Amplificação de fragmentos de genes simbióticos e características

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Amplificação de fragmentos de genes simbióticos e características
morfofisiológicas de bactérias de nódulos de Sabiá oriundos de solo
sob Caatinga(1)
Vinicius Santos Gomes da Silva (2); Maria do Carmo Catanho Pereira de Lyra (3);
Aleksandro Ferreira da Silva (2); Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos (4); Ana
Dolores Santiago de Freitas (4); Juscélia da Silva Ferreira (2)
(1) Trabalho
executado com recursos da Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco.
Estudante de doutorado em Ciências do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco; Recife, Pernambuco;
[email protected]; (3) Pesquisadora, Instituto Agronômico de Pernambuco; (4) Pesquisadora, Universidade
Federal Rural de Pernambuco.
(2)
RESUMO: A Caatinga é um dos centros de
diversificação de espécies do gênero Mimosa. No
presente trabalho, avaliaram-se as características
de bactérias de nódulos de sabiá nativas de solo
coletado em área de Caatinga densa, no município
de Belo Jardim/PE. Determinou-se a habilidade dos
isolados de realizar a fixação biológica de nitrogênio
por meio da amplificação de fragmentos de genes
simbióticos (nifH e nodC). Foram obtidos 37
isolados, dos quais 25 apresentaram amplificação
para o gene nifH e 21% das bactérias amplificaram
tanto o nifH como o nodC. Os isolados que
amplificaram pelo menos um dos genes simbióticos
foram
agrupados
de
acordo
com
suas
características culturais, formando 8 grupos. Todos
os isolados que amplificaram apresentaram
crescimento rápido e 66% acidificaram o meio. Os
resultados indicam que os isolados bacterianos de
solos de Caatinga apresentam elevada variabilidade
em suas características fenotípicas e padrões de
amplificação dos genes estudados.
nitrogênio atmosférico, disponibilizando o nutriente
para a planta e incorporando-o ao solo. Desta
forma, esses micro-organismos apresentam grande
importância para o bioma, uma vez que um dos
fatores que mais limitam a produção vegetal nessas
áreas, depois da restrição hídrica, é a
disponibilidade de nitrogênio.
Apesar da importância para Caatinga da
associação simbiótica entre sabiá e bactérias
nodulíferas, pouco se conhece sobre as
características das diazotróficas que tem habilidade
de estabelecer a simbiose.
Ante a essas considerações, objetivou-se com o
presente trabalho caracterizar morfofisiologicamente
bactérias de nódulos de sabiá cultivado em solo
coletado de área de Caatinga no município de Belo
Jardim/PE. A habilidade desses isolados de realizar
a fixação biológica de nitrogênio foi avaliada por
meio da amplificação de fragmentos de genes
simbióticos (nifH e nodC).
MATERIAL E MÉTODOS
Termos de indexação: Mimosa caesalpiniifolia,
fixação biológica de N, nodulação.
INTRODUÇÃO
Mimosa é um dos gêneros mais ricos da família
das Leguminosas, apresentando mais de 500
espécies, que se distribuem nos mais diversos
habitats, incluindo florestas tropicais, florestas
secas, desertos, pastagens e savanas. Sendo a
Caatinga, bioma exclusivo do Nordeste do Brasil,
um dos principais centros de diversidade de
leguminosas desse gênero (Simon et al., 2011).
Leguminosas da Caatinga tem recebido
considerável atenção nos últimos anos em razão de
sua associação simbiótica com bactérias nodulíferas
que permitem a fixação de elevadas quantidades de
nitrogênio atmosférico (Freitas et al., 2010).
O sabiá, Mimosa caesalpiniifolia Beth., é uma das
leguminosas nativas da caatinga, com habilidade de
estabelecer associações simbióticas com bactérias
diazotróficas nativas. Essas bactérias fixam o
Amostras compostas do horizonte superficial (020cm) de solo sob vegetação de Caatinga foram
coletadas no município de Belo Jardim, Agreste de
Pernambuco, cujas características químicas e
físicas encontram-se na Tabela 1. As amostras
foram destorroadas, peneiradas e distribuídas em
vasos com capacidade para 2kg.
Para a obtenção dos nódulos, sementes de sabiá
(Mimosa caesalpiniifolia Beth.,) foram semeadas em
vasos contend 1 kg do solo que foi coletado.
Antecedendo o semeio, para superar a dormência,
as sementes foram submetidas a choque térmico,
com água a temperatura de 80 ºC por cinco
minutos, seguido da imersão em água a
temperatura ambiente por 12 horas. Posteriormente
as sementes foram desinfestadas superficialmente
com etanol comercial (30 segundos), hipoclorito de
sódio a 2% (5 minutos) e dez lavagens com água
destilada estéril (Vincent, 1970). Cada vaso recebeu
quatro sementes, deixando após 15 dias uma planta
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por vaso.
Aos 90 dias após a emergência realizou-se a
colheita das plantas, separando-se a raiz da parte
aérea. O sistema radicular foi lavado em água
corrente, os nódulos foram destacados, contados e
armazenados em recipientes contendo sílica gel,
para o subsequente isolamento das bactérias.
Para o isolamento, 60 nódulos foram escolhidos
aleatoriamente. Inicialmente os nódulos foram
reidratados durante 40 minutos em água destilada
estéril e desinfestados superficialmente em álcool
etílico 70% por 30 segundos e em hipoclorito de
sódio a 2% por 5 minutos, seguido de 10 lavagens
em água.
Com o auxílio de uma pinça, os nódulos
desinfestados foram pressionados em placa de
Petri, contendo meio YMA (Vincent, 1970), com
vermelho do congo (Somasegaran & Hoben, 1994).
As placas foram incubadas a 28 ºC até o
aparecimento das colônias bacterianas. Para
purificação dos isolados, as colônias foram
inoculadas sucessivas vezes no meio YMA
contendo o indicador azul de bromotimol até a
obtenção de cultura pura. Os isolados purificados,
foram caracterizados avaliando-se o tempo de
crescimento, alteração do pH e tamanho da colônia.
Para avaliar a habilidade dos isolados obtidos
em realizar a fixação biológica de nitrogênio, as
bactérias tiveram seu DNA extraído de acordo com
a metodologia de Dhaese et al. (1979) e em seguida
foram submetidos a reação duplex para a
amplificação simultânea de fragmentos dos genes
nifH e nodC, seguindo protocolo estabelecido por
Fernandes Júnior et al. (2013).
A reação de PCR foi dimensionada para um
volume final de 10 ul, contendo tampão de reação
1X, MgCl2 2,5 mM, Taq DNA polimerase 0,25U. Os
iniciadores utilizados foram 1uM de PolF
(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)
e
PolR
(ATSGCCATCATYTCRCCGGA)
para
a
amplificação de um fragmento de aproximadamente
360 pb correspondente à parte do gene nifH no
operon nifHKD (POLY et al., 2001) e 0,6 ul de
NodCF (AYGTHGTYGAYGACGGTTC) e NodCR(I)
(CGYGACAGCCANTCKCTATTG)
para
a
amplificação de um fragmento interno ao gene nodC
com aproximadamente 980 pb (Laguerre et al.,
2001).
As bactérias com amplificação positiva para um
dos fragmentos, pelo menos, foram agrupadas de
acordo com suas características morfofisiológicas
por meio da elaboração de uma matriz binária para
a construção do dendograma de similaridade por
agrugamento com base no índice Jaccard e no
algoritmo UPGMA, utilizando o programa PAST.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidos 37 isolados bacterianos dos
quais, 25 apresentaram amplificação positiva para o
gene nifH e 8 amplificaram simultaneamente
fragmentos dos genes nifH e nodC. Foi utilizado o
critério de corte de 70% de similaridade para análise
do dendrograma. A análise de variabilidade genética
pelas características morfológicas e amplificação
dos genes nifH e nodC formaram com o coeficiente
de Jaccard 4 subgrupos (subclusters) com uma
variabilidade entre 80 a 100%.
Destacaram-se os subgrupos: 1Aa formado
pelos isolados (9C, 9F e 15K), 1Ba (9B e 15F), 2Ab
(20N e 4A1) e 2Bb (4L) onde os isolados
amplificaram os dois genes através da técnica de
PCR-Duplex. E os isolados dentro de cada grupo
apresentaram um grau de similaridade de 100%.
(Figura 1).
O agrupamento dos isolados no dendrograma,
considerando 100% de similaridade, de acordo com
suas características morfofisiológicas e de
amplificação, gerou 8 grupos, sendo o grupo 7 o
que apresentou maior quantidade de isolados
porém neste grupo apenas foi amplificado o gene
nifH (Tabela 2).
As colônias de isolados que amplificaram
fragmentos
de
genes
simbióticos
foram
diferenciadas com base no tempo de crescimento
em três categorias: rápidas – aquelas que produzem
crescimento moderado e abundante em até três
dias, intermediarias, entre 4 e 5 dias, e lentas as
que cresceram após 6 dias. Todos os isolados que
apresentaram amplificação positiva cresceram em
até três dias. Com base na alteração do pH em
meio de cultura YMA com indicador azul de
bromotimol, os isolados foram classificados como
de reação ácida, neutra ou alcalina. Houve uma
predominância de bactérias que acidificam o meio
(66%). Quanto ao tamanho da colônia, 14 isolados
apresentaram colônias com tamanho inferior a 1
mm, 11 com tamanhos entre 1 e 2mm (Tabela 2).
A predominância de bactérias de crescimento
rápido e que acidificam o meio para rizóbios
isolados de leguminosas arbóreas do gênero
Mimosa spp. cultivadas em regiões tropicais já foi
relatado na literatura. Martins et al. (2015), em
trabalho conduzido com Mimosa caesalpinifollia
cultivada em diferentes solos do Nordeste Brasileiro,
verificaram que os 47 isolados rizobianos obtidos
apresentaram crescimento em até três dias. Texeira
et al. (2010) realizaram a caracterização de rizóbios
nativos da Caatinga com a capacidade de nodular
Mimosa tenuiflora (Willd.) e observaram a totalidade
dos isolados dessas espécies com crescimento
rápido.
3
Tabela 2. Características morfofisiológicas e de
amplificação de 8 grupos de isolados bacterianos
de nódulos de Sabiá cultivado em solo coletado
em área de Caatinga em Belo Jardim/PE.
Grupos
(nºisolados)
Grupo 1 (3)
Amp
TC
pH
TmC
NifH+Nod
C
NifH
R
Ácido
1a2
R
Ácido
1a2
NifH+Nod
C
NifH
R
Neutro
1a2
R
Neutro
1a2
Grupo 5 (4)
NifH
R
Neutro
<1
Grupo 6 (2)
NifH+Nod
C
NifH
R
Neutro
<1
R
Ácido
<1
Grupo 2 (4)
Grupo 3 (2)
Grupo 4 (2)
Grupo 7 (7)
Grupo 8 (1)
NifH+Nod
R
Ácido
<1
C
Amp – amplificação dos genes simbióticos; TC – Tempo de
crescimento (R – rápido); TmC – tamanho da colônia em mm.
No bioma Caatinga, o gênero Mimosa spp. é
frequentemente
nodulado
por
beta-rizóbios
pertencentes ao gênero Burkholderia. Esse
resultado foi observado por Reis Jr. et al. (2010) em
estudo da nodulação e da fixação biológica de
nitrogênio em várias espécies do gênero Mimosa
nos biomas do Cerrado e da Caatinga do Brasil.
Espécies de rizóbio do gênero supracitado, como
Burkholderia sabiae e B. nodosa apresentam
características de crescimento rápido, o que pode
explicar a totalidade dos isolados com esta
característica.
CONCLUSÕES
Os isolados bacterianos de nódulos de sabiá
oriundos de solo de Caatinga em Belo Jardim/PE
apresentam elevada variabilidade em suas
características morfisiológicas e padrões de
amplificação dos genes estudados.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a FACEPE, pelo apoio
financeiro.
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4
Tabela 1. Caracterização química, física e classificação do solo coletado da área de Caatinga no Município
de Belo Jardim/PE.
pH
C
P
K
Ca
Mg
Na
Al
H+Al
-1
-3
-3
água
dag kg
mg dm
-----------------------cmoc dm ---------------------------5,86
Ds
1,45
68,41
Dp
2,64
2,32
Granulometria (%)
Areia
1,30
0,62
74,3
Silte
9,3
0,88
0,07
0,10
3,30
Classificação Textural
Classe de Solo
Franco Arenoso
Argissolo Amarelo
Argila
16,3
Figura 1. Dendrograma obtido pelo agrupamento realizado pelo algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group
Method with Arithmetical Average) usando o programa PAST a partir da matriz de similaridade genética
entre isolados noduliferos de Mimosa caesalpiniifolia Beth (Sabiá). O coeficiente de Jaccard foi utilizado
para a construção da matriz de similaridade. * isolados que amplificaram simultaneamente os genes
simbióticos nifH e NodC pela técnica de Duplex-PCR.