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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 E 5 E MÉTODOS
DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS
Greice Japolla
Orientadora: Prof. Dr. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito
GOIÂNIA
2012
ii
GREICE JAPOLLA
HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 E 5 E MÉTODOS
DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS
Seminário apresentado junto à Disciplina
Seminários Aplicados do Programa de
Pós-Graduação em Ciência Animal da
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Nível: Mestrado.
Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de
Alimentos (SANHTA)
Linha de Pesquisa:
Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico
e controle das doenças infecciosas dos
animais
Orientadora:
Prof. Dr. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito – IPTSP/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza ICB/UFG
Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus ICB/UFG
GOIÂNIA
2012
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 3
2.1 Os herpesvírus ................................................................................................. 3
2.2 A estrutura dos vírions...................................................................................... 3
2.3 Replicação viral ................................................................................................ 5
2.4 Enfermidades causadas por BoHV- 1 e BoHV-5. ............................................ 7
2.5 Epidemiologia ................................................................................................... 8
2.6 Métodos diagnósticos ..................................................................................... 10
2.6.1 Isolamento viral ........................................................................................... 10
2.6.2 Testes sorológicos ...................................................................................... 12
2.6.2.1 Imunofluorescência (IF) ............................................................................ 13
2.6.2.2 Imunoperoxidase (IPX) ............................................................................. 14
2.6.2.3 Soroneutralização..................................................................................... 14
2.6.2.4 Ensaio imunoenzimático........................................................................... 16
2.6.3 Testes moleculares ..................................................................................... 17
2.6.3.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ................................................. 18
2.6.3.2 Análise de fragmento após restrição enzimática (REA) ........................... 21
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 23
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 24
iv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Micrografia eletrônica de partícula de herpesvírus e desenho
esquemático de um herpesvírus..............................................................................4
FIGURA 2- Ciclo replicativo dos herpesvírus..........................................................7
FIGURA 3- Efeito citopático causado pelo BoHV-1...............................................12
FIGURA 4- Ilustração da técnica de reação em cadeia da
polimerase
(PCR).....................................................................................................................19
FIGURA 5- Ilustração da análise de restrição do genoma do herpesvírus
bovino.....................................................................................................................21
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um grande produtor e exportador de carne bovina, sendo o
centro-oeste brasileiro a principal região detentora de rebanho bovino, com 34,4%
do efetivo nacional. O Estado de Goiás possui o quarto maior rebanho do País
com uma população bovina de, aproximadamente, 21 milhões de animais, cerca
de 10% do total do nacional (IBGE 2010). Estas posições são ameaçadas, pois o
rebanho bovino está exposto a agentes causadores de enfermidades que afetam
diretamente a sua produtividade, destacando-se desta forma a importância em
relação à sanidade dos animais.
Os principais microrganismos causadores de doenças nos bovinos são
bactérias, protozoários e vírus. No grupo dos vírus são encontrados os
herpesvírus causadores de diversas manifestações clínicas e consequentes
prejuízos para pecuária mundial. Estima-se que as perdas geradas por
enfermidades relacionadas aos herpesvírus alcancem um bilhão de dólares por
ano em todo o mundo (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010). Os herpesvírus
bovinos existentes são dos tipos: 1, 2, 4 e 5, sendo o primeiro e o último os mais
conhecidos e disseminados. Ambos pertencem a mesma família (Herpesviridae),
sub-família (Alphaherpesvirinae), gênero (Varicellovirus) e apresentam grande
similaridade molecular e antigênica. Uma das características desta família referese à capacidade de estabelecer infecções latentes (THIRY et al., 2005), ou seja, o
vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por
procedimentos
virológicos
usuais
podendo
ser
reativado
e
reexcretado
possibilitando a multiplicação viral.
Para um efetivo controle das enfermidades causadas por esses vírus é
necessário um correto diagnóstico dos mesmos, a fim de saber quais são os
animais e rebanhos positivos para se tomar as decisões adequadas de
prevenção. E também identificar os reais índices de prevalência e incidência do
rebanho, além de monitorar o status sanitário dos animais. Para isto, várias
técnicas de diagnóstico vêm sendo utilizadas, incluindo entre outras, testes de
isolamento
viral,
técnicas
sorológicas
como
soroneutralização
e
ensaio
imunoenzimático (ELISA), e técnicas moleculares como a reação em cadeia pela
polimerase (PCR) e a análise de fragmento após restrição enzimática.
2
Diante da importância em se estabelecer um diagnóstico correto, esta
revisão tem o objetivo de abordar os principais métodos diagnósticos laboratoriais
disponíveis para os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e herpesvírus bovino tipo
5 (BoHV-5), assim como ressaltar algumas características de estrutura,
replicação, epidemiologia de ambos os vírus e as enfermidades por eles
causadas.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Os herpesvírus
Os
herpesvírus
Herpesviridae,
que
se
fazem
divide
parte
em
três
da
ordem
Herpesvirales,
sub-famílias:
família
Alphaherpesvirinae,
Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, englobando vírus que ocorrem em
diversas espécies animais, como moluscos, peixes, anfíbios, répteis, pássaros e
mamíferos.
Diferente
das
outras
duas
sub-famílias,
os
alfaherpesvírus
apresentam um ciclo de replicação rápido e lítico tanto in vitro quanto in vivo, e
possuem capacidade de infectar células epiteliais e nervosas, estabelecendo
infecção latente em neurônios de gânglios do sistema nervoso (ROIZMAN et al.,
1992). Os membros da sub-família Betaherpesvirinae replicam lentamente,
também estabelecem latência e possuem poucos hospedeiros (ROIZMAN &
KNIPE, 2001). Já os vírus da subfamília Gammaherpesvirinae infectam linfócitos
de forma lítica ou latente e alguns deles possuem potencial oncogênico
Quatro são os herpesvírus que infectam bovinos, o herpesvírus bovino
(BoHV) tipo 1, BoHV-2, BoHV-4 e BoHV-5. Os tipos BoHV-1 e 5 pertencem ao
gênero Varicellovirus da sub-família Alphaherpesvirinae, o BoHV-2 pertence ao
gênero Simplexvirus, também um Alphaherpesvirus e é responsável pela mamilite
herpética bovina, o BoHV-4 pertence a subfamília Gammaherpesvirina, ao qual
ainda não foi atribuído ser causa de nenhuma patologia específica. Os dois tipos
de impacto na bovinocultura são os BoHV-1 e 5. O primeiro subdivide-se em
BoHV-1.1, BoHV-1.2a e BoHV-1.2b responsáveis pela rinotraqueíte infecciosa
bovina, aborto, vulvovaginite pustular infecciosa e balanopostite infecciosa; e o
segundo subdivide-se em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV-5na/nb e causam doenças
neurológicas (D’ARCE et al., 2002, OLIVEIRA, 2006).
2.2 A estrutura dos vírions
Os vírions dos herpesvírus consistem em um núcleo (ou core) que
contém o genoma viral contendo uma molécula de DNA de fita dupla linear; um
capsídeo que exibe uma simetria icosaédrica, um tegumento que recobre o
4
capsídeo e é composto por proteínas organizadas em quantidades variáveis e um
envelope lipoprotéico contendo espículas de glicoproteínas na sua superfície
(Figura 1). O diâmetro dos vírions varia entre 120 e 300 nm (ICTVDB
MANAGEMENT, 2006).
FIGURA 1: A- Micrografia eletrônica de partícula de herpesvírus. C) capsídeo; T)
tegumento; E) envelope; G) glicoproteínas. B- Desenho esquemático
de um herpesvírus. Fonte: Adaptado de ESTEVES, (2007); FRANCO
& ROEHE, (2007).
O envelope viral é uma camada lipídica composto por glicoproteínas,
conhecidas como gB, gC, gD, gE, gI, gH, gL, gG, gK e gM, na qual apresentam
diferentes funções na replicação e na interação vírus-célula (SCHWYZER;
ACKERMANN, 1996).
A gB e a gC são as principais glicoproteínas envolvidas no processo de
adsorção dos vírions à superfície das células hospedeiras. A gD é uma
glicoproteína essencial para a replicação viral e sugere-se que também esteja
envolvida na adsorção, penetração e fusão celular. A gC vem sendo estudada
para o desenvolvimento de testes diagnósticos, como a PCR e suas variações
(nested PCR e multiplex PCR) para a detecção de BoHV-1 ou diferenciação deste
do tipo 5. (ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005; CLAUS et al., 2007;
ESTEVES, 2007; SILVA, 2009). Há também estudos que utilizam a gC como
antígenos, produzindo anticorpos monoclonais diferenciais entre BoHV-1.1 e
BoHV-1.2, bem como provas tipo ELISA diferenciais entre BoHV-1.1 e 1.2 e
BoHV-1 e BoHV-5 (RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2005).
5
A gE desempenha um papel importante na neuroinvasividade e
neurovirulência no BoHV-5, ela tem sido alvo de deleção para a produção de
vacinas diferenciais tanto para o BoHV-1 quanto para o BoHV-5 (HÜBNER et al.,
2005). Através da clonagem e expressão de um fragmento da glicoproteína E do
BoHV-1 é possível a realização de testes com intuito de diferenciação sorológica
entre animais vacinados e animais infectados com o vírus de campo (OLIVEIRA,
2012).
Os capsídeos são formados por várias subunidades, chamadas de
capsômeros (FRANCO & ROEHE, 2007). O capsídeo é composto por apenas
cinco proteínas altamente conservadas (pUL19, pUL18, pUL38, pUL35 e pUL6)
(METTENLEITER et al., 2006).
O tegumento está localizado entre o envelope e o capsídeo é uma
substância amorfa, composto de proteínas em quantidade variáveis (ROIZMAN &
PELLET, 2001).
Estas proteínas possuem funções importantes na replicação
viral, como a ativação da transcrição dos genes alvos (proteína VP16 ou αTIF) e
na supressão da síntese protéica celular (VHS) (METTENLEITER et al., 2006).
O núcleo (ou core) de um vírion maduro contém o genoma viral
conjugado com algumas proteínas codificadas pelo vírus (FRANCO & ROEHE,
2007). O BoHV-5 possui 138.890pb e é maior que o genoma do BoHV-1,
apresentando uma composição G+C (guanina e citosina) de 75%. Já o BoHV-1
apresenta a composição de G+C de 72% e 135.872pb. O genoma de ambos os
vírus é constituído por uma molécula de DNA linear de dupla fita viral, pode ser
dividido em uma região longa (UL) e uma região curta (US) cercada por duas
regiões repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra terminal (TR)
(DELHON et al., 2003). O genoma codifica em torno de 70 proteínas, entre elas
as glicoproteínas inseridas no envelope viral que foram citadas.
2.3 Replicação viral
A
penetração
do vírus
na
célula hospedeira
e
consequente
multiplicação viral se iniciam com o encontro de receptores apropriados na
superfície das células com glicoproteínas do envelope viral (ROIZMAN &
MANDEL, 2005). A maioria dos herpesvírus, provavelmente, reconhece múltiplos
6
receptores celulares, qualquer um dos quais pode ser suficiente para a entrada na
célula (SPEAR & LONGNECKER, 2003). A partir de então, ocorrem as seguintes
fases: 1) adsorção; 2) penetração; 3) transporte do nucleocapsídeo e proteínas
virais contidas no tegumento ao núcleo das células infectadas; 4) transcrição,
replicação e síntese do DNA e proteínas virais; 5) montagem e preenchimento
dos capsídeos e 6) liberação da progênie infecciosa. Presume-se que ocorra de
forma semelhante para o BoHV-1 e 5 (ROIZMAN & KNIPE, 2001).
A adsorção ocorre quando há a interação do vírus com receptores da
membrana das células-alvo permitindo que ocorra uma fusão entre o envelope e a
membrana plasmática da célula, consequentemente ocorre uma invaginação e
perfuração da membrana, que é a penetração. A adsorção ativa um processo
mediado por glicoproteínas virais, onde pelo menos cinco glicoproteínas (gB, gD,
gH, gL e gK) estão envolvidas no processo de fusão e penetração do vírus. Após
a entrada dos virions no citoplasma das células, o envelope viral desliga-se
rapidamente da membrana plasmática e ocorre o transporte dos vírus
envelopados para os poros nucleares (WILD et al., 1998).
A transcrição do genoma viral se inicia logo após a sua penetração no
núcleo. O DNA viral é transcrito pela RNA polimerase II celular com o auxílio de
fatores celulares e virais. A síntese de proteínas virais é regulada de forma
precisa, pois a expressão de genes virais ocorre de forma coordenada. Os genes
virais são divididos em três grupos principais: genes alfa (immediate early ou de
transcrição imediata), beta (early ou iniciais) e gama (late ou tardios) (FRANCO &
ROEHE, 2007).
Para o inicio da expressão desses genes, é necessário que o fator
iniciador de transcrição dos gene α (α-TIF), uma proteína do tegumento, se
conjugue com fatores celulares para estimular a transcrição, cuja função principal
é ativar a transcrição dos genes β (TIKOO et. al., 1995). As proteínas beta estão
envolvidas na síntese de nucleotídeos trifosfato e na replicação do genoma. Os
genes gama somente são transcritos após a replicação do DNA e codificam
principalmente proteínas estruturais. Parte dessas proteínas penetra no núcleo e
forma pré-capsídeos, nos quais o genoma é introduzido. Os nucleocapsídeos
adquirem o envelope por brotamento através da membrana nuclear interna.
Podem perder o envelope ao atravessar a membrana nuclear externa e serem
reenvelopados no aparelho de Golgi, ou são enviados em vesículas até o Golgi.
7
Os vírions envelopados são transportados em vesículas do trans-Golgi até a
superfície celular, onde são liberados por exocitose (Figura 2) (FRANCO &
ROEHE, 2007).
FIGURA 2: Ciclo replicativo dos herpesvírus. Fonte: Adaptado de FRANCO &
ROEHE,2007.
2.4 Enfermidades causadas por BoHV- 1 e BoHV-5.
O BoHV-1 é um vírus que está associado a uma variedade de afecções
clínicas, incluindo rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) (GAY & BARNOUIN,
2009), vulvovaginite pustular infecciosa (IPV), balanopostite infecciosa dos
bovinos (IPB), conjuntivite e abortos, interferindo na reprodução do rebanho.
Também pode estar associado a desordens neurológicas (ENGELS &
8
ACKERMANN, 1996; ROIZMAN & PELLETT, 2001; HENZEL et al., 2008), relatos
recentes atribuem a ocorrência de encefalites à infecção por BoHV-1 e BoHV1.2b, sendo este último o menos patogênico (BATISTA et al., 2010), porém a
maioria das informações sobre enfermidade neurológica, são associadas apenas
com o tipo 5.
Amostras de BoHV-5 eram consideradas “variantes encefalitogênicas”
de BoHV-1, baseado nas amplas reações cruzadas entre estes dois vírus
encontradas em testes sorológicos, mas desde a década de 90 o BoHV-5 é
reconhecido como um agente distinto do BoHV-1 (ROIZAMANN et. al., 1992), que
possui tropismo por células do sistema nervoso central (SNC), causando doença
neurológica aguda (SANCHES et al. 2000), e também o causador
da
meningoencefalite e sinais neurológicos caracterizados por depressão profunda,
incoordenação, anorexia, ptialismo, tremores musculares, bruxismo, salivação,
opistótono, cegueira, e convulsões (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006).
2.5 Epidemiologia
Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção
pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes. Em relação ao
BoHV-5, infecções por este agente parece ser causa de morbidade e mortalidade
importante somente em países do hemisfério Sul, embora tenha sido descrita no
hemisfério Norte há muito tempo (D’ARCE et al., 2002; GUARINO et al., 2007;
FRANCO & ROEHE, 2007).
No Brasil o BoHV-1 foi isolado pela primeira vez a partir de um caso de
vulvovaginite no ano de 1978, no estado da Bahia. O BoHV-5 foi relatado
primeiramente em 1989 a partir da ocorrência de surtos de meningoencefalite no
Rio Grande do Sul, ambos os vírus vem sendo diagnosticados até nos dias de
hoje. Estudos vêm revelando uma elevada frequência de BoHV-5 no Rio Grande
do Sul (CAMPOS et al., 2009; HOLZ et al., 2009), embora ainda se desconheça a
sua real prevalência no Brasil, principalmente devido à reatividade sorológica
cruzada com BoHV-1.
No estado de Goiás, a primeira detecção de anticorpos para esses
vírus foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et al., 1989). Posteriormente estudos
9
foram realizados, apontando a presença de anticorpos para o BoHV-1 em soros
de animais de propriedades com problemas reprodutivos, incluindo rebanhos de
leite, corte e misto, e também animais antes do abate (VIERIA, 2003; AFFONSO,
2010). Em 2009, foi realizado o primeiro isolamento do BoHV-5 no estado (SILVA
et al., 2009). O primeiro estudo com amostras de Goiás a comprovar a presença
de ambos os vírus (BoHV-1 e BoHV-5), ocorreu em 2011, no qual a identificação
foi confirmada através da técnica de multiplex-PCR , em cérebros de bovinos
jovens que vieram a óbito com sinais neurológicos (SILVA, 2011).
Os bovinos são os hospedeiros naturais do BoHV-1 e 5, entretanto
anticorpos já foram encontrados em ovinos, caprinos e bubalinos de animais
infectados experimentalmente (DIEL et al., 2007).
Uma característica fundamental para a epidemiologia dos herpesvírus
é o estabelecimento da infecção latente. Bovinos com infecção latente são
reservatórios naturais de ambos os vírus e após a reativação viral, se tornam um
risco potencial de contaminação para os animais susceptíveis (SILVA, 2011). As
causas dos episódios de reativação permanecem parcialmente desconhecidas.
No entanto, alguns fatores desencadeantes são notórios, como o estresse (p. ex.:
induzido por transporte, desmame, descorne, parto, carências nutricionais graves
ou excesso de trabalho) e aplicação de drogas imunossupressoras (FRANCO &
ROEHE, 2007).
As infecções pelo BoHV-1 podem ser transmitidas pelo contato direto e
indireto entre animais, pois o vírus é disseminado através de secreções
respiratórias, oculares e genitais, sendo excretado em grandes quantidades por
animais durante a infecção aguda. Quando presente no sêmen de touros
infectados, pode ser disseminado tanto por monta natural como por inseminação
artificial (FRANCO & ROEHE, 2007). OLIVEIRA et al., (2011) encontraram
positividade em quase 50% de amostras de sêmen colhidas nos estados do Rio
Grande do Sul e de Goiás. O vírus também já foi encontrado em leite de vacas,
sendo esta mais uma possível fonte de infecção para bezerros (CAMPOS, 2009).
A transmissão do BoHV-5 provavelmente ocorra de modo semelhante
à do BoHV-1, ou seja, por contato direto ou indireto entre animais (RISSI, et al.,
2006).
10
2.6 Métodos diagnósticos
A diversidade dos sinais clínicos, bem como a semelhança destes
sinais com outras doenças infecciosas e parasitárias, não permite a elaboração
de um diagnóstico clínico conclusivo da infecção ocasionada pelo BoHV-1 ou
BoHV-5. Mesmo nos casos de vulvovaginite, onde as lesões são características, o
diagnóstico baseado no exame clínico é apenas presuntivo (TAKIUCHI et. al.,
2001). Assim sendo, o auxilio das técnicas laboratoriais são necessárias para
estabelecer um diagnóstico preciso. Nesta revisão os métodos diagnósticos
abordados serão divididos em isolamento viral, testes sorológicos e testes
moleculares.
2.6.1 Isolamento viral
O isolamento viral em cultivo celular é considerado o método de
diagnóstico etiológico padrão ouro. Para tanto, são utilizadas células de rim,
pulmão ou testículo bovino, células de pulmão fetal bovino, traquéia ou células de
linhagens estabelecidas, como a Madin-Darby Bovine kidney (MDBK) que são
células permissíveis ao vírus (TAKIUCHI et. al., 2001; OLIVEIRA, 2006).
Os vírus podem ser isolados de várias fontes: suabe de secreção
conjuntival, vaginal, nasal, lavado prepucial, e macerado de alguns órgãos de feto
abortado (fígado, baço, rim, pulmão, linfonodo, mucosa do trato respiratório e
tonsilas) (HOMAN & EASTERDAY, 1980), áreas com lesões evidentes; tecidos
(traquéia, pulmões), soro, sêmen e cérebro, dependendo dos sinais clínicos e do
vírus pesquisado.
Entre as vantagens destaca-se a universalidade (aplicável a quase
todos os vírus) e a obtenção do vírus viável para manutenção e posteriores
estudos. Porém o método possui desvantagens, é uma técnica laboriosa, com alto
custo e que necessita de correto acondicionamento das amostras por depender
de partículas virais viáveis. Além disto, o tempo necessário para obtenção dos
resultados pode levar alguns dias e os tecidos podem conter enzimas que são
tóxicas para o cultivo de células (FLORES, 1999; TAKIUCHI et. al., 2001).
11
Para realização da técnica o material a ser examinado (suspensão de
tecidos ou secreções) é inoculado em cultivos celulares apropriados, acompanhase por três a cinco dias para observação do efeito citopático (ECP) (Figura 3)
característico para confirmação do diagnóstico (SILVA, 2011). Em geral este ECP
é caracterizado por uma macrocitose e perda da morfologia celular, ficando as
células bastante arredondadas além de levar à destruição de outras em algumas
áreas (OLIVEIRA, 2006). Em cultivos celulares não existem diferenças
morfológicas entre os isolados de BoHV-1 e BoHV-5, ou seja, não é possível
determinar qual dos dois tipos de vírus esta presente na amostra. Da mesma
forma à diferenciação de amostra vacinal e amostra selvagem não é possível
determinar (ROEHE et al., 1997b).
Fragmentos do sistema nervoso central de bovinos com doença
neurológica em rebanhos brasileiros foram submetidos ao isolamento viral em
cultivo celular para detecção do BoHV-5, tendo resultados positivos em 39%
confirmado por técnicas moleculares, mostrando a distribuição deste vírus nos
estados do Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul
(CLAUS et al., 2007). No Rio Grande do Sul, BATISTA e colaboradores (2010),
identificaram através do isolamento viral, a presença do BoHV-1 em encéfalos de
bovinos submetidos ao diagnóstico de raiva.
KUNERT FILHO, 2011 realizou a técnica de isolamento viral em
encéfalos bovinos também submetidos ao diagnóstico de raiva, na busca do
BoHV-1 e 5 e todas as amostras foram negativas, porém as mesmas amostras
quando submetidas à amplificação por “nested PCR” tiveram positividade,
portanto estes resultados devem ser analisados com cautela, pois mesmo com
presença do genoma dos vírus não é possível afirmar que ambos os vírus são
causadores de encefalites devido a impossibilidade de isolar o vírus em forma
infecciosa.
Após a realização do isolamento, a identificação do agente viral pode
ser efetuada com o emprego de outras técnicas, como imunofluorescência (IF),
imunoperoxidase (IPX) e técnicas moleculares que quando utilizadas levam a um
resultado mais rápido (ROEHE et al., 1997b). Estas técnicas serão abordadas
posteriormente.
12
Figura 3: Efeito citopático causado pelo BoHV-1. Fonte: Arquivo Pessoal,
2012.
2.6.2 Testes sorológicos
Os testes sorológicos podem ser usados na pesquisa de antígenos
virais ou de anticorpos. Várias técnicas têm sido aplicadas para o diagnóstico do
herpesvírus bovino. Para detecção de antígenos podem ser usados anticorpos
monoclonais ou policlonais.
Anticorpos monoclonais (AcM) são anticorpos de especificidade única,
derivados de um único clone de células B e que respondem a um único epítopo.
Já os anticorpos policlonais detectam uma multiplicidade de epítopos,
reconhecendo antígenos diferentes (BECK, 2005). O uso de anticorpos policlonais
em testes diagnósticos efetua-se quando se pretende detectar mais do que uma
estirpe de um patógeno (RODRIGUES, 1998). A utilização de ambos anticorpos
tem sido uma alternativa empregada em várias áreas da saúde, sendo sua
aplicação cada vez mais comum e essencial em técnicas de diagnósticos e na
pesquisa.
13
2.6.2.1 Imunofluorescência (IF)
O diagnóstico rápido buscando a identificação de células contendo
antígenos virais em secreções ou tecidos pode ser obtido através das provas de
imunofluorescência. Estes testes dependem essencialmente do tipo de anticorpos
empregados para a detecção do antígeno. Se realizados com anticorpos
policlonais, provavelmente serão incapazes de diferenciar entre amostras de
BoHV-1 e BoHV-5. Contudo, se realizados com anticorpos monoclonais tipoespecíficos, poderão ser capazes de diferenciar entre estes vírus (ROEHE et al.,
1997a).
A imunofluorescência (IF) permite a visualização de antígenos nos
tecidos ou em suspensões celulares utilizando substâncias fluorescentes. A
técnica consiste em usar anticorpos (policlonal ou monoclonal) produzidos
especialmente contra o vírus desejado, conjugado a uma substância fluorescente.
Esse anticorpo conjugado (ou marcado), quando incubado com o antígeno, ligase especificamente. Ao ser exposto à luz ultravioleta, a substância fluorescente
emite luz (amarelo-esverdeada) que pode ser observada ao microscópio.
Portanto, quando há a presença de proteínas virais no material a ser examinado,
há a emissão de fluorescência (FLORES, 1999).
ALKAN
e
colaboradores
(2000)
apontaram
a
técnica
de
imunofluorescência como importante ferramenta para detectar o antígeno do
BoHV-1 em suabes. KUNRATH et al., 2004 detectaram antígenos virais do BoHV1 e BoHV-5 em secreções nasais de bezerros por imunofluorescência em células
descamativas e compararam o resultado com a técnica de isolamento viral, 89,6%
apresentaram resultados concordantes nos dois testes. Comparando-se com o
isolamento, a IF apresentou sensibilidade de 96,6%, especificidade de 70,9%, e
precisão de 89,6%. Esses resultados indicam que a detecção de antígenos em
células descamativas presentes em secreções nasais coletadas com swabs
representa uma alternativa para o diagnóstico de infecções agudas pelo BoHV-1 e
BoHV-5.
Além da especificidade, outra vantagem da técnica de IF é a rapidez de
obtenção dos resultados. Considerando-se a preparação das lâminas, fixação e
execução da técnica, o procedimento pode ser concluído em menos de duas
horas. Em situações de surto, em que um diagnóstico etiológico ágil é necessário
14
para direcionar as medidas a serem adotadas, esse método pode representar
uma alternativa rápida e segura de diagnóstico. No entanto o sucesso da técnica
depende da correta coleta e estocagem do material, apesar de não exigirem a
infecciosidade da partícula viral, é fundamental a integridade estrutural da
partícula e das proteínas virais. (TAKIUCHI et al., 2001; KUNRATH et al., 2004)
2.6.2.2 Imunoperoxidase (IPX)
É uma técnica de detecção de antígenos, que utiliza anticorpos
específicos conjugados com uma enzima. A presença do antígeno no material
suspeito é indicada pela mudança de coloração do substrato enzimático que é
adicionado no final da reação. A IPX pode ser adaptada para detecção de
antígenos em vários materiais, incluindo células de cultivo, células sanguíneas,
tecidos congelados e cortes histológicos parafinizados (FLORES, 1999).
Assim como na IF, a técnica de IPX, apesar de não exigir a
infecciosidade do vírus, podem ser seriamente comprometidas caso a integridade
estrutural da partícula não seja mantida, por falhas de transporte e estocagem
(TAKIUCHI et al., 2001).
A IPX é uma técnica bastante específica na detecção de antígenos
virais, principalmente quando se usa anticorpos monoclonais, permitindo a
caracterização do BoHV-1 e BoHV-5 (ROEHE et al., 1997a; D’ARCE et al., 2002;
SOUZA et al., 2002). Pesquisas utilizando esta técnica são pouco realizadas.
2.6.2.3 Soroneutralização
Uma forma para identificação da infecção é feita pela detecção de
anticorpos neutralizantes através da reação de soroneutralização (SN). O teste é
utilizado para detectar anticorpos que possuem a capacidade de neutralizar a
infectividade do vírus (anticorpos neutralizantes). Inicialmente, incuba-se o soroteste com o vírus (BoHV-1 ou BoHV-5). A mistura é adicionada a cultivos
celulares susceptíveis a replicação viral. O cultivo é então monitorado por três a
cinco dias. Se o soro possuir anticorpos, o vírus será neutralizado e não produzirá
efeito citopático nas células. Se o soro não possuir anticorpos, o vírus
15
permanecerá viável e causará citopatologia nas células de cultivo (FINO et al.,
2012).
A detecção de anticorpos no soro em um teste isolado indica somente
que o animal teve contato prévio com o agente, seja por infecção natural ou por
vacinação, possuindo significado limitado quando o objetivo é diagnosticar um
evento de doença clínica, sendo necessário, portanto duas coletas de soro: a
primeira durante a fase aguda e a segunda três a quatro semanas após. Um
aumento de quatro vezes no título de anticorpos entre as duas coletas é indicativo
da infecção e pode confirmar o diagnóstico (FRANCO & ROEHE, 2007).
Apesar de ser considerada uma técnica sorológica padrão, possui
algumas desvantagens por ser um teste laborioso, por não permitir distinção entre
o BoHV-1 e BoHV-5 em decorrência das reações cruzadas e por não permitir um
diagnóstico rápido (MÉDICI et al., 2000, CAMPOS et al., 2009).
Alguns autores pesquisaram métodos para a realização do teste de
soroneutralização utilizando anticorpos monoclonais no intuito de uma técnica
mais rápida e obtiveram sucesso nos resultados (KUNRATH et. al, 2004).
Outro aspecto a ser levado em consideração é o fato de existir vários
subtipos de vírus, tornando difícil a escolha de qual subtipo utilizar para realização
do teste. Com relação a este fato, estudos recentes comprovaram que existe
variação na detecção de soros positivos dependente da amostra viral utilizada,
podendo alterar a sensibilidade da técnica. Para a otimização da técnica HOLZ,
2008 realizou uma investigação constatando que a utilização de apenas um
subtipo viral nos testes pode prejudicar a detecção de animais soropositivos,
comprometendo programas de controle. Ao utilizar apenas um cepa viral a
sensibilidade mostrou-se reduzida. Porém, quando o teste foi realizado com seis
cepas virais (entre tipos e subtipos), a sensibilidade apresentou-se bastante
elevada e viável para utilização em estudos soroepidemiológicos. Geralmente é
utilizado somente uma amostra viral para realização da SN, sendo que o uso de
várias amostras demonstrou melhorar a sensibilidade do teste. (HOLZ et al.,
2009, VARELA et al., 2010; HOLZ et al., 2010). Para minimizar o risco da
introdução de animais infectados em rebanhos, os testes sorológicos devem ser
sensíveis o suficiente para evitar resultados falso-negativos.
16
2.6.2.4 Ensaio imunoenzimático
Outra técnica sorológica bastante utilizada é o ensaio imunoenzimático
(EIE) ou “enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA), que é sensível e
específico. Existem testes comerciais ou os conhecidos como ELISA “in house”,
por ser feito com reagentes preparados no laboratório, ambas as maneiras
possuem uma variedade nos testes, podendo ser classificados como indireto,
direto ou competitivo/bloqueio. São encontrados para ambos os vírus, porém para
o BoHV-5 testes específicos são mais raros (NANDI et al., 2007).
Os testes de ELISA podem ser utilizados para detectar antígenos ou
anticorpos, com base em interações anticorpo-antígeno, sendo que um desses
dois é fixado em um poço de placa de microtitulação. A seguir a amostra é
aplicada, se houver anticorpos/antígenos na amostra em teste ocorrerá a ligação
antígeno-anticorpo, que é determinada pela ação de um conjugado que contém
enzima, ao adicionar um substrato para este enzima os orifícios onde ocorreram a
reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração. No método de ELISA
competitivo ou de bloqueio, o soro teste é incubado com o antígeno antes de ser
inoculado na placa com anticorpos, ocorrendo a reação antígeno- anticorpo, o
antígeno na se ligara na placa, é adicionado um segundo anticorpo conjugado
com enzima e um substrato, em um teste positivo, não haverá mudança de cor,
devido a inicial incubação do antígeno com o anticorpo (FLORES, 1999).
A técnica apresenta vantagens em comparação a SN, permitindo o
processamento de um grande número de amostras, é também de relativa
facilidade e de rápida execução. Uma das principais desvantagens dessa técnica
é que o uso destes testes é dificultado pelo custo de aquisição de kit para
realização do ELISA, em virtude disto alguns laboratórios produzem e padronizam
seu próprio material (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; ESTEVES,
2007).
Na tentativa de desenvolver e padronizar um teste de ELISA, com base
em anticorpos monoclonais (AcMs), para a detecção de anticorpos contra BoHV-1
e/ou BoHV-5, BAUERMANN et al., (2010) obtiveram resultados positivos no
sentido de constituir uma alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA
importados, entretanto, como nos outros estudos não há possibilidade de
diferenciação entre os dois agentes, ou seja, reações cruzadas foram detectadas.
17
Uma grande dificuldade no diagnóstico do BoHV-1 e 5 é a
incapacidade de diferenciação sorológica entre os animais vacinados e os
naturalmente infectados. Assim, vacinas diferenciais com deleção da glicoproteína
E (gE) têm sido desenvolvidas com essa finalidade. A gE tem sido alvo de
deleção para a produção de vacinas diferenciais tanto para o BoHV-1 quanto para
o BoHV-5. Como na vacina o gene está deletado, apenas animais naturalmente
infectados irão apresentar o antígeno da gE (BRUM et al., 2010; OLIVEIRA,
2012). A utilização de testes diagnósticos capazes de diferenciar a produção de
anticorpos vacinais dos induzidos pelo vírus de campo são necessários quando
utilizadas estas vacinais. Esta diferenciação pode se realizada por um teste de
ELISA que detecta anticorpos contra a proteína ausente no vírus vacinal (gE),
mas presente no vírus de campo (OLIVEIRA, 2012).
Na Europa, há algum tempo já utiliza-se testes de ELISA para detecção
da gE, devido ao uso de vacinas com vírus com deleção da gE (MUYLKENS et
al., 2007), no Brasil, OLIVEIRA 2012, desenvolveu um teste diferencial de ELISA
com esta finalidade que foi capaz de diferenciar sorologicamente animais
vacinados com a cepa gE deletada do BoHV-5 dos animais experimentalmente
infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Apesar da padronização da técnica por
alguns autores do Brasil, o teste não é comercializado, provavelmente devido à
metodologia empregada, dificultando a produção em larga escala, ou até por falta
de interesse pelas indústrias produtoras deste teste. Além disto, nenhum dos
testes avaliaram a eficiência na detecção de anticorpos contra BoHV-5 (TEIXEIRA
et al., 2001, FERRERA et. al., 2005).
2.6.3 Testes moleculares
Técnicas de biologia molecular, para a detecção do genoma viral, como
a PCR e a análise de fragmento após restrição enzimática podem ser
empregadas com sucesso para o diagnóstico dos herpesvírus. Além da
identificação de ácidos nucleicos virais, estes testes são importantes na
identificação de animais positivos durante a forma latente da infecção (CAMPOS,
2009).
18
2.6.3.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) têm
sido os métodos de diagnósticos mais explorados nos últimos anos, apresentado
elevados índices de sensibilidade e especificidade, além da rapidez de execução
(ESTEVES, 2007).
A PCR tem como objetivo a amplificação de uma região alvo no DNA
viral, consistindo na síntese in vitro de uma grande quantidade de cópias de um
segmento de DNA existente na amostra. O processo ocorre em três etapas:
desnaturação, anelamento ou hibridização e polimerização. A região-alvo a ser
amplificada é delimitada por primers, que são oligonucleotídeos sintéticos de
aproximadamente 20 nucleotídeos. A PCR envolve a realização de vários ciclos,
na desnaturação (95°C) a temperatura alta causa separação das moléculas de
cadeia dupla do DNA, após ocorre o anelamento dos primes (50-60°), esses
primers hibridizam com suas regiões complementares, que se localizam nas
cadeias opostas do DNA, nas regiões flanqueadoras da sequência alvo, e em
seguida ocorre a polimerização (72°C) da cadeia de DNA a partir dos primers,
pela enzima DNA polimerase, esta enzima atua adicionando as bases, uma a
uma, a partir da extremidade dos primers, copiando a molécula molde ( Figura 4).
A cada ciclo o número de moléculas correspondentes à sequência-alvo duplica e,
no final da reação, acumulam-se milhões de cópias idênticas correspondentes à
sequência-alvo inicial. Essas moléculas, denominadas genericamente de produtos
de PCR ou amplicons, podem, então, ser detectadas visualmente após corrida
eletroforética em géis de agarose, corados com brometo de etídio ou outros
corantes sob luz UV (BRUM & WEIBLEN, 2007).
Algumas variantes da PCR foram desenvolvidas para os diagnósticos
do BoHV-1 e BoHV-5 como a nested PCR, multiplex PCR, e PCR em tempo real.
Esta última recentemente está se tornando uma ferramenta muito útil no
diagnóstico de viroses, tanto na medicina humana como veterinária. É uma
técnica qualitativa e quantitativa e possibilita a obtenção de um resultado preciso
e rápido, não necessitando de análise em gel de agarose (CORBELLINI, 2011).
Embora seja possível caracterização e consequente diferenciação entre o BoHV-1
e BoHV-5, por meio desta técnica, poucos são os estudos realizados no intuito de
diferenciá-los.
19
FIGURA 4: Ilustração da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).
Fonte: Adaptado de BRUM & WEIBLEN, (2007).
A nested-PCR é uma segunda amplificação em um produto já
amplificado, utilizando-se este produto da primeira reação como molde e um outro
conjunto de primers complementares a sequências localizadas internamente no
produto da primeira reação. Com isso, esta sequência interna do primeiro produto
é reamplificada. Em relação à PCR tradicional, a nested-PCR possui as
vantagens de maior sensibilidade (duas etapas de amplificação) e especificidade
(BRUM & WEIBLEN, 2007). No caso dos herpesvírus uma reação de PCR é
20
realizada para identificar a presença do vírus, sem entretanto diferenciar entre o
BoHV-1 e 5 (ESTEVES, 2007). A nested-PCR é então aplicada no intuito de
caracterização do BoHV como tipo 1 ou 5.
O método da multiplex-PCR baseia-se na utilização de dois ou mais
pares de primers na mesma reação. Devido a sua versatilidade, essa técnica é
utilizada para a identificação de diferentes agentes ou variantes do mesmo agente
em uma única reação. A realização de uma única reação diminui a possibilidade
de contaminação das amostras (BRUM & WEIBLEN, 2007). Este método também
pode ser realizada no intuito de diagnóstico diferencial de encefalites bovinas
provocadas por BoHV-1 e BoHV-5 (FONSECA Jr. et al., 2011).
Outra vantagem destas técnicas moleculares é que uma ampla
variedade de amostras biológicas pode ser utilizada no diagnóstico, tais como:
fragmentos de tecidos de feto abortado, sistema nervoso central, secreções,
sêmen e cultura de tecidos, contendo partículas virais viáveis e não viáveis, sendo
que a técnica possibilita a detecção de partículas virais latentes, pois a análise é
feita por meio da identificação do genoma viral, o que confere a técnica com de
extrema importância nos casos de latência. Também pode ser realizada em
tecidos parafinizados, permitindo estudos retrospectivos (TAKIUCHI et al., 2001,
ARRUDA et al., 2010; FINO et al., 2012).
Amplificações de regiões conservadas dos genes que codificam
glicoproteínas gb, gC, gE e a timidina quinase vem sendo estudadas (CLAUS et
al., 2005; AOKI, 2006; SILVA, 2009).
Vários protocolos de PCR (ESTEVES, 2007; FIGUEIREDO, 2009),
nested PCR (CAMPOS, et al., 2009) e multiplex-PCR(CLAUS et al., 2005;
ARRUDA et al., 2010; FONSECA Jr. et al., 2011) vêm sendo desenvolvidos e
padronizados para identificação do BoHV-1 e BoHV-5 , no caso do multiplex-PCR,
com intuito de cada vez mais se ter um teste específico, rápido, conclusivo e que
permita a detecção e a identificação simultânea de ambos os vírus.
21
2.6.3.2 Análise de fragmento após restrição enzimática (REA)
A identificação viral e a determinação de subtipos virais podem ocorrer
pela análise de restrição por enzimas (endonucleases) que clivam o DNA em
sítios específicos. Assim o genoma de um determinado vírus DNA é clivado por
uma ou mais endonucleases produzindo um determinado perfil de bandas após
corrida eletroforética (Figura 5). Diferentes isolados do vírus, irão gerar padrões
de clivagem distintos, podendo-se, assim, fazer a diferenciação entre isolados
(BRUM & WEIBLEN, 2007).
FIGURA 5: Ilustração da análise de restrição do genoma do herpesvírus
bovino.Fonte: Adaptado de BRUM & WEIBLEN, (2007).
22
Por meio dessa técnica, isolados respiratórios de herpesvírus foram
classificados como BoHV-1.1 e isolados de doença genital como BoHV-1.2. Em
relação aos subtipos do BoHV-5, estes são classificados também com a restrição
enzimática em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV5na/nb (não a e não b) (D’ARCE et al.,
2002).
BATISTA et al., (2010) através da REA determinaram os subtipos
BoHV-1.1 e BoHV-1.2b a partir de encéfalos de bovinos submetidos ao
diagnóstico de raiva no estado do Rio Grande do Sul.
A opção de diferenciar BoHV-1 de BoHV-5 por restrição enzimática
deve-se ao fato de o BoHV-1 também causar danos neurológicos (RISSI et al.,
2008). SILVA et al., (2007), encontraram genoma de BoHV-1 em 19,3% (5 em 26
casos) dos encéfalos de bovinos com doenças neurológicas, contradizendo
autores que afirmam que o BoHV-1 é raramente associado a encefalite.
23
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os BoHV tipos 1 e 5 são importantes patógenos de bovinos
causadores de enfermidades e estão associados a perdas econômicas relevantes
na bovinocultura do Brasil e em vários outros países, sendo de grande
importância o conhecimento da epidemiologia de ambos os vírus e consequente
diagnóstico.
Com a realização de um correto diagnóstico é possível determinar a
distribuição das doenças nos vários grupos etários, os índices de prevalência e/
ou incidência, monitorar o status sanitário dos animais e avaliar o progresso ou
sucesso de programas de controle ou erradicação. Portanto para todos estes
feitos, é necessário avaliação de alguns fatores para escolha de quais técnicas
serão utilizadas, como: disponibilidade do teste, custo, rapidez, facilidade de
execução, sensibilidade e especificidade.
Várias são os métodos de diagnósticos realizados, alguns deles
utilizados somente para pesquisa e outros na rotina de laboratórios. O isolamento
viral é considerado padrão-ouro, mas é uma técnica laboriosa, com alto custo e
que necessita de correto acondicionamento das amostras. Com relação aos
testes sorológicos, é necessário o desenvolvimento de técnicas mais rápidas para
a SN. O teste de ELISA tem ótima sensibilidade e especificidade, porém no Brasil
o uso é dificultado pelo custo de aquisição dos mesmos, sendo necessárias mais
pesquisas brasileiras para efetiva padronização dos kits e disponibilização para
venda e que possam competir com os kits disponíveis no mercado. Já as técnicas
moleculares permitem a identificação e diferenciação dos vírus, são versáteis e
muito utilizadas. Com os avanços da biologia molecular, as perspectivas futuras
são a seleção e caracterização de anticorpos e peptídeos recombinantes na
utilização dos testes diagnósticos, como por exemplo, o desenvolvimento de um
teste de ELISA com uso de peptídeos sintéticos.
A diversidade dos testes de diagnóstico permite o uso de combinações
das técnicas, possibilitando maior clareza e precisão dos resultados.
24
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