caracterização da frequência de

Maicon Fernando Zanon da Silva
CARACTERIZAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS FGFR1, PI3K,
AKT, PTEN E SUAS ASSOCIAÇÕES CLINICOPATOLÓGICAS EM CARCINOMA ADENOIDE
CÍSTICO DE CABEÇA E PESCOÇO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação da Fundação-Pio XII
Hospital de Câncer de Barretos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Cristovam Scapulatempo Neto
Barretos, SP
2014
Maicon Fernando Zanon da Silva
CARACTERIZAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS FGFR1, PI3K,
AKT, PTEN E SUAS ASSOCIAÇÕES CLINICOPATOLÓGICAS EM CARCINOMA ADENOIDE
CÍSTICO DE CABEÇA E PESCOÇO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação da Fundação-Pio XII
Hospital de Câncer de Barretos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Cristovam Scapulatempo Neto
Barretos, SP
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada por Vanessa Alves Zagatto CRB 8/8638
Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
S586c
Silva, Maicon Fernando Zanon da
Caracterização da frequência de imunoexpressão das proteínas FGFR1,
PI3K, AKT, PTEN e suas associações clinicopatológicas em carcinoma adenoide
cístico de cabeça e pescoço. / Maicon Fernando Zanon da Silva. - Barretos, SP
2014.
100 f. : il.
Orientador: Dr. Cristovam Scapulatempo Neto.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital
de Câncer de Barretos, 2014.
1. Neoplasias de Cabeça e Pescoço. 2. Glândulas Salivares. 3. Neoplasias das
Glândulas Salivares. 4. Carcinoma Adenoide Cístico. 5. Imuno-Histoquímica. 6.
Proteínas. I. Autor. II. Scapulatempo Neto, Cristovam.
CDD 616.994 316
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maicon Fernando Zanon da Silva
Caracterização da frequência de imunoexpressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT, PTEN e suas
associações clinicopatológicas em carcinoma adenoide cístico de cabeça e pescoço
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de
Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de Concentração: Oncologia
Data da aprovação: 10/07/2014
Banca Examinadora:
Prof.ª Dra. Albina Messias de Almeida Milani Altemani
Instituição: Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
Prof. Dr. Iberê Cauduro Soares
Instituição: Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
Prof. Dr. Cristovam Scapulatempo Neto
Orientador - Presidente da Banca
“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da PósGraduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações
e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos”.
“Os pesquisadores declaram não ter qualquer conflito de interesse relacionado a este
estudo”.
Aos meus pais, Marta e Carlos pelas alegrias
proporcionadas durante uma vida inteira.
Aos meus irmãos, Dú e Tami minhas maiores
lembranças de uma infância feliz.
AGRADECIMENTOS
À Deus, te agradeço senhor por tudo que conquistei até agora e pela certeza de que tudo
daria certo, sempre.
Ao Cristovam Scapulatempo Neto, meu orientador, professor e exemplo de pessoa e
profissional. Que em meio a grande correria que é sua vida, encontrou espaço para estar
presente e conduzir toda orientação deste projeto. Agradeço pelo companheirismo,
reconhecimento e conselhos que me fazem refletir diariamente sobre a busca constante
pelo aprendizado e qualificação profissional. A você meu sincero muito obrigado e todo meu
respeito pelo olhar humano com o qual enxerga sua família e a vida.
Ao Dr. André Lopes Carvalho, pela competência, clareza e objetividade que muito contribuiu
para o direcionamento deste projeto além, da disponibilidade e boa vontade em ajudar
sempre, estruturando o banco de dados e realizando todas as análises estatísticas
apresentadas neste projeto.
Ao Dr. José Humberto T. G. Fregnani, pela disponibilidade imediata na realização das
análises estatísticas para minha qualificação, além de todo conhecimento compartilhado
durante suas aulas.
Aos assessores, Dra. Marcia M. C. M. Silveira e Dr. Ibere Cauduro Soares pela
disponibilidade e considerações propostas durante as bancas de acompanhamento e
qualificação.
Ao Dr. Luciano de Souza Viana, Dr. Rui Reis, Dr. Fernando Augusto Soares e Dr. Rafael
Malagori, pelas contribuições clínicas, científicas e técnicas.
À Flávia Eguchi, minha amiga Nem e barretense de longa data, que se faz presente na minha
vida frequentemente, além de fazer meus dias mais felizes, pelas boas e constantes risadas e
pelo apoio durante está jornada.
À Marina Schmidt Carrijo, amiga e principal incentivadora para que eu me mantivesse forte
durante toda pós-graduação, agradeço as palavras de conforto, a disponibilidade em me
auxiliar sempre e em qualquer situação desde a formatação desta dissertação até a
paciência para rever minhas apresentações e ouvir minhas histórias.
À Taciane Macedo, pela amizade consolidada durante a pós-graduação, pelas horas de
estudo e de boas risadas e por cada sonho dividido e alcançado juntos.
À Deise Mendes, pela amizade, carinho, demonstrações explícitas de quão bom o ser
humano pode ser e todo tempo que destinou na obtenção dos artigos científicos solicitados.
Ao Renato Oliveira, pelas conversas que sempre variavam entre a fantasia e a loucura
tornando tudo mais fácil e leve de se entender e aceitar, pelas boas explicações e os
intermináveis momentos de bom humor compartilhados.
À Adriana Cruvinel, pelo afeto e gentileza sempre prestados.
À Letícia Yamane, Viviane Aline, Augusto Marino e Camila Martinelli pelas experiências
enriquecedoras de vida trocadas durante nossas conversas.
À Ana Laura Rodrigues, pelo reconhecimento, pelo incentivo e exemplo de perseverança.
À Silvana Rodrigues, pelo acolhimento, pelas boas conversas sobre pós-graduação e cultura,
mas principalmente por uma frase que faz pensar e refletir constantemente “uma pessoa faz
o trabalho de uma pessoa”.
À Brenda Honda, pela eficiência, agilidade e doces palavras de “boa sorte” sempre faladas
antes de um seminário ou banca que quebravam toda tensão.
À Allini Mafra, pela torcida, apoio e todo suporte prestado durante a estruturação da ficha
de coleta, ensinamentos sobre edição de gráficos e a colaboração de sua equipe do Registro
Hospitalar: Kelly, Lara, Pamela e Marcos pela atualização de informações de seguimento.
Ao Matias Melendez, o argentino mais gente boa desse Brasil pelas revisões do inglês para
minhas apresentações no Journal Club.
Aos funcionários da Patologia, agradeço à dedicação, o empenho, a amizade e o bom
humor prestados por: Patrícia, Guilherme, Bia e Letícia todas as vezes que solicitei auxílio
técnico para execução deste projeto.
Aos funcionários do SAME: Vinícius, Leonardo e Renan pela compreensão e agilidade no
levantamento de prontuários todas as vezes que solicitados.
Ao Núcleo de apoio ao pesquisador, Rossana, Estela e Cleyton pelo suporte estatístico e
esclarecimentos durante as conversas além, do auxílio prestado pelas funcionárias Silvia,
Ana Maria e Jamile durante a digitação das fichas de coleta.
Aos funcionários da Biblioteca: Jacqueline pela eficiência no levantamento dos artigos,
Vanessa e Rafael pelo bom atendimento e pelas orientações bastante válidas sobre o
manuseio do software End note.
As funcionárias do CEP: Daniela e Bruna pelos esclarecimentos e auxílio durante a
submissão e manutenção do projeto ao comitê de ética em pesquisa.
Aos colegas, que sempre prestaram apoio e encontravam em suas vidas um espaço para
questionar como caminhava a minha vida e meu projeto: Fernanda Cury, Talitha Menghini,
Mariana Schmidt, Carla Pinheiro, Isabela de Carvalho, Adriana Lorenzi, Carol Laus,
Alessandra Paulino, Adriane Feijó, Silvana Gisele, Edenir Palmero, Andreza Vargas, Eliane
Marçon, Luciana Manfredini, Marcio Saito, Natalia Campacci, Lidia Rebolho, Abel Queiroz,
Ademar Longatto e Wilson Marçal.
Por fim, minha imensa gratidão pela família que a vida me concedeu: minha mãe Marta (os
olhos mais lindos que já vi), meu pai Carlos (um guerreiro), meus irmãos Dú (um sonhador) e
Tami (uma batalhadora) que são a grande motivação para realização deste sonho e meus
maiores orgulhos. Sou infinitamente grato por toda confiança depositada sobre mim, pela
boa educação e pelo grande respeito que se referem ao meu trabalho. São por vocês, a força
e garra que demonstro mesmo de longe e que me faz levantar diariamente e acreditar que
posso matar um leão por dia e retornar vitorioso, e é por vocês que chego ao final, passados
24 meses com plena satisfação de um trabalho bem realizado.
Á todos que sempre se fizeram presentes e que compartilharam dessa história comigo, nas
próximas páginas segue um projeto embargado pelo companheirismo, aprendizado,
desafios, otimismo, conquistas e muito orgulho.
“No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade”
Albert Einstein
INDÍCE
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
INTRODUÇÃO
Epidemiologia
Comportamento clínico
Histopatologia
Imuno-histoquímica
Alterações citogenéticas e moleculares
Tratamentos
Fator de crescimento dos fibroblastos
Via de sinalização PI3K/AKT/PTEN
1
3
4
5
6
7
11
13
2
2.1
JUSTIFICATIVA
Hipótese
17
3
3.1
3.2
OBJETIVOS
Objetivo geral
Objetivos específicos
18
18
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.9.1
4.9.2
4.9.3
MATERIAIS E MÉTODOS
Ética na pesquisa
Delineamento do estudo
Critérios de inclusão
Critérios de exclusão
Instrumento de pesquisa
População de estudo
Confecção de TMA controle
Confecção de TMA: Coletânea de Carcinoma adenoide cístico
Imunohistoquímica em plataforma automatizada
Análise de imunoexpressão dos marcadores
Análise de sobrevida livre de doença e global
Análise estatística
19
19
19
19
19
20
21
22
23
24
25
25
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
RESULTADOS
Consistência de dados
População do estudo
Detecção de imunoexpressão
Caracterização da população
Caracterização topográfica
Frequência de imunoexpressão dos marcadores
Análise de sobrevida livre de doença em portadores de CAC
Análise de sobrevida global em portadores de CAC
26
26
28
34
34
37
46
53
6
DISCUSSÃO
61
7
CONCLUSÕES
68
8
PERSPECTIVAS
69
REFERÊNCIAS
ANEXO A
Ficha de instrumento de pesquisa para coleta de dados
ANEXO B
Carta de aprovação do CEP
76
78
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Aspecto histopatológico dos padrões de crescimento do
carcinoma adenoide cístico com coloração hematoxilinaeosina.
Figura 2 -
5
Representação esquemática da translocação entre os
cromossomos 6q22-23 e 9p23-24 na fusão oncogênica
6
MYB/NFIB.
Figura 3 -
Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico
9
a agentes quimioterápicos clássicos.
Figura 4 -
Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico
10
a agentes quimioterápicos alvo dirigidos.
Figura 5 -
Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico
11
a agentes quimioterápicos clássicos e alvo dirigidos.
Figura 6 -
Representação esquemática da cascata de sinalização
13
decorrente de ativação pelo FGF.
Figura 7 -
Representação esquemática da ativação das proteínas PI3K e
AKT decorrente ao estímulo do receptor de fator de
14
crescimento.
Figura 8 -
Fluxograma representativo para construção de TMA.
22
Figura 9 -
Descrição de anticorpos utilizados, fonte e diluições segundo
24
padronização imuno-histoquímica.
Figura 10 -
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de FGFR1 total.
Figura 11 -
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de PI3K total.
Figura 12 -
29
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de PI3K fosforilado.
Figura 13 -
28
30
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de AKT total.
31
Figura 14 -
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de AKT fosforilado.
Figura 15 -
32
Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica em
CAC para detecção da expressão de PTEN total
33
Figura 16 -
Curva de sobrevida livre de doença conforme o sexo.
46
Figura 17 -
Curva de sobrevida livre de doença conforme o tabagismo.
47
Figura 18 -
Curva de sobrevida livre de doença conforme o etilismo.
47
Figura 19 -
Curva de sobrevida livre de doença conforme a classificação
topográfica.
Figura 20 -
Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento
clínico.
Figura 21 -
52
Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão
citoplasmática e nuclear da proteína AKT fosforilada.
Figura 29 -
51
Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão
nuclear da proteína AKT fosforilada.
Figura 28 -
51
Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão
da proteína PI3K fosforilado.
Figura 27 -
50
Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão
da proteína PI3K total.
Figura 26 -
50
Curva de sobrevida livre de doença conforme o padrão
histológico de crescimento.
Figura 25 -
49
Curva de sobrevida livre de doença conforme o status de
margem cirúrgica.
Figura 24 -
49
Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento
patológico (pN).
Figura 23 -
48
Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento
patológico (pT).
Figura 22 -
48
52
Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão
da proteína PTEN total.
53
Figura 30 -
Curva de sobrevida global conforme o sexo.
54
Figura 31 -
Curva de sobrevida global conforme o tabagismo.
54
Figura 32 -
Curva de sobrevida global conforme o etilismo.
Figura 33 -
Curva de sobrevida global conforme a categorização
55
topográfica.
55
Figura 34 -
Curva de sobrevida global conforme o estadiamento clínico.
56
Figura 35 -
Curva de sobrevida global conforme o estadiamento
patológico (pT).
Figura 36 -
Curva de sobrevida global conforme o estadiamento
patológico (pN).
Figura 37 -
59
Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão
citoplasmática e nuclear da proteína AKT fosforilada
Figura 42 -
58
Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão nuclear
da proteína AKT fosforilada.
Figura 41 -
58
Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da
proteína PI3K fosforilado.
Figura 40 -
57
Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da
proteína PI3K total.
Figura 39 -
57
Curva de sobrevida global conforme o padrão histológico de
crescimento.
Figura 38 -
56
59
Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da
proteína PTEN total.
60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Dados demográficos, clínicos e histológicos dos portadores de
carcinoma adenoide cístico (Hospital de Câncer de Barretos,
15.02.2014 a 14.03.2014).
35
Tabela 2 -
Dados clínicos de portadores de carcinoma adenoide cístico
(Hospital de Câncer de Barretos, 15.02.2014 a 14.03.2014).
36
Tabela 3 -
Distribuição de sítios primários.
37
Tabela 4 -
Frequência de imunoexpressão das proteínas na forma total e
fosforilada em portadores de CAC.
38
Tabela 5 -
Associação da imunoexpressão da proteína FGFR1 total com as
variáveis demográficas e clínico patológicas de pacientes com
CAC (n=36).
39
Tabela 6 -
Associação da imunoexpressão da proteína PI3K total com as
variáveis demográficas e clínico patológicas de pacientes com
CAC (n=33).
40
Tabela 7 -
Associação da imunoexpressão da proteína PI3K fosforilado com
as variáveis demográficas e clínico patológicas de pacientes com
CAC (n=36).
41
Tabela 8 -
Associação da imunoexpressão da proteína AKT citoplasmática
fosforilada com variáveis demográficas e clínico patológicas de
pacientes com CAC (n=37).
42
Tabela 9 -
Associação da imunoexpressão proteína AKT nuclear fosforilada
com variáveis demográficas e clínico patológicas de pacientes
com CAC (n=36).
43
Tabela 10 -
Associação da imunoexpressão da proteína AKT citoplasmática e
nuclear com variáveis demográficas e clínico patológicas de
pacientes com CAC (n=36).
44
Tabela 11 -
Associação da imunoexpressão da proteína PTEN com variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=32).
45
LISTA DE ABREVIATURAS
CAC
SPEN
NOTCH1
KRAS
BRAF
MYB
NFIB
PI3K
TP53
EGFR
PTEN
KIT
FGFR2
KDM6A
CREBBP
FGF
IGF
5 – FU
HER2
c- KIT
RTKs
AJCC
TNM
HE
FGFR
PI3CA
PDK1
AKT
HCB
SAME
TMA
Carcinoma adenoide cístico
Spen Family transcriptional repressor
gene Notch
Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog
v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1
v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog
nuclear factor I/B
Proteína Fosfatidilinositol 3-cinase
gene supressor tumoral TP53
Receptor do fator de crescimento epidérmico
Phosphatase and Tensin homolog
gene localizado no cromossomo 4q12
Receptor 2 do fator de crescimento dos fibroblastos
Desmetilase específica lisina K 6A
CREB binding protein
Fator de crescimento dos fibroblastos
Fator de crescimento da insulina
5 –fluoracil
Receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2.
Receptor tirosina quinase KIT
Receptores tirosina cinases
“American Joint Committee on Cancer”
Sistema de estadiamento de câncer da União Internacional contra o
Câncer (UICC).
Hematoxilina e Eosina
Receptor de fator de crescimento de fibroblastos
gene Fosfatidilinositol 3-cinase
Gene Piruvato Desidrogenase Kinase 1
proteína cinase B
Hospital de Câncer de Barretos
Serviço de Arquivo de Estatística Médica
Coletânea de microarranjos teciduais
LISTA DE SÍMBOLOS
≥
α
N
%
Maior ou igual
Alfa
Número amostral
Porcentagem
RESUMO
Silva MFZ. Caracterização da frequência de imunoexpressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT, PTEN e suas
associações clinicopatológicas em portadores de carcinoma adenoide cístico de cabeça e pescoço. Dissertação.
Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2014.
JUSTIFICATIVA: O Carcinoma Adenoide Cístico (CAC) é uma neoplasia rara que acomete predominantemente
glândulas salivares, considerado rádio sensível e quimio resistente, com alta taxa de morbimortalidade e sem
tratamento com resultados satisfatórios em longo prazo. Uma vez que este tumor tem frequências baixas de
mutação demonstradas em estudos de sequenciamento de todo o genoma, surge a necessidade de caracterização
de outros mecanismos genéticos, além da presença de mutações, e o estudo das vias de sinalização ativas que
possam estar associadas à gênese e progressão desses tumores para que busquemos alternativas terapêuticas
que possam ter efetividade clínica significativa a curto e longo prazo. OBJETIVOS: Avaliar a frequência de
imunoexpressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT, PTEN, assim como das formas fosforiladas de PI3K e AKT,
buscando verificar associações com parâmetros clínico-patológicos em Carcinomas Adenoides Císticos de Cabeça
e Pescoço. MATERIAIS E MÉTODOS: Estudo observacional transversal com 44 pacientes admitidos no
departamento de cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital de Câncer de Barretos com diagnóstico de Carcinoma
adenoide cístico. Foi construída uma coletânea de amostras teciduais (TMA) para avaliação da imunoexpressão
das proteínas FGFR1 total, PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforiliado e PTEN total e as lâminas foram
submetidas às reações de imunohistoquímica em plataforma automatizada. A análise descritiva foi realizada para
descrever a frequência de imunoexpressão das proteínas. A sobrevida livre de doença e global foram calculadas
utilizando Kaplan-Meier, e o teste de long rank foi empregado para comparação entre as variáveis plotadas na
curva. RESULTADOS: Dos 44 casos avaliados, 25 se originaram em glândulas salivares menores (56,9%) e 19
(43,1%) ocorreram nas glândulas salivares maiores, sendo 11 dos 19 casos (57,9%) originados nas glândulas
parótidas. Presença de imunoexpressão de FGFR1 total em 35 casos (97,2%), PI3K total em 25 casos (75,7%), PI3K
fosforilado em 17 casos (47,2%), AKT total em 35 casos (100,%), AKT fosforilado em 35 casos (94,5%) e PTEN em
23 casos (28,1%). CONCLUSÕES: Não houve associação entre a imunoexpressão dos marcadores FGFR1 total, PI3K
total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total com nenhuma das variáveis clínico-patológicas e
também com a sobrevida livre de doença e sobrevida global. O estadiamento clínico mais avançado (III/IV), o
maior estadio patológico (pT) e a presença de metástase linfonodal (pN) foram associados à menor sobrevida livre
de doença e menor sobrevida global nos portadores de CAC. Ainda na sobrevida global, o sexo masculino e o
etilismo foram fatores associados à menor sobrevida destes pacientes.
PALAVRAS-CHAVE: Neoplasias de Cabeça e Pescoço; Glândulas Salivares; Neoplasias das Glândulas Salivares;
Carcinoma Adenoide Cístico; Imuno-Histoquímica; Proteínas.
ABSTRACT
Silva MFZ.Characterization of the immunoexpression frequency of the FGFR1, PI3K, AKT, PTEN and
their clinicopathological associations in patients with adenoid cystic carcinoma of the head and neck.
Barretos: Barretos Cancer Hospital; 2014.
BACKGROUND: Adenoid Cystic Carcinoma (ACC) is a rare neoplasm that predominantly affects the
salivary glands, and is radio sensitive and chemo-resistant, with a high mortality rate without longterm treatment satisfactory results. Since this tumor has low frequency of mutations demonstrated
in studies of whole genome sequencing, the necessity of characterizing other genetic mechanisms,
and the study of signaling pathways that plays a role in this tumor that can be associated with the
genesis and tumor progression is critical for seeking new therapies that may have a significant impact
on disease control and overall survival improvement. OBJECTIVES: To evaluate the immunostainning
frequency of FGFR1, PI3K, AKT, PTEN proteins, as well as the phosphorylated forms of PI3K and AKT,
looking for associations with clinicopathological parameters and disease free and overall survival in
adenoid cystic carcinomas of the head and neck. MATERIALS AND METHODS: Cross-sectional
observational study of 44 patients admitted to the Barretos Cancer Hospital Head and Neck surgery
department with a diagnosis of adenoid cystic carcinoma. The samples were organized in a tissue
microarray (TMA) to assess the immunostainning of FGFR1, PI3K, phosphor-PI3K, AKT, and phosphoAKT and PTEN. A descriptive analysis was performed to describe the frequency of immunostaining of
the selected markers. The overall and disease-free survival were calculated using Kaplan-Meier
method, and the long rank test was used to compare the variables plotted on the curve. RESULTS: Of
the 44 cases evaluated, 25 were located in the minor salivary glands (56.9%) and 19 (43.1%) on the
major salivary glands. Eleven of the 19 cases (57.9%) were located in the parotid glands. FGFR1 was
positive in 35 cases (79.5%), PI3K in 25 cases (56.8%), phospho-PI3K in 17 cases (38.6%), AKT in 35
cases (79, 5%), phosphor-AKT in 35 cases (94.6%) and PTEN in 23 cases (52.3%). CONCLUSIONS: We
didn´t find any association between FGFR1, PI3K, phosphor-PI3K, AKT, phosphor-AKT and PTEN with
clinicopathological parameters and with disease free and overall survival. The most advanced clinical
stage (III/IV), pathological stage (pT) and lymph node metastasis (pN) were associated with shorter
disease-free survival and shorter overall survival in patients with ACC. We also observed shorter
overall survival associated with male sex and alcohol consumption
Keywords: Head and Neck Neoplasms; Salivary Glands; Salivary Gland Neoplasms; Adenoid Cystic,
Carcinoma; Immunohistochemistry; Proteins.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia
As neoplasias de cabeça e pescoço acometem anualmente aproximadamente
900.000 pessoas, sendo a sexta causa mais prevalente de morte por câncer 1. Com uma
ampla extensão de sítios anatômicos acometidos, dentre eles a cavidade oral, lábios,
glândulas salivares, seios da face, cavidade nasal, faringe, laringe, hipofaringe, esôfago e
traquéia.
Dentre os agentes mais comumente associados à iniciação e progressão de alguns
tipos clássicos de tumores de cabeça e pescoço, está a exposição aos agentes presentes no
cigarro e ingestão frequente de álcool. No contexto geral, aproximadamente 75% das
neoplasias de cabeça e pescoço tem atribuídos ao seu início e progressão a combinação
álcool e cigarro 2.
Localizadas na região da cabeça e do pescoço, as glândulas salivares são unidades
formadas por componentes morfofuncionais cuja função exclusiva é a secreção de saliva na
cavidade oral, objetivado a umidificação, lubrificação, digestão dos alimentos ingeridos e a
destruição de patógenos presentes na cavidade oral. Essas glândulas por sua vez, são
estratificadas em dois grupos, as glândulas salivares maiores e glândulas salivares menores e
ainda classificadas quanto ao tipo de secreção que produzem 3.
As glândulas salivares maiores constam de três pares: glândula parótida (localizada
ao lado do ouvido) e classificada como uma glândula serosa pela característica da secreção
que produz, glândula submandibular (localizada sob o arco mandibular) e classificada como
uma glândula mista e a glândula sublingual (localizada no assoalho bucal) e classificada como
uma glândula mucosa 4.
As glândulas salivares menores são apresentadas em número aproximado de 600 a
1.000 e estão espalhadas pela cavidade oral, lábios, seios da face, cavidade nasal, faringe,
laringe, esôfago e traquéia 3 4.
Dez a quinze por cento das neoplasias das glândulas salivares são malignas,
correspondendo a cerca de 3% de todas as neoplasias malignas de cabeça e pescoço5. As
2
frequências de localização, idade e gênero variam entre os tipos histológicos, de acordo com
raça e localização geográfica 6 7 8.
Em relação à etiologia, alguns fatores citados e comumente relacionados às
neoplasias em glândulas salivares são a ingestão de álcool, exposição aos agentes
ocupacionais como o pó originado da madeira 5.
As neoplasias das glândulas salivares são relativamente incomuns e tem histologia
complexa com incidência global de 0.4-13.5 por 100.000 pessoas anualmente e nos Estados
Unidos incidência de 2.2 a 2.5 casos por 100.000 pessoas 9 10.
Os sítios mais frequentes de neoplasias benignas são as glândulas parótidas (80%),
seguido pelas glândulas submandibulares (50%); o palato e as glândulas salivares menores
somam menos de 40% dos casos
10
5
. Os tumores benignos mais comuns são o adenoma
pleomórfico e adenoma de células basais, já os malignos são o carcinoma mucoepidermóide
e o Carcinoma Adenoide Cístico (CAC).
O CAC é uma neoplasia maligna relativamente rara, sendo a segunda neoplasia mais
comum em glândulas salivares com acometimento preferencial das glândulas salivares
menores (60%) e, entre as glândulas salivares maiores, a glândula parótida é o sítio
comumente mais atingido, sendo responsável por 25% dos tumores malignos dessa
topografia 11 12 13 8 .
O CAC não se restringe apenas aos sítios topográficos de cabeça e pescoço, sendo
incidente também ainda que com menor frequência em glândulas exócrinas como mama,
vulva, pele, próstata e vias aéreas 14 13 15.
No contexto geral, o CAC compreende de 10%-15% de todas as neoplasias de
glândulas salivares e corresponde a 1 % de todos os tumores de cabeça e pescoço 16 14.
É comumente diagnosticado em pacientes entre a 5ª e 7ª década de vida com
predileção pelo sexo feminino, enquanto sua etiologia e mecanismos moleculares ainda
permaneçam desconhecidos e sem uma caracterização bem estabelecida 17 18 16 19.
3
1.2 Comportamento Clínico
O CAC foi primeiramente descrito por Billroth no ano de 1959, mas foi nos anos de
1853 e 1854 que esta neoplasia foi melhor caracterizada por um grupo francês, que publicou
os primeiros relatos e descrições a cerca da aparência e comportamento clínico dos CAC que
até então eram descritos como cilindromas 12.
Já em 1974 Conley e colaboradores, o descreveram como um dos tumores mais
imprevisíveis e biologicamente destrutivos da cabeça e pescoço
12
.
Com todas essas
descrições, tornou-se bem estabelecido que quanto ao contexto clínico, o CAC apresenta
uma história natural caracterizada pelo crescimento lento, curso indolente, alta capacidade
de invasão perineural e metástase à distância tardia 20 7.
A literatura mostra que a sobrevida livre de doença em 5 anos ocorre em 65-70% dos
pacientes, porcentagem essa reduzida para 30-40% quando essa sobrevida é avaliada em 15
anos, caracterizando dessa forma o alto perfil de morbimortalidade apresentado pela
doença, a qual é a causa de óbito de 80%-90% dos pacientes nos 15 anos após o diagnóstico
inicial 21 22.
Entre os sítios mais incidentes de metástase, o pulmão é o mais frequente, seguido
pelos rins e ossos 23 24 . Além disso, uma vez identificadas lesões metastáticas, a sobrevida
média é de 20 a 32 meses, dependendo do local da metástase 12. A taxa de sobrevida de 3
anos após o diagnóstico varia de 41% a 46% 14 22 23.
Além da importância prognóstica dos sítios primário e metastático da neoplasia,
outros fatores contribuem para um prognóstico desfavorável: a histologia sólida (grau 3),
infiltração perineural em nervos de maior diâmetro, margens comprometidas à ressecção
cirúrgica e a presença de múltiplos sintomas. Além disso, a pior taxa de sobrevida é
conferida pela presença de metástase óssea 20.
4
1.3 Histopatologia
Histologicamente o CAC é constituído por uma dupla população celular, formada por
células epiteliais e mioepiteliais. As células têm fenótipo basalóide, núcleos pequenos,
angulados, com cromatina densa e exibem citoplasma muito exíguo, com capacidade de
produzir matriz extracelular que pode variar de aspecto mixóide a material hialino 21.
Patey e Thackray em 1958 estabeleceram a importância de se caracterizar o padrão
de crescimento deste tipo de tumor uma vez que a agressividade está diretamente ligada ao
padrão morfológico predominante. Desta forma, são identificados no CAC três padrões de
crescimento (Figura1), a partir da extensão predominante, sendo estes: tubular (grau I),
cribriforme (grau II) e sólido (grau III), nos casos que apresentam extensão de área sólida
≥30% 6 11.
O padrão tubular é constituído por células arranjadas em ninhos circundadas por
variável quantidade de material eosinofílico e frequentemente estroma hialinizado.
Ocasionalmente pode haver aumento importante do estroma levando a compressão dos
blocos celulares que podem ficar com aspecto trabecular. Túbulos bem formados são
facilmente reconhecidos, com uma camada interna epitelial e a externa mioepitelial.
O subtipo cribriforme é o mais frequente , composto de ilhas de células basalóides
circundando espaços císticos de tamanhos variados, dando um aspecto de queijo suíço.
O padrão sólido contém agregados de células basalóides sem formação tubular ou
cística. Nesse padrão as células podem ser maiores e pode haver maior pleomorfismo
nuclear 21 25.
Um quarto padrão de crescimento que previamente era descrito como CAC
desdiferenciado, foi melhor descrito por Leon Barns et al, como CAC com transformação de
alto grau. É importante o reconhecimento dessa variante uma vez que são tumores mais
agressivos e histologicamente são caracterizados por aumento e irregularidade nuclear,
elevado índice mitótico e perda da dupla população celular (epitelial e mioepitelial). A área
de transformação de alto grau se apresenta como adenocarcinoma cribriforme pouco
diferenciado ou carcinoma sólido indiferenciado com necrose e desmoplasia proeminentes.
Vale ainda ressaltar que esses tumores têm maior propensão à metástase ganglionar
locorregional e conferem uma menor sobrevida aos pacientes 26 27.
5
Segundo classificação atual da Organização Mundial da Saúde (OMS) o padrão de
crescimento deve ser relatado ao invés de se estabelecer uma frequência numérica para sua
classificação.
A
B
C
Figura 1 - Aspecto histopatológico dos padrões de crescimento do carcinoma adenoide
cístico com coloração hematoxilina-eosina: (A) Tubular; (B) Cribriforme; (C)Sólido.
1.4 Imunohistoquímica
Uma característica do CAC é sua constituição por uma dupla população celular, no
qual as células mioepitelias apresentam expressão de queratinas, actina de músculo liso,
calponina, p63, proteína S100 e proteína ácida gliofibrilar (GFAP). Enquanto, as células
epiteliais também expressam queratinas, porém, não expressam marcadores mioepiteliais.
Aproximadamente 78% a 100% dos CAC expressam c-KIT, marcação essa não
associada à presença de amplificação ou mutações do gene KIT. A frequência de mutações
do KIT é muito rara ou praticamente ausente
13 28
e quando presente mostrou-se não
funcional em culturas celulares 30. Somente um trabalho mostrou uma alta frequência (88%)
de mutações no gene kit 29, mas o mesmo foi severamente criticado pela falta de qualidade
metodológica30.
Alguns marcadores preditivos expressos pelo CAC e avaliados por método
imunohístoquímico incluem EGFR, HER-2, p53 31.
6
1.5 Alterações Citogenéticas e Moleculares
A constante busca por novas ferramentas diagnósticas e o aprimoramento de
tecnologias mais recentes, vem colaborando para melhor caracterização genética do CAC e
para seleção de futuros alvos terapêuticos.
Os trabalhos citogenéticos mostram alterações envolvendo os cromossomos 6 e 9,
especificamente a translocação 6q22-23 e 9p23-24, gerando a fusão oncogênica entre o
oncogene MYB, que está relacionado a processos básicos do ciclo celular, proliferação,
diferenciação e apoptose e o gene NFIB, um fator relacionado a transcrição humana
13 22
.
Assim, a fusão oncogênica MYB/NFIB (Figura 2) passa a ser analisada como uma assinatura
genética do CAC, presente em até 79% dos casos. Esta fusão pode ser considerada até
determinado ponto um biomarcador efetivo e auxiliar na detecção e confirmação desta
neoplasia, uma vez que não foi documentada em outras neoplasias de glândulas salivares 13,
22 32 33
.
Figura 2 - Representação esquemática da translocação entre os cromossomos 6q22-23 e
9p23-24 na fusão oncogênica MYB/NFIB.
(Fonte: Referente a Persson M, Andren Y, Mark J, Horlings HM, Persson F, Stenman G. Recurrent fusion of MYB and NFIB
transcription factor genes in carcinomas of the breast and head and neck. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(44):18740-4.)
Stephens et al
33
ao sequenciarem o exoma completo de 24 amostras de CAC,
identificaram 312 mutações somáticas, com destaque para as mutações no gene SPEN,
NOTCH1, além de mutações pontuais envolvendo os oncogenes KRAS e BRAF; mutações
estas já descritas e empregadas em terapias alvo dirigidas para outras neoplasias, sugerindo
dessa forma, a exploração destes oncogenes e vias de sinalização como futuros e
promissores alvos terapêuticos no tratamento do CAC.
7
Frierson et al 34 ao reportarem os resultados encontrados na análise do exoma de 24
amostras de CAC, identificaram a presença da translocação MYB/NFIB em 79% das amostras,
confirmando neste caso está translocação como uma assinatura genética do CAC, enquanto
mutações em PI3K ocorreram em apenas um caso, e foram ausentes em TP53, BRAF, EGFR,
KRAS, PTEN e KIT. Foram também identificados, mutações no FGFR2 e NOTCH1/2 sugerindo
provável relação com a tumorigênese.
Ho et al
35
, ao reportarem os resultados encontrados em 60 amostras de sangue
periférico e tecido tumoral fresco de CAC, identificaram aproximadamente 22 mutações
somáticas por amostra e validaram 710 mutações não sinônimas distintas, entre, deleções
homozigotas, amplificações, alterações estruturais e mutações somáticas, fornecendo
evidências da ampla heterogeneidade e inconstância mutacional identificados nesta
neoplasia.
Aliás, ao identificarem as mutações com maior potencial oncogênico e/ou mais
recorrentes, evidenciaram o envolvimento direto dos genes PI3K, TP53, PTEN, SMARCA2,
KDM6A e CREBBP com o oncogene MYB, sinalização de PI3K, mutação nos reguladores da
remodelação da cromatina (35%), danos ao DNA, e uma frequência de 30% de mutações em
genes de grande importância da via de sinalização FGF/IGF/PI3K.
Cabe ressaltar que todos os trabalhos que fizeram a pesquisa de sequenciamento em
todo o genoma de CAC encontraram uma média muito baixa de mutações, quando
comparado com outros tumores sólidos, mostrando uma pequena heterogeneidade
mutacional entre as amostras.
1.6 Tratamentos
O CAC é uma neoplasia com curso clínico indolente e com comportamento clínico
bastante agressivo, logo, como conduta terapêutica a ressecção cirúrgica constitui a
principal modalidade de tratamento, entretanto a extensa infiltração local e a disseminação
através da invasão perineural característica nesta neoplasia frequentemente causam
dificuldade para a obtenção de um controle efetivo do tumor com a cirurgia isolada 36 37.
A ressecção cirúrgica objetiva o controle loco-regional da doença, tentando preservar
ao máximo a funcionalidade do local acometido e reduzindo a probabilidade de
disseminação à distância da neoplasia17. Complementar à ressecção, o tratamento
radioterápico adjuvante pode beneficiar o paciente uma vez que este tumor é radio sensível,
8
entretanto, como modalidade única de tratamento a radioterapia não propicia a cura da
doença, mas sim é efetivo na maioria dos casos para redução do volume tumoral e
concomitante à cirurgia tem papel importante no controle local da doença 38. Logo, a
radioterapia como opção isolada de tratamento não se mostra como uma conduta
terapêutica elegível para fins de cura, mas poder ser considerada isoladamente como
tratamento paliativo 18 28.
Também considerada como efetiva para o controle do CAC, embora com altas taxas
de toxicidade nos pacientes, a terapia com feixes de nêutron tem mostrado eficácia no
controle da recorrência local com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 45% 20.
Com papel menos importante na adjuvância que o apresentado pela radioterapia, a
quimioterapia vem sendo utilizada associada à radioterapia como método terapêutico. As
drogas mais comumente utilizadas são a carboplatina e o paclitaxel, que exibem resposta
terapêutica não muito efetiva16. A quimioterapia tem sido indicada em neoplasias
localmente avançadas, em tumores recidivados ou metastáticos, mesmo não se
comprovando uma diferença significativa no controle local e nem na melhora da sobrevida
destes pacientes, entretanto há o benefício da melhoria dos sintomas, principalmente da
dor, relatada pelos pacientes 20 24 39.
Existem poucas publicações que reportam o tratamento de mais de 10 pacientes, a
maioria deles utilizando uma única droga e apenas dois trabalhos utilizando mais de duas
drogas. Os melhores resultados foram obtidos com a utilização de cisplatina, onde Schramm
et al conseguiu resposta completa em 4 (40% e 29%) dos pacientes tratados, entretanto
nenhum outro trabalho conseguiu reproduzir tais resultados, o que a maioria dos trabalhos
mostrou foi uma estabilização da doença com o uso de uma única droga isolada (5-FU,
Mitroxantrona, epirubicina, Paclitaxel e Gencitabina) 20 40.
As drogas terapia alvo dirigidas como inibidor de c-KIT (Imatinib) e inibidor de EGFR
(Gefitinib, Cetuximab), inibidor de proteossoma (Bortezomib) e inibidor de HER-2 e EGFR
(Lapatinib), já foram testadas em CAC, e todas elas se mostraram úteis na estabilização da
doença. Dentre elas, o Cetuximab foi o que mostrou maior taxa de estabilização da doença
(80%)20. Devido à hiper-expressão imunohistoquímica de C-KIT em CAC foi tentado o
tratamento com Imatinib, com resultados muito variados, alguns mostrando estabilização da
doença 41 42. No entanto, os trabalhos relatam a ausência de uma resposta objetiva frente a
9
terapias alvo dirigidas e também relatam observar a progressão tumoral durante o
tratamento 43.
Um recente estudo de fase II ao empregar o fármaco Sunitinib, não evidenciou taxa
de cura ou resposta à droga, entretanto mostrou uma estabilização da neoplasia durante
aproximadamente 7,2 meses em 62% dos pacientes submetidos a está terapia alvo dirigida
44
.
Papaspyrou et al publicaram no ano de 2011, um estudo que reunia as taxas de
respostas a 7 agentes quimioterápicos clássicos e que foram reportadas em 10 trabalhos
científicos publicados entre 1980-2008. Em todos os trabalhos (Figura 3), foi utilizado um
único quimioterápico como terapia isolada, todas as taxas de respostas foram baixas e
comumente com curta duração terapêutica 20.
Agentes
Quimioterápico
5-Fluoracil
Cisplatina
Autores
Tannock and
Sutherland
Schramm et al
Ano
Portadores
de CAC
Resposta
Completa
Resposta
Parcial
Resposta
Global
Doença
Estável
1980
12
0 (0%)
-
4 (33%)
2 (17%)
1981
10
4 (40%)
3 (30%)
7 (70%)
0 (0%)
Suen e Johns
1982
14
4 (29%)
5 (36%)
9 (64%)
-
Licitra et al
1991
13
2(15%)
0 (0%)
2 (15%)
6 (46%)
de Haan et al
1992
10
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
5 (50%)
Mattox et al
1990
18
1 (6%)
0 (0%)
1 (6%)
12 (67%)
Verweij et al
1996
32
0 (0%)
4 (12%)
4 (12%)
22 (69%)
Vermoken et al
1993
20
0 (0%)
2 (10%)
2 (10%)
10 (50%)
Vinorelbine
Airoldi et al
2001
13
0 (0%)
2 (13%)
2 (13%)
-
Paclitaxel
Gilbert et al
2006
14
0 (0%)
0 (%)
0 (0%)
-
Gencitabine
van Herpen et al
2008
21
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
11 (53%)
Mitoxanthrone
Epirubicin
Figura3 - Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico a agentes
quimioterápicos clássicos.
(Fonte: Modificado de Papaspyrou G, Hoch S, Rinaldo A, Rodrigo JP, Takes RP, van Herpen C, et al. Chemotherapy and
targeted therapy in adenoid cystic carcinoma of the head and neck: a review. Head Neck. 2011;33(6):905-11.)
No mesmo estudo foram avaliadas as taxas de respostas encontradas em 7 trabalhos
científicos (Figura 4) com fármacos alvo dirigidos, e observaram uma ausência completa de
resposta dos pacientes a todas as drogas estudadas bem como resposta parcial e global
praticamente ausentes pós tratamento 20.
10
Agentes
Quimioterápico
Autores
Ano
Portadores
de CAC
Resposta
Completa
Resposta
Parcial
Resposta
Global
Doença
Estável
Imatinib,
Cisplatina
Slevin et al
2004
12
0 (%)
1 (8%)
1 (8%)
5 (42%)
Gefitinib
Glisson et al
2005
19
0 (%)
0 (%)
0 (%)
13 (68%)
Imatinib
Hotte et al
2005
15
0 (%)
0 (%)
0 (%)
9 (60%)
Bortezomib
Argiris et al
2006
25
0 (%)
0 (%)
0 (%)
16 (64%)
Lapatinib
Aguinik et al
2007
19
0 (%)
0 (%)
0 (%)
15 (79%)
Imatinib
Pfeffer et al
2007
10
0 (%)
0 (%)
0 (%)
2 (20%)
Cetuximab
Locati et al
2009
23
0 (%)
0 (%)
0 (%)
20 (87%)
Figura 4 - Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico a agentes
quimioterápicos alvo dirigidos.
(Fonte: Modificado de Papaspyrou G, Hoch S, Rinaldo A, Rodrigo JP, Takes RP, van Herpen C, et al. Chemotherapy and
targeted therapy in adenoid cystic carcinoma of the head and neck: a review. Head Neck. 2011;33(6):905-11.)
A Adenoid Cystic Carcinoma Research Foundation localizada em NeedhamMassachusets publicou resultados encontrados nos 10 últimos anos dedicados aos ensaios
clínicos com pacientes portadores de CAC e submetidos ao uso de diversos quimioterápicos
clássicos e alvo dirigido com a proposta de encontrar, estabelecer e validar novas opções
terapêuticas nos ensaios clínicos que conduzem. Ao final, relataram que apesar de um
número alto de ensaios clínicos, os resultados ainda eram bastante limitados principalmente
pela alta frequência de ausência de resposta completa e parcial (Figura 5) 18 45.
11
Agentes
Quimioterápico
Paclitaxel e
Carboblatina
Vinorelbine e
Cisplatina
Vinorelbine
Gefitinib
Imatinib
Paclitaxel
Bortezomib
Lapatinib
Imatinib
Gemcitabine
Sunitinib
Cetuximab
Gemcitabine e
Cisplatina
Imatinib e
Cisplatina
Alvos Moleculares
Ano
Pacientes
com CAC
Resposta
Completa
Resposta
Parcial
Doença
Estável
Quimioterápicos
2000
10
0%
20 %
NA
Quimiterápicos
2001
9
22%
22%
NA
Quimioterápico
EGFR
Múltiplos alvos
Quimioterápico
Proteasome
EGFR, HER2
Múltiplos alvos
Quimioterápico
Múltiplos alvos
EGFR
2001
2005
2005
2006
2006
2007
2007
2008
2008
2009
13
19
15
14
25
19
10
21
12
23
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
15%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
NA
68%
60%
50%
64%
79%
70%
52%
92%
87%
Quimioterápicos
2009
10
0%
20%
NA
Múltiplos avos e
Quimioterápicos
2010
28
0%
11%
68%
Figura 5 - Taxa de resposta de portadores de carcinoma adenoide cístico a agentes
quimioterápicos clássicos e alvos dirigidos.
(Fonte: Modificado de Adenoid Cystic Carcinoma Research Foundation – www.accrf.org)
Esses dados nos revelam a magnitude e a complexidade que é o tratar o CAC. Todos
os esforços terapêuticos associados à utilização de quimioterápicos clássicos, isoladamente
ou em combinação, assim como a utilização de múltiplas drogas alvo utilizadas isoladamente
ou em combinação com quimioterápicos clássicos como platina e taxanos também falharam
em mostrar resultados satisfatórios para o tratamento do CAC.
1.7 Fator de crescimento de fibroblastos (FGF)
Os receptores tirosina quinases (RTKs), abrangem um ampla família de proteínas
transmembranas com arquitetura celular bastante similar entre si e têm direta relação com
os processos clássicos relacionados ao controle do ciclo celular. Estes RTKs modulam funções
primordiais aos processos de homeostasia e estão diretamente envolvidos em alterações
genéticas bastante comuns ao câncer e doenças emergentes como o diabetes 46.
Dentre as 20 subfamílias dos RTKS, destaca-se a família dos fatores de crescimento
dos fibroblastos (FGF), que são pequenos polipeptídios com alta afinidade pela heparina e
12
diretamente responsáveis pelo controle de múltiplos processos relacionados ao
comportamento celular e o desempenho em funções importantes, relacionadas aos
processos básicos de regulação da angiogênese, reparo de tecidos e cicatrização de feridas
nos organismos adultos 47 48.
Os receptores do fator de crescimento dos fibroblastos (FGFR), por sua vez, são
expressos em vários sistemas orgânicos, entre eles o endotélio vascular, sugerindo que
exerçam um papel fundamental relacionado aos mecanismos homeostáticos e sua direta
relação com o comportamento celular e desempenho de funções básicas como proliferação,
diferenciação, migração e sobrevivência 47 49.
No entanto, os ligantes do FGF são 4 receptores de membrana altamente
conservados (FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4) que podem sofrer alterações como a
proliferação excessiva e sinalização constante, apresentando relação direta com mecanismos
diretamente envolvidos no estímulo e proliferação de células cancerosas. Dentre os
mecanismos mais comuns e bem descritos na literatura relacionados à carcinogênese, está a
modulação de mutações pontuais, indução de translocações cromossômicas, a amplificação
de genes receptores e consequentemente a promoção de angiogênese alterada 47.
Especificamente o FGFR1, localizado no cromossomo 8p11-12 foi identificado em
vários estudos e correlacionado em grande parte destes com algumas alterações genéticas
bastante comuns ao câncer. Sua amplificação está presente em aproximadamente 10% das
neoplasias de mama, 5% das neoplasias de ovários, em 3% das neoplasias hematológicas e
3% dos casos de rabdomiosarcomas, enquanto mutações pontuais e translocações
específicas são aparentemente raras nos casos de melanoma e leucemias mielóides crônicas
47 50
.
O mecanismo pelo qual o FGF estimula os FGFRs levando a transmissão de sinais
intracelulares e posterior ativação de múltiplas vias de transdução de sinais (Figura 6), dá-se
através da ligação do FGF (conjugado a heparina que confere maior estabilidade a ligação)
ao FGFR, seguido da dimerização dos FGFRs e transmissão de sinais extracelulares através da
autofosforilação e recrutamento de proteínas adaptadoras que levam a ativação de cascatas
de sinalização específicas e diretamente relacionadas ao controle do ciclo celular 46 47 51.
Myoken et al demonstraram que carcinomas adenoide císticos de glândula salivar
proveniente de 6 pacientes através do método imunohistoquímico encontravam-se
13
superexpressos apesar da localização variando entre membrana, citoplasma e núcleo do
FGFR52 53.
Figura 6 - Representação esquemática da cascata de sinalização decorrente de ativação pelo
FGF.
(Fonte: Referente a Turner N, Grose R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer.
2010;10(2):116-29.)
1.8 Via de sinalização PI3K/AKT/PTEN
Fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K), são cinases lipídicas codificadas pelo gene PI3CA,
localizado no cromossomo 3q23. Essa família de cinases são heterodímeros classicamente
ativado por RTKs, que têm uma subunidade catalítica (p110) e uma subnunidade
reguladora/adaptadora (p85), que tem a função de fosforilar 3´-hidroxila em fosfolípides de
inositol. A ativação de PI3K rapidamente promove a conversão de PIP2 em PI3-4-5-P3 (PIP3),
um segundo mensageiro que recruta um subgrupo de proteínas de sinalização com
14
homologia Pleckstrin (PH) para a membrana, inclusive PDK1 e AKT (Figura 7). A ativação de
PI3K desempenha funções relacionadas à regulação do ciclo celular, diferenciação,
proliferação e sobrevivência.
Figura 7 - Representação esquemática da ativação das proteínas PI3K e AKT decorrente ao
estímulo do receptor de fator de crescimento.
(Fonte: Referente a Vara JAK CE, Castro J de, Cejas P, Belda-Iniesta C, González-Barín M. PI3K/Akt signalling pathway and
cancer. Cancer Treat Rev. 2004:193-204.)
No entanto, mutações, amplificações, superexpressão e deleção deste gene
passaram a ser observadas em neoplasias gástricas, do ovário e mama, passando assim este
gene a ser considerado um potencial alvo para terapias direcionadas no tratamento do
câncer, já que apresenta relação direta na regulação do crescimento e angiogenêse tumoral
54 55 56
.
Além disso, o PI3K controla várias vias de sinalização, no qual a proteína cinase B
(AKT), destaca-se como seu maior alvo. Esta proteína é fundamental na modulação do
crescimento, diferenciação, sobrevivência e progressão do ciclo celular por bloquear a
função das proteínas pro-apoptóticas. Por mediar esses mecanismos, apresenta relação
direta com processos fisiológicos, angiogênicos e amplificações comuns em neoplasias de
mama, pâncreas, ovário e estômago, apresentando assim potencial alvo para terapias
dirigidas 57 56 55.
15
A partir do potencial exploratório observado na via de sinalização PI3K/AKT como
proteínas que desempenham papel fundamental na regulação e proliferação do ciclo celular
e a relação direta com múltiplas neoplasias, a ativação desta via de sinalização sem mutação
dos genes, tem sido descrita frequentemente em câncer de mama, pâncreas, esôfago,
ovário, tireoide entre outras neoplasias 57.
Nesta via de sinalização, a proteína fosfatase homóloga à tensina deletada do
cromossomo 10 (PTEN) exerce participação como supressor tumoral, regulador negativo ou
diminuição progressiva dos níveis, quando dar-se-á perda de sua função, o resultado é a
consequente ativação permanente e ou constitutiva de PI3K pela desfosforilação PI(3,4,5)P3
na posição 3′ e consequentemente de AKT 58.
Análises pré-clínicas em células de câncer de mama demonstram a relação entre
ativação do FGFR e a via PI3K/AKT
59
. Estudos pré-clínicos em linhagens celulares de
carcinomas adenoide cístico demonstraram que a utilização de quercetina e flavanóide
natural, inibe a expansão das linhagens celulares tumorais através da regulação negativa da
via PI3K/AKT apontando para uma ligação entre a via PI3K e a carcinogênese destes tumores
60
.
Os principais mecanismos pelos quais o FGFR promove a ativação inadequada da via
de sinalização, PI3K/AKT, são através da superexpressão do gene FGFR1, que ocorre
mediante a amplificação ou transcrição aberrante, aumento da disponibilidade dos fatores
de crescimento, dentre outros 52 59.
A ativação anômala da via PI3K ocorre com mais frequência por mutações no gene
PI3CA responsável pela subunidade catalítica p110. Essas alterações são mais comumente
via amplificação do gene e mutações pontuais, onde 80% ocorre em 3 hot spots já
conhecidos
61
. A AKT é uma proteína fundamental na transdução de sinal, situando-se na
intersecção da via PI3K com outras vias intracelulares. Mutações no gene PI3CA ou
inativação do PTEN promovem sua ativação 61.
A maior parte do conhecimento da via PI3K foi estabelecida a partir de estudos
relacionados ao gene PTEN. Este gene tem função antagonista na sinalização desta via,
assim quando sua atividade está reduzida, devido mutações inativadoras, na qual ocorrem
acúmulo de PIP3 (fosfatidilinositol3-4-5-trifosfato) que mantém a via de sinalização com
hiperatividade através da fosforilação da proteína AKT 61.
16
Ressalta-se
que
mutações
em
múltiplos componentes
da
via não
são
necessariamente redundantes, mesmo que ambos aumentem a sinalização da via PI3K,
exemplo mutação do gene PI3CA e PTEN, em carcinomas de endométrio, onde se sugere um
efeito aditivo ou talvez sinérgico 61.
17
2 JUSTIFICATIVA
O
Carcinoma
Adenoide
Cístico
é
uma
neoplasia
rara
que
acomete
predominantemente glândulas salivares, considerado rádio sensível e quimio resistente,
com alta taxa de morbimortalidade e sem tratamento com resultados satisfatórios em longo
prazo. Uma vez que este tumor tem frequências baixas de mutação demonstradas em
estudos de sequenciamento de todo o genoma, surge a necessidade de caracterização de
outros mecanismos genéticos, além da presença de mutações, e o estudo das vias de
sinalização ativas que possam estar associadas à gênese e progressão desses tumores para
que busquemos alternativas terapêuticas que possam ter efetividade clínica significativa a
curto e longo prazo.
Haja visto que há escassa literatura que reporte a frequente hiperexpressão de
FGFR1 em Carcinoma adenoide cístico e que existem estudos clínicos em andamento
testando a efetividade do fármaco Dovitinib, que é um inibidor de FGFR1 em carcinomas
adenoides císticos, levantamos a necessidade de estudar o papel do FGFR1 como uma
proteína que quando fosforilada fosse capaz de ativar a via PI3K-AKT, tendo assim papel
chave no crescimento, invasão e progressão tumoral, tornando o FGFR1 um importante alvo
terapêutico.
2.1 Hipótese
Caracterizando a expressão das proteínas FGFR1, PI3K( total e fosforilada), AKT (total
e fosforilada) e PTEN isoladamente, poderíamos indiretamente inferir sobre a ativação de pAKT via ativação de FGFR1.
18
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a frequência de imunoexpressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT, PTEN, assim
como das formas fosforiladas de PI3K e AKT, buscando verificar associações com parâmetros
clínico-patológicos em Carcinomas Adenoide Císticos de Cabeça e Pescoço.
3.2 Objetivos específicos
1.
Descrever a frequência de imunoexpressão de FGFR1 total, PI3K total, PI3K
fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total em Carcinomas
adenoides císticos;
2.
Verificar a associação da imunoexpressão das proteínas FGFR1 total, PI3K
total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total com
parâmetros clínico-patológicos.
3.
Avaliar a associação da imunoexpressão das proteínas FGFR1 total, PI3K total,
PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total com sobrevida
global e sobrevida livre de doença.
4.
Avaliar a sobrevida global e livre de doença nos pacientes com carcinoma
adenoide cístico.
19
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Ética na Pesquisa
Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de
Barretos e obteve aprovação sob número 135.352/29.10.2012.
Por se tratar de um estudo retrospectivo de casos, não foi aplicado o termo de
consentimento livre e esclarecido. Os dados clínicos foram obtidos exclusivamente por meio
de prontuários arquivados no Serviço de Arquivo de Estatística Médica (SAME).
4.2 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional transversal.
4.3 Critérios de inclusão
1. Pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma adenoide cístico de cabeça e
pescoço com idade ≥ 18 anos.
2. Pelo menos 1 bloco de parafina do tumor primário que não foi submetido a
qualquer tratamento radioterápico ou quimioterápico prévio, e que esteja disponível no
arquivo do Serviço de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos.
4.4 Critérios de exclusão
1. Material tumoral insuficiente para confecção do tissue microarray (TMA).
4.5 Instrumento de Pesquisa
Para correta caracterização da população de estudo e estratificação do perfil de
pacientes atendidos pelo departamento de cabeça e pescoço do Hospital de Câncer de
Barretos (HCB) foi elaborado um instrumento de pesquisa (Anexo 1) junto a dois médicos do
serviço de cabeça e pescoço do HCB.
20
4.6 População de estudo
A busca dos pacientes com Carcinoma Adenoide Cístico foi realizada junto ao
departamento de Registro Hospitalar de Câncer do HCB e nos arquivos do departamento de
Patologia do HCB.
Foram selecionados retrospectivamente 119 pacientes com diagnóstico histológico
de CAC atendidos no HCB até o ano de 2012. Para cada paciente, foi solicitado junto ao
SAME o seu prontuário médico e utilizando o instrumento de pesquisa como guia foram
coletadas informações necessárias para obtermos dados sobre a avaliação clinicopatológica,
informações sócio demográficas, estadiamento clínico, número de identificação de blocos
referente à biópsia ou peça cirúrgica tumoral incluídas em parafina, tratamentos realizados e
informações de seguimento.
Durante a avaliação do prontuário médico, as informações referentes a tabagismo e
etilismo (sim atual/sim passado; não atual/não passado) foram consideradas apenas quando
relatadas de maneira clara durante a anamnese do paciente, na ausência desta informação
no prontuário consideramos como informação ignorada.
Após, a revisão dos prontuários, todas as lâminas referentes à biópsia ou peça
tumoral que estavam fixadas e coradas com hematoxilina-eosina (HE) foram revisadas
quanto aos parâmetros histopatológicos de maior interesse nesta neoplasia, sendo:
topografia,
padrão
histológico
(tubular/cribriforme/sólido),
invasão
perineural
(presente/ausente), invasão angiolinfática (presente/ausente), extravasamento capsular
(presente/ausente) e o status das margens cirúrgicas (livres/comprometidas). Nos casos em
que os pacientes possuíam apenas material de biópsia e/ou que houve dificuldade em
avaliar presença ou ausência de invasão perineural e angiolinfática estes parâmetros não
foram descritos como ausentes e sim classificados como não-avaliáveis. Nos casos em que
não observamos a identificação dos blocos nos respectivos laudos anátomo-patológicos
consideramos as margens cirúrgicas como não avaliáveis.
Posteriormente, todas as informações registradas no instrumento de pesquisa foram
tabuladas em programa SPSS for Windows, versão 21.0 para estruturação do banco de
dados.
21
4.7 Confecção de TMA controle
Para uma melhor avaliação da qualidade das imunomarcações dos anticorpos FGFR1
total, PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforiliado e PTEN total nas amostras
tumorais de carcinoma adenoide cístico, inicialmente construiu-se um TMA controle para a
correta padronização de diluições e especificidade de imunomarcação.
Para tanto, elegeu-se 105 amostras tumorais entre peças e biópsias de diversas
origens topográficas entre elas mama, estômago, cólon, pele, rim, fígado, pulmão e glândula
salivar normal. A partir destas, a lâmina de HE destes tumores foram previamente avaliadas
e a área tumoral mais representativa delimitada com caneta permanente.
Uma vez delimitada as áreas mais representativas das amostras tumorais, foi traçado
um mapa guia com a correta identificação, localização, e distância entre os cilindros para
auxílio na confecção do TMA.
Sendo assim, por meio de instrumento mecânico Beecher™ (Beecher Intruments,
Estigen, Estônia), foram criadas “caselas” no bloco receptor seguido da retirada de 1-2
cilindros ou “spots” de 1,0 milímetro de diâmetro do bloco doador e transferidos para o
bloco receptor em posição previamente mapeada gerando ao final, uma coletânea de
amostras teciduais de diversos sítios topográficos (Figura 8). Ao final, constava em único
bloco receptor de 1-4 cilindros oriundos dos 105 blocos doadores, na sequência foram
realizados 20 cortes com 4µm de espessura que foram transferidos e fixados para lâminas
com carga positiva StarFrost (Knittel Glaser, Bielefeld, Alemanha), das quais 1 lâmina foi
corada com HE, para avaliação em microscópio Nikon i50 da integridade de cada cilindro.
Posteriormente, estas lâminas foram submetidas às reações de imuno-histoquímica
em plataforma automatizada Ventana BenchMark Ultra® (Ventana, Tucson, AZ, USA) e na
sequência foram avaliadas quanto intensidade e extensão de imunomarcação até
estabelecimento da padronização ideal.
22
A
B
C
D
F
E
Figura 8 - Fluxograma representativo para obtenção de TMA: (A) Beecher Intruments
utilizado na confecção do TMA; (B) retirada de tecido tumoral (cilindro) do bloco doador;
(C-D) transferência e inserção de cilindro no bloco receptor; (E)confecção de cortes de 4µm
em micrótomo; (F) coletânea de amostras teciduais fixada em lâmina com carga positiva.
(Fonte: Referente a http://www.microarraystation.com/tissue-microarray/)
4.8 Confecção de TMA: Coletânea de Carcinomas adenoide císticos
Durante a revisão das lâminas para caracterização histopatológica dos CACs, a área
mais representativa do tumor primário foi delimitada com caneta permanente.
Como descrito previamente para a construção do TMA controle, foi confeccionado 1
bloco de TMA de CACs que continham de 1-3 cilindros tumorais de cada amostra,
dependendo da quantidade de material no bloco de parafina. Além, dos cilindros tumorais
originados de bloco de parafina de CAC, foram inseridos cilindros de outros órgãos como
pulmão, mama, rim e glioblastomas para facilitar a orientação espacial na lâmina no
momento da leitura.
Na sequência foram cortadas com micrótomo (Leica RM2235) 30 cortes histológicos
com 4µm micra de espessura que foram transferidos e fixados para lâminas com carga
positiva StarFrost (Knittel Glaser, Bielefeld, Alemanha), das quais 4 lâminas foram coradas
com hematoxilina-eosina, para avaliação em microscópio Nikon i50 da integridade de cada
cilindro.
23
4.9 Imunohistoquímica em plataforma automatizada
Com a finalidade de avaliação da imunoexpressão dos anticorpos FGFR1 total, PI3K
total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforiliado e PTEN total em CACs, as lâminas foram
submetidas às reações de imunohistoquímica em plataforma automatizada Ventana
BenchMark Ultra® (Ventana, Tucson, AZ, USA).
Inicialmente, todas as lâminas, foram previamente incubadas em estufa durante 20
minutos à temperatura de 1000 Célsius para desparafinização. Na sequência foram
transferidas para o equipamento Ventana BenchMark Ultra®, que possui um painel com
programas específicos e bem estabelecidos de incubação.
Uma vez inseridas na plataforma automatizada, as lâminas foram novamente
desparafinizadas, desta vez a 720 Célsius e receberam uma solução (1x) de lavagem EZ Prep
para remoção da parafina residual, seguido de uma lavagem com tampão, para posterior
recuperação antigênica com solução cell condicioner CC1 (Ventana, Tucson, AZ) de pH alto e
bloqueio das peroxidases endógenas com água oxigenada (H2O2). Após o bloqueio das
peroxidases, e com as diluições e tempo de recuperação antigênica padronizada para cada
um dos anticorpos inseridos no estudo, procedeu-se a incubação das lâminas com o
anticorpo primário, seguido desta incubação, os cilindros histológicos receberam o anticorpo
secundário (Ultraview DAB, Ventana, Tucson, Az- USA), (Figura 9).
Ao final das reações imunohistoquímicas, procedeu-se a contra coloração com
hematoxilina de Harris (Hematoxilin II, Ventana), durante 4 minutos seguidos da incubação
com o reagente Bluing (Ventana) durante 4 minutos, resultando em uma coloração nuclear
azulada.
Na sequência, os cilindros receberam uma lavagem com solução de água e
detergente para remoção do óleo que é dispensado na superfície das lâminas para evitar
dessecamento do material. Ao final das reações imunohistoquímicas, as lâminas foram
retiradas da plataforma e submetidas à desidratação em banhos de etanol 70%, 85% e 100%
durante 2 minutos e após a secagem, procedeu-se a montagem das lâminas com uma gota
de resina sintética Entelan (Merck Millipore, Damstat, Alemanha.) e cobertura dos cilindros
com lamínula de 22x22 mm.
24
Anticorpo
(Ac)
FGFR1
Clone/espécie
Fabricante
Recuperação
(minutos/solução)
64CC1
Rabbit mAb
Cell Signaling
(D8E4) XP
Anti-PI3
Rabbit
abcam
8CC1
Kinase
monoclonal
[ep380y]
Anti-phospho- Rabbit polyclonal Bioss
Sem recuperação
PI3K
(Tyr524)
AKT (pan)
Rabbit mAb
Cell Signaling 64CC1
(C67E7)
Phospho-AKT Mouse mAb
Cell Signaling 64 CC1
(Ser473)
PTEN total
6H2.1 M3627/
Dako
PT Link high pH
Monoclonal
Figura 9 - Descrição de anticorpos utilizados, fonte e diluições
Incubação/Ac
Secundário
2H Ac
Diluição
44 Ac
1;100
32 Ac
1;100
32 Ac
1;300
32 Ac
1;100
20 Ac
FLEX
1;50
segundo padronização
imunohistoquímica.
4.9.1 Análise de imunoexpressão dos marcadores
(Anticorpos avaliados: FGFR1 total, PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT
fosforilado e PTEN total)
A partir dos testes de padronização inicial no TMA controle, foram realizados ajustes
quanto tempo de incubação com anticorpos, diluições e posterior avaliação para definição
das melhores concentrações e diluições de cada um dos anticorpos avaliados neste estudo.
Durante os testes de padronização foi priorizado o estabelecimento de um protocolo
imuno-histoquímico no qual a imunomarcação era altamente específica nas áreas tumorais.
Uma vez estabelecida a padronização imuno-histoquímica, o mesmo protocolo foi executado
no TMA com a população de CAC para posterior avaliação do estudo.
Para análise das imunonomarcações, foi utilizado o microscópio Nikon ECLIPSE 50i
juntamente ao sistema de aquisição de imagens NIS Elements F3.0
O perfil de expressão imunohistoquímico dos 44 pacientes foi avaliado por dois
observadores após a calibração visual inicial quanto à intensidade e extensão de
imunomarcação. Assim, tornaram-se elegíveis para análise apenas os cilindros com material
tumoral íntegro e marcação imunohistoquímica específica e sem fundo de coloração.
A expressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT nas formas totais e fosforiladas foram
avaliadas e classificadas a partir da extensão: 0. (negativo); 1. (até 10%); 2. (11% - 50%); 3.
25
(≥50% das células), e a intensidade: 1. (Fraco), 2. (Moderado) e 3. (Forte). Foram
considerados como positivos os casos onde a soma dos escores de extensão e intensidade
foram ≥ 4.
A imunomarcação de PTEN de acordo com Fang-Hua Li et al 62 foi avaliada de acordo
com a extensão e a intensidade da marcação. Quanto à extensão, foram classificados em 3
grupos:
1 (0-25%), 2 (26-50%) e 3 (≥ 50%), e quanto a intensidade os casos foram
classificados como 1( fraco), 2 (moderado) e 3 (forte). Para o PTEN foram considerados
positivos os casos com escore ≥ 5.
A proteína AKT fosforilada, permitiu análise nuclear e citoplasmática isoladamente.
Para correlacionar com nossas variáveis clinico patológicas, optamos por considerar a análise
citoplasmática comumente descrita na literatura.
4.9.2 Análise de sobrevida livre de doença e sobrevida global
Para análise de sobrevida livre de doença foi considerado o tempo, em meses, da
data de cirurgia até o aparecimento da primeira recidiva local, regional, á distância ou última
informação de seguimento. Somente os pacientes que sofreram tratamento com intenção
curativa e que não tinham metástase ao diagnóstico foi calculada a sobrevida livre de
doença.
Para análise de sobrevida global definiu-se o tempo, em meses, decorrente entre a
data de cirurgia e data de óbito ou última informação de seguimento.
4.9.3 Análise estatística
A análise descritiva foi realizada para descrever a frequência de imunoexpressão das
proteínas na forma total e fosforilada, e descrição das variáveis clinico-patológicas
estudadas, além de cálculos simples de porcentagem, média e mediana.
Para a análise comparativa realizamos testes de qui-quadrado e o teste exato de
Fisher, confrontando as características clinico-patológicas com a imunoxpressão das
proteínas FGFR1, PI3K, AKT e PTEN.
A sobrevida livre de doença e global foi calculada utilizando Kaplan-Meier, e o teste
de long rank foi empregado para comparação entre as variáveis plotadas na curva.
Todos os testes estatísticos foram realizados pelo software estatístico (Statistical
Package for Social Science – SPSS for Windows, versão 21).
26
5
RESULTADOS
5.1
Consistência de dados
Após a finalização da coleta e tabulação de dados clinicopatológicos em programa
SPSS, realizou-se a consistência de dados com um médico do serviço de cabeça e pescoço
para triagem e seleção apenas dos pacientes elegíveis e de interesse para o estudo.
Para tanto, a partir da população de estudo composta inicialmente por 119
pacientes, foram excluídos 19 pacientes com diagnóstico de CAC de outras topografias
exceto cabeça e pescoço, sendo 03 de colo uterino, 11 de mama, 03 de vulva, 01 de pulmão
e 01 de pele.
Quando analisados somente os casos de CAC de cabeça e pescoço, foram excluídos
56 pacientes, 30 por não possuírem bloco de parafina nos arquivos do departamento de
Patologia do HCB, 11 por terem somente bloco da recidiva ou metástase do tumor primário,
06 por já terem sido tratados com radioterapia ou quimioterapia prévia à ressecção
cirúrgica, 06 por apresentarem escassa quantidade de tumor no bloco de parafina,
impossibilitando assim a amostragem no TMA e outros 3 casos foram reclassificados pelo
patologista sendo 2 casos de adenoma canicular e 01 caso de carcinoma polimorfo de baixo
grau.
Ao final excluímos 75 pacientes por não estarem de acordo com os critérios de
inclusão e exclusão inicialmente propostos.
5.2 População do estudo
Tornaram-se elegíveis para o estudo 44 pacientes pertencentes à topografia de
cabeça e de pescoço, estes pacientes por sua vez a partir da localização primária foram
estratificados em dois grandes grupos: Glândulas salivares maiores (Glândulas parótida,
submandibulares e sublinguais) e Glândulas salivares menores (lábio, boca, seios paranasais,
laringe, faringe e cavidade nasal).
No período de 08/04/2014 a 10/04/2014, os prontuários referentes aos 44 pacientes
foram revistos para o estabelecimento do estádio patológico. Assim, a partir do sistema de
estadiamento TNM (AJCC 2007), foram revisadas as variáveis patológicas pT (tamanho
tumoral), pN (número de linfonodos positivos ao diagnóstico) e pM (presença ou ausência
27
de metástase ao diagnóstico), resultando assim no estadiamento clínico dos pacientes ao
diagnóstico.
Neste mesmo período, foram atualizadas as informações de seguimento dos
pacientes quanto ao status atual: óbito por câncer, óbito por outras causas, vivo com doença
e vivo sem doença a partir da data com a última informação registrada no prontuário
médico. Atualizamos também, a informação referente ao seguimento deste paciente e
consideramos a perda de seguimento referente a duas ausências em consultas médicas.
Ao final da revisão do seguimento clínico, concluímos a perda de seguimento de 16
pacientes. Os prontuários dos mesmos foram encaminhados ao departamento de Registro
Hospitalar do HCB para a atualização de informação a partir de ligação telefônica para os
pacientes, familiares ou cartórios da cidade de origem. Sendo assim, atualizamos a
informação de seguimento atual de 11 pacientes e apenas 05 continuaram com perda de
seguimento pela dificuldade em conseguir estabelecer contato com familiares e ausência de
informações em cartórios, neste contexto, para estes pacientes mantemos a última
informação de status vital.
28
5.3 Detecção de imunoexpressão
A
B
C
D
Figura 10 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de FGFR1 total. (A, B, C) imunomarcações positivas, x100, x400, x100. (D)
imunomarcação negativa, x100.
29
A
B
C
D
Figura 11 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de PI3K total. (A, B) imunomarcações positivas, x100, x200. (C, D)
imunomarcações negativa, x100, x200.
30
A
B
C
D
Figura 12 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de PI3K fosforilado. (A, B, C) imunomarcações positivas, x200, x100, x100. (D)
imunomarcação negativa, x100.
31
A
B
C
D
Figura 13 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de AKT total. (A, B) imunomarcações positivas, x100. (C) imunomarcação
negativa, x100. (D) imunomarcações negativa e positiva, x40.
32
A
B
AKT
FOSFORILADO
C
D
Figura 14 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de AKT fosforilado. (A) imunomarcação positiva, x100. (B) imunomarcação
positiva, x400. (C) imunomarcações positiva, x100. (D) imunomarcação negativa, x100.
33
A
B
C
D
Figura 15 - Imagens representativas de coloração imunohistoquímica em CAC para detecção
da expressão de PTEN total. (A) imunomarcação positiva e negativa, x200. (B)
imunomarcação positiva e negativa, x100. (C) imunomarcação positiva, x100. (D)
imunomarcação negativa, x100.
34
5.4 Caracterização da população
Este estudo foi composto por 44 pacientes, com média de idade de 50 anos, dos
quais 26 (59,1%) eram mulheres e 18 (40,9%) homens.
Com relação às informações clínico-patológicas 13(86,7%) dos pacientes relataram
dor ao diagnóstico, 15 (34,0%) apresentaram estádio precoce (I/II) e 29 (65,9%) estádio
avançado (III/IV), 3 (7,1%) apresentaram metástase linfonodal ao diagnóstico e o padrão
histológico mais comum foi o cribriforme 21 (47,7%).
Entre as características de maior agressividade do tumor, a presença de invasão
perineural foi observada em 38 (41,9%) dos casos e a invasão angiolinfática em 6 (14,0%).
Margens cirúrgicas comprometidas foram observadas em 17 (39,5%) dos casos.
A ressecção cirúrgica com intenção curativa foi realizada em 41 (93,2%) dos casos,
dos quais 27 (61,4%) realizaram ressecção total da lesão, seguido de tratamento
radioterápico adjuvante em 38 (86,4%) dos casos e apenas 1 (2,3%) caso de quimioterapia
adjuvante.
Durante a evolução clínica 25 (56,8%) dos pacientes não recidivaram localmente.
Entretanto, 14 (31,8%) apresentaram recidiva, a recorrência loco-regional foi presente em 5
(11,4%) e a evidência de metástases à distância em 12 (27,3%) dos casos, sendo as
topografias mais frequentes o pulmão 11 (25,0%) e ossos 2 (4,5%).
No decorrer da evolução clínica, ocorreram 13 óbitos (29,5%) pela doença,
entretanto, 7 pacientes (15,9%) permanecem vivos porém com doença em atividade e 24
pacientes (54,5%) tiveram remissão completa e estão vivos sem doença.
5.5 Caracterização topográfica
Dos 44 casos avaliados, 25 se originaram em glândulas salivares menores (56,9%) e
19 (43,1%) ocorreram nas glândulas salivares maiores, sendo 11 dos 19 casos (57,9%)
originados nas glândulas parótidas.
35
Tabela 1 - Dados demográficos, clínicos e histológicos dos portadores de carcinoma
adenoide cístico (Hospital de Câncer de Barretos, 15.02.2014 a 14.03.2014).
Variável
Categoria
Idade, mediana
n
(%)
46,44 (24,32-85,27)
Sexo
Feminino
Masculino
26
18
59,1
40,9
Dor ao diagnóstico
Não
Sim
2
13
13,3
86,7
Estadiamento clínico
I/II
III/IV
15
29
34,0
65,9
Metástase linfonodal
Ausente
Presente
39
3
92,9
7,1
Padrão histológico de crescimento
Tubular
Cribriforme
Sólido
17
21
6
38,6
47,7
13,6
Invasão perineural*
Não
Sim
24
18
55,8
41,9
Invasão angiolinfática*
Não
Sim
36
6
83,7
14,0
Tratamento primário
Cirurgia
Radioterapia
Quimioterapia
41
3
1
93,2
6,8
2,3
Status de margem cirúrgica**
Livre
Comprometida
7
17
16,3
39,5
Tratamento adjuvante
Radioterapia
Quimioterapia
38
1
86,4
2,3
36
Tabela 2 - Dados clínicos de portadores de carcinoma adenoide cístico (Hospital de Câncer
de Barretos, 15.02.2014 a 14.03.2014).
Variável
Categoria
N
(%)
Ressecção cirúrgica
Não realizada
Total
Parcial
Ressecção não declarada
3
27
10
4
6,8
61,4
22,7
9,1
Radioterapia
Não realizada
Adjuvante
Paliativa
3
38
3
6,8
86,4
6,8
Quimioterapia
Não realizada
Adjuvante
Adjuvante concomitante
à rxt
Paliativa
38
1
86,4
2,3
4
1
9,1
2,3
Recidiva
Não
Sim
Progressão
25
14
5
56,8
31,8
11,4
Recidiva local
Não
Sim
40
4
90,9
9,1
Recidiva regional
Não
Sim
43
1
97,7
2,3
Recidiva à distância
Não
Sim
32
12
72,7
27,3
Pulmão
Fígado
Pele
Ossos
Sistema nervoso central
11
1
1
2
1
25,0
2,3
2,3
4,5
2,3
Status vital
Óbito por câncer
Vivo com doença
Vivo sem doença
13
7
24
29,5
15,9
54,5
Perda de seguimento
Não
Sim
37
7
84,1
15,9
Topografia das metástases à
distância
37
Tabela 3 - Distribuição de sítios primários (n= 44).
Categoria
n
(%)
Glândulas salivares maiores
Parótida
Submandibular
19
11
8
43,2
57,9
42,1
Glândulas salivares menores
Laringe
Hipofaringe
Base da língua (orofaringe)
Assoalho da boca
Lábio superior
Boca
Bochecha
Palato mole (orofaringe)
Retromolar
Seios da face
Cavidade nasal
Fossa nasal
Seio maxilar
25
1
1
2
3
1
2
1
3
2
5
2
1
1
56,9
4,0
4,0
8,0
12,0
4,0
8,0
4,0
12,0
8,0
20,0
8,0
4,0
4,0
5.6 Frequência de imunoexpressão dos marcadores
Observamos a presença de imunoexpressão dos marcadores na frequência que
segue: FGFR1 total, 35 casos (97,2%), PI3K total, 25 casos (75,7%), PI3K fosforilado, 17 casos
(47,2%), AKT total 35 casos (79,5%), AKT fosforilado-nuclear, 23 casos (53,2%), AKT
fosforilado-citoplasmática, 35 casos (79,5%), AKT fosforilado citoplasmática e nuclear, 23
casos (52,3%) e PTEN, 23 casos (71,8%).
As frequências de imunoexpressão estão listadas na tabela 4. Não encontramos
nenhuma associação estatística significativa entre a imunomarcação dos anticorpos FGFR1,
PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado-nuclear, AKT fosforilado-citoplasma,
AKT fosforilado citoplasma e núcleo e PTEN, e as variáveis clínico patológicas e
demográficas.
38
Tabela 4 - Frequência de imunoexpressão das proteínas na forma total e fosforilada em
portadores de CAC.
Anticorpos
Categoria
Negativo
n (%)
Positivo
n (%)
FGFR1
Total
1 (2,8%)
35 (97,2%)
PI3K
Total
Fosforilado
8 (24,3%) 25 (75,7%)
19 (52,8%) 17 (47,2%)
AKT
Total
nuclear fosforilado
citoplasmática fosforilado
citoplasmática e nuclear fosforilado
0 (0,0%)
14 (31,8)
2 (4,5%)
14 (31,8)
35 (79,5%)
23 (52,3%)
35 (79,5%)
23 (52,3%)
PTEN
Total
9 (28,2)
23 (71,8%)
39
Tabela 5 - Associação da imunoexpressão da proteína FGFR1 total com as variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=36).
Variável
Categoria
Imunoexpressão
FGFR1 total
negativo
n (%)
FGFR1 total
positivo
n (%)
1 (2,8%)
35 (97,2%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
0 (0,0%)
1 (6,2%)
20 (100,0%) 0,444
15 (93,8%)
Tabagista
Não
Sim
0 (0,0%)
1 (7,7%)
21 (100,0%) 0,382
12 (92,3%)
Etilista
Não
Sim
0 (0,0%)
1 (10,0%)
23 (100,0%) 0,303
9 (90,0%)
Glândulas salivares
Menores
Maiores
1 (4,5%)
0 (0,0%)
21 (95,5%) 1,000
14 (100,0%)
Tubular
Cribriforme
Sólido
0 (0,0%)
1 (5,9%)
0 (0,0%)
14 (100,0%) 0,563
16 (94,1%)
5 (100,0%)
I/II
III/IV
0 (0,0%)
1 (4,0%)
11 (100,0%) 1,000
24 (96,0%)
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
0 (0,0)
1 (4,2%)
1 (3,0%)
0 (0,0%)
1 (2,9%)
0 (0,0%)
12 (100,0%) 1,000
23 (95,8%)
32 (97,0%) 1,000
2 (100%)
33 (97,1%) 1,000
2 (100,0%)
Padrão de
crescimento
histológico
Estadiamento
clínico
Estadiamento
patológico
Invasão perineural
Invasão
angiolínfatica
Não
Sim
19 (100,0%)
15 (100,0%)
Não
Sim
29 (100,0%)
5 (100,0%)
*Teste exato de Fisher
40
Tabela 6 - Associação da imunoexpressão da proteína PI3K total com as variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=33).
Variável
Categoria
Imunoexpressão
PI3K total
negativo
n (%)
PI3K total
positivo
n (%)
8 (24,3%)
25 (75,7%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
6 (30,0%)
2 (15,4%)
14 (70,0%)
11 (84,6%)
0,431
Tabagista
Não
Sim
5 (26,3%)
2 (16,7%)
14 (73,7%)
10 (83,3%)
0,676
Etilista
Não
Sim
5 (22,7%)
2 (25,0%)
17 (77,3%)
6 (75,0%)
1,000
Glândulas salivares
Menores
Maiores
4 (19,0%)
4 (33,3%)
17 (81,0%)
8 (66,7%)
0,420
Tubular
Cribriforme
Sólido
3 (23,1%)
5 (29,4%)
0 (0,0%)
10 (76,9%)
12 (70,6%)
3 (100,0%)
0,563
I/II
III/IV
2 (16,7%)
6 (28,6%)
10 (83,3%)
15 (71,4%)
0,678
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
2 (16,7%)
6 (28,6%)
7 (21,9%)
1 (100,0%)
8 (25,0%)
0 (0,0%)
10 (83,3%)
15 (71,4%)
25 (78,1%)
0 (0,0%)
24 (75,0%)
1 (100,0%)
0,678
Não
Sim
4 (22,2%)
4 (28,6%)
14 (77,8%)
10 (71,4%)
0,703
Não
Sim
6 (22,2%)
2 (40,0%)
21 (77,8%)
3 (60,0%)
0,578
Padrão de
crescimento
histológico
Estadiamento clínico
Estadiamento
patológico
Invasão perineural
Invasão
angiolínfatica
*Teste exato de Fisher
0,242
1,000
41
Tabela 7 - Associação da imunoexpressão da proteína PI3K fosforilado com as variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=36).
Variável
Categoria
Imunoexpressão
PI3K fosforilado
negativo
n (%)
PI3K fosforilado
positivo
n (%)
19 (52,8%)
17 (47,2%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
10 (50,0%)
9 (56,2%)
10 (50,0%)
7 (43,8%)
0,749
Tabagista
Não
Sim
10 (47,6%)
9 (69,2%)
11 (52,4%)
4 (30,8%)
0,296
Etilista
Não
Sim
13 (56,5%)
5 (50,0%)
10 (43,5%)
5 (50,0%)
1,000
Glândulas salivares
Menores
Maiores
12 (57,1%)
7 (46,7%)
9 (42,9%)
8 (53,3%)
0,736
Tubular
Cribriforme
Sólido
7 (46,7%)
9 (56,2%)
3 (60,0%)
8 (53,3%)
7 (43,8%)
2 (40,0%)
0,816
Estadiamento clínico
I/II
III/IV
6 (50,0%)
13 (54,2%)
6 (50,0%)
11 (45,8%)
1,000
Estadiamento patológico
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
6 (46,2%)
13 (56,5%)
18 (54,5%)
1 (50,0%)
18 (52,9%)
1 (50,0%)
7 (53,8%)
10 (43,5%)
15 (45,5%)
1 (50,0%)
16 (47,1%)
1 (50,0%)
0,730
Invasão perineural
Não
Sim
12 (63,2%)
6 (40,0%)
7 (36,8%)
9 (60,0%)
0,300
Invasão angiolinfática
Não
Sim
16 (55,2%)
2 (40,0%)
13 (44,8%)
3 (60,0%)
0,648
Padrão de crescimento
histológico
*Teste exato de Fisher
1,000
1,000
42
Tabela 8 - Associação da imunoexpressão da proteína AKT citoplasmática fosforilada com variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=37).
Variável
Categoria
Perfil de
imunoexpressão
AKT fosfo cito
negativo
n (%)
AKT fosfo cito
positivo
n (%)
2 (4,5%)
35 (94,6%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
1 (5,0%)
1 (5,9%)
19 (95,0%)
16 (94,1%)
1,000
Tabagista
Não
Sim
1 (5,0%)
1 (7,1%)
19 (95,0%)
13 (92,9%)
1,000
Etilista
Não
Sim
1 (4,5%)
1 (9,1%)
21 (95,5%)
10 (90,9%)
1,000
Menores
Maiores
2 (9,1%)
0 (0,0%)
20 (90,9%)
15 (100,0%)
0,505
Tubular
Cribriforme
Sólido
0 (0,0%)
0 (0,0%)
2 (33,3%)
15 (100,0%)
16 (100,0%)
4 (66,7%)
I/II
III/IV
0 (0,0%)
2 (8,0%)
12 (100,0%)
23 (92,0%)
1,000
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
0 (0,0%)
2 (8,3%)
1 (3,0%)
1 (33,3%)
2 (5,7%)
0 (0,0%)
13 (100,0%)
22 (91,7%)
32 (97,0%)
2 (66,7%)
33 (94,3%)
2 (100,0%)
0,532
Não
Sim
2 (10,5%)
0 (0,0%)
17 (89,5%)
16 (100,0%)
0,489
Não
Sim
2 (6,7%)
0 (0,0%)
28 (93,3%)
5 (100,0%)
1,000
Glândulas
salivares
Padrão de
crescimento
histológico
Estadiamento
clínico
Estadiamento
patológico
Invasão
perineural
Invasão
angiolínfatica
0,162
1,000
43
Tabela 9 - Associação da imunoexpressão proteína AKT nuclear fosforilada com variáveis
demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=36).
Variável
Categoria
Imunoexpressão
AKT fosfo
nuclear
negativo
n (%)
AKT fosfo
nuclear
positivo
n (%)
14 (37,8%)
23 (62,2%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
9 (45,0%)
5 (29,4)
11 (55,0%)
12 (70,6%)
0,498
Tabagista
Não
Sim
8 (40,0%)
4 (28,6%)
12 (60,0%)
10 (71,4%)
0,717
Etilista
Não
Sim
9 (40,9%)
3 (27,3)
13 (59,1%)
8 (72,7%)
0,703
Menores
Maiores
9 (40,9%)
5 (33,3%)
13 (59,1%)
10 (66,7%)
0,738
Tubular
Cribriforme
Sólido
5 (33,3%)
5 (31,2%)
4 (66,7%)
10 (66,7%)
11 (68,8%)
2 (33,3%)
0,280
I/II
III/IV
3 (25,0%)
11 (44,0%)
9 (75,0%)
14 (56,0%)
0,306
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
3 (23,1%)
11 (45,8%)
12 (36,4%)
2 (66,7%)
14 (40,0%)
0 (0,0%)
10 (76,9%)
13 (54,2%)
21 (63,6%)
1 (33,3%)
21 (60,0%)
2 (100,0%)
0,288
8 (42,1%)
6 (37,5%)
11 (57,9%)
10 (62,5%)
1,000
12 (40,0%)
2 (40,0%)
18 (60,0%)
3 (60,0%)
1,000
Glândulas
salivares
Padrão de
crescimento
histológico
Estadiamento
clínico
Estadiamento
patológico
Invasão perineural Não
Sim
Invasão
angiolínfatica
Não
Sim
0,547
0,517
44
Tabela 10 - Associação da imunoexpressão proteína AKT citoplasmática e nuclear com
variáveis demográficas e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=36)
Variável
Categoria
Imunoexpressão
AKT fosfo
AKT fosfo
(c+n) negativo (c+n) positivo
n (%)
n (%)
14 (37,8%)
23 (62,2%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
9 (45,0%)
5 (29,4%)
11 (55,0%)
12 (70,6%)
0,498
Tabagista
Não
Sim
8 (40%)
4 (28,6%)
12 (60%)
10 (71,4%)
0,717
Etilista
Não
Sim
9 (40,9)
3 (27,3%)
13 (59,1)
8 (72,7)
0,703
Glândulas salivares
Menores
Maiores
9 (40,9%)
5 (33,3)
13 (59,1%)
10 (66,7%)
0,738
Tubular
Cribriforme
Sólido
5 (33,3%)
5 (31,2%)
4 (66,7%)
10 (66,7%)
11 (68,8%)
2 (33,3%)
0,280
I/II
III/IV
3 (25,0%)
11 (44,0%)
9 (75,0%)
14 (56,0%)
0,306
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
3 (23,1%)
11 (45,8%)
12 (36,4%)
2 (66,7%)
14 (40,0%)
0 (0,0%)
10 (76,9%)
13 (54,2%)
21 (63,6%)
1 (33,3%)
21 (60,0%)
2 (100,0%)
0,288
Não
Sim
8 (42,1%)
6 (37,5%)
11 (57,9%)
10 (62,5%)
1,000
Não
Sim
12 (40,0%)
2 (40,0%)
18 (60,0%)
3 (60,0%)
1,000
Padrão de
crescimento
histológico
Estadiamento
clínico
Estadiamento
patológico
Invasão perineural
Invasão
angiolínfatica
*Teste exato de Fisher
0,547
0,517
45
Tabela 11 - Associação da imunoexpressão da proteína PTEN com as variáveis demográficas
e clínico patológicas de pacientes com CAC (n=32).
A Variável
Categoria
Imunoexpressão
PTEN total
negativo
n (%)
PTEN total
positivo
n (%)
9 (28,2%)
23 (71,8%)
p*
Sexo
Feminino
Masculino
5 (26,3%)
4 (30,8%)
14 (73,7%)
9 (69,2%)
1,000
Tabagista
Não
Sim
5 (26,3%)
3 (27,3%)
14 (73,7%)
8 (72,7%)
1,000
Etilista
Não
Sim
6 (28,6%)
2 (25,0%)
15 (71,4%)
6 (75,0%)
1,000
Glândulas salivares
Menores
Maiores
5 (26,3%)
4 (30,8%)
14 (73,7%)
9 (69,2%)
1,000
Tubular
Cribriforme
Sólido
2 (16,7%)
6 (37,5%)
1 (25,0%)
10 (83,3%)
10 (62,5%)
3 (75,0%)
0,474
Estadiamento clínico
I/II
III/IV
3 (27,3%)
6 (28,6%)
8 (72,7%)
15 (71,4%)
1,000
Estadiamento patológico
T1/T2
T3/T4
N0
N+
M0
M1
4 (33,3%)
5 (25,0%)
8 (26,7%)
0 (0,0%)
7 (23,3%)
2 (100,0%)
8 (66,7%)
15 (75,0%)
22 (73,3%)
1 (100,0%)
23 (76,7%)
0 (0,0%)
0,696
Invasão perineural
Não
Sim
5 (31,2%)
4 (26,7%)
11 (68,8%)
11 (73,3%)
1,000
Invasão angiolínfatica
Não
Sim
7 (28,0%)
2 (33,3%)
18 (72,0%)
4 (66,7%)
1,000
Padrão de crescimento
histológico
1,000
0,073
46
5.7 Análise de sobrevida livre de doença em portadores de CAC
Foram consideradas durante a análise de sobrevida livre de doença e sobrevida
global, as variáveis relacionadas às características clinico-patológicas apresentadas por 39
pacientes. Durante a análise 5 pacientes foram excluídos, dois por apresentarem metástase
ao diagnóstico e três por apresentarem progressão da doença.
Através da análise e comparação das curvas de sobrevida livre de doença (60 meses),
foram identificadas 3 variáveis estatisticamente significativas: estadiamento clínico
(p=0,026/Figura 20), estadiamento patológico T (p=0,026/Figura 21) e estadiamento
patológico N (p=0,000/Figura 22).
Entre os marcadores analisados, nenhum mostrou diferença significativa nas curvas
de sobrevida.
Figura 16 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o sexo.
47
Figura 17 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o tabagismo.
Figura 18 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o etilismo.
48
Figura 19 - Curva de sobrevida livre de doença conforme a classificação topográfica.
Figura 20 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento clínico.
49
Figura 21 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento patológico (pT).
Figura 22 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o estadiamento patológico (pN).
50
Figura 23 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o status de margem cirúrgica.
Figura 24 - Curva de sobrevida livre de doença conforme o padrão histológico de crescimento.
51
Figura 25 - Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão da proteína PI3K total.
Figura 26 - Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão da proteína PI3K fosforilado.
52
Figura 27 - Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão da proteína nuclear AKT
fosforilada.
Figura 28 - Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão citoplasmática e nuclear
da proteína AKT fosforilada.
53
Figura 29 - Curva de sobrevida livre de doença conforme imunoexpressão da proteína PTEN total.
5.8 Análises de sobrevida global
As análises de comparações das curvas de sobrevida global (250 meses),
evidenciaram 5 variáveis estatisticamente significativas : sexo (p=0,0230/Figura 30 ), etilismo
(p=0,042/Figura 32 ), estadiamento clínico (p=0,003/Figura 34 ), estadiamento patológico T
(p=0,003/Figura 35 ) e estadiamento patológico N (p=0,021/Figura 36 ).
As análises das curvas de sobrevida global revelaram que as mulheres tiveram
sobrevida maior que os homens (p=0,0230/Figura 30), os etilistas tiveram menor sobrevida
global (p=0,0420/Figura 32 ), os pacientes com estádios clínicos menores (I/II) tiveram uma
maior sobrevida quando comparados aos estádios avançados (III/IV) (p=0,003/Figura: 34 ),
assim como os pacientes com presença de metástases linfonodais ao diagnóstico pN tiveram
menor sobrevida global quando comparados com os pacientes sem metástase linfonodal
(p=0,021/ Figura 36).
O padrão de imunoexpressão de nenhum dos marcadores se mostrou
estatisticamente significante na análise de sobrevida global
54
Figura 30 - Curva de sobrevida global conforme o sexo.
Figura 31 - Curva de sobrevida global conforme o tabagismo.
55
Figura 32 - Curva de sobrevida global conforme o etilismo.
Figura 33 - Curva de sobrevida global conforme a categorização topográfica.
56
Figura 34 - Curva de sobrevida global conforme o estadiamento clínico.
Figura 35 - Curva de sobrevida global conforme o estadiamento patológico (pT).
57
Figura 36 - Curva de sobrevida global conforme o estadiamento patológico (pN).
Figura 37 - Curva de sobrevida global conforme o padrão histológico de crescimento.
58
Figura 38 - Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da proteína PI3K total.
Figura 39 - Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da proteína PI3K fosforilada.
59
Figura 40 - Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão nuclear da proteína AKT fosforilada.
Figura 41 - Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão citoplasmática e nuclear da proteína AKT
fosforilada.
60
Figura 42 - Curva de sobrevida global conforme imunoexpressão da proteína PTEN total.
61
6 DISCUSSÃO
O CAC é um tumor extremamente desafiador para todos aqueles profissionais
envolvidos desde seu diagnóstico até o seu tratamento. O desafio em lidar com este tumor
se deve ao seu potencial de progressão que é lento, porém constante, cursando com baixas
taxas de cura em longo prazo de seguimento.
Em relação à prevalência nos gêneros, os dados são bastante controversos com
publicações não relatando diferenças de frequências entre os sexos e algumas mais recentes
mostrando discreta prevalência do sexo feminino, dados esses que vão de encontro com
nossa casuística, onde 59,1% dos pacientes eram mulheres 19 63.
Os fatores de risco ambientais para o desenvolvimento do CAC ainda permanecem
desconhecidos, embora a literatura mostre uma frequência de aproximadamente 75% das
neoplasias de cabeça e pescoço com desenvolvimento atribuído a combinação tabagismo e
etilismo. Em nossa população 15 pacientes (34,1%) eram tabagistas, 12 (27,3%) eram
etilistas, dos quais 10 também eram tabagistas. Na avaliação da sobrevida global destes
pacientes, foi possível notar uma diminuição expressiva da sobrevida de pacientes etilistas
quando comparada aos não etilistas(105 versus 194 meses). Esse achado pode ser explicado
pelo pior estado físico que esses pacientes se encontram decorrente do hábito de fumar
e/ou de beber, o que os torna mais susceptíveis a complicações mais severas do tratamento
realizado 2 5.
As glândulas salivares menores foram os sítios primários mais incidentes em 56,8%
dos casos, assim como relatado por Dodd et al e Volker 14 64. Em relação à topografia isolada,
a glândula parótida foi o sítio mais acometido, sendo responsável por abrigar 11 casos,
correspondendo a 25% de todos os tumores e 57,9% dos tumores das glândulas salivares
maiores. Bradley et al, van Weert et al e Papaspyrou et al relataram a parótida como o sítio
mais frequente de CAC enquanto, Ko et al e Dodd et al reportam a glândula submandibular
como o sítio mais frequente
12 16 20 14 63
. Em relação às glândulas salivares menores, a
literatura é bastante variada em relação ao sítio mais frequente. Na série de Khan et al a
orofaringe seguida da cavidade nasal foram os sítios mais frequentes31, Rapidis et al65
mostraram maior frequência no palato seguido pelo antro maxilar enquanto, em nossa
casuística os seios da face foi a topografia mais acometida isoladamente. Esta topografia é
reportada como indicativo de pior prognóstico entre os sítios de cabeça e pescoço 12.
62
Dodd14 durante um trabalho de revisão mostrou que os tumores em glândulas
salivares maiores apresentam um melhor prognóstico que as glândulas salivares menores,
pela facilidade na remoção cirúrgica completa destas glândulas infiltradas pela neoplasia.
Não observamos associação estatística significativa entre o sítio primário em glândulas
salivares maiores e menores e a sobrevida livre de doença e sobrevida global em relação
para inferir em nossa casuística está categorização topográfica como fator determinante de
melhor ou pior prognóstico. Embora alguns trabalhos mostrem que o sítio primário em seios
da face confere um pior prognóstico pela complexidade anatômica e dificuldade de
ressecção cirúrgica12, não encontramos tal associação com a sobrevida global e livre de
doença . O que pudemos observar é que a radioterapia foi bastante eficiente em prevenir a
recidiva local de grande parte dos casos de CAC até mesmo entre aqueles com margens
comprometidas (9 casos) somente 2 apresentaram recidiva local. O que pode acontecer é
que por se tratar de uma neoplasia rara as séries são bastante antigas e as técnicas de
planejamento radioterápicas evoluíram, mostrando uma melhoria no controle local da
doença.
Composto por uma morfologia bastante heterogênea, definida por três padrões
clássicos de crescimento a considerar tubular, cribriforme e sólido; o padrão cribriforme é
relatado por van Weert e Ko et al como o mais comum assim como observado em nossa
casuística16
63
. Quando comparamos o tempo de sobrevida livre de doença e global dos
pacientes que apresentavam isoladamente estes três padrões de crescimento, com maior
destaque para o padrão sólido inferido como preditor de pior prognóstico 16, que foi o
subtipo menos frequente, representado por apenas 6 casos (13,6%), ficou evidente na curva
o menor tempo de sobrevida apresentado por 13,6% dos pacientes embora, não tenha
resultado em significância estatística significativa pelo baixo número de pacientes incluídos
com este subtipo histológico.
Além da graduação histológica, foi importante a caracterização da presença de
invasão perineural e angiolinfática, uma vez que estas variáveis classicamente estão
associadas a comportamentos biológicos de maior agressividade, e são associados a maior
frequência de metástases regionais em carcinomas. Nos CAC a invasão perineural é um
achado histológico bastante frequente que até auxilia o patologista na classificação do
tumor como CAC e a infiltração angiolinfática não é um achado muito frequente. Embora
saibamos que esses tumores não costumam metastatizar em linfonodos regionais, a
63
metástase ganglionar quando presente é associada à presença de metástase à distância, e
menor sobrevida global63. Na nossa casuística observamos invasão angiolinfática em 6
pacientes (14%) e invasão perineural em 18 pacientes (41,9%). Entre os pacientes que
apresentaram margens cirúrgicas comprometidas (39,5%), apenas 2 pacientes recidivaram, e
nestes casos a recidiva à distância foi no pulmão, mais uma vez, mostrando o importante
papel da radioterapia no controle local da doença.
Ao estadiamento clínico, 65,9% das lesões foram classificadas como avançadas
(III/IV), mostrando que assim como em quase todas as neoplasias atendidas em nosso
Hospital, à maioria dos pacientes tem um diagnóstico tardio por motivos que vão desde a
falta de acesso ao sistema de saúde à baixa escolaridade.
Houve recorrência de doença (local, regional e à distância) em 14 pacientes, dos
quais em 7 a recorrência ocorreu em até 5 anos e nos outros 7 pacientes (50%) a recorrência
ocorreu em mais de 60 meses, sendo que a recorrência mais tardia ocorreu em 134 meses
após o diagnóstico, este tempo encontra-se de acordo com a literatura, por se tratar de um
tumor indolente, no qual as recorrências ocorrem aproximadamente entre o quinto e
décimo ano pós tratamento. Por isso, diferente da maioria dos pacientes com câncer, o
tempo de seguimento tem que ser muito longo e não devemos falar em “cura” para esses
doentes. Em nossa casuística o tempo de seguimento variou de 7 a 215 meses, com uma
média de 59 meses e uma mediana de 50 meses, o que consideramos um bom tempo de
seguimento haja visto que em 50 meses pudemos detectar aproximadamente 60% das
recorrências.
O tratamento frequentemente realizado em portadores de CAC é a cirurgia seguida
de radioterapia adjuvante
16 31
. Conforme observado em nossa casuística, a ressecção
cirúrgica foi realizada em 93,2% dos casos e a radioterapia adjuvante em 86,4% destes,
apesar de não definido como um tratamento standart para o CAC ainda é o mais eficiente e
comumente escolhido como terapêutica de escolha. Em nossos pacientes, a eficiência desta
combinação (ressecção + radioterapia) ficou evidente ao notar a baixa frequência de casos
que recidivaram (31,8%), sendo que destas apenas 11,4% dos casos recidivaram em sítios
locoregionais ressaltando a qualidade do tratamento cirúrgico disponibilizado a estes
pacientes. Entre os pacientes que fizeram metástases à distância, o sítio mais frequente e já
descrito por Papaspyrou e van Weert foi o pulmão seguido dos ossos 20 16.
64
Papaspyrou et al66 mostraram em um trabalho de revisão sobre artigos que utilizou a
quimioterapia isoladamente para o tratamento de pacientes com CAC utilizando drogas
clássicas, terapias-alvo dirigidas ou combinações de ambas, a ausência de respostas
completas e até mesmo ausência de resposta nos CACs. Na presente casuística 86,4% dos
pacientes não foram tratados com quimioterapia e mesmo assim conseguimos uma alta taxa
de controle local da neoplasia, observando recidiva local em apenas 4 pacientes. Vale
ressaltar que mesmo a quimioterapia tendo um efeito sistêmico, nenhum trabalho até o
momento comprovou a eficácia do método par ao tratamento desses tumores. Esse tópico é
tem que ser vastamente estudado, para que possamos além do controle local com a
radioterapia melhorar o controle da doença metastática e consequentemente a sobrevida
desses pacientes.
O processo de início da carcinogênese decorre de alterações constantes em proteínas
e vias de sinalização que desempenham funções chaves relacionadas ao processo celular,
estas proteínas encontram-se circulantes em níveis basais durante a homeostasia e podem
se apresentar completamente desreguladas durante o câncer. A partir destas constatações
teve-se início uma busca constante e crescente por biomarcadores moleculares preditivos de
resposta frente ao diagnóstico e direcionamento para condutas diagnósticas e terapêuticas.
Vara et al55 mostrou a importância de identificar alterações em PI3K/AKT que estão
diretamente envolvidos com diversos tipos de neoplasias sendo portanto, preditores a
biomarcador diagnóstico e implicado como alvo específico de drogas anti-neoplásicas, e
também relatados como potencias alvos de resistência e resposta aos tratamentos de
escolha.
Assim, com o auxílio da técnica imunohistoquímica foi possível caracterizar a
frequência de imunoexpressão das proteínas FGFR1, PI3K, AKT e PTEN em peças e biópsias
tumorais de portadores de CAC. A proteína FGFR1 na sua forma total foi expressa por 97,2%
dos casos conforme reportado no website da Adenoid Cystic Foundation45, a qual também é
reportado que FGFR1 é superexpresso, assim como sua forma fosforilada na maioria dos
CAC, sem citar porcentagem ou referência. Corroborando com os dados do site previamente
citado, Frierson e Moskaluk34, num comentário sobre o artigo de Stephens et al33 sobre
“Whole exome sequencing of adenoid cystic carcionoma” também referem que seu grupo
encontrou aumento da expressão e ativação de FGFR1 em muitos casos, quando
comparados com o tecido normal da glândula salivar onde originou o tumor, mais uma vez
65
também não reportou a porcentagem numérica desse aumento da expressão e ativação
frequente desta proteína nos CACs.
Estudos recentes demonstram que a proteína PI3K pode controlar múltiplas vias de
sinalização celular, está diretamente relacionado com a carcinogênese e pode ser ativada
pelos RTKs, no entanto, em CAC de cabeça e pescoço a sua frequência de expressão até o
presente não foi estabelecida. Em nossa casuística verificamos sua imunoexpressão na
forma total em 25 (75,8%) dos 33 casos que foram passíveis de avaliação e na forma
fosforilada em 16 (44,5%) dos 36 casos com avaliação válida.
A imunomarcação
citoplasmática para a forma fosforilada da proteína AKT (p-AKT) foi positiva em 35 das 37
amostras avaliadas (94,6%), e em 23 das 35 amostras (65,7%) positivas para p-AKT também
observamos imunomarcação nuclear. Das 35 amostras que pudemos ter a avaliação de
FGFR1, PI3K fosforilado e AKT fosforilado, 16 (45,7%) foram positivas para todos os
marcadores, resultado esse que demonstra a importância dessa via FGFR1/PI3K/AKT no CAC.
Esse achado nos faz refletir sobre a presença de existência de outra(s) via(s) que podem ser
ativadas pelo FGFR1 que culminam com a fosforilação de AKT.
Também podemos levar em consideração a dificuldade de trabalhar com anticorpos
fosforilados em material parafinado e se considerarmos a via ativa através da expressão das
proteínas FGFR1, PI3K e AKT nas suas formas totais, dos 30 casos com avaliação válida para
os 3 marcadores, 23 (76,6%) tiveram co-expressão de todos os marcadores, resultado esse
que de uma maneira mais significativa ainda ressalta a alta frequência da ativação de AKT
através do FGFR1 e do PI3K.
Em relação às proteínas FGFR1 e PI3K a literatura é quase que completamente
desprovida de informação que nos permitam tecer comparações, excetuando o comentário
publicado por Frierson e Moskaluk34 que refere que FGFR1 é expresso e ativo em muitos
casos de CAC. A presença de fosforilação de AKT foi reportada por Lima et al67 nos 22 CACs
estudados (100%) e por Volker et al64 em 18 dos 29 casos de CAC estudados (62%).
Segundo Vara et al55 e Carnero et al57 a via PI3K/AKT é citada frequentemente em
diversas neoplasias, no entanto, em CAC não encontramos trabalhos avaliando a co-ativação
de PI3K e de AKT, o que gerou um questionamento sobre a importância de caracterização
dessa via, que atualmente é estudada como alvo terapêutico em várias neoplasias. Mesmo
sem ter realizado ensaios funcionais através da frequente expressão dessas proteínas
podemos inferir que esta via é constitutivamente ativa em grande parte dos casos de CAC
66
avaliados. No entanto, torna-se necessária a validação da expressão das proteínas por
metodologias que comprovem a atividade da proteína bem como sua fosforilação no sítio
alvo.
O PTEN é tido como o principal inibidor de PI3K/AKT, entretanto na presente
casuística observamos a ausência de imunoexpressão de PTEN associada à presença de
imunoexpressão de PI3K fosforilada em 10 dos 30 casos (33,3%) que tiveram válidas as
avaliações dos dois marcadores, achado esse que está de acordo com o esperado, uma vez
que com a ausência de expressão de PTEN, ocorre um aumento da síntese de PI3K e
consequente fosforilação da mesma, entretanto não conseguimos explicar a presença de coexpressão de PTEN e PI3K fosforilado em 13 dos 30 casos (43%), que pode ser decorrente de
outras alterações moleculares ou citogenéticas, como a perda de somente um dos alelos ou
microdeleções do gene PTEN que fazem com que não haja perda de expressão da proteína,
mas cursa com redução da sua função e promove uma maior ativação de PI3K, como ocorre
nos carcinomas de próstata, conferindo pior prognóstico aos mesmos 55 57 68.
A ausência de associação dos marcadores pesquisados com as variáveis demográficas
e clínico patológicas pode ser decorrente da frequente expressão desses marcadores nos
CACs e devido ao pequeno número de casos estudados.
A sobrevida livre de doença em portadores de CAC em 5 anos é bastante otimista
sendo descrita em torno 67% a 73%17. Em nossa casuística, ao associar os preditores mais
importantes como o estadiamento clínico, estadio patológico T e o status N, verificamos
relação direta entre estes preditores e a redução do tempo de sobrevida. Os pacientes com
estadios I e II a estimativa de sobrevida livre de doença foi de até 106,7 meses enquanto nos
pacientes com estadios III e IV o tempo estimado foi de 65,7 meses.
As estimativas são exatamente as mesmas quando levamos em consideração o
estadio patológico, pois em quase todos os pacientes o estadiamento clínico foi semelhante
ao estadiamento patológico. Quando a sobrevida livre de doença é estimada de acordo com
o status linfonodal, os pacientes sem metástase ganglionar tiveram o tempo estimado foi de
93,1 meses comparado aos pacientes com presença de metástase ganglionar, que tiveram
tempo de sobrevida de 25,3 meses. O conjunto desses achados corrobora para que
consideremos essa casuística bem estudada e com consistência dos dados. Outro ponto
fundamental é que a metástase ganglionar regional é um evento bastante infrequente em
CACs, somente observada em 3 dos 44 casos (6,8%), mas é um achado associado a maior
67
agressividade da doença e está associado a menor sobrevida livre de doença e global, tendo
os 3 pacientes desenvolvido metástase pulmonar. Também nos chamou atenção que 2
tumores eram grau 1 (tubular) e 1 era sólido, que é a variante considerada mais agressiva na
literatura. A presença de metástase ganglionar associada a uma menor sobrevida é um dado
extremamente escasso na literatura, mas vai de encontro aos achados de Ko et al que
observaram que a presença de metástase ganglionar foi o único preditor independente de
pior sobrevida global na análise multivariada63.
Em relação à sobrevida global, além das variáveis que influenciaram a sobrevida livre
de doença (estadiamento clínico, estadiamento patológico T e o status linfonodal N)
encontramos maior sobrevida nos pacientes do sexo feminino e naqueles pacientes não
etilistas. Em relação ao sexo, a maior sobrevida de pacientes do sexo feminino é um achado
reportado por Ellington et al28 e Lloyd et al69, e que colocam que não é claro esse achado,
mas que possa haver influência hormonal e que as mulheres têm tendência a aderir melhor
ao tratamento que os homens. Já a menor sobrevida global conferida aos etilistas pode ser
justificada pelas próprias consequências físicas causadas pelo abuso crônico do álcool.
68
7 CONCLUSÕES
1.
Na presente série de CAC observamos a presença de imunoexpressão de
FGFR1 total em 35 casos (97,2%), PI3K total em 25 casos (75,7%), PI3K
fosforilado em 17 casos (47,2%), AKT total em 35 casos (79,5%), AKT
fosforilado em 35 casos (94,6%) e PTEN em 23 casos (71,8%).
2.
Não observamos associação entre a imunoexpressão dos marcadores FGFR1
total, PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total
com nenhum parâmetro clínico-patológico estudado.
3.
Não observamos associação entre a imunoexpressão dos marcadores FGFR1
total, PI3K total, PI3K fosforilado, AKT total, AKT fosforilado e PTEN total
com a sobrevida global e sobrevida livre de doença.
4.
O estadiamento clínico mais avançado, o maior estadio patológico (pT) e a
presença de metástase linfonodal foram associados à menor sobrevida
livre de doença e menor sobrevida global nos portadores de CAC. Ainda na
sobrevida global, o sexo masculino e o etilismo foram fatores associados à
menor sobrevida.
69
8 PERSPECTIVAS
Com os interessantes achados que tivemos nesse trabalho, iremos avaliar em
amostras de CAC congeladas no Banco de Tumores de nossa Instituição, o perfil de proteínas
fosforiladas através da técnica de fosfo arrays. Esses resultados servirão para validarmos
nossos achados e também para que através de novos marcadores imuno-histoquímicos
possamos validar os achados dos resultados dos fosfo arrays, continuando assim a tentar
elucidar as vias de ativação de tirosinas cinases nos CACs.
70
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76
ANEXOS
Anexo A: Instrumento de Pesquisa para coleta de dados.
AVALIAÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO FGFR1/PI3K/AKT EM CARCINOMAS ADENOIDES
CÍSTICOS - Mestrado (Maicon Zanon)
IDENTIFICAÇÃO
1
Nome
2
Registro Hospitalar
3
Data de nascimento
4
5
6
DD/MM/AAAA
Sexo
1- Feminino; 2- Masculino
Tabagista
0- Não; 1- Sim, atual; 2- Sim, passado, 3- Sim, não especificado 99- Ignorado
Etilista
0- Não; 1- Sim, atual; 2- Sim, passado, 3- Sim, não especificado 99- Ignorado
DADOS CLÍNICOS
Data do diagnóstico
7
DD/MM/AAAA
Local do tumor
1-
8
9
10
Glândulas salivares maiores; 2- Glândulas salivares menores; 3- Outras
glândulas da cavidade oral; 4- Faringe; 5- Laringe; 6- Seios da face;
7- Outra localidade _______________
Dor no momento do diagnóstico
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
Estadiamento clínico
1- I; 2- II; 3- III; 4- IV
TRATAMENTO
Data da cirurgia
11
DD/MM/AAAA
12
13
Tipo de cirurgia
1- Total; 2- Parcial
Radioterapia
0- Não; 1- Sim, adjuvante; 2- Sim, paliativa
14
Data de início da radioterapia
15
Data do término da radioterapia
16
DD/MM/AAAA
DD/MM/AAAA
Quimioterapia
0- Não; 1- Sim, adjuvante; 2- Sim, adjuvante concomitante à Rxt; 3- Sim, paliativa
17
Data de início da quimioterapia
18
Data do término da quimioterapia
19
DD/MM/AAAA
DD/MM/AAAA
Número de linhas (Quimioterapia)
1- 1; 2- 2; 3- ≥3; 99- Ignorado
ANATOMO-PATOLÓGICO
Tamanho do tumor
20
Cm
21
22
Invasão perineural
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
Invasão angiolinfática
77
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
23
24
25
26
27
28
29
30
Margens
1- Livres; 2- Exiguas; 3- Comprometidas; 99- Ignorado
Extravasamento capsular
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
Padrão de crescimento
1- Cribriforme; 2- Tubular; 3- Sólido; 99- Ignorado
Nº de linfonodos dissecados
Nº de linfonodos positivos
Estadiamento patológico - T
1- T1; 2- T2; 3- T3; 4- T4
Estadiamento patológico - N
0- N0; 1- N1; 2- N2; 3- N3; 88- Não se aplica (não dissecou o pescoço)
Estadiamento patológico – M
0- M0; 1- M1
SEGUIMENTO
Recidiva
32
0- Não; 1- Sim
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
31
Data do primeiro diagnóstico de recidiva
DD/MM/AAAA
Recidiva local
0- Não; 1- Sim
Recidiva regional
0- Não; 1- Sim
Recidiva à distância
0- Não; 1- Sim
Local da recidiva à distância – Pulmão
0- Não; 1- Sim
Local da recidiva à distância – Rins
0- Não; 1- Sim
Local da recidiva à distância – Ossos
0- Não; 1- Sim
Local da recidiva à distância – Outros
Descrever
Status
0- Óbito por câncer; 1- Óbito por outras causas; 2- Vivo com doença;
3- Vivo sem doença
Data da última informação ou óbito
DD/MM/AAAA
Perda de seguimento (2x o tempo do retorno sem informação)
0- Não; 1- Sim
Estadiamento patológico
1- I; 2- II; 3- III; 4- IV; 88- Não se aplica (não dissecou o pescoço)
78
79
Anexo B: Carta de Aprovação do CEP.
80