Dissertação Isabelle V. Carvalho - Genética

Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
Programa de Pós-Graduação em Genética
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VETORES VACINAIS PARA
A CINOMOSE CANINA, BASEADOS EM ADENOVIRUS E Lactococcus
lactis EXPRESSANDO AS PROTEÍNAS HEMAGLUTININA E DE
FUSÃO, E ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL INDUZIDA
APÓS IMUNIZAÇÃO
ORIENTADO: Isabelle Vilela Carvalho
ORIENTADOR: Oscar Bruna Romero
Belo Horizonte
2011
ISABELLE VILELA CARVALHO
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VETORES VACINAIS PARA
A CINOMOSE CANINA, BASEADOS EM ADENOVIRUS E Lactococcus
lactis EXPRESSANDO AS PROTEÍNAS HEMAGLUTININA E DE
FUSÃO, E ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL INDUZIDA
APÓS IMUNIZAÇÃO
Dissertação apresentada como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre pelo programa de PósGraduação em Genética, Departamento de Biologia
Geral,
Instituto
de
Ciências
Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais.
ORIENTADO: Isabelle Vilela Carvalho
ORIENTADOR: Oscar Bruna Romero
Belo Horizonte
2011
“Os verdadeiros vencedores na vida são pessoas que olham para cada situação com a
esperança de poder resolvê-la ou melhorá-la”.
Barbara Pletche
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Minas Gerais e ao programa de Pós-Graduação em
Genética pela oportunidade para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Oscar Bruna Romero pela orientação, ensinamentos, confiança e apoio.
A todos os colaboradores que contribuíram para a realização deste trabalho: Prof. Dr.
Anderson Miyoshi e suas alunas Camila Próspere e Tessália Saraiva do
Departamento de Biologia Geral - UFMG; Prof. Dr. Rômulo Cerqueira e sua aluna
Gissandra Farias do Departamento de Medicina Preventiva - UFMG.
Ao programa de Pós-Graduação em Microbiologia por permitir a utilização de seus
equipamentos para a realização dos experimentos.
Aos amigos do LAR pela amizade e ajuda em todos os momentos.
Ao Douglas pelo carinho, compreensão, companheirismo.
Aos meus pais Paulo e Cássia, avô Sebastião, irmãos Carol, Marcus e sobrinho Gu
pelo carinho, apoio, confiança e amizade.
SUMÀRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... I
LISTA DE TABELAS................................................................................................................. III
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................... IV
RESUMO.................................................................................................................................... 1
ABSTRACT................................................................................................................................ 2
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 3
1.1 Cinomose canina .............................................................................................................. 3
1.1.2 Vírus da Cinomose canina (VCC)............................................................................... 5
1.1.3 Patogenia................................................................................................................... 9
1.1.4 Resposta Imune contra VCC.................................................................................... 11
1.1.5 Vacinas contra o Vírus da Cinomose canina ............................................................ 13
1.2 VETORES VACINAIS ..................................................................................................... 15
1.2.1 Adenovírus ............................................................................................................... 15
1.2.1.2 Adenovírus como vetor vacinal.......................................................................... 17
1.2.2 Lactococcus lactis .................................................................................................... 19
1.2.2.1 Lactococcus lactis como vetor vacinal ............................................................... 20
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................... 22
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 24
3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 24
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 24
4.
FLUXOGRAMA DE ATIVIDADES .................................................................................... 25
5. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 26
5.1 Meios de cultura utilizados .............................................................................................. 26
5.2 Construção de Adenovírus Recombinantes capazes de expressar as proteínas H e F do
vírus da Cinomose canina..................................................................................................... 26
5.2.1 Construção das ORFs sintéticas das proteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F) do
vírus da cinomose canina.................................................................................................. 26
5.2.2 Transformação bacteriana........................................................................................ 27
5.2.2.1 Confecção de Escherichia coli DH5α quimiocompetente................................... 27
5.2.2.2 Transformação de E. coli DH5α com os plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e
pCR4-TOPO HASSF..................................................................................................... 28
5.2.2.3 Extração do DNA plasmidiano pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO HASSF de E.
coli. ............................................................................................................................... 28
5.2.3 Digestão enzimática, purificação e ligação do DNA.................................................. 28
5.2.3.1 Transformação de E. coli DH5α com os plasmídeos pAdCMVHASSH e
pAdCMVHASSF ............................................................................................................ 29
5.2.3.2 Reação de Sequenciamento ............................................................................. 30
5.2.4 Construção dos Adenovírus Recombinantes............................................................ 30
5.2.4.1 Transfecção dos plasmídeos recombinantes em células HEK 293A ................. 30
5.2.4.2 Confirmação da presença das sequências nucleotídicas da ORF H no AdH e da
ORF F no AdF............................................................................................................... 32
5.2.4.3 Confirmação da expressão das proteínas H e F pelos adenovírus recombinantes,
através da técnica de RT-PCR (Transcrição reversa e Reação em Cadeia da
Polimerase). .................................................................................................................. 32
5.2.4.4 Western Blotting ................................................................................................ 33
5.2.4.5 Purificação e titulação dos adenovírus recombinantes ...................................... 33
5.2.4.6 Imunizações de camundongos com os adenovírus recombinantes ................... 34
5.2.4.7 Análise da Resposta Imune Humoral................................................................. 34
5.2.4.7.1 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ......................................... 34
5.2.4.7.2 Ensaio de Neutralização Viral ..................................................................... 35
5.3 Construção de L. lactis recombinantes capazes de expressar as proteínas H e F do vírus
da cinomose canina. ............................................................................................................. 35
5.3.1 Obtenção das ORFs de interesse. ........................................................................... 35
5.3.2 Transformação bacteriana........................................................................................ 36
5.3.2.1 Confecção de células eletrocompetentes de L. lactis NCDO2118 ..................... 36
5.3.2.2 Transformação de L. lactis NCDO2118 com os plasmídeos pXYSEC:H e
pXYSEC:F..................................................................................................................... 37
5.3.2.3 Confirmação dos clones de L. lactis contendo os plasmídeos pXYSEC:He
pXYSEC:F..................................................................................................................... 37
5.3.2.4 Reação de Sequenciamento ............................................................................. 38
5.3.2.5 Confirmação da expressão das proteínas H e F pelos L. lactis recombinantes . 38
5.3.2.5.1 Indução da expressão gênica das proteínas H e F ..................................... 38
5.3.2.5.2 Extração das frações protéicas, citoplasmática e secretada dos L. lactis
recombinantes........................................................................................................... 38
5.3.2.5.3 Western Blotting ......................................................................................... 39
6. RESULTADOS ..................................................................................................................... 40
6.1 Construção dos Adenovírus Recombinantes capazes de expressar as proteínas H e F do
vírus da Cinomose canina..................................................................................................... 40
6.1.1 Obtenção das ORFs H e F ....................................................................................... 40
6.1.2 Construção dos Adenovírus Recombinantes............................................................ 41
6.1.3 Análise funcional dos adenovírus recombinantes construídos.................................. 43
6.1.4 Análise da Resposta Imune Humoral ....................................................................... 45
6.1.4.1 ELISA ................................................................................................................ 45
6.1.4.2 Ensaio de Neutralização Viral............................................................................ 46
6.2 Construção de Lactococcus lactis capazes de expressar as proteínas H e F do vírus da
Cinomose canina .................................................................................................................. 48
6.2.1 Obtenção das ORFs de interesse ............................................................................ 48
6.2.2 Construção dos L. lactis recombinantes ................................................................... 49
6.2.3 Análise funcional das linhagens recombinantes de L. lactis ..................................... 50
7. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 51
8. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ....................................................................................... 54
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................... 55
LISTA DE FIGURAS
Figure 1. Árvore Filogenética baseada na diferença de porcentagem nucleotídica do gene da
fosfoproteína............................................................................................................................... 3
Figure 2. Árvore Filogenética “Neighbor-joining” baseada na sequência parcial do gene da
nucleoproteína do VCC............................................................................................................... 5
Figure 3. Representação esquemática do genoma do vírus da Cinomose canina ..................... 6
Figure 4. Representação esquemática do vírus VCC................................................................. 7
Figure 5. Representação esquemática da replicação do VCC ................................................... 8
Figure 6. Corpúsculos de Lentz (setas) em hemácia e neutrófilo ............................................. 11
Figure 7. Representação esquemática da estrutura do Adenovírus ......................................... 16
Figure 8. Representação esquemática da construção dos plasmídeos contendo as ORFs
sintéticas H e F ......................................................................................................................... 27
Figure 9. Representação esquemática da construção dos vetores de transferência. ............... 29
Figure 10. Representação esquemática da recombinação homóloga resultante da cotransfecção do vetor de transferência pAdCMVlink e do pJM17 ............................................... 31
Figure 11. Representação esquemática da clonagem das ORFs F e H no plasmídeo de
expressão pXYSEC:Nuc........................................................................................................... 36
Figure 12. Sequências das proteínas F e H adicionadas dos sítios de restrição e o Peptídeo
sinal HASS ............................................................................................................................... 40
Figure 13. Resolução eletroforética da clivagem dos plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e pCR4TOPO HASSF........................................................................................................................... 41
Figure 14. Resolução eletroforética da clivagem dos plasmídeos pAdCMVlinkHASSH e
pAdCMVlinkHASSF .................................................................................................................. 42
Figure 15. Resolução eletroforética da reação de PCR do sobrenadante de células HEK293A
infectadas com os adenovírus recombinantes .......................................................................... 43
Figure 16. Resolução eletroforética da RT-PCR do sobrenadante de células HEK293A
infectadas com AdF e AdH. ...................................................................................................... 44
Figure 17. Ensaio de Imunodetecção para confirmar a expressão das proteínas H e F pelos
AdH e AdF em células HEK293A.............................................................................................. 45
Figure 18. Resposta imune humoral de camundongos BALB/c imunizados com adenovírus
recombinantes .......................................................................................................................... 46
I
Figure 19. Ensaio de Neutralização Viral para confirmação da presença de anticorpos
neutralizantes específicos contra o VCC no soro de camundongos imunizados com adenovírus
recombinantes codificando as proteínas H e F. ........................................................................ 47
Figure 20. Resolução eletroforética da reação de PCR do pCR4-TOPOHASSF e pCR4TOPOHASSFH com iniciadores específicos............................................................................. 48
Figure 21. Resolução eletroforética da reação de ligação entre o plasmídeo pXYSEC e ORF H
e plasmídeo pXYSEC e ORF F................................................................................................. 49
Figure 22. Resolução eletroforética da reação de PCR do DNA plasmidiano extraído dos clones
de L. lactis recombinantes. ....................................................................................................... 49
Figure 23. Ensaio de Imunodetecção a partir das proteínas extraídas do sobrenadante e da
fração celular dos L. lactis recombinantes, induzidos e não induzidos.. .................................... 50
II
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sinais clínicos mais frequentes em cães infectados pelo vírus da cinomose canina. 10
Tabela 2. Microrganismos utilizados como vetores vacinais..................................................... 15
Tabela 3. Síntese das funções das proteínas adenovirais ........................................................ 17
Tabela 4. Antígenos e proteínas terapêuticas expressadas em L. lactis................................... 21
Tabela 5. Iniciadores específicos utilizados para o sequenciamento dos insertos HASSH e
HASSF ..................................................................................................................................... 30
Tabela 6. Iniciadores específicos utilizados para confirmação da presença das ORFs de
interesse no AdH e AdF............................................................................................................ 32
Tabela 7. Iniciadores específicos utilizados para amplificar as ORFs H e F para construção de
L. lactis ..................................................................................................................................... 35
III
LISTA DE ABREVIATURAS
BL - Bactérias Lácticas
º C - Graus Celsius
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxinucleotídeo trifosfato
DO600nm - Densidade ótica em comprimento de onda de 600 nm
DTT - Ditioeritritol
EDTA - Etileno diamino tetra-acetato dissódio
ELISA - Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISPOT - Enzyme-linked immunosorbent spot
F - Proteína de fusão do vírus da cinomose canina
GRAS - Generally Regarded As Safe
H - Proteína hemaglutinina do vírus da cinomose canina
HAd5 - Adenovírus humano do tipo 5.(Human adenovirus 5)
IFNγ - Interferon-gama
IgG - Imunoglobulina G
IgA - Imunoglobulina A
IL - Interleucina
Kb - Quilobases (103 pb)
kDa - Kilodalton
LB - Meio Luria-Bertani
mg - mililitro
mM - Milimolar
ng - Nanograma
nm – Nanômetro
OGM – Organismo geneticamente modificado
ORF - Fase Aberta de Leitura (Open Reading Frame)
pb - Pares de bases
PBS - Salina tamponada com fosfato (Phosphate-buffered saline)
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase Polymerase Chain Reaction)
PEG - Polietileno glycol
PMSF - Fenil-metil sulfonil fluoreto
pH - Potencial Hidrogeniônico
IV
q.s.p - Quantidade suficiente para
RNA - Ácido ribonucléico
mRNA - Ácido ribonucléico mensageiro
r.p.m - Rotações por minuto
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
TCA - Ácido Tricloroacético
TH1 - Células T auxiliares do tipo 1
TH2 - Células T auxiliares do tipo 2
UFP - Unidade Formadora de Placa
U.V. - Ultravioleta
VCC - Vírus da Cinomose Canina
µFD - Microfaraday
µg - Micrograma
µL - Microlitro
µM - Micromolar
ρmoles - Picomoles
Ω - OHM
V
RESUMO
A cinomose canina causa uma doença grave em cães podendo levar ao óbito de animais
jovens e debilitados. As vacinas contra o vírus da cinomose atualmente disponíveis no
mercado não são totalmente eficazes e ainda apresentam problemas de segurança, sobre
tudo pela significativa frequência de reversão ao fenótipo patogênico dos vírus atenuados
que entram na sua composição. As vacinas recombinantes baseadas em vetor carregando
antígenos virais (proteínas H e F) vêm sendo consideradas ferramentas promissoras contra
a cinomose canina, já que são caracterizadas como seguras e eficazes. O adenovírus
humano tipo 5 recombinante deficiente em replicação foi pesquisado neste trabalho como
vetor vacinal contra cinomose canina por ser muito seguro e por ter a capacidade de induzir
respostas imunes semelhantes aquelas descritas como protetoras contra a doença
(anticorpos neutralizantes e IFNγ). Bactérias da espécie L. lactis também foram utilizadas
como vetores de imunização em nossos experimentos, devido ao fato de serem igualmente
seguras e porque estudos mostraram que estas bactérias são eficientes na indução de
respostas imunes de mucosa com secreção de IgAs específicos contra os antígenos
recombinantes que expressam. Nossos resultados mostram que a construção de dois
candidatos vacinais contra cinomose canina baseados no adenovírus humanos tipo 5
recombinante e mais dois baseados em L. lactis recombinantes, onde cada vetor foi capaz
de expressar a proteína hemaglutinina (H) ou a proteína de fusão (F), separadamente, foi
bem sucedida. Ensaios de imunodetecção (imunoeletroblotting) mostraram a capacidade
tanto do vetor adenoviral quanto do L. lactis em expressar corretamente as proteínas H e F.
Quando os adenovírus recombinantes foram administrados em camundongos BALB/c foi
detectada a produção de anticorpos IgG anti-VCC por meio de ELISA e confirmada a
presença de anticorpos neutralizantes pelo ensaio de neutralização viral. Podemos assim
concluir que os vetores adenovirais, assim como aqueles baseados na bactéria L. lactis
podem ser utilizados no futuro como candidatos vacinais contra a cinomose canina,
podendo ser também testados como componentes de protocolos heterólogos de imunização
sequencial do tipo dose-reforço “prime-boost” para determinar a possibilidade de indução de
respostas imunes protetoras complementares que permitam diminuir a dose vacinal de cada
um destes vetores.
1
ABSTRACT
Canine distemper is a severe disease in dogs that leads young and impaired animals to
death. Currently available vaccines against canine distemper virus (CDV) are not completely
effective and represent safety concerns, mainly because of the significant frequency of
reversion of attenuated viruses, present in the vaccine, into the pathogenic phenotype.
Recombinant vector-based vaccines carrying viral antigens (H and F proteins) have been
considered promising tools against canine distemper, as they are characterized as safe and
effective. In this study, the recombinant replication-deficient human adenovirus type 5 was
tested as a vaccination vector against canine distemper due to its safety and ability to induce
immune responses similar to those described as effective against the disease (neutralizing
antibodies and IFNγ). Lactococcus lactis bacteria were also used as a vaccination vectors in
our trials, for being equally safe and because previous studies showed that these bacteria
are efficient in inducing mucosa immune responses with specific IgA secretion against the
recombinant antigen they express. Our results show the construction of two vaccine
candidates against canine distemper based on recombinant human adenovírus type 5 and
two more based on recombinant L. lactis, both vectors expressing the hemagglutinin (H) or
the fusion protein (F), separately. Immunodetection assays (imunoeletroblotting) showed the
competence of both adenoviral and L. lactis vectors to properly express the H and F
proteins. When the recombinant adenoviruses were administered to BALB/c mice was
observed the production of anti-CDV IgG by ELISA. Neutralinzing antibodies were also
detected by a Virus Neutralization Assay. Our results support the idea that adenoviral, as
well as L. lactis vectors must be considered as promising vaccine candidates against canine
distemper. Further tests wtih both vectors in sequential prime-boost immunization
heterologous protocols are guaranteed to determine the possibility of synergistic induction of
protective immunity against CDV.
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 Cinomose canina
O vírus da cinomose canina (VCC) pertence ao gênero Morbillivirus, família
Paramyxoviridae, ordem Mononegavirales. Além do VCC, são também representantes do
gênero o vírus do sarampo, Vírus da peste bovino, Vírus da peste de pequenos ruminantes
e vírus emergentes de mamíferos aquáticos (vírus da cinomose de focas, golfinhos e botos)
(Figura 1) (Murphy et al., 1999; Visser et al., 1993). Os Morbillivirus são patógenos
altamente contagiosos que causam doença severa em humanos e animais, causando febre,
coriza, conjuntivite, gastroenterite e pneumonia em seus hospedeiros naturais. Os principais
locais de propagação viral são tecidos linfóides, e doenças agudas são acompanhadas por
linfopenia profunda e imunossupressão, levando a infecções secundárias (Griffin, 2001;
Murphy et al., 1999).
Figure 1. Árvore Filogenética baseada na diferença de porcentagem nucleotídica do gene da
fosfoproteína. Modificado de Barret et al., 1993.
A cinomose canina é uma doença multissistêmica com distribuição mundial que
acomete principalmente cães, mas, atualmente devido à intensa urbanização que aumenta
o contato entre os animais domésticos e silvestres, o vírus está se disseminando entre os
carnívoros selvagens como, os da Família Canidae (raposas, dingos, coiotes, lobos e
chacais), Família Mustelidae (furões, doninhas, martas, cangambás, texugos e lontras),
Família Procyonidae (guaxinins, juparás e quatis), Família Felidae (guepardos, leões,
3
onças-pintadas, maracajás e jaguatiricas), e ainda Família Ursidae (ursos e pandas)
(Sherding, 2003).
A doença foi primeiramente documentada na América do Sul em 1746, e
posteriormente houve a disseminação do vírus para os países europeus como Espanha,
Inglaterra, Itália e Rússia. A chegada do VCC a Europa foi atribuída aos colonizadores
espanhóis no século XVII (Blancou, 2004).
A cinomose apresenta relevante importância já que resulta em alta mortalidade (30%
a 70%) só perdendo em gravidade para raiva, é caracterizada como enzoótica no mundo,
sendo endêmica no Brasil. Os filhotes de cães (2 a 6 semanas) são as principais vítimas da
moléstia, como consequência da perda da imunidade materna (Swango, 1997), mas
acomete cães de todas as idades como foi demonstrado no estudo realizado por Silva e
colaboradores (2007) na região de Santa Maria (RS) onde constataram que dos animais
diagnosticados com cinomose, 45,9 % eram filhotes, 51,4% adultos e 2,7% idosos.
Várias linhagens do vírus da cinomose canina são encontradas atualmente, sendo
todas antigenicamente semelhantes, mas variáveis quanto à virulência e o tropismo da
infecção, e sorologicamente indiferenciáveis (Kornegay,1992). Uma pesquisa conduzida por
Castilho e colaboradores (2007) no estado de São Paulo, avaliou a diversidade genética
molecular das linhagens de VCC pela análise da sequência nucleotídica parcial da região
mais conservada do gene da nucleoproteína utilizando reação da polimerase em cadeia
(PCR) e transcrição reversa. A análise filogenética apresentou 4 grupos maiores, no grupo I
foram alocadas as linhagens brasileiras com identidade nucleotídica de 95.6% e 95,8% com
as linhagens vacinais Onderstepoort e Lederle, respectivamente. O grupo II é composto por
linhagens relacionadas aos guaxinins, grupo III com linhagens orientais e o grupo IV com as
linhagens vacinais Onderstepoort e Lederle com identidade de 99,7% entre elas (Figura 2).
4
Figure 2. Árvore Filogenética “Neighbor-joining” baseada na sequência parcial do gene da
nucleoproteína do VCC. Modificado de Castilho et al., 2005.
1.1.2 Vírus da Cinomose canina (VCC)
Dentre os membros do gênero Morbillivirus, o vírus da cinomose canina e o vírus do
sarampo encontram-se juntamente relacionados, apresentando organização genômica
muito similar (Chan et al., 2009)
O vírus VCC é envelopado com morfologia esférica e diâmetro variando de 100 a
700 nm (Appel, 1987). O genoma é composto de RNA de fita simples de polaridade
negativa não segmentado com aproximadamente 16Kpb, há 6 unidades transcricionais
codificando 8 proteínas, sendo 6 estruturais e 2 não estruturais (Harder e Osterhaus, 1997;
Pozza, 2005). Dentre as proteínas estruturais estão a proteína do nucleocapsídeo (N),
fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), proteína de fusão (F), hemaglutinina (H) e a
grande proteína (L). As proteínas não estruturais são C e V (Harder & Osterhaus, 1997)
(Figura 3).
5
Figure 3. Representação esquemática do genoma do vírus da Cinomose canina
O genoma apresenta uma região 3` denominada líder, contendo sinais de
terminação transcricional e traducional para o gene da nucleoproteína, seguida pelas
unidades transcricionais separadas por regiões intergênicas curtas com exceção de uma
longa região intergênica entre os gene das proteínas matriz (M) e de fusão (F), a qual
apresenta alta grau de plasticidade entre as linhagens (Rima et al., 1995) e por último uma
curta região 5` chamada trailer com sinais de iniciação de transcrição e tradução para o
gene da proteína L (Belline et al., 1985; Cattaneo et al., 1993; Lamb e Parks, 2007). As
UTRs (Unstranlated Region) dos Morbillivirus apresentam comumente comprimento de 100
a 200 nucleotídeos, com exceção da UTR entre os genes M e F que são maiores, por
exemplo, no vírus do sarampo pode ultrapassar os 1000 nucleotídeos (Heider et al., 1997).
Esta longa UTR provavelmente tem importância funcional. No vírus do sarampo tem sido
proposto que esta região controla a citopatogenicidade durante a replicação (Takeda et al.,
2005), otimiza a disponibilidade da polimerase para replicação viral (Parks et al., 2001) e
regula a atividade de fusão célula - célula (Cathomen et al., 1995).
No VCC a região entre os genes M e F contêm muitos códons de iniciação em fase
de leitura, seguido por um peptídeo sinal longo da proteína F. A diminuição do peptídeo
sinal resulta em aumento da formação de sincício, indicando que esta região regula a
função da proteína F (Von Messling e Cattaneo, 2002), portanto, há indícios de que esta
região modula a virulência através do controle transcricional da expressão do gene F
(Anderson e Messling, 2008).
Os genes são transcritos pela RNA polimerase dependente de RNA viral, a qual
inicia pela extremidade 3` do genoma. A maioria dos genes é monocistrônico com exceção
do gene P que codifica também as proteínas C e V, sendo V expressa pela edição do RNA
co-transcricional e C é expressa por sobreposição do quadro de leitura (Bellini et al., 1985;
Cattaneo et al., 1989).
6
Figure
4.
Representação
esquemática
www.virology.net/bigvirology/EM/3dvírus).
do
vírus
VCC.
(Modificado
de
O nucleocapsídeo é formado pela proteína N juntamente com cópias da proteína P
associada à polimerase dependente de RNA (L). Logo, o RNA viral associado ao
nucleocapsídeo (N, P e L) formam o complexo ribonucléico (RNP) que direciona a síntese
do RNA mensageiro e a replicação (Lamb e Parks, 2007) (Figura 4).
A proteína P é altamente fosforilada e possui aproximadamente 73 a 80 KDa, atua
na formação do complexo para a síntese de RNA. A proteína C e V ainda não tiveram suas
funções totalmente elucidadas, mas a primeira parece atuar na inibição seletiva de síntese
de RNA permitindo a transição da transcrição primária para a replicação do genoma viral
(Curran et al., 1992) e a segunda participa da síntese de mRNA (Tober et al., 1998).
A proteína M desempenha funções na maturação e no agrupamento das partículas
virais e compõe a camada interna estabilizando a membrana e mediando o contato com o
complexo ribonucléico (Harder & Osterhaus, 1997), além de servir como ponto de
ancoragem para as duas glicoproteínas de superfície (Lamb & Kolakofsky, 1996).
As proteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F) são glicoproteínas de superfície que
estão ancoradas no envelope viral, são responsáveis pela adsorção e fusão viral, ou seja,
são proteínas chaves para a infecção e antigenicamente determinantes (Lamb e Parks,
2007).
A proteína H tem morfologia globular e medeia à ligação do vírus ao receptor celular
da membrana e a interação proteína F-H atua na fusão das duas membranas, celular e viral
permitindo a entrada do complexo RNP (Messling et al., 2001; Lamb e Parks, 2007;
Cattaneo e Rose, 1993). Na maioria dos representantes dos membros da família
Paramyxoviridae a proteína H apresenta atividade de hemaglutinação e neuraminidase,
7
porém esta última atividade nunca foi descrita nos representantes do gênero Morbilivirus, no
qual está alocado o VCC (Langedijk et al ., 1997).
O gene F codifica uma proteína de 662 aminoácidos, o qual compreende um
peptídeo pré-sinal, a subunidade F1 e a subunidade F2, as duas subunidades são
produzidas via proteólise pós-traducional do precursor F0 (Merz et al., 1980; Cherpillod et
al., 2004). A proteína F medeia à penetração na célula hospedeira permitindo a dispersão
do vírus.
A replicação do VCC ocorre no citoplasma da célula hospedeira. A entrada do vírus
na célula é mediada pela ligação da proteína de superfície hemaglutina a receptores
celulares (CD150), seguido pela fusão a membrana plasmática, promovida pela proteína de
fusão. Após a fusão, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma, onde tem início a
replicação do genoma viral, para tal ocorre à formação de um RNA (+) intermediário
seguido da cópia do genoma viral RNA (-), já que o VCC apresenta genoma com polaridade
negativa (Diallo, 1990). A transcrição é realizada pela RNA polimerase viral, a tradução das
proteínas virais ocorre nos ribossomos, exceto das proteínas de superfície H e F, as quais
são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso e posteriormente, processadas no
complexo de Golgi. Os nucleocapsídeos montados no citoplasma migram para a superfície
celular onde se associam à membrana onde estão inseridas as proteínas de superfície H e
F (Lamb e Kolakofsky, 1996). A liberação das partículas virais maduras é realizada por
brotamento na membrana plasmática onde é adquirido o envelope. (Krakowka et al., 1980,
1985) (Figura 5).
Figure 5. Representação esquemática da replicação do VCC. Modificado de Moss and Griffin, 2006.
8
1.1.3 Patogenia
O vírus da cinomose canina causa uma doença muito semelhante ao sarampo
humano, mas, com diferenças significativas mostrando-se mais neurotrópica e causando
encefalite aguda em cerca de metade dos animais infectados (Appel e Gillespie, 1972;
Mamaev et al., 1996). O índice de mortalidade pela infecção do VCC varia com a espécie
hospedeira, variando de 0% em gatos domésticos, a 50% em cães domésticos e chegando
a 100% nos furões. A encefalite é a causa de morte mais comum em animais infectados
(Appel e Gillespie, 1972; Summers e Appel, 1994).
Assim como outros morbilívirus, o VCC é um agente infeccioso linfotrópico e
altamente imunossupressivo. A infecção causa a inibição e comprometimento das funções
imune humoral e celular, caracterizada por imunossupressão, perda de linfócitos, e
leucopenia, tornando os animais altamente susceptíveis às infecções oportunistas. O
linfotropismo do VCC é baseado na ligação da proteína H viral ao receptor CD150, este
receptor é expresso em uma variedade de células, mas após a infecção pelo VCC a
expressão deste receptor aumenta nas células linfóides, o que parece ser uma estratégia
para aumentar a amplificação do vírus no hospedeiro (Beineke et al., 2009).
O mecanismo de imunossupressão induzida pelo VCC ainda não é bem
compreendido, mas, a destruição seletiva das células infectadas expressando o CD150
parece contribuir para o processo. Já foi demonstrado que o VCC é capaz de induzir
apoptose, resultando na depleção de linfócitos, assim como, modular a função de
macrófagos pela inibição da interleucina 1 (IL-1), prejudicando à apresentação de antígenos
pelos mesmos, e como consequência ocorre a redução da diferenciação de células B em
imunoglobulinas
(Krakowka
et
al.,1987).
As
proteínas
virais
com
propriedades
imunomodulatórias descritas são, a nucleoproteína e a proteína V, a primeira atua na
supressão de células não infectadas e modula a apresentação de antígenos pelas células
dendríticas (Schneider-Schaulies e Dittmer, 2006), e a segunda inibi a resposta de citocina
(von Messling et al., 2006).
Grandes variações na duração, gravidade e apresentação clínica da cinomose
canina têm sido observadas em animais infectados. O período de incubação pode variar de
1 a 4 semanas dependendo da linhagem viral, idade do animal e estado imune do
hospedeiro. A manifestação da doença varia da ausência de sinais clínicos a doença severa
com alta mortalidade (Appel, 1970; Krakowka et al., 1980; Moritz et al., 2000).
É uma enfermidade de evolução aguda, subaguda ou crônica que, além dos sinais
clínicos sistêmicos, pode também evoluir para graves sinais neurológicos. Os principais
sintomas da doença são alterações oculares, gastrointestinais, respiratórios e neurológicos
(Tabela 1) (Rude, 1987; Shell, 1990; Tipold, 1995).
9
A transmissão do vírus ocorre por meio de aerossóis e gotículas (Ettinger, 1992). A
infecção viral inicia-se com a replicação viral em tecidos linfóides do trato respiratório
superior; macrófagos e monócitos representam os primeiros tipos celulares onde ocorre a
propagação viral (Appel, 1970). Após esta replicação viral local, o patógeno é então
disseminado pelo sistema linfático e circulatório para tecidos hematopoiéticos distantes
durante a fase de viremia primária, a qual resulta em infecção generalizada de todos os
tecidos linfóides (Beineke et al., 2009). A multiplicação do vírus nos linfócitos produz
linfopenia levando a um quadro de imunossupressão. Os sinais clínicos iniciais são
caracterizados por letargia, desidratação, anorexia, perda peso e febre. A segunda viremia
acontece alguns dias depois, frequentemente associada à febre alta, e resulta na infecção
de vários tecidos em todo o organismo (Appel, 1969; Appel e Gillespie, 1972; Okita et al.,
1997), podendo atingir o sistema nervoso central, neste estágio ocorre hiperplasia e
desenvolvimento de células gigantes multinucleadas (Arns et al., 2007).
Tabela 1. Sinais clínicos mais frequentes em cães infectados pelo vírus da cinomose canina.
FORMA CLÍNICA
Inespecífica
SINAIS CLÍNICOS
Anorexia, apatia e febre
Cutânea
Máculas, pápulas, pústulas, hiperqueratose do
focinho e das almofadas plantares
Sistêmica
Gastrenterite, conjuntivite, descarga nasal,
tosse, hipoplasia de esmalte
Neurológica
Incoordenação, ataxia, delírios com vocalização,
paresia do membro posterior, tetraplegia,
diminuição dos reflexos pupilares, coma e morte
No estágio agudo, o vírus é encontrado nas secreções e excreções do corpo, esta
fase é acompanhada por vários sinais clínicos com erupções cutâneas, secreção nasal e
ocular, conjuntivite e anorexia seguida de sinais respiratórios e gastrointestinais, os quais
são complicados por infecções bacterianas secundárias (Krakowka et al., 1985). O período
de incubação da doença aguda geralmente é de três a seis dias, podendo se estender por
21 dias (Arns et al., 2007).
Se ocorrer uma resposta imune eficiente, principalmente com o aumento da
produção de anticorpos neutralizantes específicos o animal pode se recuperar levando a
eliminação dos vírus de alguns órgãos, mas ele pode persistir em certos tecidos como nos
órgãos linfóides e sistema nervoso central (SNC) (Appel, 1970, 1987; Greene e Appel,
1998; Grone et al., 2003; Schobesberger et al., 2005).
10
A permanência do VCC no SNC resulta na forma nervosa da cinomose canina, cães
com sinais nervosos geralmente morrem. Alguns animais se recuperam, mas ficam com
sequelas como mioclonia persistente (Beineke et al., 2009). A invasão do sistema nervoso
central pelo vírus ocorre principalmente pela via hematogênica, células como os astrócitos,
oligodendrócitos, microglia, neurônios e células do plexo coróide podem ser infectadas
(Orlando et al., 2008).
A infecção por ser de amplo espectro, na maioria dos casos há dificuldade no seu
diagnóstico clínico sendo confundida com outras moléstias. Entretanto, diversos testes mais
específicos podem ser usados para o diagnóstico da doença como o de detecção de
corpúsculos de Lentz (Figura 6) em células como hemácias e leucócitos através de
esfregaço sangüíneo, Histopatológico, a Soroneutralização, a Imunohistoquímica, a Reação
em
Cadeia
de
Polimerase
da
Transcriptase
Reversa
(RT-PCR),
ELISA,
a
Imunofluorescência, entre outros (Martins et al., 2009).
Figure 6. Corpúsculos de Lentz (setas) em hemácia e neutrófilo. Martins et al., 2009
1.1.4 Resposta Imune contra VCC
Estudos sobre a infecção pelo VCC em cães têm demonstrado que a produção de
anticorpos específicos e a resposta imune mediada por células, contra o vírus são ambas,
críticas para defesa contra a infecção (Beineke et al., 2009).
A resposta imune humoral contra o vírus foi investigada em animais infectados
naturalmente e experimentalmente (Krakowka et al, 1980; Rima et al, 1991). A presença e a
quantidade de anticorpos específicos contra o VCC têm sido correlacionadas ao nível de
gravidade da doença. A ausência destes, leva a um quadro clínico agudo, muitas vezes
fatal, e ao contrário, quando títulos de anti-VCC são detectados com cerca de 10 -14 dias
11
pós-infecção, é observada a eliminição viral do hospedeiro (Beineke et al., 2009).
Geralmente, a imunidade protetora humoral está relacionada a produção de anticorpos
contra as seguintes proteínas virais, a nucleoproteína, a hemaglutinina e a proteína de fusão
(Miele e Krakowka, 1983; Rima et al., 1991). Foi demonstrado por Rima et al., 1991, que a
produção de anticorpos contra a proteína hemaglutinina previne o desenvolvimento de
lesões no SNC em cães infectados. Adicionalmente, os anticorpos neutralizantes e a
citotoxicidade humoral mediada pelo complemento, são críticos para a eliminação de
particulas virais livres (durante a infecção e as viremias), evitando assim, a disseminação
viral no hospedeiro (Appel et al.,1982,1984).
Apesar dos anticorpos anti-VCC reduzirem a disseminação viral, eles podem atuar
na modulação da expressão dos antígenos virais, o que pode contribuir para persistência da
infecção nos animais, possivelmente devido à diminuição do reconhecimento dos antígenos
e inadequada citotoxicidade humoral mediada pelo complemento (Ho e Babiuk, 1979;
Alldinger et al., 1993).
A resposta imune celular contra o VCC também exerce um papel fundamental na
proteção contra o vírus. Gerber e Marron, em 1976, demonstraram a presença de imunidade
protetora celular contra a cinomose canina, mesmo na ausência de resposta imune mediada
por anticorpos. Resposta imune mediada por células T específicas para o VCC foi
evidenciada em alguns trabalhos, como a presença de células T citotóxicas (CD8+) (Shek et
al., 1980; Appel et al., 1982) e células “Natural Killer” (NK), estas últimas, segundo Ringler e
Krakowka (1985), parece atuarem de forma basal na defesa imune contra o VCC. Através
da análise da função dos macrófagos durante a infecção, Appel e colaboradores (1984),
revelaram que a citotoxicidade mediada por linfócitos antivirais determina o quadro clínico
em animais infectados. Logo, uma resposta imune celular sólida pode resultar na eliminação
viral, enquanto a falta ou uma inadequada citotoxicidade mediada por linfócitos está
correlacionada à persistência do VCC no SNC (Appel et al., 1982).
Com relação ao perfil de citocinas produzidas durante a infecção pelo VCC, Valli et
al (2009), demonstrou que o padrão de produção de citocina em resposta a infecção não
reflete o perfil Th1 ou Th2 clássica, o que se observa é um equilíbrio da produção de
citocinas pró e anti-inflamátorias, onde os níveis das mesmas tendem a mudar ao longo do
tempo. Svitek e von Messling (2007), analisaram a resposta de citocinas em furões
infectados com VCC, eles observaram nos animais sobreviventes, uma robusta e duradoura
produção de citocinas com resposta imune inicial do tipo Th1 e posteriormente uma
resposta tendendo a Th2.
12
1.1.5 Vacinas contra o Vírus da Cinomose canina
Não existem medicamentos antivirais efetivos para a infecção por VCC, assim faz-se
necessário a utilização de medidas preventivas como as vacinas para evitar a disseminação
do vírus.
Em 1950, foi desenvolvida uma vacina contra o VCC, que era composta pelo vírus
atenuado e sua ampla utilização ajudou a manter a doença sob controle (Appel, 1987; Appel
e Summers, 1999; Greene et al., 1998). Atualmente, a maioria das vacinas comerciais
disponíveis também é composta por linhagens de VCC atenuadas por meio de passagens
seriadas em cultivos celulares, como em células de rim canino (linhagem Rockborn), em
ovos de galinha (linhagem Onderstepoort) ou em cultura de fibroblasto de galinha (linhagem
Lederle) (Haig, 1956).
As vacinas vivas atenuadas estimulam tanto resposta imune celular quanto humoral
(Valli et al., 2009), porém como o processo de atenuação está baseado em passagens
sucessivas, torna-se um processo de tentativas e erros, e a estabilidade e homogeneidade
das modificações são críticas para a segurança da vacina. Casos de reversão à virulência
foram amplamente documentados em vacinas para cinomose canina (Gemma et al., 1996),
além de baixa eficiência das mesmas quando na presença de proteção passiva em animais
jovens (até 9 meses de idade) devido aos anticorpos transferidos ao cão via colostro, que
neutralizam o vírus vacinal e impedem sua multiplicação o que gera desenvolvimento de
resposta imune deficiente (Welter et al., 2000). Além de apresentar o risco de induzir
infecção virulenta em espécies silvestres (Barrett et al., 1993). Apesar das vacinas
compostas pelo vírus da cinomose atenuado terem sido eficientes no passado, resultando
em diminuição dos casos, atualmente, a incidência de doença relacionada ao VCC na
população canina em todo o mundo parece ter aumentado nas últimas décadas e muitos
episódios de infecção em animais vacinados têm sido relatados (Blixenkrone-Moller et al.,
1993; Kai et al., 1993; Gemma et al., 1996; Decaro et al., 2004).
Neste contexto, novas tecnologias vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de
vacinas com objetivo de gerar o tipo e a duração da resposta imune apropriada a cada
patógeno e para a obtenção de produtos seguros e eficazes. O avanço dos conhecimentos
na área de biologia molecular e da genética dos microrganismos permitiu a geração das
vacinas recombinantes através da manipulação de patógenos como: 1. Deleção de genes
responsáveis pela patogenicidade, tornando a linhagem vacinal adequadamente atenuada;
2. Deleção de genes que codificam proteínas de superfície, para diferenciar animais
vacinados dos naturalmente infectados (vacinas com marcadores antigênicos); 3.
Construção de vetores recombinantes (vírus e/ou bactérias) que codificam genes de
proteínas de outros patógenos; 4. Construção de vacinas recombinantes que codificam
13
moléculas imunomoduladoras, as quais estimulam diferentes mecanismos da resposta
imunológica (Flores, 2010).
Dentre as vacinas recombinantes que vêm sendo desenvolvidas para prevenir a
cinomose canina, estão às vacinas de DNA e as baseadas em vetores virais vivos.
As vacinas de DNA são construídas a partir da inserção de um gene que codifica o
antígeno de interesse dentro de um plasmídeo contendo um forte promotor e uma
sequência sinal para poliadenilação, o qual é injetado diretamente nas células musculares
onde o gene é expresso. Foi observado que a vacina de DNA pode gerar resposta imune
celular, incluindo de células T citotóxicas (Wolff et al., 1990). Pesquisas com vacinas de
DNA para cinomose canina têm sido realizadas, utilizando o gene H (Jensen et al., 2009),
genes N e H (Dahl et al., 2004; Nielsen et al., 2009), os genes H, N e F (Cherpillod et al .,
2000; Griot et al., 2004). Sixt e colaboradores (1998) imunizaram camundongos com
plasmídeos expressando a proteína H e F, e obtiveram respostas do tipo Th1 e Th2.
Conferindo proteção contra infecção letal a todos os animais imunizados tanto com
plasmídeo expressando H quanto F, porém só no primeiro foi observada, in vitro, a
presença de anticorpos neutralizantes de vírus.
As vacinas de DNA demonstram bons resultados, mas um produto comercial ainda
não foi permitido devido às preocupações com segurança, como, o amplo risco de
integração no genoma hospedeiro, ativação de proto-oncogenes e inativação de genes
supressores de tumor e da possibilidade de geração de anticorpos anti-nucleares (Sharma e
Khuller 2001; Dunham, 2002).
Já as vacinas vivas baseadas em vetores recombinantes são compostas por
microrganismos geneticamente modificados. Estes vetores funcionam como sistemas de
entrega derivados, na maioria das vezes, de patógenos e são usados para expressar genes
codificadores de antígenos dos mais variados patógenos, eles podem ser bactéria ou vírus
recombinantes. As vacinas vetorizadas são eficientes na indução de resposta humoral e,
principalmente, de resposta imune celular, pois, são capazes de entregar antígenos
heterólogos até as vias de processamento de antígenos necessárias para estimular
resposta células T citotóxicas (CTL) restrita ao MHC de classe I. No caso de infecção viral,
como, por VCC, são essências as respostas imunes humoral e celular para a eliminação do
vírus, principalmente de CTLs que desempenham importante papel no combate a infecção
(Liu, 2010). Na tabela 2 são mostrados alguns exemplos de microrganismos que vêm sendo
utilizados como vetores.
14
Tabela 2. Microrganismos utilizados como vetores vacinais.
Vetores Recombinantes
Adenovírus, Poxvírus, Vírus associado a Adeno, Herpes Vírus, Vírus do
Vírus
Sarampo, Vírus da Estomatite Vesicular.
Bactérias
Salmonella, Shigella, Listeria, Lactococcus.
Vacinas recombinantes contra VCC, utilizando poxvírus como vetor, os quais
induzem a expressão das proteínas H e F já foram desenvolvidas. Elas são conhecidas
como NYVAC-HF (vírus vaccinia atenuado) e ALVAC-HF (canaripoxivirus recombinante),
tendo esta última, sido liberada para a imunização de cães. Estas vacinas são consideradas
eficientes, mas apresentam algumas limitações na presença de anticorpos pré-existentes
contra o VCC como foi demonstrada por Welter et al., (2000). O adenovírus canino tipo 2
competente em replicação expressando as proteínas H e F separadamente, também já foi
utilizado como vetor vacinal para cinomose canina. Construídos por Fischer et al., (2002),
seus resultados mostraram que eles foram capazes de gerar proteção contra o vírus mesmo
na presença de anticorpos maternos anti-VCC e anti-HAd5.
1.2 VETORES VACINAIS
1.2.1 Adenovírus
Os adenovírus foram primeiramente isolados em 1953 por Wallace Rowe e
colaboradores, onde os mesmos tinham como objetivo o isolamento do “vírus causador do
resfriado comum” através do cultivo de células das adenóides e amígdalas retiradas de
crianças. Eles descreveram um agente que causava degeneração celular (Rowe et al,
1953), o qual foi denominado a princípio de adenoid degeneration (AD) adenoidpharyngealconjuntival (APC) e acute respiratory disease agents (ARD) e, em 1956, teve sua
nomenclatura consolidada.
Os membros da família Adenoviridae infectam várias espécies de vertebrados,
dentre eles suínos, caninos, bovinos, humanos, peixes. Os principais sintomas associados à
infecção
pelo
adenovírus
são
as
doenças
respiratórias,
urinárias,
oculares
e
gastrointestinais. Na maioria dos casos a infecção é branda, no entanto, em indivíduos
imunocomprometidos pode torna-se fatal (Hierholzer,1992).
Segundo o Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV – International
Committee on Taxonomy of Viruses), a família Adenoviridae é composta pelos gêneros
15
Ichtadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus. Os adenovírus
que infectam humanos estão alocados no gênero Mastadenovirus e são diferenciados em
51 sorotipos, eles estão entre os vírus mais bem caracterizados e com capacidade de
infectar diferentes tipos celulares (Kojaoghlanian et al., 2003).
Os adenovírus são vírus não envelopados com capsídeo icosaédrico com uma dupla
fita de DNA genômico com aproximadamente 36 Kbp (Horwitz, 1996). A maioria dos
sorotipos codifica mais que 30 proteínas estruturais e não estruturais, dentre as proteínas
não estruturais, estão aquelas que controlam o ciclo celular humano e várias que interferem
na resposta imune do hospedeiro (Figura 7) (Kojaoghlanian et al., 2003).
Figure 7. Representação esquemática da estrutura do Adenovírus. Modificado de Hall et al., 2010.
O capsídeo é formado pelas proteínas denominadas hexons e pentons com
projeções denominadas fiber nos doze vértices (Stewart et al., 1993). Outras proteínas
chamadas “menores”, IIIa, VI, VIII e IX, também estão associadas ao capsídeo (Vellinga et
al., 2005). No núcleo viral há 6 proteínas estruturais, 5 estão associadas a dupla fita de
DNA, são elas V, VII, Mu, IVa2 e a proteína terminal (TP) que está ligada covalentemente a
região 5´ terminal que apresenta região repetitiva invertida (ITRs) . O último componente é
uma protease, a qual é necessária para o processamento de algumas das proteínas
estruturais para a produção de vírus infecciosos maduros (tabela 3) (Russel, 2000).
A entrada do vírus na célula é mediada por ligação de alta afinidade da proteína fiber
a receptores celulares, como o CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor) identificado
como uma glicoproteína com 46 KDa utilizado pela maioria dos adenovírus, exceto pelos
16
adenovírus B (Roelvink et al.,1998; Muotri et al, 2002). O ciclo de infecção pode ser definido
dentro de três fases de expressão: precoce, intermediária e tardia. A primeira compreende a
entrada do vírus na célula hospedeira e a passagem do genoma viral para o núcleo,
seguido pela transcrição seletiva e tradução dos genes precoces. Estes eventos iniciais
modulam as funções da célula, permitindo a replicação do DNA viral e resultando na
transcrição e tradução dos genes tardios (Russel, 2000).
Tabela 3. Síntese das funções das proteínas adenovirais
Nome
Localização
Função conhecida
II
Hexon (monômero)
Estrutural
III
Base Penton
Penetração
IIIA
Associado a penton
Penetração
IV
Fibre
Ligação ao receptor
V
Core: associado com DNA e Penton
Empacotamento
VI
Polipeptídeo menor Hexon
Estabilização/Montagem da partícula
VII
Core
Como histona
VIII
Polipeptídeo menor Hexon
Estabilização/Montagem da partícula
IX
Polipeptídeo menor Hexon
Estabilização/Montagem da partícula
TP
Genoma - proteína terminal
Replicação do genoma
Mu
Nucleoproteína
Replicação do genoma
IV2a
Nucleoproteína
Empacotamento do genoma
Protease
Associado com pentons
Maturação
Modificado de www.microbiologybytes.com/virology/Adenoviruses.htmL
1.2.1.2 Adenovírus como vetor vacinal
Vários vírus têm sido utilizados como vetores vacinais, as características intrínsecas
de cada vírus determina suas aplicações específicas e seu potencial como vetor vacinal
(Liu, 2010). Muitas vacinas baseadas em vetores adenovirais recombinantes estão sendo
testadas, entre elas estão às vacinas para o HIV, Malária e Tuberculose (Buchbinder et al.,
2008, Sridhar et al., 2008, Magalhães et al., 2008).
Os vetores adenovirais são obtidos através da deleção de genes do genoma viral
para a inserção de antígenos exógenos. Os vetores de primeira geração apresentam
supressão dos genes das regiões E3 e E1, sendo estes últimos essenciais para a
replicação viral, logo estes vetores são de replicação deficiente. A replicação destes
adenovírus recombinantes é realizada em células HEK (Human Embryonic Kidney) 293, as
quais são transformadas, logo possuem a região viral E1 integrada em seu genoma. Novas
construções de vetores vêm sendo desenvolvidas através de deleções gênicas adicionais,
17
como dos genes da região E4 (Ad com deleção E1 e E4) (Raper et al., 1998) e os “helperdependent adenoviruses” que são vetores totalmente desprovidos das regiões codificantes
de proteínas virais, os quais necessitam de adenovírus auxiliares para sua geração (Mitani
et al., 1995). As sucessivas deleções têm como objetivos a diminuição da expressão de
proteínas virais diminuindo a intensidade da resposta imune do hospedeiro contra o vetor,
aumento da capacidade de clonagem e redução dos riscos da geração de adenovírus
competentes para replicação (Krougliak et al., 1995; Dedieu et al., 1997).
Entre as vantagens do uso do adenovírus como vetor, estão: o nível significativo de
expressão do produto transgênico (Dani, 2000); a incapacidade do material genético
adenoviral de se integrar ao genoma do hospedeiro (Hall et al., 2010); a estabilidade; a
obtenção de altos títulos virais; a fácil manipulação e purificação; a capacidade de infectar
vários tipos celulares e principalmente, a capacidade de induzir resposta imune inata e
adaptativa (humoral e celular) (Graham, 2000).
Atualmente o AdCh63 e o AdC9 estão sendo testados como ferramentas para o
desenvolvimento de vacinas (Capone et al., 2010; Reyes-Sandoval et al., 2010). O
adenovírus humano sorotipo 5 (HAd5) apesar de ter sido intensamente utilizado no
passado, ainda é considerado um bom candidato a vetor para a construção de vacinas.
Estudos em humanos e animais têm demonstrado que o HAd5 como vetor é capaz de
induzir resposta imune inata e adaptativa (celular e humoral), principalmente, resposta
imune celular de células T CD8+ específica contra o produto transgênico (Shiver et al.,
2002; Casimiro et al., 2003; Casimiro et al., 2004), além de serem considerados seguros e
bem tolerados (Priddy et al., 2008; Buchbinder et al., 2008; Harro et al., 2009).
Muitas vacinas já foram desenvolvidas utilizando como vetor o adenovírus humano
tipo 5 recombinante apresentando resultados significativos, como para Malária (Plasmodium
falciparum) (Shott et al., 2008; Palma et al., 2011), Botulismo (Zeng et al., 2007), vírus da
encefalite do carrapato (Jacob et al., 1994), Pseudomonas aeruginosa (Worgall et al., 2005).
Xiang et al., construíram em 2003, um adenovírus humano tipo 5 recombinante
expressando a glicoproteína do vírus da raiva, e imunizaram, pelas vias oral e intranasal,
camundongos recém nascidos de fêmeas previamente imunizadas com adenovírus
recombinante. Seus resultados mostraram que os camundongos imunizados, tanto por via
oral quanto intranasal, induziram produção de anticorpos e que os mesmos foram capazes
de proteger os animais contra o desafio com o vírus da raiva. A eficácia do vetor adenoviral
não foi prejudicada pela presença dos anticorpos maternos transferidos.
18
1.2.2 Lactococcus lactis
As Bactérias Láticas (BL) são bactérias Gram-positivas, que compõe um grupo
heterogêneo de microrganismos que em sua maioria convertem carboidratos em ácido
lático e estão naturalmente associadas às superfícies das mucosas, principalmente no trato
gastrointestinal animal. Entre as BL há espécies patogênicas, como os Streptococcus
pneumoniae (causador da pneumonia) e espécies não patogênicas utilizadas na
fermentação industrial tanto de produtos lácteos quanto de carnes e vegetais (Dunny &
Cleary, 1991; Wood & Holzapfel; 1995). Apresentam uma variedade de gêneros importantes
como Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc
e Lactobacillus (Makarova et al., 2006).
O gênero Lactococcus inclui cinco espécies, dentre elas o L. lactis, os quais são
diferenciados em subespécies L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. hordniae e L. lactis
subsp. Lactis (Garde et al., 1999). São cocos homofermentativos que produzem
exclusivamente acido lático L (+), os quais são encontrados geralmente associados à
material vegetal (Williams et al., 1990).
As Lactococcus lactis são bactérias não invasivas e apatogênicas, elas já são
utilizadas há milênios na preservação e produção de produtos fermentados (Bolotin et al.,
2001). Há três subespécies de L. lactis como citado acima, cujos fenótipos são
diferenciados com base na utilização da arginina, temperatura de crescimento e tolerância a
salinidade (Kelly et al., 2010). Diante do papel fundamental dos L. lactis na fermentação de
produtos industrializados, tem-se observado um aumentado progressivo das pesquisas
buscando ampliar o conhecimento da biologia molecular desta espécie (Burne et al., 2007).
O sequenciamento completo do genoma de L. lactis ssp. lactis IL1403 foi realizado
por Bolotin et al., (2001), onde foi observado um conteúdo genômico rico em AT com
2,365,589 pb, codificando 2.310 proteínas, incluindo 293 genes codificando proteínas
pertencentes a seis profagos e 43 elementos de sequências de inserção (IS). O conteúdo
de GC é de 35,4%, a região codificante representa 86%, a não codificante 12,6% e RNA
estável 1,4%.
Durante as duas últimas décadas muitos estudos têm sido realizados ampliando o
conhecimento sobre a genética e o sistema de expressão protéica de Lactococcus lactis
(Nouaille et al., 2003; Mills et al., 2006); o que tem permitido um maior controle de
processos industriais que utilizam estes microrganismos, além de estimular o interesse em
novas aplicações como na produção de proteínas heterólogas, na produção de proteínas de
interesse dentro de alimentos e principalmente na construção de vacinas vivas, utilizandoas como vetores para entrega de antígenos ou proteínas terapêuticas ao nível de mucosa
(Burne et al., 2007).
19
1.2.2.1 Lactococcus lactis como vetor vacinal
Muitos atributos dos L. lactis levaram a sua utilização como vetor vacinal, entre
estes, incluem a possibilidade de entrega por via oral, que é a via natural de infecção de
grande número de microrganismos (Liu, 2010), assim como relativo baixo custo de
produção sendo viáveis para produção em larga escala, são sensíveis a antibióticos
facilitando o controle em caso de reações adversas.
A princípio, as variantes atenuadas de bactérias patogênicas despertaram maior
interesse para o desenvolvimento de vacinas, mas as espécies não patogênicas fornecem
um nível maior de segurança e algumas apresentam atividade adjuvante inata (Nouaille et
al., 2003). Muitas espécies de BL têm sido usadas como veículos de entrega de vacinas e
moléculas terapêuticas ao sistema imune de mucosas, como Streptococcus gordonii,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, e Lactococcus lactis
(Wells, 2011).
O L. Lactis tem sido considerado um candidato promissor para a administração
controlada de antígenos vacinais (Bermúdez-Humarán et al., 2004; Wells & Mercenier,
2009), devido principalmente, a sua associação longa e segura com humanos,
representando uma boa alternativa ao uso dos clássicos vetores bacterianos patogênicos
atenuados (Wells & Mercenier, 2009), como a Salmonella sp., Listeria monocytogenes e
Shigella sonnei, evitando assim, o risco de virulência residual ou reversão de virulência .
Esta bactéria, além de ser considerada um microrganismo “GRAS” (Generally
Regarded As Safe), ou seja, seguro para o consumo, apresenta outras características que a
torna um bom candidato tanto para vetor de expressão quanto vacinal, entre elas estão, i)
não produzem endotoxinas, ii) número reduzido de proteínas são secretadas, sendo apenas
uma (Usp45 – 45 KDa) detectada em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes
(van Asseldonk et al., 1990), iii) são bactérias não invasivas, logo não colonizam evitando
tolerância ao veto, iiii) a imunização com L. lactis recombinantes, por via oral, apresenta
vantagens em relação à entrega sistêmica como a redução dos efeitos secundários, fácil
administração, e a segurança (Neutra e Kozlowski, 2006; Levine e Dougan, 2008). Este tipo
de imunização tem como objetivo a entrega de antígenos a superfície de mucosa; as quais
são locais onde naturalmente ocorre a interação entre organismo e ambiente,
representando assim, a principal porta de entrada de patógenos (Bermúdez-Humarán,
2009).
Desta forma, estas bactérias podem gerar resposta imune de mucosas, ou seja, são
capazes de induzir a produção de imunoglobulina A antígeno específica pelo tecido linfóide
associado à mucosa, as quais podem neutralizar vírus ou toxinas. Assim como, no caso de
entrega de moléculas terapêuticas, pode ser eficaz no tratamento de doenças associadas à
20
mucosa, resultando na diminuição do consumo de drogas, e reduzindo ou evitando
possíveis efeitos das mesmas no organismo devido à administração sistêmica (Wells,
2011).
Muitas pesquisas vêm sendo feitas utilizando o L. lactis expressando antígenos,
como mostrado na tabela 4. Marelli (2011) e colaboradores construíram L. lactis
expressando a subunidade VP8+ do capsídeo do rotavírus na forma citoplasmática e
ancorada na parede celular e imunizaram, oralmente, camundongos BALB/c. Foi observado
nível significativo de anticorpos IgA intestinal e sistêmico nos camundongos imunizados e
que estes anticorpos foram capazes de bloquear a infecção pelo rotavírus em ensaio in
vitro. Resultados similares foram obtidos por Gu e colaboradores (2009) que construíram L.
lactis expressando a subunidade UreB de Helicobacter pylori , onde foi constada a presença
de IgG e IgA no soros dos animais imunizados e que estes foram protegidos quando
desafiados com H. pylori SS1.
Tabela 4. Antígenos e proteínas terapêuticas expressadas em L. lactis
Antígenos
Administração(Via)
Patógeno / Doença
Referência
Fragmento C da toxina tétano
Oral, intranasal
Tétano
Robinson et al., 1997
Proteína
Oral
Helicobacter pylori
Kim et al., 2006
Intranasal
Streptococcus
Hanniffy et al., 2007
Antígenos Bacterianos
de
membrana
Cag12
Antígeno PspA
pneumoniae
Antígenos Virais
E7 (HPV -16)
Proteína capsídeo L1
Intranasal
Oral
Vírus do papiloma
Bermudez-Humaran et
humano
al., 2005
Vírus do papiloma
Cortes-Perez et al.,
humano
2009
Antígeno NSP4
Intramuscular
Rotavírus
Enouf et al., 2001
Antígeno VP7
Oral
Rotavírus
Li et al., 2010
MSP-1(19)
Oral
Plasmodium yoelii
Zhang et al., 2005
CWP2
Oral
Giardia lamblia
Lee et al., 2009
Antígenos de Protozoários
Modificado de Bahey-El-Din et al., 2010.
21
2. JUSTIFICATIVA
A cinomose canina é uma doença considerada enzoótica no mundo, embora o uso
da vacina tenha reduzido a ocorrência da doença a partir de 1950. No Brasil é considerada
endêmica com um número significativo de mortes de cães.
O vírus da cinomose canina apresenta um amplo espectro de hospedeiros sendo
capaz de infectar varias espécies da ordem Carnívora. O principal reservatório do vírus são
os cães; animais de todas as idades podem ser acometidos. Os filhotes e os indivíduos
imunocomprometidos são os mais susceptíveis a infecção, e na maioria dos casos, não
resistem à infecção.
É uma doença viral aguda, subaguda ou crônica altamente contagiosa. A infecção
apresenta sinais respiratórios, digestivos, oculares e/ou cutâneos, resultantes da
disseminação sistêmica do vírus, o que causa grande sofrimento físico ao animal. Quando
na forma neurológica da doença, causa alta taxa de mortalidade.
A morbidade da doença varia de 25% a 75% e a relação letalidade/casos chega
frequentemente de 50-90% dependendo da linhagem viral. Apenas a raiva tem
porcentagem de letalidade em cães mais elevada que a cinomose (Swango, 1997).
Apesar do uso constante de vacinas vivas atenuadas, a cinomose ainda é uma
doença frequente. A vacina recombinante comercial, que utiliza como vetor um poxvírus,
apresenta resultados significativos, porém, com eficácia comprometida nas doses de reforço
e na presença de anticorpos maternos. Assim faz-se necessário o desenvolvimento de
vacinas recombinantes, utilizando novos vetores, visando à obtenção de vacinas que
resultem em eficácia e proteção de longa duração.
O adenovírus humano tipo 5 é um vetor viral que apresenta características positivas
para o desenvolvimento da vacina, como a relativa estabilidade, a fácil manipulação, a
possibilidade de ser obtido em altos títulos, a fácil purificação, a segurança devido a
deficiência na replicação viral e a imunogenicidade com alta eficiência na indução de
respostas imunes mediadas por linfócitos T e B. Muitos trabalhos têm comprovado a
eficiência do adenovírus humano tipo 5 em induzir resposta principalmente de linfócitos T
CD8 resultando na proteção dos animais imunizados contra infecções virais, mesmo na
presença de anticorpos pré-existentes contra o vetor. Assim estes vetores expressando as
glicoproteínas do VCC podem ser eficientes na indução de resposta imune protetora contra
o vírus.
Além do vetor viral propõem-se o uso L. lactis como vetor bacteriano. A L. lactis se
encontra no grupo das BL sendo amplamente utilizada na indústria de alimentos para a
produção e preservação de alimentos fermentados. Esta bactéria tem sido apontada por
muitos pesquisadores como um promissor meio de apresentação de antígenos, já que não
22
é patogênica nem invasiva, além de ser bem caracterizada. A administração oral destas
bactérias recombinantes promove um contato efetivo do antígeno com o sistema imune
associado à mucosa induzindo a secreção de IgAs, a principal classe de anticorpos que
podem ser eficientemente secretados pelo epitélio, visando o combate ao patógeno durante
a fase inicial da infecção. Estudos comprovam a capacidade do L. lactis para expressar
antígenos virais e bacterianos e induzir resposta imune sistêmica e de mucosa. O VCC
inicia a infecção principalmente pelo epitélio respiratório, logo, uma vacina com o L. lactis
expressando as proteínas F e H, poderia gerar resposta imune mucosal com a secreção de
IgAs anti-VCC, os quais, impediriam a entrada do vírus nas células do hospedeiro, evitando
a sua disseminação.
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi a construção de vacinas recombinantes
contra a cinomose canina utilizando como vetores o adenovírus humano tipo 5 deficiente
em replicação e o L. lactis, ambos expressando as glicoproteínas de superfície H e F do
VCC.
23
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Construir vetores vacinais para cinomose canina utilizando o adenovirus humano tipo
5 e o L. lactis expressando as proteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F) e avaliar a
resposta imune humoral em modelos murinos
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Construir um adenovírus recombinante capaz de expressar a glicoproteína H e um
outro expressando a glicoproteína F do vírus da Cinomose canina.
2. Administrar os adenovírus recombinantes, separadamente ou em combinação, em
camundongos BALB/c com protocolo de imunização do tipo dose única e reforço
(prime-boost).
3. Avaliar a resposta imune humoral induzida pelas glicoproteínas H e F expressas
pelos adenovírus recombinantes, através de ensaio imunoenzimático (ELISA).
4. Analisar a capacidade de neutralização viral dos anticorpos produzidos, através do
ensaio de neutralização viral.
5.
Construir um L. lactis recombinante capaz de expressar a glicoproteína H e um
outro expressando a glicoproteína F do vírus da Cinomose canina.
24
6. FLUXOGRAMA DE ATIVIDADES
25
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Meios de cultura utilizados
Luria-Bertani (LB)
Os componentes foram pesados nas seguintes quantidades: 10 g Peptona; 5 g Extrato de
levedura; 5 g Cloreto de Sódio e homogeinizados em q.s.p 1 litro de água. E
posteriormente, o meio preparado foi autoclavado por 15 minutos.
M17
Os componentes foram pesados nas seguintes quantidades: 5g Digerido pancreático de
caseína; 5 g de Peptona de soja; 5 g de Extrato de carne; 2,5 g de Extrato de levedura;
0,5 g de Ácido ascórbico; 0,25 g de magnésio; 19 g de Betaglicerofosfato dissódico e
homogeinizados em q.s.p 1 litro de água. E posteriormente, o meio preparado foi
autoclavado por 15 minutos.
M17 + Glicose + Sacarose (M17Gluc-Sac):
Foram adicionados ao meio descrito acima, 5 g de Glicose e 171,1 g Sacarose, após os
componentes foram homogeinizados e autoclavados por 15 minutos.
M17 + Glicose (GM17)
Meio M17 foi acrescido de Glicose 0,5% estéril.
M17 + Xilose (XM17)
Meio M17 foi acrescido de Xilose 1% estéril.
5.2 Construção de Adenovírus Recombinantes capazes de expressar as proteínas H e
F do vírus da Cinomose canina
5.2.1 Construção das ORFs sintéticas das proteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F)
do vírus da cinomose canina
As sequências nucleotídicas codificadoras das proteínas H e F (sem sequências de
ancoramento), foram obtidas apartir do genoma completo da linhagem vacinal
Onderstepoort depositado no GenBank (http: www.ncbi.nlm.nih.gov) com número de acesso
AF305419. Foram adicionados às respectivas sequências nucleotídicas, a sequência
26
nucleotídica para a expressão do sinal de secreção da hemaglutinina do vírus influenza
(HASS) e sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI, na sequência da proteína
hemaglutinina, e SpeI e KpnI, na sequência da proteína de fusão. As ORFs foram
sintetizadas pela empresa Entelechon GmbH.
As ORFs sintéticas foram clonadas no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen), gerando os
plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO HASSF (Figura 8).
A
B
Figure 8. Representação esquemática da construção dos plasmídeos contendo as ORFs sintéticas,
A) pCR4-TOPOHASSH; B) pCR4-TOPOHASSF
5.2.2 Transformação bacteriana
5.2.2.1 Confecção de Escherichia coli DH5α quimiocompetente
Uma colônia de E. coli DH5α foi cultivada em 5 mL de meio Luria Bertani – LB (descrito
na páginas 24) e incubada sob agitação (180 r.p.m, Shaker Superohom G25, Brasil) a 37oC
por 16 horas. Uma alíquota de 1 mL desta cultura foi inoculada em 300 mL de LB e
incubada sob as mesmas condições até a cultura atingir uma densidade óptica a 600nm
(DO600nm ) entre 0.4 e 0.6. As bactérias foram centrifugadas a 2800 x g durante 10 minutos a
4°C e o sedimento homogeneizado em 150 mL de 75 mM de CaCl2, 10 mM de Tris-HCl
27
pH 8,0. As bactérias foram centrifugadas novamente e o sedimento celular foi
ressuspendido em 30 mL da mesma solução, acrescida de 15% de Glicerol, sendo então
distribuído em alíquotas de 100 µL e congelados a -70°C até o momento do uso.
5.2.2.2 Transformação de E. coli DH5α com os plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e
pCR4-TOPO HASSF
A transformação dos plasmídeos (pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO HASSF) em
células de E. coli DH5 α foi realizada pelo Método de Choque Térmico conforme descrito
por Mandel & Higa (1970). Aproximadamente 100 ng dos plasmídeos foram utilizados para
a transformação, após o processo as células foram plaqueadas em meio LB com ampicilina
(100 µg/mL) para seleção das colônias de bactérias transformadas.
5.2.2.3 Extração do DNA plasmidiano pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO HASSF de E.
coli.
As colônias de bactérias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB
suplementado com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas a 37º C por 16 horas com aeração.
Os plasmídeos recombinantes foram extraídos através do Kit Miniprep Quiagen, conforme o
manual do fabricante.
5.2.3 Digestão enzimática, purificação e ligação do DNA
Para a digestão enzimática dos plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO
HASSF foram realizadas reações com as enzimas BglII e KpnI, e com SpeI e KpnI,
respectivamente.
Os produtos das reações de clivagem foram resolvidos em gel de agarose a 1% em
tampão TAE 1X (tris-acetato 0,04M; EDTA 0,001M), acrescido com brometo de etídio (1%
p/v), sob voltagem de 100 V durante 1 hora. As bandas correspondentes as sequências
HASSH e HASSF foram extraídas e purificadas utilizando o Kit QIAEX II da Qiagen,
conforme o manual do fabricante.
As ORFs H e F purificadas foram clonadas separadamente, no vetor de transferência
pAdCMVLink1, o qual foi previamente clivado pelas mesmas enzimas de restrição
correspondentes. A ligação de cada ORF ao pAdCMVLink1 foi realizada utilizando 1U da
enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen) em um volume final de 10 µL, a 16ºC durante 4 horas
utilizando uma proporção equimolar de 3 inserto / 1 vetor, resultando nos plasmídeos
recombinantes pAdCMVHASSH e pAdCMVHASSF (Figura 9).
28
A
B
Figure 9. Representação esquemática da construção dos vetores de transferência através da ligação
dos insertos nos plasmídeos. A) pAdCMVHASSH; B) pAdCMVHASSF.
5.2.3.1 Transformação de E. coli DH5α com os plasmídeos pAdCMVHASSH e
pAdCMVHASSF
Aproximadamente 5 µl do produto de cada reação de ligação (pAdCMVHASSH ou
pAdCMVHASSF) (item 5.2.3) foram usados para transformar 100 µl de células
quimiocompetentes de E. coli DH5α de acordo com o descrito no item 5.2.2.
Para a confirmação da presença das ORFs no vetor de transferência pAdCMVLink1,
os DNAs plasmidiais (pAdCMVHASSH e pAdCMVHASSF) foram extraídos (conforme
descrito no item 5.2.2.3) e a confirmação das clonagens foi realizada pela análise do perfil
de clivagem com a enzima de restrição BglII no plasmídeo pAdCMVHASSH e com as
enzimas de restrição SpeI e KpnI para o plasmídeo pAdCMVHASSF .
29
5.2.3.2 Reação de Sequenciamento
As sequências nucleotídicas dos insertos HASSH e HASSF clonadas no vetor
pAdCMVLink1 foram confirmadas através de sequenciamento parcial (Sanger et al., 1977)
com iniciadores específicos mostrados na tabela 5, utilizando o Kit DYEnamic ET Dye
Terminator
(Amersham
Bioscience)
e
o
sequenciador
MegaBACE.
Todos
os
sequenciamentos foram feitos no Núcleo de Genoma e Expressão Gênica (NAGE) do ICBUFMG.
Tabela 5. Iniciadores específicos utilizados para o sequenciamento dos insertos HASSH e HASSF
INICIADOR
SEQUÊNCIA
OB29 Senso
5’ ACG GGG ATT TCC AAG TCT 3’
SV40 Antisenso
5’ CAC TGC ATT CTA GTT GTG G 3’
5.2.4 Construção dos Adenovírus Recombinantes
5.2.4.1 Transfecção dos plasmídeos recombinantes em células HEK 293A
Os plasmídeos recombinantes (pAdCMVHASSH ou pAdCMVHASSF) foram cotransfectados com o plasmídeo pJM17,o qual apresenta o genoma completo do HAd5, em
células HEK 293A (Kidney Embrionary Human) para recombinação homóloga e geração
dos adenovírus recombinantes (Figura 10).
A transfecção foi realizada pelo Método de Cloreto de Cálcio (McGrory et al., 1988).
As células HEK293A foram cultivadas em placas com 6 poços, numa densidade de 6 x 105
células por poço, em DMEM (Dulbecco Modified Eagle’s Medium) completo acrescido de
5% soro fetal bovino, e cultivadas durante 24 horas. Para cada transfecção foram utilizados
10 µg de plasmídeo pJM17 e 10 µg do vetor de transferência clonado (pAdCMVLink HASS
H ou pAdCMVLink HASS F), os quais foram diluídos juntos em água deionizada estéril
q.s.p. 450 µL, e posteriormente foi adicionado 50 µL de CaCl2 2,5M.
Em um tubo de polipropileno foram adicionados 500 µL do tampão HeBS 2X,
composto de 280 mM de NaCl, 50 mM de HEPES e 1 mM de Na2HPO4, pH 7,05-7,12. A
solução de plasmídeos/CaCl2 foi adicionada gota a gota no tampão HeBS 2X, com a
agitação constante da mistura. A mistura foi incubada durante 30 minutos em temperatura
ambiente para formação do precipitado de cristais de fosfato de cálcio e DNA. Em seguida,
a mistura foi agitada em “vortex” e acrescentada a 3 mL de DMEM completo. Cada poço
contendo 6 x 105 células HEK293A foi cultivado com 3 mL do meio contendo o precipitado
30
durante 16 horas. Os poços foram lavados 2 vezes com PBS 1X para retirada do excesso
de precipitado, e as células de cada poço foram tratadas com tripsina e divididas para 3
poços. Os cultivos transfectados foram mantidos a 37º C e 5% de CO2 até a formação de
placas de lise na monocamada, as quais indicam a formação de vírus recombinantes.
Figure 10. Representação esquemática da recombinação homóloga resultante da co-transfecção do
vetor de transferência pAdCMVlink contendo o inserto de interesse e o plasmídeo pJM17, o qual
contém o genoma do adenovírus humano tipo 5.
No 14º dia após a transfecção foram observadas as placas de lise, as mesmas
foram coletadas e utilizadas para re-infectar células HEK293A e posteriormente o
sobrenadante celular contendo os vírus recombinantes AdH ou AdF foram estocados a
-70 ºC.
31
5.2.4.2 Confirmação da presença das sequências nucleotídicas da ORF H no AdH e da
ORF F no AdF.
Para a obtenção do DNA viral, células HEK 293A foram cultivadas em placas de
cultura (60 mm x 15 mm) até apresentarem confluência de 70 a 90%. Posteriormente foram
infectadas com AdH e AdF, separadamente. Quando as células apresentaram efeito
citopático, o sobrenadante celular foi coletado para a realização de reações de PCR
(Polimerase Chain Reaction) utilizando os iniciadores específicos mostrados na tabela 6. O
produto da PCR (5 µL) foi resolvido por eletroforese em gel de agarose 1 % em TAE 1X
(Tris-acetato 0,04 M; EDTA 0,001 M), acrescido com brometo de etídio (1% p/v), a 70 V,
visualizado em luz U.V. a 320 nm e fotografado.
Tabela 6. Iniciadores específicos utilizados para confirmação da presença das ORFs de interesse no
AdH e AdF
INICIADOR
SEQUÊNCIA
H Senso
5´ GGA GAT GGT ATG GAT TAT TAT 3´
H Antisenso
5´ TTC TCA TGT AAC CGT TAA 3´
F Senso
5´ ATG CAC AAG GGA ATC CCC 3´
F Antisenso
5´ AAG GCT CAG ATA CAT TG GAA 3´
5.2.4.3 Confirmação da expressão das proteínas H e F pelos adenovírus
recombinantes, através da técnica de RT-PCR (Transcrição reversa e Reação em
Cadeia da Polimerase).
Para realização da RT-PCR, o RNA das células infectadas, com cada adenovírus
recombinante, foi extraído através do RNeasy Mini Kit (QUIAGEN) e tratados com a enzima
DNAse RQ1 (Promega) conforme especificações do fabricante. A reação de RT-PCR foi
preparada com 0,5 µg de Oligo dT15 (iniciador hibridiza com a cauda poliA dos mRNAs), 2
µL dNTP 40 mM, 100 U RNAsin Ribonuclease Inhibitor (Promega), 200 U enzima M-MLV
Antisenso Transcription (Promega), 5 µL do tampão 5X de reação da enzima, 2 µg RNA e
H2O ultra pura para um volume final de 25 µL. As reações da RT foram feitas a 37ºC por 5
minutos; 42ºC por 60 minutos; e 70ºC por 20 minutos em termociclador. Após esse ciclo
foram feitas as reações de PCR utilizando os iniciadores descritos na Tabela 6. O produto
de PCR (5 µL) foi resolvido por eletroforese em gel de agarose 1% em TAE 1X (Tris-acetato
0,04 M; EDTA 0,001 M), acrescido com brometo de etídio (1% p/v), a 70 V, visualizado em
luz U.V. a 320 nm e fotografado.
32
5.2.4.4 Western Blotting
Para verificar a indução da expressão das proteínas H e F pelos adenovírus
recombinantes construídos, foram realizados ensaios de imunodetecção. Células HEK293A
foram cultivadas e infectadas separadamente com os adenovírus recombinantes. Após 48
horas de infecção as proteínas totais das células HEK293A infectadas com os adenovírus
AdH ou AdF foram extraídas em tampão de amostra (6 mL Tris-HCl 0,5 M; 4,8 mL glicerol;
9,6 mL SDS 10%; 2,4 mL β-mercaptoetanol; 1,2 mL azul de bromofenol 0,05% (v/v); 24 mL
H2O destilada), desnaturadas a 95 ºC por 5 minutos e separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida 8%.
As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-C ExtraAmershan Biosciences). As membranas foram incubadas com tampão de bloqueio (PBS
1X, 5% leite em pó desnatado e 0,1% Tween 20), “overnight” a 4º C. Após esse período, as
membranas foram incubadas com o anticorpo primário na concentração 1:5.000 em tampão
de bloqueio por 2 horas sob agitação, à temperatura ambiente. O anticorpo primário foi
obtido através do soro coletado de camundongos BALB/c imunizados com a vacina
comercial NOBIVAC PUPPY DP (composta pelos vírus atenuados da cinomose canina e da
parvovirose).
Após 3 lavagens com tampão de bloqueio, as membranas foram sensibilizadas com
o anticorpo secundário Rabbit anti-Mouse IgG (H+L) na concentração 1:10.000 em tampão
de bloqueio por 1 hora sob agitação, à temperatura ambiente. A membrana foi lavada três
vezes com Tampão de Bloqueio, seguida de três lavagens com uma solução PBS 1X
contendo 0,1% Tween 20 e outras três vezes com PBS 1X. A revelação foi realizada
utilizando o kit ECL-Plus (Amershan Biosciences) e filme Kodak, segundo o protocolo do
fabricante.
5.2.4.5 Purificação e titulação dos adenovírus recombinantes
Para a purificação dos adenovírus recombinantes, 15 garrafas de cultura celular de
150 cm2, contendo células HEK293A com cerca de 90% de confluência, foram infectadas
com AdH e AdF, separadamente. Após 48 horas, foi observado o efeito citopático causado
pela infecção viral e então, as células foram centrifugadas a 724 x g, por 5 min a 4 ºC, e o
“pellet” celular e sobrenadante foram submetidos ao processo de purificação utilizando o Kit
Vivaspin (VivaScience), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.
Após a purificação os adenovírus foram aliquotados em volume de 250 µL e
armazenados a -70ºC. Para as titulações, foram feitas diluições seriadas dos vírus
recombinantes em meio DMEM. Cerca de 450 µL de cada uma das diluições (107 a 1011)
33
foram adicionadas aos poços de placas de cultura com células HEK293A confluentes, em
duplicata. As placas foram incubadas por 7 a 9 dias a 37ºC e 5% CO2. Após esse período
foi observada a formação de placas de lise nas diluições e essas placas foram contadas.
5.2.4.6 Imunizações de camundongos com os adenovírus recombinantes
Para a imunização foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c fêmeas com
6 a 8 semanas de idade, obtidos do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais foram manipulados
conforme recomendações do “Guia de Manutenção e Uso de Animais de Laboratório” e de
acordo com o Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da UFMG que
previamente autorizou os testes (protocolo número 140/2005).
Grupos contendo 5 camundongos foram imunizados com duas doses de AdH (grupo
1), AdF (grupo 2), AdH/AdF (grupo 3), e como controle foi utilizado um grupo não
imunizado. A administração das vacinas foi realizada por via subcutânea na base da cauda,
seguindo o protocolo de imunização conhecido como “dose-reforço” baseada na inoculação
múltipla dos vetores de imunização. Antes da primeira dose da vacina foi retirado o sangue
dos animais pelo plexo retrorbital para obtenção do soro pré-imune. Posteriormente, foi
realizada a primeira imunização com 10 µL dos adenovírus recombinantes com 109 UFP/mL
diluídos em PBS1X e 1% de soro de animal não imunizado. Após 28 dias, foi retirado
sangue dos animais e foi inoculada a dose reforço da vacina. Seguidos 10 dias da dose
reforço, outra coleta de soro foi realizada. Os soros coletados foram utilizados para análise
da resposta humoral induzida pelos adenovírus recombinantes.
5.2.4.7 Análise da Resposta Imune Humoral
5.2.4.7.1 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Para os ensaios de ELISA, placas de 96 poços foram sensibilizadas com
0,5 µg/poço de vírus VCC linhagem Lederle concentrado (gentilmente cedido por Gissandra
F. Braz do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva - UFMG). Os soros dos
camundongos foram diluídos (1:25 a 1:25.600) e utilizados como anticorpo primário. Como
anticorpo secundário foi utilizado anti-mouse IgG conjugado à peroxidase (Zymed). Após
incubação foi revelado com Tetrametilbenzidina (Sinapse) e a leitura realizada a 450 nm.
Todos os experimentos foram feitos em duplicata. O valor do cut-off foi obtido pela fórmula:
Cut-off = Média das absorbâncias do controle negativo X 3. (Desvios padrão do controle negativo)
34
5.2.4.7.2 Ensaio de Neutralização Viral
Para o ensaio de neutralização, os soros coletados dos animais imunizados com os
adenovírus recombinantes foram inicialmente aquecidos a 56ºC por 30 minutos e diluídos
(1:2 a 1: 32) em meio DMEM (Dulbecco Eagle´s Minimum Essential Medium), sem soro.
As diluições dos soros foram misturadas a igual volume de inóculo de VCC contendo 3,3
TCID50 (Dose Infectante de Cultura de Tecido) em cada poço de uma placa de 96 poços. A
mistura foi incubada a 37ºC, a 5% de CO2 por 180 minutos para a neutralização.
Posteriormente, foi adicionado a cada poço cerca de 16.000 células VERO. A placa foi
mantida a 37ºC, 5% de CO2 por 3 dias, quando foi, então, observado o efeito citopático nas
células. O ensaio foi realizado em triplicata.
5.3 Construção de L. lactis recombinantes capazes de expressar as proteínas H e F do
vírus da cinomose canina.
5.3.1 Obtenção das ORFs de interesse.
Para a obtenção das ORFs H e F através dos plasmídeos pCR4-TOPOHASSH e
PCR-TOPOHASSF, foram construídos iniciadores específicos (mostrados na tabela 7) para
amplificar as sequências nucleotídicas por reações de PCR, tornando possível a retirada do
peptídeo sinal HASS e a inserção de sítios de restrição para as enzimas de restrição NsiI e
ClaI.
Tabela 7. Iniciadores específicos utilizados para amplificar as ORFs H e F para construção de L.
lactis
INICIADOR
SEQUÊNCIA
LacH Senso
5´ CCA TGC ATC AAT GCT CCC CTA CCA AGA C 3´
LacH Antisenso
5´ ATA TCG ATT TAA CGG TTA CAT GAG AAT CT 3´
LacF Senso
5´ CCA TGC ATC AAT GCA CAA GGG AAT CCC 3´
LacF Antisenso
5´ CCA TCG ATT TAC TAG TTA AAG GAA GAG CG 3´
Os produtos das reações de PCR foram clivados com as enzimas de restrição NsiI e
ClaI e purificados utilizando o Kit QIAEX II da Qiagen, seguindo especificações do
fabricante. Posteriormente, os mesmos foram ligados, separadamente, ao plasmídeo de
expressão pXYSEC:Nuc (gentilmente cedido pelo Prof. Anderson Miyoshi do Departamento
de Biologia Geral - UFMG), previamente linearizado com as mesmas enzimas de restrição,
35
utilizando-se a enzima T4 DNA ligase (Promega) de acordo com as recomendações do
fabricante.
O sistema de expressão gênica e endereçamento protéico para L. lactis utilizado
neste trabalho foi o denominado XIES (Xylose-Inducible Expression System), desenvolvido
por Miyoshi et al., (2004). Este sistema consta do promotor PxyIT, peptídeo sinal (PS) e sítio
de ligação do ribossomo (RBS) da proteína Usp45 de L. lactis e o gene repórter nuc de
Staphylococcus aureus.
Figure 11. Representação esquemática da clonagem das ORFs F e H no plasmídeo de expressão
pXYSEC:Nuc. A) pXYSEC:F; B) pXYSEC:H
5.3.2 Transformação bacteriana
5.3.2.1 Confecção de células eletrocompetentes de L. lactis NCDO2118
Um primeiro inóculo foi realizado com uma única colônia de L. lactis NCDO2118
(gentilmente cedido pelo Prof. Anderson Miyoshi) em meio M17Glu-Sac (vide item 5.1). Este
inóculo foi mantido a 30°C, “overnight” e sem agitação. Um segundo inóculo foi realizado
36
com 100 µL dessa primeira cultura, que foi novamente inoculada em meio M17Glu-Sac, a
qual foi incubada a 30°C, sem agitação, por 8-10 horas. Uma alíquota de 1 µL, desta última
cultura foi então inoculada em 150 mL de meio M17Glu-Sac contendo glicina (1%). Uma vez
que a cultura, alcançou uma densidade óptica (DO600nm) em torno de 0.4-0.6, esta foi
centrifugada a 8.000 x g durante 15 minutos a 4°C.
O precipitado celular foi então ressuspenso em 150 mL de uma solução gelada
constituída de sacarose 0,5 M e glicerol 10%. Esse processo de centrifugação e lavagem foi
repetido mais três vezes e, após a última lavagem, o “pellet” foi ressuspenso em 1 mL de
uma solução constituída por PEG3000 30% e glicerol 10%. Alíquotas de 100 µL dessas
células foram estocadas a -70º C até o momento de uso.
5.3.2.2 Transformação de L. lactis NCDO2118 com os plasmídeos pXYSEC:H e
pXYSEC:F
Os produtos das reações de ligação dos plasmídeos pXYSEC:H e pXYSEC:F foram
usados para transformar as células de L. lactis NCDO2118. Alíquotas com células
eletrocompetentes, congelados à -70°C foram colocadas no gelo durante 5 minutos. Em
seguida, adicionou-se 100 ng dos plasmídeos, separadamente, as células, as quais foram
transferidas para cubetas de eletroporação, previamente resfriadas. Ambas as amostras
foram submetidas a um pulso de 2,5 KVolts, capacitância 25 µFD e resistência de
200 OHMS, utilizando um eletroporador CelljecTUno (Thermo Electro Corporation).
Imediatamente após o pulso, foi adicionado 1 mL de meio M17 Glu-Sac para ressuspender
as células e estas foram incubadas à 30º C sem agitação por 4 horas.
A seleção dos transformantes foi realizada plaqueando-se 100 µL da cultura de
células eletroporadas, com cada um dos plasmídeos, em placas de Petri contendo meio
M17 Glu-Sac ágar suplementado com 10 µg/mL de cloranfenicol. As culturas foram
mantidas a 30º C por aproximadamente 30 horas, e posteriormente, os clones
recombinantes foram coletados.
5.3.2.3 Confirmação dos clones de L. lactis contendo os plasmídeos pXYSEC:H e
pXYSEC:F
As colônias de L. lactis transformadas com os plasmídeos pXYSEC:H e pXYSEC:F
coletadas foram inoculadas em 5 mL de meio M17 Glu-Sac suplementado com 10 µg/mL de
cloranfenicol. As culturas foram incubadas a 30°C por aproximadamente 18 horas. Foi feita
uma cultura estoque em glicerol (500 µL da cultura + 500 µL de glicerol 80%) de cada clone
e estes foram armazenados a 70º C. O protocolo utilizado para a extração dos plasmídeos
37
foi o mesmo utilizado no item 5.2.2.3 com uma única modificação: após a primeira
centrifugação, o precipitado celular foi ressuspenso em 100 µL de uma solução de TrisEDTA-Lisozima (10 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; 300 mM NaCl; 10 mg/mL Lisozima) e
incubado por meia hora. Posteriormente, o DNA plasmidiano foi utilizado para a realização
de reações de PCR com os iniciadores específicos mostrados na tabela 7.
5.3.2.4 Reação de Sequenciamento
Para a confirmação da presença dos insertos nos plasmídeos pXYSEC:H e
pXYSEC:F, foi realizado o sequenciamento (Sanger et al., 1977) parcial do DNA
plasmidiano, utilizando-se o Kit DYEnamic ET Dye Terminator (Amersham Bioscience) e o
sequenciador MegaBACE. Todos os seqüenciamentos foram feitos no Núcleo de Genoma e
Expressão Gênica (NAGE) do ICB-UFMG, utilizando os iniciadores específicos mostrados
na tabela 7.
5.3.2.5 Confirmação da expressão das proteínas H e F pelos L. lactis recombinantes
5.3.2.5.1 Indução da expressão gênica das proteínas H e F
Uma alíquota de 10 µL da cultura estoque dos clones confirmados de L. lactis
NCDO2118 recombinantes (pXYSEC:H ou pXYSEC:F) foi inoculada em meio GM17 (vide
item 5.1) suplementado com 10 µg/mL de cloranfenicol. Os inóculos foram mantidos
“overnight” a 30º C, sem agitação. Essas culturas foram então diluídas (1:10.000) em meio
XM17 (vide item 5.1) ou GM17 (controle negativo da indução) suplementados com 10 µg/mL
de cloranfenicol. Uma vez que a cultura alcançou uma densidade óptica (DO600nm) em torno
de 1, alíquotas da fração celular e do sobrenadante (4 mL) de cada cultura foram coletadas
e submetidas à extração protéica.
5.3.2.5.2 Extração das frações protéicas, citoplasmática e secretada dos L. lactis
recombinantes.
Alíquotas de 4 mL das culturas (induzidas e não induzidas) foram centrifugadas a
8.000 x g, 4º C por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi separado do precipitado
celular, e tratados separadamente.
O sobrenadante foi filtrado (filtro 0,22 µm) e então adicionou-se 100 µL de ácido
tricloroacético (TCA) 100% gelado; ditiotreitol (DTT) 10mM e foi incubado por uma hora no
38
gelo. Após incubação, o mesmo foi centrifugado a 8.000 x g, 4º C, por 20 minutos. O
precipitado protéico foi então ressuspenso em 60 µL de NaOH 50 mM.
O “pellet” celular foi ressuspenso em 100 µL de solução de TE-LYS (vide item
5.3.2.3) acrescido de DTT 10 mM. Em seguida, foi incubado a 37ºC por 30 minutos e,
posteriormente, adicionados 50 µL de dodecil sulfato de sódio (SDS) 20%.
Ao final da extração, as amostras foram ressuspensas em tampão DTT-LB 2X
(75 mM tris-HCl pH 6,8; 3% SDS; 15% glicerol; 0,15% azul de bromofenol; 200 mM DTT) na
proporção de 1:1, aquecidas a 100°C por 5 minutos e estocadas a -20º C.
5.3.2.5.3 Western Blotting
O ensaio de imunodetecção foi utilizado para a confirmação da expressão das
proteínas H e F. As frações protéicas extraídas dos clones de L. lactis recombinantes
induzidos e não induzidos foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%.
As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-C ExtraAmershan Biosciences). Estas membranas foram incubadas com tampão de bloqueio (PBS
1X, 5% leite em pó desnatado e 0,1% Tween20), “overnight” a 4º C. Após esse período as
membranas foram incubadas com o anticorpo primário (soro de coelho hiperimune anti-VCC
Lederle, gentilmente cedido por Gissandra F. Braz do Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva - UFMG) na concentração 1: 20.000 em tampão de bloqueio por 1
hora sob agitação à temperatura ambiente.
Após 3 lavagens com tampão de bloqueio, as membrana foram sensibilizadas com o
anticorpo secundário Goat anti-Rabbit IgG (H+L) na concentração 1:10.000 em tampão de
bloqueio por 1 hora sob agitação à temperatura ambiente. A membrana foi lavada três
vezes com tampão de bloqueio, seguida de três lavagens com uma solução PBS 1X
contendo 0,1% Tween 20 e outras três vezes com PBS 1X. A revelação foi realizada
utilizando o kit ECL-Plus (Amershan Biosciences) e filme Kodak, segundo o protocolo do
fabricante.
39
6. RESULTADOS
6.1 Construção dos Adenovírus Recombinantes capazes de expressar as proteínas H
e F do vírus da Cinomose canina.
6.1.1 Obtenção das ORFs H e F
As sequências nucleotídicas das ORFs H e F do vírus da cinomose canina linhagem
Onderstepoort foram obtidas no Genbank. A estas sequências foram acrescidos a
sequência de nucleotídeos do sinal de secreção da hemaglutinina do vírus influenza (HASS)
e sítios de restrição de enzimas, os quais são necessários para as etapas posteriores de
clonagem (Figura 12). As ORFs H e F adicionadas do sinal de secreção HASS foram
denominadas de HASSH e HASSF, respectivamente.
Figure 12. Sequências das proteínas F e H adicionadas dos sítios de restrição e o Peptídeo sinal
HASS. A) Sequência da proteína F com sítios de restrição para as enzimas KpnI e SpeI; B)
Sequência da proteína H com sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. Destacado em azul
está a localização do peptídeo sinal HASS.
As sequências nucleotídicas HASSH (1921pb) e HASSF (1908pb) foram sintetizadas
pela empresa Entelechon GmbH e clonadas no plasmídeo pCR4-TOPO (Invitrogen),
separadamente. Posteriormente, estas sequências foram retiradas destes plasmídeos por
meio de enzimas de restrição para clonagem no plasmídeo de transferência pAdCMVlink 1
(Figura 13).
40
Figure 13. Resolução eletroforética da clivagem dos plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO
HASSF. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. 1-Marcador de peso
molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), 2 -produto da digestão do pCR4-TOPO HASSH (1921pb) e
3-produto da digestão do pCR4-TOPO HASSF (1908 pb). As bandas marcadas são correspondentes
aos insertos HASSH e HASSF, respectivamente.
6.1.2 Construção dos Adenovírus Recombinantes
Para a construção dos adenovírus recombinantes os insertos HASSH e HASSF
obtidos por clivagem dos plasmídeos pCR4-TOPO HASSH e pCR4-TOPO HASSF foram
ligados nos plasmídeos pAdCMVLink1 previamente linearizados pelas mesmas enzimas de
restrição, resultando nos vetores pAdCMVHASSH e pAdCMVHASSF. As clonagens foram
confirmadas pela clivagem dos plasmídeos e através de sequenciamento parcial. Na figura
14 pode-se observar que quando clivado com a enzima de restrição BglII, o plasmídeo
pAdCMVHASSH apresenta-se como uma banda de aproximadamente 9.000 pb
correspondente ao pAdCMVLink1 (6.700 pb) mais a sequência nucleotídica HASSH (1.922
pb). Já o plasmídeo pAdCMVHASSF foi clivado com as enzimas de restrição SpeI e KpnI,
evidenciando a presença da sequência nucleotídica HASSF (1.908 pb) no vetor de
transferência pAdCMVLink-1 (6.700pb).
41
A
B
Figure 14. Resolução eletroforética da clivagem dos plasmídeos pAdCMVlinkHASSH e
pAdCMVlinkHASSF. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. A) Clivagem
do plasmídeo pAdCMVlinkHASSH 1-Marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), 2pAdCMVlink1 vazio linearizado (6700pb), 3-pAdCMVlinkHASSH (9000pb) clivado com a enzima BglII,
B) Clivagem do plasmídeo pAdCMVlinkHASSF com as enzimas Spe I e Kpn I 1- Marcador de peso
molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), 2-pAdCMVlink vazio (6700pb) e HASSF (2000pb). As
bandas marcadas são correspondentes ao pAdCMVHASSH linearizado e o inserto HASSF,
respectivamente.
Para a geração dos adenovírus humanos tipo 5 recombinantes (HAd5) os
plasmídeos pAdCMVHASSH ou pAdCMVHASSF foram co-transfectados com o plasmídeo
pJM17 em células permissivas HEK 293A pelo Método Cloreto de cálcio desenvolvido por
McGrory et al., (1988).
Após 14 dias da transfecção, foi possível observar placas de lise, as quais indicam a
formação dos adenovírus recombinantes contendo os insertos de interesse, estes foram
denominados AdH e AdF. A confirmação da presença dos insertos nos adenovírus foi feita
por PCR utilizando iniciadores específicos mostrados na tabela 6. Na figura 15 é possível
observar uma banda de 525 pb correspondente a parte da sequência de nucleotídeos da
42
ORF H amplificada do sobrenadante de células HEK293A infectadas com AdH e uma banda
de 418 pb referente a parte da ORF F em células infectadas com AdF
Figure 15. Resolução eletroforética da reação de PCR do sobrenadante de células HEK293A
infectadas com os adenovírus recombinantes. 1-Marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder
(Invitrogen). 2-Fragmento da sequência nucleotídica da proteína F amplificado (418pb) do
sobrenadante de células infectadas com AdF. 3-Controle positivo (pAdCMV-LinkHASSF). 4Fragmento da sequência nucleotídica da proteína H amplificado (525pb) do sobrenadante de células
infectadas com AdH. 5- Controle positivo (pAdCMV-LinkHASSH).
6.1.3 Análise funcional dos adenovírus recombinantes construídos.
A fim de se verificar a transcrição das ORFs heterólogas pelos adenovírus
recombinantes obtidos, foi realizada a técnica RT-PCR. Para isto, o RNA viral, de células
HEK293A infectadas com os mesmos, foi convertido em cDNA, o qual foi utilizado como
molde para reações de PCR com os iniciadores específicos mostrados na tabela 6. Na
figura 16 é possível observar a amplificação de fragmentos das sequências nucleotídicas
relativas proteína H (522 pb) e a proteína F (418 pb).
43
Figure 16. Resolução eletroforética da RT-PCR do sobrenadante de células HEK293A infectadas
com AdF e AdH. A) Amplificação apartir do cDNA de células infectadas com AdF; 1- Marcador de
peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), 2-3 Fragmento amplificado da sequência nucleotídica
da proteína F (418pb), 4- Controle positivo (pAdCMV-LinkHASSF), 5-Controle Negativo. B)
Amplificação apartir do cDNA de células infectadas com AdH; 1- Marcador de peso molecular 1Kb
DNA Ladder (Invitrogen), 2- Fragmento amplificado da sequência nucleotídica da proteína H (525pb),
3- Controle positivo (pAdCMV-LinkHASSH).
O reconhecimento por anticorpos anti-VCC das proteínas H e F expressas pela
maquinaria das células HEK293A infectadas pelos adenovírus AdH e AdF foi detectado por
Western Blotting. Anticorpos foram coletados de camundongos imunizados com vacina
comercial (NOBIVAC-Puppy Dp - Intervet). Uma banda de aproximadamente 70 KDa
correspondente a proteína F (precursor F0) foi observada no sobrenadante de células
HEK293A infectadas com AdF, já no sobrenadante de células HEK293A infectadas com
AdH foi detectada uma banda de
60 KDa referente a proteína H, as quais não são
observadas nos controles (sobrenadantes de células HEK293A não infectadas e células
HEK293A infectadas com AdCMV) (figura 17).
44
Figure 17. Ensaio de Imunodetecção para confirmar a expressão das proteínas H e F pelos AdH e
AdF em células HEK293A, respectivamente. A) 1- Proteína F expressa por células HEK293A
infectadas com AdF reconhecidas por anticorpos anti-VCC, 2- Células HEK293A não infectadas
(controle), 3- Células HEK293A infectadas com AdCMV (controle). B) 1- Proteína H expressa por
células HEK293A infectadas com AdH reconhecidas por anticorpos anti-VCC , 2- Células HEK293A
não infectadas (controle), 3- Células HEK293A infectadas com AdCMV (controle).
6.1.4 Análise da Resposta Imune Humoral
6.1.4.1 ELISA
Um dos testes utilizados para avaliar se as imunizações dos camundongos com os
adenovírus recombinantes, expressando as proteínas F e H, são capazes de gerar resposta
imune humoral contra o vírus VCC foi o teste de ELISA.
A imunização dos animais com os adenovírus recombinantes, expressando as
proteínas isoladamente ou a mistura dos dois vetores, foram capazes de induzir resposta de
anticorpos IgG anti-VCC. No entanto, na primeira dose administrada não foi detectada
produção significativa de IgG anti-VCC quando comparado ao controle negativo, mas após
a segunda imunização observou-se um aumento do título de anticorpos.
Dentre os grupos de imunização o que apresentou maior título de IgG total após a
segunda dose foi o que recebeu AdF (25.600) seguido pelos vacinados com AdH (12.800) e
com a mistura dos adenovírus (6.400), como evidenciado na figura 18.
45
A
B
C
Figure 18. Resposta imune humoral de camundongos BALB/c imunizados com adenovírus
recombinantes. A) Titulação dos anticorpos do soro de animais que receberam 2 doses de AdH; B)
Titulação dos anticorpos do soro de animais que receberam 2 doses de AdF; C) Titulação dos
anticorpos do soro de animais que receberam 2 doses de AdH/AdF. Como controle foi utilizado soro
de animais não imunizados (NI), a resposta imune humoral foi avaliada 10 dias após a segunda
imunização utilizando como antígeno o vírus VCC da linhagem vacinal Lederle concentrado. Cut-off
0.043855
6.1.4.2 Ensaio de Neutralização Viral
A capacidade de neutralização, in vitro, do vírus VCC pelos anticorpos produzidos
através das imunizações foi comprovada pela técnica de Neutralização Viral. A partir deste
ensaio foi constatado que todos os grupos imunizados com os adenovírus recombinantes
apresentaram anticorpos neutralizantes contra o vírus VCC, quando comparados ao grupo
controle composto de animais imunizados com AdLacz. Na figura 19, é possível observar a
maior atividade de anticorpos neutralizantes no soro de animais imunizados com AdH e com
AdH/AdF. Uma vez que as células VERO mostraram-se com menor efeito citopático, ou
seja, formação de sincícios.
46
A
B
C
D
Figure 19. Ensaio de Neutralização Viral para confirmação da presença de anticorpos neutralizantes
específicos contra o VCC no soro de camundongos imunizados com adenovírus recombinantes
codificando as proteínas H e F. A) Soro do grupo imunizado com AdF; B) Soro do grupo imunizado
com AdH; C) Soro do grupo imunizado com AdH/AdF; D) Soro do grupo controle imunizado com
AdLacZ. Ensaio mostrado em duplicata para melhor visualização, e o resultado foi obtido na diluição
1:4 dos soros no terceiro dia pós-infecção.
47
6.2 Construção de Lactococcus lactis capazes de expressar as proteínas H e F do
vírus da Cinomose canina
6.2.1 Obtenção das ORFs de interesse
As sequências de nucleotídeos referentes às ORFs H e F para a construção dos L.
lactis recombinantes foram obtidas por PCR dos plasmídeos sintéticos pCR4-TOPOHASSH
e pCR4-TOPOHASSF. Para tal foram construídos iniciadores específicos (Tabela 7) para
que as sequências nucleotídicas de interesse fossem obtidas sem peptídeo sinal HASS e
para inserção de sítios de enzimas de restrição requeridos para as etapas posteriores da
clonagem. A figura 20 mostra a amplificação das ORFs H (1840 pb) e F (1840 pb).
Figure 20. Resolução eletroforética da reação de PCR do pCR4-TOPOHASSF e pCR4TOPOHASSFH com iniciadores específicos mostrados na tabela 7. 1-Marcador de peso molecular
1Kb DNA Ladder (Invitrogen). 2- sequência da ORF da proteína F amplificada (1840 pb). 3sequência da ORF da proteína H amplificada (1840 pb).
Após a amplificação das ORFs H e F e clivagem das mesmas e do plasmídeo
pXYSEC:Nuc pelas enzimas de restrição específicas, foram realizadas reações de ligação
entre
pXYSEC e ORF H, e pXYSEC e ORF F utilizando-se a enzima T4 DNA ligase
(Promega). Aproximadamente 5 µL dos produtos das reações de ligação foi aplicada em gel
de agarose 1%, onde foi confirmada a ligação das ORFs de interesse nos plasmídeos
pXYSEC (figura 21).
48
Figure 21. Resolução eletroforética da reação de ligação entre o plasmídeo pXYSEC e ORF H e
plasmídeo pXYSEC e ORF F. 1-Marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen). 2-Banda
representando o plasmídeo pXYSEC:H. 3- Banda representando o plasmídeo pXYSEC:F.
6.2.2 Construção dos L. lactis recombinantes
Os plasmídeos pXYSEC:F e pXYSEC:H foram utilizados para a transformação de
L. lactis NCDO2118 por eletroporação. A confirmação dos clones positivos foi realizada por
sequenciamento parcial e PCR utilizando os iniciadores mostrados na tabela 7, obtendo
assim duas bandas de 1840 pb uma correspondente à ORF H e a outra à ORF F (figura 22).
Figure 22. Resolução eletroforética da reação de PCR do DNA plasmidiano extraído dos clones de L.
lactis recombinantes. 1-Marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen). 2- Sequência da
ORF F (1840 pb) amplificada do DNA plasmidiano do L. lactis; 3- Controle positivo (pCR4TOPOHASSH). 4-Controle negativo. 5- sequência da ORF H (1840 pb) amplificada do DNA
plasmidiano do L. lactis; 6- Controle positivo (pCR4-TOPOHASSF). 7- Controle negativo.
49
6.2.3 Análise funcional das linhagens recombinantes de L. lactis
A confirmação da correta expressão e endereçamento das proteínas H e F pelos L.
lactis recombinantes, induzidos por xilose, foi realizada por Western Blotting. Para o
reconhecimento das proteínas F e H foi utilizado anticorpos anti-VCC provenientes de soro
hiperimune de coelho. Na figura 23 A, observa-se uma banda de 69 KDa correspondente a
proteína H e na figura 23 B a proteína precursora F0 com uma banda de 70 KDa, ambas
proteínas foram detectadas no sobrenadante das células induzidas.
Figure 23. Ensaio de Imunodetecção a partir das proteínas extraídas do sobrenadante e da fração
celular dos L. lactis recombinantes, induzidos e não induzidos. A) L. lactis codificando a proteína
H; 1 e 2 - proteínas da fração celular e do sobrenadante proteínas da fração celular e do
sobrenadante de bactérias induzidas, respectivamente; 3 e 4- proteínas da fração celular e do
sobrenadante de bactérias não induzidas, respectivamente; B) L. lactis codificando a proteína F; 1
e 2 - proteínas da fração celular e do sobrenadante de bactérias induzidas, respectivamente; 3 e 4proteínas da fração celular e do sobrenadante de bactérias não induzidas, respectivamente. Bandas
marcadas são correspondentes as proteínas H e F, respectivamente.
50
7. DISCUSSÃO
As proteínas H e F foram escolhidas como antígeno vacinal devido a suas
características imunogênicas comprovadas por Welter et al., (1998) com canaripoxívirus
recombinantes e por Cherpillod et al., (2000), Sixt et al., (2008), Jensen et al., (2009) e
Nielsen et al., (2009) com vacinas de DNA. A fim de se potencializar e direcionar a resposta
imune gerada, cada uma das sequências nucleotídicas que codificam estas duas proteínas,
foi inserida, no genoma do HAd5 recombinante e em plasmídeo para expressão em L. lactis.
Para otimizar a expressão e a apresentação ao sistema imune das proteínas
codificadas pelos adenovírus recombinantes, foi adicionado a suas sequências nucleotídicas
o sinal de secreção HASS, o qual já foi utilizado em outros trabalhos comprovando sua
eficácia no aumento da expressão e secreção de proteínas recombinantes (Hussy et al.,
1996).
O adenovírus humano tipo 5 tem sido amplamente utilizado como vetor para o
desenvolvimento de muitas vacinas para humanos e animais contra as mais variadas
doenças, como Malária (Bruna-Romero et al., 2001; Shott et al ., 2008; Palma et al., 2011),
Ebola (Ledgerwood et al., 2010), Febre Aftosa (Moraes et al., 2002), entre outros.
Um dos desafios apontados na utilização de vetores adenovirais para o
desenvolvimento de vacinas é a presença de imunidade pré-existente contra o vetor. No
entanto, muitos estudos têm demonstrado a capacidade dos mesmos em gerar imunidade
protetora contra o antígeno mesmo na presença de anticorpos contra o vetor, o que foi
demonstrado por Lees et al., (2002) e Xiang et al., (2003) utilizando adenovírus
recombinantes expressando a glicoproteína G do vírus da raiva para imunizar animais
recém nascidos. Esta característica do adenovírus pode representar uma vantagem para o
desenvolvimento de uma vacina para a cinomose canina, já que os filhotes são os mais
acometidos pela doença e as vacinas recombinantes disponíveis contra o VCC, NYVAC-HF
(vírus vaccinia atenuado) e ALVAC-HF (canaripoxivirus recombinante) não são capazes de
proteger os animais na presença de anticorpos contra o vetor (Welter et al., 2000).
Segundo, Andrade et al., (2007), o adenovírus humano tipo 5 apresenta algumas
características que pode torná-lo mais imunogênicos que os poxvírus, como a presença de
proteínas com atividade adjuvante no vírion (Molinier-Frenkel et al., 2003), a habilidade de
infectar células apresentadoras de antígenos sem causar danos a funcionalidade das
mesmas, a capacidade de infectar vários tipos celulares (Brown et al., 2003), e de expressar
altos níveis de transgene por um curto período de tempo, evitando o desenvolvimento de
tolerância. Além destas características, o HAd5 pode superar a relativa imaturidade do
sistema imune de neonatos, devido a sua habilidade de infectar células dendríticas imaturas
51
dirigindo a sua maturação em células apresentadoras de antígenos (Zhong et al., 1999;
Varnavski et al., 2003).
Já foi demonstrado por Fischer et al., (2002) que o adenovírus pode ser uma
ferramenta eficaz contra o VCC. Os autores construíram adenovírus caninos tipo 2 (CAd2)
competentes em replicação, expressando as proteína H e F e os inocularam em cães recém
nascidos de mães previamente imunizadas. Foi constatado que filhotes imunizados foram
protegidos do desafio com VCC mesmo na presença de imunidade pré-existente ao vetor.
No entanto, para fins de imunização preconiza-se o uso de Ad deficiente em replicação,
visto que os Ad replicativos são menos previsíveis e sua utilização pode gerar insegurança
quanto ao seu potencial de toxicidade (Tatsis e Ertl, 2004). Logo, a construção de vacinas
usando HAd5 recombinantes deficiente em replicação para cinomose canina torna-se uma
opção segura e eficaz, já que o animal não apresenta anticorpos neutralizantes contra o
vetor e, por estar desabilitado, não apresenta capacidade de gerar doença no animal.
Neste trabalho foram construídos dois adenovírus recombinantes um expressando a
proteína H e o outro a proteína F. A capacidade dos mesmos em expressar corretamente as
proteínas foi confirmada por ensaios de imunodetecção utilizando anticorpos policlonais
anti-VCC. Porém, a proteína H mostrou-se um pouco menor, já que em Schmid et al.,
(2000) esta proteína apresentou aproximadamente 69 KDa, mas, Fischer et al., (2002)
demonstrou em seu trabalho que duas bandas foram reconhecidas por anticorpos
monoclonais anti-VCC uma de 68 KDa e a outra um pouco menor. A banda menor parece
ser resultado da falta de estabilidade da proteína H ou a terminação prematura do processo
de síntese. Nos estudos citados, a expressão foi induzida pelo VCC em células VERO e
MDCK (Madin and Darby canine kidney) respectivamente, Sendo assim, o tamanho
reduzido da proteína também pode ter sofrido interferência das diferenças no
processamento da proteína na célula HEK293A.
Os adenovírus recombinantes quando inoculados em camundongos BALB/c em
diferentes combinações foram capazes induzir a produção de IgG anti-VCC, de acordo com
o protocolo de imunização do tipo prime-boost. É relevante ressaltar que o soro do grupo
que recebeu duas doses de AdF foi a que apresentou maior título de anticorpos. No
entanto, através do Ensaio de Neutralização Viral foi possível observar a maior prevalência
de anticorpos neutralizantes do VCC no soro dos animais imunizados com AdH/AdF e com
AdH, comprovando os relatos de Hirayama et al., (2001) e Sixt et al., (1998), de que os
anticorpos contra a proteína H tem atividade neutralizante e inibem a ligação do VCC a
receptores celulares. Segundo Jensen et al., (2009), estes anticorpos protegem os animais
contra viremia, linfopenia e sintomas clínicos causados pelo vírus.
Os resultados deste trabalho comprovam assim o potencial dos adenovírus
recombinantes construídos de gerar resposta imune humoral contra o vírus da cinomose
52
canina. No entanto, estudos adicionais da resposta imune mediada por células induzida
pelos vetores recombinantes são necessários, devido a sua aparente importância no
desenvolvimento de uma proteção sólida contra VCC, como demonstrado por Welter et al.,
(2000), Sixt et al., (1998) e Shek et al., (1980).
Além
dos
adenovírus
recombinantes
foram
construídas
duas
linhagens
recombinantes de L. lactis, uma expressando a proteína H e, a outra, a proteína F. Muitos
estudos têm demonstrado que o L. lactis pode ser geneticamente modificado para
expressar antígenos, como o antígeno ribossomal L7/L12 de Brucella (Ribeiro et al., 2002),
antígeno E7 do Papillomavírus humano Tipo 16 (Bermudez-Humaran et al., 2002) e o
fragmento C da toxina do tétano (Robinson et al., 1997). Estas bactérias são capazes de
estimular resposta imune sistêmica e principalmente de mucosa, sendo capazes de
neutralizar patógenos. Estudos como o de Li et al., (2010), comprovam a geração de
anticorpos neutralizantes contra rotavírus estimulada por L. lactis expressando antígeno
específico. Desde modo, a utilização de L. lactis recombinantes expressando as
glicoproteínas H e F como vetor vacinal para cinomose canina pode induzir a secreção de
anticorpos IgA específicos anti-VCC nas mucosas, as quais são a principal via de entrada
do vírus no organismo, o que pode impedir ou reduzir o nível de infecção das células do
hospedeiro.
A correta expressão e endereçamento das proteínas produzidas pelos L. lactis
recombinantes foram confirmadas por ensaios de imunodetecção utilizando soro hiperimune
anti-VCC de coelho. Esses resultados iniciais são relevantes, pois demonstram a
capacidade destas bactérias de se tornarem promissores vetores vacinais contra o vírus da
cinomose canina.
Apesar dos L. lactis recombinantes serem considerados bons vetores e seguros,
atualmente, tem-se discutido os possíveis impactos da liberação na natureza destas
bactérias, as quais são linhagens não colonizadoras. A utilização de organismos
geneticamente modificados (OGM) causa preocupação sobre a sua sobrevivência e
propagação no ambiente, e sobre a transferência de genes de resistência a antibióticos
utilizados como marcadores de seleção, ou de outras modificações genéticas para outros
microrganismos. Para prevenir a liberação dos OGMs no ambiente, estratégias de
biocontenção têm sido desenvolvidas, como a construção de microrganismos auxotróficos
ou a inserção de gene suicida (Lee, 2010).
53
8. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
Apartir dos dados aqui apresentados é possível concluir que os adenovírus
recombinantes codificando as proteínas H e F construídos foram capazes de expressar
corretamente as proteínas, e quando inoculados em camundongos BALB/c foram capazes
de gerar resposta imune humoral contra o vírus da cinomose canina. Além dos adenovírus
recombinantes, os L. lactis recombinantes construídos também foram capazes de expressar
e endereçar corretamente as proteínas.
Como continuidade a este trabalho, pretende-se administrar em camundongos
BALB/c os vetores construídos em protocolos heterólogos, assim como outros vetores já
utilizados (ALVAC, NYVAC). Posteriormente serão avaliadas as respostas imunes celular e
humoral envolvidas na proteção contra o vírus VCC através de testes como ELISPOT,
Ensaio de Proliferação, ELISA. Além disso, será realizado o ensaio de Soroneutralização
com diferentes linhagens do vírus para verificar a ocorrência de proteção cruzada.
54
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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