ATIVIDADE CARRAPATICIDA DO LÁTEX DA - pgbioexp

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA – UNIR
FILOMENA MARIA MINETO BRONDANI
ATIVIDADE CARRAPATICIDA DO LÁTEX DA PLANTA Hura crepitans E DO
EXTRATO ETANÓLICO DA PLANTA Rinorea pubiflora em larvas de Boophilus
microplus E Rhipicephalus sanguineus
Monte Negro – RO
2006
FILOMENA MARIA MINETO BRONDANI
ATIVIDADE CARRAPATICIDA DO LÁTEX DA PLANTA Hura crepitans E DO
EXTRATO ETANÓLICO DA PLANTA Rinorea pubiflora EM LARVAS DE Boophilus
microplus E Rhipicephalus sanguineus
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental
da Universidade Federal de Rondônia para
a obtenção do título de Mestre em Biologia
Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
Co-orientadora: Profª. Drª. Mariangela Soares de Azevedo
Monte Negro – RO
2006
ii
FILOMENA MARIA MINETO BRONDANI
ATIVIDADE CARRAPATICIDA DO LÁTEX DA PLANTA Hura crepitans E DO
EXTRATO ETANÓLICO DA PLANTA Rinorea pubiflora EM LARVAS DE Boophilus
microplus E Rhipicephalus sanguineus
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental
da Universidade Federal de Rondônia para
a obtenção do título de Mestre em Biologia
Experimental.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
USP – Universidade de São Paulo
________________________________________________
Profª. Drª. Mariangela Soares de Azevedo
UNIR – Universidade Federal de Rondônia
________________________________________________
Profª. Drª. Luciana Gatto Brito
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa da Agropecuária
________________________________________________
Profª. Drª. Rubiane C. Pagotto - suplente
UNIR – Universidade Federal de Rondônia
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
BRONDANI, Filomena Maria Mineto Brondani
Atividade carrapaticida do látex da Hura crepitans e do extrato
etanólico da planta Rinorea pubiflora em larvas de Boophilus microplus e
Rhipicephalus sanguineus.
Monte Negro, RO, UNIR-USP, 2006.
xvi, 59p.
Dissertação: Mestre em Biologia Experiental
1. Carrapaticida; 2. Fitoterapico; 3. Hura creapitans; 4. Rinorea pubiflora.
I. Universidade Federal de Rondônia, Núcleo de Saúde. II. Título.
iv
Ao meu marido Walmor e filhos, Paulo Augusto e
Joaquim Osório pelo apoio e compreensão em meus
momentos de ausência.
Ao meu pai Vitélio e a memória de minha mãe
Almerinda, que me incentivaram a estudar e me
ensinaram a ser persistente.
v
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me proporcionado a vida e as oportunidades, zelando sempre
por mim.
Ao meu orientador Dr Luís Marcelo pela orientação, paciência e a
oportunidade a mim concedida para que eu pudesse melhorar os meus
conhecimentos abrindo-me caminhos na pesquisa científica.
A minha co-orientadora profª Mariângela que não mediu esforços em me
auxiliar na parte de fitoquímica.
Ao meu marido Walmor pela sua compreensão e carinho ajudando-me em
todos os momentos a cuidando de nossos filhos.
Aos meus filhos, Paulo Augusto e Joaquim Osório por compreender a minha
ausência e pelo carinho nos momentos difíceis.
A minha irmã Gertrudes e cunhados Mariano, Inês e Irineu, minhas sobrinhas
Lara e Larissa pelo apoio neste período de ausência.
Aos professores da UNIR, pela colaboração no meu crescimento pessoal e
profissional.
Ao professor Pedro Barreto Crispim pela sua disponibilidade e auxílio na
análise estatística e gráficos.
A profª Vera Engracia e dona Edinéia pela disponibilidade em sempre
atender-me com carinho e presteza.
A minha amiga Denise pela colaboração na formatação do trabalho e carinho
com seu apoio.
A meus amigos e pesquisadores do laboratório que estiveram sempre
presentes ajudando-me em vários momentos desta pesquisa, os quais foram muito
vi
importantes para que ela acontecesse, Dr Labruna, Ms Débora, Dr Cecília, Dr Carlos
e Flávio.
A minha amiga Márcia pela sua disponibilidade, paciência e colaboração nos
momentos de estudo.
Aos amigos João, Suzamar, Sandra, Aline, Adriana, Edilene, Raquel, Carolina
e os demais colegas de turma pela amizade e apoio.
Aos amigos do laboratório que sempre deram apoio com sua presença e
agradável convivência, Leormando, Marlene, Ademir, João, Max, Juliana em
especial ao seu Manoel pela colaboração na coleta das teleógenas.
A Direção e professores do colégio Aurélio pelo apoio .
A SEDUC, através da Carmem, da Rizeuda, Tereza e demais, pelo apóio e
compreensão.
Ao Sr Manuel das Dores Ferreira que auxiliou na coleta de material da planta
H. crepitans.
Agradeço de maneira geral a todos que contribuíram direta ou indiretamente
para a conclusão deste trabalho, que por esquecimento deixei de citá-los.
vii
“Um homem não é grande pelo que faz, mas pelo que renuncia”.
(Albert Schweitzer)
viii
RESUMO
O controle da infestação por carrapatos Rhipicefalus sanguineus e Boophilus
microplus é de importância médica e veterinária, pois os mesmos são agentes
causadores de doenças aos animais e ao homem como; dermatoses, babesiose,
anemia, tristeza parasitária bovina, erliquioses entre outras.
O presente trabalho avaliou a atividade carrapaticida do extrado etanólico das
folhas da planta R. pubiflora (Canela de macuco) e do látex da planta H. crepitans L
(Assacu) em ensaios biológicos com a utilização de larvas infestantes de R.
sanguineus e B. microplus.
Os testes foram feitos em duplicata com a utilização de larvas infestantes,
sendo as mesmas colocadas em envelopes impregnados com extrato etanólico da
R. pubiflora e látex da H. crepitans em 5 concentrações diferenciadas e a
mortalidade das larvas foi verificada no tempo 6, 12 e 24 horas após terem sido
colocadas nos envelopes. Os resultados desses ensaios biológicos demonstraram
que o Látex da Planta H. crepitans L teve atividades carrapaticida significativa
(acima de 97%), tanto para R. sanguineus como para B. microplus e o extrato
etanólico da planta R. pubiflora não demonstrou atividade carrapaticida em nenhum
dos casos.
Na verificação das classes de substâncias, através de testes, constatou-se
que o extrato etanólico da planta R. pubiflora possui esteróides em sua composição
e que o látex da planta H. crepitans L. contém alcalóide.
ix
O uso indiscriminado de carrapaticidas químicos resulta em resistência
adquirida, exigindo assim doses cada vez maiores, e, conseqüentemente
aumentando os danos ao meio ambiente, aos animais e ao homem.
A utilização de produtos de nossa biodiversidade como agente carrapaticida
vem contribuir para a preservação do meio ambiente colaborando assim para o
desenvolvimento sustentável da região.
x
ABSTRACT
The control of the ticks Rhipicephalus sanguineus and Boophilus micropulus is
of public and veterinary health importance. These species are vectors of very
important diseases such as ehrlichosis, babesiosis, anaplasmosis as well as
producing dermatitis and anemia.
The acaricidal activity of the latex obtained from Hura crepitans L and the
ethanolic extract of Rinoria pubiflora (Canela de macaco) leaves against “infectious”
larvae of R. sanguineus and B. micropulus was evaluated by filter paper contact
toxicity bioassays.
The biotoxicity of the latex and the extract against the larvae was assessed
separately and in duplicate. The larvae were incubated in filter paper envelopes
impregnated with the compounds in 5 different concentrations for 24 hours. The
larvae were observed at 6, 12 and 24 hours and their mortality rate was recorded.
The H. crepitans L latex demonstrated a significant acaricidal activity (over 97
% mortality) for the larvae of Rhipicephalus sanguineus and Boophilus micropulus.
The ethanolic extract of R. pubiflora show no acaricidal activity at any of the
concentrations tested for the two tick species studied here.
The chemical analyses of these compounds revealed that the latex of H.
crepitans L and that the ethanolic extract of R. pubiflora contained alkaloids and
steroids respectively.
The control of the ticks Rhipicephalus sanguineus and Boophilus micropulus is
of public and veterinary health importance. These species are vectors of very
important diseases such as ehrlichosis, babesiosis, anaplasmosis as well as
producing dermatitis and anemia.
xi
The indiscriminate use of chemical acaricides for tick control facilitates the
induction of parasite resistance and the need for the application of higher doses to
achieve effectiveness with the consequent deleterious impact on the environment.
The use of natural products obtained from our diverse native flora as acaricidal
agents will greatly contribute to the preservation of the environment and the
sustainable development of the region.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição geográfica da H. creapitans na América...........................
9
Figura 2 - Tronco, folhas e fruto de Hura crepitans............................................... 10
Figura 3 - Exemplar de Rinorea pubiflora.............................................................
12
Figura 4 - Imagem de fêmea ingurgitada de Boophilus microplus........................
13
Figura 5 - Ciclo de vida do Boophilus microplus...................................................
14
Figura 6 - Bovino infestado por B. microplus........................................................
15
Figura 7 - Capituli sextavado da base, um caráter identificando o R.
sanguíneus. ....................................................... ................................................... 17
Figura 8 - Dimorfismo sexual de R. sanguíneus. ................................................
18
Figura 9 - Ciclo de vida do R. sanguineus. ..........................................................
19
Figura 10 - R. sanguineus infestando o pavilhão auditivo de um cão................... 20
Figura 11 - Localização do município de Monte Negro – RO...............................
23
Figura 12 - Localização do município de Humaitá – AM. ..................................... 23
Figura 13 - Planta H. crepitans, observar metodologia de coleta.........................
26
Figura 14 – Preparação de extratos...................................................................... 29
Figura 15 - Envelopes em duplicatas.................................................................... 29
Figura 16 - Contagem das larvas..........................................................................
30
Figura 17 - Relação da concentração do látex da planta Hura crepitns L. em
função da mortalidade de larvas de B. microplus no decorrer do tempo............... 37
Figura 18 - Porcentagem média de mortalidade em relação ao tempo corrigida
pela fórmula e Abbott em larvas de B. Microplus para cada concentração do
latex H. Crepitans................................................................................................... 38
xiii
Figura 19 - Relação da concentração do látex da planta Hura crepitns L. em
função da mortalidade de larvas de R. sanguineus no decorrer do tempo em
relação as 5 concentrações e controle..................................................................
39
Figura 20- Porcentagem média de mortalidade de larvas de R. sanguineus em
relação ao tempo para cada concentração do latex H. Crepitans corrigida pela
fórmula de Abbott. .................................................................................................
40
Figura 21 - Comparação da mortalidade das larvas do B. microplus nas cinco
concentrações do extrato etanólico da R. pubiflora e controle em função do
tempo de contato...................................................................................................
41
Figura 22 - Compara a mortalidade das larvas de R. sanguineus em contato
com as 5 concentrações do extrato etanólico da R. pubiflora e controle em
função do tempo de contato. ................................................................................. 42
xiv
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Resultados obtidos nos testes para classe de substâncias.................
32
Tabela 2 - Mortalidade de larvas B. microplus, por ação da H. crepitans L. em
diferentes dosagens observadas a cada 6 horas por 24 horas.............................
33
Tabela 3 - Mortalidade de larvas R. Sanguineus, por ação da H. crepitans L.
em diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas.........................
34
Tabela 4 - Mortalidade de larvas B. microplus, por ação da R. pubiflora em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas...............................
35
Tabela 5 - Mortalidade de larvas R. sanguineus, por ação da R. Pupiflora em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas...............................
36
xv
SUMÁRIO
RESUMO
viii
ABSTRACT
x
LISTA DE FIGURA
x
LISTA DE TABELA
xii
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................
1
1.1 HISTÓRICO SOBRE O USO TERAPEUTICO DAS PLANTAS...............
4
1.2 FAMÍLIA EUPHORBIACEAE...................................................................
7
1.2.1 Hura crepitans ... .............................................................................
8
1.3 FAMILIA Violaceae...................................................................................
10
1.3.1 CARACTERISTICA DA PLANTA Rinorea pubiflora........................
11
1.4 Boophilus microplus.................................................................................
12
1.4.1 - CARACTERISTICAS DOS B. microplus.......................................
12
1.4.2 CICLO DE VIDA DO Boophilus microplus. .....................................
13
1.4.3 IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA DO Boophilus microplus...............
15
1.5 Rhipicephalus sanguineus......................................................................
17
1.5.1 CARTERISTICAS DO Rhipicephalus sanguineus..........................
17
1.5.2 CICLO DE VIDA..............................................................................
18
1.5.3 IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA DO R. sanguineus........................
19
2- OBJETIVO.......................................................................................................
21
2.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................
21
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................
21
3- METODOLOGIA..............................................................................................
22
3.1 AREAS DE COLETAS DE MATERIAIS BIOLÓGICOS...........................
22
xvi
3.1.1 MONTE NEGRO - RO.....................................................................
22
3.1.2 HUMAITÁ - AM................................................................................
23
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................
24
3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS...................................................
25
3.4 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DAS PLANTAS.........................................
25
3.5 OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DA PLANTA Rinorea
pubiflora...............................................................................................................
27
3.6 IDENTIFICAÇÃO DA CLASSE DAS SUBSTANCIAS..............................
27
3.6.1 Esteróides e Terpenos.....................................................................
27
3.6.2 Flavanóides......................................................................................
28
3.6.3 Alcalóides.........................................................................................
28
3.7 COLETAS DE TELEÓGENAS INGURGITADAS DE B. microplus E R.
sanguineus..........................................................................................................
28
3.8 ENSAIOS BIOLÓGICOS..........................................................................
28
3.9 ANÁLISE ESTATISTICA..........................................................................
30
4 RESULTADO....................................................................................................
32
4.1 CLASSE DE SUBSTÂNCIAS..................................................................
32
4.2 ATIVIDADE CARRAPATICIDA DAS PLANTAS R. pubiflora E H.
creapitans EM R. sanguineus E B. microplus......................................................
33
5 DISCUSSÃO.....................................................................................................
43
6 CONCLUSÃO...................................................................................................
48
7 BIBLIOGRAFIA.................................................................................................
49
1
1 INTRODUÇÃO
Possuidor de uma flora variada o Brasil conta com um grande número de
espécies vegetais utilizadas como fitoterápicos, e, somente uma pequena
fração tem sido alvo de estudos que confirmem seus efeitos. A biodiversidade
presente no Brasil constitui uma de nossas maiores riquezas, destacando-se
como fontes para a obtenção de novas substâncias com finalidade terapêutica
na medicina e veterinária.
O Brasil abriga a maior diversidade biológica, e se encontra entre os 17
países ditos mega diversos, reúnem 70% das espécies de animais e vegetais
catalogadas até hoje no mundo. Calcula-se que o Brasil possua entre 15% a
20% de toda a biodiversidade mundial e o maior número de espécies
endêmicas
(Lewinsohn
&
Prado,
2002).
Sendo
assim,
esta
ampla
biodiversidade acaba se tornando um recurso estratégico, um laboratório
genético para a medicina, a agricultura e indústria (Marques, 1982).
O potencial das plantas superiores usadas como fonte de novos
medicamentos é ainda pouco explorado, considerando estimativa de que existe
cerca de 400 a 500 mil espécies de plantas e somente uma pequena
porcentagem tem sido investigada fitoterapicamente, e dentre estas, a fração
que representa as que são submetidas a testes biológicos e farmacológicos é
ainda menor (Hamburguer & Hostettmn, 1991).
Com o apogeu das idéias de preservação e de desenvolvimento
sustentável, novas perspectivas surgem em relação a plantas de importância
fitoterápica. A tendência global de uma preocupação com a biodiversidade em
2
conjunto com idéias de desenvolvimento sustentável trouxe novos ares ao
estudo de plantas medicinais brasileiras, despertando novamente um interesse
geral na fitoterapia. Novas linhas de pesquisa foram estabelecidas em
universidades, algumas buscando bases mais sólidas para avaliação científica
do uso de plantas medicinais (Lorenzi. & Abreu, 2002).
A busca por fórmulas alternativas de controle de pragas, sem o uso de
substância sintética, tem sido uma tendência mundial tanto na área agrícola
como veterinária, buscando assim alimentos sem resíduos químicos e
conseqüentemente uma melhor qualidade de vida (Morrone, et al, 2001).
O controle dos carrapatos é na maioria das vezes feito através de
carrapaticidas químicos, enquanto somente uma pequena quantidade de
agricultores o faz através de fitoterápicos ou removem-os manualmente (Pamo
et al, 2004). Estudos que visam à utilização de extratos vegetais no combate a
carrapatos ainda estão em fase inicial. As técnicas de controle mais usadas é a
rotação de pastagens, a criação de bovinos resistentes e aplicação de produtos
químicos, sendo este último método que provoca contaminação do ambiente e
a restrição temporária da utilização da carne e do leite de animais tratados,
além de contribuir para criar carrapatos resistentes a esses produtos. Essa
problemática tem causado prejuízos econômicos em nosso país que
ultrapassam bilhões de dólares anualmente (Boletim Agropecuário, 2003).
A utilização de extrato etanólico da planta Rinorea pubiflora da família
Violeaceae e do látex da planta Hura crepitans, da família das Euphorbiaceas
em ensaios biológico para testar efeitos como carrapaticidas vem colaborar na
valorização de produtos oriundos da biodiversidade amazônica.
3
O uso indiscriminado de carrapaticidas químicos, muitas vezes sem
assistência técnica, resulta em resistência adquirida por carrapatos, exigindo
assim doses cada vez maiores e conseqüentemente aumentando os danos ao
meio ambiente, aos animais e ao homem. Em conseqüência do avanço da
agricultura e pecuária extensivas houve um abandono no uso de plantas
fitoterápicas de ação antipragas e antiparasitas selecionadas por conhecimento
empírico. Isto implica em importantes perdas: ambientais, econômicas e sociais
entre outras, pois o Brasil com sua mega-biodiversidade deixa de explorar suas
riquezas naturais se sujeitando a dependência da tecnologia externa, além de
contribuir para a poluição do meio ambiente e até mesmo na extinção de
espécies.
Direcionar estudos para carrapatos Boophilus microplus (carrapatos de
bovinos) e Rhipicephalus sanguineus (carrapatos marrom de cães) se deve ao
fato de parasitarem animais domésticos e conseqüentemente estarem ligados
ao convívio humano. E, utilizar extrato etanólico da planta Rinorea pubiflora e
do látex da Hura creapitans
em teste biológico com larvas de Boophilus
microplus e Rhipicephalus sanguineus é buscar alternativa usando produtos de
nossa biodiversidade amazônica como agente carrapaticida, contribuindo
assim com a preservação do meio ambiente e colaborando para o
desenvolvimento econômico sustentável da região.
4
1.1 Histórico sobre o uso terapêutico das plantas
O uso das espécies vegetais, com fins terapêuticos, remonta ao início da
civilização, desde o momento que o homem despertou para a consciência e
começou um longo percurso de manuseio, adaptação e modificação de recursos
naturais para seu benefício. Essas práticas milenares, atividade humana por
excelência, ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo
evolutivo e chegou até os dias atuais, sendo amplamente utilizada por grande
parte da população mundial. Desde a pré-história o homem procurou aproveitar
os princípios ativos existentes nos vegetais, embora de modo totalmente
empírico ou intuitivo, baseados em descobertas ao acaso. Antigos textos
caldeus, babilônios e egípcios já traziam referências a certas espécies vegetais
usadas em rituais religiosos, na Bíblia, tanto no novo como no antigo testamento,
há muitas referências a plantas curativas (Van den Berg, 1998).
Até o século XIX, os recursos terapêuticos eram constituídos
predominantemente por plantas e extratos vegetais. No início do século
passado, esses recursos começaram a ser estudados com os instrumentos
científicos da época e se estabeleceu paulatinamente a tendência da utilização
das substâncias ativas isoladas, nesta época toma impulso à química orgânica,
Wohler sintetiza a uréia a partir do cianeto de amônio, mudando à teoria que
orgânico só se origina de orgânico e os químicos começam a produzir versões
dos componentes das plantas, iniciando assim, a transição de medicamentos
naturais para sintéticos (Schenkel et al., 2003).
Muitas plantas acumulam substâncias que podem ser extraídas em
quantidade suficientes para serem economicamente utilizadas para as mais
5
variadas aplicações científicas, tecnológicas e comerciais. As substâncias
químicas extraídas das plantas são normalmente classificadas em metabólitos
primários e secundários. Os primários são encontrados principalmente em
sementes e órgãos de armazenamento, estão ligados ao desenvolvimento da
planta. Os secundários são derivados do metabolismo primário, com
distribuição limitada a determinados grupos taxonômicos, possuem um papel
ecológico, como: atrativos para polinizadores, defensores químicos contra
microorganismos, insetos, predadores superiores e até mesmo contra outras
plantas (aleloquímicos). Eles são utilizados comercialmente como compostos
biologicamente ativos como: Pesticidas, fármacos, aromatizantes entre outros.
Podemos citar como alguns exemplos de metabólitos secundários a nicotina,
aspiretrina, rotenona, cocaína, morfina, azadirachtina (planta Neen), óleos
essências, resinas, alcalóides, flavanóides, taninos, entre outros (Di Stase,
1996). Tanto os primários como os secundários podem ser obtidos através de
processos relativamente simples como: destilação a vapor, extração com
solvente aquoso ou orgânico (Balandrim, 1985).
A nicotina é um dos mais antigos inseticidas e provavelmente o alcalóide
mais conhecido e utilizado, agindo também como acaricida, ela se decompõe
facilmente em presença de luz (Pilli & Yoshinaga,2003).
Os produtos naturais podem ser de potencial interesse no combate a
pestes. Primeiro porque, graças à diversidade de tipos estruturais, constituem
fonte rica de compostos a serem pesquisados em testes biológicos de triagem,
segundo porque o conhecimento sobre sua atividade biológica pode levar à
aplicação direta do próprio produto resultante de modificações estruturais,
6
terceiro porque conhecer e compreender função de um produto químico na
natureza pode levar as novas estratégias no manejo de pragas (Prates, 1992).
Pesquisas estão sendo feitas na busca de alternativas biológicas no
controle de ectoparasitos de importância veterinário. Como relatado por Prates
et al. (1993), o óleo essencial da Melinis minutiflora (capim gordura) composta
por monoterpenos e α e β- pineno, provocou mortalidade de 100% das larvas
do carrapato Boophilus microplus em dez minutos em condições de laboratório
e dois componentes isolados do óleo essencial do capim gordura matam larvas
em cinco minutos.
Um grupo de pesquisa de plantas da Empresa brasileira de pesquisa
agropecuária de Campo Grande, MS, comprovou a atividade carrapaticida em
B. microplus da planta Melia azedarach (cinamomo) e pesquisas em
andamento com o objetivo de isolar o princípio ativo desta planta (Dantas et al.,
2000).
Furlong et al. (2002), realizaram um estudo sobre extrato alcoólico e o
aquoso do Neen (Azadirachta indica) que é composto por azadiractina
(proteína), limoneno, triterpenos, genuninos, nimbim em larvas de B. microplus.
O extrato aquoso em 48 horas de exposição obteve os melhores resultados.
Silva & Martinez. (2004) avaliaram duas formulações comerciais de A. indica
contra B. microplus e observaram elevada eficiência dos produtos somente em
altas concentrações, assim como em Amblyomma variegatum (Ndumu et al.,
1999). Costa-Junior et al. (2002) avaliaram a eficiência in vitro de rotenóides
extraídos do Timbó (Derris urucu) em teleóginas do carrapato B. microplus e a
maior concentração utilizada no experimento (10,0 mg/ml) obtiveram uma
eficiência média de 97,85%. Chagas (2001) detectou a ação acaricida dos
7
óleos essenciais (hidrocarbonetos terpenicos monocíclicos) de três espécies de
eucalipto (Eucalytus citriodora, Eucalypitus globulus e Eucalyptus staigeriana)
sobre o carrapato B. microplus. Os resultados foram tão satisfatórios que
incentivaram o depósito de três patentes nacionais e uma patente internacional
dos produtos desenvolvidos a partir dos óleos essenciais destas três espécies
de eucalipto.
Os acaricidas constituem o principal mecanismo de controle de
carrapatos. Os primeiros acaricidas foram os arsênicos (década de 40), os
clorados (DDT, BHC em 1952), os fosforados (décadas de 50 e 60), as
amidinas (década de 70), os piretróides (década de 80) e por último os
quimioterápicos com ação inseticida (Furlong, 1993).
Inseticidas e acaricidas provocam certo grau de poluição ambiental,
sendo prejudiciais à vida e ao meio ambiente. Resíduos de acaricidas no leite e
na carne constituem um problema universal e de grande importância na saúde
pública e sua presença interfere na comercialização de produtos de origem
animal (Uilenberg, 1996).
1.2 Familia Euphorbiacea
Esta família é representada, aproximadamente, por 290 gêneros, com
cerca de 7500 espécies, distribuídas em todas as regiões tropicais e
subtropicais do globo, principalmente na América e África. No Brasil ocorrem
72 gêneros e cerca de 1100 espécies em habitat diferentes (Barrroso, 1991).
São plantas de hábitos bastante variados, existindo ervas, subarbusto,
árvores e trepadeiras. Possuem folhas alternadas, inteiras ou partidas, em
geral estípulas, lactescentes ou não. Flores sempre de sexos separados,
8
geralmente monoclamídeas, também diclamídeas, em plantas monóicas,
reunidos em inflorescências muito variadas, em geral do tipo cacho. Dentre as
Euphorbiacecae encontram-se muitas plantas úteis como à mamona (Ricinus
communis), com sementes ricas em óleo rícino, o tungue (Auleurites fordii) que
produz óleo de baixo ponto de congelamento, essenciais para certos tipos de
lubrificação. Também pertence a essa família a seringueira da Amazônia
(Hevea brasileisis), a mandioca (Manihot esculenta), o assacu (Hura crepitans )
árvore que produz látex cáustico, a coroa-de-cristo (Acacia farnesiana), o
quebra-pedra (Phyllanthus niruri) usado como remédio entre outras (Joly,1993).
O aspecto químico característico da família das Euphorbiaceae é
representado por triterpenos seguido de flavanóides e alcalóides (Payo Hill et
al., 2001).
Muitas plantas que produzem alcalóides são evitadas por animais ou
insetos em sua dieta, isto ocorre devido a sua toxidade ou ao fato de a maioria
dos alcalóides ter gosto amargo (Simões, 2003).
1.2.1 Hura crepitans L.
A Hura crepitans é largamente distribuída em toda a América tropical,
desde a Amazônia até a América Central e Antilhas sendo encontrada em
solos argilosos das matas de várzeas, em terrenos alagáveis ao logo dos rios e
igarapés (SUDAM, 1979). (fig.1) Em geral é encontrada em regiões de clima
quente, com temperaturas variando entre (25°C e 28°C), requer uma alta
precipitação de chuvas e um subsolo bastante úmido na região das raízes,
exige solo rico em nutrientes minerais, com pH variando entre cinco a oito
(Franscis,1990).
9
Fonte: John Francis
Figura 1 – Distribuição geográfica da H. creapitans na América.
Árvore grande, de até 30 metros de altura (fig. 2), casca verde,
espinescente e muito lactente, folhas alternadas longo-peciolada, duas
estípulas, largo-ovaladas ou quase cordadas, dentadas ou inteiras, dobras na
página superior e com as nervuras da página inferior pálido-ferrugineas, flores
avermelhadas, monóicas apeladas, as femininas solitárias e as masculinas
dispostas em espigas pendiculadas de 6 centímetros de comprimento. Frutos
em forma de cápsula esférica, lenhosa, dura, achatado. O tronco fornece
madeira branca e macia, resistente à umidade, usada na construção civil, à
queima da madeira produz fumaça inseticida, o látex produzido pela árvore é
cáustico e irritante, destrói tecidos ulcerados, usado em doses mínimas é antireumático e anti-helmíntico. A “hurina” e a “creptina” (proteínas) são uns dos
princípios ativos da Hura crepitans, o látex pode provocar a morte se usado na
razão de 6g/50 kg de peso corporal. O albúmen que envolve a semente
constitui purgante, mas a semente desprovida de albúmen é comestível por
certos macaco e araras, os índios Ipurinãs usam o látex para envenenar
10
flechas e outras tribos também o utilizam para embarbascar peixes (Corrêa,
1978; Mesa, 1974; Stirpe, 1974). A planta Hura crepitans L. possui a “lecetina”
uma proteína tóxica (Rates, 2000).
O conhecimento empírico do uso do látex da H. crepitans L. pelos povos
da Amazônia como inseticida originou a possibilidade de ser testado como
provável carrapaticida.
Fonte: http://stfs.siedu/webatlas/spanish/huracr.html
Figura 2 – Tronco, folhas e fruto de Hura crepitans.
1.3 Família Violaceae
A família Violaceae foi subordinada por Hutchinson em 1967, no Brasil
ocorrem cerca de setenta espécies subordinadas a dez gêneros. A maior
concentração de espécies encontra-se nos Estados Unidos da América e
Europa (Barroso et al, 2004).
Esta família é composta por 16 gêneros de distribuição nas regiões
tropicais e subtropicais, são plantas herbáceas, lenhosas ou trepadeiras, com
folhas inteiras em rosetas ou de disposição alternada, com espículas. Flores
cleistógamas às vezes desenvolvidas. Flores pequenas e vistosas, cíclicas,
11
hermafroditas de simetria radial ou fortemente zigomorfas, diclamídeas, em
geral zigomorfas, podendo ou não apresentar uma espora (da corola)
desenvolvida. Possuem cinco estames, livres entre si ou com os filetes
soldados. Ovário superior em geral com três carpelos, porém unilocular, com
placentação parietal. Fruto seco, capsular, sementes aladas ou com arilo.
Como planta cultivada destaca-se Violeta (Viola adorata), com flores normais e
flores cleistógomas, curto-pendiculadas não coloridas, desenvolvidas rente ao
chão na roseta, o amor perfeito (Viola tricolor) é também um exemplo desta
espécie (Joly, 1993).
A planta da África Rinorea welwitschii (violaceae) é utilizada pelos povos
de Ghana no tratamento de febre, picada de cobra e sífilis (Stewart et al, 2000).
1.3.1 Catacteristrica da planta Rinorea pubiflora
Árvore de no máximo 8m de altura localiza-se em terrenos pedregosos,
beira de rio e mata em geral, pouco citada na literatura, quando citada refere-se
à catalogação (fig. 3). Essa planta foi alvo de estudo a partir de observação
feita pelos pesquisadores Dr. Phd Luís Marcelo Aranha Camargo, médico
parasitologista
e
Dr.
Marcelo
Bahia
Labruna,
veterinário
ambos
os
pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP), quando ao transportar
carrapatos silvestres em frascos contendo folhas de R. pubiflora, os mesmos
morreram,
surgindo
carrapaticida.
a
possibilidade
dessa
planta
possuir
atividade
12
Fonte: Denise Rezende
Figura 3 – Exemplar de Rinorea pubiflora.
1.4 Boophilus microplus
1.4.1 Caracteristicas dos B. microplus
O B. microplus é um carrapato ixodíneo amplamente distribuído
ocorrendo entre as latitudes de 32° norte e 35° sul, correspondendo à faixa
intertropical que abrange importantes zonas da América Central, América do
sul, África e Oceania. No Brasil é uma das espécies de maior prevalência e
importância (Santana, 2004). Esse carrapato pode infestar: bovinos, búfalos,
cavalos, burros, caprinos, ovelhas, cervos, porcos e cães. Tendo maior
importância veterinária em bovinos (Sou..., 2003).
Taxonomicamente o B. microplus é classificado como: Filo: Artopode;
Classe: Aracnídea; Família: Ixodidae; Gênero: Boophilus e Espécie: Boophilus
microoplus (Drugueri,2004).
O B. microplus possui o corpo pequeno, sem ornamentação, capitulo
hexagonal, aparelho bucal curto, hipostômio mais longo do que os palpos com
placas circulares, sulco anal e festões ausentes. Machos com quatro placas
13
adunais longas e distintas; o corpo termina numa ponta aguda e nas fêmeas o
corpo termina normalmente em forma arredondada (Guimarães et al, 2001)
(Fig. 4).
Fonte: http://imagens.google.com.br/imagens?q=boophilus+microplus
Figura 4 – Imagem de fêmea ingurgitada de Boophilus microplus.
1.4.2 Ciclo de vida do Boophilus microplus.
O B. microplus é um carrapato monoxeno, ou seja, só precisa de um
hospedeiro para completar a sua fase parasitária. Quando uma larva sobe em
um bovino (Fig. 5), fixa-se à pele e após 7 a 8 dias, muda para o estágio de
ninfa, esta ninfa, imediatamente inicia sua alimentação e após 7 a 8 dias
ocorre sua mudança para o estágio adulto, sendo que 50% das ninfas
transformam-se em adultos fêmeas (Teleóginas) e 50% em adultos machos
(Gonandro). As fêmeas se alimentam por sete dias, posteriormente se
desprendem da pele do bovino, caindo ao solo para iniciar a fase não
parasitária. A fase parasitária compreendida da larva à fêmea ingurgitada se
completa em 21 a 22 dias, num único bovino (Gonzales, 1993).
14
Fonte: http://www.carol.com.br/estilo/boletim.jsp?edi=13&pag=7
Figura 5 – Ciclo de vida do Boophilus microplus.
A fase parasitária pode variar de 18 até 35 dias para a maioria dos
carrapatos. No caso dos machos, eles se ingurgitam como as fêmeas, e podem
permanecer no corpo dos bovinos por até 50 dias, fecundando várias fêmeas
neste período. A fase não parasitária em condições ambientais favoráveis
(27°C) e 80% de umidade relativa apresentam as seguintes durações para
cada etapa: O período entre a queda da fêmea ingurgitada do hospedeiro no
solo até o início da postura dos ovos (período de pré-postura) dura de dois a
três dias. O período de postura dura aproximadamente de 15 dias, quando
cada fêmea ingurgitada coloca de 2000 a 3000 ovos. Após o fim desse período
em torno de 10 dias, as larvas começam a eclodir podendo durar até 10 dias
este período. Após a eclosão, as larvas ainda não estão aptas para subir nos
15
bovinos, pois necessitam em torno de 7 dias para endurecer suas cutículas e
se tornarem infestantes. A partir daí, subirão para a ponta dos capins,
esperando a passagem de um bovino para que possam subir nele e iniciar a
fase parasitária (Labruna, 2000).
1.4.3 Importância veterinária do Boophilus microplus
O Carrapato dos bovinos, B. microplus, é um parasita que necessita
obrigatoriamente passar uma fase de vida sobre os animais, onde se alimenta
(Fig. 6). Ao se alimentar, causa irritação, danifica o couro, ingere sangue e
podem inocular os agentes da Tristeza Parasitária Bovina (Furlong & Massard,
1994). Eles podem causar vários tipos de ações que prejudicam o animal
como: ação espoliativa, pela retirada de sangue do animal; cada carrapato que
completa o seu ciclo no animal retira de 1mL a 3mL de sangue; ação irritante,
devido à penetração e aderência do rostro (peça bucal); a saliva do carrapato
possui uma ação anti-coagulante; ação necrosante, responsável pelo estrago
no couro e predisposição do animal às infecções e outros parasitas, como as
miiases; ação tóxica, pela introdução de toxinas no organismo parasitado
(Lauar, 1986).
Fonte: http://www.dpi.qld.gov.au/images/2378.jpg
Figura 6 - Bovino infestado por B. microplus.
16
Os carrapatos afetam a saúde e o conforto dos animais e isso determina
também a quantidade de gado produzido, assim como seu comércio, sendo,
portanto, um problema local da fazenda e um problema público. Com custos
diretos, como: perda de peso vivo, perdas na produção de leite, prejuízo no
couro e as perdas por febre do carrapato causadas por Babesia bovis,
B.bigemina e Anaplasma marginale, além das perdas indiretas pelo controle
químico (Sutherst, 1983).
Os prejuízos causados por B. microplus à pecuária brasileira estão
classificados em dois grupos principais. No primeiro grupo se enquadram os
danos decorrentes da ação direta, caracterizados por espoliação sanguínea e
suas conseqüências, como anemia, prurido, irritação, queda de peso e perda
na produção de leite e carne, predisposição à instalação de miíases e
desvalorização do couro. Em um segundo grupo é compreendido o
traumatismo ocasionado pela ação direta, constituídos essencialmente, pela
transmissão de agentes causadores de doenças, como tristeza parasitária
bovina e pelos gastos com aquisição de medicamentos e de mão de obra
especializada para o tratamento dos animais, além das perdas com os bovinos
que vão a óbito, quando não adequadamente tratados. Na tentativa de se
evitar que a situação chegue a tal ponto, os carrapaticidas são utilizados
indiscriminadamente, levando ao aumento dos gastos, à seleção e proliferação
de populações de carrapatos resistentes às bases químicas disponíveis, além
da poluição ambiental e da elevada quantidade de resíduos nos produtos
derivados dos animais tratados (Furlong & prata, 2003).
17
1.5 Rhipicephalus sanguineus
1.5.1 Caracteristicas do Rhipicephalus sanguineus
Originário da região afro tropical, o ixodíneo foi introduzido no Brasil
possivelmente a partir do século XVI, com a chegada dos colonizadores
europeus e seus animais domésticos (Labruna & Pereira, 2001). É um
ectoparasito que se caracteriza pela hematofagia em animais de sangue
quente, preferindo o cão como principal hospedeiro, mas pode parasitar
cavalos bovinos e até humanos (Goddard, 1989).
É um carrapato de fácil reconhecimento, de cor marrom escuro
(chamado de carrapato vermelho do cão), ornamentado, embora não suficiente
para identificação formal, pode ser reconhecido por sua cor marrom escura,
forma alongada do corpo e capituli sextavado da base. O capituli sextavado da
base é um caráter particular de identificação do R. sanguineus (Lord, 2001)
(fig. 7).
Fonte:
http://www.creatures.ifas.ufl.edu/urban/medical/brown_dog_tick.htm
Figura 7 - Capituli sextavado da base, um caráter identificando o
R. sanguíneus.
18
É uma espécie de carrapato de textura dura, possui escudo dorsal e
corpo liso, com ornamentações na borda superior, os peritremas estão atrás
dos 4 pares de patas e o orifício genital está entre os dois pares de patas. O
dimorfismo sexual é evidente, a fêmea mede 10 a 12 mm, possui abdomem de
cor embranquecida à marrom claro; os machos medem entre 3 a 4 mm, são
mais duros e de cor marrom (fig. 8). A hematofagia é contínua e lenta. As
mudas ocorrem no meio ambiente, necessitam de três hospedeiros para
cumprir um ciclo biológico do R. sanguineus (Drugueri, 2004).
Fonte: http://www.icb.ufmg.br/~prodap/2001/ixodidae/Rhipicephalus.html
Figura 8 - Dimorfismo sexual de R. sanguíneus.
1.5.2 Ciclo de vida
As fêmeas depositam em torno de 2500 a 3000 ovos os quais são
geralmente depositados em lugar úmidos, estes depois de um período de
incubação, que varia de 21 a 27 em temperatura e umidade favorável (27ºC e
80%) e de até 80 dias em condições desfavoráveis. Após esse período
nascem as larvas que depois de um período de sete dias se tornam
infestantes, podendo subir em um hospedeiro para se alimentar de sangue,
após se alimentarem caem no solo e se transformam em ninfas infestantes em
um tempo médio de nove dias. Essas devem subir novamente em um
hospedeiro para se alimentarem e cair no solo para sofrer muda e se tornarem
19
adultas, se transforma em machos em 4,5 dias e em fêmeas em 5,5 dias.
Ambos devem subir no cão para se alimentarem. Uma vez alcançada a
maturidade sexual ocorre à cópula, as fêmeas caem no solo procurando lugar
protegido para por seus ovos e completar o ciclo e os machos permanecem
por mais um período no cão, geralmente não se alimentam de sangue
(Drugueri, 2004) (fig. 9).
Fonte: http://www.icb.ufmg.br/~prodap/2001/ixodidae/Rhipicephalus.html
Figura 9 – Ciclo de vida do R. sanguineus.
1.5.3 Importância veterinária do R. sanguineus
O R. sanguineus tem se mostrado vetor para muitas doenças em cães,
como a Ehrlichia canis e Hematozoon canis (Inokuma et al., 1998). Seu ataque
causa irritação e desconforto aos animais, com perda de sangue (Fig. 10). Na
África, especialmente na bacia do Mediterrâneo, é o principal vetor de um tipo
de tifo, conhecido pelo nome de Febre Botanosa. A doença é causada pela
20
Rickttesia conori. O carrapato é transmissor da Babesia canis, causadora da
babebiose canina e da Rickettsia canis, causadora da riquetsiose canina, é
hospedeiro intermediário de Hepatozoon canis, protozoário causador de
anemia nos cães (Guimarães et al, 2001).
Estudos realizados na Carolina do Norte, EUA, demonstraram que o R.
sanguineus, principalmente suas formas imaturas alimentam-se em humanos
mais frequentemente do que previamente se suponha. O ixodineo desenvolvese em alta densidade em algumas cidades do Brasil, e poderá causar aumento
da incidência de enfermidades emergentes ao homem, tais como babesiose e
febre maculosa (Fernandes, 2000).
Fonte: http://www.icb.usp.br/~marcelcp/Rhipicephalus.htm
Figura 10 - R. sanguineus infestando o pavilhão auditivo de um cão.
21
2- OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade carrapaticida do extrato etanólico da planta Rinorea
pubiflora e do látex da planta Hura crepitans em larvas de B. microplus e R.
sanguineus.
2.2 Objetivo específico
- Avaliar a atividade carrapaticida do extrato etanólico da planta Rinorea
publifora em larvas de B. microplus e R. sanguineus.
- Verificar o potencial carrapaticida do látex da planta Hura crepitans em
larvas de Boophilus microplus e Rhiphicephalus sanguineus.
- Identificar a classe dos constituintes químicos presentes no extrato
etanólico da planta Rinorea pubiflora e do látex da planta Hura crepitans.
22
3- METODOLOGIA
3.1 Áreas de coletas de materiais biológicos
3.1.1 Monte Negro - RO
O município de Monte Negro (“S 10° 15’35”, W 63° 18’06”) (Fig. 11),
localizado no Estado de Rondônia, possui vastas áreas de florestas equatoriais
apresentando
regime
hidrográficas
de
enchentes
e
vazantes,
tendo
característica de rios de planaltos e planícies, o relevo é constituído de
planícies e baixos planaltos variando de 90 a 350m acima do nível do mar
(IBGE,2004).
Neste município encontra-se implantado o Instituto de pesquisa
avançado da USP, onde foram realizados a coleta da planta R. pubiflora e
preparação de seu extrato etanólico, coleta de teleógenas de R. sanguíneus e
B. microplus para obtenção de larvas bem como os ensaios biológicos para a
verificação da atividade carrapaticida das plantas estudadas.
23
Figura 11 – Localização do município de Monte Negro – RO.
3.1.2 Humaitá - AM
Pertencente ao Estado do Amazonas com uma população de 29.164
habitantes, área territorial de 33.074 km, caracteriza por florestas tropicais com
matas de várzea e terra firme. A economia caracteriza-se por agricultura de
subsistência e extensiva, pesca extração vegetal e criação de gado (IBGE,
2000). Em floresta de várzea deste município foi coletado o material vegetal e
extraído o látex da Hura crepitans L (fig. 12).
Fonte: http://www.manausonline.com/municipio_detalha.asp?ide_mun=26
Figura 12 – Localização do município de Humaitá – AM.
24
3.2 Materiais e métodos
A produção do extrato etanólico da planta Rinorea pubiflora foi realizada
no laboratório do Instituto de Ciências Biomédicas 5/Universidade de São
Paulo (ICB5USP), localizado no município de Monte Negro-RO tendo como
coordenador o Professor Dr. Luiz Marcelo A. Camargo.
Foi utilizada balança modelo A2000c n°259459 marca Marte para pesar
material vegetal e estufa marca Supermax modelo Lab-trad FB-60 para
secagem do mesmo. Na preparação do extrato etanólico utilizou-se etanol 95%
PA da marca VETEC. Utilizou-se aparelho banho-maria marca Carolina para
evaporação do solvente e na pesagem do extrato balança de precisão marca
Voyager, modelo SND2791118353644. Nos ensaios de identificação das
classes das substâncias foram utilizados: Acido clorídrico, ácido sulfúrico, fita
magnésio e clorofórmio marca VETEC, anidrido acético marca MERCK e
solução de dragendorf.
Na coleta das fêmeas ingurgitadas foi usado luvas marca RIMED, para
armazenamento das mesmas usou-se vidro com tampas e descecadores
Shilds H42050 e H42051, Should marca Quimis, modelo 341-210. Nos ensaios
biológicos foi usado papel filtro melita n° 103, água destilada processada no
destilador marca QUIMIS e modelo 341 - 210 placas petri diâmetro 15 cm,
copos béquer, pipetas e pincel n° 06, marca CONDOR. O látex da Hura
crepitans foi coletado em recipiente plástico descartável e armazenado em
freezer CONSUL.
25
3.3 Procedimentos experimentais
Os procedimentos referentes as etapas da pesquisa seguem no
organograma abaixo.
Coleta do Material
Vegetal
Rinorea pubiflora
Hura crepitans
Secagem e Maceração
do Material
1-EtOH 95%
2- Filtração/Evaporação
Torta
Preparação de
Excicatas
Extração do Látex
Teste Classe de
Substância
Ensaios
Biológicos/Atividade
Carrapaticida
Extrato Etanólico
3.4 Coleta e identificação das plantas
O material vegetal da Rinorea publifora foi coletado as margens do rio
Jamari no lado pertencente ao Município de Cacaulândia-RO, distante 10 Km
da sede do município do Monte Negro-RO. A planta foi localizada a partir do
conhecimento empírico e orientada pelo motorista e mateiro Ademir Quadros,
funcionário do Instituto de Ciência biomédica 5/ Universidade de São Paulo
(ICB5USP). Foram coletadas folhas para preparação do extrato etanólico e
material vegetativo e reprodutivo para confecção de exsicata que foi enviada ao
Instituto de Pesquisa da Amazônia (INPA), sendo identificada como Rinorea
pubiflora, com testemunho n° 217114.
26
O material vegetativo bem como o látex da planta H. crepitans foram
coletadas a partir de informações empíricas do Sr. Manuel das Dores Ferreira,
filho de seringueiro e natural do município de Manicoré-AM. Esses materiais
foram coletados de plantas H. crepitans localizadas no município de HumaitáAM, a margem do rio Madeira a 20 km da sede do município, sentido Manaus.
O látex foi extraído através de técnica idêntica a utilizada na coleta do
látex da seringueira (Hevea brasiliensis) (fig.13), foi coletado em torno de 900
mL e armazenado em recipiente plástico, transportado em caixa térmica com
gelo e posteriormente conservado em freezer até a utilização do mesmo em
ensaios biológico com o objetivo de verificar sua atividade carrapaticida. Foi
coletado também material vegetativo para a confecção de exsicatas, sendo a
mesma enviada para o INPA, onde foi confirmado que se tratava da planta H.
crepitans L, mas não foi catalogada por não possuir material reprodutivo.
Fonte: Manoel das Dores Ferreira
Figura 13 – Planta H. crepitans, observar metodologia de coleta.
27
3.5 Obtenção do extrato etanólico da planta Rinorea pubiflora
As folhas da Rinorea pubiflora após coletadas foram selecionadas
obtendo-se 1550g de material fresco e posteriormente colocadas em estufa a
40°C por três dias, após esse período as mesmas foram trituradas e pesadas,
resultando em 623g de material seco. Esse material foi colocado em recipiente
de vidro e acrescentado 2,4 L de etanol 95% PA e deixado em repouso por 15
dias. Através do processo de filtração foi separada a parte sólida da líquida, o
filtrado foi submetido a banho-maria para evaporação do etanol, resultando um
montante de 25g de extrato etanólico com aspecto pastoso de cor verde oliva.
O mesmo foi armazenado em recipiente escuro, vedado e guardado em
geladeira para posterior utilização em ensaios biológicos para verificação da
atividade carrapaticida.
3.6 Identificação da classe das subsâncias
O extrato etanólico da planta R. publifora e o látex da H. crepitans foram
submetidos a testes específicos para as principais classes de substâncias, tais
como: terpenos, flavanóides, esteróides e alcalóides, segundo Merck (1972).
3.6.1 Esteróides e Terpenos - Dissolve-se uma pequena quantidade do
material em clorofórmio (CHCL3) adicionou-se 1mL de anidrido acético e
aproximadamente três gotas de ácido sulfúrico (H2SO4). A coloração verde
indica teste positivo para esteróides e a coloração vermelha positivo para
terpenos.
28
3.6.2 Flavanóides – Dissolveu-se uma pequena quantidade de material em
etanol, adicionaram-se algumas fitas de magnésio e em seguida ácido
clorídrico concentrado. A coloração avermelhada indica teste positivo para
flavanóides.
3.6.3 Alcalóides – Solubilizou-se uma pequena quantidade do material em
solução de ácido clorídrico (HCL). Adicionou-se solução de dragendorf. A
precipitação de material amarelo indica resultado positivo para alcalóides.
3.7 Coleta de Teleóginas ingurgitados de B. microplus e R. sanguineus
Foram coletadas teleóginas ingurgitadas, colocadas em recipientes de
vidro, mantidos dentro de descecadores com água na bandeja para manter
umidade em torno de 80% e deixando em temperatura ambiente (22 a 35°C).
As mesmas produziram ovos que geraram um pool de larvas, sendo usadas
em ensaios biológicos quando atingiram de 14 a 21 dias de nascidas.
3.8 Ensaios Biológicos
Os ensaios foram feitos segundo FAO (1971), seguindo o mesmo
modelo tanto para o R. Sanguineus e B. microplus.
Foram preparadas cinco concentrações de extrato etanólico da Rinoria
pubiflora, solubilizados em 30 gotas de Tween 20 e 7,5 mL de água destilada
nas proporções de 0,2g; 0,4g; 0,6g; 0,8g; 1,0g. O controle foi feito com 30
gotas de Tween em 7,5 mL de água destilada (Fig. 14).
29
Foto: Leormando Fortunato
Figura 14 – Preparação de extratos.
As cinco diferentes concentrações do látex da H. crepitans para cada 10
mL de água destilada foram de 0,25mL; 0,50mL; 0,75mL; 1,00mL e 1,25mL. O
controle foi feito com apenas água destilada.
Utilizaram-se envelopes em duplicatas para cada concentração e para
os controles. Nos envelopes, com o auxílio de um pequeno pincel, foram
colocadas aproximadamente 70 larvas de 18 dias de nascidas, sendo
escolhidas as que estavam na borda do recipiente e envelopes foram vedados
com clips, os mesmos deixados em ambiente com umidade em torno de 80% e
temperatura ambiente (Fig. 15).
Foto: Leormando Fortunato
Figura 15 - Envelopes em duplicatas.
30
A observação da mortalidade foi feito no tempo de 6, 12 e 24 horas.
Para mortalidade maior contaram-se os vivos e para mortalidade menor
contaram-se os mortos e no final das 24 horas verificou-se a mortalidade para
cada caso. As larvas vivas foram separadas e colocadas sobre algodão
embebido em solução de detergente para imobilizá-las. Somente as larvas que
se deslocavam eram consideradas vivas (Fig. 16).
Foto: Leormando Fortunato
Figura 16 - Contagem das larvas.
3.9 Análise estatística
Os resultados dos ensaios biológicos para verificação da atividade
carrapaticida do extrato etanólico da planta R. publiflora e do látex da H.
crepitans L. foram armazenados no programa estatístico STATISTIES 6.0
sendo os mesmo utilizados na confecção dos gráficos e o índice de
mortalidade corrigidos pela fórmula de ABBOTT (1925), transcrita abaixo.
(%mortalidade= mortalidade das larvas tratadas – mortalidade das larvas do controle x 100)
100-mortalidade das larvas do controle
31
Para a análise estatística foi realizado o testes ANOVA e quando houve
diferenças significativas pelo teste da ANOVA foi utilizado o procedimento de
comparações múltiplas de Tukey com nível se significância 5%.
32
4 RESULTADOS
4.1 Classe de substâncias
Resultados obtidos através de testes para classe de substâncias
presentes no látex da H. crepitans e no extrato etanólico da R.. pubiflora : estão
representados na tabela abaixo.
Tabela 1 – Resultados obtidos nos testes para classe de substâncias
Resultados das classes de substâncias
Extrato etanólico R.
Látex da H. crepitans
pubiflora
L.
Esteróide
(+)
(-)
Terpenos
(-)
(-)
Flavanóides
(-)
(-)
Alcalóides
(-)
(+)
Classes
33
4.2 Atividade carrapaticida da planta R. pubiflora e H. creapitans em R.
sanguineus e B. microplus
Tabela 2– Mortalidade1 de larvas B. microplus, por ação da H. crepitans em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas.
Dosagem
Mortalidade Média (%) ± Desvio-Padrão
0h
6h
12 h
24 h
Controle
0.00 ± 0.00 a2
0.00 ± 0.00 a
2.35 ± 0.04 a
8.35 ± 1.34 a
0.25
0.00 ± 0.00 a
85.79 ± 0.97 b
90.1 ± 1.66 b
100.00 ± 0.00 b
0.50
0.00 ± 0.00 a
88.75 ± 1.77 b
91.89 ± 0.61 b
100.00 ± 0.00 b
0.75
0.00 ± 0.00 a
92.59 ± 0.13 c
96.45 ± 1.41 c
100.00 ± 0.00 b
1.00
0.00 ± 0.00 a
94.17 ± 0.99 c
100.00 ± 0.00 d
100.00 ± 0.00 b
1.25
0.00 ± 0.00 a
95.39 ± 0.08 c
100.00 ± 0.00 d
100.00 ± 0.00 b
1
Mortalidade (%) corrigida em relação à testemunha (ABBOTT, 1925).
2
Médias não seguidas da mesma letra minúscula na coluna, diferem
significativamente entre si, pela análise de variância um fator e o procedimento
de comparações múltiplas de Tukey em nível de 5% de significância
34
Tabela 3 – Mortalidade1 de larvas R. sanguineus, por ação da H. crepitans em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas.
Dosagem
Mortalidade Média (%) ± Desvio-Padrão
0h
6h
12 h
24 h
Controle
0.00 ± 0.00 a2
2.43 ± 3.44 a
6.21 ± 1.55 a
11.22 ± 1.37 a
0.25
0.00 ± 0.00 a
55.39 ± 3.36 b
91.89 ± 1.53 b
93.88 ± 1.64 b
0.50
0.00 ± 0.00 a
54.17 ± 0.23 b
93.19 ± 0.10 b
96.41 ± 1.64 b
0.75
0.00 ± 0.00 a
62.38 ± 0.17 bc
97.30 ± 0.10 c
100.00 ± 0.00 c
1.00
0.00 ± 0.00 a
69.99 ± 2.56 bc
100.00 ± 0.00 d
100.00 ± 0.00 c
1.25
0.00 ± 0.00 a
84.99 ± 3.55 c
100.00 ± 0.00 d
100.00 ± 0.00 c
1
Mortalidade (%) corrigida em relação à testemunha (ABBOTT, 1925).
2
Médias não seguidas da mesma letra minúscula na coluna, diferem
significativamente entre si, pela análise de variância um fator e o procedimento
de comparações múltiplas de Tukey em nível de 5% de significância.
35
Tabela 4 – Mortalidade1 de larvas B. microplus, por ação da R. publifora em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas.
Dosagem
1
Mortalidade Média (%) ± Desvio-Padrão
0h
6h
12 h
24 h
Controle
0.00 ± 0.00 a
0.00 ± 0.00 a
2.10 ± 0.03 ab
4.29 ± 0.06 a
0.20
0.00 ± 0.00 a
0.00 ± 0.00 a
2.33 ± 0.08 ab
2.33 ± 0.08 b
0.40
0.00 ± 0.00 a
0.00 ± 0.00 a
1.25 ± 1.77 a
5.00 ± 0.00 c
0.60
0.00 ± 0.00 a
0.00 ± 0.00 a
2.27 ± 0.07 ab
6.81 ± 0.22 d
0.80
0.00 ± 0.00 a
1.10 ± 1.53 a
3.28 ± 1.50 ab
6.59 ± 0.10 d
1.00
0.00 ± 0.00 a
1.25 ± 1.77 a
5.60 ± 0.08 b
10.13 ± 0.18 e
Médias não seguidas da mesma letra minúscula na coluna, diferem
significativamente entre si, pela análise de variância um fator e o procedimento
de comparações múltiplas de Tukey em nível de 5% de significância.
36
Tabela 5 – Mortalidade1 de larvas R. sanguineus, por ação da R. publifora em
diferentes dosagens observada a cada 6 horas por 24 horas.
Dosagem
1
Mortalidade Média (%) ± Desvio-Padrão
0h
6h
12 h
24 h
Controle
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
2.10 ± 0.03
4.21 ± 0.06
0.20
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
1.09 ± 1.53
3.28 ± 1.50
0.40
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
2.67 ± 0.05
3.98 ± 1.81
0.60
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
2.22 ± 0.00
4.44 ± 0.00
0.80
0.00 ± 0.00
1.11 ± 1.57
2.27 ± 0.07
5.56 ± 1.55
1.00
0.00 ± 0.00
2.41 ± 0.03
3.54 ± 1.57
7.14 ± 0.24
Não houveram diferenças significativas nas comparações das dosagens de
acordo com o tempo em nível de significância 5% na análise de variância.
37
Line Plot (Spreadsheet3 6v*4c)
120
100
80
60
40
20
Controle
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
0
-20
0 horas
6 horas
12horas
24 horas
Figura 17 - Relação da concentração do látex da planta H. crepitns em função
da mortalidade de larvas de B. microplus no decorrer do tempo nas cinco
concentrações e controle.
38
120
Porcentagem de Mortalidade
100
80
60
40
20
0
-20
0
6
12
24
Controle
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Tempo ( horas )
Figura 18 - Porcentagem média de mortalidade em relação ao tempo corrigida
pela fórmula e Abbott em larvas de B. microplus para cada concentração do
latex H. crepitans.
39
Line Plot ( 10v*10c)
120
100
80
60
40
20
CONTR
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
0
-20
0horas
6horas
12horas
24horas
Ca
Figura 19 - Relação da concentração do látex da planta H. crepitns L. em
função da mortalidade de larvas de R. sanguineus no decorrer do tempo em
relação as 5 concentrações e controle.
40
120
Porcentagem de Mortalidade
100
80
60
40
20
0
-20
0
6
12
24
Controle
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Tempo ( horas )
Figura 20 - Porcentagem média de mortalidade de larvas de R. sanguineus em
relação ao tempo para cada concentração do latex H. crepitans corrigida pela
fórmula de Abbott.
41
Line Plot (Spreadsheet5 6v*4c)
10
8
6
4
2
controle
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0
-2
0 horas
6 horas
12 horas
24 horas
Figura 21 – Comparação da mortalidade das larvas do B. microplus nas 5
concentrações do extrato etanólico da R. pubiflora e controle em função do
tempo de contato.
42
Line Plot (Spreadsheet4 6v*4c)
8
7
6
5
4
3
2
1
Controle
0,20
0,4
0,6
0,8
1,0
0
-1
0 horas
6 horas
12 horas
24 horas
Figura 22 - Compara a mortalidade das larvas de R. sanguineus em contato
com as 5 concentrações do extrato etanólico da R. pubiflora e controle em
função do tempo de contato.
43
5 DISCUSSÃO
O látex da planta H. crepitans demonstrou presença de alcalóides e o
extrato etanólico da planta R. pubiflora a presença de esteróides. Já
mencionado por Kutchan (1995) e Evans (1996), onde citam que essas
substâncias
nitrogenadas(alcalóides)
farmacologicamente
ativas
são
encontradas predominantemente nas angiospermas e na sua grande maioria
possuem caráter alcalino. Esse grupo tem apresentado um grande impacto
através dos tempos na economia, na medicina, na agronomia, na veterinária e
em outros setores sociais e políticos. O uso de extratos vegetais contendo
alcalóides como medicamento, venenos e em porções mágicas (rituais
religiosos), pode ser traçado desde os primórdios da civilização (Henrique, et
al., 2003).
Os alcalóides possuem atividades farmacológicas antibacteriana,
antifúngica, antiinflamatórias, como inseticidas entre outras (DI Stasi, 1996b).
A salasodina (esteróide) extraída da planta do gênero Solanum tem sido
usada como fonte para produção de progesterona e cortisona, compostos que
são utilizados como matéria-prima na produção de fármacos diuréticos e
anticoncepcionais (Mola, 1997).
O resultado dos testes para verificar atividade carrapaticida mostrou que
o extrato etanólico da R. pubiflora não possui atividade carrapaticida e o látex
da planta H. crepitans possui, confirmando assim os efeitos fitorerápicos de
seus componentes, onde esteróides estão relacionados com fármacos ligados
a hormônios (Mola, 1997) e os alcáides com atividades antibacteriana,
antifúngica e na agricultura como inseticida ou acaricida (DI Stasi, 1996b).
44
De acordo com as normas do Ministério da Agricultura um acaricida é
está dentro dos padrões quando sua eficácia for igual ou maior que 95%
(Brasil, 1990). Os resultados deste estudo mostram que o látex da planta H.
crepitans é um carrapaticida eficiente para R. sanguineus e B. microplus.
Figura 17 e 18 relaciona o látex da planta H. crepitans em cinco
concentrações e controle, onde verificarou-se que após 24 horas todas as
cinco diferentes concentrações obtiveram o mesmo índice de mortalidade
(100%).
Na figura 19 e 20 observou-se que as cinco concentrações do látex da
H. crepitans em contato com larvas de R. sanguineus obtiveram médias
relativamente
semelhante com pequeno desvio padrão e o controle se
diferenciando das 5 concentrações. As concentrações 0,25 e 0,50 são
estatisticamente iguais e diferentes das demais e que a partir da concentração
0,75 até 1,25 são também consideradas estatisticamente iguais. Comprovando
assim a eficiência do látex da planta H. cripitans como carrapaticida, pois
embora nas duas primeiras concentrações não tenham alcançado 100% de
mortalidades como as demais, possuem atividade carrapaticidas, pois o índice
de mortalidade foi superior a 95%.
A figura 21 mostra às cinco concentrações do extrato etanólico da planta
R. pubiflora e controle em função do tempo de exposição das larvas de B.
microplus. Constatou-se que a média de mortalidade da concentração 0,2 foi
menor que o controle, sugerindo que essa concentração não interferiu na
mortalidade das larvas, nas demais concentrações houve um pequeno
aumento na porcentagem de mortalidade com um pequeno desvio padrão, mas
45
com diferenças pouco significativas. Esse gráfico confirma que o estrato
etanólico não possui atividade carrapaticida em B. microplus.
A figura 22 relaciona a porcentagem de mortalidade das larvas de R.
sanguineus em presença das cinco concentrações do extrato etanólico da
planta R. pubiflora e controle onde observou-se que não houve diferenças
significativas entre as concentrações próximas em relação a mortalidade, mas
uma pequena diferença entre a primeira e a última, diferença essa que não
demonstrou atividade carrapaticida do extrato.
Observações
feitas
a
partir
dos
gráficos
referentes
às
cinco
concentrações do extrato etanólico da planta R. pubiflora onde foram testada a
atividade carrapaticida em larvas de B. microplus e R. sanguineus, constatouse que essa planta não possui atividade carrapaticida, pois as mortalidades
das larvas foram insignificantes em relação ao controle.
Os resultados dos testes foram confirmados através do teste ANOVA e
comparação múltipla de Tukey e o índice de mortalidade corrigido pela fórmula
de ABBOTT.
Segundo observação feita pelos pesquisadores Dr Luis Marcelo A.
Camargo e Dr Marcelo B. Labruna onde a planta R. pubiflora
poderia
apresentar atividade carrapaticida, não foi confirmado em teste com B.
microplus e R. sanguineus, a não confirmação desta hipótese pode estar
relacionado com as espécies de carrapatos, pois os mesmos observaram que
carrapatos de animais silvestres morreram ao serem transportados em
presença de folhas dessa planta e os carrapatos utilizados em ensaios
biológicos são carrapatos de animais domésticos sendo os mesmos de habitat
diferentes. Ou ainda, pode estar relacionado com outros fatores, como:
46
temperatura, vedação dos frascos, umidade, isto é, condicionamento no
transporte dos mesmos.
O fato do látex da planta H. crepitans revelar atividade carrapaticida
pode estar relacionada à presença de alcalóide, ou ainda pela presença de
proteínas como Hurina, creptina (correia, 1978) e lecitina (Rates 2000).
A
lecitina é uma proteína considerada inseticida, proteínas com ação inseticida
precisam ser ingeridas pelo inseto para que seus efeitos aconteçam, uma vez
que
o
exoesqueleto
oferece
proteção
contra
agentes
hidrofílicos
e
macromoléculas como é o caso das proteínas. Em conseqüência o mecanismo
de ação da maioria das proteínas inseticidas envolve interferências com o
processo digestivo, agindo nas enzimas digestivas, por exemplo, as
glicohidrolases e proteinases (Carline, 2004).
A piretrina uma proteína derivada de flores de plantas do gênero
Clysanthemum é um dos inseticidas mais antigos, sendo usada na Pércia para
matar piolho desde 400 aC. A ginesina é uma proteína isolada a partir da
pimenta preta (Piper nigrum) que também possui atividade inseticida (Pilli, &
IOSHINAGA, 2003c).
O alcaloide encontrado no látex da H. crepitans pode estar agindo de
forma semelhante à nicotina.
A atividade inseticida da nicotina está
relacionada com sua semelhança na configuração e distribuição de cargas
como a acetilcolina, onde o ían nicotinium interage com a acetilcolina, atuando
como inseticida, interferindo no sistema nervoso (Pilli & Yoshinaga, 2003).
Para determinar qual das substâncias presentes no látex da H. crepitans
que possui atividade carrapaticida sugere-se um estudo posterior onde através
de coluna cromatográfica possa separar os componentes, bem como novos
47
ensaios
biológicos
carrapaticida
carrapaticida.
poderão
ser
e identificação da
feitos
para
substância
verificação
presente
da
que
atividade
age
como
48
6 CONCLUSÃO
Analisando todos os aspectos apresentados nesta pesquisa, conclui-se
que o extrato etanólico da planta R. pubiflora apresenta esteróides, em sua
composição química e que o látex da planta H. crepitans possui alcalóides
como um dos seus componentes químicos presentes na planta.
Os resultados dos ensaios biológicos com carrapatos R. sanguineus e B.
microplus demonstrou que o extrato etanólico da planta R. pubiflora não possui
atividade carrapaticida e que o látex da planta H. crepitans. obteve atividade
carrapaticida significativa.
Conforme o resultado obtido nesta pesquisa sugere-se estudos
posteriores com isolamento e identificação das substâncias presentes no látex
da H. crepitans, para que seja possível identificar o principio ativo que age
como carrapaticida, viabilizando o uso do mesmo.
Sendo a planta H. crepitans comum nas áreas alagadas das margens
dos rios da região amazônica, viabilizar o uso do seu látex como agente
carrapaticida é valorizar a biodiversidade local sem correr o risco de sacrificar
as árvores, bem como incentivar o uso racional do meio ambiente colaborando
para o desenvolvimento sustentável da região.
49
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