prevalência do papilomavírus humano em mulheres portadoras do
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FACULDADE DE BIOMEDICINA EWERTON DO NASCIMENTO MIGLIO PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO EM MULHERES PORTADORAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA ATENDIDAS NO SERVIÇO AMBULATORIAL ESPECIALIZADO DE IMPERATRIZ-MA. Belém - 2012 EWERTON DO NASCIMENTO MIGLIO PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO EM MULHERES PORTADORAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA ATENDIDAS NO SERVIÇO AMBULATORIAL ESPECIALIZADO DE IMPERATRIZ-MA. . Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientadora: Profª. Drª. Fabiola Elizabeth Villanova Belém - 2012 EWERTON DO NASCIMENTO MIGLIO PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO EM MULHERES PORTADORAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA ATENDIDAS NO SERVIÇO AMBULATORIAL ESPECIALIZADO DE IMPERATRIZ-MA. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. JULGADO EM: ___/___/___ NOTA: _________________ BANCA EXAMINADORA: _________________________________________ Profª. Drª. Fabiola Elizabeth Villanova – UFPA/NMT Orientadora ______________________________ Prof. Drª Esther Iris Christina Freifrau Von Ledebur Avaliador ______________________________ Prof. MSc Sylvia Regina Vasconcellos Aguiar Avaliador ______________________________ Prof. Dr. Élcio de Souza Leal Avaliador suplente AGRADECIMENTOS À Profª Drª Fabiola Elizabeth Villanova, por me aceitar como orientando no início desta caminhada e pela sua enorme paciência e dedicação em me ensinar técnicas de biologia molecular, que por sinal domina muito bem, tenho a honra de ser o primeiro orientando oficial da carreira dessa brilhante profissional pela qual tenho muita adimiração, o que me propiciou aprendizado e a finalização da graduação em Biomedicina. Ao Laboratório de Imunopatologia, em especial à profª Hellen Thaís Fuzii que disponibilizou o tema e todo o suporte ao desenvolvimento do estudo. Aos meus familiares que em todo e qualquer momento estiveram presentes em minha vida e são os grandes benfeitores desse mérito: aos meus pais Krysler e Maria, meus irmãos Jefferson e Diego, minha avó Creuza, minhas tias Angélica e Kíuza, meus primos Harrison e Eduardo e a minha namorada, Kelly, que sempre me deu carinho e força. Aos meus amigos de graduação que proporcionaram da UFPA um lugar ótimo de se conviver e enfrentar todas as dificuldades do curso, em especial ao: Alan, Camila, Cléber, Diego, Gildeone, Iguaracy, Ilana, Jean, Jorge,Kelly, Leonan, Maiana, Manoel, Maico, Melina, Messias e Ronildo. À Profª Drª Antonia Benedita Rodrigues Vieira por ter me proporcionado à iniciação científica no ano de 2010 e aos amigos que me ajudaram na confecção do trabalho, Alison e Christian. Ao grande ser humano e amigo de sala Fábio que nos deixou, mas enquanto esteve entre nós proporcionou momentos de sabedoria e humildade suprema. Vá em paz, amigo!! RESUMO O câncer de colo uterino apresenta altas taxas de morbimortalidade sendo o terceiro mais comum em mulheres no mundo. No estado do Maranhão é a neoplasia mais frequente, estimando-se que haja 780 novos casos no ano de 2012 com uma taxa de 13,97 casos por 100 mil mulheres. O desenvolvimento do câncer de colo do útero está associado a diversos fatores, sendo que a exposição a um vírus de transmissão sexual, o papilomavírus humano (HPV), é um dos mais importantes. Dados atuais mostram que a infecção pelo Vírus de Imunodeficiência Humana ou HIV aumenta a incidência e a persistência do HPV. Foi coletado material cervical de 78 pacientes com idades de 18 a 65 anos, soropositivas para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e avaliouse a presença do genoma do HPV por meio de análise pela Reação em cadeia de Polimerase (PCR). Das 78 amostras analisadas, 59 (75,6%) foram positivas para HPV. O estudo aponta para a necessidade da manutenção sistemática e contínua do programa de rastreamento de prevenção do câncer de colo uterino na população feminina HIV soropositivo, tendo em vista a elevada prevalência do genoma do papilomavírus encontrado nesta população. Palavras-chave: Papilomavírus humano (HPV); Imperatriz; Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); Reação em cadeia da Polimerase (PCR). LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS OU SÍMBOLOS AIDS – Síndrome da imunodeficiência adiquirida AP – Proteína associada bp – pares de bases C- - controle negativo C+ - controle positivo D – daltons DNA - Ácido desoxirribonucleico dNTPs - Desoxirribonucleotídio Trifosfato E - Região precoce do genoma viral EUA – Estados Unidos da América GP-5 – Glicoproteína 5 HIV - Vírus da imunodeficiência humana HLA – Antígenos leucocitários humanos HPV – Papilomavírus Humano INCA – Instituo Nacional de Câncer L - Região tardia do genoma viral LCR – Região reguladora do genoma viral MA – Maranhão NIC – Neoplasia intra-epitelial cervical nm – nanômetro OMS – Organização Mundial de Saúde ORI – Origem de replicação do genoma viral PBS – Tampão fosfato-salino PCR – Reação em Cadeia da Polimerase PM – Peso molecular Rb – Retinoblastoma RNA – Ácido ribonucleico RPM – Rotações Por Minuto TBE - Tris-Borato-EDTA UFPA – Universidade Federal do Pará β - beta SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................... 10 1.1 Justificativa................................................................................... 10 1.2 Objetivo........................................................................................ 10 2. REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................. 11 2.1 Vírus da Imunodeficiência Humana................................................ 11 2.2 Epidemiologia............................................................................... 12 2.3 Etiologia........................................................................................ 13 3. PAPILOMAVÍRUS HUMANO............................................................... 13 3.1 Classificação e morfologia........................................................... 13 3.2 Organização genômica............................................................... 14 3.3 Replicação................................................................................. 14 3.4 Oncoproteínas E6 e E7................................................................ 15 3.5 Resposta imunológica ao HPV..................................................... 16 3.6 Infecção pelo HPV e câncer cervical............................................. 16 3.7 Lesões precursoras do câncer de colo uterino............................... 18 3.8 Prevalência da infecção pelo HPV................................................ 19 4. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................. 21 4.1 Local do estudo.............................................................................. 21 4.2 Aspectos éticos......................................................................... 21 4.3 Caracterização das amostras....................................................... 21 4.3.1 Critérios de inclusão........................................................... 21 4.3.2 Critérios de exclusão.......................................................... 21 4.4 Coletas das amostras.................................................................. 21 4.5 Técnicas de biologia molecular.................................................... 22 4.5.1 Extração de DNA................................................................. 22 4.5.2 PCR para amplificação do gene da Beta-globina................. 23 4.5.2.1 Eletroforese.............................................................. 23 4.5.2.2 Aplicação da amostra............................................... 23 4.5.2.3 Corrida eletroforética................................................. 24 4.5.3 PCR para HPV..................................................................... 24 4.5.3.1 Eletroforese............................................................... 24 4.5.3.2 Aplicação da amostra.................................................. 24 4.5.3.3 Corrida eletroforética.................................................. 24 4.5.4 PCR para GP5...................................................................... 25 4.5.4.1 Eletroforese................................................................ 25 4.5.4.2 Aplicação da amostra................................................. 25 4.5.4.3 Corrida eletroforética.................................................. 25 4.6 Análise estatística dos dados......................................................... 25 5. RESULTADOS...................................................................................... 26 6. DISCUSSÃO............................................................................................. 30 7. CONCLUSÕES..................................................................................... 33 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... ..34 APÊNDICES......................................................................................... 41 ANEXOS............................................................................................... 43 10 1. INTRODUÇÃO O câncer de colo uterino apresenta altas taxas de morbimortalidade sendo o terceiro mais comum em mulheres no mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2012 calcula que surja aproximadamente 685.480 novos casos por ano na população sexualmente ativa do Brasil. Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA), este é o segundo câncer mais incidente na população brasileira, estima-se que surjam 17.540 novos casos em 2012 com um risco de 17 casos a cada 100 mil mulheres. No estado do Maranhão é a neoplasia mais frequente, estimando-se que haja 780 novos casos no ano de 2012 com uma taxa de 13,97 casos por 100 mil mulheres (INCA, 2011). O desenvolvimento do câncer de colo do útero está associado a diversos fatores, sendo que a exposição a um vírus de transmissão sexual, o papilomavírus humano (HPV), é um dos mais importantes. Estudos mostram que cerca de 98% dos cânceres de colo uterino apresentam o DNA do HPV sugerindo que este vírus pode ser considerado o agente etiológico deste tipo de câncer (Roncato, 2011). O vírus também está presente nas lesões precursoras do câncer de colo uterino, as neoplasias intraepiteliais cervicais. Pessoas que praticam atividade sexual desprotegida tem risco combinado de se infectarem por diversos patógenos de transmissão sexual. Dados atuais mostram que a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana ou HIV aumenta a incidência e a persistência do HPV. 1.1 Justificativa Tendo em vista que mulheres portadoras do HIV são mais suscetíveis a infecções, inclusive pelo HPV, potencial causador de câncer cervical, se faz necessária a investigação de cérvices dessas pacientes. 1.2 Objetivo Avaliar a prevalência do HPV na cérvice uterina de mulheres soropositivo para HIV, residentes do município de Imperatriz-MA, utilizando-se a técnica de PCR. 11 2. REFERENCIAL TEÓRICO A infecção por HPV se enquadra como uma das principais doenças sexualmente transmissíveis, logo a principal via de contaminação é a sexual, neste contexto, a Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2012 calcula que surjam aproximadamente 685.480 novos casos por ano na população sexualmente ativa do Brasil. 2.1 O vírus da imunodeficiência humana - HIV A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é o estágio mais avançado da infecção causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1 e HIV-2). Normalmente, a infecção pelo HIV gera imunossupressão progressiva, principalmente da imunidade celular e a desajustes imunitários, estas desordens no sistema imune podem ocasionar uma série de doenças oportunistas e/ou neoplasias (Nadler, 1996). Segundo dados do Programa Conjunto das Nações Unidas HIV/AIDS (UNAIDS) do ano de 2012, há um aumento do número de pessoas portadoras da síndrome. Investimentos no acesso à terapia antirretroviral sustentados por doadores e governos nacionais elevaram o número de vidas salvas nos últimos seis anos. Em 2011, mais de meio milhão a menos de pessoas morreram de doenças relacionadas à Aids do que seis anos antes. Em 14 países, mortes relacionadas à Aids caíram em mais de 50% entre 2005 e 2011. Os números podem quantificar, mas por si só não podem expressar o impacto de cada morte evitada em toda a comunidade, incluindo seus filhos. (UNAIDS, 2012). Segundo dados do último boletim da AIDS, 17.819 novos casos foram registrados no Brasil de janeiro a junho de 2012 (Ministério da Saúde, 2012). No começo, a infecção pelo vírus era restrita a homossexuais e usuários de drogas injetáveis, porém, hoje as transmissões em pessoas heterossexuais são as de maior incidência, principalmente em mulheres. Outro dado importante é a constante e progressiva contaminação em pequenos e médios centros urbanos (Melchior, 2006). 12 2.2 Epidemiologia Os vírus de HIV-1 e HIV-2 apresentam as mesmas vias de transmissão e possuem semelhantes aspectos clínicos, porém as suas distribuições geográficas são diferentes, enquanto o HIV-1 é encontrado principalmente na Europa, Ásia e África, o HIV-2 predomina na África ocidental (CDC, 2012). Globalmente, 34 milhões de pessoas viviam com o HIV no final de 2011. Estima-se que 0,8% de adultos com idades entre 15-49 anos no mundo vivem com HIV, embora o peso da epidemia continue a variar consideravelmente entre países e regiões (UNAIDS/WHO, 2012). Mundialmente, o número de pessoas infectadas vem caindo: o número de pessoas (adultos e crianças) que adquiriram a infecção pelo HIV em 2011 foi de 2,5 milhões, valor 20% menor que em 2001. As maiores quedas nos números de novas infecções pelo HIV desde 2001 ocorreram no Caribe (42%) e África sub-saariana (25%) (UNAIDS, 2012). A África Sub-saariana continua sendo a área mais severamente afetada, cerca de 1 em cada 20 adultos (4,9%) vivem com HIV valor responsável por 69% das pessoas vivendo com HIV em todo o mundo. Ainda que a prevalência regional da infecção pelo HIV seja quase 25 vezes maior na África subsaariana que na Ásia, quase 5 milhões de pessoas estão vivendo com HIV no Sul, Sudeste e Leste da Ásia combinados. Depois da África sub-saariana, as regiões mais afetadas são o Caribe e Europa Oriental e Ásia Central, onde registrou-se 1,0% dos adultos vivendo com HIV em 2011(UNAIDS, 2012). Foram contabilizados cerca de 656.701 casos no Brasil, de 1980 a junho de 2012: a região sudeste com 367.540 casos, o sul com 130.942, o nordeste com 88.830, o centro-oeste, 37.244 e o norte, 32.140. Na região centro-sul, a incidência de AIDS está estabilizada, porém no norte e nordeste do país a incidência de AIDS vem aumentando (Ministério da Saúde, 2012). Segundo dados do boletim epidemiológico de 2012, 253.706 óbitos em decorrência da AIDS foram notificados no Brasil de 1980/2011, destes, 160.871 ocorreram na região sudeste, 42.990 no sul, 28.393 no nordeste, 12.351 no centro-oeste e 9.092 na região norte. No estado do Maranhão, de 1980 a 2010, foram registrados 8.844 casos de AIDS. Os cinco municípios do estado que apresentaram o maior número de casos acumulados até junho de 2010 foram: São Luís (3.652), Imperatriz (939), 13 Caxias (324), Timon (258) e São José de Ribamar (190). Quanto à taxa de incidência (por 100.00 hab.), o estado figurava na 16ª posição no ranking nacional. Dentre os municípios citados, a maior incidência em 2010 foi observada em São Luís (37,5/100.000 hab.), o município de Imperatriz obteve (25,5/100.000 hab.). Quanto à mortalidade por AIDS, o estado acumulou, até 2010, um total de 2.691 óbitos. O coeficiente de mortalidade por AIDS no Maranhão foi de 4,6/100.000 habitantes em 2010 (Ministério da Saúde, 2011) 2.3 Etiologia O HIV foi isolado primeiramente em 1983, quase simultaneamente por Luc Montagner na França e Robert Gallo nos Estados Unidos em pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida. Em 1986, isola-se um agente etiológico com características semelhantes ao HIV-1 e este foi denominado como HIV- 2. Em comum, o fato de infectarem seres humanos e pertencerem à família dos retrovírus (Sepkowwitz, 2001). O HIV-1 e HIV-2 são membros da família retroviridae, na subfamília dos lentivírus. Este grupo de vírus se caracteriza por infecção persistente, à revelia da resposta imune do hospedeiro. Outro aspecto importante é o fato de terem uma replicação dependente de um DNA dupla-hélice intermediário (provírus) integrado ao genoma da célula hospedeira (Nadler, 1996). O genoma do HIV é constituído por duas moléculas iguais de RNA de cadeia simples envolto por uma capa proteica, dita capsídeo viral. Possui também uma matriz lipoproteica, o envelope, que armazena as glicoproteínas virais. A DNA polimerase dependente de RNA (transcriptase reversa) tem papel na replicação dos retrovírus e o faz por meio de um molde de RNA viral sintetizando uma molécula de DNA de cadeia simples. A partícula viral apresenta um capsídeo com simetria icosaédrica, forma esférica e tamanho final de aproximadamente 150nm (Leão et al., 1997). 3. O PAPILOMAVÍRUS HUMANO 3.1 Classificação e morfologia O Papiloma Vírus Humano (HPV) é um vírus da família Papillomaviridae, do tipo icosaédrico, não envelopado, constituído de ácido desoxirribonucleico 14 (DNA) de dupla fita, circular com 7.900 pares de base, capsídeo com 55 nm e peso molecular de 5.2 x 10D (Chang, 1990). 3.2 Organização genômica O genoma viral é formado pela região reguladora (LCR – Long Control Region), esta contém a origem de replicação (ORI) e grande parte dos promotores de transcrição. As regiões codificadoras chamam-se open reading frames (ORF) e dividem-se em sequências precoce e tardia (Southern & Herrington, 1998). A região precoce (E-early) codifica proteínas como E1, E2, E6 e E7, estas tem papel na replicação do DNA viral e na transformação celular (Buck, 2008). A região tardia (L-late) codifica proteínas do capsídeo L1 e L2 que vão atuar nas etapas finais de replicação viral, como a síntese de proteínas estruturais do capsídeo (Finnen, 2003). 3.3 Replicação Resumidamente, a infecc - E6, E7, E1 e E2, suficiente para a manutenc ô (Doorbar, 2005). Para a produc n o dos genes E6 e E7. A montagem das partículas s genes virais E1, E2, E4 e E5. Como demonstra a figura 1. 15 gênica viral no ciclo da infecc 16. Fonte: DOORBAR, 2005 4, importante na alterac , maturac (Doorbar, 2005; Scheurer, 2005). Esta organizac . O desenvolvimento de uma neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) e do câ perda da regulaç à , evento que caracteriza os HPV oncogênicos (Doorbar, 2005) 6 e E7 qu , com diminuic â , fato que impossibilita que o ciclo produtivo se complete ( Doorbar, 2005; Scheurer, 2005). diferencia a infecc infecc 3.4 , de uma . (Doorbar, 2005). Oncoproteínas E6 e E7 O vírus HPV apresenta no seu genoma duas proteínas que são oncogênicas para a célula hospedeira, estas são as proteínas codificadas pelos genes E6 e E7. Ambas proteínas interferem com o ciclo celular e a morte celular programada, ou apoptose. Para o vírus, não é interessante que a célula onde ele está hospedado seja reconhecida pelo sistema imunológico pare de multiplicar-se, ou morra. O vírus precisa de uma célula que apresente as três características para ele se replicar e propagar. Consegue isso com a expressão 16 das proteínas E6 e E7 que apresentam como alvo principal duas proteínaschave no controle do ciclo celular, as proteínas P53 e Retinoblastoma (Rb). A proteína E6 viral atua degradando a proteína P53 – importante supressor de tumor celular. A P53 apresenta várias funções, entre elas, a de checar se a replicação do DNA celular foi correta, induzir mecanismos de reparo se o erro for menor e finalmente se o dano for maior, induzir a morte da célula por meio da apoptose. O HPV quando infecta a célula, além de induzir a replicação celular, ocasiona mutações e alterações cromossômicas que seriam detectadas pela P53, detendo o ciclo celular. Para evitar a ação da P53, a proteína E6 do HPV forma um complexo com AP (do inglês Proteína Associada) e ubiquitinam a P53 ocasionando sua degradação proteolítica (Scheffner & Whitaker, 2003; Thomas & Banks, 1999). A proteína E6 ativa o promotor da telomerase celular evitando o encurtamento cromossômico que freia a replicação celular (Klingelhutz et al, 1996). Tumores malignos podem ser desencadeados a partir da ativação da telomerase (Rosa, et al 2007). Por outro lado, a proteína E7 atua ligando à proteína Rb outro importante gene supressor tumoral, essa ligação faz com que pRb deixe seu papel de regulação do ciclo celular (Kastan & Bartek, 2004). Rb se liga a E2F evitando que esta ative os genes de replicação celular. Quando Rb fica sem ação devido a E7, E2F fica livre para ativar os complexos ciclina-cdk que levam à progressão irrestrita da fase G1 para S do ciclo celular, resultando em proliferação celular contínua (Scheffner & Whitaker, 2003). 3.5 Resposta imunológica ao HPV As proteínas Human Leucocytes Antigens (HLA) atuam mediando a apresentação de antígenos aos linfócitos, este mecanismo mediado por células é a principal defesa do organismo frente à infecção pelo HPV (Souza et al, 2008). 3.6 Infecção pelo HPV e câncer cervical Existem mais de 200 tipos diferentes de HPV identificados e destes aproximadamente 45 tipos contaminam a área anogenital. Porém, são os subtipos 6, 11, 16 e 18 os responsáveis por lesões nessa área (Giraldo et al, 2008). 17 Os HPV de baixo potencial de oncogênico para a cérvice uterina atualmente listados são os 6, 11, 32, 34, 40, 42, 44, 54, 55, 57, 61, 62, 64, 67,69, 70, 71, 72, 81, 83, 84 e os de alta potencialidade oncogênica são os 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 82 (Trottier et al, 2006; Noronha, 2007). As lesões causadas pelos HPV de baixo risco se caracterizam por verrugas nos órgãos genitais, ânus e colo uterino (Ministério da Saúde, 2012). Para combater a infecção pelo vírus, o hospedeiro ativa as respostas imunológicas inata e adaptativa. O primeiro combate é não específico, com o intuito de proteger o hospedeiro até que a resposta adaptativa se estabeleça de maneira específica ao agente agressor ao organismo (Parellada & Pereyra, 2005; Diniz, 2009). O vírus consegue evadir-se do sistema imunológico, uma vez que as células epiteliais não possuem mecanismos tão eficazes de apresentação de antígenos retardando o reconhecimento viral, fazendo com que apenas 10% a 20% dos HPV sejam apresentados ao sistema imunológico de maneira adequada (Parellada & Pereyra, 2005). No ponto de inoculação viral na camada basal são expressos os genes precoces que possuem poucas cópias virais não ocasionando lise celular, tampouco processo inflamatório, portanto, não estimulando o sistema imunológico através da ativação das células de Langerhans (células dendríticas), fazendo com que haja atraso no reconhecimento viral (Parellada & Pereyra, 2005; Zimmermmann, 2009; Diniz, 2009). A partir da progressão da infecção, há amadurecimento celular e então se dá a expressão de grande quantidade de cópias virais pelos genes precoces, concomitante a isso, os genes tardios que expressarão L1 e L2 são expressos na camada superficial da pele, estes formam virions infectantes (Parellada & Pereyra, 2005; Stanley, 1998 apud Noronha, 2007; Zimmermmann, 2009; Diniz, 2009). As células de Langerhans são fundamentais para identificação e apresentação de antígenos de HPV na superfície de epitélio e mucosa, suspeita-se que a quantidade e os desarranjos ocorridos nessa célula tenham relação com o princípio e desenvolvimento da infecção (Giannini et al., 2002 apud Zimmermann, 2008; Zimmermmann, 2009). O mecanismo exato para 18 reconhecimento do HPV pelo sistema imune ainda não foi totalmente elucidado, sabe-se que a imunidade celular representa papel central e preponderante e a imunidade humoral apresenta papel secundário. Foi notado que em pacientes imunodeficientes de células T houve maior prevalência de infecções por HPV, outros achados como presença de infiltrados de macrófagos e células TCD4+ ocorreram em local onde aconteceu regressão espontânea de condilomas (Parellada & Pereyra, 2005; Machado et al., 2004; Zimmermmann, 2009; Diniz, 2009). As células de Langerhans fagocitam e apresentam antígenos virais aos linfócitos TCD4+ que serão ativados para linfócitos T helper (TH). Estes sofrerão ação da Interleucina-12 (IL-12) e passarão a TH-1 que por sua vez ativarão a linfócitos citotóxicos (TCD8+), que produzirão Interferon-gama (INF-y), que estimularão a atividade de macrófagos com a produção de Interleucina- 1(IL-1), que também estimula Th-1 a produzir Interleucina-2 (IL-2). Para destruírem queratinócitos infectados por HPV, células TCD8 e Natural Killer (NK) extravasam a parede do vaso, enquanto o Interferon interrompe o ciclo celular de queratinócitos infectados pelo vírus (Parellada & Pereyra, 2005). Seja qual for o tipo viral de HPV que causou lesões no hospedeiro, as ações do sistema imune para reestabelecer a normalidade com o consequente desaparecimento das lesões se dão por meios fagocíticos e citotóxicos agindo de maneira concomitante (Parellada & Pereyra, 2005; Stanley, 2007; Wright, 2002; Diniz, 2009). 3.7 Lesões precursoras do Câncer de Colo Uterino A maior incidência de câncer de colo de útero se dá na faixa etária acima de 40 anos, isso se deve ao fato de o tempo médio entre as primeiras lesões e o estabelecimento de carcinoma invasor ocorrer entre 10 e 20 anos, pelo mesmo motivo entende-se o fato de tal neoplasia ser menos frequente em menores de 25 anos (INCA, 2011; Mendonça et al, 2008; Coelho, 2008). Tendo por base o tipo de tecido e nível de anomalia ocorrido na estrutura de células do mesmo, foram categorizadas em lesões de células escamosas, abrangendo a displasia com diferentes graus de NIC e carcinoma epidermóide invasor e em lesões de células glandulares, que além de adenocarcinoma in 19 situ, inclui adenocarcinoma invasor cervical e endometrial (INCA, 2011). Compreende-se como “NIC”, displasia com processo multiplicativo. Foram divididas em três graus, considerando a intensidade das alterações de cada desarranjo: displasia leve ou NIC I, displasia moderada ou NIC II e displasia acentuada/carcinoma in situ ou NIC III. Esta ordem tem como parâmetro o risco de um processo cancerígeno e o quão grave é a avaria morfológica na célula em questão (Richart, 1968; Wright, 2002; Corrêa, 2005; Mendonça et al, 2008). NIC I – Neoplasia Intra-epitelial Cervical grau I - Perda de polaridade das células, limitada ao terço inferior do epitélio, onde podem ser encontradas figuras de mitose, porém típicas. Nas camadas superiores, há grau leve de discariose, que se caracteriza por maturação citoplasmática completa e células superficiais com núcleos atípicos. NIC II – Neoplasia Intra-epitelial Cervical grau II - Metade a dois terços inferiores da espessura epitelial contém células imaturas atípicas. Há presença de mitoses atípicas. NIC III – Neoplasia Intra-epitelial Cervical grau III - Acomete pelo menos dois terços da espessura epitelial, ou a sua totalidade – carcinoma in situ; com numerosas figuras de mitoses atípicas; alterações nucleares atípicas, hipercromasia e alta relação núcleo/citoplasmática (Richart, 1968; De palo et al, 1996; Corrêa, 2005). O Adenocarcinoma in situ mantém particularidades histológicas quanto a lesões no epitélio, envolvendo a troca total ou parcial do epitélio endocervical por células neoplásicas quando associado a NIC, o que representa dois terços dos casos, estas lesões tem como origem o epitélio cilíndrico cervical. Casos de adenocarcinoma invasor cervical, endometrial e sem especificações caraterizam-se pelo aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromasia, mitoses frequentes e depleção de muco. Pode assumir vários tipos de diferenciação celular (Carvalho, 2000; Corrêa, 2005). 3.8 Prevalência da infecção pelo HPV A OMS afirma que a infecção por HPV pode causar câncer cervical, o segundo mais comum em mulheres de todo o mundo. No Brasil, a prevalência de câncer cervical só é inferior à do câncer de mama, além de ser a quarta maior causa de mortes entre mulheres, vitimando 4.986 no ano de 2010 e 20 estima-se que 17.540 novos casos surjam durante o ano de 2012 (INCA, 2012). Nakagawa et al. (2010) cita como possíveis causas para essa alta mortalidade por câncer cervical o fato de ser uma doença de lenta progressão, apresentar poucos sintomas no estágio inicial de sua infecção e por se tratar de uma DST, problema grave em países em desenvolvimento. De acordo com dados do boletim epidemiológico AIDS/DST do ano de 2012, a população feminina infectada pelo HIV de 1980 a 2011 é de cerca de 210.538, representando 35% da população infectada no Brasil. Segundo Souza et al. (2001) pacientes portadoras de HIV/HPV tem 13,3 vezes de chance a mais de desenvolver Neoplasia Intra-epitelial Cervical (NIC) em relação a pacientes não portadoras de HPV. Outro trabalho ratificando o que foi mencionado relatou alta incidência de anormalidades de NIC em portadoras de HIV/HPV, de um total de 38 infectadas por HPV, 36 apresentavam NIC de algum grau (Galore et al., 1995). Estudo demonstrou maior prevalência de HPV em portadoras de HIV do que em não portadoras do mesmo, sugerindo forte correlação entre os vírus. Utilizando-se técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), demonstrouse que 73,2% das mulheres portadoras de HIV também possuem HPV, enquanto 23,7% de mulheres não portadoras de HIV estão infectadas por HPV (Campos et al., 2005). Há pouco tempo um estudo indicou que mulheres HIV positivo com importante imunossupressão (definida como contagem de células CD4 abaixo de 200 células/mm³) têm maior chance de apresentarem lesões reincidivas de NIC 2-3 que mulheres soronegativo para HIV que foram submetidas a cirurgias, sugerindo que o menor número de moléculas CD4 em HIV positivo possa ser um fator preponderante no resultado (Russomano et al, 2008). Recentemente Corrêa et al. (2011), também relatou elevada prevalência e multiplicidade de genótipos de HIV/HPV em mulheres de Minas Gerais, contabilizando quase 80% de infecção por HPV em pacientes soropositivo para HIV. 21 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Local do estudo O estudo foi realizado no município de Imperatriz, o segundo mais populoso do estado do Maranhão. Localiza-se a sudoeste do estado, possui área de 1.369 km² (aproximadamente e população estimada em 247.505 habitantes (IBGE, 2007). 4.2 Aspectos éticos O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Núcleo de Medicina Tropical-UFPA. Todas as participantes concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, no qual se garantiu o total sigilo da identidade das pacientes. 4.3 Caracterização das amostras Foi coletado material cervical de 78 pacientes com idades de 18 a 65 anos, soropositivas para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). 4.3.1Critérios de inclusão Mulheres maiores de 18 anos, soropositivas para o vírus HIV, com vida sexual iniciada, com funções cognitivas preservadas, atendidas no serviço ambulatorial especializado do município de Imperatriz-MA que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. 4.3.2 Critérios de exclusão Mulheres que não se enquadram nos critérios de inclusão. 4.4 Coleta das amostras Com as pacientes em posição ginecológica, foi introduzido um espéculo na vagina e em seguida uma escova do tipo campos da paz para a remoção de células cervicais da ectocérvice, endocérvice, fundo de saco e paredes laterais da vagina. Logo após, a escova foi mergulhada em um tubo de 15 ml contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS 1X). 22 4.5 Técnicas de Biologia Molecular Por meio de análise pela Reação em cadeia de Polimerase (PCR), se investigou amostras colhidas através de técnica de esfoliado celular de colo uterino. Essa técnica detecta com alta sensibilidade e especificidade a presença do DNA do Papilomavirus. As etapas percorridas foram: extração de DNA da amostra cervical; PCR para detecção de DNA genômico; PCR para detecção do DNA do HPV; eletroforese em gel de agarose. 4.5.1 Extração de DNA O DNA das amostras foi extraído de acordo com o protocolo do Purelink™ Genomic DNA mini kit (Invitrogen, Carlsbad, EUA). Em um microtubo de 1,5 ml, foi adicionado 200 µl de esfoliado celular do colo uterino, 20 µl de Proteinase K (20 mg/ml), 20 µl Rnase A (20 mg/ml). Logo em seguida, a suspensão foi agitada no vortex e incubado durante 2 minutos. Em cada microtubo, foram adicionados 200 µl de Tampão de Lise, levados ao vortex novamente e incubados em banho-maria a 55ºC por 10 minutos. A seguir, adicionamos 200 µl de etanol absoluto. A próxima etapa foi a transferência da amostra para a coluna do kit acoplada ao tubo coletor. As colunas foram centrifugadas durante 1 minuto a 10.000 rotações por minuto (rpm) em centrífuga (Eppendorf). Após a centrifugação o tubo coletor foi descartado e a coluna foi transferida para novo tubo coletor. Em cada coluna foram adicionados 500 µl de Solução de Lavagem 1 e nova centrifugação a 10.000 rpm durante 1 minuto. O tubo coletor foi descartado com transferência da coluna para outro tubo coletor. Em seguida foram adicionados em cada coluna 500 µl de Solução de Lavagem 2 e mais uma centrifugação a 13.000 rpm por 3 minutos. O tubo coletor foi descartado e a coluna transferida para microtubo de 1,5 µl. Finalmente, foram adicionados 100 µl de água destilada/deioinizada em cada coluna para eluição do DNA e centrifugação a 13.000 rpm durante 1 minuto. A coluna foi descartada e o DNA extraído condicionado a -20ºC. 23 4.5.2 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação do gene da Beta-Globina Para a realização da técnica de PCR utilizamos o kit Platinum® Taq DNA (Invitrogen, Brasil) em uma reação com volume final de 20 µl. Para isso adicionamos 2 µl de solução tampão (10X) a um microtubo de 0,2 ml; 0,8 µl de Cloreto de Magnésio 50 mM; 0,8 µl de Desoxirribonucleotídio Trifosfato (dNTPs) a 10 mM; 0,8 µl de Oligonucletídeo Iniciador 5' - GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC - 3' 10 µM e Oligonucleotídeo Iniciador reverso 5' - CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC- 3' 10 µM; 0,15 µl de Taq Polimerase 5U/µl ; 14,45 µl de água destilada/deionizada. Logo em seguida, adicionamos um 1 µl de DNA extraído. As reações ocorreram em termociclador (Eppendorf) onde foram submetidas à seguinte ciclagem: Primeiramente, ocorreu um ciclo de desnaturação a 94ºC por 3 minutos. Seguiram-se 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, ciclo de hibridação dos oligonucleotídeos iniciadores a 56ºC por 30 segundos, e ciclo de extensão da Taq polimerase a 72ºC por 30 segundos. Após a ciclagem, realizou-se um ciclo de extensão final a 72ºC por 3 minutos e a reação foi estabilizada em 4ºC. 4.5.2.1 Eletroforese Preparo do gel de agarose a 2% p/v Em um becker, colocamos 2 gramas de agarose e adicionamos 100 ml de Tris-Borato-EDTA (TBE 1X). Logo em seguida, levamos ao forno microondas por 90 segundos até que a agarose dissolvesse completamente no tampão. Aguardamos a solução do gel ficar a 6070ºC e adicionamos 1 µl de Brometo de Etídio (10mg/ml). Despejamos a solução de gel em uma cuba de acrílico e colocamos o pente para a formação de poços. Uma vez geleificado, colocamos o gel na cuba de eletroforese contendo TBE (1X). 4.5.2.2 Aplicação da amostra Em um microtubo, colocamos 8 µl de produto da PCR com 2 µl de tampão de aplicação no poço do gel. 24 4.5.2.3 Corrida eletroforética Programamos a fonte da cuba de eletroforese a 100 V, 500 mA para efetuar a eletroforese por 30 minutos. Nesse tempo, o DNA da amostra migrou até o polo positivo da cuba e o brometo de etídeo foi intercalando-se entre as bases do ácido nucleico. Após esta etapa, levamos o gel para a visualização sob luz ultravioleta no transiluminador Gelliance 200™, Perkin Elmer®, EUA e utilizamos o software GeneSnap para visualizarmos as bandas de DNA. Esperou-se um segmento de DNA amplificado do gene da Globina de 269 pares de bases. 4.5.3 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) para HPV Para a realização da técnica de PCR utilizamos o kit Platinum® Taq DNA (Invitrogen, Brasil), produzimos uma reação com volume final de 20 µl. Adicionamos 2 µl de solução tampão (10X) a um microtubo de 0,2 ml; 0,8 µl de Cloreto de Magnésio 50 mM; 0,8 µl de Desoxirribonucleotídio Trifosfatado (dNTPs) 10 mM; 0,8 µl de Oligonucleotídeos Degenerados MY09 5 - CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC – 3 10 µM e MY11 5 - GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG - 3 a 20 µM ; 0,15 µl de Taq Polimerase 5U/ µl ; 14,45 µl de água destilada/deionizada. Logo em seguida, adicionamos um 1 µl de DNA extraído. As reações ocorreram em termociclador (Eppendorf), onde foram submetidas a seguinte ciclagem: Primeiro ocorreu um ciclo de desnaturação a 94ºC por 3 minutos. Seguiram-se 40 ciclos de desnaturação a 94ºC por 20 segundos, ciclo de anelamento dos Oligonucleotídeos Degeneradores a 55ºC por 30 segundos e ciclo de extensão da Taq polimerase a 72ºC por 30 segundos. Houve um ciclo de extensão final a 72ºC por 3 minutos e a reação se estabilizou em 4ºC. 4.5.3.1 Eletroforese O preparo do gel, a aplicação do produto de PCR e a eletroforese foram realizados como explicados anteriormente nos itens 4.5.2.1, 4.5.2.2 e 4.5.2.3. Esperou-se um segmento de DNA amplificado de 450 pares de base. 25 4.5.4 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) para Glicoproteína 5 do HPV (GP5) Para a realização da técnica de nested PCR utilizamos o kit GoTaq® Green Master Mix (Promega, USA), fizemos uma reação com volume final de 20 µl. Adicionamos 10 µl de Promega green a um microtubo de 0,2 ml; 1 µl de Oligonucleotídeos Iniciadores GP5 5’- TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC – 3’ e GP6 5' - GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C – 3' a 10 µM; 8 µl de água destilada/deionizada. Logo em seguida, adicionamos um 1 µl de produto obtido na primeira PCR para amplificar o DNA do HPV. As reações ocorreram em termociclador (Eppendorf), onde foram submetidas à seguinte ciclagem: Primeiro ocorreu um ciclo de desnaturação a 94ºC por 3 minutos. Seguiram-se 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 20 segundos, ciclo de hibridação dos oligonucleotídeos iniciadores a 55ºC por 30 segundos e ciclo de extensão da Taq polimerase a 72ºC por 30 segundos. Houve um ciclo de extensão final a 72ºC por 3 minutos e a reação se estabilizou em 4ºC. 4.5.4.1Eletroforese O preparo do gel, a aplicação do produto de PCR e a eletroforese foram realizados como explicados anteriormente nos itens 4.5.2.1, 4.5.2.2 e 4.5.2.3. Esperou-se um segmento de DNA amplificado de 150 pares de base. 4.6 Análise estatística dos dados O levantamento dos dados coletados foi realizado a partir do software Microsoft Office Excel 2007, onde foi elaborado o banco de dados de estudos e gráfico dos resultados. 26 5. RESULTADOS Para avaliar a qualidade da extração de DNA, foi realizada a reação de PCR com oligonucleotideos de β-Globina. Todas as amostras extraídas amplificaram para o gene da β-Globina, que possui uma banda de 269 pares de bases (pb), como visualizado na figura 2, percebemos que as amostras de 1-7 amplificaram na altura do gene mencionado, além do controle positivo amplificado e o controle negativo não amplificado, como esperado com gel de agarose a 1% sob luz ultravioleta após eletroforese. FIGURA 2: Reação em Cadeia da Polimerase de sete amostras para βGlobina. Fonte: protocolo de pesquisa 27 Avaliamos as amostras para a presença do genoma do vírus HPV. Após aplicação de 10 ul do produto da PCR com os primers MY9 e MY11, nas amostras positivas foi observada uma banda de aproximadamente 450 pb. A figura 3, abaixo mostra o resultado da amplificação do gene L1, região conservada do Papilomavirus, para as amostras 3, 6, 9 e 11, além do controle positivo amplificado e o controle negativo não amplificado, como esperado. FIGURA 3: Reação em Cadeia da Polimerase de 11 amostras para Papilomavírus Humano. Fonte: protocolo de pesquisa FIGURA 4: Reação em Cadeia da Polimerase de 13 amostras para Glicoproteína-5. Fonte: protocolo de pesquisa Para a possível detecção de amostras positivas para o HPV, mas com baixa carga viral, foi realizada a nested PCR, pois esta apresenta maior sensibilidade em relação a PCR comum. O produto esperado foi de 150 pb. Na figura 4, com gel de agarose a 1% podemos observar as bandas das amostras 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12 e 13 positivas, além do controle positivo amplificado e o controle negativo não amplificado, como esperado para o DNA do vírus HPV. 28 A tabela 1 expõe o resultado dos exames de PCR e nested PCR para a detecção do DNA viral nas mulheres do estudo. Para detectar o DNA do vírus em amostras com baixo número de cópias virais, amostras negativas para a primeira PCR foram avaliadas por nested PCR. Assim, de 32 amostras negativas para a primeira PCR ao ser avaliadas novamente por nested PCR, encontramos mais 13 amostras positivas para HPV, totalizando 59 amostras positivas para HPV das 78 analisadas. Portanto, a prevalência de HPV nas mulheres portadoras de HIV foi de 75, 6%. TABELA 1: Distribuição das mulheres do estudo de acordo com os resultados dos exames de biologia molecular. Imperatriz, 2012. Variáveis PCR Positivo Negativo NESTED n % 46/78 32/78 58,9% 41,1% Positivo Negativo TOTAL POSITIVO TOTAL NEGATIVO 13/32 19/32 59/78 19/78 40,6% 59,4% 75,6% 24,4% Fonte: protocolo de pesquisa 29 A figura 5 apresenta os dados relativos a frequência de infecção por HPV encontrado em mulheres HIV soropositivo do município de Imperatriz, estado do Maranhão, ressalta-se que os valores apresentados indicam que o DNA viral do Papiloma foi identificado por PCR e/ou nested PCR. Nota-se que 75% do grupo estudado apresentaram infecção pelo papiloma, indicando uma elevada taxa de infecção e somente 1/4 do público alvo está livre da infecção pelo Papiloma. Fonte: Protocolo de pesquisa 30 6. DISCUSSÃO O HPV exerce um papel central na carcinogênese do colo uterino, que é o segundo mais frequente na população feminina no Brasil e continua a ser um grave problema de saúde pública. Mulheres imunodeprimidas apresentam risco elevado para o desenvolvimento de neoplasia cérvico-vaginal e câncer. A evidência de uma possível interação entre o HPV e o HIV foi reconhecida formalmente quando o câncer cervical foi incluído como um dos critérios definidores de caso AIDS em mulheres soropositivas (Bosch et al., 2006). Neste estudo, a prevalência de HPV em mulheres infectadas por HIV foi de 75,6%. Nossos resultados vão de acordo com os descritos por Araújo et al. (2012) que diagnosticou 68% de prevalência em mulheres HIV positivas, assim como Corrêa et al, (2011) que relatou 79% de prevalência de HPV para infectadas por HIV, e também do exposto por Souza et al. (2001), no qual foi feito um estudo de comparação entre métodos de detecção do Papilomavírus, a PCR revelou 86% de prevalência de HPV para as pacientes HIV positivo, chegando a conclusão do grande poder de rastreamento do Papiloma pelo referido exame. A técnica de PCR apresentou sensibilidade satisfatória. Quando combinada à nested PCR demonstrou especificidade superior para a detecção do genoma do Papiloma. Atualmente, PCR e suas variações são as técnicas mais sensíveis de que se dispõe, além de confiáveis apresentam menor custo quando comparadas a técnica de hibridização in situ (Carmo et al., 2007; Wolschick et al., 2007). Valores muito similares aos nossos foram revelados por Campos et al. (2005) que conduziram um estudo comparativo entre portadoras de HIV e não portadoras, chegando a 73% e 24% de frequência do Papiloma respectivamente. O nosso estudo também revelou prevalência superior a encontrada por Paulo et al. (2007), que divulgou 27% de prevalência de HPV nas mulheres HIV positivo. O presente estudo encontrou uma prevalência de HPV de 75,6% em mulheres portadoras de HIV, número bem maior do que a encontrada no 31 estudo de gestantes em Imperatriz-MA (trabalho do nosso grupo, dados não publicados), com uma prevalência de 15%. Estudos prospectivos sugerem que metade das infecc mulheres HIV positivo , enquanto a outra metade representa reativac adquiridas Strickler et al. (2005). Alguns autores afirmam que mulheres infectadas por HIV tem uma maior prevale ipos de HPV e de subtipos oncogê infectadas pelo HIV (Moscicki et al., 2000; Ellerbrock et al., 2000; Strickler et al., 2003). Estudos demonstram que a detecc 4+ e cargas virais mais elevadas do H 4+, principal /mm³ - los tipos de HPV (Palefsky et al., 1999; Strickler et al., 2003; da infecc ncia, a persistencia entre as pacientes HIV positivo s pelo HIV (Frisch et al., 2000). Em mulheres portadoras do HIV, a prevalencia e a persistência da infecc aumentam com a queda da contagem de 4+ e a elevac carga viral, sendo que alguns estudos mostram que tipos oncogênicos do HPV podem ser mais comuns, com baixas contagens de CD4+ e/ou carga viral mais alta (Minkoff et al., 1998; Palefsky et al., 1999; Luque et al., 1999). Rachid & Schechter (2005) relataram que a prevalência da infecc HIV. A prevalência e a incide - o maiores nas pacientes portadoras do HIV do que naquelas HIV negativo (Palefsky, 2003). Mulheres infectadas pelo HIV tê -epite 4+ (Palefsky et al., 1999; Duerr et al., 2006). Pacientes soropositivo para HIV quando associados a lesão de alto grau revelaram maior progressão e persistência do vírus, portanto, são refratários ao tratamento e apresentam maiores recorrências do que em mulheres HIV negativas (Russomano et al, 2008). Esta é a razão pela qual 32 pacientes soropositivo para HIV precisam de tratamento mais agressivos (Queiroz, 2005). Por outro lado, sabe-se que mulheres HIV positivo quando tratadas adequadamente com terapia antirretroviral de alta atividade (HAART), portanto, imunocompetentes apresentam história natural semelhante às demais mulheres (Australian Government/National Health and Medical Research Council, 2005). 33 7. CONCLUSÕES A prevalência de HPV em mulheres portadoras de HIV no município de Imperatriz-MA foi de 75,6%. O estudo aponta para a necessidade de manutenção sistemática e contínua do programa de rastreamento de prevenção do câncer de colo uterino na população feminina soro positivo para HIV, tendo em vista a elevada frequência do genoma do papiloma encontrado, fazendo-se necessário exames adicionais para a tipagem do Papilomavírus encontrado para maiores procedimentos. 34 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, A. C. L. et al. Incidence of cervical intraepithelial neoplasia in a cohort of HIV-infected women. International Journal of Gynecology & Obstetrics, 117. 211–216 (2012). AUSTRALIAN GOVERNMENT/National Health and Medical Research Council. Screening to Prevent Cervical Cancer: Guidelines for the Management of Asymptomatic women with Screen Detected Abnormalities. Canberra: Biotext Pty Ltd., 2005. Disponível em URL: http://www.nhmrc.gov.au/PUBLICATIONS/synopses/wh39syn Acesso em: 30 set. 2012. BOSCH, F. X. Preface. The field of cervical cancer prevention. Vaccine, 24. 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Prevalência do Papilomavirus humano e seus genótipos em mulheres portadoras do vírus da imunodeficiência humana atendidas no Serviço Ambulatorial Especializado de Imperatriz-MA. O HPV é considerado um dos agentes causadores do câncer cervical. Em cerca de 95% dos casos de câncer cervical, ele esta presente. Em cerca de 95% dos casos de câncer cervical, o vírus é encontrado Quando a mulher esta infectada por HIV e HPV aumenta a possibilita de desenvolver o câncer. Cerda de 55% de mulheres infectadas por HIV que apresentam câncer de colo uterino. Com isso, este projeto se dedica a avaliar presença do HPV em mulheres infectadas por HIV na população do município de Imperatriz. Esta região apresenta grande desenvolvimento e atende a várias cidades dos arredores, e se torna de grande importância este tipo de estudo para que se possa fazer programas regionalizados para prevenção dessa doença. Para isso, utilizaremos as amostras colhidas da região vaginal para apesquisa do HPV pela técnica de biologia molecular. Sem a necessidade de qualquer outra intervenção. Se você tiver qualquer pergunta sobre este estudo ou riscos, você pode entrar em contado com a pesquisadora Franciara Batista Casanova, telefone 99-9989-0700. Se você tiver dúvidas sobre seus direito ou com relação aos aspectos éticos do trabalho, você pode entrar em contado com o Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (CEP) do Núcleo de Medicina Tropical - UFPA – Av. Generalíssimo Deodoro, 92, Umarizal, Belém – PA; Telefone 3241-0032. É garantida a liberdade de retirar o consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na instituição. As informações serão analisadas em conjunto com outros pacientes, não sendo divulgado a identificação de nenhum paciente. Não há nenhuma despesa pessoal adicional ao participante neste estudo. Também não haverá compensação financeira relacionada à sua participação. Você pode se negar a participar deste estudo sem que haja qualquer prejuízo ao seu tratamento neste Serviço.Os dados obtidos por sua participação serão apenas utilizados para este estudo. Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo "Prevalência do Papilomavirus humano e seus genótipos em mulheres portadoras do vírus da imunodeficiência humana atendidas no Serviço Ambulatorial Especializado de Imperatriz-MA". Eu discuti com Franciara Batista Casanova sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim, quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu 42 consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. ______________________________ Belém __/__/200_ Participante ______________________________ Testemunha Belém __/__/200_ Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente para a participação neste estudo. ______________________________ Pesquisador Belém __/__/200_ 43 ANEXOS
