Clinical Case Study Estudo do Caso
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Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico A Febrile Blood Donor Julian W. Tang1,a, Yvonne Ng2, Evelyn S. C. Koay1, Gek Har Leow1, Eng Soo Yap3, Douglas Chan1, Lip Kun Tan3 and Paul A. Tambyah4 Uma Doadora de Sangue Febril Julian W. Tang1,a, Yvonne Ng2, Evelyn S. C. Koay1, Gek Har Leow1, Eng Soo Yap3, Douglas Chan1, Lip Kun Tan3 and Paul A. Tambyah4 1 Departments of Laboratory Medicine, 2 Neonatology, 3 Haematology and 4 Medicine, National University Hospital, Singapore. a Envie correspondência para esse autor para: Department of Laboratory Medicine, National University Hospital, 5 Lower Kent Ridge Road, Singapore 119074, Singapore. Fax +65-67771613; e-mail [email protected] CASO Um neonato de 4 dias nascido prematuramente com 29 semanas de gestação desenvolveu trombocitopenia (contagem de plaquetas 43 x 109/L) com grave hemorragia intracraniana e pulmonar associada. Transfusões urgentes com 10 mL/kg de eritrócitos e 10 mL/kg de concentrado de plaqueta foram administrados, obtidos de sangue doado 2 dias antes em Cingapura por uma universitária de 21 anos de idade que estava clinicamente bem na época. No dia seguinte após administração ao neonato, a doadora de sangue contactou o serviço de transfusão de sangue para informá-los de que ela estava agora enferma com uma doença febril parecida com a gripe. Sua amostra do plasma do teste da doação de sangue foi recuperada e analisada por PCR para vários vírus, incluindo dengue, chikungunya, enterovírus, e vírus Epstein-Barr. RNA da dengue (sorotipo 2) foi constatado estar presente em uma quantidade muito baixa (isto é, em um ciclo PCR de tempo real de número Ct de 39–40) (Fig. 1A) a partir do extrato inicial do RNA (extrato A). Para confirmar a presença dessa baixa quantidade de RNA da dengue 2, o mesmo extrato (extrato A, que tinha sido armazenado à –20 °C) foi reanalisado (Fig. 1B), e novamente descobriu-se dar um resultado positivo baixo. Figura 1. Resultados de RNA PCR para dengue em tempo real da amostra de plasma da doadora. (A), Resultados de PCR em tempo real no extrato do RNA (extrato A, primeiro teste ) obtidas da primeira amostra da doadora mostrando um Ct de 39.6, um sinal positivo de baixo nível para RNA de sorotipo 2 da dengue. (B), Teste de repetição no extrato A após 1 ciclo de congelamento-descongelamento (de –20 °C), mostrando um Ct mais alto de 40.8, indicando uma quantidade até mesmo mais baixa de RNA presente. O resultado da PCR em tempo real vista num plano sigmóide. O valor Ct é onde o sinal sigmóide da curva (indicando acúmulo da produção específica do PCR da dengue ) cruza o limite (linha verde horizontal ) indicando um resultado positivo. O limite para curvas individuais pode ser diferente e pode ser automaticamente estabelecido pelo software do teste, mas também pode ser ajustado de acordo com epidemiologia local Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico do vírus da dengue e os valores esperados do Ct para resultados positivos nessa específica população de pacientes. NTC, controle sem padrão. Dengue seropype 2 positive control – controle positivo do sorotipo da dengue 2 Negative control baseline – linha de base do controle negativo Donor sample – amostra da doadora Delta Rn vs Cycle – Delta Rn vs Ciclo Cycle Number – Número do Ciclo Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico QUESTÕES PARA SEREM CONSIDERADAS Que passos devem ser tomados depois? O que pode causar resultados de PCR falsos negativos e falsos positivos? Como devem resultados de PCR baixos positivos afetar o tratamento do paciente? DISCUSSÃO Recentemente, Wilder-Smith e colegas salientaram a importante questão da segurança da transfusão de sangue com relação à infecção da dengue em um país com epidemia de dengue, tal como Cingapura (1). Embora na época da submissão do seu relatório Wilder-Smith et al. não puderam identificar quaisquer eventos de transmissão de dengue associados com transfusão de sangue, houve um relatório apresentando evidência convincente para vários eventos de transmissão (2). Além disso, houve pelo menos 1 caso anterior de transmissão de dengue em Cingapura, via transplante de órgãos (3). Foi importante verificar o status dessa doação de sangue tão precisamente quanto possível, porque esse evento teve implicações adicionais para o serviço de transfusão de sangue. Três abordagens foram feitas: reanálise da amostra original, análise do neonato, e análise adicional da doadora. Reanálise da amostra original foi feita voltando para a amostra original do teste do sangue (armazenada à 4 °C) e reextraindo o RNA (extrato B). Todo RNA foi extraído usando-se o sistema Qiagen Biorobot EZ1 (Qiagen). Além disso, outro extrato de RNA (extrato C) que tinha sido obtido mais cedo, na mesma época que o extrato A, foi recuperado do armazenamento à –20 °C para teste adicional. Extratos A, B, e C foram analisados como réplicas de 5 (isto é, 3 x 5 = 15 testes) no mesmo teste RNA PCR da dengue. Surpreendentemente, todos esses testes foram negativos — até mesmo o extrato A, que tinha dado baixo positivo duas vezes anteriormente. Teste de antígeno adicional e retrospectivo do NS1 da dengue na primeira amostra sérica (isto é, a amostra sérica original da qual os extratos A e B foram obtidos ) também foi negativo. O neonato foi então urgentemente analisado para RNA da dengue por PCR nos dias 2, 5, e 8 após transfusão e, felizmente, todos os resultados dos testes de RNA da dengue foram negativos. Resultados dos testes do antígeno do NS1 da dengue também foram negativos. Na época, o status negativo do neonato se pensava ser devido ao baixo volume dos produtos sanguíneos transfundidos (volume combinado de 16 mL), que reduziu o potencial para transmissão do vírus da dengue. Nesse caso, felizmente a doadora concordou em retornar para teste de anticorpo convalescente para determinar se a dengue ou alguma outra infecção viral era responsável pela sua febre e doença parecida com a gripe. Ela foi sorologicamente analisada 15 dias após seu relatado começo da doença para dengue e vírus Epstein-Barr IgM e IgG, assim como para gripe A e B, parainfluenza tipos 1–3, adenovírus, e vírus sincicial respiratório. Todos os resultados dos testes de sorologia foram negativos. Ao examinar produtos sanguíneos, é importante que os clínicos sejam capazes de distinguir uma possível carga viral de baixo nível em um produto sanguíneo transfundido de um evento de contaminação cruzada de baixo nível de um laboratório. O caso que nós relatamos inicialmente sugeriu a presença de RNA de baixo nível da dengue em um produto sanguíneo, que foi trazido para nossa atenção apenas quando a doadora procu- Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico rou o hospital 2 dias após a doação de sangue para relatar uma doença febril. sido congelado e descongelado uma vez (de –80 °C). Existem várias possíveis razões para resultados discrepantes de PCR. A possibilidade mais óbvia é que deve ter havido 2 ocorrências de contaminação de baixo nível do RNA da dengue dos testes do PCR quando o extrato A foi testado as 2 primeiras vezes. Tal contaminação é sempre possível em um laboratório molecular e pode ser difícil de excluir. Dois diferentes operadores realizaram esses 2 primeiros testes do RNA PCR da dengue para o extrato A. Todos os resultados dos testes da sorologia convalescente para vários vírus provaram ser negativos na doadora. É possível que seus sintomas relatados fossem devidos aos mais comuns rinovírus ou coronavírus, para os quais teste de PCR não foi realizado durante o estágio da doença aguda e para os quais teste sorológico não estava disponível para determinar infecção passada recente com estes patógenos. Devido aos resultados negativos desse teste convalescente na doadora, é portanto provável que os resultados duas vezes positivos do RNA PCR da dengue (mostrados na Fig. 1 ) fossem provavelmente devidos a um evento de contaminação cruzada em vez de uma baixa quantidade de RNA da dengue nessa amostra. Evidência adicional para a falta da transmissão da dengue para o neonato foi fornecida por resultados negativos do IgM e IgG da dengue em soro convalescente tirado do neonato 4 semanas após o evento da transmissão. Uma explicação alternativa é o baixo número de cópias do RNA da dengue sugerido pelo sinal do PCR [número limite do ciclo (Ct) de 39–40], um número de cópias que está virtualmente em nosso limite definido de sensibilidade clínica para esse teste interno. Com tal baixo número de cópias do RNA na amostra original, efeitos estocásticos se tornam importantes, e é possível se perder ao apanhar com a pipeta o RNA alvo a ser ampliado. De uma amostra de plasma de 500–1000 µL, apenas 200 µL é usado no processo de extração do RNA. Desse volume da amostra é obtido 50 µL contendo RNA, e disso apenas 1 µL é usado na reação do PCR. É possível que quando existirem números de cópias muito baixos do RNA na amostra original, até mesmo após se concentrar o RNA no volume de eluição de 50-µL, ao se inserir a pipeta nesse volume para remover apenas 1 µL é possível não se pegar qualquer RNA na ponta da pipeta. Esse tipo de "perda" potencial é um fenômeno estocástico que foi bem descrito anteriormente (4). O processo de congelar e descongelar também é conhecido por diminuir as quantidades de RNA intactas nas amostras (5). Extrato A foi congelado e descongelado duas vezes (de –20 °C), extrato B foi congelado e descongelado uma vez (de –20 °C), e extrato C foi obtido do plasma original que tinha Nós suspeitamos que a fonte da contaminação cruzada pôde ter vindo do controle positivo da dengue 2, porque muitas poucas outras amostras foram positivas (houve 1 de cada da dengue 1, 2, e 3) durante essa semana. Embora nós recebamos cerca de 10– 20 amostras por semana para teste do PCR para dengue, apenas cerca de 10%–15% podem ser positivas em qualquer 1 semana, e essas amostras são geralmente uma mistura da dengue 1 e 2, embora a dengue 3 e 4 sejam ocasionalmente vistas. Nós rotineiramente não quantificamos a dengue nessas amostras positivas, mas o Ct pode variar de 25–35, em média (com um separador clínico arbitrário ajustado em um Ct de aproximadamente 39–40, baseados em nossa experiência de se analisar casos clínicos e locais de dengue, a maioria dos quais têm sido confirmados em teste sorológico paralelo). Clinical Case Study Nesse caso, o contato inicial da doadora quando ela se tornou sintomática mais sua vontade de cooperar com o teste de acompanhamento nos permitiu resolver esse caso satisfatoriamente. Medidas agora têm sido postas em prática para prevenir a recorrência dessa situação, incluindo revisão e cuidadosa análise dos protocolos padrões de operação com os membros da equipe que rotineiramente realizam esse teste específico para PCR da dengue. Com o teste de tempo real do PCR se tornando mais e mais rotineiro nos hospitais, é Estudo do Caso Clínico crítico se distinguir nas amostras clínicas as verdadeiras quantidades baixas de patógenos da contaminação cruzada do laboratório. Durante qualquer investigação e até que a questão seja resolvida, a possibilidade de tais resultados potencialmente falsosnegativos deve ser considerada no processo de tratamento do paciente em curso. Tais resultados podem, contudo resultarem ser verdadeiros positivos, e ficar atentos a eles garante que qualquer oportunidade para intervenção não terá sido perdida. PONTOS PARA SEREM LEMBRADOS Teste do PCR é uma técnica muito sensível que permite que pequenas quantidades de RNA ou DNA sejam amplificadas mais do que um milhão de vezes. Desse modo qualquer contaminação de baixo nível (por exemplo, de um controle positivo ) também será amplificada. Contaminação deve ser monitorada colocando-se vários controles negativos em cada rodada do PCR. Se qualquer um desses controles negativos der um sinal positivo, a rodada inteira deve ser considerada inválida. Reextração da amostra original (que deve ser guardada até que todo o teste tenha sido satisfatoriamente completado) é obrigatória se um resultado falso-positivo for suspeitado. Nem todos os resultados baixos positivos são necessariamente falsos positivos, e pode de fato haver uma baixa quantidade de RNA ou DNA na amostra. Para infecções virais agudas (em oposição a persistentes ou crônicas ) se pegar uma segunda amostra do paciente para reanalisar pode não resolver a questão porque a maioria das cargas virais diminuem progressivamente a partir da data do começo da doença devido à eliminação viral imune mediada. Teste de repetição no extrato original (ou em um novo extrato da amostra original ) de uma amostra verdadeira baixa positiva pode subsequentemente dar um resultado negativo devido à decomposição do RNA ou DNA após o congelamento ou descongelamento. Em situações nas quais uma doença inesperada se desenvolve tanto no receptor quanto no doador de um produto sanguíneo, quando a infecção é suspeitada, amostras agudas e convalescentes pareadas (tiradas pelo menos 10–14 dias mais tarde ) devem ser tiradas para sorologia paralela, PCR, e/ou cultura. Durante essas investigações laboratoriais adicionais, tratamento do paciente deve ser rigorosamente coordenado com o laboratório diagnóstico para evitar uso desnecessário de potentes drogas antivirais ou se perder a janela ótima para o tratamento necessário. Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico Agradecimentos Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: Nada a declarar. Consultor ou Papel Consultivo: Nada a declarar. Posse dos Valores: Nada a declarar. Honorários: Nada a declarar. Fundo de Pesquisas: P.A. Tambyah, Baxter e Sanofi-Pasteur. Testemunho Hábil: Nada a declarar. Outra Remuneração: P.A. Tambyah, Novartis. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Agradecimentos: Nós agradecemos a mãe do neonato e a doadora de sangue por sua cooperação nessa investigação. Referências 1. Wilder-Smith A, Chen LH, Massad E, Wilson ME. Threat of dengue to blood safety in dengue-endemic countries. Emerg Infect Dis 2009;15:8-11.[CrossRef][Web of Science][Medline] [Order article via Infotrieve] 2. Tambyah PA, Koay ESC, Poon MLM, Lin RVTP, Ong BKC. Dengue hemorrhagic fever transmitted by blood transfusion. N Engl J Med 2008;359:1526-1527.[Free Full Text] 3. Tan FL, Loh DL, Prabhakaran K, Tambyah PA, Yap HK. Dengue haemorrhagic fever after living donor renal transplantation. Nephrol Dial Transplant 2005;20:447448.[Free Full Text] 4. Katsoulidou A, Moschidis Z, Sypsa V, Chini M, Papatheodoridis GV, Tassopoulos NC, et al. Analytical sensitivity and clinical sensitivity of the Procleix Ultrio HIV1/HCV/HBV assays in samples with a low viral load. Vox Sang 2007;92:814.[CrossRef][Web of Science][Medline] [Order article via Infotrieve] 5. Williams JV, Wang CK, Yang CF, Tollefson SJ, House FS, Heck JM, et al. The role of human metapneumovirus in upper respiratory tract infections in children: a 20-year experience. J Infect Dis 2006;193:387-395.[CrossRef][Web of Science][Medline] [Order article via Infotrieve] Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico Comentário Lynne Uhl Beth Israel Deaconess Medical Center/Harvard Medical School, Boston, MA. Envie correspondência para esse autor para: Beth Israel Deaconess Hospital YA-309, 330 Brookline Ave, Boston, MA, 02215. Fax 617-667-4533; e-mail [email protected]. No rastro do reconhecimento do HIV transmitido pela transfusão, a comunidade do banco de sangue introduziu um exame mais extensivo do doador, melhorou o teste do doador, e a modificação do produto pós doação para melhorar a segurança do suprimento do sangue e reduzir o risco para infecção transmitida por transfusão (TTI). Além das múltiplas perguntas do exame de pré doação, nos países desenvolvidos unidades coletadas são sujeitas à extenso exame laboratorial, incluindo teste de ácido nucléico para HIV/vírus da hepatite C, e mais recentemente vírus da hepatite B e vírus West Nile. Consequentemente, o risco para TTI tem sido reduzido à níveis variando de 1/200 000 até 1/1–2 milhões de episódios de transfusões. Apesar dessas diminuições no risco, vigilância em andamento para doenças infecciosas emergentes potencialmente transmissíveis através de transfusão de sangue é necessária (1). Como notado por Tang et al., o agente arbovírus responsável pela febre da dengue é amplamente endêmico em regiões equatoriais e há evidência acumulada para o risco de infecção da dengue transmitida por transfusão. Atualmente, entretanto, nenhuma boa pergunta do exame tem sido formulada para identificar doadores com alto risco para TTI associada à dengue, e nem existe um teste aceitável para exame do doador que possa ser praticamente aplicado (1). Consequentemente, comunicação pós doação por um doador de sangue de uma doença febril den- tro de 7 dias da doação é crítico, como evidenciado pelo relatório desse caso. Uma vez que a instalação de coleta de sangue é presenteada com essa informação, cabe a eles determinar o risco para TTI, apesar da baixa especificidade da febre para uma potencial TTI. Na maioria dos casos, as instalações de coleta de sangue seguem o princípio pré monitório e tentam interditar a liberação de componentes sanguíneos iniciando um recall de mercado ou retirada, frequentemente via um telefonema para o serviço de transfusão que recebeu os componentes sanguíneos em questão (2). Em resposta, o serviço de transfusão examina seu inventário para determinar a disposição do produto sanguíneo implicado. Se ainda estiver em inventário, o produto sanguíneo é imediatamente posto de quarentena até que informação adicional da instalação de coleta esteja disponível com relação a segurança para distribuição. Se o produto foi liberado para transfusão, é responsabilidade do serviço de transfusão alertar o médico do recebedor com relação ao risco para TTI e trabalhar com o médico para desenvolver um plano de ação para avaliação adicional e tratamento do paciente. Esse relatório do caso ilustra a importância do trabalho em equipe coordenado entre a instalação de coleta de sangue, o departamento de medicina laboratorial, e o serviço clínico na avaliação do risco de TTI associado com um componente sanguíneo para o qual preocupação foi levantada. Clinical Case Study Estudo do Caso Clínico Agradecimentos Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Nenhum autor declarou qualquer potencial conflito de interresse. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Referências 1. Stramer SL, Hollinger FB, Katz LM, Kleinman S, Metzel PS, Gregory KR, Dodd RY. Emerging infectious disease agents and their potential threat to transfusion safety. Transfusion 2009;49:1S-29S.[CrossRef][Web of Science][Medline] [Order article via Infotrieve] 2. Ramsey G. Managing recalls and withdrawals of blood components. Transfus Med Rev 2004;18:36-45.[CrossRef][Web of Science][Medline] [Order article via Infotrieve] Comentário Roger Y. Dodd Research and Development, American Red Cross, Rockville, MD. Envie correspondência para o autor para: Research and Development, American Red Cross, Holland Laboratory, 15601, Crabbs Branch Way, Rockville, MD 20878. E-mail [email protected]. Infelizmente, elevada sensibilidade diagnóstica clínica vem as custas da especificidade diagnóstica clínica. Além disso, testes com alta sensibilidade analítica são suscetíveis à contaminação laboratorial. Desse modo, é claro que testes diagnosticamente e analiticamente sensíveis estão sujeitos a resultados falsos positivos. Nesse caso, preocupação sobre as circunstâncias que rodeiam um resultado aparentemente (contudo fracamente) positivo para PCR para RNA da dengue 2 levou à extensos e apropriados estudos adicionais que fortemente apoiam a conclusão final de que os resultados iniciais foram de fato devidos à contaminação. Um segundo e terceiro extrato da amostra original foram analisados múltiplas vezes e constatados não reativos, e avaliação de amostras subseqüentes para evidência de soro conversão forneceu evidência confirmadora de que a doadora (e o neonato recebedor de sua doação de sangue) não foram infectados com o vírus da dengue. O laboratório não pode ser culpado por essas cuidadosas determinações, contudo elas teriam acontecido em um ambiente menos crítico? Aqui jaz a lição. Entretanto, uma pergunta mais ampla que pode ser feita é por que o teste foi feito em primeiro lugar e como os analitos foram escolhidos? Devido ao recente achado de uma transmissão da dengue por transfusão em Cingapura, e o envolvimento de alguns dos mesmos autores no caso, é compreensível que os vírus da dengue e até mesmo da chikungunya fos- Clinical Case Study sem de interesse, mas houve qualquer informação clínica útil para fornecer uma base para o teste? Qual é a probabilidade de precisamente se identificar o agente etiológico de uma doença febril parecida com a gripe por essa abordagem? Poderia não ter sido uma infecção bacteriana ou até mesmo parasítica, qualquer uma das quais teria tido im- Estudo do Caso Clínico plicações muito diferentes para o recebedor do sangue? O caso ainda ilustra que, na ausência de cautela apropriada, as propriedades e modos de potenciais falhas de testes sensíveis podem levar a um achado aparente daquilo que se espera, em vez do que realmente está lá. Agradecimentos Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Na submissão do artigo, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: Nada a declarar. Consultor ou Papel Consultivo: Nada a declarar. Posse dos Valores: R. Y. Dodd, Abbott Laboratories (membro imediato da família ). Honorários: R. Y. Dodd, Novartis Vaccines e Diagnostics. Fundo de Pesquisas: Nada a declarar. Testemunho Hábil: Nada a declarar. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. “This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2010; 56: 3 352-356, by permission of AACC. Original copyright © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry.” “Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2010; 56: 3 352-356, por permissão da AACC. Cópia original © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,Clinical Chemistry.”
