2%): F1PR/BRT (n=1), F1PR/BF1BRT (n=1), BPR/BF1RT (n=2), BPR/BCBRT (n=2), BPR/CRT
(n=1), BPR/BCRT (n=1), CPR/CBRT (n=1) and one CRF31_BC-like isolate. Recombination
42
pattern of these mosaics is presented in Figure 3. Among isolates with resistance mutation
(n=12), 11 were classified as subtype B and one of them was a BPR/BCRT recombinant form.
Discussion
This study showed a high rate of TDR among MSM contrasting with moderate
levels detected in heterosexual male and female patients recruited in Piauí State, Northeast
Brazil. Our results indicate that in this setting, MSM may probably play a key role in the
spreading of HIV-1 with drug resistance. TDR rate observed among MSM was over 20%,
while rates among heterosexual male and female patients were around 10%. However, there
was no statistically significant difference among TDR rates among groups.
Since the beginning of the HIV/AIDS epidemic, 30 years ago, male-to-male sexual
contact has been a well-recognized route of infection and more recently, there has been
increased concern about resurging HIV-1 incidence among MSM on a global level.30,31 High
HIV-1 infection rates have been reported among MSM from Asia, Africa, Latin America,
and the former Soviet Union.32-35 In Brazil, the prevalence of HIV-1 infection among MSM
raised from 0.56% in 2002 to 1.2% in 2007.36,37
In our study, half of the patients with TDR were MSM, which by definition
includes gay, bisexual, transgendered and self-identified heterosexual men who engage in
sex with other men.38 In this study group, 5 out of 22 MSM declared bisexual behavior,
confirming the potential bridging role of MSM for transmitting HIV-1 to heterosexual
women. Our findings are important for public health indicating that in Piauí State, local
prevention and intervention programs should target MSM as an effort to interrupt both the
homosexual and heterosexual transmission of HIV-1 and TDR. TDR can potentially impact
virologic, immunologic and other health outcomes by decreasing the effectiveness of
ARV.39-42
MSM have well-characterized risk factors for HIV-1 acquisition and transmission,
however they have been usually under-represented in surveillance evaluations and in
targeted prevention programs. In general, MSM can still be considered a ‘hidden’ group as
they may prefer not to participate in surveillance studies due to stigma and discrimination
(homophobia).43 We are aware that our sample size is not sufficient to generalize the
findings, however obtaining representative samples of high risk subpopulations as MSM is a
known surveillance challenge. However, despite the small number of MSM in the studied
population, the high rate of TDR identified among them, highlight the need for continuous
43
surveillance. Other studies among MSM have shown moderate to high prevalence of
resistance mutations.20,44-46
Two recent multicenter surveys in Brazil have shown moderate levels of TDR
according to the WHO survey scoring system for TDR (low <5%, moderate 5%-15%, high
>15%)3,8,9,47 Similar rates of TDR have been reported in different geographical regions in
Brazil: 11.5% in the northern Tocantins State; 10% in the central western Goiás State;
14.2% in the southeastern São Paulo State and 11% in the southern Santa Catarina
State.11,20,48,49 The overall moderate rate of TDR identified in the current study (13.5%) is in
accordance with other reports from Brazil and from the northeastern region.15,16
In ARV naïve patients from Piauí State, singleton mutations to PI, NRTI or NNRTI
predominated
(10/12);
only
two
patients
had
dual-class
resistance
mutations
(NRTI/NNRTI): T215L (NRTI) and E138G/Y188L (NNRTI); T215N (NRTI) and F227L
(NNRTI). The most frequent NNRTI resistance mutations were: K103N/S (25%; 3/12) that
causes
high-level
resistance
to
nevirapine
and
efavirenz;
K103S
that
causes
intermediate/high-level resistance to nevirapine and low/intermediate-level resistance to
efavirenz.3 Major PI resistance mutations (M46L, V82F and L90M) were detected. A
previous study among patients under PI-based highly active antiretroviral therapy (HAART)
from the United States of America (USA) showed L90M as the most prevalent (42%)
resistance mutation, independently of the PI used and of the number of PI-containing
regimens.50 Thymidine analog mutations (TAMs) are frequent in low-income countries with
ARV treatment based on fixed-dose combinations of thymidine analogs. In this study, type I
TAM (M41L) and type II TAM (D67N) were observed in two patients. The M41L mutation
occurred with T215S but M41L usually occurs with T215Y/F mutations, causing high-level
resistance to zidovudine, stavudine and intermediate resistance to didanosine, abacavir and
tenofovir.51 The T215S/N/L mutation in codon 215 was the most frequent NRTI-SDRM,
identified in 3 out of 12 patients (25%), two of them MSM. T215S/N is a revertant mutation
that indicates that the T215Y/F mutation was previously transmitted to one zidovudinenaïve patient and that the virus reverted to a phenotype closer to the wild type. T215S/N
mutations can be considered as ‘tracks’ in this change.52 The T215 revertant mutations have
been previously described in other Brazilian studies.21,53,54 The D67N mutation detected in
one patient, contributes to low-level resistance to zidovudine and stavudine.2
In this study, the high/moderate rate of TDR contrasts with a rather low level of
HIV-1 genetic diversity in which overall, more than 85% of the patients were infected with
‘pure’ subtype B. These data suggest that HIV-1 diversity in this setting has received little
44
impact from the south/southeast/central western where declining trend in subtype B
prevalence has been reported.20,53-55 Teresina city is the only capital in the northeast region
which is not located by the Atlantic Coast and only recently it has attracted migrants from
other regions Moreover, compared to other Northeastern capitals, it has limited touristic
activities, a factor that may have contributed to the highly subtype-B dominated epidemic.
The circulation of ‘pure’ non-subtype-B viruses in this setting was restricted to only
two patients: one subtype F1 male patient that had worked in São Paulo city, southeast and
one subtype C infection detected in a male prisoner. On the other hand, diverse B/F1 (n=5)
and B/C (n=6) recombinants representing 11.2% of the viruses were identified, even with
low frequency of circulating “pure” subtype F1 and C isolates. These findings suggest that
in this area of high subtype B prevalence and very low prevalence of subtype F1 and
subtype C, there is reduced chances of co-infection or super-infection with subtypes B and
F1 or C which is required for the generation of recombinants. Therefore rather than being
generated locally, the B/F1 and B/C recombinant forms circulating in Northeast Piauí have
probably been imported from Brazilian South or Southeast regions where they are frequent.
Our results also indicate low northwards dissemination of “pure” subtype C, which is
prevalent in southern Brazil, toward northeast Piaui.14,15,17,47,55-58 In fact, our data show that
subtype C seems to be spreading to northeast Brazil as recombinant B/C viruses, rather than
“pure” subtype C viruses. The characteristics of B/F1 and B/C recombinant viruses and their
impact on the epidemic from Piauí, northeast Brazil can be better elucidated by full-length
or near full-length genomes indicating whether these recombinants represent any of the
already described CRFs or if they represent new yet unidentified CRFs.
In conclusion, this study the high subtype B prevalence and the limited circulation
of non-subtype B viruses, contrast with several patterns of B/F1 and B/C recombinants.
More importantly, high TDR rate was observed among MSM compared to moderate rates in
heterosexual patients. The high TDR level among MSM in a geographical area of increasing
HIV-1 prevalence highlights the need of extensive MSM testing to evaluate both incidence
and TDR level, which is the cornerstone for guidelines for pre ARV genotyping.
Funding
This study was supported by CAPES and PRONEX/FAPEG/CNPq-07/2012.
Mariane M. A. Stefani is a recipient of a fellowship from CNPq (grant#304869/2008-2),
Maria Edileuza S. Moura was supported by a fellowship from CAPES and FAPEMA
45
(grant#APP-UNIVERSAL-00222/12),
Mônica
N.
G.
Reis
by
FAPEG
(grant#
201210267000386), Yanna A. Lima by CAPES (grant#52001016) and Ludimila P. V.
Cardoso by CAPES (grant#02479/09-5).
Competing interests
All authors declare no conflicts of interest.
Ethical approval
This study was approved by the regional Institutional Review Boards (“Comitê de
Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual do Piauí”,
protocol# 022/2011 and “Comitê de Ética de Pesquisa do Hospital de Doenças Tropicais Dr.
Natan Portela”, protocol# 16/2011). All participants were instructed about the study and
signed a written informed consent before interview and blood collection for HIV-1
molecular analysis.
Acknowledgements
We are thankful to the medical staff from the Public Health Central Laboratory /
LACEN Dr. Costa Alvarenga, from Teresina city for support during recruitment.
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53
Figure 1. Distribution of HIV-1 isolates obtained from ARV naïve patients across Piauí
State, located in Northeastern Brazil. The capital, Teresina city was the recruitment site of
patients from all the State. Municipalities are classified by population density: dark gray
marks represent cities densely populated (11,000 – 815,000 inhabitants), light gray marks
represent less populated cities (1,000 – 4,500 inhabitants). Red stars represent municipalities
where subjects with transmitted drug resistance were identified and blue stars represent the
place of residence of HIV-1 infected subjects recruited.
54
Table 1. Baseline and virologic characteristics of 96 HIV-1 ARV naïve subjects from Piauí
State, Northeast Brazil
Gender
Male
Female
Median of age in years (range)
Route of infection [n (%)]
Heterosexual
Female
Male
MSM
IDU
Unknown
Median of CD4 counts, cells/µl (range)
HIV-1 RNA, copies/ml [n (%)]
<10,000
10,000 - 100,000
>100,000
PR/RT HIV-1 subtype [n (%)]
B/B
F1/F1
C/C
B/F1
B/C
ARV naïve
patients (n=89)
Transmitted drug
resistance (SDRM-2009)
(n=12/89, 13.5%)
45 (50.6%)
44 (49.4%)
34 (18-80)
8 (17.7%)
4 (4.2%)
36 (27-48)
64 (71.9%)
44 (49.4%)
20 (22.5%)
22 (24.7%)
1 (1.1%)
2 (2.2%)
424
(27-1,290)
6 (9.4%)
4 (9.1%)
2 (10.0%)
6 (27.3%)
380
(27-678)
39 (43.8%)
39 (43.8%)
11 (12.4%)
4 (33.3%)
6 (50.0%)
2 (16.7%)
77 (86.5%)
1 (1.1%)
1 (1.1%)
4 (4.5%)
6 (6.7%)
11 (91.7%)
1 (8.3%)
ARV: Antiretroviral; IDU: Intravenous drug user; MSM: Men who have sex with men; PR:
protease; RT: reverse transcriptase; SDRM: Stanford Surveillance Drug Resistance
Mutation.
55
Fig2
56
Figure 2. Phylogenetic classification in PR and RT regions of “pure” subtypes from HIV-1
isolates obtained from ARV-naïve patients from Piauí State, Northeast Brazil. Viral isolates
characterized in this study are represented by black lines. Red lines correspond to reference
sequences used for comparison analyses.
57
Figure 3. Bootscanning analysis of recombinant HIV-1 sequences in protease and reverse
transcriptase regions from ten ARV-naïve patients from Piauí State, Northeast Brazil. Bars
represent HIV-1 genome. PR: protease; RT: reverse transcriptase; INT: integrase.
58
Table 2. Amino acid substitutions in protease and reverse transcriptase resistance-related codons of patients from Piauí State,
northeast Brazil.
GenBank
Route of
Sex
Mutations
Resistance profile
accession
infection
/Age
PI
PI
NRTI
NNRTI
Low
Intermedia
High
number
HIV-1
(years) Minor
Major
te
PR/RT
Subtype
MSM
M/39
L10I
RPV
KF700957
E138A
B
Hetero
F/34
NFV
KF700966
M46L
B
Hetero
F/46
EFV,
KF700975
K103N
B/BC
NVP
Hetero
M/43
ATV,
FPV,
IDV,
KF700988
V82F
B
DRV,LPV
NFV
MSM
M/35
D67N,
AZT, d4T
KF700993
B
V75I
Hetero
F/39
M41L,
ABC, ddI,
AZT, d4T
KF700995
B
TDF
T215S
MSM
M/31
EFV,
KF700996
K103N
B
NVP
MSM
M/48
EFV
NVP
KF701005
K103S
B
MSM
M/27
L10V
E138G,
AZT, d4T
ETR
EFV,
KF701010
T215L
B
V179E,
NVP,
RPV
Y188L
Hetero
F/36
RPV
KF701011
E138A
B
MSM
M/43
AZT, d4T,
NVP
KF701014
T215N
F227L
B
EFV
Hetero
M/35
L10V
ATV,
SQV
NFV
KF701030
L90M
B
FPV, IDV
59
Legend: PR: protease region; RT: reverse transcriptase region. MSM: men who have
sex with men; Hetero: heterosexual. M: Male; F: Female.PI: protease inhibitor; NRTI:
nucleoside
reverse
transcriptase
inhibitors;
NNRTI:
non-nucleoside
reverse
transcriptase inhibitors. ATV: atazanavir; AZT: zidovudine; ddI: didanosine; d4T:
stavudine; DRV: darunavir; EFV: efavirenz; FPV: fosamprenavir; IDV: indinavir;
LPV: lopinavir; NFV: nelfinavir; NVP: nevirapine; RPV: rilpivirine; SQV:
saquinavir;TDF: tenofovir. The resistance mutations are given in bold.
60
ARTIGO 2
LOW RATE OF TRANSMITTED DRUG RESISTANCE MAY INDICATE LOW
ACCESS TO ANTIRRETROVIRAL TREATMENT IN MARANHÃO STATE,
NORTHEAST BRAZIL
Maria Edileuza Soares Moura1
Mônica Nogueira da Guarda Reis2
Yanna Andressa Ramos Lima2
Kelsen Dantas Eulálio3
Ludimila Paula Vaz Cardoso2
Mariane Martins de Araújo Stefani2*
Affiliation:
1
2
State University of Maranhão, Caxias city/Maranhão State, Brazil
Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia
city/Goiás State, Brazil
3
Faculty of Medicine, University of Piauí State, Teresina city, Piauí State, Brazil
Correspondence: Mariane Martins de Araújo Stefani. Address: Universidade Federal de
Goiás/ Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Rua 235 s/n Setor Universitário,
74605-050, Goiânia-Goiás/Brazil. Fax: 55 62 3209-6363 Phone: 55 62 3209-6111. Email: [email protected]; [email protected]
Running Title: HIV-1 drug resistance in Northeast Brazil
61
ABSTRACT
In the last decade significant geographic differences have been reported in the Brazilian
AIDS epidemic with reduction in incidence of AIDS cases and its related mortality in the
epicenter (southeast region) contrasting with significant rise in the northeast region,
where Maranhão State is located. In this study HIV-1 transmitted drug resistance (TDR)
and genetic diversity were investigated among 106 ARV naïve patients from Maranhão
state. HIV-1 protease (PR) and reverse transcriptase (RT) regions were sequenced
and subtypes were assigned by REGA and phylogenetic analysis. TDR was identified by
Stanford HIV-1 Drug Resistance (SDRM) database. Median age of participants was 31
years (range 18-72), 54.7% were women, 78.3% reported heterosexual
unprotected sex, 17.9% were men who have sex with men (MSM) and 1.9%
reported intravenous drug use (IDU). CD4 + T cell counts ranged from 8-1,193
cells/µl. Plasma viral loads varied from ≤10,000 copies/ml (47.2%) to >100,000
copies/ml (6.6%). SDRM-TDR rate was 3.8% (4/106; CI 95%, 1.2-8.9%). TDR was
identified in adults (29-45 years), mostly males (3/4) and two of them were MSM. Single
class mutations associated with NRTI (M184V; T215S) or with NNRTI (K103S/N) were
detected. No major PI mutation was identified; two isolates presented PI accessory
mutations (L10I; A71V). Subtype B represented 81.1% (86/106), subtype F1 1.9%
(2/106), subtype C 2.8% (3/106); 14.2% were mosaics: BPR/BF1BRT (n=6), BPR/BF1RT
(n=3), F1PR/BF1BRT (n=1), F1PR/BF1RT (n=2), F1BPR/BRT (n=1), BPR/CRT (n=1),
CPR/CBRT (n=1). Surveillance on TDR and HIV-1 genetic diversity may improve
prevention strategies to control the spread of epidemic in this region.
Keywords: HIV-1; Transmitted drug resistance; Subtypes.
62
Introduction
The AIDS epidemic in Latin America is well represented in Brazil, the largest
and most populous country with 686,478 HIV-1/AIDS cases reported from 1980 to
2013.1 Important geographic differences have been reported in the Brazilian HIV-1/AIDS
epidemic, which is strongly concentrated in the most populated and industrialized
southeast and south regions, accounting for 55.2% and 20% of cases, respectively.
Although the Brazilian HIV-1/AIDS epidemic is considered stable, regional features also
reflect differences in the dynamic of the epidemic. In the last decade, a reduction of
18.6% in the HIV-1/AIDS detection rate has taken place in the southeast, contrasting
with a significant increase of 92.7% in the north and 62.6% in the northeast regions, with
high rates of HIV-1 infected young individuals within 15-24 year age range.1 Moreover
during the same period, the 33.3% growth in AIDS related mortality reported in the
northeast region contrasts with the 14% reduction seen in Brazil.1
Since the 90’s the Brazilian public health program has provided free
antiretroviral drugs (ARV) to more than 313,000 HIV-1/AIDS patients, promoting the
decline in AIDS associated mortality.2 However, one of the drawbacks of the widespread
use of ARV is the selection of mutations associated with drug resistance, which can be
transmitted to uninfected patients. Transmitted drug resistance (TDR) represents an
important public health issue that can impact initial treatment options.3-5 Over two
hundred mutations have been associated with drug resistance to HIV-1 and complex
mutation patterns can be associated with secondary resistance to highly active
antiretroviral therapy (HAART) which include nucleoside and non nucleoside reverse
transcriptase inhibitors (NRTI/NNRTI) and protease inhibitors (PI). Genotyping tests
have been employed to orientate treatment options by identifying mutations that may
confer resistance to ARV drugs.6
TDR and HIV-1 diversity have been well described and monitored in patients
from the most densely inhabited and developed southeast and south regions in Brazil
where low to moderate levels of TDR have been reported.7-11 However, there is limited
data from other regions, especially the ones where the epidemic is growing, as the
northeast region which ranks third in the country accounting for 95,516 notified AIDS
cases.2 This growing epidemic with high mortality is taking place in geographic regions
with very scarce molecular data on HIV-1. This is true for Maranhão State, our study area
in northeast Brazil, which reported 106.2% increase in the detection rate of AIDS cases
63
and regional molecular epidemiology data on HIV-1 are lacking. In this context, this
study aimed to describe HIV-1 molecular characteristics, including TDR and HIV-1
genetic diversity among ARV naïve patients from Maranhão. Molecular data on HIV-1
can assist strategies for monitoring the HIV-1 epidemic trends in a rising incidence
region and prevention measures for the epidemic control.
Materials and Methods
Study Area and Subjects
A total of 138 consecutive cases of ARV naïve patients infected with HIV-1
were enrolled from January to June 2012 in Maranhão State. From these, 97 were
recruited at the regional referral center (Public Health Central Laboratory/LACEN)
located in the capital São Luís, for CD4+ cell counts and viral loads determinations.
Moreover, 41 patients living in Maranhão State were recruited at Hospital de Doenças
Tropicais Dr. Natan Portela, located in Teresina, Piauí State. This Hospital is the closest
referral center for many patients living close to the border within these two states.
Approximately 10% of all HIV-1/AIDS patients living in Maranhão State attend this
referral center in Teresina, Piauí.12 Age, sex distribution and time since diagnosis among
patients recruited in São Luís and Teresina were statistically similar. The 138 patients
recruited in this study represented 21.1% of the 502 HIV-1/AIDS cases reported in
Maranhão State during the study period.13
Since the beginning of HIV-1/AIDS epidemic in Brazil, Maranhão has notified
11,460 cases in a population of 6,794,301 inhabitants, (66.7% brown multiracial, 25.6%
white, 6.4% black, 0.7% asian and 0.6% amerindian individuals). The capital São Luís is
a port city and Itaqui port is responsible for exportation of iron ore, pig iron, soy,
petroleum derivatives, copper and aluminum.14 São Luís city exhibits the highest
incidence of HIV-1/AIDS among municipalities with over 50,000 inhabitants in northeast
Brazil (42.5/100,000 inhabitants). Moreover, from 2009-2012 ten referral centers for
HIV-1/AIDS care were available in Maranhão State, where most of HIV-1 infected
patients present symptomatic with AIDS-defining illness at the time of diagnosis.15
Among 138 ARV naïve patients recruited, 53 lived in São Luís while the
remaining 85 came from 44 different small interior villages scattered throughout the state
(Fig. 1). Inclusion criteria for study participants were: patients with recent or long-term
diagnosis of HIV-1 infection living in Maranhão State, never exposed to any ARV drugs,
64
from both genders and older than 18 years. Socio-behavioral data were obtained by faceto-face interviews using standardized questionnaires. Clinical and laboratory data
(plasma viral load-bDNA-Siemens Medical Solutions, Mississauga, Ontario, Canada and
CD4+ T cell counts-FACSalibur, Becton & Dickson, San Jose, CA, USA) were retrieved
in standardized questionnaires from the medical files at Hospital Presidente Vargas, São
Luís, Maranhão and at Hospital de Doenças Tropicais Dr Natan Portela, Teresina, Piauí.
This study was approved by the regional Institutional Review Boards (Comitê de
Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual do
Piauí, protocol #022/2011 and Comitê de Ética de Pesquisa do Hospital de Doenças
Tropicais Dr Natan Portela, protocol #16/2011). All participants were instructed about
the study and signed a written informed consent.
Genetic Analysis
HIV-1 RNA was extracted from plasma (QIAamp Viral RNA Mini
Kit/QIAGEN, Qiagen GmbH), reverse transcribed into complementary DNA
(cDNA) (Invitrogen, Carlsbad, CA) and used as the target for a nested
polymerase chain reaction (nested-PCR) of pol region as previously described. 16
The entire protease (PR) and approximately 750-bp of reverse transcriptase (RT)
fragment were amplified employing K1/K2 as external primers and DP10/F2 as
internal primers. 17,18 After purification of amplicons (QIAquick PCR Purification
Kit/QIAGEN, Qiagen GmbH), genomic sequencing was performed (BigDye
Terminator Cycle Sequencing, Applied Biosystems, CA, USA; ABI Prism 3130
Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Phylogenetic Analysis
The HIV-1 subtypes were identified by REGA automated genotyping
tool version 2.0 and by phylogenetic inference using reference sequences
obtained from the database of Los Alamos HIV. 19,20 Trees were generated by
Neighbor-Joining method under Kimura’s two-parameter correction model using
MEGA5 software. 21,22 Bootstrap values (1000 replicates) above 70% were
considered significant. The HIV-1 sequences with discordant subtypes in the PR
and RT fragments which are suggestive of intersubtype recombination were
analyzed by SIMPLOT 3.5.1. 23
65
The GenBank accession numbers used in the comparative phylogenetic
and SIMPLOT analyses are subtype B: U21135, FJ638434, AY173956, K03455,
EF379194, EF379210, FJ548795, FJ548804, and U63632; subtype C: AF110967,
U46016, FJ548791, FJ594149, AF286228, AF067155, and U52953; subtype F1:
DQ358801, AF077336, and AF005494 and the simian immunodeficiency virus
sequence from the chimpanzee (SIVcpz): X52154, which was used as an
outgroup.
Resistance Analysis
TDR was analyzed using the Calibrated Population Resistance-CPR tool
(Stanford Surveillance Drug Resistance Mutation-SDRM). 24 The ARV mutation
susceptibility profile was analyzed by the Stanford HIV Drug Resistance
Database. 25
Statistical Analyses
Continuous variables were described as medians with minimum and
maximum range. Categorical variables were presented as frequency and
percentage. Chi-square or Fisher´s exact test were used to analyze the differences
among categorical variables, with a significance level of 5%. All descriptive
analyses were performed using Epi Info TM version 7 (CDC, Atlanta).
Results
Among enrolled 138 ARV naïve patients infected with HIV -1, 106 had
PR and RT regions of HIV-1 amplified and sequenced (76.8%) and were
described in this study. Among 106 participants, female patients represented
54.7% and the overall median age of participants was 31 years (range: 18 -72
years). The most frequent risk factor reported was heterosexual unprotected sex
(78.3%; 83/106; male=27, female=56), 17.9% (19/106) were men who have sex
with men (MSM), two individuals (1 female, 1 male) reported intravenous drug
use (IDU); for two patients the exposure category was unknown (Table 1). The
median of CD4 + T cell counts was 402 cells/µl (range: 8-1,193 cells/µl); 25/106
(23.6%) of patients had CD4 + T cell counts below 300 cells/µl. Plasma viral
66
loads ranged widely from below 10,000 copies/ml (47.2%, 50/106) to over
100,000 copies/ml (6.6%, 7/106) (Table 1).
Within this group of ARV naïve patients living in Maranhão TDR rate was 3.8%
(4/106; CI 95%, 1.2-8.9%). TDR was identified among young adults (median age: 33
years; range: 29-45 years), mostly males (3/4; 2 were MSM and one was heterosexual)
(Table 2). Among patients with TDR, the median of CD4+ T cell counts was 218.5
cells/µl (range 51–569 cells/µl) and the median of plasma viral load was 22,169
copies/ml (1,770–139,308 copies/ml range). Patients with TDR harbored subtype B (n=3)
and one patient had a B/F1 unique recombinant form (URF).
Individual mutation profiles and the level of resistance to distinct ARV drugs of
resistant HIV-1 isolates are depicted in Table 2. Only singleton mutations associated with
NRTI (M184V and T215S) or with NNRTI (K103S and K103N) were detected. No
major mutation to PI was identified, however two out of four isolates with TDR
presented L10I and A71V PI accessory mutations.
Phylogenetic analysis showed that in the HIV-1/AIDS epidemic in Maranhão
State, northeast Brazil “pure” non-subtype B isolates in PR/RT regions were infrequent:
two subtype F1 sequences (1.9%) and three subtype C cases (2.8%). The epidemic is
highly dominated by “pure” subtype B (81.1%, 86/106) and the majority of HIV-1
PR/RT sequences (85.8%, 91/106) circulating in this geographic area clustered with a
single HIV-1 subtype (Fig. 2). However, 14.2% of the isolates were mosaic forms of
HIV-1 with discordant subtypes in PR and RT regions (Fig. 3). Several different
recombination patterns were observed with predominance of B/F1 recombinant mosaics:
BPR/BF1BRT (n=6), BPR/BF1RT (n=3), F1PR/BF1BRT (n=1), F1PR/BF1RT (n=2), F1BPR/BRT
(n=1). Moreover BPR/CRT and one CPR/CBRT recombinant were also detected.
Discussion
This is the first detailed study on the molecular pattern of HIV -1
circulating among ARV naïve patients living in Maranhão State, northeast Braz il
where significant increase in both AIDS cases and associated mortality have
been reported in the last decade. Brazilian AIDS epidemic is highly
heterogeneous within its five geographic regions reflecting socio economic
contrasts. Maranhão State, in northeast Brazil, ranks as one of the most resource limited
states presenting the second lowest human development index (HDI) in the country (HDI
67
is a statistical tool developed by the United Nations to measure and rank levels of social
and economic development based on life expectancy at birth, mean years of schooling,
expected years of schooling and gross national income per capita). One of the recent
trends of the Brazilian HIV-1/AIDS epidemic is its increasing incidence among
the poor and underprivileged. Therefore, the low access to health and education facilities
by the Maranhão State population is probably fueling the spread of the virus.
In this setting, low rate of TDR was detected (3.8%), mainly among male
patients, including MSM. Considering a small group of MSM, a high TDR rate was
observed (2/19, 10.5%). These findings may reflect low adherence to ARV treatment
among drug-exposed infected patients or greater tendency of male patients to be
diagnosed in the first stages of infection, once resistance mutations in naïve long-term
infected patients may be masked over time by the wild-type virus in the absence of ARV
pressure.6 In this regard, the low prevalence of TDR observed in this study may be
associated with late presentation for diagnosis, a characteristic previous related in HIV1/AIDS epidemic in Maranhão State.15,26 In fact, in this study group, 23.6% of patients
presented CD4+ T cell counts below 300 cells/µl, which may be associated with
late diagnosis. These data also reinforce well-known risk factors for HIV-1 acquisition
such as unprotected sex among heterosexual and homosexual partners.
As it is expected for TDR, singleton mutations to either NRTI or to
NNRTI were detected. The M184V NRTI resistance mutation was detected in a
heterosexual female harbouring the BPR/BF1BRT recombinant mosaic form. This
mutation is responsible for 3TC resistance, which also increases susceptibility to ZDV
and d4T.27,28 The revertant T215S mutation was detected in one MSM patient,
indicating that the T215Y/F mutation was previously transmitted to one ZDV
naïve patient and that the virus reverted to a phenotype closer to the wild type,
since the T215S mutation is considered a “track” in this change. 29 The presence
of T215 revertant mutations in ARV naïve HIV-1 infected individuals has been
previously described in other Brazilian studies. 16,30,31 K103N/S NNRTI
resistance mutations were also identified in this group: the K103N mutation,
detected in one hetrosexual male patient causes high -level resistance to
nevirapine (NVP) and efavirenz (EFV) which is an important component of the
HAART regimen in Brazil. The K103S mutation, detected in one MSM patient,
causes intermediate/high-level resistance to NVP and low/intermediate-level
resistance to EFV. 32
68
Interestingly, in this study 5 patients had the common polymorphic
accessory mutation E138A: 4 heterosexual female patients and one IDU female
patient. Although this mutation is not included in the CPR database, this
mutation can be weakly selected by rilpivirine (RPV), a drug not available in
Brazil, and it can decrease susceptibility to RPV by ~2 -fold.
In Maranhão State the HIV-1 epidemic is highly driven by subtype B,
similarly to what is observed in other Brazilian States. However , strains assigned
as concordant PR/RT subtype F1 was infrequent, in contrast to what is observed
in most Brazilian regions, including the northeast region, where subtype F1 in
the second most prevalent form. HIV-1 subtype C is the most prevalent form in
south Brazil, however recent studies from central west Brazil indicate its
dissemination northwards, mainly among young pregnant women. 33 The current
study shows that subtype C had been introduced in Maranhão State, but its
prevalence is still low.
Surprisingly, the low prevalence of “pure” F1 and C subtypes in this
setting contrasts with 14% prevalence of mosaic viruses, mainly BF1 and two
cases of BC recombinants. The co-circulation of different subtypes within a
geographic region is known to favor co-infection or super-infection which is
required for intersubtype recombination. 34-36 In this context, since “pure”
subtype F1 and subtype C viruses are scarce in Maranhão, mosaic BF1 and BC
viruses identified have probably been imported from southeast or other Brazilian
regions. Given the diversity of BF1 mosaic patterns detected in this study one
can also speculate that second or third generation BF1 recombinants are being
produced in this setting due to recombination of originally imported BF1 viruses
with subtype B isolates, which is highly prevalent regionally. The first BF1
recombinants were described in the 90’s in southeast Brazil. 37,38 PR and RT
fragments are considered hotspots for recombination and more recently increased
genotyping for monitoring ARV therapy has produced an increasing num ber of
sequences that have revealed multiple unrelated BF1 mosaic viruses. 39 In fact
based on data mainly from the southeast region, Brazil has been considered as a
geographic recombination hotspot. The rate of BF1 in southeast and in northeast
Brazil is around 4%. 40-42 In central west Brazil, higher rates of BF1 have been
reported. 16,30,31 This study shows that the circulation of BF1 viruses extends to
the northeast region at a much higher rate than in the southeast. The BF1 rate
69
detected in Maranhão is similar to rates observed in central west Brazil: Goiás
State (7.2%), Mato Grosso State (12%), Mato Grosso do Sul State (8.2%) and
north Brazil: Tocantins State (9.6%). 16,30,31,43 The relationship among these BF1
mosaic viruses from northeast and other BF1 circulating recombinant forms
(CRFs) already described in Brazil deserves further studies.
The HIV-1/AIDS epidemic in Brazil is fueled in the main seaports as thousands
of male sailors from around the world wait for ships to be unloaded and arriving truck
drivers are usually served by a thriving sex industry. In this context, one cannot ignore
the potential impact on the regional AIDS epidemic of one of the most important seaports
in Brazil and the country’s second largest in cargo volume, the Port of Itaqui, located in
São Luís. In southeastern Brazil, Santos, the largest port in Latin America and a major
transportation hub to all Brazilian regions and to the rest of South America presents one
of the region's highest rates of AIDS.44 Also, the subtype C epidemic in Brazil was
initially thought to have initiated in the city of Rio Grande in Southern Brazil where its
port, one of the largest seaports in the country serves as a southern transportation hub to
neighboring countries in South America and also receive ships from Africa and Asia.45
In conclusion our study showed a low level of TDR in a group with a
high frequency of late presentation for diagnosis, suggesting that among recently
infected individuals this rate may be higher. The genetic diversity obs erved
indicates a probable insertion of viruses from other regions as well as a local
dissemination. In this resource limited setting with rising HIV-1/AIDS incidence
and related mortality, HIV-1 molecular data provided in this study may
contribute for better management, prevention and control strategies.
Acknowledgments
We are thankful to the medical staff of Dr. Costa Alvarenga Public Health
Central Laboratory (LACEN) from Teresina city and Public Health Central Laboratory
(LACEN) from São Luís city for support during recruitment. This study was supported
by CAPES and PRONEX/FAPEG/CNPq-07/2012. Mariane Stefani is a recipient of a
fellowship from CNPq (grant#304869/2008-2), Maria Edileuza Moura was supported by
a fellowship from CAPES and FAPEMA (grant#APP-UNIVERSAL-00222/12), Mônica
Reis by FAPEG (grant# 201210267000386), Yanna Lima by CAPES (grant#52001016)
and Ludimila Cardoso by CAPES (grant#02479/09-5).
70
Sequence Data
The GenBank accession numbers of sequences analyzed in this study are
KF782680-KF782785.
Author Disclosure Statement
No competing financial interests exist.
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76
Figure 1. Localization of HIV-1 resistant isolates obtained from ARV naïve patients
recruited in Maranhão State, located in Northeast Brazil. Municipalities are classified by
population density: dark marks represent cities densely populated (31,000 – 1,015,000
inhabitants), light marks represent less populated cities (4,000 – 10,500 inhabitants). The
capital, São Luís city is marked with a red star. Only one patient was recruited from each
city where TDR cases were identified.
77
78
Figure 2. Phylogenetic classification of HIV-1 isolates from naïve patients with
concordant PR and RT regions from Maranhão State, northeast Brazil. The GenBank
accession numbers used in the comparative phylogenetic analyses are subtype B:
FJ548804, EF379210, K03455, U63632, AY173956, U21135, FJ548795 and EF379194;
subtype C: AF110967, U46016, AF067155, FJ594149, FJ548791, U52953 and
AF286228; subtype F1: AF077336, DQ358801 and AF005494 and the simian
immunodeficiency virus sequence from the chimpanzee (SIVcpz): X52154, which was
used as the outgroup. The isolates characterized in this study are marked with a closed
lozenge ().
79
Figure 3. Bootscanning analysis of HIV-1 PR and RT regions of 15 recombinant isolates
from Maranhão State, northeast Brazil. The GenBank accession numbers used in the
SIMPLOT analyses are subtype B: K03455, U63632 and FJ548804; subtype C: U52953,
FJ594149 and FJ548791; subtype F1: DQ358801 and AF005494.
80
Table 1. Baseline characteristics of the subjects from Maranhão/State, northeast
Brazil.
ARV naïve patients
Gender (male/female)
Median of age in years (range)
Route of infection [n (%)]
Heterosexual
Female
Male
MSM
IDU
Unknown
Median of CD4 counts
(cells/µl, range)
HIV-1 RNA (copies/ml) [n (%)]
<10,000
10,000 - 100,000
>100,000
PR/RT HIV-1 subtype [n (%)]
B
F1
C
BF1
BC
48/58
31 (18-72)
83 (78.3%)
56 (52.8%)
27 (25.5%)
19 (17.9%)
2 (1.9%)
2 (1.9%)
402
(8-1,193)
50 (47.2%)
49 (46.2%)
7 (6.6%)
86 (81.1%)
2 (1.9%)
3 (2.8%)
13 (12.3%)
2 (1.9%)
ARV: antiretroviral; MSM: men who have sex with men; PR: protease; RT: reverse
transcriptase.
81
Table 2. Amino acid substitutions in protease and reverse transcriptase resistance-related codons of patients from Maranhão
State, northeast Brazil.
GenBank
accession
number
KF782694
KF782711
KF782723
KF782732
Route of
Infection/
HIV-1 PR/RT
Subtype
MSM
B
MSM
B
Hetero
B
Hetero
B/BF1B
Sex/Age
(years)
PI Minor
M/29
-
M/35
Mutations
NRTI
NNRTI
Low
Resistance profile
Intermediate
-
K103S
-
EFV
NVP
A71V
T215S
-
AZT, d4T
-
-
M/45
L10I
-
K103N
-
-
EFV, NVP
F/31
-
M184V
-
ABC
-
FTC, 3TC
High
PR: protease region; RT: reverse transcriptase region. MSM: men who have sex with men; Hetero: heterosexual. M: Male; F:
Female. PI: protease inhibitor; NRTI: nucleoside reverse transcriptase inhibitors; NNRTI: non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitors. ABC: abacavir; AZT: zidovudine; d4T: stavudine; EFV: efavirenz; FTC: emtricitabine; NVP:
nevirapine; 3TC: lamivudine. The resistance mutations are given in bold.
82
6 DISCUSSÃO
Os primeiros casos de aids notificados no estado do Maranhão datam de 1985 (5
casos). Desta data até 30 de junho de 2013 foram notificados 11460 casos de aids no
estado. Os municípios do Maranhão que apresentaram maior número de casos de aids
acumulados até junho de 2010 foram: São Luís (3.652), Imperatriz (939), Caxias (324),
Timon (258) e São José de Ribamar (190). Dentre esses municípios, a maior incidência
em 2009 foi observada em São Luís (40,1/100.000 habitantes) (Brasil 2011).
O primeiro caso de aids notificado no Piauí ocorreu em 1986 (1 caso). Desde
então, segundo dados da Coordenação de DST/Aids do Estado do Piauí até 30 de junho
de 2013 foram notificados 4570 casos de aids no estado. Os cinco municípios do Piauí
que apresentaram o maior número de casos de aids acumulados até 30 de junho de 2010
foram: Teresina (2614), Parnaíba (152), Oeiras (52), Campo Maior (52) e Floriano (50).
Dentre esses municípios, a maior incidência, em 2009, foi observada em Teresina (44,1
por 100 mil habitantes) (Brasil 2011).
Este foi o primeiro estudo detalhado sobre o padrão molecular do HIV-1 que
circula entre os pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí, nordeste do Brasil, onde o
crescimento significativo em casos de aids e mortalidade associada têm sido relatadas na
última década (Brasil 2013). Entre as cinco regiões geográficas brasileiras a epidemia de
aids é altamente heterogênea refletindo as diferenças socioeconômicas e contrastes
existentes no país. Entre os 27 estados brasileiros o Maranhão e o Piauí estão
classificados como estados pobres apresentando o segundo e o quarto índice de
desenvolvimento humano mais baixo do país, respectivamente (IDH é uma ferramenta
estatística desenvolvida pela Organização das Nações Unidas para medir e níveis
hierárquicos de desenvolvimento social e econômico baseado na expectativa de vida ao
nascer, anos médios de escolaridade, anos esperados de escolaridade e renda nacional
bruta per capita). Neste cenário brasileiro de recursos limitados, o baixo acesso aos
serviços de saúde e educação, provavelmente, está alimentando a propagação do HIV-1.
No estado do Maranhão foi detectada uma baixa taxa de TDR (1,2% -8,9%) com
base em IAS/USA. A maioria dos indivíduos com TDR era mulheres, indicando que seus
83
parceiros sexuais infectados pelo HIV-1, em tratamento ARV não estão adotando
medidas de sexo seguro. Também entre dois UDI recrutados, um foi caso de TDR. Estes
dados reforçam fatores conhecidos de risco para aquisição do HIV-1 e, portanto, também
para TDR como relações sexuais desprotegidas entre parceiros heterossexuais e
homossexuais e também UDI. É importante ressaltar que no estado do Maranhão, o
diagnóstico da infecção pelo HIV- 1 é considerado tardio, pois os casos recentemente
diagnosticados têm infecção oportunista (Alves et al. 2003, Clipping SVS 2012). Na
verdade, neste grupo de estudo, com base na contagem de células T CD4+,
aproximadamente um quarto dos pacientes (23,6%) apresentaram valores inferiores a 300
células/ml, e podem ser considerados casos de diagnóstico tardio. Neste sentido, para
estes indivíduos cronicamente infectados, na ausência de pressão ARV, as mutações de
resistência aos medicamentos tendem a diminuir (Shafer 2002). Portanto, no estado do
Maranhão, a taxa real de TDR pode ser maior em casos de infecção recente, em oposição
a estes casos de infecção crônica do HIV-1.
Como esperado para TDR, mutações únicas para ambos os ITRN ou a ITRNN
foram prevalentes. A mutação principal de resistência aos ITRN foi M184V, detectado
em uma mulher heterossexual abrigando um mosaico recombinante B/BF1B. Esta
mutação é responsável pela resistência a 3TC, o que também aumenta a susceptibilidade
a AZT e d4T (Clarke et al. 1999, Mandelbrot et al. 2001). A mutação de reversão T215S
foi detectada em um paciente HSH e um homem heterossexual, indicando que a mutação
T215Y/F foi previamente transmitida para um paciente naïve e que o vírus reverteu para
um fenótipo mais próximo do tipo selvagem. A presença de mutações de reversão T215
em indivíduos HIV-1 infectados virgens de tratamento ARV foi descrito anteriormente
em outros estudos brasileiros (Cardoso et al. 2009, Ferreira et al. 2011, Silveira et al.
2012). Foram identificadas mutações de resistência aos NNRTIs: K103N/S. A mutação
K103N, detectada em um paciente do sexo masculino heterossexual provoca alto nível de
resistência à nevirapina (NVP) e efavirenz (EFV), que é um componente importante do
regime HAART no Brasil. A mutação K103S, detectada em um paciente HSH, provoca
resistência de nível intermediário para EFV e alto nível de resistência para NVP (Bennett
et al. 2009). Nenhum dos isolados com TDR do estado do Maranhão apresentou qualquer
mutação principal de resistência a drogas IPs, mas foram detectadas mutações acessórias.
No estado do Maranhão a epidemia de HIV-1 mostrou-se altamente assinalada
pelo subtipo B de forma semelhante ao observado em outros estados brasileiros. No
entanto, diferentemente de Pernambuco, também no nordeste, o subtipo F1 foi um
84
subtipo raro. O subtipo C foi introduzido no Maranhão, mas sua prevalência ainda é
baixa. O subtipo C do HIV-1 é originário do sul do Brasil, onde é prevalente, no entanto,
estudos recentes do centro oeste do Brasil indicam a sua disseminação para o norte,
principalmente entre as
mulheres
jovens
grávidas (Alcântara et
al.
2012).
Surpreendentemente neste cenário, a baixa prevalência de subtipos F1 e C contrasta com
a prevalência de 14% de vírus mosaico principalmente BF1 e dois casos de
recombinantes BC.
A co-circulação de diferentes subtipos dentro de uma região geográfica é
conhecida por favorecer a coinfecção ou superinfecção que são necessários para
recombinação intersubtipo (Thomson et al. 2004). Neste contexto, os vírus mosaico
identificados no estado do Maranhão, provavelmente, foram importados da região
sudeste brasileira ou outras. Dada a diversidade de padrões de mosaico BF1 detectados
neste estudo pode-se também especular que recombinantes BF1 de segunda ou terceira
geração estão sendo produzidos neste ambiente devido à recombinação de vírus
"importados originalmente BF1" com isolados do subtipo B o que o tornaria prevalente
regionalmente.
Os primeiros recombinantes BF1 foram descritos na década de 90 no sudeste do
Brasil (Sabino et al. 1994, Morgado et al. 1994). Na verdade, com base em dados,
principalmente, da região sudeste, o Brasil tem sido considerado como "hotspot de
recombinação geográfica". A taxa de BF1 no sudeste e no nordeste do Brasil é de cerca
de 4% (Sá-Ferreira et al. 2007, Gonsalez et al. 2007, Cavalcanti et al 2007). No centro
oeste do Brasil, taxas mais elevadas de BF1 foram relatadas (Cardoso et al. 2009, Ferreira
et al. 2011, Silveira et al. 2012). Este estudo mostrou que a circulação do vírus BF1 se
estende para a região nordeste a uma velocidade muito maior do que no sudeste. A taxa
de BF1 detectada no Maranhão (12,3%) é semelhante às observadas em Goiás (7,2%),
Mato Grosso (12%) e Mato Grosso do Sul (8,2%), centro oeste do Brasil, Tocantins
(9,6%), norte do Brasil (Cardoso et al. 2009, Ferreira et al. 2011, Silveira et al. 2012,
Carvalho et al. 2011). A relação entre estes vírus mosaico BF1 e outras CRFs BF1 já
descritas no país merece mais estudos.
No estado do Piauí, este estudo com pacientes virgens de tratamento ARV
mostrou uma alta taxa de TDR entre HSH contrastando com níveis moderados detectados
em homens heterossexuais e pacientes do sexo feminino. Estes resultados indicam que,
neste cenário, HSH parecem desempenhar papel fundamental na disseminação do HIV-1
com resistência a medicamentos com taxas variando em torno de 27,3% de acordo com
85
critérios SDRM, enquanto as taxas de resistência transmitida a ARV entre homens
heterossexuais foi de 10% e entre as mulheres 9,1%. Apesar da alta taxa de TDR
identificada entre os HSH, a análise filogenética não mostrou qualquer agrupamento de
isolados de HIV-1 com mutações de resistência aos antirretrovirais.
Desde o início da epidemia de HIV/aids, há 30 anos, o contato sexual homem homem tem sido reconhecido como uma importante via de infecção e, mais
recentemente, tem sido crescente a preocupação com a incidência do HIV-1 entre os
HSH em um nível mundial (Baral et al. 2007, van Griensven et al. 2009). Nesta amostra,
metade dos pacientes com TDR eram do grupo HSH que por definição inclui gays,
bissexuais, transgêneros e heterossexuais auto-identificados que praticam sexo com
outros homens.
De acordo com o método de pesquisa da OMS para avaliar a resistência
transmitida do HIV em populações virgens de ARV em uma área geográfica específica, o
seguinte sistema de pontuação deverá ser aplicada: baixo (<5%), moderada (5% - 15%)
ou alta (> 15 %) (Bennet et al. 2009, Karlsson et al. 2012). Dois estudos multicêntricos
recentes no Brasil têm mostrado níveis moderados de TDR (Inocêncio et al. 2009, Sprinz
et al. 2009). Taxas semelhantes de TDR têm sido relatadas em diferentes regiões
geográficas do Brasil: 11,5% no Estado do Tocantins, região norte; 10% no Estado de
Goiás, região centro-oeste; 14,2% no Estado de São Paulo, região sudeste e 11% no
estado de Santa Catarina, região sul (Ferreira et al. 2013, Cardoso et al. 2009, Carvalho et
al. 2011, Gräf et al. 2011). A taxa global avaliada como moderada da TDR identificada
no presente estudo (13,5%) está de acordo com outros relatos do Brasil e da região
nordeste (Cavalcanti et al. 2012, Arruda et al. 2011). Assim, estes dados podem
contribuir para definir melhores estratégias de gestão, prevenção e controle da epidemia
regional e nacional.
86
7 CONCLUSÕES
Neste estudo, identificou-se níveis moderados de TDR no Maranhão, uma região
onde o diagnóstico da infecção pelo HIV-1, é considerado tardio, sugerindo que entre
indivíduos recentemente infectados, essa taxa pode ser maior. A epidemia de aids no
Maranhão é fortemente dominada pelo subtipo B com circulação limitada de subtipos F1
e C. No entanto, uma proporção significativa dos vírus mosaico, principalmente BF1
indicam que recombinantes foram provavelmente gerados no sudeste e importados para a
região nordeste, onde uma segunda ou terceira geração de recombinantes são propensos
de serem produzidos principalmente devido à recombinação com subtipos B locais. Neste
cenário de recursos limitados, com aumento da incidência e da mortalidade relacionada,
os dados moleculares do HIV-1 fornecidas neste estudo podem contribuir para definir
melhores estratégias de gestão, prevenção e controle da epidemia.
No estado do Piauí a alta prevalência do subtipo B e circulação limitada de vírus
do subtipo não B, contrastam com vários padrões de B/F1 e recombinantes B/C,
sugerindo a transmissão local e disseminação de formas recombinantes no interior do
nordeste do Brasil. Além disso, a alta taxa de TDR foi observada entre os HSH enquanto
que entre os participantes heterossexuais a taxa de TDR foi moderada. Estes resultados
ressaltam a necessidade de estudos de vigilância contínuos entre HSH neste cenário para
avaliar a incidência de HIV-1 e os níveis de TDR que é considerado a pedra angular das
diretrizes recomendadas para genotipagem antes do início de ARV. Assim, o
monitoramento de TDR, especialmente entre HSH, na região nordeste pode ser
resomendado.
Estes resultados também indicam que o HIV-1 do subtipo C está se espalhando
para o nordeste do Brasil, principalmente como vírus recombinantes B/C, em vez do
vírus do subtipo C "puro". As características de vírus recombinantes B/F e B/C e seu
impacto sobre a epidemia no nordeste do Brasil pode ser melhor elucidado por estudos de
genoma completo que mostrarão se os recombinantes identificados representam uma das
CRFs já descritas ou se representam novas CRFs ainda não identificadas.
87
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103
ANEXOS
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética
104
ANEXO B – Comprovantes de submissão dos artigos/ aceite para publicação para
artigos ainda não publicados/ doi dos artigos publicados
Dear Ms. Cardoso,
Manuscript ID JMV-14-4164 entitled "HIV-1 transmitted drug resistance and
genetic diversity among patients from Piauí State, Northeast Brazil" which
you submitted to Journal of Medical Virology, has been reviewed. The
comments of the referee(s) are included at the bottom of this letter.
The referee(s) have recommended publication, but also suggest some minor
revisions to your manuscript. Therefore, I invite you to respond to the
referee(s)' comments and revise your manuscript.
You can upload your revised manuscript and submit it through your Author
Center. Log into http://mc.manuscriptcentral.com/jmv and enter your Author
Center, where you will find your manuscript title listed under "Manuscripts
with Decisions".
When submitting your revised manuscript, you will be able to respond to the
comments made by the referee(s) in the space provided. You can use this
space to document any changes you make to the original manuscript.
IMPORTANT: We have your original files. When submitting (uploading) your
revised manuscript, please delete the file(s) that you wish to replace and
then upload the revised file(s).
Once again, thank you for submitting your manuscript to Journal of Medical
Virology. I look forward to receiving your revision.
Kind regards,
Prof. Arie Zuckerman
Editor-in-Chief, Journal of Medical Virology
[email protected]
105
Dear Dr. Stefani:
It is a pleasure to accept your manuscript entitled "LOW RATE OF
TRANSMITTED DRUG RESISTANCE MAY INDICATE LOW ACCESS TO
ANTIRRETROVIRAL TREATMENT IN MARANHÃO STATE, NORTHEAST
BRAZIL" in its current form for publication in AIDS Research and Human Retroviruses.
Please be sure to cite this article to ensure maximum exposure of your work.
All authors will get a follow-up email with instructions on how to complete our online
Copyright Agreement form.
FAILURE BY ALL AUTHORS TO SUBMIT THIS FORM MAY RESULT IN A
DELAY OF PUBLICATION.
The corresponding author is responsible for communicating with coauthors to make sure
they have completed the online copyright form. Authors not permitted to release
copyright must still return the form acknowledging the statement of the reason for not
releasing the copyright. The corresponding author will receive notification when all
copyright forms have been submitted.
Consider Liebert Open Option to have your paper made free online immediately upon
publication for a one-time fee. Benefits of Liebert Open Option include: accelerated epub ahead of print publication; email message highlighting the article; increased readers,
citations and downloads; an identifying icon in the table of contents showing that the
paper is permanently available for free to all readers; and immediate deposition into
PubMed Central®. Subsequent accepted papers are eligible for a reduced fee for Open
Option. Please contact Karen Ballen [email protected] or at (914) 740-2194 for
more information.
Thank you for your fine contribution. On behalf of the Editors of AIDS Research and
Human Retroviruses, we look forward to your continued contributions to the Journal.
Sincerely,
Dr. Brian Foley
Editor, AIDS Research and Human Retroviruses
[email protected]
106
ANEXO C – TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário(a), em uma
pesquisa. Você precisa decidir se quer participar ou não. Por favor, não se apresse em
tomar a decisão. Leia cuidadosamente o que se segue e me pergunte qualquer dúvida que
você tiver. Este estudo está sendo conduzido por a Profª Drª Mariane Martins de
Araújo Stefani. Após ser esclarecido(a) sobre as informações a seguir, no caso de
aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias.
Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de não aceitar você não
sofrerá nenhum tipo de penalidade. Em caso de outras dúvidas você pode procurar o
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual do Piauí.
ESCLARECIMENTOS SOBRE A PESQUISA:
TÍTULO DO ESTUDO: Mutações associadas à resistência primária a antirretrovirais e
diversidade genética do HIV-1 em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí.
PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Mariane Martins de Araújo Stefani.
INSTITUIÇÃO/DEPARTAMENTO: Universidade Federal de Goiás (UFG) –
Laboratório de Imunologia da AIDS e da Hanseníase do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP) / UFG.
PESQUISADOR PARTICIPANTE: Maria Edileuza Soares Moura.
Telefones para contato (inclusive a cobrar): 86 – 99726308 ou 32357898
Local de Coleta de Dados:
Este estudo objetiva avaliar se o subtipo de HIV que você é portador tem algum
tipo de resistência aos medicamentos usados no tratamento da AIDS. Você está sendo
convidado(a) por ser portador(a) do HIV e ainda não ter feito uso de medicação contra a
AIDS.
Ao aceitar participar do estudo você irá responder algumas perguntas sobre sua
doença e também sobre sua vida pessoal. Depois, você será encaminhado ao ( ) LACEN
– Piauí ou ( ) LACEN - Maranhão, onde será coletado 5 mililitros de sangue de uma
veia para realização de um exame, chamado genotipagem do HIV-1, que será realizado
na Universidade Federal de Goiás e através deste exame se diagnosticará o subtipo de
HIV-1 que você é portador e se este subtipo tem algum tipo de resistência aos
medicamentos contra a AIDS.
Este convite está sendo feito no Serviço de Atendimento Especializado (SAE) que
faz seu acompanhamento, no horário em que o mesmo funciona e os exames serão
coletados no LACEN de seu Estado no horário em que este serviço funciona.
Não há benefício imediato para você, participante, mas este estudo levantará
informações quanto ao subtipo de HIV-1 que você possui e esclarecerá se este tem
alguma resistência aos medicamentos prescritos no tratamento da AIDS. Nossa
pretensão é contribuir para complementar e melhorar a assistência prestada a você,
107
colocando a sua disposição os laudos dos exames de genotipagem para que o médico que
lhe acompanha use esse laudo como ferramenta para vigilância e monitoramento da
resistência primária (nas pessoas que nunca usaram medicação contra a AIDS) nos
estados do Piauí e Maranhão; sendo dessa forma, um assunto importante social e
profissionalmente.
Sua participação não trás nenhum risco para você.
Você não receberá nenhum auxílio financeiro.
Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela
pesquisa para esclarecimentos de eventuais dúvidas. O responsável local pelo estudo é a
Profª. Me. Maria Edileuza Soares Moura que pode ser encontrada no Departamento de
Enfermagem da Universidade Estadual do Maranhão - UEMA, nos telefones 99
35213938 ou 86 99726308. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da
pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade
Estadual do Piauí [Faculdade de Ciências Médicas – Rua Olavo Bilac, 2335, Bairro
Centro/Sul – Teresina – Piauí] e ou por o telefone 86 32216658.
Se você concordar em participar do estudo, seu nome e identidade serão mantidos
em sigilo, só sendo necessário utilizá-los para a liberação dos laudos de genotipagem. A
menos que, requerido por lei ou por sua solicitação, somente o pesquisador, a equipe do
estudo, Comitê de Ética independente e inspetores de agências regulamentadoras do
governo, (quando necessário) terão acesso a seus dados para verificar as informações do
estudo.
Esta pesquisa já foi liberada pelas Comissões de Ética em Pesquisa das
instituições envolvidas e Comitê de Ética em Pesquisa da UESPI e você poderá retirar
seu consentimento a qualquer tempo, sem qualquer prejuízo.
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu,_______________________________________________________,
RG__________________, CPF__________________, abaixo assinado, concordo em
participar deste estudo como sujeito. Afirmo que fui suficientemente esclarecido a
respeito das informações que li, descrevendo o estudo que tem por título “Mutações
associadas à resistência primária a antirretrovirais e diversidade genética do HIV-1
em pacientes dos estados do Maranhão e do Piauí”.
Eu discuti com Maria Edileuza Soares Moura sobre a minha decisão em
participar desse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha
participação é isenta de despesas. Concordo, voluntariamente, em participar deste estudo
e sei que poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o
mesmo, sem penalidades ou prejuízo neste serviço.
Local e data_________________________________________________
Assinatura do sujeito: _________________________________________
Declaração da testemunha
Eu,
_____________________________________________________,
RG_______________, CPF____________________, declaro que presenciei a explicação
acima descrita e posso afirmar que foi deixado a cargo do sujeito a decisão de participar
108
ou não do estudo, assim como,confirmo que foi dado a oportunidade ao sujeito de fazer
perguntas e que neste momento ele assinou este termo de espontânea vontade.
Local e data ____________________________________________________
Assinatura da testemunha__________________________________________
Declaração do Investigador:
Declaro que expliquei o objetivo deste estudo ao sujeito. Declaro também que diante de
uma linguagem simples eu expliquei até que o mesmo entendesse o objetivo, os
procedimentos, os riscos e os benefícios deste estudo. Declaro também que entreguei
uma cópia assinada deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ao sujeito do
estudo.
Local e data ____________________________________________________
Nome do investigador _____________________________________________
Assinatura do investigador _________________________________________
SE VOCÊ NÃO ENTENDEU ALGUMA PARTE DESTE DOCUMENTO, PERGUNTE
AO INVESTIGADOR ANTES DE ASSINÁ-LO. UMA CÓPIA DESTE TERMO SERÁ
ENTREGUE A VOCÊ LOGO APÓS AS ASSINATURAS.
109
APÊNDICE A - Questionário sobre a infecção pelo HIV
I. N° do registro do paciente no estudo:
II. Data:
/
/
.
III. Número do registro no SAE:
IV. Endereço:
V. Bairro:
VI. Município:
VII. Estado:
VIII. Telefone:
IX. Outro contato:
X. Data de nascimento:
XI. Idade:
XII. Sexo: 1- Masculino
2 - Feminino
XII.a. Se feminino, gestante? 1 – Sim
2 – Não
XII.b.Tem filhos? 1 - Sim 2-Não
XII.c Quantos? ______
XII.d Qual tipo de parto?
XII.e. Teve aborto? 1 - Sim
2 - Não
XII.f Se sim, Quantos? ______
XII.g Se aborto, em que período 1 – Antes de 3 meses de gravidez
2 – Após 3 meses de gravidez
XII. h. Usou TARV na gravidez? 1 - Sim
2 - Não
XII.i Se sim, Quais medicamentos?
XII.j. Tem algum filho com HIV/AIDS? 1 – Sim
2 - Não
XII.k. Se sim, Quantos?_____
XII.l Idade?________
XIII. Profissão: _________
XIV. Renda familiar: 1 – Até um SM
2 – Um a cinco SM
3 – Mais de cinco SM
110
XV. Escolaridade (anos de estudo):
1 – Nenhuma
2 – De um a três
3 – De quatro a sete
4 – De oito a onze
5 – De doze e mais
6 – Não informado
9 - Ignorado
XVI. Ano de diagnóstico da infecção pelo HIV:
XVII. Local do diagnóstico da infecção pelo HIV:
XVIII. Utilizou algum esquema terapêutico anteriormente? 1 – Sim
2 - Não
XIX. Local de residência nos últimos 10 anos:
XX. Tipo de exposição: 1 - Parceiro sexual infectado HIV/AIDS
2 - Usuário de drogas injetáveis
3 - Homossexual
4 - Bissexual
5 - Outro
XXI. FAZ TRATAMENTO PARA AIDS? 1 – Sim
2 – Não
XXII. Se sim, Qual?
XXIII. Último resultado da carga viral:
XXIV. Data:
XXV. Último resultado da contagem CD4/CD8:
XXVI. Data:
XXVII. Alguma doença definidora de AIDS? 1 – Sim
2 – Não
XXVIII. Se sim, qual?
XXIX. Estado clínico atual: 1 – Assintomático
2 - Sintomático
111
112