PROGRAMA DE DOUTORADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E

UNIVERSIDADE PAULISTA
PROGRAMA DE DOUTORADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL
EFEITOS DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS
NO TUMOR DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS:
Uma abordagem experimental
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Ambiental e
Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de Doutor
em Patologia Ambiental e Experimental.
JULIANA GIMENEZ AMARAL
SÃO PAULO
2015
UNIVERSIDADE PAULISTA
PROGRAMA DE DOUTORADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL
EFEITOS DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS
NO TUMOR DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS:
Uma abordagem experimental
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Ambiental e
Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de Doutor
em Patologia Ambiental e Experimental,
sob orientação da Profa. Dra. Leoni Villano
Bonamin.
JULIANA GIMENEZ AMARAL
SÃO PAULO
2015
Amaral, Juliana Gimenez.
Efeitos de medicamentos homeopáticos no tumor de Ehrlich em
camundongos : uma abordagem experimental / Juliana Gimenez
Amaral. - 2015.
66 f. : il. color.
Tese de Doutorado Apresentada ao Programa de Pós Graduação
em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista,
São Paulo, 2015.
Área de Concentração: Patologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Leoni Villano Bonamin.
1. Homeopatia. 2. Tumor de Ehrlich. 3. Imunologia.
I. Bonamin, Leoni Villano (orientador). II. Título.
JULIANA GIMENEZ AMARAL
EFEITOS DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS
NO TUMOR DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS:
Uma abordagem experimental
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Ambiental e
Experimental da Universidade Paulista –
UNIP, para obtenção do título de Doutor
em Patologia Ambiental e Experimental.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
_______________________/__/___
Prof. Nome do Professor Universidade Paulista – UNIP
_______________________/__/___
Prof. Nome do Professor Universidade Paulista – UNIP
_______________________/__/___
Prof. Nome do Professor Universidade Paulista UNIP
_______________________/__/___
Prof. Nome do Professor Universidade Paulista – UNIP
_______________________/__/___
Prof. Nome do Professor Universidade Paulista UNIP
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a meus filhos, João Gabriel e Luiz Guilherme, que, por
algum tempo, foram compreensíveis frente à necessidade da minha ausência e me
sustentaram nesse período com muito amor e carinho.
A meus pais e irmãos, por sempre me apoiarem e não me deixarem desistir
frente às dificuldades.
A minhas sobrinhas, Manuella e Isabella, princesas da minha vida.
À coordenadora geral do curso de Enfermagem da Unip, professora Raquel
Cavalca Machado Coutinho, pelo incentivo contínuo à pesquisa e pelo apoio quando
foi preciso.
Ao grupo de pesquisa a que este trabalho pertence, equipe unida e parceira
para todas as horas.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Unip, pela oportunidade de pesquisa e aprendizado
A Thiago Alóia, amigo e companheiro de trabalho que nos ajudou em
resultados importantes para esta pesquisa.
Aos funcionários do Laboratório de Pesquisa da Unip, Fabiana Toshie de
Camargo Konno, Suzana Maria Bezerra, Cleide Marques da Silva Santana, Wilton
Pereira do Santos e Paulo Ailton Vedovato, pela parceria durante toda a pesquisa
(aguardo nomes completos).
Aos meus amigos e companheiros de trabalho que sempre estiveram
presentes e me encorajando durante esta pesquisa.
SUMÁRIO
ARTIGO 1 ................................................................................................................... 6
ARTIGO 2 ................................................................................................................. 39
ANEXO 1................................................................................................................... 65
APÊNDICE 1 ............................................................................................................. 66
6
ARTIGO 1
Efeitos de medicamentos homeopáticos no tumor de Ehrlich em
camundongos: uma abordagem experimental
Effects of homeopathic medicines on Ehrlich tumor in mice: an experimental
approach
Running head: Homeopathy in experimental oncology and tumor immunity
Juliana Gimenez Amaral, Thayná Neves Cardoso, Aloísio Cunha de Carvalho,
Luciane Costa Dalboni, Luana Ramos, Silvio Leite Monteiro da Silva, Fabiana
Rodrigues Santana, Cideli de Paula Coelho, Louise Teixeira, Elizabeth Cristina
Perez Hurtado, Leoni Villano Bonamin
Abstract
The objective of this study was to describe different aspects related to the biology of
the Ehrlich tumor in mice, such as growth rate, histological organization and immune
response after treatment of Carcinosinum and other homeopathic medicines.
Carcinosinum was chosen after an initial pilot experiment, comparing the action of
different drugs used in the "Banerji Protocol" on the development of ascites tumor
and survival. In a second phase, different potencies of Carcinosinum, 6CH, 200cH
and a chord of 6cH + 200cH (called “MIX”) or vehicle (control) were analyzed by
macro and microscopic investigation of the solid form of this tumor, in which
apoptosis (Caspase 3), proliferation (Ki 67) and angiogenesis (VEGF) markers were
analyzed by immunohistochemistry. The spleen cell populations were studied by flow
cytometry. Mice treated with Carcinosinum MIX presented a mild reduction of tumor
necrosis and tissue invasion, more caspase 3 positive cells and significant increase
in the CD4+/CD8+ cell ratio associated to increase of CD25+ T cells in relation to
total T cells in spleen (p=0,0001), which can be related to modulatory rules. In
contrast, the group treated with Carcinosinum 6CH presented more edema in the
tumor inoculation site (p=0,01), increase in the number of Ki67 positive tumor cells
(p=0,01) and poor clinical outcome. Carcinosinum 200cH induced the best scores of
animal welfare improvement, but without changes in the tumor growth. The results
reveal the importance of homeopathic potency in the treatment outcome. Further
analyzes are needed to elucidate the mechanism of action involved and the
usefulness of homeopathy in oncology practice.
Keywords: Ehrlich ascites tumor. High dilutions. Homeopathy. Carcinosinum. Tumor
immunology. Experimental oncology.
7
ARTIGO 1
Efeitos de medicamentos homeopáticos no tumor de Ehrlich em
camundongos: uma abordagem experimental
Área de pesquisa: Homeopatia em oncologia experimental e imunidade
tumoral
Juliana Gimenez Amaral, Thayná Neves Cardoso, Aloísio Cunha de Carvalho,
Luciane Costa Dalboni, Luana Ramos, Silvio Leite Monteiro da Silva, Fabiana
Rodrigues Santana, Cideli de Paula Coelho, Louise Teixeira, Elizabeth Cristina
Perez Hurtado, Leoni Villano Bonamin
Resumo
O objetivo deste estudo foi descrever os diferentes aspectos relacionados com a
biologia do tumor de Ehrlich em camundongos, tais como taxa de crescimento,
organização histológica e resposta imune após o tratamento de Carcinosinum e
outros medicamentos homeopáticos. Carcinosinum foi escolhido após uma
experiência piloto inicial, comparando a ação de diferentes fármacos utilizados no
"Protocolo Banerji" sobre o desenvolvimento da ascite tumoral e sobrevida. Em uma
segunda fase, diferentes potências de Carcinosinum, 6CH, 200cH e um acorde de
6cH + 200cH (chamado "MIX") ou veículo (controle) foram analisados por meio de
investigação macro e microscópico na forma sólida desse tumor, em que
marcadores para apoptose (caspase 3), proliferação celular (Ki 67) e angiogênese
(VEGF) foram analisados por imunohistoquímica. As populações de células do baço
foram estudadas por citometria de fluxo. Os ratinhos tratados com Carcinosinum MIX
apresentaram uma redução ligeira de necrose tumoral e invasão de tecidos, mais
células positivas para Caspase 3 e um aumento significativo na proporção de células
CD4 + / CD8 + associado ao aumento de células CD25 + em relação às células T
totais no baço (p = 0,0001), o que pode estar relacionado a uma ação modulatória.
Em contraste, o grupo tratado com Carcinosinum 6CH apresentou mais edema no
local de inoculação do tumor (p = 0,01), aumento do número de células tumorais
positivas para Ki67 (p = 0,01) e o resultado clínico pobre. Carcinosinum 200cH
induziu as melhores pontuações de melhoria do bem-estar animal, mas sem
alterações no crescimento do tumor. Os resultados revelam a importância da
potência homeopática no resultado do tratamento. Análises adicionais são
necessárias para elucidar o mecanismo de ação envolvido e a utilidade da
homeopatia na prática oncologia.
Palavras-chave: Tumor ascite Ehrlich. Altas diluições. Homeopatia. Carcinosinum.
Imunologia de tumores. Oncologia experimental.
8
INTRODUÇÃO
O câncer é um problema de saúde pública. De acordo com a Organização Mundial
de saúde (OMS), em 2012 houve 14,1 milhões de casos novos de câncer em todo o
mundo e 8,2 milhões de mortes por câncer (INCA, 2014). Junto com a busca de
soluções convencionais, a identificação de tratamentos oferecidos por diversos
sistemas de medicina alternativa e complementar, incluindo a homeopatia, também
é foco de pesquisas recentes (ROSSI et al., 2014). A pesquisa básica sobre
homeopatia tem avançado muito nos últimos anos, com a evolução de modelos
experimentais in vivo e in vitro (BONAMIN, ENDLER, 2010; 2015; BELLAVITE et al.,
2014; BONAMIN et al., 2015). Embora existam poucos estudos clínicos sobre a
eficácia da homeopatia no tratamento do câncer (FRENKEL, 2015), atualmente
observa-se um importante crescimento de pesquisas realizadas in vitro sobre os
mecanismos epigenéticos envolvidos no modo de ação de tais medicamentos
(KHUDA-BUKHSH et al., 2015;).
Na Alemanha, uma pesquisa mostrou que pacientes submetidos à quimioterapia
convencional associada ao uso de medicamentos homeopáticos prescritos
individualmente apresentaram menos fadiga e maior qualidade de vida (ROSTOK, et
al, 2011). Um estudo observacional prospectivo recente, conduzido durante um ano
com pacientes com câncer, comparou a evolução na qualidade de vida de pacientes
tratados com homeopatia associada ou não com tratamento convencional e mostrou
haver melhoria significativa no grupo homeopatia, observada até 12 meses após a
administração, com melhoria contínua dos parâmetros avaliados (BANERJI, 2008).
Nos últimos anos, o “Protocolo Banerji” tem ganhado um papel importante nesse
universo da pesquisa, motivando pesquisadores de diferentes partes do mundo a
estudar e entender os mecanismos dos medicamentos homeopáticos nesses casos
(BANERJI, 2012; FRENKEL, 2015). Os medicamentos mais utilizados para obtenção
desses resultados foram o Carcinosinum 30c, Conium maculatum 3c, Pyholacca
decandra 200c e Thuya occidentalis 30c. Por esse motivo, tais medicamentos têm
sido alvo de pesquisa básica nos últimos anos, incluindo o presente trabalho. No
protocolo Banerji, o Carcinosinum é utilizado em associação a outros medicamentos
para tratar os tumores de mama, próstata e osso (BANERJI, 2012).
Resultados positivos também foram obtidos no tratamento de pacientes portadores
de glioma com Ruta graveolens. De 9 pacientes, 8 (88,9%) apresentaram regressão
9
completa do tumor e um paciente apresentou regressão parcial. Resultados
similares foram obtidos em pacientes portadores de meningioma. Tais achados
encontram suporte científico em estudos in vitro que apontam a fragmentação do
DNA e o bloqueio do ciclo celular, com indução de apoptose, como prováveis
mecanismos (PATHAK et al, 2003; PREETHI et al, 2012; ARORA et al., 2013;
FREYER et al., 2014; ARORA, TANDON, 2015). Mecanismos similares também são
observados nos estudos sobre Carcinosinum, Phytolacca decandra, Thuya
occidentalis, Conium maculatum, Sabal serrulata e Condurango (FRENKEL, 2010;
2015; MUKHERJEE, 2013; KHUDA-BUKSHS et al., 2015; THANGAPAZHAM et al,
2006), sugerindo a ativação de vias intracelulares comuns a diferentes tratamentos,
os quais seguem o princípio de similitude. Os efeitos antiproliferativos de Phytolacca
em diversas potências (tintura mãe, 30C, 200C, 1M e 10M) sobre células de câncer
de mama e cólon in vitro também foram demonstrados por ARORA et al., 2013.
Por outro lado, ainda há poucos dados na literatura sobre a participação do
microambiente tumoral e mecanismos fisiopatológicos sistêmicos na atividade de
tais medicamentos homeopáticos. Tendo em vista que o estudo do microambiente
tumoral tem sido foco prioritário nas pesquisas sobre o câncer (HANAHAN;
WEINBERG, 2011), alguns aspectos sobre essa abordagem e sobre a participação
da resposta imune foram incluídos neste trabalho. O emprego de marcadores
tumorais biológicos é importante instrumento na avaliação do comportamento clínico
das neoplasias, que envolvem eventos celulares que ocorrem em âmbito tanto
genético como bioquímico (ARISAWA, et al. 1999). Os marcadores tumorais são
macromoléculas presentes no tumor ou no sangue, cuja presença ou cujas
alterações estão diretamente ligadas à gênese e ao crescimento de células
neoplásicas. Esses marcadores atuam como indicadores de presença de neoplasia
e podem ser produzidas pelo próprio tumor, auxiliando no manejo clínico do paciente
com câncer, no processo diagnóstico, estadiamento, resposta terapêutica,
prognóstico e investigação de recidivas. (ALMEIDA et al, 2007). Assim, uma das
técnicas empregadas para a caracterização do tumor nos animais tratados foi a
imunohistoquímica.
O tumor de Ehrlich é uma neoplasia maligna, experimental e transplantável,
descoberta em 1886 e descrita em 1905 por Paul Ehrlich como um carcinoma
mamário de camundongos fêmeas. Esse tumor desenvolve forma ascética, quando
10
inoculado no peritônio, e forma sólida, quando inoculado no tecido subcutâneo
(EHRLICH, 1906). Nesse caso, vários são os fatores do microambiente que
influenciam o crescimento tumoral. Por exemplo, a quantidade de capilares no tumor
de Ehrlich na forma sólida é regulada pela glutamina e pela secreção do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) pelas próprias células tumorais, o que
influencia o crescimento do tumor (SILVA, 2006; GHOSH et al, 2004). O tumor de
Ehrlich também tem sido utilizado como modelo para a elucidação dos mecanismos
dos medicamentos homeopáticos nos tumores (SHAH et al., 2013).
Objetivo
Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é descrever diferentes aspectos relacionados à biologia do
tumor de Ehrlich frente ao tratamento com medicamentos homeopáticos utilizados
no “protocolo Banerji”.
Objetivos específicos
Fase 1 (Estudo piloto): avaliação clínica e de sobrevida de camundongos portadores
de tumor ascítico tratados com diferentes medicamentos e escolha de um
medicamento para ser estudado amiúde na segunda fase.
Fase 2: estudo macro e microscópico do tumor na forma sólida em camundongos
tratados com Carcinosinum (medicamento escolhido) em diferentes potências
homeopáticas, considerando-se o crescimento, a organização histológica do
microambiente tumoral e a resposta imune sistêmica.
Métodos
Animais
Foram utilizados 46 camundongos da linhagem BALB/c, machos e adultos, mantidos
em microisoladores (Techniplast®) no biotério de Experimentação animal – SPF do
Centro de Pesquisa da UNIP (Campus Indianópolis), com água e ração ad libitum,
controle de temperatura (22±2oC), umidade (55-65%), trocas de ar (75/hora) e ciclos
claro e escuro 12/12horas.
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Ética
Esta pesquisa foi aprovada e certificada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Paulista em 17/04/2013, sob o protocolo n. 158/2013 – CEP/ICS/UNIP
(anexo 1).
O desenho experimental foi planejado para atender aos requisitos de bem-estar
animal e ao conceito dos 3 Rs (reduction, replacement, refinement), obtendo o
máximo de informação com o mínimo de intervenções e número mínimo de animais
para validação estatística. Assim, o estudo piloto possibilitou identificar os aspectos
clínicos mais relevantes dos diferentes medicamentos, incluindo sobrevida e, em
seguida, eleger aquele que fosse realmente útil para a sequência da pesquisa,
utilizando o menor número de animais possível e evitando múltiplas repetições de
um mesmo experimento com os diferentes medicamentos.
Outros estudos que foram executados em paralelo no laboratório pelo mesmo
período (todos aprovados pelo Comitê de Ética em protocolos específicos)
partilharam o mesmo grupo controle, o que atende às diretrizes brasileiras de ética
em experimentação animal.
O experimento final foi realizado com tumor na forma sólida para possibilitar ampla
avaliação de parâmetros complementares a partir do mesmo material tumoral
preparado histologicamente, evitando repetições e eutanásias desnecessárias.
Modelo experimental
Preparo das células tumorais para inoculação
O tumor de Ehrlich é mantido no laboratório por meio de repiques semanais em
camundongos, por via intraperitoneal. Para a inoculação do tumor, foi feita a punção
abdominal de um camundongo portador com 7 a 10 dias de inoculação, e 2 a 3 mL
de fluído ascítico foram retirados e transferidos para um tubo Falcon. O líquido foi
centrifugado a 1500rpm por 5 minutos e as células depositadas (pellet) foram
ressuspensas em 2 mL de PBS e homogenizadas para nova centrifugação. Esse
processo foi repetido por 3 vezes para a completa lavagem das células. A
suspensão final foi mantida em gelo durante a contagem, feita pelo método Azul de
Tripam 0,1% (GIBCO). Assim, as células foram diluídas na proporção 1:100 para
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observação e contagem em câmara de Neubauer (HAUSSER SCIENTIFIC),
utilizando os quadrantes laterais de leucócitos.
Inoculação do tumor de Ehrlich
Na fase 1, estudo piloto, foi inoculado em cada camundongo, por via intraperitoneal,
0,1 mL de suspensão celular do tumor de Ehrlich contendo 106 células, para
obtenção do tumor na forma ascítica. Na segunda fase, 0,05 mL da suspensão
celular foram inoculados no tecido subcutâneo do coxim plantar esquerdo, contendo
105 células, para obtenção do tumor na forma sólida. Esse volume permitiu observar
e medir o crescimento tumoral lentamente, dia a dia, sem a necessidade de mais
eutanásias e sem causar desconforto excessivo para o animal. O prazo de 10 dias
foi escolhido como “end-point” para que os resultados fossem analisados antes da
piora clínica.
Preparação dos medicamentos
As matrizes dos medicamentos foram obtidas de farmácia credenciada pela ANVISA
com uma potência abaixo da que foi utilizada (5CH e 199CH). A diluição final (6CH e
200CH) foi feita no próprio laboratório, semanalmente. Assim, 10mL de água ultrapura (MilliQ) foram usados para diluir 100µL de cada medicamento, em frasco
âmbar. A sucussão dos frascos foi feita de forma automatizada em braço mecânico
Autic®, seguindo as normativas descritas na Farmacopéia Homeopática Brasileira,
3ª edição (ANVISA, 2011). Entende-se como CH a diluição centesimal da substância
original em solução hidro-alcóolica 70%. O número de passagens corresponde às
“potências homeopáticas”, conforme nomenclatura específica da área.
“Acordes de potências” homeopáticas são preparações que contêm diferentes
diluições de medicamentos homeopáticos misturadas em partes iguais, preparados
a partir de uma mesma tintura. Essa proposta foi introduzida por Cahis e Kats no
início do século 20, sugerindo que a mistura de potências poderia ser mais eficaz
que uma única potência (CAHIS, 1913; KATZ, 1913). Pedalino e colaboradores
(2004) mostraram que a mistura de potências de Belladonna potencializa os efeitos
protetores desse medicamento sobre a peritonite experimental em camundongos.
Baseando-nos nesses dados, incluímos a proposta da mistura de Carcinosinum 6CH
e 200CH nesta pesquisa, com o objetivo de avaliar possíveis mudanças qualitativas
ou quantitativas de seus efeitos em relação às potências simples.
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Os medicamentos foram codificados por um funcionário não envolvido com a
execução dos experimentos para que se pudesse trabalhar em dupla ocultação (“em
cego”) ao longo de todo o estudo. Os códigos foram abertos apenas após a análise
estatística.
Delineamento experimental
Fase 1 - Estudo piloto: Screening de medicamentos, avaliação semiquantitativa
de parâmetros clínicos e sobrevida.
Os animais foram divididos randomicamente em 4 grupos contendo 5 animais em
cada um deles. Um grupo foi caracterizado como o controle e os outros 4 grupos
foram caracterizados conforme a medicação que receberam, sendo as medicações
escolhidas: Carcinosinum 200CH, Conium maculatum 200CH e Thuya occidentalis
200CH. A partir de 24h da inoculação do tumor, os camundongos receberam, por via
oral, uma dose de 10 μL de medicamento / 10g de peso vivo/animal/dia até o último
dia de vida.
Durante o ensaio de sobrevida, também foi avaliada a condição clínica de cada
animal, conforme a incidência de sinais clínicos relevantes. Os itens avaliados
foram: pele, pelos, comportamento, peso, olhos, sistema respiratório, sistema
locomotor, sistema nervoso, genitália, quantidade de água e ração ingeridas e
temperatura do corpo. As fichas estão mostradas no apêndice 1. A avaliação do
crescimento do tumor ascítico foi feita pelo ganho de peso.
A análise do quadro clínico nos diferentes grupos serviu de critério para a escolha do
medicamento a ser utilizado na fase 2.
Experimento 2 – Avaliação clínica, resposta imune e expressão de marcadores
tumorais do tumor de Ehrlich na forma sólida após tratamento com
Carcinosinum.
Quatro grupos de 5 animais e um grupo de 6 animais foram organizados de forma
randômica. Os grupos foram nomeados como: Veículo (controle), Carcinosinum
200CH, Carcinosinum 6CH e Carcinosinum MIX (mistura ou “acorde” de potências 6
e 200CH na proporção 1:1) e Sem tumor (controle branco).
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Após 24h de inoculação do tumor, os camundongos receberam, por via oral, doses
de 10μL de medicamento / 10g de peso vivo/animal/dia, ao longo de 10 dias.
Também se observaram diariamente as condições clínicas de cada animal, seguindo
os mesmos critérios descritos na fase 1. Os animais que receberam o tumor na
forma sólida tiveram seus coxins plantares medidos antes da inoculação do tumor e
todos os dias, durante 10 dias, utilizando um micrômetro (Mitutoyo ® IP65, Japan).
Colheita de material para histopatologia e citometria de fluxo
No experimento 2, após 10 dias de inoculação do tumor sólido no coxim plantar,
todos os animais foram eutanasiados. Para a eutanásia, os animais foram sedados
profundamente com 0,1 mL de mistura ketamina - xilazina na proporção 2:1 para
cada 10g de peso vivo (equivalente às doses de 20 mg/10g peso vivo de Xilazina e
10 mg/10g de peso vivo de Ketamina), até a interrupção dos sinais vitais. Em
seguida, foi realizado o deslocamento cervical para garantir a morte dos mesmos
antes de realizar qualquer procedimento de necropsia.
Para o exame histopatológico, foram colhidos fragmentos histológicos da lesão
tumoral, do
linfonodo
poplíteo
isolateral
e
do
baço,
sendo fixados em
paraformaldeído 8% (ideal para preservação antigênica). Em seguida, foram
encaminhados para a inclusão em parafina, microtomia e montagem dos cortes em
lâminas silanizadas (para a imunohistoquímica) ou lâminas convencionais (para
coloração por hematoxilina-eosina - HE).
Para a citometria de fluxo, um fragmento central do baço foi colocado numa placa de
Petri plástica com uma gota de PBS-SFB 1%. As células foram ressuspensas com o
auxílio do êmbolo de uma seringa e transferidas para um tubo Falcon, sendo
mantidas em gelo até o processamento final. Para que a quantidade de células fosse
suficiente para garantir uma leitura representativa ao citômetro, cada tubo continha
um pool de suspensão celular obtidas de dois camundongos do mesmo grupo.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo das células do baço foi utilizada para a quantificação de
linfócitos T (CD4+, CD8+ e CD25+), linfócitos B1, linfócitos B2, linfócitos B da Zona
Marginal (BZM) e macrófagos, conforme descrito no Quadro 1.
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Quadro 1 – Células quantificadas por citometria de fluxo
CÉLULAS
MARCADORES
Linfócitos B1
CD19+ CD23- CD11b+
Linfócitos B2
CD19+ CD23+ CD11bMacrófago
CD19- CD23- CD11b+
Linfócitos T
CD19- CD4+ ou CD19- CD8+
Linfócitos Treg ou T ativados
CD19- CD25+
Linfócitos B de zona marginal
CD19+ CD23- CD11bOs tubos foram centrifugados em centrífuga refrigerada a 2000rpm / 5 minutos,
sendo o sobrenadante descartado. Assim, 2mL de tampão hemolítico foram usados
para lavagem das células, sendo as mesmas incubadas por 2 minutos antes de
serem submetidas a nova centrifugação. Em seguida, as células foram contadas em
câmara de Neubauer (HAUSSER SCIENTIFIC) pelo método do azul de Tripam 0,1%
(GIBCO), sendo utilizados os quadrantes laterais de leucócitos.
Em seguida, 10 µl de anti-CD16/32 foram adicionados a 990 µl de PBS-BSA 1%
para preparo da solução bloqueadora, sendo que 10 µl da mesma foram acrescidos
a cada amostra, incubada a 4oC por 30 minutos. Após nova lavagem em PBS, o
conteúdo de cada tubo foi transferido para 3 microtubos contendo 10 6 células por
microtubo. Um microtubo foi designado como sem marcar, um microtubo como
combo 1 (linfócitos B) e o terceiro microtubo foi designado como combo 2 (linfócitos
T). Uma sequência adicional de amostras foi separada para a marcação simples,
com cada um dos marcadores utilizados, para a compensação da positividade das
amostras no citômetro. Para cada 106 células, foram adicionados 20 microlitros de
anticorpo específico em concentração de 1%, seguido de incubação a 4oC por 40
minutos, conforme Quadro 2.
Quadro 2 – Marcadores utilizados para análise de células do baço de
camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida por citometria
de fluxo
Combo 1 CD 23 FITC
Combo 2 CD25 AF488
CD 5 PE
CD 19 PE Cy 5:5
CD 11b PB
CD 4 PE
CD 19 PE Cy 5:5
CD8 AF 405
Após a incubação, as células foram lavadas em PBS, centrifugadas, ressuspensas
em 100 µl de PBS-BSA 1% com 400 µl de paraformaldeído 1%, para fixação. As
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amostras foram mantidas a 4oC e embaladas em papel alumínio por até 48 horas
antes da contagem no citômetro CANTO® (BD, USA). Os dados foram processados
no software Flow Jo 7.6.5 para identificação dos “gates”, desenhados conforme
Figuras 1 e 2.
Figura 1 – Imagem gráfica obtida pelo software flow-jo 7.6.5 demonstrando os
“gates” e as populações de leucócitos B do baço analisadas pela citometria de
fluxo. (A) População total de leucócitos; (B) População de Linfócitos B1, B2 e
fagócitos; (C) População de Linfócitos BZM e Linfócitos B2; (D) População de
células B1a e B1b. Dados obtidos da análise do animal 10, tratado com
Carcinosinum 6CH
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Figura 2 – Imagem gráfica obtida pelo software flow-jo 7.6.5 demonstrando os
“gates” e as populações de Linfócitos T do baço analisadas pela citometria de
fluxo. (A) População total de leucócitos; (B) População de células CD19(Linfócitos T, fagócitos e células NK) e células CD19+ (linfócitos B); (C)
População de Linfócitos T (CD4+ e CD8+); (D) População de células CD25+
(Linfócitos Treg ou Linfócitos T ativados); (E) População de Linfócitos T
CD4+CD25+ e CD8+CD25+. Dados obtidos da análise do animal 10, tratado com
Carcinosinum 6CH
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Imunohistoquímica e histometria
Imunohistoquímica indireta
Após 12 horas de fixação em paraformaldeído 8%, o material tumoral colhido na
necrópsia foi processado e incluído em parafina. Cortes de 5 μm foram montados
em lâminas silanizadas. Os cortes foram desparafinizados, reidratados e submetidos
ao desmascaramento antigênico em tampão citrato (DAKO®, USA) durante 20
minutos, em panela elétrica (PANASONIC®, Japan). Após o resfriamento, os cortes
foram submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena em solução de 5% H2O2 em
metanol, durante 5 minutos. Os cortes foram lavados por três vezes e os sítios de
adsorção inespecíficos bloqueados com soro normal de equino 2,5% (VECTOR®,
USA), durante 30 minutos. Posteriormente, os cortes foram incubados com
anticorpos monoclonais em diferentes diluições, overnight e a 4oC, em câmera
úmida (Quadro 3). Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo
secundário ligado a polímero e peroxidase (Kit Impress Universal VECTOR®, USA)
durante 30 minutos, em temperatura ambiente. As células positivas foram
evidenciadas após a coloração com DAB (VECTOR®, USA). Controles negativos de
todas as reações foram feitos utilizando apenas o diluente dos anticorpos no lugar
do anticorpo primário (DAKO®, USA).
Avaliação semiquantitativa
As lâminas contendo cortes de coxim plantar foram observadas em microscópio
NIKON Eclipse 200® (Japan) e avaliadas quanto ao tamanho do tumor. Para cada
lâmina, todo o corte foi rastreado e avaliado, utilizando objetivas de 4x e 10x. Um
sistema de escores foi aplicado, conforme Quadro 4, Figura 3.
19
Quadro 3 – Anticorpos utilizados na imunohistoquímica indireta
Anticorpo
Alvo
Espécie
Molecular
doadora
Finalidade
Clone
Fator de
VEGF
Angiogênese
Diluição
Marca
1:200
abcam®
VG-1
Rato
crescimento
monoclonal
Proteína
Proliferação
Ki 67
nuclear e
Rato
Policlonal
1:1000
abcam®
Coelho
Policlonal
40µg/mL
abcam®
Rato
Krt1-19
1:50
Serotec®
celular
citoplasmática
Caspase
Proteína
Apoptose
3
citoplasmática
Marcador de
Proteína
Cito K
células
citoplasmática
epiteliais
Quadro 4 – Escore de quantificação de tumor no coxim plantar
Escore 0
Sem tumor
escore 1
escore 2
escore 3
1 a 20% da área do corte do coxim com tumor
20 a 50% de área do corte do coxim com tumor
mais que 50% de área do corte do coxim com tumor
20
Figura 3 – Fotomicrografias de coxim plantar corado com HE apresentando
tumor sólido de Ehrlich na derme. A quantificação foi feita segundo escores
predeterminados. Objetiva: 4x
Avaliação quantitativa
Incidência de parâmetros histopatológicos
A avaliação quantitativa foi realizada em microscópio Nikon Eclipse 200® (Japan),
utilizando as objetivas de 40x e 100x (imersão), considerando a presença ou não de
necrose, invasão tumoral e microembolia, para cada corte de coxim plantar corado
com HE.
Histometria
Entre 4 e 10 fotomicrografias da área correspondente ao tecido tumoral, no coxim,
foram feitas aleatoriamente, utilizando a objetiva de 40x em microscópio Nikon
Eclipse 200® (Japan) acoplado a uma câmera digital Coolpix com um monitor LCD®
21
(Japan). A positividade das células tumorais (marcadas em castanho pelo DAB) para
Citoqueratina e Caspase 3 e de vasos para VEGF (Figura 4) foi calculada
automaticamente, em pixels, usando o software Metamorph®. O software foi
calibrado com filtros de cor digitais, com regulação de bits vermelho, verde e azul, de
tal maneira que só foram incluídas células positivas, sendo a coloração de fundo
excluída. Nesse caso, levou-se em consideração a intensidade média da coloração
marrom presente em cada campo analisado. O número de células positivas por
campo para Ki 67 foi calculado pela contagem visual das mesmas, levando-se em
conta apenas as células que apresentaram positividade nuclear (Figura 4).
O edema do coxim plantar foi quantificado a partir dos cortes corados em HE. A
área clara de tecido dissociado (edema) foi calculada automaticamente, em pixels,
pelo software Metamorph® (Figura 5).
Figura 4 – Fotomicrografias de coxim plantar com tumor sólido de Ehrlich,
utilizadas para avaliação de positividade de VEGF, Caspase 3, CitoK e KI67.
Objetiva de 40x
22
Figura 5- Fotomicrografias de coxim plantar com tumor sólido de Ehrlich,
coradas por HE e utilizadas para avaliar a área de edema. Objetivas: 4x e 40x
Análise Estatística
A determinação da homocedasticidade das variáveis foi feita pelo teste de Bartlett
(INSTAT 3.0). O teste ANOVA e o Tuckey-Krammer foram utilizados para
comparação de dados paramétricos. Kuskal-Wallis e Dunn foram usados para dados
não paramétricos. Para análise dos dados da citometria de fluxo, o teste do X2 foi
usado em adição, a fim de comparar as proporções entre as diferentes populações
celulares do baço. Para todos os casos, os valores de p≤0.05 foram considerados
estatisticamente significantes.
Resultados
Fase
1
–
Estudo
piloto:
Screening
de
medicamentos,
avaliação
semiquantitativa de parâmetros clínicos e sobrevida.
Com base nos resultados da avaliação clínica, demonstrou-se que os animais
tratados com Carcinosinum 200CH apresentaram menor incidência de sintomas por
23
menos tempo, além de apresentarem maior sobrevida e redução de ganho de peso
associado à ascite. Esse resultado motivou a escolha do referido medicamento para
a segunda fase da pesquisa.
Para todos os grupos, o pico de aparecimento dos sintomas foi no D18, com
exceção de Carcinosinum 200CH, que apresentou atraso significativo no
aparecimento dos sintomas D29. Todavia, o grupo de animais tratados com Conium
maculatum foi o que apresentou a maior incidência de sintomas.
Todos os grupos apresentaram queda na temperatura corporal um dia antes da
morte, em função de choque endotóxico.
Esses resultados são demonstrados na Tabela 1.
Tabela 1 – Frequência (%) de sinais clínicos e ganho de peso (g) ao longo do
período de sobrevida de camundongos inoculados com tumor de Ehrlich na
forma ascítica e tratados diariamente, por via oral, com Conium maculatum
200CH, Thuya occidentalis 200CH, Carcinosinum 200CH e veículo (controle).
ANOVA
Característica
Conium
Carcinosinum
Thuya
Controle
21
32
28
30
13,3 ± 3,51
14,8 ± 3,27
15,0 ± 3,76
15,5 ± 3,30
Letargia
80%
20%
60%
60%
Cianose
80%
40%
80%
60%
40%
-
20%
20%
-
20%
Taquidispnéia
60%
20%
20%
60%
Locomoção:
dificuldade
80%
40%
80%
60%
Tempo de vida
(número de dias
necessários para 100%
das mortes)
Delta peso (g)
Eritema/edema
trato genital
do
Secreção purulenta
genital
Diarréia
Piloereção
Tremor
-
-
-
-
20%
80%
40%
80%
60%
-
20%
-
-
24
Fase 2 – Avaliação clínica, resposta imune e expressão de marcadores
tumorais do tumor de Ehrlich na forma sólida após tratamento com
Carcinosinum.
Na avaliação clínica dessa fase, os animais tratados com Carcinosinum 200CH
apresentaram menor incidência de sintomatologia que os outros grupos,
confirmando os dados clínicos obtidos no experimento 1 (tumor ascítico). Os
sintomas prevalentes entre os grupos foram edema, hiperemia do coxim e
piloereção (Tabela 2).
Tabela 2 – Frequência (%) de sinais clínicos ao longo do período de 10 dias de
camundongos inoculados com tumor de Ehrlich no coxim (forma sólida) e
tratados diariamente, por via oral, com Carcinosinum 200CH, Carcinosinum
6CH, Carcinosinum MIX e veículo (controle)
Incidência de sintomas (%)
CARC
200CH
CARC
6CH
MIX
CONTROLE
33,3 (2/6)
100(6/6)
85,7(5/6)
57,1(3/6)
Hiperemia de pata
0
66,6 (4/6)
42,8 (3/6)
57,1(3/6)
Piloereção
0
16,6 (1/6)
0
0
Consumo de ração
4,1±9,72
6,2±0
4,1±9,59
4,2±0
Consumo de água
5,2±0
6,4±9,72
5,1±9,59
4,8±0
Edema de pata
Os animais tratados com Carcinosinum 6CH foram os que apresentaram maior
percentual de sintomas e a maior diversidade de sintomas, comparado com os
outros grupos. Diferenças no consumo da água e comida entre os grupos não
apresentaram significância estatística durante o experimento (Tabela 1).
A avaliação macroscópica do tumor mostrou aumento progressivo e significativo da
espessura do coxim ao longo de 10 dias no grupo tratado com Carcinosinum 6CH,
25
em relação ao grupo controle sem tumor. O aumento mais significativo se deu após
o 6º dia de inoculação (Figuras 6 e 7).
Figura 6 – Aumento da espessura do coxim (delta), em mm, entre os dias zero
e dez após a inoculação do tumor de Ehrlich nos diferentes grupos. *p=0,01
Kruskal-Wallis/Dunn, em relação ao grupo controle sem tumor
*
Figura 7 – Evolução do aumento da espessura do coxim plantar inoculado com
tumor de Ehrlich, ao longo de 10 dias, nos diferentes grupos. *p= 0,01 KruskalWallis/Dunn, em relação ao grupo controle sem tumor
*
*
*
26
Citometria de fluxo
Na citometria de fluxo, foram analisadas as células do baço em suspensão, para a
quantificação das células positivas para CD4, CD8 e CD25 (linfócitos T), linfócitos
B1, B2, BZM (linfócito B da Zona Marginal), macrófagos e total de células T e B e
nas respectivas proporções.
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos para nenhum dos
subtipos celulares, considerando-se o número de diferentes células esplênicas para
cada 10000 eventos registrados no citômetro. Contudo, a análise das proporções
entre as diferentes populações celulares, utilizando o teste do X2, revelou
significância nos grupos tratados com Carcinosinum 6CH e 200CH em relação ao
controle (p=0,0001), sendo maior razão de células CD19- em relação às células
CD19+, o que sugere desvio para linfócitos T, NK e/ou NKT. Também a proporção
CD8+ / CD4+ foi menor, sendo o CD4+ predominante em todos os grupos tratados,
em relação ao controle (p=0,0001). A proporção CD25+/T total foi maior no grupo
tratado com MIX de potências em relação ao controle (Tabela 2).
27
Tabela 2 – Número de células positivas para cada marcador específico nos
“gates” selecionados a partir da citometria de fluxo do baço de camundongos
portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida por 10 dias. Os valores
representam média ± desvio padrão. A razão entre subtipos celulares está
representada em porcentagem. *X2, p=0,0001 em relação ao controle. ANOVA,
sem significância estatística
Cell
sub-type
Control
Carcinosinum
6CH
Carcinosinum
200CH
Carcinosinum
MIX
Linfócitos B
totais (CD19+)
26624,33± 61,07
24610±
2074,32
26115,67 ±
5340,89
29334 ±
61,07
Linfócitos T
totais (CD19-)
10599,33 ±2057,11
11070 ± 1625,11
10638 ± 1113,29
8427±6353,10
B-2
(CD19+ CD23+)
6616,33 ±1684,84
5281,66 ±650,28
5638,66 ±1840,71
6779,66 ±1292,45
B-1
(C19+ CD23CD11b+)
712,66 ±251,20
580,33 ±70,50
848,33 ±617,56
865 ±171,67
BZM
(CD19+ CD23-)
5830,66 ±944,93
4962,66 ±770,14
4858 ±444,41
5941,66 ±1542,86
Macrófago
(CD19- CD11b+)
11796,67 ±1503,71
11650 ±710,51
10910,33 ±5738,67
13506,67 ±2151,01
CD4+
6272,66 ± 1742,93
66991 ±736,08
6553 ±613,22
7829 ±962,16
CD8+
2525,33 ±480,81
2339 ±587,59
2295,66 ±938,76
2093,33 ±265,93
CD25+
574,66 ±135,81
435 ±133,83
435,66 ±166,62
576,66 ±165,65
Razão
CD 25+/CD19(T reg/Ttotal)
5,5%
3,9%
4%
6,8% *
Razão
B1 / B2
11%
13%
15%
13%
Razão
CD8+/CD4+
40%
35% *
35% *
27% *
11796,67± 1503,71
11650± 710,51
10910,33± 5738,67
13506,67± 2151,01
Phagocytes
28
Histologia, imunohistoquímica e histometria
O tecido conjuntivo subcutâneo dos coxins plantares dos camundongos no grupo
tratado com Carcinosinum 6CH inoculados com o tumor de Ehrlich apresentaram
maior área de edema no corte histológico em relação ao grupo controle e ao grupo
sem tumor (Figura 8). Esse mesmo grupo apresentou maior incidência de necrose,
porém sem significância estatística.
A Tabela 3 mostra que o grupo tratado com MIX (Carcinosinum 6CH + 200CH)
apresentou o melhor resultado geral em relação ao controle, no que diz respeito à
interação do tumor com o tecido hospedeiro, sendo a menor incidência de necrose
(14%), embolia (43%) e invasão tumoral (56%), embora sem significância estatística.
Também não houve diferença estatisticamente significativa em relação à
positividade para citoqueratina e VEGF, porém animais tratados com Carcinosinum
6cH e 200cH apresentaram aumento no número de células positivas para Ki67 por
campo.
Figura 8 – Área de edema no coxim plantar de camundongos portadores de
tumor de Ehrlich na forma sólida inoculado há 10 dias, frente a diferentes tipos
de tratamento. Os valores representam a média da área clara, calculada
automaticamente em pixels x 104, pelo software Metamorph®. As barras de
erro representam o desvio padrão. *p= 0,01 Kruskal-Wallis/Dunn, em relação
ao grupo controle sem tumor
edema
*
40
30
20
10
co
nt
ro
ca
l
rc
in
os
in
um
ca
6c
rc
H
in
os
in
um
20
0c
ca
H
rc
in
os
in
um
M
IX
tu
m
or
0
no
area - pixels x 10
4
50
no tumor
control
carcinosinum 6cH
carcinosinum 200cH
carcinosinum MIX
29
Tabela 3 – Avaliação da positividade para marcadores tumorais identificados
por imunohistoquímica no tumor de Ehrlich, forma sólida, quantificada pela
intensidade média de pixels de cor marrom pelo software Metamorph®. Os
valores representam média ± desvio padrão e porcentagem. *p≤0,05; **p≤ 0,01
Kruskal-Wallis/Dunn, em relação ao grupo controle e MIX. CitoK =
citoqueratina
Controle
Escore de proporção
Carcinosinum Carcinosinum Carcinosinum
6CH
200CH
MIX
1,43±0,79
2,33±0,82
1,50±0,55
2,72±0,95
3/6 (50%)
5/6 (83%)
3/6 (50%)
1/7 (14%)
3/6 (50%)
5/6 (83%)
4/6 (66%)
3/7 (43%)
6/6 (100%)
6/6 (100%)
6/6 (100%)
4/7 (57%)
96,25±15,69
103,38±9,61
103,83±10,28
109,20±14,66
26,5±12,4
42,7±3,3**
31,4±8,3
30,8±5,5
120,6±9,1
114,8±13,8
114,8±3,3
114,8±7,8
0,56±0,727
2,91±1,66*
2,86±1,72*
1,33±1,65
115,6±8,0
106,7±6,8
130,2±13,5
113,5±8,2
tumoral (HE)
Necrose – incidência
(HE)
Embolia – incidência
(HE)
Invasão tumoral –
incidência (HE)
CASPASE 3 –
Intensidade em pixels
Edema – área em
pixels
CitoK – intensidade
em pixels
Ki67 – positivas por
campo
VEGF – intensidade
em pixels
A incidência de necrose foi proporcional ao tamanho do tumor presente no corte
histológico, exceto para o grupo MIX, que também apresentou relação inversa entre
a incidência de invasão tumoral nos tecidos adjacentes e o aumento no escore de
massa tumoral local (Tabela 3), indicando mudança no padrão de distribuição das
células tumorais.
30
Discussão
A homeopatia no tratamento de câncer tem seu papel e eficácia ainda pouco
estudados, embora a literatura sobre o assunto tenha crescido exponencialmente
nos últimos anos. Muitas vezes, a homeopatia é uma opção como adjuvante, no
intuito de melhorar a qualidade de vida, outras vezes, como tratamento único, como
se vê em algumas regiões da Índia (ROSTOK et al., 2011; BANERJI, BANERJI,
2012; ROSSI et al., 2014).
Existem diversos estudos in vivo e in vitro sobre a ação dos medicamentos
homeopáticos como agentes antitumorais (BISWAS, et al. 2005; SATO et al., 2005;
SUNILA et al a,b., 2007 a,b; FRENKEL et al., 2010; SAHA et al., 2014; MONDA,
PANIGRAHI, 2014, ARORA. TANDON, 2015; KHUDA-BUKHSH et al., 2015), mas
poucos focam a avaliação clínica dos animais associada a aspectos histológicos e
fisiopatológicos, o que evidencia um aspecto importante do presente trabalho. Um
dos poucos estudos que relatam a avaliação clínica utilizando o tumor de Ehrlich
como modelo mostra a ação da tintura de Boswellia serrata como medicamento,
considerando diferentes propriedades antitumorais, como redução da ascite em
89,89% dos animais no D14 de tratamento e redução do tumor sólido em 46,03%
dos animais também no D14, em comparação ao grupo controle (AGRAWAL, 2011),
além de outros efeitos sistêmicos, como atividade e clínica mais saudável, que
podem impactar na qualidade de vida.
Neste trabalho, a comparação entre Thuya, Conium e Carcinosinum permtiu
escolher qual dos três medicamentos seria o mais interessante para aprofundar o
estudo com tumor de Ehrlich, uma vez que parâmetros clínicos de alta prioridade
foram avaliados, dentre eles a sobrevida. Assim, o Carcinosinum foi o medicamento
escolhido, por apresentar melhor conjunto de benefícios clinicamente observáveis,
além de prolongar a sobrevida.
Esta fase do estudo foi particularmente elucidativa, pois revelou parâmetros ainda
não disponíveis na literatura. Pesquisas recentes in vitro demonstram o mecanismo
anti-neoplásico da Thuya occidentalis nas potências 6CH, 30c, 30CH e 200CH,
reportando a indução de apoptose por meio de mecanismos epigenéticos, com
maior expressão de p53 e diminuição de BCL-2. O tratamento de linhagens celulares
31
tumorais com Thuya occidentalis 30CH induziu aproximadamente 50% a mais de
morte celular em relação ao controle (MUKHERJEE et al, 2013). Contudo, não se
encontram menções sobre avaliações clínicas e/ou fisiopatológicas e sua correlação
com a sobrevida dos animais tratados. Também não encontramos na literatura
resultados que demonstrem aspectos clínicos e sistêmicos de animais tratados com
Conium maculatum 200CH, porém um estudo recente in vitro demonstra a ação
antitumoral do extrato (tintura mãe) de Conium, reduzindo a proliferação e
viabilidade celular e exercendo atividade bloqueadora do ciclo celular (fase G1) entre
24 e 48h de tratamento (MONDA et al, 2014; ARORA, et al, 2013). Em contrapartida,
nossos resultados apontam que camundongos tratados com Conium maculatum
200CH apresentam maior incidência de sintomas e piora da sobrevida. As
discrepâncias entre os resultados obtidos in vitro e in vivo reforçam a importância de
se estudar o impacto da resposta imune e do microambiente tumoral na atividade
dos medicamentos homeopáticos sobre tumores, conforme observado por SAHA et
al. (2013).
Há poucas pesquisas publicadas que tratam especificamente do uso exclusivo do
Carcinosinum em diversas potências, como fizemos aqui, o que mostra outro
aspecto inédito deste estudo. PREETHI et al.,2014, demonstraram que células
tratadas com Carcinosinum 200C aumentam a expressão do gene p53, um
importante gene que induz a apoptose em células que não são capazes de reparar
danos ao DNA, mas pouco se sabe sobre os efeitos do Carcinosinum in vivo.
Resultados similares já haviam sido descritos por SUNILA, et al., 2007.
Na primeira fase da pesquisa (screening), o grupo tratado com Carcinosinum 200CH
apresentou melhor resultado clínico e melhor sobrevida; por esse motivo, tal
medicamento foi escolhido como objeto de estudo na segunda fase. Nos animais
portadores de tumor ascítico, o tratamento com Carcinosinum 200cH levou ao
menor ganho de peso em relação aos demais grupos tratados. Embora sem
significância estatística, tal efeito pode estar relacionado ao desenvolvimento menos
intenso da ascite. Os efeitos do Carcinosinum 200CH sobre o tumor sólido não
foram tão expressivos, embora, também nesse caso, tenha havido melhora clínica.
Talvez o uso do Carcinosinum 200CH como terapia adjuvante à terapia
convencional, com o propósito de melhorar a qualidade de vida do paciente seja
uma alternativa interessante.
32
MACLAUGHLIN et al., 2006, observaram, em modelos in vivo e in vitro de câncer de
próstata, que diferentes resultados foram obtidos com Carcinosinum 1000cK, Thuya
occidentalis 1000cK, Conium maculatum 1000cK e Sabal serrulata 200CH. Nenhum
dos tratamentos afetou o peso dos animais, mas os melhores efeitos antitumorais
foram obtidos com Sabal serrulata 200CH, com redução de 38% do volume do tumor
(JONAS et al., 2006). FRENKEL et al., 2010, demonstraram que os efeitos
citotóxicos de Carcinosinum 30C e Phytolacca 200C em células de câncer de mama
foram semelhantes à atividade de 0,12µM de paclitaxel (Taxol), a droga mais
comumente usada como quimioterápico para câncer de mama.
Tais dados, tomados em conjunto, apontam para a importância da escolha das
potências e das associações medicamentosas para o sucesso da terapêutica
homeopática oncológica. Os resultados apresentados aqui corroboram essa
observação, tendo em vista a constatação de efeitos indesejáveis após o tratamento
com Carcinosinum 6cH, como o edema no local da inoculação do tumor, maior
incidência de piloereção e hipertermia. Além disso, observou-se aumento do número
de células tumorais positivas para Ki67 no tumor sólido.
O aumento no volume da pata inoculada após o 6º dia de inoculação pode ser
considerado reflexo, em nível macroscópico, do edema observado histologicamente,
uma vez que a área de tumor ocupada na derme não foi maior do que nos demais
grupos experimentais. Algumas causas fisiopatológicas do edema estão diretamente
ligadas ao câncer, como obstrução linfática neoplásica, inflamação e angiogênese
(HANAHAN; WEINBERG, 2011). De fato, o grupo tratado com Carcinosinum 6CH
também apresentou maior quantidade de tumor infiltrado na musculatura do coxim,
conforme observação histológica semiquantitativa. Esse resultado está diretamente
proporcional à positividade da citoqueratina, um marcador sensível à detecção de
células malignas de origem epitelial. A observação de efeitos adversos do
Carcinosinum em baixas potências (6CH) também é inédita, pois não se observam
relatos similares nos demais trabalhos da literatura sobre homeopatia e câncer.
Contudo, a análise semiquantitativa do tumor sólido em camundongos tratados com
a mistura do Carcinosinum 6CH e 200CH (MIX) revelou um perfil histológico
peculiar. Embora sem significância estatística, observou-se maior positividade para
Caspase 3 e menor incidência de necrose, embolia e invasão muscular. Houve,
33
ainda, também aumento da área tumoral na derme, o que pode sinalizar mudanças
na distribuição das células tumorais no tecido hospedeiro. Estudos futuros sobre a
expressão de receptores de proteínas de matriz e produção de metaloproteinases
pelas células tumorais em animais tratados com Carcinosinum em “acorde” de
potências podem dar luz aos possíveis mecanismos envolvidos. De qualquer forma,
esse dado indica a necessidade de se conhecer mais sobre a utilidade ou não do
uso de tais misturas (“acordes”) de potências homeopáticas em oncologia, bem
como de se determinar a combinação ideal entre elas. Dados anteriores obtidos pelo
nosso grupo apontam efeitos interessantes dessas preparações (acordes de
potências) na modulação do processo inflamatório peritoneal (PEDALINO et al.,
2004).
Paralelamente, os animais tratados com Carcinosinum MIX apresentaram mudanças
significativas nas populações de células esplênicas, com aumento da proporção de
células CD4+/CD8+ e aumento na população de células T CD25+ em relação ao
total de células T, as quais têm papel regulador ou expressam estado de ativação.
Sabe-se que Linfócitos CD8+ reconhecem moléculas de MHC classe I na superfície
das células tumorais e desenvolvem resposta citotóxica contra essas células, a partir
do estímulo modulatório de citocinas liberadas pelos linfócitos CD4+, como a IL-2.
Tais interações estabelecem uma relação estreita entre a resposta imune inata e
adaptativa, o que é fundamental para uma resposta antitumoral eficiente
(RODRIGUES, 2013).
O conjunto desses resultados mostra que, embora o tratamento homeopático com
carcinosinum não tenha sido capaz de promover mudanças robustas na quantidade
de células T no baço, há a indução de um desvio sutil, porém significante, no
fenótipo de tais células, com aumento na proporção de linfócitos T helper em relação
aos demais subtipos celulares. O aumento da população de CD25+ no grupo tratado
com carcinosinum MIX apresentou maior proporção de células em relação ao total
de células T, o que corrobora a ideia de regulação imunológica. Alterações no
balanço entre diferentes subtipos celulares em órgãos linfoides induzidas por
tratamento homeopático já foram demonstradas anteriormente pelo nosso grupo
(BONAMIN et al. 2013; SANTANA et al, 2014).
34
Não foram observadas alterações na positividade das células tumorais ao VEGF, em
nenhum dos tratamentos testados. O VEGF é expresso em uma variedade de
tumores humanos e animais e demonstra indução à angiogênese. Está diretamente
relacionado a características fundamentais dos tumores, tais como taxa de
crescimento, densidade de microvasos, arquitetura vascular e desenvolvimento
metastático de tumores (GOSH, et al. 2004). Um estudo que avaliou a ação antiangiogênica de curcumina e carboplatina no tumor de Ehrlich, sólido e ascítico,
demonstrou que todos os medicamentos reduziram significativamente a quantidade
de microvasos e os níveis de VEGF (EL-AZAB, et al. 2011). Não foram encontradas
na literatura pesquisas que demonstrassem resultados de avaliação de VEGF em
tumores utilizando os medicamentos desta pesquisa.
Em suma, o modelo experimental proposto mostra diferentes ferramentas
metodológicas úteis para o estudo e desenvolvimento da homeopatia oncológica e
também aponta para a importância da escolha das potências nos diferentes
tratamentos.
Conclusão
Dentre os medicamentos estudados, o Carcinosinum apresentou melhor resposta
clínica e imunológica, associada a mudanças qualitativas no microambiente tumoral,
sem, contudo, modificar o crescimento das células neoplásicas. Um aspecto
importante que emerge dos dados obtidos é a importância das potências
homeopáticas na evolução da relação tumor-hospedeiro, uma vez que se observam
claras mudanças qualitativas entre elas: a potência 6CH apresentou piora em todos
os parâmetros observados; a potência 200CH, por sua vez, mostrou benefícios
consistentes em relação à qualidade de vida do hospedeiro, e a mistura de ambas
as potências mostrou mudanças na relação das células tumorais com seu
microambiente e no balanço de subtipos de linfócitos T esplênicos. Tais resultados
abrem um vasto campo de investigações sobre os prováveis mecanismos envolvidos
e sobre a otimização do uso de tais medicamentos na oncologia prática como
terapia complementar aos agentes anti-neoplásicos clássicos.
35
Conflito de interesse
Não há conflitos de interesse para este estudo.
36
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39
ARTIGO 2
Efeitos do uso da Timulina 5cH no tumor de Ehrlich em camundongos: uma
abordagem experimental
Effects of Thymuliln 5cH on Ehrlich tumor in mice: an experimental approach
Running head: Homeopathic Thymulin in experimental oncology and tumor
immunity
Juliana Gimenez Amaral, Thayná Neves Cardoso, Aloísio Cunha de Carvalho, Luciane
Costa Dalboni, Luana Ramos, Silvio Leite Monteiro da Silva, Fabiana Rodrigues
Santana, Cideli de Paula Coelho, Louise Teixeira, Elizabeth Cristina Perez Hurtado,
Leoni Villano Bonamin
Abstract
The objective of this study was to describe different aspects related to the biology of
the Ehrlich tumor in mice, such as growth rate, histological organization and immune
response after treatment with Thymulin 5CH. Clinical aspects, macro and
microscopic investigation of the solid form of this tumor were made, in which
necrosis, emboli, tumor development were assessed together with quantitative
evaluation of apoptosis (Caspase 3), proliferation (Ki 67) and angiogenesis (VEGF),
using specific markers reveled by immunohistochemistry. The spleen cell populations
were studied by flow cytometry. Mice treated with Thymulin 5CH presented
modification in tumor micro-environment, such as reduction in the incidence of microemboli and increase in Caspase 3 positivity, showing bigger apoptotic activity of the
tumor cells, even though no reduction of tumor mass was observed. No changes in
systemic immune response were seen, since the balance of spleen cells populations
was unchanged. Further analyzes are needed to elucidate the mechanism of action
involved and the usefulness of homeopathy in oncology practice.
Keywords: Tumor Ehrlich ascites, high dilutions, homeopathy, Thymulin, tumor
immunology, experimental oncology.
40
ARTIGO 2
Efeitos do uso da Timulina 5cH no tumor de Ehrlich em camundongos: uma
abordagem experimental
Juliana Gimenez Amaral, Thayná Neves Cardoso, Aloísio Cunha de Carvalho, Luciane
Costa Dalboni, Luana Ramos, Silvio Leite Monteiro da Silva, Fabiana Rodrigues
Santana, Cideli de Paula Coelho, Louise Teixeira, Elizabeth Cristina Perez Hurtado,
Leoni Villano Bonamin
O objetivo deste estudo foi descrever os diferentes aspectos relacionados com a
biologia do tumor de Ehrlich em camundongos, tais como taxa de crescimento,
organização histológica e resposta imune após o tratamento com timulina 5CH.
Aspectos clínicos e investigação macro e microscópico da forma sólida desse tumor
foram feitos. Necrose, êmbolos e desenvolvimento do tumor foram avaliados em
conjunto com a avaliação quantitativa da apoptose (Caspase 3), proliferação (Ki 67)
e angiogênese (VEGF), utilizando marcadores específicos por imunohistoquímica.
As populações de células do baço foram estudadas por citometria de fluxo. Os
camundongos tratados com timulina 5CH apresentaram modificação no
microambiente do tumor, tais como redução da incidência de microêmbolos e
aumento da caspase 3, mostrando maior atividade apoptótica das células tumorais,
embora não se tenha observado qualquer redução da massa do tumor. Não
ocorreram alterações na resposta imune sistêmica, uma vez que o equilíbrio da
população de células do baço não foi alterada. Análises adicionais são necessárias
para elucidar o mecanismo de ação envolvendo a utilidade da homeopatia na prática
oncológica.
Palavras-chave: Tumor ascite Ehrlich, altas diluições, homeopatia, timulina,
imunologia tumor, oncologia experimental.
41
Introdução
O perfil epidemiológico do câncer tem caracterizado essa doença como um
problema de saúde pública no Brasil, o que exige das instituições em geral e de
todas as esferas de governo a criação de novas estratégias de prevenção e controle
de tal patologia . A mudança rápida e crescente do perfil sociodemográfico da
população em geral tem colaborado para o aumento considerável do câncer, visto
que fatores de risco como o envelhecimento e os maus hábitos de vida em geral
estão cada vez mais presentes no nosso dia a dia. (INCA, 2014)
A Organização Mundial de saúde (OMS) relatou que, em 2012, houve 14,1 milhões
de casos novos de câncer em todo o mundo, levando a óbito 8,2 milhões de
pessoas (INCA, 2014). O câncer vem associado a outras problemáticas, como custo
do tratamento, mutilações, terapias que impactam diretamente na qualidade de vida
do paciente e família, além de desesperança.
Os tratamentos atuais no combate ao câncer causam efeitos adversos e sequelas
que impactam negativamente na vida do indivíduo doente. Os pacientes têm
buscado cada vez mais outras alternativas de tratamento, como a homeopatia.
Ervas, minerais, vitaminas e medicações homeopáticas, consideradas terapias
complementares, tem sido cada vez mais usadas no regime terapêutico contra o
câncer. (FRENKEL, 2010)
Teixeira (2008) relata que há a possibilidade de adaptação dos protocolos de
pesquisa
clínica
convencional
ao
modelo
homeopático.
Assim,
modelos
experimentais in vivo e in vitro têm sido realizados na pesquisa básica sobre
homeopatia nos últimos anos. Poucos estudos estão relacionados à ação dos
medicamentos homeopáticos e câncer, porém observa-se o crescimento de
pesquisas na busca de respostas sobre a ação de tais medicamentos (BONAMIN,
ENDLER, 2010; BELLAVITE et al., 2014; BONAMIN et al., 2015; SAHA et al., 2014;
SAHA et al. 2015a; SAHA et al., 2015b; ARORA et al., 2013; ARORA; TANDON,
2015), o que incita ainda mais a discussão para o papel da homeopatia na prática
oncológica (FRENKEL, 2015).
A timulina é um peptídeo endócrino, diretamente ligada da diferenciação de células
T. Foi descoberta em 1970, como um nonapeptídeo zinco-dependente produzido
42
pelas células epiteliais do timo e de importante papel na maturação de células T
(DARDENNE, 2009). É obtida a partir de lisado ácido do timo de vitelo e atua sobre
as células T, B e NK, modulando a proliferação e diferenciação das células
progenitoras da medula óssea (GARRITANO, 2007). O extrato tímico é capaz de
modular a produção, maturação e ativação de linfócitos T e macrófagos, agentes
importantes nas respostas imunes. (LENGYEL G, FEHER J. 1994.)
Nas células maduras, o extrato tímico aumenta o número e a função dos linfócitos
T4, a produção de anticorpos, a reatividade aos mitógenos, a competência de
linfócitos T para participar de culturas mistas, o efeito “killer” contra as células
tumorais, a secreção de interleucinas pelos linfócitos T e o desenvolvimento da
imunidade celular (GARRITANO, 2007). Porém, há poucos estudos sobre a ação
imunomoduladora da timulina preparada homeopaticamente em tumores (TOLEDO,
2005).
O tumor de Ehrlich utilizado nesta pesquisa é uma neoplasia maligna, experimental
e transplantável, descoberta em 1886 e descrita em 1905 por Paul Ehrlich como um
carcinoma mamário de camundongos fêmeas. Esse tumor desenvolve forma
ascética, quando inoculado no peritônio, e forma sólida, quando inoculado no tecido
subcutâneo (EHRLICH, 1906). Nesse caso, vários são os fatores que influenciam o
crescimento tumoral. Por exemplo, a quantidade de capilares no tumor de Ehrlich na
forma sólida é regulada pela glutamina e pela secreção do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF) pelas próprias células tumorais, o que influencia o
crescimento do tumor sólido (SILVA, 2006; GHOSH et al, 2004). O tumor de Ehrlich
também tem sido utilizado como modelo para a elucidação dos mecanismos dos
medicamentos homeopáticos nos tumores (SAHA et al., 2013).
43
Objetivo
Objetivo geral
O objetivo deste trabalho, portanto, é descrever diferentes aspectos relacionados à
biologia do tumor de Ehrlich frente ao tratamento com Timulina 5CH (preparada
homeopaticamente).
Objetivo específico
Estudo macro e microscópico do tumor na forma sólida em camundongos tratados
com Timulina 5CH, considerando-se o crescimento, a organização histológica e a
resposta imune sistêmica.
Métodos
Animais
Foram utilizados 18 camundongos da linhagem BALB/c, machos, adultos, mantidos
em microisoladores (Techniplast®) no biotério de Experimentação animal – SPF do
Centro de Pesquisa da UNIP (Campus Indianópolis), com água e ração ad libitum,
controle de temperatura (22±2oC), umidade (55-65%), trocas de ar (75/hora) e ciclos
claro e escuro 12/12horas.
Ética
Esta pesquisa foi aprovada e certificada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Paulista em 17/04/2013 sob o protocolo n. 158/2013 – CEP/ICS/UNIP
(Anexo 1).
O desenho experimental foi planejado para atender aos requisitos de bem-estar
animal e ao conceito dos 3 Rs (reduction, replacement, refinament). Assim, outros
estudos foram executados em paralelo pelo mesmo período (aprovados pelo Comitê
de Ética em protocolos específicos) e utilizaram o mesmo grupo controle, atendendo
às diretrizes brasileiras de ética em experimentação animal. O experimento foi
realizado com tumor na forma sólida para possibilitar ampla avaliação de parâmetros
44
complementares a partir do mesmo material tumoral, preparado histologicamente,
evitando repetições e eutanásias desnecessárias.
Modelo experimental
Preparo das células tumorais para inoculação
O tumor de Ehrlich é mantido no laboratório por meio de repiques semanais em
camundongos, por via intraperitoneal.
Para a inoculação do tumor, foi feita a punção abdominal de um camundongo
portador com 7 a 10 dias de inoculação, e 2 a 3 mL de fluído ascítico foram retirados
e transferidos para um tubo Falcon. O líquido foi centrifugado a 1500rpm por 5
minutos e as células depositadas (pellet) foram ressuspensas em 2 mL de PBS e
homogenizadas para nova centrifugação. Esse processo foi repetido por 3 vezes
para a completa lavagem das células. A suspensão final foi mantida em gelo durante
a contagem, feita pelo método Azul de Tripam 0,1% (GIBCO). Assim, as células
foram diluídas na proporção 1:100 para observação em câmara de Neubauer
(HAUSSER SCIENTIFIC) e contagem subsequente, utilizando os quadrantes laterais
de leucócitos.
Inoculação do tumor de Ehrlich
Foi inoculado 0,05 mL da suspensão no tecido subcutâneo do coxim plantar
esquerdo, contendo 105 células, para obtenção do tumor na forma sólida. A partir
desse volume, foi possível observar o crescimento tumoral dia a dia, sem a
necessidade de eutanásia e sem causar desconforto excessivo para o animal. O
prazo de 10 dias foi escolhido como “end-point” para que os resultados fossem
analisados antes da piora clínica.
Preparação dos medicamentos
A Timulina 5CH foi preparada a partir da solução em estoque (4CH), cedida pelo
laboratório Boiron Brasil®. De acordo com o fabricante, essa solução foi preparada a
partir do peptídeo sintético, livre de zinco (fator tímico soro, peso molecular =
858,85), com pureza declarada de 98,66%.
45
A última diluição (5CH) foi feita no próprio laboratório, semanalmente. Assim, 10mL
de água ultra-pura (MilliQ) foram usados para diluir 100µL de timulina 4CH, em
frasco âmbar. A sucussão dos frascos foi feita de forma automatizada em braço
mecânico Autic®, seguindo as normativas descritas na Farmacopeia Homeopática
Brasileira, 3ª edição (ANVISA, 2011). Entende-se como CH a diluição centesimal da
substância original em solução hidroalcóolica 70%. O número de passagens
corresponde às “potências homeopáticas”, conforme nomenclatura específica da
área.
O medicamento e os controles foram codificados por um funcionário não envolvido
com a execução dos experimentos, para que se pudesse trabalhar em dupla
ocultação ao longo de todo o estudo, e abertos após a análise estatística.
Delineamento experimental
Avaliação clínica, resposta imune e expressão de marcadores tumorais do
tumor de Ehrlich na forma sólida após tratamento com Timulina 5CH
Utilizamos três grupos, sendo um grupo com 5 animais (sem tumor), um com 6
animais (Timulina 5CH) e um com 7 animais (controle tratado com veículo). Os
animais sem tumor serviram de base para as avaliações clínicas. Os outros dois
grupos foram usados para as avaliações imunológicas e anatomopatológicas. Os
animais eram provenientes do biotério da FMVZ-USP (Universidade de São Paulo),
assim divididos em gaiolas. Optamos por mantê-los nos mesmos grupos, evitando o
estresse por competição dos animais.
Após 24h de inoculação do tumor, os camundongos receberam doses de 10μL de
medicamento / 10g de peso vivo/animal/dia, ao longo de 10 dias. As características
clínicas de cada animal também foram observadas, conforme critérios do Apêndice
1. Os animais tiveram seus coxins plantares medidos antes da inoculação do tumor
na forma sólida e todos os dias, durante 10 dias, utilizando um micrômetro (Mitutoyo
® IP65, Japan).
Colheita de material para histopatologia e citometria de fluxo
Após 10 dias de inoculação do tumor sólido no coxim plantar, todos os animais
foram eutanasiados. Para a eutanásia, os animais foram sedados profundamente
46
com 0,1 mL de mistura ketamina - xilazina na proporção 2:1 para cada 10g de peso
vivo (equivalente às doses de 20 mg/10g peso vivo de Xilazina e 10 mg/10g de peso
vivo de Ketamina), até a interrupção dos sinais vitais. Em seguida, foi realizado o
deslocamento cervical para garantir a morte dos mesmos antes de se realizar
qualquer procedimento de necropsia.
Foram colhidos fragmentos histológicos da lesão tumoral para o exame
histopatológico,
sendo
fixados
em
paraformaldeído
8%,
para
preservação
antigênica. Em seguida, foram encaminhados para a inclusão em parafina,
microtomia
e
montagem
dos
cortes
em
lâminas
silanizadas
(para
a
imunohistoquímica) ou lâminas convencionais (para coloração por hematoxilinaeosina - HE).
Para a citometria de fluxo, um fragmento central do baço foi colocado numa placa de
Petri plástica com uma gota de PBS-SFB 1%. As células foram ressuspensas com o
auxílio do êmbolo de uma seringa e transferidas para um tubo Falcon, sendo
mantidas em gelo até o processamento final. Para que a quantidade de células fosse
suficiente para garantir uma leitura representativa ao citômetro, cada tubo continha
um pool de suspensão celular obtidas de dois camundongos do mesmo grupo.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo das células do baço foi utilizada para a quantificação de
linfócitos T (CD4+, CD8+ e CD25+), linfócitos B1, linfócitos B2, linfócitos B da Zona
Marginal (BZM) e macrófagos, conforme descrito no Quadro 1.
Quadro 1 – Células quantificadas por citometria de fluxo
CÉLULAS
MARCADORES
Linfócitos B1
CD19+ CD23- CD11b+
Linfócitos B2
CD19+ CD23+ CD11b-
Macrófago
CD19- CD23- CD11b+
Linfócitos T
CD19- CD4+ ou CD19- CD8+
Linfócitos Treg ou T ativados
CD19- CD25+
Linfócitos B de zona marginal
CD19+ CD23- CD11b-
47
Os tubos foram centrifugados em centrífuga refrigerada a 2000rpm / 5 minutos,
sendo o sobrenadante descartado. Assim, 2mL de tampão hemolítico foram usados
para lavagem das células, sendo as mesmas incubadas por 2 minutos antes de
serem submetidas a nova centrifugação. Em seguida, as células foram contadas em
câmara de Neubauer (HAUSSER SCIENTIFIC) pelo método do azul de Tripam 0,1%
(GIBCO), sendo utilizados os quadrantes laterais de leucócitos.
Posteriormente, 10 µl de anti-CD16/32 foram adicionados a 990 µl de PBS-BSA 1%
para preparo da solução bloqueadora, sendo que 10 µl da mesma foram acrescidos
à amostra, incubada a 4oC por 30 minutos. Após nova lavagem em PBS, o conteúdo
de cada tubo foi transferido para 3 microtubos em um volume contendo 10 6 células
por microtubo. Um microtubo foi designado como sem marcar, um microtubo como
combo 1 (linfócitos B) e o terceiro microtubo foi designado como combo 2 (linfócitos
T). Uma sequência adicional de amostras foi separada para a marcação simples,
com cada um dos marcadores, para a compensação da positividade das amostras
no citômetro. Para cada 106 células, foram adicionados 20 microlitros de anticorpo
específico em concentração de 1%, seguido de incubação a 4oC por 40 minutos,
conforme Quadro 2.
Quadro 2 – Marcadores utilizados para análise de células do baço de
camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida por citometria
de fluxo
Combo 1 CD 23 FITC
Combo 2 CD25 AF488
CD 5 PE
CD 4 PE
CD 19 PE Cy 5:5
CD 19 PE Cy 5:5
CD 11b PB
CD8 AF 405
Após a incubação, as células foram lavadas em PBS, centrifugadas, ressuspensas
em 100 µl de PBS-BSA 1% com 400 µl de paraformaldeído 1%, para fixação. As
amostras foram mantidas a 4oC e embaladas em papel alumínio por até 48 horas
antes da contagem no citômetro CANTO (BD). Os dados foram processados no
software Flow Jo 7.6.5 para identificação dos “gates” para linfócitos T, B e seus
subtipos, conforme mencionado em Amaral et al. (2015), neste volume.
48
Imunohistoquímica e histometria
Imunohistoquímica indireta
Cortes de 5 μm de coxim plantar incluídos em parafina foram montados em lâminas
silanizadas. Os cortes foram desparafinizados, reidratados e submetidos ao
desmascaramento antigênico em tampão citrato durante 20 minutos, em panela
elétrica (PANASONIC). Após o resfriamento, os cortes foram submetidos ao
bloqueio da peroxidase endógena em solução de H2O2 3 a 5% em metanol, durante
5 minutos. Os cortes foram lavados por três vezes e os sítios de adsorção
inespecíficos, bloqueados com soro normal de equino 2,5% (VECTOR®), durante 30
minutos. Posteriormente, os cortes foram incubados com anticorpos monoclonais em
diferentes diluições, overnight e a 4oC em câmera úmida (Quadro 3). Em seguida,
as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário ligado a polímero e
peroxidase (Kit Impress Universal VECTOR®) durante 30 minutos, em temperatura
ambiente. As células positivas foram evidenciadas após a coloração com DAB.
Realizamos controles negativos de todas as reações, utilizando o diluente dos
anticorpos (DAKO).
Quadro 3 – Anticorpos utilizados na imunohistoquímica indireta
Anticorpo
Finalidade
Alvo
Molecular
Espécie
doadora
Clone
Diluição
Marca
VEGF
Angiogênese
Fator de
crescimento
Rato
VG-1
monoclonal
1:200
abcam®
Ki 67
Proliferação
celular
Proteína
nuclear e
citoplasmática
Rato
Policlonal
1:1000
abcam®
Caspase
3
Apoptose
Proteína
citoplasmática
Coelho
Policlonal
40µg/mL
abcam®
Cito K
Marcador de
células
epiteliais
Proteína
citoplasmática
Rato
Krt1-19
1:50
Serotec®
Avaliação semiquantitativa
As lâminas coradas em HE contendo cortes de coxim plantar foram observadas em
microscópio NIKON Eclipse 200 e avaliadas quanto ao tamanho do tumor (Figura
1). Para cada lâmina, todo o corte foi rastreado e avaliado, utilizando objetiva de 4x.
Um sistema de escores foi aplicado, conforme Quadro 4.
49
Quadro 4 – Escore de quantificação de tumor no coxim plantar
Escore 0
Sem tumor
escore 1
escore 2
escore 3
1 a 20% da área do corte do coxim com tumor
20 a 50% de área do corte do coxim com tumor
mais que 50% de área do corte do coxim com tumor
Figura 1 – Fotomicrografias de tecidos de coxim plantar com tumor sólido de
Ehrlich, corados pelo método hematoxilina-eosina (HE), utilizadas para
quantificar o turmor seguindo escores pré determinados. Objetiva: 4x
Avaliação quantitativa
Incidências de parâmetros histopatológicos
Foi realizada a avaliação quantitativa da incidência de diferentes parâmetros
tumorais por contagem macroscópica visual, em microscópio Nikon Eclipse 200,
utilizando as objetivas de 40x e 100x (imersão). Considerou-se a presença ou não
de necrose, invasão tumoral e microembolia para cada corte de coxim plantar
corado por HE.
50
Histometria
Foram feitas entre 4 e 10 fotomicrografias da área correspondente ao tecido tumoral,
no coxim, de forma a cobrir todos os campos microscópicos relativos ao tumor,
utilizando a objetiva de 40x em microscópio Nikon Eclipse 200 acoplado a uma
câmera digital Coolpix com um monitor LCD. A positividade para Citoqueratina,
Caspase 3 e VEGF (Figura 2), marcada em castanho pelo DAB, foi calculada
automaticamente, em pixels, usando o software Metamorph®. O software foi
calibrado com filtros de cor digitais, com regulação de bits vermelhos, verdes e
azuis, de tal maneira que só foram incluídas células positivas, sendo a coloração de
fundo excluída. Nesse caso, levou-se em consideração a intensidade média da
coloração marrom presente em cada campo analisado. O número de células
positivas por campo para Ki 67 foi calculado pela contagem visual das mesmas,
levando-se em conta apenas as células que apresentaram positividade nuclear
(Figura 2).
O edema do coxim plantar foi quantificado a partir dos cortes corados em HE. A
área de tecido dissociado (edema) foi calculada automaticamente, em pixels,
analisando a área clara pelo software Metamorph® (Figura 3).
Análise Estatística
O Teste “t” de Student e Mann-Whitney foram utilizados para a avaliação de
parâmetros histológicos (em pixels ou escores), segundo a homocedasticidade das
variáveis, definida pelo teste de Bartlett. Os dados da citometria de fluxo foram
avaliados pelo teste de Mann-Whitney. Para a análise dos dados semiquantitativos
(incidências), foi usado o teste exato de Fisher. A ANOVA de 2 vias foi usada para
avaliação de parâmetros evolutivos em função do tempo. Para todos os casos, os
valores de p≤0.05 foram considerados estatisticamente significantes.
51
Figura 2 – Fotomicrografia de tecidos de pata e linfonodo com tumor sólido de
Ehrlich, utilizadas para avaliação de positividade de VEGF, Caspase 3, CitoK e
Ki67, usando o software Metamorph®. Objetiva de 40x (Imagens
compartilhadas em AMARAL et al., 2015, neste volume)
Figura 3 – Fotomicrografias de coxim plantar com tumor sólido de Ehrlich
corado por HE, utilizadas para avaliar a área de edema no software
Metamorph®. Objetivas: 4x e 40x
52
Resultados
Parâmetros clínicos
O consumo de água e comida, a evolução da temperatura da pele e o ganho de
peso corporal não apresentaram significância estatística ao longo do período de
observação, tampouco o crescimento tumoral, avaliado macro e microscopicamente
(Tabela 1, Figuras 4, 5, 6, 7,8).
Tabela 1 – Escore de avaliação de crescimento tumoral no tecido subcutâneo
do coxim plantar ao final do período de 10 dias. Dados expressos em média e
desvio padrão. Teste “t” de Student, sem significância estatística
CONTROLE
TIMULINA
5cH
1,43 ± 0,786
0,83 ± 0,983
Figura 4 – Evolução macroscópica do crescimento tumoral em função do
tempo, representado pela espessura da pata inoculada com tumor de Ehrlich
(em mm). Valores representam média e desvio padrão. ANOVA de 2 vias, sem
significância estatística e sem interação tratamento x tempo
crescimento tumoral - macroscopico
2.2
controle sem tumor
controle - veículo
timulina 5CH
mm
2.0
1.8
Dias
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
1.6
53
Figura 5 – Evolução do peso corpóreo, em função do tempo (em gramas), de
animais inoculados com tumor de Ehrlich (em mm) no coxim plantar. Valores
representam média e desvio padrão. ANOVA de 2 vias, sem significância
estatística e sem interação tratamento x tempo
Figura 6 – Evolução da temperatura corpórea, em função do tempo (em
gramas), de animais inoculados com tumor de Ehrlich (em mm) no coxim
plantar. Valores representam média e desvio padrão. ANOVA de 2 vias, sem
significância estatística e sem interação tratamento x tempo
Evolução da temperatura
42
controle sem tumor
controle - veículo
timulina 5CH
38
36
Days
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
34
1
Celsius
40
54
Figura 7 – Evolução do consumo de ração por gaiola (grupo), em função do
tempo (em gramas), de animais inoculados com tumor de Ehrlich (em mm) no
coxim plantar. Valores representam a média
consumo ração
Gramas (g)
8
controle sem tumor
controle - veículo
timulina 5CH
6
4
2
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Dias
Figura 8 – Evolução do consumo de água por gaiola (grupo), em função do
tempo (em mL), de animais inoculados com tumor de Ehrlich (em mm) no
coxim plantar. Valores representam a média
consumo agua
10
controle sem tumor
controle - veículo
timulina 5CH
8
mL
6
4
2
Dias
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
55
Citometria de fluxo
Na citometria de fluxo, foram analisadas as células do baço em suspensão, para a
quantificação das células positivas para CD4, CD8 e CD25 (linfócitos T), linfócitos
B1, B2, BZM (linfócito B da Zona Marginal), macrófagos, total de células T e B e
respectivas proporções, calculado pela razão entre as médias dos diferentes tipos
celulares (Figura 5).
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos para nenhum dos
subtipos celulares, considerando-se a concentração de células esplênicas em
suspensão, em percentual e a razão entre eles (Tabela 2).
Histologia, imunohistoquímica e histometria
O grupo tratado com Timulina 5CH apresentou menor incidência de embolia
(p=0,01) e maior índice de positividade (intensidade em pixels) para Caspase 3
(p=0,05), de forma estatisticamente significante. A expressão de citoqueratina
também foi reduzida (p=0,03), embora a redução do escore tumoral não tenha
apresentado significância estatística (Tabela 1). Os demais parâmetros também não
apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos (Tabela 3).
Os dados tomados em conjunto mostram que o tratamento com timulina 5CH não foi
capaz de reverter vários parâmetros importantes relacionados à resposta imune
sistêmica e aos aspectos clínicos. Contudo, a avaliação histopatológica do
microambiente tumoral revelou diminuição da incidência de microembolias e da
positividade para citoqueratina (expressa por células tumorais), acompanhada de
aumento no índice de positividade para Caspase 3.
56
Tabela 2 – Porcentagem de células positivas para cada marcador específico
nos “gates” selecionados a partir da citometria de fluxo do baço de
camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida durante 10 dias.
Os valores representam média ± desvio padrão. A razão foi calculada pela
divisão simples das médias. Mann-Whitney e Fisher. BZM = linfócitos B de
Zona Marginal
Subtipos
celulares
Controle
Timulina 5CH
53,43 ± 5,59
50,00 ± 5,93
Linfócitos T
totais (CD19-)
46,46 ± 5,598
54,40 ± 0,424
Linfócitos B2
(CD19+ CD23+)
50,50 ± 7,98
56,95 ± 14,35
Linfócitos B1
(C19+ CD23-)
6,01 ± 2,12
5,39 ± 0,12
Linfócitos BZM
51,43± 2,30
41,70 ± 13,71
Macrófagos
43,10 ± 5,48
44,45 ± 6,43
CD4+
63,93 ± 4,74
60,05 ± 3,04
CD8+
18,66 ± 2,65
21,40 ± 0,14
CD25+
8,93 ± 0,84
6,89 ± 0,66
0,19
0,12
0,12
0,09
Razão
CD8+/CD4+
0,19
0,35
Phagocytes/
Leucócitos
totais
0,57
0,66
Leucócitos
Btotais
Razão
CD 25+/CD19(T reg/Ttotal)
Razão
B1 / B2
57
Figura 5 – Histograma e dot plot das populações de subtipos linfocitários
esplênicos nos diferentes grupos, quantificadas por citometria de fluxo
58
Tabela 3 – Avaliação de parâmetros morfológicos evidenciados em cortes
corados por HE e da positividade para marcadores tumorais identificados por
imunohistoquímica no tumor de Ehrlich, forma sólida, quantificada pela
intensidade média de pixels de cor marrom pelo software Metamorph®. Os
valores representam média ± desvio padrão ou porcentagem. * p= 0,01 teste
exato de Fisher. ** p=0,05 teste “t” de Student. # p=0,03, Mann-Whitney,
U=6.000, em relação ao controle. CitoK= citoqueratina
Parâmetros
Necrose – incidência
(HE)
Embolia – incidência
(HE)
Invasão tumoral–
incidência (HE)
Edema –
área em pixels x 10
4
CASPASE 3 – intensidade
em pixels
CitoK – intensidade em
pixels
VEGF – intensidade em
pixels
Ki67 – positivas por campo
Controle
Timulina
3/6 (50%)
1/6 (16%)
5/6 (83%)
0/6 (0%) *
6/6 (100%)
5/6 (83%)
25,31 ± 12,76
23,43 ± 11,04
96,58 ± 2,91
108,78 ± 4,83 **
113,08 ± 18,07
95,60 ± 9,02 #
117,97 ± 3,10
111,19 ± 25,29
09/16
13/14
59
Discussão
A funcionalidade do sistema imune está diretamente ligada aos sistemas nervoso e
endócrino, constituindo um network homeostático integrado. O sistema imunológico
percebe, através de reconhecimento antigênico, uma imagem interna dos
componentes macromoleculares e celulares do corpo e reage a alterações dessa
imagem, efetivamente participando da homeostase do organismo (DARDENNE,
2009). Os linfócitos T são os responsáveis pela resposta celular, que envolve o
contato célula a célula com os diversos patógenos. Nesse caso, entram em ação os
linfócitos “helper” (CD4), supressores (CD8), citotóxicos (CD8), células T “killers”
(NKT) e células “natural killers” (NK), além de macrófagos e monócitos. Todo esse
processo de maturação é controlado pelos hormônios tímicos e seus produtos
celulares, como interleucinas e interferons (OHARA, 1996). A primeira referência da
importância do timo na resposta imune foi feita por White em 1949, sendo que
somente na década de 60 a timosina foi isolada (GARRITANO, 2007).
A timulina tem um papel fisiológico abrangente, que envolve mecanismos endócrinos
e parácrinos, como a maturação de células T, que pode ser realizada intra e
extratímica. Atividade de células NK, PMN, monócitos e a produção de interleucinas,
como IL 1, IL 6, TNF e PGE2, são moduladas pela timulina (MAZZOLI, 1974; LIN,
1989; BENEDIKT, 2000). O aumento da timulina sérica determina desvio da
resposta imune para o padrão celular Th1, em detrimento ao padrão celular Th2. Da
mesma forma, a falta de zinco determina desvio para resposta humoral, uma vez
que esse metal é um importante cofator da timulina. O controle da secreção de
timulina envolve a participação de fatores imunitários e extraimunitários, como
hormônios tireoidianos, de crescimento, prolactina, melatonina, zinco e outros
(NETO, 2007). Uma das primeiras pesquisas relacionadas à timulina foi realizada
por KALLEN (1986), em
que ratos tratados com ciclofosfamida tiveram a função
linfocitária T reestabelecida após tratamento com timulina.
A recuperação do balanço entre células T em pacientes portadores de câncer e
tratados com timulina foi descrita por GARRITANO, 2007. Nesse caso, o uso da
timulina foi capaz de restaurar os níveis das células T, equilibrar a relação entre as
subpopulações dos linfócitos CD4 e CD8, promovendo, assim, a recuperação da
competência imunológica. Dessa forma, os danos imunossupressores e colaterais
60
induzidos pela terapia antineoplásica foram reduzidos, não havendo necessidade de
interromper os ciclos desses tratamentos. A timulina não exibiu qualquer efeito
mutagênico e não mostrou qualquer toxicidade, mesmo quando usada em altas
concentrações.
Os dados da literatura sobre a timulina preparada homeopaticamente em modelos
murinos são escassos. SANTANA et al (2014), pesquisaram a modulação da
resposta inflamatória à leishmaniose cutânea murina pela timulina 5CH. Depois de
um aumento transitório das células T reg peritoneais, os camundongos tratados
apresentaram, cronicamente, aumento na percentagem de células B1 peritoniais no
baço e peritônio. BONAMIN et al. (2013) avaliaram a ação da timulina 5CH no
desenvolvimento do granuloma induzido por BCG, relatando o aumento de fagócitos
peritoneais derivados de células B1, sugerindo a ação da mesma na regulação dos
processos de diferenciação e migração das células progenitoras B1 para o sítio
inflamatório, facilitando a remissão infecção.
Ao contrário dos resultados obtidos anteriormente sobre a timulina 5cH em relação à
modulação da resposta imune sistêmica em processos infecciosos, mensurada por
citometria de fluxo (BONAMIN et al., 2013; SANTANA et al., 2014), o tratamento de
camundongos com tumor de Ehrlich na forma sólida com timulina 5cH não
apresentou diferenças significativas em relação ao controle. Tais discrepâncias
podem estar associadas à atividade imunossupressora de tumores malignos
(MANDAL et al., 2005; MANDAL; PODDAR, 2007), as quais poderiam anular
eventuais efeitos imunomoduladores da timulina homeopática.
Todavia, o tratamento com timulina 5CH pareceu exercer mudanças importantes no
microambiente tumoral, tais como redução na incidência de microembolias e
aumento na positividade à Caspase 3, denotando haver aumento na atividade próapoptótica tumoral. Em estudos anteriores, o uso da timulina homeopática 5CH em
associação à ciclofosfamida em animais portadores de tumor de Ehrlich na forma
sólida induziu metaplasia óssea na área ocupada pelo tumor, paralelamente à
regressão da massa tumoral (TOLEDO, 2005). Tais variações do microambiente
tumoral decorrentes do tratamento com timulina 5cH ainda são pouco esclarecidas e
merecem estudos futuros.
61
Os dados obtidos neste trabalho colaboram com a literatura recente sobre a ação de
medicamentos homeopáticos na biologia tumoral, em que modelos in vitro e in vivo
mostram diferentes aspectos do microambiente tumoral e do potencial indutor de
apoptose de tais preparações (SAHA et al. 2015a; SAHA et al., 2015b; ARORA et
al., 2013; ARORA; TANDON, 2015). A aplicação desses medicamentos na prática
oncológica, contudo, ainda está em discussão e incita mais estudos a respeito
(FRENKEL, 2015).
Conclusão
O tratamento de camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida com
timulina 5CH induziu modificações importantes no microambiente tumoral, como
redução na incidência de microembolias e aumento na positividade das células
tumorais à Caspase 3, denotando incremento na atividade pró-apoptótica do tumor.
Contudo, tal tratamento não parece modificar parâmetros de imunidade sistêmica,
nem tampouco evolução clínica. A aplicabilidade da timulina 5CH na prática
oncológica ainda está sob discussão.
Conflito de interesse
Não há conflitos de interesse para este estudo.
62
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http://www3.unip.br/ensino/pos_graduacao/strictosensu/med_veterinaria/download/m
edvet_ruggerozallaneto.swf
65
ANEXO 1
66
APÊNDICE 1
Modelo da ficha de avaliação clínica