18-018 - Metallum Eventos Técnicos e Científicos

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais
13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO
24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR
ESTUDO IN VITRO DE Ageratum fastigiatum EM ELEMENTOS DO
CITOESQUELETO E INTEGRINAS DE MEMBRANA DE LINFÓCITOS
HUMANOS
P. G. M. de Alvarenga¹; M. H. F. Ottoni²; B. E. Souza¹; B. A. Avelar-Freitas²;
J.V.W. Silveira¹; A. B. Meireles²; C. F. F. Grael²; G. E. A. Brito-Melo²; L. A.
Gonzáles-Torres¹
¹Instituto de Ciência e Tecnologia – Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)
²Departamento
de
Farmácia
–
Universidade
Federal
dos
Vales
do
Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)
Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000 - Diamantina - MG, 39100-000
E-mail: [email protected]
RESUMO
Extratos de Ageratum fastigiatum são utilizados na medicina popular
para tratar dores e inflamações. Entretanto, o mecanismo envolvido na ação
anti-inflamatória da planta, ainda não foi devidamente elucidado. O objetivo
deste estudo é analisar a influência do óleo essencial de A. fastigiatum sobre
integrinas de membrana, bem como sobre a conformação celular, utilizando
métodos de citometria de fluxo e microscopia óptica. Os resultados indicam que
o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de CD18, marcador de
integrinas da membrana linfocitária. Além disso, pode modificar a estrutura do
citoesqueleto, permitindo dessa forma interferir no mecanismo de migração
celular. A compreensão desse fenômeno pode auxiliar no desenvolvimento de
métodos de tratamento e diagnóstico de doenças do sistema imune.
Palavras chave: leucócitos, imunologia, citometria de fluxo, migração celul
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INTRODUÇÃO
O Ageratum fastigiatum (Gardner) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae),
conhecida popularmente no estado de Minas Gerais - Brasil como “matapasto”
ou "enxota", é utilizada na medicina popular como anti-inflamatório e
analgésico
(2) (7) .
Seu extrato é preparado a partir de folhas e ramos frescos
picados e submetidos a maceração ou decocção. O extrato aquoso, após
filtração, é aplicado topicamente para tratar dor e inflamações. O óleo essencial
pode ser obtido através de processos de hidrodestilação. Foi demonstrado in
vivo, que o óleo essencial dessa planta tem um efeito anti-inflamatório e
analgésico, através da redução de edema e da migração leucocitária induzidos
em modelo animal
(7).
Contudo, os mecanismos envolvidos na ação anti-
inflamatória da planta ainda não foram bem elucidados.
Alguns estudos demonstraram o efeito do óleo essencial de A. fastigiatum
na redução de linfócitos e neutrófilos que produziram a citocina TNF-α
(5) ,
um
mediador importante na resposta imune inflamatória, capaz de induzir a
expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento
celular para o sítio da inflamação
(3) (9) .
Contudo, nenhum estudo avaliou o
efeito do óleo essencial da planta sobre integrinas de membrana leucocitárias
envolvidas na migração celular e nos arranjos de elementos do citoesqueleto.
Tendo em vista a ação anti-inflamatória de A. fastigiatum e seu potencial de
atuar sobre leucócitos, o objetivo desse estudo foi investigar o efeito do óleo
essencial de A. fastigiatum sobre a expressão de CD18, marcador de integrinas
de membrana leucocitárias, bem como avaliar mudanças geométricas nas
células de culturas de células mononucleares do sangue periférico humano in
vitro. As dimensões geométricas são avaliadas, devido à possível mudanças
causadas por alterações no citoesqueleto.
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção e análise química do óleo essencial
O material vegetal fresco foi cominuído e a extração de seu óleo essencial
foi realizada através de aparato de Clevenger, por 2 h(6). O óleo essencial foi
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acondicionado em frasco tipo eppendorff e conservado a –20°C até o momento
de análise química.
A identificação dos constituintes químicos do óleo
essencial foi realizada com base nos dados de análises através de
cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM). Foram realizadas
duas análises sob as mesmas condições experimentais: uma análise do óleo
essencial sem a adição de nenhuma substância e outra análise do óleo
essencial misturado com uma série homóloga de hidrocarbonetos (C7 a C 40 padrões de hidrocarbonetos saturados dissolvidos em hexano). A partir da
primeira injeção do óleo essencial foram obtidos os espectros de massas dos
componentes químicos. A segunda injeção foi realizada para se obter tempos
de retenção dos constituintes químicos e dos hidrocarbonetos para se calcular
o índice de retenção relativa, de acordo com a equação (A) (4).
(A)
Onde:
IRR = número do índice de retenção relativa;
n = número de átomos de carbono do hidrocarboneto eluído imediatamente
antes do composto “x” de interesse;
tn e tn+1 = tempos de retenção dos hidrocarbonetos eluídos imediatamente
antes e após o composto “x” de interesse, respectivamente;
tx = tempo de retenção do composto “x”.
Os espectros interpretados e os IRR calculados foram comparados com
dados da literatura
(1)
e de sites especializados e de acesso livre
(http://www.pherobase.com/ e http://www.flavornet.org/flavornet.html) para se
confirmar a identificação dos componentes químicos do óleo analisado. Os
espectros obtidos experimentalmente foram comparados a espectros contidos
na espectroteca (NIST).
Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro
com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum
Para avaliar o efeito do óleo essencial da A. fastigiatum sobre a
viabilidade dos leucócitos, 5x106 células foram incubadas com meio RPMI
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(acrescido de soro humano (10%), L-glutamina (1%) e coquetel antibiótico e
antimicótico (1%)) e tratadas com óleo essencial nas concentrações finais de
25x10-3 μL/mL, 12,5x103 μL/mL e 6,25x10-3 μL/mL por 5 dias, em estufa com
5% de CO2 e 37ºC. Culturas celulares contendo apenas RPMI e culturas
acrescidas de dimetilsulfóxido (DMSO) constituíram a cultura controle e
controle do solvente, respectivamente. O óleo essencial à 25x10-3 μL/mL. Após
o período de incubação as células foram removidas da placa por lavagem com
tampão fosfato salina (PBS) gelado, centrifugadas a 200 G, 10 min, 4ºC. O
precipitado foi suspenso em PBS para avaliação da viabilidade pela técnica de
exclusão de azul de tripan por citometria de fluxo
(5) .
A viabilidade celular foi
determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais,
coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).
Estimulação das células com óleo essencial
Inicialmente foram testados dois protocolos, sendo o primeiro com
estimulação de sangue total por 4 h e o segundo estimulação de células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) por 24 h.
Cultura de sangue total
Para teste do protocolo 500 μL de sangue total foram estimulados ou não
com PMA-ionomicina (25 ng/mL). As culturas permaneceram por 4 h em estufa
úmida a 37ºC e 5 % de CO2. Em seguida, as amostras foram submetidas à lise
das hemácias por adição de uma solução de lise eritrocitária e incubadas à
temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, as amostras foram
centrifugadas, o sobrenadante descartado e as células suspensas em PBS
(PBS 0,015 M pH 7,4). As células foram então marcadas com anticorpos
monoclonais anti-CD18 conjugados com phycoerythrin (PE) por 30 min.
Terminada a incubação, as células foram lavadas com PBS e avaliadas por
citometria de fluxo (FACScanto - Becton Dickinson), procedendo-se a aquisição
de 30.000 eventos por tubo.
Cultura de Células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
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As PBMCs foram obtidas a partir de sangue periférico venoso após
centrifugação em Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA). O anel de
PBMC, formado após a centrifugação, foi recolhido e lavado duas vezes em
PBS. O precipitado de células foi em seguida suspenso em 1 mL de PBS/BSA
1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após contagem das células em
câmara
hemocitométrica
de
Neubauer,
as
células
foram
novamente
centrifugadas e suspensas em PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO,
USA) suplementado com L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2 mM), e
coquetel
antibiótico/antimicótico
(penicilina
G
100 UI/mL,
estreptomicina
100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, USA) na
concentração de 1x107 células/mL.
A partir de um volume de 50 μL, 5x105 células foram incubadas em
RPMI da suspensão celular. As culturas tratadas com os produtos naturais
foram estimuladas ou não com o PMA. A cultura estimulada com PMA
constituiu o controle positivo. As células foram incubadas por 24 h em estufa
úmida, a 37ºC contendo 5% de CO2. Após o período de incubação, as células
foram lavadas duas vezes com PBS. Foi realizada a marcação com anticorpos
anti-CD18 e realizada a leitura de 30.000 eventos por citometria.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Análise da composição do óleo essencial de A. fastigiatum
A análise da cromatografia gasosa revelou a presença das substâncias
listadas na Tabela 1. Das substâncias elucidadas, as que se encontram em
maiores concentrações são o germacreno e α-pineno, os quais já foram
encontradas em outras amostras do óleo essencial desta planta
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(5)(7) .
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Tabela 1: Substâncias presentes no óleo essencial
Tempo de
IRR
IRR
retenção (min)
calculado
literatura
α-pineno
6,90
934,9
932
143.331.056
β-pineno
8,22
979,1
974
16.696.142
β-mirceno
8,55
990,3
988
4.322.807
d-limoneno
9,96
1029,6
1024
87.911.992
β-ocimeno
10,60
1046,6
1044
11.151.418
α-copaeno
24,45
1379,7
1374
9.273.628
4,8-β-epóxi-cariofileno
26,31
1425,1
1423
64.096.240
Germacreno
28,82
1487,6
1484
151.216.768
Biciclogermacreno
29,43
1502,9
1500
12.008.181
NI
34,17
1627,7
-
81.561.200
NI
34,93
1648,5
-
8.961.346
NI
40,92
1819,0
-
19.160.288
Composto identificado
Área do pico*
*Área absoluta do pico no cromatograma; corrente de íons total, sem padronização;
NI= não identificado.
Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro
com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum.
A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis
no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis). Os
resultados indicaram que o tratamento com até 25x10 -3 μL/mL do óleo
essencial de A. fastigiatum em DMSO, em cultura celular não altera a
viabilidade dos linfócitos para culturas com incubação de 5 dias. De tal forma,
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todas as concentrações utilizadas em tais testes foram consideradas de baixa
toxicidade (Figura 1).
% Células Inviáveis
3
2
1
0
Controle
DMSO
25
12,5
6,25
Óleo Essencial de A. fastigiatum
x10-3 μL/mL
Figura 1: Percentual de células inviáveis após incubação com concentrações
do óleo essencial A. fastigiatum por cinco dias. Anova seguida de Tukey, n=4.
Até o momento o que se pode concluir é que o óleo essencial na
concentração de 25x10-3 μL/mL não foi tóxico e, portanto, é a primeira
concentração a ser utilizada nos ensaios de inibição da expressão de
moléculas de adesão como a CD18.
Resultados da padronização do experimento para escolha do uso de
Sangue Total ou PBMC
Os resultados com sangue total indicaram que após 4 horas e incubação
e análise dos linfócitos o PMA não foi capaz de induzir o aumento na
expressão de citocinas. O percentual de células CD18+, bem como a
intensidade de fluorescência das culturas estimuladas e não estimuladas foram
semelhantes. Portanto o estimulo do PMA (25 ng/mL) por quatro horas não
produziu o efeito desejado (Figura 2).
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Figura 2: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 4 h em sangue
total para expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
Já a análise com PBMC indicou que após 24 h de incubação foi possível
observar o efeito do PMA na indução da expressão de CD18 em linfócitos
(Figura 3). Portanto os testes para verificação do efeito do óleo essencial de A.
fastigiatum foram realizados com o a incubação de 24 h. Tendo em vista que
os neutrófilos e hemácias presentes no sangue total possuem tempo de vida
limitado em culturas, para incubação de 24 h foram utilizadas células PBMC’s.
Figura 3: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 24 h em sangue
PBMC na expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
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Expressão de CD18 em linfócitos estimulados com PMA e tratados com
o óleo essencial de A. fastigiatum
O CD18 representa uma família de integrinas expressas na superfície de
leucócitos que vão auxiliar na adesão dos leucócitos para a diapedese e
migração nos tecidos. Na inflamação ocorre uma alta taxa de migração celular,
a fim de restaurar a homeostase tecidual. No entanto, em algumas doenças
autoimunes é necessária a intervenção farmacológica para cessar os efeitos da
inflamação. Os resultados indicaram que o óleo essencial na 1/160 reduziu a
intensidade de fluorescência das células marcadas com anti-CD18, o que
demonstra que as células tratadas com o óleo essencial da planta reduziram o
efeito provocado pelo PMA de induzir a expressão de CD18 (Figura 4). As
células estimuladas com PMA apresentaram uma intensidade média de
fluorescência (IMF) para a marcação de CD18 no valor de 1008, as células
estimuladas com PMA e tratadas com o óleo essencial apresentaram o valor de
IMF de 619, muito próximo do controle não estimulado IMF 622. É possível
que parte dos mecanismos envolvidos na ação do CD18 sejam medidas pela
diminuição do recrutamento de células inflamatórias para o tecido.
Figura 4: Resultados da Intensidade média de fluorescência (IMF) das culturas
marcadas com anti-CD18 nas culturas: controle não marcado (A), controle
negativo (B), controle positivo estimulado com PMA (C) e cultura teste
estimulada com PMA e tratada com óleo essencial (D).
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Análise de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular
Utilizando-se o protocolo de obtenção de PBMC, dessa vez, após a
mesma cultura de 24 h, foram feitas análises em microscópio óptico para que
fossem tomadas medidas dos eixos das células. Foi padronizado um número
de dez medidas por amostra (não marcada, não estimulada, controle positivo e
tratada com óleo essencial). A Figura 5 apresenta um comparativo do resultado
médio e do desvio padrão das medições dos diâmetros (em μm).
Figura 5: Diâmetros das células com e sem influência de óleo essencial.
Apesar das análises em citometria de fluxo apresentarem alterações na
intensidade de fluorescência de células marcadas com CD18 quando tratadas
com óleo essencial de A. fastigiatum, não foi possível observar alterações
significativas no tamanho das células. Porém a falta de mudanças morfológicas
perceptíveis se deve ao fato de que essa é uma medida indireta e pouco
sensível para avaliar a deformação do citoesqueleto.
CONCLUSÃO
Sugere-se que o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de
CD18, reduzindo assim a migração linfocitária. Ensaios em microscopia óptica
foram realizados no sentido de avaliar a alteração na conformação celular,
porém
em
virtude
do
método
pouco
sensível,
os
resultados
foram
inconclusivos. Diante dos resultados, é possível inferir, que parte da ação anti-
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inflamatória de A. fastigiatum se dê pela redução da migração celular para o
sítio da inflamação.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer à FAPEMIG e à CNPq pelo suporte
financeiro para a realização desse trabalho e ao laboratório de imunologia da
UFVJM por todo suporte estrutural para o desenvolvimento da pesquisa.
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Ageratum fastigiatum IN VITRO STUDY ON CYTOSKELETON ELEMENTS
AND HUMAN INTEGRINS MEMBRANE
ABSTRACT
A. fastigiatum essential extracts are employed to treat pains and inflammations.
Even though, the mechanism, involved in the anti-inflammatory action, is not
elucidated properly. The objective of this study is to analyze the influence of
different essential oils contents over the leucocytes internal structure, by the flux
cytometry and optical microscopy methods. Results showed that the A.
Fastigiatum reduces the CD18 expression, an integrin marker from lymphocyte
membrane. Also, it could modify the cytoskeleton structure, interfering in the cell
migration mechanism. The comprehension of this phenomena can help the
development of diagnosis and treatment methods for immunological system
diseases.
Key words: Leucocytes, immunology, flux cytometry, cell migration.
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